TAXONOMÍA Y EVOLUCIÓNTAXONOMÍA Y EVOLUCIÓNBACTERIANABACTERIANA

BIBLIOGRAFÍA

• Brock, Biología de los microorganismos, 8a, 9a o 10a

ed. (Evolución microbiana y sistemática, Diversidad deArchaea y Bacteria)

• Reviews• Roselló-Mora R & Amann R. (2001). The species concept for prokaryotes.

FEMS Microb Rev 25, 39-67.

• Vandamme P. et al (1996). Polyphasic taxonomy, a consensus approachto bacterial systematics. Microbiol Rev 60, 407-438.

TEMARIO

Taxonomía y concepto de especie en procariotas

Taxonomía clásica, numérica y polifásica

Caracteres fenotípicos: clásicos y quimiotaxonómicos

Caracteres genotípicos: clásicos y modernos (fingerprinting)

Filogenética: clasificación y relación evolutiva

gen del ARNr 16S, árbol filogenético y definición de dominos

Relación entre taxonomía clásica y filogenética.

Diversidad bacteriana.

Identificacion de una cepa

Clasificaciónestructura los organismos en grupos (taxones) en base a susimilitud

Nomenclaturaasigna nombres a los taxones

Identificacióndetermina a que taxones pertenece un organismo que seaisla

TAXONOMÍA

• Taxonomía– Caracterización exhaustiva– Aplicación de teoría y método de clasificación– Formación de grupos taxonómicos (taxones)– Nomenclatura

• Identificación– Caracterización por número limitado de tests

adecuados al problema– Comparación con spp conocidas– Asignación a una sp– No identificado: estudio taxonómico

• unidad taxonómica básica• grupo de cepas que tiene un alto grado de similitud

en sus propiedades y que difieren en formasignificativa de otros grupos de cepas

• Cepa: población de organismos que desciende de unúnico organismo

ESPECIE

• Concepto en revisión continua

ESPECIE BACTERIANA

• Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinaciónde características fenotípicas y genómicas)

• Definición metodológica estándar:- % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%

- ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2)

Longitud de onda (nm)

ADN simple hebra

ADN doble hebra

Abs

orba

ncia

220 260 300

Abs

. rel

ativ

a 26

0 nm

80 90 100temperatura (ºC)

Tm = 86ºC

ADN doble hebra

ADN simple hebra

desnaturalización

Tm: punto mediodel perfil dedesnaturalizacióntérmica de ADN-ADN o de ADN-ARN

Aumento deabsorbancia delADN a 260nm pordesnaturalizacion

Ensayo de reasociación de ADN-ADN para cepas a y b

Curvas de desnaturalización térmica de ADN homoduplexy heteroduplex

Taxones: Dominio

Phylum

Clase

Orden

Familia

Género

Especie

Sub-especie

importancia en estudiosclínicos y ecológicos

RANGOS TAXONOMICOS ENCLASIFICACION BACTERIANA

Sistema binomial de nomenclatura

(Linneo)

Escherichia coli

Escherichia coli o E. coli

Dominio Phylum Clase Orden Familia Genero Especie

Bacteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Zymobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Escherichia Escherichia coliEscherichia coli

• serovariedad o serotipo (antígenos distintos)

• fagovariedad (tipificación por fagos)

• biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas)

• patovariedad (patogenicidad)

• morfovariedad (diferencias morfológicas)

• genomovariedad (grupos con ADN similares)

Categorías de clasificacion a nivel de sub-especie (tipificación)

Variedades o tipos

Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology

1923 (1ed)-1994 (9ed)

Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed1984(vol 1)-1989(vol 4)

Bergey´s manual of Systematic Bacteriology 2a Ed2001(vol 1)

The Prokaryotes (http:/www.prokaryotes.com)

PUBLICACIONES

International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology (antes IJSB).Publicado por la Sociedad General de Microbiología

Otros: Applied and Environmental Microbiology,Systematic Applied Microbiology

COLECCIONES (cepas tipo y otras)ATCC (American Type Culture Collection)

DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZelkulturen, Colección alemana)

CIP (Colección del Instituto Pasteur, Francia)

Taxonomía bacteriana

CLÁSICA

• caracteres fenotípicos (morfología, nutrición,etc.)

