taxonomía molecular del clado central del género
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Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología Evolutiva Departamento de Microbiología y Ecología
Colección Española de Cultivos Tipo
Taxonomía molecular
del clado central del género Vibrio y otras Vibrionaceae
Francisco Javier Pascual Martínez
Tesis Doctoral
Valencia, 2010
Dra. María Jesús Pujalte Domarco, Profesora Titular del
Departamento de Microbiología y Ecología de la Universidad de
Valencia,
Dr. David Ruiz Arahal, Profesor Contratado Doctor del Departamento
de Microbiología y Ecología de la Universidad de Valencia, y
Dra. Mª Carmen Macián Rovira, Técnico Superior de Investigación de
la Colección Española de Cultivos Tipo de la Universidad de Valencia,
CERTIFICAN:
Que Francisco Javier Pascual Martínez, Licenciado en Ciencias
Biológicas por la Universidad de Valencia, ha realizado bajo su
dirección el trabajo titulado “Taxonomía molecular del clado central del
género Vibrio y otras Vibrionaceae”, que presenta para optar al grado
de Doctor en Ciencias Biológicas por la Universidad de Valencia.
Y para que conste, en el cumplimiento de la legislación vigente, firman
el presente certificado en Valencia, a 12 de febrero de 2010.
Mª Jesús Pujalte Domarco David Ruiz Arahal Mª Carmen Macián Rovira
A mi familia
AGRADECIMIENTOS Cuando una persona alcanza un sueño, es difícil expresar los
sentimientos que uno tiene en un papel, por ello me ha resultado muy complejo escribir esta parte de la Tesis. Son muchas las personas que, de una manera u otra, me han ayudado a alcanzar mi sueño, por ello quiero agradeceros a TODOS, todo lo que habéis hecho por mí.
En primer lugar quiero agradecer a Esperanza Garay la oportunidad que me dio para realizar esta Tesis Doctoral, así como a mis directores de Tesis, Mª Jesús Pujalte, David Ruiz Arahal y Mª Carmen Macián, quienes han confiando en mí desde un primer momento a pesar de mis defectos. Gracias por ayudarme a madurar como persona e investigador, así como por transmitirme la pasión por una rama de la ciencia que a mucha gente le resulta “aburrida” y “poco práctica” como es la taxonomía. Además, tengo que agradecerles toda la ayuda tanto moral como económica que me han ofrecido para poder continuar sumergido en un mundo tan poco valorado y remunerado como es el de la investigación. ¡Gracias de todo corazón!
A Teresa y Amparo, mis nuevas compañeras de trabajo, por ayudarme en todo lo que han podido en esta última fase de la Tesis. Trabajar en equipo siempre es más divertido y productivo.
Al resto del personal de la CECT por aceptarme desde un primer momento como un miembro más en su grupo de trabajo: Loly, Mª José, Bea, Laura, Chemi, Rosa, Ana, Mapy, Inma, María, Nicolás y Adrián.
A todas las colaboradoras que me han ayudado en el trabajo “sucio” del laboratorio: Inma, Ele, Helena, Mamen, Violeta, Sergio, Mapy y Ana.
A todo el Departamento de Microbiología y Ecología de la Universidad de Valencia, tanto becarios como profesores. Puesto que son muchos los componentes del Departamento, detallar todos los nombres resultaría muy extenso. Sin embargo, creo que debo de resaltar el nombre de aquellas personas que SIEMPRE han estado cerca de mí: Celia, Paco Roig, Amparo, Ricardo, David, Mariola, Sonia, Eva, Alberto, Alex, Agnés, Paco Valle, Ángel y Rosario. ¡Gracias por estar ahí siempre que os he necesitado!
A todo el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela (mi segunda familia dentro del mundo de la investigación) por tratarme como en casa durante mi estancia en Santiago. Lo mejor que me traje de esa estancia fue la gran amistad que actualmente nos une: Jesús, Sabela, Ale, Mary, Alicia, Juan, Roxana, Susana, Carmen, etc.
A toda la gente del “Istituto di Chimica Biomolecolare-CNR”, tanto napolitana como “extranjera”, por todos los buenos momentos que pasamos juntos, ofreciéndome su amistad y ayuda en todo momento: Agata, Ida, Susi, Eduardo, Mónica, Giusi, Laura, Ilaria, Roberto, Andrea, Nadia, Dolores, Laura, Markus, Stell, Olimpia y Giuseppe. ¡Grazie mile!
A mis amigos “de siempre”, sin vosotros mi vida fuera de las paredes del laboratorio no tendría sentido, GRACIAS por estar ahí: Loren, Queco, Sandra, Bea, Loli, Emilio, Silvia, David, Fran, Isa, Ana, Andres, Rebeca y Laura.
A mis abuelos y tíos por no olvidarse de mí en ningún momento.
En último lugar, quiero agradecérselo a mi FAMILIA: Papá, Mamá, Iván, Natalia/Iván “junior” (mi futura sobrina/o), gracias por TODO lo que habéis hecho por mí. Estoy orgulloso de tener la familia que tengo. A pesar de las barreras que nos ha puesto la vida, juntos siempre hemos salido hacia delante y esta Tesis es una muestra de ello. ¡Veis, todos los sueños son posibles!
Publicaciones
Relación de publicaciones derivadas de la presente Tesis Doctoral
Pascual, J., Macián, M. C., Arahal, D. R., Garay, E. y Pujalte, M. J. (2009). Description of Enterovibrio nigricans sp. nov., reclassification of Vibrio calviensis as Enterovibrio calviensis comb. nov. and emended description of the genus Enterovibrio Thompson et al. 2002. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 59, 698-704.
Pascual, J., Macián, M. C., Arahal, D. R., Garay, E. y Pujalte, M. J. (2010). Multilocus Sequence Analysis of the central clade of the genus Vibrio by using 16S rRNA, recA, pyrH, rpoD, gyrB, rctB, and toxR genes. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 60, 154-165.
INDICE
Introducción ............................................................................. 1
Taxonomía de Procariotas ......................................................................... 1 1. Definición y concepto ............................................................................... 1 2. Historia de la taxonomía procariota ......................................................... 2 3. Caracteres y metodologías utilizados ....................................................... 5 3.1. Caracterización fenotípica ................................................................... 6 3.1.1. Generalidades ............................................................................... 6 3.1.2. Quimiotaxonomía .......................................................................... 7
3.2. Caracterización genómica ................................................................... 8 3.2.1. Composición global de bases del genoma .................................... 9 3.2.2. Hibridación DNA‐DNA ................................................................... 9 3.2.3. Técnicas de tipificación genético‐molecular ............................... 11 3.2.4. Análisis de secuencias nucleotídicas ........................................... 15
4. Efecto de los mecanismos de evolución molecular en la taxonomía ..... 25 5. La especie procariota .............................................................................. 26
Taxonomía de vibrios .............................................................................. 33 1. Historia del género Vibrio ....................................................................... 33 2. La familia Vibrionaceae ........................................................................... 33 3. El género Vibrio ....................................................................................... 35 4. El clado central del género Vibrio ........................................................... 37 5. El género Enterovibrio ............................................................................. 46
Objetivos y Plan de Trabajo .................................................... 49
Material y Métodos ................................................................ 53
1. Cepas bacterianas, condiciones de cultivo y conservación .................... 55
2. Caracterización morfológica, bioquímica, fisiológica y quimiotaxonómica ............................................................................................................... 59
3. Caracterización genético‐molecular ..................................................... 63 3.1. Extracción, purificación y cuantificación del DNA genómico ............... 63 3.2. Técnicas de tipificación molecular: fingerprinting ............................... 64 3.2.1. Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) .............................. 64 3.2.2. Repetitive Extragenic Palindromic‐PCR (Rep‐PCR) ......................... 65 3.2.3. 16S‐23S rRNA Intergenic Spacer Region PCR (ISR‐PCR) .................. 65
3.2.4. Análisis de los perfiles electroforéticos .......................................... 65 3.3. Análisis multigénico (MLSA) ................................................................. 68 3.3.1. Amplificación y secuenciación de los genes ................................... 68 3.3.2. Detección de los eventos de recombinación ................................. 69 3.3.3. Análisis filogenético ....................................................................... 70
4. Hibridación DNA‐DNA .......................................................................... 71 4.1. Marcaje del DNA .................................................................................. 71 4.2. Hibridación DNA‐DNA .......................................................................... 71 4.3. Revelado y detección del DNA eluido .................................................. 73 4.4. Tratamiento de los datos de hibridación DNA‐DNA ............................ 74
5. Análisis de correlación ......................................................................... 74
Resultados y Discusión ............................................................ 77
1. Técnicas de tipificación molecular ........................................................ 79
2. Multilocus Sequence Analysis ............................................................. 105
3. Validación de las técnicas .................................................................. 151
4. Taxonomía del género Enterovibrio ................................................... 165
Conclusiones ......................................................................... 189
Bibliografía ............................................................................ 193
Tablas suplementarias ........................................................... 213
Anexos .................................................................................. 217
Glosario de Tablas y Figuras .................................................. 225
Abreviaturas
AAI Average amino acid identity (Identidad aminoacídica media) AIC Akaike information criterion ANI Average nucleotide identity (Identidad nucleotídica media) ADH Arginina dihidrolasa ASW Artificial sea water (Agua de mar artificial) BM Basal medium (Medio basal) BR Binding ratio (Tasa de unión) BSA Bovine serum albumin (Seroalbúmina bovina) CAIM Collection of Aquatic Important Microorganisms (Colección
