TAXONOMÍA Y CLASIFICACION DE BACTERIAS

Claudia EtchebehereCátedra de Microbiología

Facultad de Química y Facultad de Ciencias2008

• Brock, Biología de los microorganismos, 8a, 9a o 10a

ed. (Evolución microbiana y sistemática, Diversidad de Archaea y Bacteria)

• Prescott, Harley and Klein, Microbiología, cuarta edición. Capítulo 19).

BIBLIOGRAFÍA

TEMARIO

Taxonomía y concepto de especie en procariotas

Taxonomía clásica, numérica, molecular y polifásica

Caracteres fenotípicos: clásicos y quimiotaxonómicos

Caracteres genotípicos: clásicos y modernos (fingerprinting)

Filogenética: clasificación y relación evolutiva

gen del ARNr 16S, árbol filogenético y definición de dominos

Relación entre taxonomía clásica y filogenética.

Diversidad bacteriana. Ejemplos.

Identificación de una cepa

Taxos=estructuración u orden, nomos=ley

Comprende:

•Clasificación

estructura los organismos en grupos (taxones) en base a su similitud

•Nomenclatura

asigna nombres a los taxones

•Identificación

determina a que taxones pertenece un organismo que se aisló

TAXONOMÍA

¿Para que sirve clasificar los microorganismos?

Ordenar los conocimientos

Lenguaje común

Descubrir organismos no descriptos

Caracterizar aislamientos (por ejemplo patógenos)

Estudios evolutivos

TaxonomíaCaracterización exhaustivaAplicación de teoría y método de clasificaciónFormación de grupos taxonómicos (taxones)Nomenclatura

IdentificaciónCaracterización por número limitado de tests

adecuados al problemaComparación con spp conocidasAsignación a una spNo identificado: estudio taxonómico

Identificación de un aislamiento

Cultivo puroEstudios morfológicos (macro y micro, Gram)Estudios bioquímicos, enzimas vías de degradación, metabolismo, relación con el oxígeno.Comparación con cepas ya caracterizadasAsignación de especie

Definición de especie

Unidad taxonómica básica

Grupo de cepas que tiene un alto grado de similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de otros grupos de cepas

Cepa: población de organismos que desciende de un único organismo o de una sola célula

Definición en revisión continua

• Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas, genómicas y filogenéticas)

• En el futuro definición genómica de especie.

• Definición metodológica estándar: - % de hibridación ADN bacteria1-ADN bacteria2 > 70%

- ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2)

Definición de especie en Bacterias

Longitud de onda (nm)

ADN simple hebra

ADN doble hebra

Abs

orba

ncia

220 260 300

Abs

. rel

ativ

a 26

0 nm

80 90 100temperatura (ºC)

Tm = 86ºC

ADN doble hebra

ADN simple hebra

desnaturalización

Tm: punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADN-ADN o de ADN-ARN

Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion

Determinación del % de hibridación ADN-ADN

Cinéticas de desnaturalización térmica de ADN homoduplex y heteroduplex

Hibridación genómica como herramienta taxonómica

Taxones: Dominio

Phylum

Clase

Orden

Familia

Género

Especie

Sub-especie

importancia en estudios clínicos y ecológicos

RANGOS TAXONOMICOS EN CLASIFICACION BACTERIANA

Sistema binomial de nomenclatura

(Linneo)

Escherichia coli

Escherichia coli o E. coli

Nomenclatura

Dominio Phylum

Clase Orden

Familia Genero

Especie

BacteriaProteobacteria

Gamma ProteobacteriaZymobacteria

ChromatialesChromatiaceae

AllochromatiumAllochromatiumAllochromatium warmingiiwarmingii

Bacterias Gram negativasBacterias fotótrofas púrpuras

Bacterias púrpuras del azufre

Secuencia del gen 16S rRNA

Jerarquía taxonómica de la bacteria AllochromatiumAllochromatium warmingiiwarmingii

•serovariedad o serotipo (antígenos distintos)

•fagovariedad (tipificación por fagos)

•biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas)

•patovariedad (patogenicidad)