• algunos genotípicos: % G+C, hibridación ADN-ADN

• ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)

Características fenotípicas clásicasde valor taxonómico

Morfología: forma, tamaño y tinción

Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo,aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos,fuentes alternativas de C, N y S

Movilidad: tipo y disposición de flagelos

Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidada antibióticos, patogenicidad

• Contenido G+C

% G+C = G + C x 100 G + C + A + T

determinación por gradiente de CsCl, desnaturalizacióntérmica o cromatografía

Amplio rango en procariotas: 20 al 80%Poca información para la caracterización taxonómica

criterio de exclusión: %GC > 3, probablemente especies diferentes %GC > 10, probablemente géneros diferentes

Características genotípicas clásicas

• Hibridación ADN-ADN

- depende de la secuencia completa del genoma - útil en organismos estrechamente relacionados

- determinación por: % hibridación de ADN1 - ADN2 Δ Tm del híbrido

- es el criterio actual de definición de especie

NUMÉRICA• Agrupación de unidades taxonómicas o taxones

por métodos numéricos• Se basa en un gran número de caracteres• Cada carácter tiene igual peso• La similitud es función de la proporción de

caracteres comunes

NUMÉRICA - caracteres fenotípicos (no menos de 60)

- coeficiente de semejanza = a + d .

a + b + c + d

a: número de caracteres positivos en ambas cepasb: número de caracteres positivos sólo en cepa 1c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2d: número de caracteres negativos en ambas cepas

Desventajas de una clasificación artificial

• No permite inferir propiedades• No permite comprender microorganismos

que no se han cultivado en el laboratorio• No permite estudiar el origen y evolución

de funciones celulares (resistencia aantibióticos, aerobiosis, fotosintesis)

Clasificación natural

Estructura los organismos en taxonescuyos miembros reflejan tanto como seaposible su naturaleza biológica.

Es ventajosa si además establecerelaciones evolutivas

POLIFÁSICA

Fenotípicos: - clásicos (morfología, nutrición, etc)- marcadores quimiotaxonómicos- perfil de proteínas totales y enzimas

Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S

Genotípicos: clásicos: % G+C hibridación DNA-DNA

nuevos: fingerprinting (ej. perfiles molecularespor restricción o amplificación de ADN)

Es la tendencia moderna. Consenso en laintegración de distintos tipos de caracteres:

Esquema de las técnicas e información más frecuente empleadas en lataxonomía polifásica (Vandamme et al., 1996).

Marcadores quimiotaxonómicos

Características

- análisis químico con equipamiento especializado

- no son universales, muy útiles dentro de algunosgrupos

- alto grado de discriminación

- presentes en distintas estructuras celulares

CARACTERES FENOTIPICOS

• Pared: peptidoglicanos en todas las bacterias salvo enPlanctomyces y Mycoplamas

• Membrana externa Gram negativos: lipopolisacáridos

• Membrana citoplasmática: acidos grasos (Fatty AcidMethyl Ester), ácidos micólicos en un grupo de bacteriasGram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoidesen bacterias fotótrofas anoxigénicas.

• Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas.

• Sistema fotosintético: bacterioclorofilas.

• Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gramnegativas

• Plantean hipótesis de evolución (determinarelaciones de parentesco entre las especies)

• Compara la secuencia de moléculas (cronómetrosevolutivos) y establece la relación entre ellas

• Las secuencias de las moléculas son el registrohistórico de la evolución

CARACTERES FILOGENETICOSCARACTERES FILOGENETICOS

PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO

– distribución universal (presente en todos losorganismos)

- función homóloga en todos los organismos- secuencias con zonas altamente conservada para

distancias evolutivas grandes (alineamiento) yalgunas zonas variables

- ausencia de transferencia horizontal- cantidad de informacion suficiente

•ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese)•Factor de Elongación Tu•Subunidad beta de ATPasa•RecA•Genes funcionales

Moléculas usadas para la determinaciónde relaciones filogenéticas deorganismos

ARNr en Procariotas

Nombre Tamaño Ubicación (nucleótidos)

5S 120 Subunidad mayor del ribosoma

16S 1500 Subunidad menor

23S 2900 Subunidad mayor

Arboles filogéneticos

Arboles filogenéticos

• Uso de programas para alinear secuencias yconstruir árboles filogenéticos

• Longitud de la línea entre organismos esproporcional a la distancia evolutiva

• Similitud de secuencias implica similitud enlos genes

Ejemplo de un árbol filogenético basado en el gen ARNr 16S. La barraindica la sustitución de 10 nucleótidos cada 100

• Estructura primaria: Dominios de conservación universal Regiones altamente variables Dominios de nivel intermedio de conservación,

con cambios de secuencia, pero conservación deestructura secundaria

• Estructura secundaria: Similar en todos los organismos Acotada por su función en la síntesis de

proteínas: función ancestral

Secuencia del ARNr 16S

Estructurasecundaria delARNr 16S de E. coliLíneas gruesas: dominiosde conservación universal

Líneas normales:dominios de conservaciónintermedia

Líneas punteadas:regiones hipervariables

ARBOL FILOGENETICO UNIVERSAL

Bacteria Archaea Eucarya

Peptidoglicano Sí No No

Lípidos Enl. ester Enl. eter Enl. ester

Ribosomas 70S 70S 80S

tRNA iniciador Formilme-

tionina

Metionina Metionina

Intrones en tRNA No Sí Sí

RNA polimerasa Una

(4 subun)