de microorganismos de importancia en acuicultura) CECT Colección Española de Cultivos Tipo dATP Desoxiadenina trifosfato dCTP Desoxicitosina trifosfato dGTP Desoxiguanina trifosfato dNTPs Desoxinucleótidos trifosfato DNA Ácido desoxirribonucleico DO Densidad óptica DS Double strand (cadena doble) DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
(Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares)
dTTP Desoxitimidina trifosfato dUTP Desoxiuracilo trifosfato EDTA Ácido etilendiaminotetraacético sal disódica 2-hidrato
(Na2EDTA·2H2O) EEO Electroendósmosis ISR-PCR Intergenic spacer region-PCR (Amplificación de regiones
espaciadoras intergénicas) K2P Kimura 2 parámetros LDC Lisina descarboxilasa MA Marine agar (Agar marino) MB Marine broth (Caldo marino) MLSA Multilocus sequence analysis (Análisis de secuencias
multigénicas) MLST Multilocus sequence typing (Tipado de secuencias
multigénicas) ML Maximum likelihood (Máxima verosimilitud) MP Máxima parsimonia
NJ Neighbour joining ODC Ornitina descarboxilasa OTUs Operational taxonomic units (Unidades taxonómicas
operativas) pb Pares de bases PB Phosphate buffer (Tampón fosfato) PBS Phosphate-buffered Saline (Tampón fosfato salino) PCR Polymerase chain reaction (Reacción en cadena de la
polimerasa) p/v Peso/Volumen RAPD Random amplified polymorphic DNA (Polimorfismo de
productos de amplificación con cebadores arbitrarios) RBR Relative binding ratio (Tasa de unión relativa) RDP Ribosomal database project (Proyecto de base de datos
ribosómicos). Rep PCR Repetitive extragenic palindromic PCR (Amplificación de
fragmentos palindrómicos repetitivos extragénicos) RNAsa Ribonucleasa rpm Revoluciones por minuto sp Especie SDS Sodium dodecyl sulfate (Dodecil sulfato sódico) SS Single strand (Cadena simple) SSC Saline sodium citrate (Citrato sódico salino) T Cepa tipo TBE Tris-borato-EDTA TCBS Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar (Agar tiosulfato-
citrato-sales biliares-sacarosa) THG Transferencia horizontal de genes Tm Melting temperature (Temperatura de fusión) Tris-HCl Tris-hydroximethil-aminomethane hydrochloride (Clorhidrato
de Tris-hidroximetil-aminometano) TSA Trypticase Soy Agar (Agar tripticasa de soja) UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean
(Método de agrupamiento por pares no ponderados con media aritmética)
UV Luz ultravioleta v/v volumen/volumen VP Voges-Proskauer
Introducción
Introducción
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Taxonomía de Procariotas
1. Definición y concepto La taxonomía procariota se define como el estudio teórico de la clasificación de las bacterias en sentido amplio, esto es, la organización de las mismas en grupos o taxones. Habitualmente se emplea el término taxonomía como sinónimo de clasificación, pero la clasificación es una parte de la taxonomía junto con otros dos aspectos, la identificación y la nomenclatura. La clasificación es una manera de resumir y catalogar información de los microorganismos con el fin de agrupar éstos en grupos (que pueden mostrar o no relaciones evolutivas) y permite asignar nuevos aislados a grupos ya establecidos. La identificación, es el proceso por el cual un organismo desconocido se asigna a un taxón previamente descrito y la nomenclatura es el proceso de asignar nombre a los taxones, siendo ésta la única parte de la taxonomía que está reglamentada. Algunos autores también consideran la sistemática como sinónimo de la taxonomía, aunque en realidad la sistemática tiene un carácter más general, que incluye la evolución, ecología, bioquímica, genética, patología, biología molecular, etc. de los grupos.
La clasificación en bacteriología se basa en el grado de relación o similitud entre los microorganismos, es decir en las propiedades compartidas entre los mismos. Se puede hablar de:
a. Clasificaciones artificiales. Se hacen con un propósito especial. Por ejemplo las clasificaciones de microorganismos patógenos o de importancia industrial.
b. Clasificaciones naturales. Se basan en las relaciones entre microorganismos atendiendo a su similitud global, y teniendo en cuenta a todas las bacterias y todos los aspectos conocidos de las mismas, desde su estructura molecular al hábitat, pasando por su fisiología entre otros. Las clasificaciones naturales pueden ser fenéticas o cladísticas. En las clasificaciones naturales fenéticas, los organismos se organizan en grupos llamados fenones, representándose los resultados en forma de dendrogramas. En ocasiones, la clasificación natural se basa en relaciones cladísticas, esto es, las relaciones evolutivas entre los microorganismos. Generalmente, en bacterias estas relaciones se establecen a partir del análisis comparativo de secuencias génicas
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homólogas, como es el gen que codifica el 16S rRNA. Este tipo de análisis se basa en la existencia previa de un modelo de evolución de caracteres homólogos que actúan como un reloj molecular. El resultado se muestra en un cladograma que representa la filogenia de los microorganismos. Sin ermbargo, no hay que olvidar que en realidad también estos análisis filogenéticos se basan en relaciones fenéticas, pues lo que se compara es la secuencia actual del gen y nada sabemos sobre las secuencias ancestrales de esos organismos.
2. Historia de la taxonomía procariota La taxonomía procariota es una disciplina reciente debido al tardío descubrimiento de los microorganismos por la imposibilidad de observarlos a simple vista. Fue A. van Leeuwenhoek quién observó por vez primera en 1676 microorganismos a los que denominó animalculi. Los posteriores microscopistas de los siglos XVII y XVIII continuaron observando y describiendo meticulosamente a los microorganismos, aunque no llegaron a establecer un sistema de clasificación. En aquella época, todos los procariotas eran considerados como una única especie de animalculi que podía presentar una gran variedad de formas (pleomorfismo). Fue a finales del siglo XVIII, cuando O. Mϋller estableció por primera vez un sistema de clasificación basado en las características morfológicas de los microorganismos. Estableció dos géneros, Monas y Vibrio que diferenciaba a las bacterias puntiformes de las elongadas, respectivamente. En los inicios del siglo XIX, C. Ehrenberg amplió la clasificación de Mϋller incluyendo bacterias helicoidales.
F. Cohn fue la primera persona que durante la década de 1870 estableció los rangos taxonómicos de especies y géneros en la clasificación procariota. Además, diseñó un sistema de clasificación compuesto por seis géneros basado también en un criterio morfológico. No obstante, señaló que una clasificación basada únicamente en un criterio morfológico no era adecuada, pues bacterias con similar morfología podían presentar marcadas diferencias fisiológicas.
Uno de los hitos más importantes fue el aislamiento de los microorganismos en cultivos puros, pues a partir de ese momento se pudo obtener información específica de cada microorganismo. En 1872, J. Schroeter, purificó por primera vez una bacteria cromogénica, y en 1878 Joseph Lister purificó el microorganismo causante del agriado de la leche. R. Koch en 1881 dio a conocer la técnica de cultivo en medio
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sólido de gelatina, y posteriormente de agar, comenzando de esta manera la edad de oro de la microbiología médica.
A finales del siglo XIX y durante las dos primeras décadas del siglo XX, se fueron desarrollando un gran número de nuevas pruebas fenotípicas que proporcionaron la base de un nuevo sistema de clasificación más complejo, basado en caracteres morfológicos, fisiológicos, metabólicos y de patogenicidad. Ello condujo a la descripción de un gran número de nuevas especies, fundamentalmente de importancia médica.
K. B. Lehman y R. Neumann publicaron en 1896 su Atlas und Grundniss der Bakterien donde describían varios nuevos géneros (Corynebacterium, Mycobacterium, Actinomyces). W. Migula, en 1897 recopiló en su Das System der Bakterien todas las bacterias que habían sido descritas hasta la fecha. También S. N. Winogradsky y M. W. Beijerinck describieron un gran número de nuevos géneros cuyos nombres tenían relación con la ecología, fisiología y bioquímica de los microorganismos. S. Orla-Jense, en su trabajo Die Hauptlinien des natϋrlichen Bakteriensystems (1909), diseñó un sistema de clasificación basado en las relaciones genealógicas entre los microorganismos que fue la base de la sistemática natural bacteriana.
Con el fin de ordenar la gran cantidad de información que se poseía de los microorganismos así como para integrar los distintos sistemas de clasificación existentes, R. E. Buchanan estableció en el periodo 1916-1918 un sistema de clasificación formal, como un consenso de los distintos sistemas de clasificación que se habían desarrollado hasta la fecha. Este sistema proporcionó la base para que D. H. Bergey posteriormente desarrollara en 1923 el Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology, una herramienta que en su momento fue una útil clave de identificación fenotípica fundamentalmente enfocada hacia bacterias de interés clínico. Con los años se fueron publicando diferentes ediciones con la información actualizada. La última edición (novena) se publicó en 1994. Además, entre 1984 y 1989 se publicó la primera edición del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, manual más enfocado a la clasificación que a la identificación, atendiendo a caracteres fenotípicos. En 2001, se publicó el primero de los cinco volúmenes de la segunda edición de dicho manual. Por primera vez presenta una organización filogenética en vez de por grupos funcionales, dando más relevancia a los aspectos ecológicos que la primera edición.
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Pero siguiendo la línea del tiempo, en 1941 R. Stanier y C. B. van Niel, destacaron la importancia de disponer de un sistema de clasificación natural aunque lo consideraban inalcanzable. Los intentos iniciales de establecer una clasificación natural fracasaron porque se carecía de información sobre las bases moleculares de la genética, desconocían los mecanismos hereditarios, y no se disponía de la capacidad técnica para estudiar la estructura de los genes y los cromosomas.
En la década de 1950 se impuso la taxonomía numérica en el mundo procariota como un tipo de análisis multivariante gracias al incipiente desarrollo de la informática. Esto permitió clasificar de manera objetiva un gran número de microorganismos manejando una gran cantidad de datos fisiológicos, bioquímicos y morfológicos.