•morfovariedad (diferencias morfológicas)

•genomovariedad (grupos con ADN similares)

Categorías de clasificación a nivel de sub-especie (tipificación)

Variedades o tipos

Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology

1923 (1ed)-1994 (9ed)

Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed 1984(vol 1)-1989(vol 4)

Bergey´s manual of Systematic Bacteriology 2a Ed 2001-2005 (vol 1-vol 5)

The Prokaryotes (http:/www.prokaryotes.com)

Manuales de microorganismos

International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology (antes IJSB). Publicado por la Sociedad General de Microbiología

Otros: Applied and Environmental Microbiology, Systematic Applied Microbiology (validación del nombre)

PUBLICACIONES

COLECCIONES DE MICROORGANISMOS

(cepas tipo y otras)

ATCC (American Type Culture Collection)

DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZelkulturen, Colección alemana)

CIP (Colección del Instituto Pasteur, Francia)

www.straininfo.net

Taxonomía bacteriana

CLÁSICAcaracteres fenotípicos (morfología, nutrición, etc.)

% G+C

ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)

Morfología: forma, tamaño y tinción

Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo, aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos, fuentes alternativas de C, N y S

Movilidad: tipo y disposición de flagelos

Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad a antibióticos,patogenicidad

Características fenotípicas clásicas de valor taxonómico

Contenido G+C

% G+C = G + C x 100G + C + A + T

Determinación por gradiente de CsCl, desnaturalización térmica o cromatografía (HPLC)

Permite distinguir dos organismos, si tienen diferente % G+C entonces son de diferente especie (difieren mas del 10%)Si presentan similar G+C no se puede afirmar nada

Características genotípicas clásicas

Rangos de composición de bases de ADN

• Agrupación de unidades taxonómicas o taxones por métodos numéricos

• Se basa en un gran número de caracteres

• Cada carácter tiene igual peso

• La similitud es función de la proporción de caracteres comunes

TAXONOMÍA NUMÉRICA

- caracteres fenotípicos (no menos de 60)

- coeficiente de semejanza = a + d .

a + b + c + d

a: número de caracteres positivos en ambas cepasb: número de caracteres positivos sólo en cepa 1c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2d: número de caracteres negativos en ambas cepas

Se construyen matrices de semejanza y dendrogramas

TAXONOMÍA NUMÉRICA

Taxonomía molecular

Basada en el estudio de moléculas

Caracteres GenotípicosCaracteres GenotípicosHibridación ADN-ADN

Molecular fingerprinting (huella molecular)

Caracteres FenotípicosCaracteres FenotípicosQuimiotaxonomía. Biomarcadores: lipídicos (FAME), otros

- depende de la secuencia completa del genoma- útil en organismos estrechamente relacionados

- determinación por: % hibridación de ADN1 - ADN2Δ Tm del híbrido

- es el criterio actual de definición de especie

Hibridación ADN-ADN

• secuencias de ADN de un organismo son sometidas a la digestión con enzimas de restricción •resolución a nivel de sub-especie.

Molecular fingerprinting

Marcadores quimiotaxonómicos

Características

- análisis químico con equipamiento especializado

- no son universales, muy útiles dentro de algunos grupos

- alto grado de discriminación

- presentes en distintas estructuras celulares

CARACTERES FENOTIPICOS

- Pared: peptidoglicanos en Gram +

- Membrana externa Gram negativos:

-lipopolisacáridos

- Membrana citoplasmática:

-ácidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester),

-lípidos polares, ácidos micólicos en un grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas anoxigénicas.

- Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas.

- Sistema fotosintético: bacterioclorofilas.

- Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram negativas

Marcadores quimiotaxonómicos

Desventajas de una clasificación artificial

No permite inferir propiedades

No permite comprender microorganismos que no se han cultivado en el laboratorio

No permite estudiar el origen y evolución de funciones celulares (resistencia a antibióticos, aerobiosis, fotosíntesis)

Clasificación natural

Estructura los organismos en taxones cuyos miembros reflejan tanto como sea posible su naturaleza biológica.