Varias

(8-12 subun)

Tres

(12-14 subun)

Ribosoma sensible a:

Toxina diftérica No Sensible Sensible

Cloranfenicol

Kanamicina

Estreptomicina

Sensible No No

Características diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya

Secuencias signaturas o firma en ARNr

Oligonucleótidos o bases presentes endeterminadas posiciones en ciertos gruposde organismosEjemplos:

AAACUCAAA (posición 910) en BacteriaCACACACCG (posición 1400) en Archaea

C (posición 47) en gamma-Protebacteria,Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos

Arbol del ARNr 16S

• Termofilia representada en los gruposmas profundos de Archaea y Bacteria

• Muchos de los linajes profundos sonanerobios o microaerofílicos

• Fotosíntesis basada en clorofilas:distribuida en varios linajes de Bacteria

Termofilia en todos los miembros de la rama

Termofilia en algunos miembros de la rama

Propiedades definidas genéticamente quehan cambiado poco

• Estructura de la pared celular:– peptidoglicano solo presente en Bacteria– Gram +: linaje filogenéticamente coherente

• Lípidos de membrana (ésteres o éteres)• Metanogénicos: todos pertenecen a uno de

los 4 linajes dentro de Archaea

Caracteres que confirman el árbol universalconstruido a partir del ARNr 16S

• Principales diferencias entre dominios Bacteria,Archaea y Eukarya

• Procariotas actuales mas cercanos al ancestrorelacionadas con las condiciones fisicoquímicas en elorigen de la vida: Aquifex y Methanopyrus(termofilia, anaerobiosis)

• Características de los Eukarya mas cercanos a losprocariotas: Giardia y Microsporidia

• Secuencias de otras moléculas, especialmente lasligadas a la replicacion, transcripción y traducción

Microsporidia y Giardia: carecen de mitocondria, son parásitos obligados,tienen genoma un poco mayor que los procariotas.

Caracteres similares en taxonesfilogenéticamente distantes

Chloroflexus y Chlorobium

ambos poseen clorosomas con similar función yestructura, pero diferentes centros de reacción

posibles explicaciones:

transferencia lateral

evolución independiente

el gen del ARNr 16S aportaría información limitada

Arbol del dominio Bacteria

DOMINIO BACTERIA

Actualmente con mas de 40 divisiones (phylum),algunas sin organismos cultivados (secuenciasambientales)

Phylum mejores caracterizados: Proteobacteria(α,β,γ,δ,ε), Gram positivos (LowGC y HighGC)

Origen de mitocondrias (phylum Proteobacteria) ycloroplastos (phylum Cyanobacteria)

Relación entre la definición de especiebacteriana y el análisis del gen ARNr 16S

En general se cumple:secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3%con el resto de las secuencias conocidas de bacteriasentonces el % de hibridación ADN-ADN es menor al 70%

especies diferentes

Definición especie: % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%

COMPLETAR IDENTIFICACIÓN DE CULTIVOS PUROS

ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO

Secuencia del gen ARNr 16S

Se emplea frecuentemente para:

ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA

IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA

> 3% < 3%

Diferencia de secuencia con la cepa mas similar

Alineamiento y corrección de la secuencia

Comparación con bases de secuencias(http://rdp.cme.msu.edu/html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)

NUEVA CEPA DE LAMISMA ESPECIE

< 70%

Hibridación ADN-ADN

pruebas fenotípicas

similaresdiferentes

> 70%

Confirmación conpruebas fenotípicas ygenotípicas diferentes

NUEVA ESPECIE

¿Por qué hay tanta diversidad entre losProcariotas (Archaea y Bacteria)?

• son ancestrales

• son ubicuos: ambientes extremos, parásitos osimbiontes de Eukarya

• representan la mayor diversidad de seres vivos,mucha de la cual esta aún inexplorada

Ejemplos de diversidad: estructura y función

• Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas)

• Membranas: diferente composición (Mycobacterium)

• Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter),formacion de hifas (Streptomyces)

• Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa)

• Diferenciacion celular: microcistos de Cyanobacterias,comportamiento social (Myxobacterias)

• Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio)

• Obtención de energía independiente del trasporte de electrones(fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación,ej.decarboxilasas en Oxalobacter formigenes

• Origen de la tierra 4600 millones de años

• Condiciones de la Tierra primitiva: CH4, CO2, N2 NH3y muy poco O2 (ambiente reductor). Trazas de FeS yH2S

• Temperatura > 100°C

• Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva(microfósiles: estromatolitos)

• Vida primitiva: ¿organismos con ARN? (sin ADN)

• Célula moderna: ADN ARN Proteína

• Origen de eucariotas: teoría endosimbiótica

ORIGEN DE LA VIDA