Durante la década de 1960, los avances en el conocimiento del DNA y el desarrollo de nuevas técnicas moleculares, evidenciaron que la mejor manera de clasificar las bacterias era comparando los genomas bacterianos, puesto que las clasificaciones basadas en caracteres fenotípicos no necesariamente reflejaban las relaciones evolutivas. Primero se estudió el contenido de bases complementarias de los genomas (G+C mol%). Posteriormente se desarrolló la técnica de hibridación DNA-DNA aplicada a bacterias (Schildkraut y col., 1961; Brenner y col., 1969), que se convirtió y sigue siendo, en la técnica estándar para la circunscripción de las especies bacterianas.
En la década de los 70 se empezó a trabajar con las secuencias del rRNA, lo que supuso otro gran hito pues a partir de entonces se pudieron establecer de manera más precisa las relaciones evolutivas entre microorganismos distantes. En esa época se conocía que la secuencias aminoacídicas y nucleotídicas de determinados genes podían reflejar la evolución de los microorganismos, al poder actuar como relojes moleculares, como es el caso del citocromo c de los eucariotas. Se asume que dichas moléculas presentan una tasa de cambio constante durante la evolución, tomando valores similares en las distintas especies. Dichos relojes moleculares pueden evolucionar con distinta tasa, reflejando la evolución de los microorganismos a distintas escalas evolutivas. Según la teoría neutralista propuesta por M. Kimura, en los relojes moleculares la mayoría de las mutaciones son neutrales o negativas (por selección purificadora), siendo una pocas las mutaciones ventajosas, llevadas a termino por selección positiva
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(adaptativa) darwiniana. De esta manera, la mayoría de los cambios evolutivos se deben a la deriva genética de los genes mutantes selectivamente equivalentes. Una de las características que presentan los genes ribosomales como marcadores moleculares es que tienen distinta tasa de evolución a lo largo de sus secuencias, debido fundamentalmente a la estructura secundaria del RNA. El análisis de las secuencias del 16S y 18S rRNA ha permitido entre otras cosas revelar información desconocida hasta la fecha como el reconocimiento de las Archaeobacteria o Archaea como un linaje independiente de las Eubacteria o Bacteria, así como un importante reordenamiento del esquema de clasificación general procariota (Wheelis y col., 1992).
Actualmente se acepta que para obtener un sistema adecuado de clasificación de los procariotas, y principalmente en los rangos taxonómicos inferiores como son la especie y el género, es necesario una aproximación polifásica combinando tantas técnicas y tipos de datos diferentes como sea posible. Esto permite una circunscripción de la especie que toma en cuenta las diferentes propiedades de los diferentes grupos bacterianos (Vandamme y col., 1996; Goodfellow y col., 1997).
3. Caracteres y metodologías utilizados En los últimos años, la taxonomía procariota ha sufrido notables cambios al beneficiarse de los avances en Química, Biología Molecular e Informática. Actualmente, la taxonomía procariota se basa en estudios polifásicos en los que se aplica un amplio abanico de tipos de información que permiten analizar la variabilidad dentro y fuera de los taxones. De los microorganismos se pueden analizar dos tipos de información: información genómica y fenotípica. La información genómica se obtiene a partir del DNA, tanto directamente por secuenciación como indirectamente mediante parámetros tales como la hibridación DNA-DNA o el contenido de G+C mol % entre otros. Por otro lado, está la información fenotípica. El término fenotipo se refiere al modo en que se expresa un determinado genotipo bajo unas condiciones ambientales concretas, es decir, las características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas, entre otras, que son visibles y/o cuantificables. Muchas veces se utiliza el término genotipo como sinónimo de información genómica, sin embargo el genotipo es una parte de la información genómica. Un determinado tipo de información presenta un determinado poder de resolución, de manera que es
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esencial un uso correcto de la información para garantizar una correcta clasificación.
3.1. Caracterización fenotípica
3.1.1. Generalidades
Para generar sistemas de clasificación útiles, objetivos y robustos se necesita una integración de los caracteres genómicos y fenotípicos (Vandamme y col., 1996), de ahí la importancia de incluir pruebas fenotípicas clásicas en los esquemas de identificación, siendo además la base para la descripción formal de los taxones.
Los análisis fenotípicos incluyen, entre otras cosas, las características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de los microorganismos. Hay que tener en cuenta que la mayoría de los procariotas no poseen características morfológicas complejas ni presenta ciclos de vida con diferentes estadíos morfológicos. La reproducibilidad de los análisis fenotípicos inter- e intralaboratorio solo se consiguen usando pruebas estandarizadas (medio de cultivo, temperatura de incubación, etc.). Los análisis fenotípicos se pueden basar en metodologías convencionales, aunque cada vez existen más kits comerciales miniaturizados y automatizados destinados a grupos específicos de microorganismos.
Los datos fenotípicos, al igual que los genómicos, se pueden analizar fenéticamente (taxonomía numérica) comparando un conjunto de caracteres independientes, co-variables y de igual peso, los cuales no necesariamente están presentes de manera universal en todos los taxones. Esta comparación refleja el grado de similitud entre los OTUs, aunque no necesariamente las relaciones evolutivas (Sneath, 1989a). Los caracteres individuales fenotípicos, de manera general no tienen suficiente capacidad para resolver las relaciones evolutivas; sin embargo, un análisis fenético basado en caracteres fenotípicos sí que puede proporcionar una base para establecer clasificaciones cladísticas.
Es difícil realizar análisis cladísticos utilizando únicamente datos fenotípicos puesto que los procariotas carecen de desarrollo ontogénico (anatomía comparada) y el registro fósil existente es prácticamente nulo. Esto imposibilita distinguir entre los caracteres sinapomórficos (homología derivada compartida, descendencia a partir
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de un ancestro común reciente), simplesiomóficos (homología ancestral compartida, descendencia a partir de un ancestro lejano) y los caracteres análogos (homoplasia, convergencia evolutiva). Los caracteres sinapomórficos son los únicos válidos para establecer relaciones filogenéticas, pero para poder distinguir unos de otros se requiere conocer el o los genes responsables de dicho carácter fenotípico.
Según los caracteres fenotípicos incluidos en el estudio fenético, los resultados pueden no ser congruentes entre sí. Además, hay que tener en cuenta que el fenotipo no refleja toda la información genómica que contiene un microorganismo. Todos estos problemas se pueden minimizar incluyendo en el análisis fenético la mayor cantidad posible de caracteres.
Por otro lado, otra finalidad de las caracterizaciones fenotípicas es la creación de un marco que permita una correcta identificación de los microorganismos. Este marco puede consistir en (i) claves dicotómicas de identificación donde la identificación de un aislado se realiza de manera ordenada mediante una serie de cuestiones o (ii) en tablas diagnósticas, siendo éstas las más frecuentes en Microbiología al poseer más información y ser mucho más útiles (Trüper y Schleifer, 1992). Las tablas diagnósticas consisten en la agrupación de taxones que comparten un conjunto de caracteres característicos e identificativos (Wayne y col., 1987). El éxito en la identificación de nuevos aislados depende de cómo de buena sea la descripción de las especies así como del número de cepas pertenecientes a cada especie incluidas en la base de datos.
3.1.2. Quimiotaxonomía
El término quimiotaxonomía hace referencia a la aplicación de métodos analíticos para obtener información de los constituyentes químicos de las células con fines taxonómicos. Aunque muchas veces es tratada de manera independiente, la quimiotaxonomía debe de ser considerada como otro tipo de análisis fenotípico puesto que los parámetros estudiados, a excepción del G+C mol%, son un reflejo directo de la expresión de la información genómica de un organismo bajo unas condiciones ambientales. Puesto que la expresión de muchos de los componentes celulares puede variar según las condiciones ambientales, cuando se realiza un análisis
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quimiotaxonómico es necesario estandarizar las condiciones de cultivo. De este modo, la variación en los constituyentes celulares dependerá únicamente de las diferencias genéticas. Esto es muy importante sobre todo en los estudios que implican análisis cuantitativos de los datos químicos (Goodfellow y O´Donnell, 1993). Tal y como ocurre con otros datos fenotípicos y genómicos, hay datos quimiotaxonómicos que han sido utilizados en un amplio número de bacterias mientras que otros componentes quimiotaxonómicos son tan específicos que su análisis se restringe a un taxón particular. De manera general, los análisis quimiotaxonómicos permiten diferenciar entre rangos taxonómicos altos, por encima de la especie.
Los marcadores quimiotaxonómicos normalmente tienen un carácter de exclusión entre taxones y no de inclusión, aunque existen excepciones. Algunos análisis quimiotaxonómicos son: (i) contenido en G+C mol%; (ii) lípidos polares; (iii) ácidos grasos; (iv) quinonas isoprenoides; (v) pigmentos (bacterioclorofila, carotenoides, etc.); (vi) peptidoglicano; (vii) ácidos teicoicos; (viii) poliaminas, etc. El análisis de otros componentes celulares obtenidos mediante serotipado, fagotipado y perfiles electroforéticos de proteínas y lipopolisacaridos, también ha sido ampliamente utilizado en estudios de tipificación bacteriana.
3.2. Caracterización genómica
Debido al espectacular avance metodológico que se ha producido en los últimos años, las técnicas utilizadas para obtener la información genómica se han impuesto hasta el punto de resultar imprescindibles en los estudios de taxonomía. Estas técnicas se basan en el estudio de las moléculas de DNA o RNA que contienen los microorganismos y que permiten establecer relaciones genómicas entre los mismos (Vandamme y col., 1996). Todos los microorganismos poseen información genómica y a diferencia de lo que sucede con la información fenotípica, las condiciones ambientales únicamente pueden influir en la concentración de las moléculas de DNA o RNA y no en su composición.
El máximo poder de resolución que se puede alcanzar con la información genética es la secuenciación del genoma completo y su análisis funcional. A 1 de diciembre de 2009, el numero de genomas procariotas secuenciados es de 856 (800 bacterias y 56 arqueas) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes); no obstante, la secuenciación
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de genomas bacterianos completos de forma rutinaria no es factible todavía, debido a las dificultades técnicas y al elevado coste económico. Por ello, se utilizan aproximaciones alternativas que permiten estudiar de manera indirecta la información genómica:
-Composición global de bases del DNA genómico. -Hibridación DNA-DNA. -Técnicas de tipificación molecular. -Análisis de secuencias génicas.