Es ventajosa si además establece relaciones evolutivas

POLIFÁSICA

Fenotípicos:Fenotípicos: -clásicos (morfología, nutrición, etc)- moleculares (marcadores quimiotaxonómicos) - perfil de proteínas totales y enzimas

Filogenéticos:Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S

Genotípicos:Genotípicos: -clásicos: % G+C

- moleculares: hibridación DNA-DNA, fingerprinting(ej. Perfiles moleculares por restricción o amplificación de ADN)

Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres:

Taxonomía polifásica

CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA

CARACTERIZACIÓN TENIENDO EN CUENTA LA EVOLUCIÓN.

Bases de la filogenética molecular

El uso de secuencias moleculares para estudios filogenéticos se basa en la premisa que los cambios en las secuencias ocurren al azar y de un modo temporal-dependiente y que cierta proporción de éstos permanece fijo en las moléculas.

Plantean hipótesis de evolución (determina relaciones de parentesco entre las especies)

Compara la secuencia de moléculas (cronómetros evolutivos) y establece la relación entre ellas

Las secuencias de las moléculas son el registro histórico de la evolución

CARACTERES FILOGENETICOS

PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO

distribución universal (presente en todos los organismos)función homóloga en todos los organismoscapacidad de alinear secuencias con zonas altamente conservada para distancias evolutivas grandes (alineamiento) y algunas zonas variablesausencia de transferencia horizontalcantidad de información suficiente

•ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese)

•Subunidad beta de ATPasa

•RecA

• Factor de Elongación Tu

•Genes funcionales

Moléculas usadas para la determinación de relaciones filogenéticas de organismos

Nombre Tamaño Ubicación(nucleótidos)

5S 120 Subunidad mayor del ribosoma

16S 1500 Subunidad menor

23S 2900 Subunidad mayor

ARNrProcariotas

Estructura primaria:Dominios de conservación universal Regiones altamente variablesDominios de nivel intermedio de conservación, con

cambios de secuencia, pero conservación de estructura secundaria

Estructura secundaria:Similar en todos los organismosAcotada por su función en la síntesis de proteínas:

función ancestral

Secuencia del ARNr 16S

Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coliLíneas gruesas: dominios de conservación universal

Líneas normales: dominios de conservación intermedia

Líneas punteadas: regiones hipervariables

Un árbol filogenético es una hipótesis de relación evolutiva de un gen deducida a partir de la secuencia de ese gen en organismos que existen en el presente

Para construirlo se deben hacer suposiciones que siempre tienen una cuota importante de error, la cuestión es si esos errores invalidan o no la hipótesis filogenética resultante.

Árbol filogenético

¿Cómo se construye un árbol filogenético?

1-Extracción de ADN, PCR y secuencia

2-Alinear secuencias: determina que posiciones de las secuencias van a ser comparadas

Organismos secuencias ARN

A CGU AGA CCU GAC

B C CUU CCU AGA GCU GGC CAA

C C CAA GAC GUG GCA

D C CAU GCU AGA UGU GCC

Secuencia del organismo problema

secuencias obtenidas de la base de datos

Posicion mas conservada

Posiciones mas variables

Posiciones que van a ser comparadas

Árboles filogenéticos

Uso de programas para alinear secuencias y construir árboles filogenéticos (MEGA)

Longitud de la línea entre organismos es proporcional a la distancia evolutiva

Similitud de secuencias implica similitud en los genes

Secuencias sin alinear en programa Clustal IX

Secuencias alineadas en programa Clustal IX

Preparación de un árbol de distancias filogenéticas a partir del gen 16S ARN

Definición de especie bacteriana y el análisis del gen ARNr 16S

En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3%con el resto de las secuencias conocidas de bacteriasentonces el % de hibridación ADN-ADN es menor al 70%

especies diferentes

Definición especie: % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%

Relación entre la similitud de secuencias del 16S ARNr y la hibridización genómica de ADN entre pares de organismos.

ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA

> 3% < 3%

Diferencia de secuencia con la cepa mas similar

Alineamiento y corrección de la secuencia

Comparación con bases de secuencias(http://rdp.cme.msu.edu/html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)

NUEVA CEPA DE LA MISMA ESPECIE

< 70%

Hibridación ADN-ADN

pruebas fenotípicas

similaresdiferentes

> 70%

Confirmación con pruebas fenotípicas y genotípicas diferentes

NUEVA ESPECIE

Caracterización de especies “nuevas”

Secuencias signaturas o firma en ARNr

•Oligonucleótidos o bases presentes en determinadas posiciones en ciertos grupos de organismos•Ejemplos:

•AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria

•CACACACCG (posición 1400) en Archaea

•C (posición 47) en gamma-Protebacteria, Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos

COMPLETAR IDENTIFICACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE CULTIVOS PUROS

Secuencia del gen ARNr 16S

Se emplea frecuentemente para:

ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO

DESCRIPCIÓN DE BACTERIAS NO CULTIVADAS: “Candidatus”

METODOS RÁPIDOS DE CARACTERIZACIÓN Y CUANTIFICACION.

ESTUDIO DE COMUNIDADES MICROBIANAS

Amplificación y clonado del gen del ARNr de 16S para su posterior secuencia

DNA ambiental

PCR gen especifica

Gen amplificado de los microorganismos A y B

A B

Ligación de fragmentos de interés en el vector de clonado

Plásmidos con inserto

Transformación de cepas E. coli

Seleccion y análisis de clones por: RFLP, secuenciado, etc.

MICROORGANISMOS NO CULTIVADOS

FISH: Fluorescence in situ hybridisation

muestra

Fijacionpermeabilizacion

Fijacion

Celulas hibridadas

Lavado

sonda fluoróforo

blanco (rRNA)

Hibridación Ribosomas

Sondas de oligonucleotido fluorescentes

Deteccion

Microscopio deEpifluorescencia

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ÁRBOL FILOGENÉTICO UNIVERSAL

Caracteres fenotípicos con valor filogenético diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya

Bacteria Archaea Eucarya

Peptidoglicano Sí No No

Lípidos Enl. ester Enl. eter Enl. ester

Ribosomas 70S 70S 80S

tRNA iniciador Formilme-tionina

Metionina Metionina

RNA polimerasa Una(4 subun)

Varias(8-12 subun)

Tres(12-14 subun)

Ribosoma sensible a:

Toxina diftérica No Sensible Sensible

Cloranfenicol

Kanamicina

Estreptomicina

Sensible No No

Operones Sí Sí No

Árbol del ARNr 16S

Termofilia representada en los grupos mas profundos de Archaea y Bacteria

Muchos de los linajes profundos son anerobioso microaerofílicos

Fotosíntesis basada en clorofilas: distribuida en varios linajes de Bacteria

ÁRBOL FILOGENÉTICO UNIVERSAL

Termofilia en todos los miembros de la ramaTermofilia en algunos miembros de la rama

Caracteres que confirman el árbol universal construido a partir del ARNr 16S

• Principales diferencias entre dominios Bacteria, Archaea y Eukarya

• Procariotas actuales mas cercanos al ancestro relacionadas con las condiciones fisicoquímicas en el origen de la vida: Aquifex y Methanopyrus (termofilia, anaerobiosis)

• Características de los Eukarya mas cercanos a los procariotas: Giardia y Microsporidia

• Secuencias de otras moléculas, especialmente las ligadas a la replicación, transcripción y traducción

Caracteres similares en taxones filogenéticamente distantes

Chloroflexus y Chlorobium (pertenecen a divisiones muy alejadas entre sí) FotótrofosFotótrofos anoxigénicosanoxigénicos

Representantes de ambos géneros poseen clorosomascon similar función y estructura

posibles explicaciones:

transferencia lateral

evolución independiente

el gen del ARNr 16S aportaría información limitada

Árbol del Dominio Bacteria

Actualmente con mas de 50 divisiones (phylum), algunas sin organismos cultivados (secuencias ambientales)

Mas de 400 géneros

Phylum mejores caracterizados:

Proteobacteria (α,β,γ,δ,ε) con 270 géneros

Gram positivos (LowGC y HighGC) con 170 géneros

DOMINIO BACTERIA

DOMINIO BACTERIA

AquifexAquifexBacterias autótrofas y termófilas

Bacterias verdes no del azufreBacterias verdes no del azufre (Chloroflexus)Algunas fotosíntesis anoxigénica, autotrofía por vía del hidroxipropionato

DeinococciDeinococciAltamente resistentes a la radiación (D. radiodurans)

Bacterias verdes del azufre Bacterias verdes del azufre ((Chlorobium))Fototrofos anoxigénicos, anaerobios estrictos, autotrofía por ciclo reverso del ácido cítrico

PlanctomycetesPlanctomycetes

Bacterias prostecadas, carecen de peptidoglicano, reproducción por gemación, compartimentalización celular (membrana nuclear),” annamox” fisiología única, “Candidatus”

CyanobacteriaCyanobacteriaBacterias unicelulares o filamentosas, Fotosíntesis oxigénica

DOMINIO BACTERIA

Gram positivos bajo GCG+C < 50%Géneros: Clostridium, Bacillus, Lactobacillus,

Streptococcus, StaphylococcusGram positivos alto GC

G+C > 50-55%Géneros: Actinomyces, Micrococcus, Mycobacterium

DOMINIO BACTERIA

PROTEOBACTERIASAlfa:metilótrofas y metanótrofas, oligotrofas, litótrofas(Nitrobacter), fij. N2, bacterias rojas no del S fotosínteticasBeta:litótrofas de NH3 (Nitrosomonas)Delta:Myxobacterias, Bdellovibrio, algunas sulfato reductoras

DOMINIO BACTERIA

Etapas en el ciclo celular de Hyphomicrobium

Ciclo de Myxobacterias

Ejemplos de diversidad:estructura y función

• Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas)

• Membranas: diferente composición (Mycobacterium)

• Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter), formación de hifas (Streptomyces)

• Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa)

• Diferenciación celular: microcistos de Cyanobacterias,comportamiento social (Myxobacterias)

• Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio)

• Obtención de energía independiente del trasporte de electrones (fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación, ej.:decarboxilasas en Oxalobacter formigenes

DOMINIO ARCHAEA

40 géneros3 linajes separados:

Euryarchaeota (halófilos y metanogénicos)Crenarchaeota (termófilos)Korarchaeota (solo secuencias ambientales)

Taxones definidos previamente coherentes filogenéticamente

Actinomycetes (High GC), Spirochetes, Cyanobacteria, Myxobacteria (δ Proteobacteria)

Caracteres filogenéticamente no valiosos para definir taxones superiores:Termofilia, fototrofía, tipo de movilidad,morfología compleja (helicoidal, gemación micelio, apéndices)

¿Por qué hay tanta diversidad entre los procariotas (Archaea y Bacteria)?

Son ancestrales

Son ubicuos: ambientes extremos, parásitos o simbiontes de Eukarya

Representan la mayor diversidad de seres vivos, mucha de la cual esta aún inexplorada

¿Cómo surge una nueva especie bacteriana?

Concepto polifásico de especie:Se define como un grupo de organismos individuales monofilético y genómicamente coherente que muestran un alto grado de similitud general en muchos caracteres independientes

Concepto ecotipo (Cohan, 2004):Se define como un subgrupo de un grupo bacteriano genómicamentecoherente que difiere genéticamente de otros subgrupos por adaptación a condiciones locales ecológicas.

Futuro cercano: incluir árboles filogenéticos derivados de las bases de datos proteómicas de modo de incluir los eventos de HGT en la identificación de las especies.

• Origen de la tierra 4600 millones de años

• Condiciones de la Tierra primitiva: CH4, CO2, N2 NH3 y muy poco O2 (ambiente reductor). Trazas de FeS y H2S

• Temperatura > 100°C

• Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva (microfósiles: estromatolitos)

• Vida primitiva: ¿organismos con ARN? (sin ADN)

• Célula moderna: ADN ARN Proteína

ORIGEN DE LA VIDA

Estromatolitos