3.2.1. Composición global de bases del genoma La composición de bases de una molécula de DNA se puede definir como la abundancia relativa de los nucleótidos guanina y citosina en dicha molécula:
G CA T C Gx 100 mol%
Ésta fue la primera técnica basada en ácidos nucleicos aplicada en taxonomía. Normalmente se utiliza en la descripción de nuevas especies y géneros, al permitir diferenciar entre cepas fenotípicamente similares pero diferentes genómicamente (Goodfellow y O´Donnell, 1993).
El contenido de G+C puede variar entre 24 y 76 mol% en los genomas procariotas (Tamaoka, 1994; Vandamme y col., 1996). A mayor divergencia en el contenido de G+C mol% entre dos microorganismos, menor relación entre ellos. Empíricamente, se ha demostrado que microorganismos que difieren en más de un 10 mol%, no pertenecen a un mismo género, y si difieren en más de un 5 mol% pertenecen a especies distintas (Vandamme y col., 1996). Hay que tener en cuenta que el contenido de G+C mol% no tiene en cuenta la secuencia lineal de bases en el DNA, y valores próximos en el contenido de G+C mol% entre dos microorganismos no necesariamente indican que exista una estrecha relación entre ellos. Por lo tanto este criterio sólo puede ser utilizado de modo excluyente.
3.2.2. Hibridación DNA-DNA
El análisis de la hibridación DNA-DNA de los genomas es hasta la fecha la técnica estándar para delimitar la especie procariota. Una característica del DNA de doble cadena es su capacidad de
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reasociación o hibridación tras ser desnaturalizado. Las cadenas complementarias (homólogas o heterólogas) pueden, bajo unas condiciones experimentales adecuadas, reasociarse hasta formar de nuevo la estructura dúplex nativa en función de la similitud de sus secuencias nucleotídicas. Esta técnica genera una medida indirecta del grado de similitud de secuencia genómica a nivel de la estructura primaria entre parejas de genomas, expresándolo normalmente como % de reasociación o de hibridación (Goodfellow y O'Donnell, 1993), siendo la aproximación más aceptada en taxonomía procariota para establecer relaciones genómicas entre microorganismos (Wayne y col., 1987). No existe una correlación lineal entre la similitud de las secuencias (estructura primaria) y los valores de hibridación, por lo que el término homología debe de ser obviado al referirse a los valores de hibridación (Stackebrandt y Goebel, 1994). No obstante a mayor similitud genómica, mayor reasociación DNA-DNA y por consiguiente más emparentados están los microorganismos.
El proceso de hibridación DNA-DNA se puede medir mediante dos parámetros: (i) la tasa relativa de unión o relative binding ratio (RBR) y (ii) la diferencia en el punto medio de la curva de desnaturalización térmica entre DNAs homodúplex y heterodúplex (∆Tm). El RBR refleja la proporción relativa de hibridación entre DNAs heterólogos en comparación con la hibridación obtenida entre DNAs homólogos, asumiendo que los valores de hibridación obtenidos con el homodúplex representan el 100% de reasociación. La desnaturalización del DNA de doble cadena depende básicamente del contenido en G+C (mol%), de la fuerza iónica de la solución en el que está disuelto el DNA y de la temperatura. En una curva de desnaturalización térmica de un DNA de doble cadena, la temperatura a la que el 50% de las cadenas están desnaturalizadas, es lo que se conoce como punto medio de desnaturalización térmica o melting temperature (Tm). En la medida en que los DNAs heterodúplex tienen menos apareamientos de bases que los DNAs homodúplex, serán menos estables, de manera que en una curva de desnaturalización la Tm se alcanza a una menor temperatura. En este caso, el parámetro utilizado para medir el grado de reasociación DNA-DNA es el ∆Tm entre la Tm de DNAs homodúplex y la Tm de los DNAs heterodúplex. Aunque no existe una conversión directa entre los parámetros RBR y el ∆Tm ambos están correlacionados y pueden ser utilizados independientemente para la circunscripción de especie bacteriana (Johnson, 1989). A diferencia de la RBR, el
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resultado del ∆Tm es independiente de la metodología utilizada para realizar la hibridación y además, el valor no tiene que ser relativizado. Por el contrario, cuando se comparan valores de hibridación DNA-DNA basados en la RBR, es importante tener en cuenta la metodología seguida pues el resultado puede variar (Grimont y col., 1980).
Para que se forme un heterodúplex, incluso bajo condiciones no restrictivas de hibridación, es necesario que las secuencias heterólogas muestren como mínimo un 80% de complementariedad. De este modo, un rango de similitud entre secuencias del 80 al 100% se expande a un rango de valores de hibridación DNA-DNA entre el 0% y el 100% (Goodfellow y O´Donnell, 1993; Roselló-Móra y Amann, 2001).
Hay que considerar que los estudios de hibridación DNA-DNA son laboriosos y costosos, y que se basan en comparaciones de parejas de DNA homólogos y heterólogos. Esto hace que por norma general, los experimentos se realicen con pocos microorganismos (Hartford y Sneath, 1988). Además, no se puede crear una base de datos escalable de manera similar a la de las secuencias nucleotídicas pues los resultados son por parejas de microorganismos y porque la reproducibilidad de los resultados depende de la metodología empleada. A pesar de estos problemas, las ventajas de la hibridación DNA-DNA sobrepasan sus limitaciones pues es una medida de la similitud genómica que puede ser aplicada a todos los procariotas cultivables para delimitar la especie procariota (Goodfellow y col., 1997).
3.2.3. Técnicas de tipificación genético-molecular
Las técnicas de tipificación genético-molecular permiten detectar de manera indirecta diferencias en los genomas procariotas o en fragmentos específicos de los mismos. Éstas pueden variar en su poder de resolución y reproducibilidad y pueden ser utilizadas para analizar la diversidad inter- y/o intraespecies, pudiendo incluso reflejar en algunos casos las relaciones evolutivas. Muchas de éstas técnicas también han sido utilizadas en estudios epidemiológicos. En la actualidad, existe un gran número de técnicas de tipificación molecular a disposición de la comunidad científica, algunas de las más relevantes son:
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Esta técnica consta de cuatro pasos: (i) digestión total del DNA genómico con una o
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más enzimas de restricción y posterior unión de unos adaptadores en los sitios de restricción generados; (ii) amplificación selectiva de los fragmentos generados utilizando dos cebadores que se unen específicamente a las secuencias de los adaptadores y los sitios de restricción; (iii) separación de los productos de PCR mediante electroforesis en gel de poliacrilamida realizando una detección selectiva de los fragmentos amplificados mediante el uso de cebadores marcados con fluorescencia/radioactividad; (iv) finalmente se realiza un análisis numérico de los patrones de bandas generados. Esta técnica se caracteriza por producir patrones de bandas complejos, lo que le da un elevado poder de resolución. También es muy sensible y reproducible. Puede ser aplicada en taxones tanto filogenéticamente cercanos como distantes y muchas veces los grupos formados se corresponden con grupos de similitud DNA-DNA. También se ha utilizado en estudios de epidemiología. Sin embargo se ha comprobado empíricamente que es una técnica compleja, requiere de mucho tiempo y cara (De Vos y col., 1995; Gómez-Gil y col., 2004).
RAPD (Random amplified polymorphic DNA) y Rep PCR (Repetitive extragenic palindromic PCR). El RAPD consiste en la amplificación de DNA usando cebadores de secuencia arbitraria. El Rep PCR consiste en amplificar fragmentos de DNA que se encuentran entre motivos de DNA repetitivos como por ejemplo la secuencia repetida en tándem (GTG)5. Éstas se utilizan como técnicas de tipificación inter- e intraespecífica pudiendo presentar una elevada correlación con los resultados de hibridación DNA-DNA. Ambas son técnicas rápidas, fáciles de realizar, de coste relativamente bajo y aplicadas muchas veces en estudios de epidemiología. Como inconveniente cabe destacar su baja reproducibilidad en algunos casos (Rodríguez y col., 2006; Gómez-Gil y col., 2004).
RFLP (Restriction fragment length polymorphism). Consiste en la amplificación de determinados genes (16S rRNA, gyrB, rpoD, etc.) por PCR y su posterior fraccionamiento mediante enzimas de restricción obteniéndose de esta manera unos fragmentos de DNA que se separan mediante electroforesis. Se utiliza para clasificar e identificar especies y grupos subespecíficos. Es una técnica reproducible, cuyo poder de resolución puede variar según el gen (Urakawa y col., 1997; Chun y col., 2002).
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LFRFA (Low-frequency restriction fragment analysis). Se basa en la fragmentación del DNA genómico mediante enzimas de restricción de baja frecuencia de corte y posterior separación mediante electroforesis en campo pulsante (Tenover y col., 1995; Vandamme y col., 1996).
Ribotipado. Esta técnica se basa en el hecho de que las bacterias pueden diferir en el número y distribución de los operones de rRNA que poseen en su genoma, y consta de cinco pasos básicos: (i) fragmentación del cromosoma bacteriano con endonucleasas; (ii) separación de los fragmentos mediante electroforesis; (iii) transferencia de los fragmentos a una membrana de nylon; (iv) hibridación de los fragmentos con una sonda dirigida al rRNA marcada (químicamente); (v) detección mediante quioluminiscencia de las bandas. Finalmente, los patrones de bandas generados son analizados y comparados. Esta técnica permite la caracterización e identificación de los microorganismos tanto a nivel intra- como interespecífico. Se ha utilizado en estudios epidemiológicos así como en estudios de diversidad genómica de cepas ambientales. Su poder de resolución depende de las endonucleasas y sondas marcadas utilizadas (Ginard y col., 1997). Existe una plataforma comercial que permite realizar de manera automática todos los pasos del ribotipado llamada Riboprinter (DuPont-Qualicon, Wilmington, Delaware, USA).
Polimorfismo de tamaño de la 16S-23S ISR (Intergenic spacer region). Los genomas procariotas normalmente comprenden varias copias (2-14) del operón multigénico rRNA, pudiendo existir pequeñas diferencias en las secuencias primarias y en los tamaños entre copias dentro de un mismo genoma. La región espaciadora entre el 16S y el 23S rRNA al estar sometida a una menor presión de selección, posee mayor variabilidad que la propia secuencia del 16S rRNA. El estudio de la variabilidad de dichas secuencias se puede realizar por secuenciación directa, PCR o PCR-RFLP. Esta técnica es simple, económica y se utiliza para estudios de tipificación inter- e intraespecífica (Gürtler, 1999; Chenoll y col., 2003).
Los perfiles electroforéticos que se obtienen tras aplicar las técnicas descritas anteriormente deben de ser analizados con el fin de establecer la similitud entre los OTU´s. Este análisis se puede hacer manualmente en el caso de que los perfiles electroforéticos obtenidos sean simples/sencillos o bien con la ayuda de programas informáticos.
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Entre los programas aplicados para el análisis de las técnicas de fingerprinting destacan el BioNumerics y el GelCompar, ambos de Applied Maths. En el caso de utilizar un programa informático, el primer paso es procesar las imágenes de los geles electroforéticos. Consiste en convertir la imagen de 24-bit que se obtiene con el captador de imágenes en una imagen de 8-bits o también denominada en la escala de grises. Además se optimiza el brillo y contraste, y se elimina el ruido de fondo de la imagen. Posteriormente se determinan las carreras electroforéticas del gel y se realiza una normalización mediante marcadores de pesos moleculares incluidos en el gel. Las bandas de los marcadores de peso moleculares de cada gel se alinean respecto a un marcador de referencia, permitiendo de esta manera comparar carreras electroforéticas obtenidas en geles diferentes. Finalmente, se obtienen las matrices de similitud que permiten comparar los diferentes OTU´s entre sí mediante (i) el coeficiente de correlación de Pearson y/o (ii) el análisis basado en la presencia/ausencia de bandas. En el primer caso se analizan como un todo las curvas densitométricas de los perfiles electroforéticos. En el segundo caso, el análisis basado en la presencia/ausencia de bandas requiere determinar las distintas bandas presentes en cada una de las carreras. Una vez definidas se calcula la matriz de similitud mediante un coeficiente basado en caracteres binarios como son el coeficiente de Jaccard (divide el número de bandas presentes en ambas muestras por el número total de bandas) o el de Dice (igual que el de Jaccard, pero le da más peso a las bandas comunes) entre otros. Generalmente, se recomienda utilizar el coeficiente de Dice por el propio hecho de dar más peso a la presencia de bandas, no teniendo tanta relevancia las ausencias. El paso crítico a la hora de obtener una matriz de similitud es decidir si ésta debe ser obtenida analizando las curvas densitométricas o la presencia/ausencia de bandas. Ambas aproximaciones tienen ventajas y desventajas, de manera que se deben utilizar en base a la importancia que se le quiera dar a la intensidad de los amplicones. El análisis de las curvas densitométricas tiene en cuenta la intensidad de las bandas, siendo adecuado para realizar un rápido e inicial análisis y evita la tarea tosca y frecuentemente subjetiva de determinar las bandas, sin embargo es sensible al background de las imágenes. Normalmente se aplica en aquellas técnicas cuyo paso final previo a la separación electroforética es una amplificación de PCR (AFLP, Rep PCR, Eric PCR, RAPD, etc.) puesto que generan normalmente un gran número de bandas con diferentes intensidades. Por otro lado, el análisis de la
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presencia/ausencia de bandas se realiza en aquellas técnicas cuyo último paso previo a la separación electroforética es una restricción del material genético (RFLP, LFLP, etc.) y donde los fragmentos generados se encuentran en principio en cantidades equimolares. En este análisis se requiere determinar las bandas de manera visual o automática. Finalmente, tras obtener una matriz de similitud basada en la correlación de las curvas densitométrica o en la presencia/ausencia de bandas se procede a realizar el agrupamiento de los OTU´s mediante un algoritmo como por ejemplo UPGMA o Ward, obteniéndose de esta manera un dendrograma. Estos métodos se basan en un proceso repetitivo y secuencial de unión de clados, a partir de una matriz de similitud cuyo tamaño se va reduciendo hasta que consiste en una única celda, que se corresponde con la raíz del dendrograma. Los diferentes algoritmos discrepan en el modo en que se calcula la nueva similitud tras unir dos clados. El UPGMA calcula la media aritmética a partir de todas las similitudes individuales entre las muestras de los nuevos clusters por un lado y los clados ya existentes por otro, es decir se basa en un criterio de máxima similitud para juntar los clados. Por otro lado, el algoritmo de Ward es de más compleja interpretación estadística, pues se basa en el criterio del mínimo incremento en la suma de cuadrados.
3.2.4. Análisis de secuencias nucleotídicas
En los últimos 40 años, gracias a la secuenciación de los rRNAs y otros genes housekeeping se han podido inferir las relaciones filogenéticas de los microorganismos, así como evaluar y reestructurar la sistemática bacteriana dentro de un marco polifásico, lo que ha llevado a un importante número de reclasificaciones. De la misma manera, ha facilitado el camino para reconocer y proponer nuevos taxones a un ritmo mucho mayor que el que había hasta entonces. La tasa de evolución de estos genes en el genoma está relacionada con la función celular que presentan sus productos génicos, de manera que según el nivel de resolución al que se quiere llegar se debe utilizar un gen u otro. Los genes de tasa de evolución rápida deben ser utilizados para estudiar niveles taxonómicos bajos puesto que sus secuencias han acumulado suficientes mutaciones como para diferenciar taxones que divergieron recientemente; sin embargo, no deben ser utilizados para estudiar rangos taxonómicos altos porque las secuencias han acumulado tantas mutaciones que carecen de señal filogenética ancestral. Por el contrario, los genes de tasa de evolución lenta (por
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ejemplo el 16S rRNA) son útiles para estudiar niveles taxonómicos altos puesto que sus secuencias mantienen fragmentos conservados incluso entre taxones que divergieron en momentos muy tempranos de la vida.
A la hora de utilizar los rRNAs o cualquier otra secuencia génica como marcador molecular para inferir la filogenia hay que considerar que (i) no haya sufrido THG, para que reflejen realmente las relaciones evolutivas entre microorganismos; (ii) la similitud entre las secuencias génicas debe ser un reflejo de la similitud que presentan los genomas completos y por consiguiente de la distancia evolutiva entre los microorganismos; (iii) las secuencias deben tener un tamaño adecuado, ni demasiado pequeño, para que tenga suficiente información genética, ni demasiado grande, para que se pueda secuenciar con facilidad; (iv) hay que considerar la tasa de evolución del gen a analizar en función del poder de resolución al que se quiere llegar; y (v) en general, se prefieren genes con una única copia en el genoma.
El análisis de secuencias génicas posee un serie de ventajas respecto a otras técnicas utilizadas en taxonomía procariota: (i) los datos pueden estar disponibles en bases de datos públicas a disposición de la comunidad científica; (ii) a diferencia de la mayoría de técnicas de tipificación molecular los resultados obtenidos son reproducibles intra- e interlaboratorio; (iii) el análisis de datos es escalable, pudiendo comparar secuencias de estudios independientes; y (iv) el análisis de secuencias puede ser realizado en los tres dominios del árbol de la vida: Bacteria, Archaea y Eukarya.
Los rRNAs y los genes que los codifican fueron los primeros marcadores moleculares utilizados para inferir las relaciones filogenéticas en los procariotas (Fox y col., 1977; Woese, 1992). Los rRNA son moléculas con una función universal y constante que desde las primeras etapas de la evolución han presentado un elevado grado de conservación (reducida tasa de evolución). Una característica del análisis de los rRNA es la relativa simplicidad que supone alinear sus secuencias, gracias a la estructura secundaria común que presentan sus moléculas (Embley y Stackebrandt, 1997; Ludwig y col., 1998). En procariotas, las moléculas de rRNAs se clasifican como 23S, 16S y 5S, cuyas longitudes aproximadas son 2905, 1542 y 120 nucleótidos, respectivamente. Inicialmente la filogenia en procariotas se infirió mediante la secuenciación del 5S rRNA, aunque con el tiempo se pasó
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al 16S rRNA que al ser una molécula considerablemente mayor que el 5S rRNA, presenta una mayor cantidad de información genética. Aunque el 23S rRNA es una molécula de tamaño todavía mayor y por consiguiente con más información, su uso en taxonomía no se ha popularizado (Ludwig y col., 1998; Ludwig y Schleifer, 1999). En SILVA rRNA database Project, a 1 de diciembre de 2009 (versión 100), existe una extensa base de datos pública de secuencias del 16S rRNA de alta calidad y con una longitud mínima de 1200 pb. En dicha base de datos hay 345.332 y 17.127 secuencias de bacterias y arqueas, respectivamente.
El 16S rRNA presenta una tasa de evolución lenta, por lo que muchas veces resulta difícil establecer la relaciones filogenéticas entre taxones cuya divergencia es reciente. Por ello, se utiliza principalmente como marcador en rangos taxonómicos por encima de la especie (Stackebrandt y Goebel, 1994; Stackebrandt y Ebers, 2006). Además, las secuencias de rRNA puede ser utilizadas para explorar la diversidad de las especies viables no cultivadas (Embley y Stackebrandt, 1997), y monitorizar comunidades microbianas sin necesidad de cultivarlas mediante el empleo de sondas de rRNA marcadas (Amann y col., 1995).
Los denominados genes housekeeping también pueden ser utilizados para establecer las relaciones filogenéticas de los microorganismos. Algunos ejemplos son la subunidad beta de la DNA girasa (gyrB), el factor sigma 70 de la RNA polimerasa (rpoD), la subunidad beta de la ATP sintetasa (atpD), proteínas de recombinación (recA y recN), los factores de elongación EF-G (fusA), etc. (Ludwig y Schleifer, 1999; Zeigler, 2003; Le Roux y col., 2005).
En la actualidad se están imponiendo los estudios multigénicos o MLSA (Multilocus Sequence Analysis), que consisten en el análisis de secuencia de dos o más genes concatenados. Las ventajas con respecto al análisis de un único gen son: (i) al incluir varios genes, la cantidad de nucleótidos analizados es mayor y en principio el poder de resolución también es mayor; (ii) se pueden seleccionar genes con una determinada tasa de evolución en base al poder de resolución al que se quiere llegar; (iii) en caso de que algún gen seleccionado haya sufrido THG, el efecto de éste en el cladograma resultante puede quedar “amortiguado” por el resto de genes concatenados, mostrándose por consiguiente las relaciones filogenéticas de los microorganismos. Para
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ello se aconseja seleccionar genes con una amplia distribución física en el genoma. Este análisis, al igual que el MLST (Multilocus Sequence Typing) también se puede aplicar para estudios epidemiológicos. En estos casos pueden incluirse como marcadores genes de virulencia o regiones intergénicas (Coscollà y González-Candelas, 2007).
Si los genes (rRNAs y demás genes housekeeping) únicamente se transmitieran verticalmente, las inferencias filogenéticas derivadas de los mismos deberían ser similares entre sí, reflejando en todos los casos las relaciones evolutivas. Sin embargo, existen genes que sufren transferencia horizontal de manera que las relaciones establecidas a partir de esos genes puede que no necesariamente sean filogenéticas. La THG se puede definir como el intercambio de material genético entre microorganismos mediante los mecanismos de conjugación, transducción y transformación. La THG en los procariotas no es un proceso aleatorio, algunos genes (genes esenciales) se transmiten con menor frecuencia que otros genes (genes de adaptación). Aunque se puede dar tanto entre especies cercanas como entre taxones filogenéticamente distantes, la THG es más frecuente entre microorganismos que comparten ciertos factores: tamaño de genoma, composición de G+C mol%, fuentes de carbono y energía utilizadas, tolerancia al oxigeno, temperatura óptima de crecimiento, etc. La THG permite la adaptación de los microorganismos al ambiente, facilitando su diversificación y especiación (Cohan, 2001). Entre otras cosas permite la adquisición de genes implicados en la resistencia a antibióticos, genes de virulencia o nuevas rutas metabólicas. La THG juega un papel muy importante en la sistemática bacteriana, principalmente en las reconstrucciones filogenéticas (Jones, 1989). El problema de establecer la relaciones filogenéticas con un único gen es que si éste ha sufrido THG, el árbol filogenético de un gen particular puede que no se corresponda con el árbol filogenético de los microorganismos (Woese, 1998). Además, la adquisición de material genético exógeno mediante THG también puede modificar el fenotipo de las cepas y con ello generar errores en la clasificación e identificación (Jones, 1989). Lo ideal es identificar los caracteres que están afectados por la THG y excluirlos de los estudios taxonómicos. Pero eso no es una tarea fácil, pues se requiere conocer las secuencias génicas que codifican dichos caracteres. No obstante, este problema se minimiza al realizar estudios fenéticos (Jones, 1989). Según Woese (2000) para poder entender la evolución de los microorganismos hay
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que considerar la conexión que existe entre la evolución vertical y la adquisición horizontal de nuevo material genético. Por ello, la evolución de los procariotas no hay que verla como un esquema vertical sino más bien a modo de red.
Otros mecanismos que permiten la evolución de los genomas de los microorganismos son:
i. Duplicación génica. Al igual que la THG, origina innovación génica facilitando la adaptación de los microorganismos al ambiente y la exploración de nuevos nichos. Al contrario que en el mundo eucariota, la mayoría de los genes duplicados en los genomas se corresponden con fragmentos pequeños (Hooper y Berg, 2003).
ii. Deleción génica. Permite contrarrestar el crecimiento en tamaño de los genomas debido a la acción de la THG y las duplicaciones. Las deleciones que se implantan con mayor frecuencia suelen ser aquellas que afectan a genes que carecen de una función esencial para el microorganismo (es frecuente en bacterias endosimbiontes) pudiendo conferirle una ventaja selectiva (Coenye y col., 2005).
iii. Reordenaciones cromosómicas. Son debidas a inversiones o a los elementos móviles (secuencias de inserción y transposones). A diferencia de los anteriores fenómenos, éstos no generan una variación en el contenido génico. El grado de conservación génica puede ser utilizado para establecer relaciones filogenéticas, puesto que el nivel de conservación del orden génico tiene una relación directa con el tiempo de divergencia de los genomas (Tamames, 2001; Korbel y col., 2002).
A la hora de realizar un análisis de secuencias génicas (o proteicas) se recomienda seguir el siguiente esquema de trabajo:
1. Alineamiento de las secuencias
Es una manera de representar y comparar dos o más secuencias nucleotídicas o aminoacídicas para resaltar zonas de similitud que pueden indicar relaciones funcionales o evolutivas entre los genes o proteínas comparadas. Se puede trabajar con secuencias pertenecientes a un solo gen o a varios genes concatenados en el caso de un estudio multigénico. Si dos secuencias comparten un ancestro común, las diferencias pueden interpretarse como mutaciones
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puntuales y los huecos como indels (mutaciones de inserción o deleción). El análisis de secuencias es un paso crítico dentro del esquema de trabajo pues si no se realiza correctamente, puede que el árbol resultante tenga artefactos. El alineamiento se basa en la aplicación de un conjunto de algoritmos en los datos de secuencia y se puede facilitar mediante: (i) la utilización de la pauta de lectura si la secuencia nucleotídica es codificante; (ii) la utilización de la estructura secundaria en el caso de tenerla como por ejemplo en los rRNA.
2. Análisis de los posibles eventos de recombinación
Como se ha explicado anteriormente, la THG juega un papel importante en la evolución de los genomas. Existen diversas maneras de detectar la THG: (i) similitud inesperada entre genes homólogos de especies distantes; (ii) topologías muy discordantes para uno o varios microorganismos entre diferentes árboles génicos; (iii) existencia de un orden génico excesivamente conservado (cuando un operón se encuentra en unos pocos microorganismos filogenéticamente distantes); (iv) composición anómala de la secuencia de DNA (contenido en G+C mol%, uso de codones diferentes al resto de genes, etc.). Una manera de minimizar la posible distorsión generada por la THG es realizando un estudio multigénico.
3. Inferencia de las relaciones entre los taxones
Una vez alineadas las secuencias y verificado que no han sufrido THG, el siguiente paso es establecer las relaciones entre los taxones. Las secuencias pueden ser analizadas como datos de distancias o como datos de caracteres:
3.1. Métodos de distancias. Utilizan el alineamiento de secuencias para calcular una matriz de distancias de acuerdo a un modelo de evolución entre taxones para posteriormente representar a partir de dichas distancias las relaciones en un árbol. Cuando se trabaja con distancias se aplican principalmente los métodos UPGMA y NJ. Las distancias génicas son expresadas como la fracción de sitios que difieren entre dos secuencias en un alineamiento múltiple, de esta manera cuanto más distantes evolutivamente estén dos taxones, más diferencias nucleotídicas cabe esperar y por consiguiente mayor distancia génica.
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3.1.1. UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean). Es un algoritmo de agrupamiento “de abajo a arriba” que genera árboles enraizados asumiendo implícitamente el reloj molecular. Este método considera inicialmente cada entidad de la matriz de distancias como un grupo independiente (cluster). De forma recursiva, en cada paso se van uniendo los dos grupos más cercanos y se van re-calculando las distancias, definiéndose la distancia entre dos grupos como la media (sin ponderar) de las distancias que hay entre los miembros de cada grupo. La hipótesis del reloj molecular dice que para una determinada molécula (gen o proteína) el ritmo de cambio ha sido constante a la largo de la historia y en los distintos organismos, de forma que existe una relación directa entre tiempo y cantidad de cambios. Consecuentemente, el árbol resultante de UPGMA (o el de cualquier método que asuma un reloj evolutivo) tiene una forma tal que para cualquier par de nodos externos, las distancias de las ramas que los conectan al nodo interno común son iguales. Si la hipótesis del reloj molecular se cumple, podemos por tanto datar cronológicamente sucesos evolutivos a partir de la información de la cantidad de cambios existentes. El principal problema del algoritmo de UPGMA es que en la mayoría de los casos no se puede aplicar dicho reloj, bien porque el ritmo de cambio ha sido distinto en cada especie o bien porque distintas partes de la secuencia han cambiado con distinta velocidad. De manera que si falla la asunción del reloj molecular, el árbol inferido puede presentar artefactos.
3.1.2. NJ (Neighbor Joining). Es también un algoritmo de agrupamiento “de abajo a arriba” pero en este caso se obtienen árboles sin raíz y donde no se asume el reloj molecular. Se basa en el principio de mínima evolución, donde tras establecer la matriz de distancias, el mejor árbol es aquél que menor longitud presenta (suma de las longitudes de todas las ramas). Para tratar de encontrar dicho árbol, el método de NJ aplica una búsqueda heurística. El algoritmo modifica la matriz de distancias obtenida de forma que la distancia entre cada par de OTU´s depende tanto de la propia distancia como de la distancia de ambos con respecto al resto de OTU´s. El método agrupa en cada paso a los taxones vecinos (el par de nodos que están más cercanos entre sí que respecto al resto). Puesto que NJ genera árboles no enraizados, una manera para enraizar el árbol es incluir en el análisis un outgroup o grupo externo.
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3.2. Métodos de caracteres. Los métodos basados en caracteres hacen uso de la información de cada columna (sitio, posición) del alineamiento múltiple para inferir la mejor hipótesis.
3.2.1. MP (Máxima Parsimonia). Se basa en el principio de que el árbol más probable es aquél que requiere el menor número de cambios para explicar los datos del alineamiento (similar al principio de mínima evolución). El método de MP utiliza únicamente los “sitios informativos”. Un sitio informativo es aquél en el que al menos hay dos estados de carácter diferentes y en el que cada uno de los estados está representado en al menos dos de las entidades. De esta manera, el método de MP “rastrea” cada uno de los sitios informativos en cada uno de los posibles árboles y cuenta el número de cambios requeridos para generar cada árbol, siendo el más parsimonioso aquél que requiere un menor número de cambios. Este método tiene la ventaja de ser de fácil interpretación, aunque tiene un inconveniente en situaciones donde son frecuentes las homoplasias, pues puede dar resultados erróneos. Además, si el número de taxones es muy elevado (mayor a diez), el número de árboles que hay que analizar es demasiado alto para realizar una búsqueda exhaustiva. Por ello se realizan búsquedas branch and bound (hasta 18 taxones) que durante la búsqueda descartan familias de árboles que no pueden ser mejor que el óptimo de entre los que van construyendo. En el caso de trabajar con más de 20 taxones hay que realizar una búsqueda heurística a partir de árboles iniciales seleccionados al azar y mediante una adición secuencial de taxones que tratan de maximizar el criterio de optimización. La adición de taxones puede ser siguiendo el orden que tienen los taxones en la matriz de distancias, aleatoriamente, etc. Finalmente tanto en el caso de una búsqueda branch and bound como heurística hay que realizar un análisis de árboles alternativos por re-ordenación de ramas, branch swapping, con el fin de ver si algún árbol de los no analizados es mejor que el encontrado. Existen distintos métodos de realizar el análisis como por ejemplo el nearest neighbor interchange, subtree pruning and regrafting, tree bisection and recombination, etc. Puede darse el caso que los árboles más parsimoniosos, con igual número de cambios, sean dos o más. En ese caso se debe de calcular un árbol consenso a partir de esos árboles. En el árbol consenso se muestran todas aquellas ramas conflictivas como nodos multifurcados o mostrando aquellas ramas que aparecen en más del 50% de los árboles individuales.
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3.2.2. ML (Máxima Verosimilitud). A diferencia del método de MP, el de ML es un método estadístico que requiere un modelo de evolución explicito para el cálculo de las probabilidades. Es un método de inferencias filogenéticas que evalúa la hipótesis sobre la historia evolutiva (orden y longitud de las ramas del árbol) en base a la probabilidad que un modelo evolutivo y un árbol dado. El mejor árbol es aquel que explica con una probabilidad mayor la evolución de una serie de caracteres dado un modelo evolutivo. Se basa en encontrar la probabilidad de que se hayan generado los datos a partir de un árbol y un modelo de evolución determinado. En inferencia filogenética la hipótesis la constituye el árbol (topología + longitud de las ramas) y el modelo evolutivo, y los datos son el alineamiento múltiple. La inferencia filogenética por ML es estadísticamente fiable y considera la información de todas las posiciones del alineamiento, no sólo la de los sitios “informativos” como en MP. El análisis con ML además de mostrar cuál es el árbol más verosímil, puede ser utilizado para establecer el modelo de evolución que mejor encaja en los datos, y de esta manera obtener información del proceso evolutivo que ha conducido a la situación actual. La mayor desventaja del ML es que si el modelo de evolución aplicado es incorrecto, es probable que el árbol también sea incorrecto.
3.2.3. Métodos Bayesianos (MB). Determinan para cada árbol la probabilidad de que sea la hipótesis correcta en función de los datos. A la probabilidad de cada árbol en base a unos datos se denomina “probabilidad posterior” porque calcula la probabilidad de una hipótesis a partir de los resultados que produciría dicha hipótesis. Aunque no existe una solución analítica al sistema de Bayes en el problema de inferencia filogenética, existe una aproximación para estimar la distribución de probabilidad posterior: el Markov Chain Monte Carlo. Se inicializan al azar los parámetros que se quieren inferir, como la topología, longitud de las ramas y los parámetros del modelo evolutivo. Seguidamente se hace un pequeño movimiento aleatorio (modificación de los parámetros) y se evalúa la función de probabilidad. Si los valores mejoran, entonces se acepta el movimiento y se repite el proceso. Si no mejoran, el nuevo estado se acepta con una probabilidad proporcional al empeoramiento producido. La idea es que si se repite este proceso muchas veces se obtiene una estimación de la probabilidad asociada a cada estado (a cada árbol). La gran ventaja de los MB es que muestran la probabilidad de cada árbol y de ese modo se puede ver si aparte del
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árbol más probable existen otros con probabilidad similar, es decir, otras hipótesis alternativas plausibles. En cambio, en el caso de ML, sólo se conoce cuál es el árbol “más probable”. Por eso, para técnicas como ML, NJ o MP es muy importante realizar un análisis que permita cuantificar la fiabilidad de las reconstrucciones.
4. Fiabilidad de las reconstrucciones
Tras aplicar los métodos de ML, MP y NJ para inferir las relaciones entre los taxones, hay que analizar la fiabilidad de la reconstrucción obtenida. El método más utilizado es el bootstrap, aunque existen otros como el test de ramas internas o el jacknife. La fiabilidad se calcula para cada árbol obtenido con un determinado método y unos datos concretos, de manera que si los datos no son adecuados (existen errores sistemáticos o estocásticos) o el método no es el apropiado, la reconstrucción será errónea aunque los procedimientos de fiabilidad indiquen una gran confianza. El bootstrap consiste en re-muestrear los caracteres con reemplazamientos para obtener una serie de pseudo-réplicas de la matriz de datos. Posteriormente se analiza cada pseudo-réplica de la matriz de datos con el mismo procedimiento que la matriz de datos real (MP, NJ, ML). La concordancia entre los grupos obtenidos con los diferentes árboles resultantes del análisis de las pseudo-réplicas se determina mediante la obtención de una topología consenso según el criterio majority-rule consensus tree. La frecuencia con la que cada grupo de taxones aparece en los árboles basados en las pseudo-réplicas es una medida del respaldo de los grupos obtenidos en el árbol basado en la matriz de datos real. Valores superiores al 75% son indicativos de una gran señal. No obstante, valores menores no indican que la reconstrucción sea incorrecta, sino que los datos no la soportan.
5. Modelos de Evolución
Cuando se trabaja con NJ y ML, es necesario aplicar un modelo evolutivo que permita obtener distancias evolutivas basadas en las distancias génicas. Hay que distinguir entre distancia génica (cambios nucleotídicos que observamos en la actualidad) y distancia evolutiva (cambios nucleotídicos que realmente se han dado desde que los taxones divergieron). Los modelos de evolución se aplican para corregir los datos de secuencia actuales (distancias génicas) en base a la evolución que han sufrido las secuencias a lo largo del tiempo para
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calcular las distancias evolutivas. Existen correcciones para las sustituciones múltiples, la frecuencia de cada nucleótido, la tasa de cambio entre nucleótidos, la tasa de cambio en las diferentes partes de la molécula (parámetro gamma), la tasa de transiciones/transversiones, el criterio del reloj molecular, etc. Los modelos evolutivos presentan una amplia gama de complejidad, desde modelos sencillos como Jukes Cantor (JC) a más complejos General Time Reversible (GTR). Hay que evitar el uso de modelos de evolución de una manera no justificada, pues puede variar la topología del árbol resultante, la longitud de las ramas y las distancias evolutivas estimadas. Existen diversas aproximaciones estadísticas para determinar el modelo evolutivo apropiado de unas secuencias determinadas: Hierarchical Likelihood Ratio Tests y el Akaike Information Criterion (Posada y Crandall, 1998, 2001, 2008). Aunque en MP se aplica un modelo evolutivo de manera implícita, en los métodos de distancia y de verosimilitud hay que aplicarlo de manera explícita.
4. Efecto de los mecanismos de evolución molecular en la taxonomía
Los diferentes mecanismos de evolución de los genomas (THG, duplicaciones, etc.) pueden influir en los resultados obtenidos con las diferentes técnicas genéticas y fenotípicas utilizadas comúnmente en los estudios taxonómicos, conducir a resultados inesperados y por consiguiente generar un sistema de clasificación e identificación erróneo. Para evitar esto, es necesario conocer la influencia que pueden tener los distintos procesos evolutivos en la taxonomía.
El G+C mol% no se ve afectado por las reordenaciones cromosómicas, deleciones o duplicaciones. La THG puede tener un efecto nulo o sumamente escaso, además el proceso de amelioration de los genes xenólogos tiende a atenuarlo, ya que una vez que se incorporan al genoma están sometidos a los mismos procesos evolutivos que afectan al resto de genes del genoma, de manera que con el tiempo los genes xenólogos reflejan la misma composición que el resto de genes ortólogos.
En el caso de la hibridación DNA-DNA, el resultado está influenciado por la divergencia de las secuencias y en una menor medida por la duplicación y perdida génica, las reordenaciones y la THG.
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En las técnicas de tipado molecular, los patrones de bandas pueden verse alterados por la pérdida o ganancia de sitios de restricción o de unión de cebadores. Las reordenaciones cromosómicas, incluyendo deleciones e inserciones, pueden tener un enorme efecto en los patrones de bandas.
Finalmente, los análisis fenotípicos, incluyendo los datos quimiotaxonómicos, se ven afectados de manera indirecta por los mecanismos evolutivos que modifican el genoma. El efecto de las duplicaciones es dependiente del gen afectado pudiendo dar una neo-funcionalidad o sub-funcionalidad. También los genes xenólogos pueden generar nuevos fenotipos. La pérdida génica generalmente va asociada con una pérdida de función fenotípica.
5. La especie procariota La taxonomía procariota tuvo su gran expansión durante el siglo XX cuando el sistema de clasificación y nomenclatura Linneano fue adoptado de manera análoga a los sistemas de clasificación zoológicos y botánicos. La nomenclatura de bacterias y arqueas está regida por el International Code of Nomenclature of Bacteria creado en 1975 y revisado en 1990. A excepción de la especie, todos los demás rangos taxonómicos jerárquicos establecidos en los sistemas de clasificación procariota y eucariota (género y superiores), son rangos abstractos, artificiales y todos ellos similares y comparables entre sí. La especie es considerada como un rango taxonómico práctico para el cual los criterios adoptados para su circunscripción dependen del propio concepto adoptado: biológico, fenético, evolutivo, etc. (Van Regenmortel y col., 1997). Aunque la comparación directa entre especies pertenecientes a los dominios Archaea y Bacteria sí es factible, no ocurre lo mismo con las especies pertenecientes al dominio Eukarya, e incluso entre los propios eucariotas, al no existir un concepto único y universal de especie. Por ejemplo, el concepto de especie biológico establecido por Ernst Mayr en 1942 como “un grupo de poblaciones naturales, genéticamente similares, interfértiles y aislados reproductivamente de otros grupos análogos” no puede ser aplicado en los procariotas (Van Regenmortel y col., 1997; Mayden, 1997). El motivo radica en que los procariotas, al igual que ciertos eucariotas, carecen de los mecanismos de reproducción sexual que presentan los eucariotas superiores.
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Las primeras definiciones de especie procariota estaban basadas en grupos monotéticos definidos por caracteres fenotípicos. Posteriormente esta definición adquirió un carácter politético de modo que las especies fueron definidas por una combinación de caracteres fenotípicos independientes, co-variables y de igual peso (Sneath y Sokal, 1973; Goodfellow y col., 1997). Finalmente, gracias al desarrollo y aplicación de las técnicas moleculares que permiten un análisis genómico, se dio un nuevo enfoque al concepto de especie procariota.
Una especie procariota se define conceptualmente como “un grupo monofilético y genómicamente coherente de organismos individuales que muestran un elevado grado de similitud global con respecto a muchas características independientes, y que es diagnosticable por unas propiedades fenotípicas discriminativas”. (Wayne y col., 1987; Rosselló-Móra y Amann, 2001; Stackebrandt y col., 2002). El actual concepto de especie es universal, aplicable a todos los procariotas y permite establecer un sistema de clasificación estable, objetivo y predecible. Es un concepto pragmático con una base filofenética, cuya circunscripción se basa en una aproximación polifásica (Vandamme y col., 1996). Su utilización se restringe a aquellos microorganismos cultivados en cultivo puro.
Desde un punto de vista metodológico, la definición actual de especie procariota incluye tres aproximaciones:
a) Caracterización fenotípica. Una especie no debe ser establecida a menos que pueda ser identificada por caracteres fenotípicos determinativos e identificativos (Rosselló-Móra y Amann, 2001), por lo que la caracterización fenotípica debe ser lo más exhaustiva posible y propiciar de esta manera un sistema de clasificación apropiado (Cowan, 1965; Wayne y col., 1987). Es la base para establecer una coherencia en los taxones y la diversidad interna en los mismos. Puesto que diferenciar los caracteres fenotípicos homólogos de los análogos es muy complejo, para minimizar el efecto de estos últimos se deben analizar tantos caracteres como sea posible, tratando a todos los caracteres con la misma importancia (Sneath y Sokal, 1973). Cuando el número de caracteres estudiados en un análisis fenético es lo suficientemente grande, los grupos generados tienden a coincidir con los grupos genómicos (Rosselló-Móra y col., 1994; Sikorski y col., 1999).
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b) Caracterización genómica. La técnica estándar para delimitar la especie procariota es la hibridación DNA-DNA. Aunque la hibridación DNA-DNA no puede ser considerada como un análisis propiamente cladístico, cuando dos cepas presentan valores de hibridación DNA-DNA elevados están filogenéticamente relacionadas. Los datos empíricos obtenidos con esta técnica presentan una elevada correlación con los de otras aproximaciones genómicas y fenéticas. Se ha establecido empíricamente y bajo unas condiciones de hibridación óptimas, que la mayoría de las especies procariotas se componen de cepas cuyos valores de hibridación DNA-DNA están por encima del 70% o cuyo ∆Tm es inferior al 5 oC (Ward, 1998). No obstante, se ha visto empíricamente que la actual circunscripción podría ser más laxa en términos de valores de similitud del DNA-DNA, siempre que ese hecho esté apoyado por otros datos, de manera que se puede llegar al umbral del 50% de hibridación DNA-DNA o 7 oC de ∆Tm
(Ursing y col., 1995; Vandamme y col., 1996; Goodfellow y col., 1997; Ursing y col., 1998).
Las técnicas de tipado molecular (AFLP, Rep PCR, etc.) se pueden aplicar para conocer la variabilidad intra- e interespecífica. Son varios los estudios donde se han correlacionado los valores de similitud de los perfiles de bandas obtenidos con dichas técnicas con respecto a los valores de reasociación DNA-DNA, con el fin complementar y/o remplazar esta última técnica a la hora de circunscribir la especie procariota (Janssen y col., 1996; Gómez-Gil y col., 2004).
c) Constituir un grupo monofilético. Se considera que una especie debe ser monofilética, donde todos los individuos deben de tener un mismo antecesor común. En los procariotas, las relaciones filogenéticas se infieren principalmente con el marcador molecular 16S rRNA, aunque en los últimos años, otros genes housekeeping están adquiriendo cierta relevancia principalmente en grupos taxonómicos de reciente divergencia.
Debido a los inconvenientes que presenta la hibridación DNA-DNA, técnica estándar para delimitar la especie procariota, se han realizado estudios de correlación entre ésta y otras técnicas alternativas (por ejemplo secuencias génicas del 16S rRNA), con el fin de proponerlas como complementarias o alternativas para delimitar una genomoespecie. Debido a que no existe una correlación lineal entre el porcentaje de hibridación DNA-DNA y el porcentaje de similitud de
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secuencias del 16S rRNA, la definición de especie no puede basarse únicamente en este parámetro (Grimont, 1988; Stackebrandt y Goebel, 1994). No obstante, tiene un carácter altamente pragmático pues permite obtener con bastante precisión la situación filogenética de los microorganismos (Goodfellow y col., 1997). Empíricamente se ha visto que cepas con similitudes de secuencia del 16S rRNA inferiores al 98,5% siempre muestran valores de hibridación DNA-DNA inferiores al 70% y por consiguiente pueden ser consideradas de diferente especie sin necesidad de realizar estudios de hibridación DNA-DNA. Sin embargo, cuando dos cepas presentan valores de similitud de secuencia por encima del 98,5% e incluso del 100% pueden o no pertenecer a la misma especie. En este caso, es necesario realizar estudios de hibridación DNA-DNA para dilucidar la vinculación entre cepas (Stackebrandt y Ebers, 2006). Por otra parte, hay que tener en cuenta que la mayoría de las especies procariotas presentan dos o más copias del operón multigénico de rRNA y que entre los mismos puede haber diferencias. No obstante, y solo en contados ejemplos, esos cambios apenas suponen un ligero ruido de fondo carente de implicaciones filogenéticas (Nübel y col., 1996).
Al margen de las consideraciones metodológicas, se recomienda que las especies procariotas sean descritas con al menos 10 cepas con el objeto de que quede reflejada la variabilidad intraespecífica. Desafortunadamente, en la práctica la mayoría de las especies descritas en los últimos 20 años están basadas en una única cepa/aislado. Esto conlleva a una descripción de la especie que puede conducir a errores en la clasificación o identificación de otros aislados posteriores.
Desde un punto de vista formal en taxonomía bacteriana, todas las especies procariotas tienen asignada una cepa tipo, a la que queda vinculada el nombre de la especie. Dicha cepa es, por lo tanto, utilizada como cepa de referencia en estudios comparativos. La cepa tipo debe mantenerse en cultivo puro y sus características fenotípicas y genómicas deben coincidir con las características definidas en la descripción de la especie. Cuando se describe una nueva especie, subespecie o combinación es necesario designar y depositar la cepa tipo en dos colecciones de cultivo de países diferentes, en régimen público sin restricciones, con el fin de garantizar su disponibilidad para la comunidad científica.
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La categoría de Candidatus es un estatus provisional propuesto por Murray y Schleifer (1994) para clasificar taxones procariotas putativos que no han podido hasta la fecha ser cultivados axenicamente, al requerir unas condiciones especiales (por ejemplo patógenos obligados intracelulares y endosimbiontes), y de los que se posee cierta información sobre secuencias génicas y/o caracteres fenotípicos, pero no la suficiente como para definirlo formalmente como taxón. Dicho status fue aceptado por el International Committee on Systematic Bacteriology (Murray y Stackebrandt, 1995). Gracias a las secuencias génicas (16S rRNA) estas cepas pueden ser ubicadas en un marco filogenético, siempre teniendo en cuenta el poder de resolución que presenta dicho gen (Pace, 1985; Embley y Stackebrandt, 1997).
Perspectivas futuras del concepto de especie procariota
La definición de especie procariota no es estática porque está vinculada al desarrollo metodológico y avance conceptual. En los últimos años se están desarrollado nuevas herramientas moleculares e informáticas que permiten la secuenciación completa de los genomas y su análisis, llegando de esta manera al nivel máximo de información genómica posible. A partir de este nivel podremos estimar las similitudes genómicas completas entre cepas (inter- e intraespecífica), estimar el efecto que tiene la THG, establecer de manera inequívoca las verdaderas relaciones evolutivas entre las cepas (filogenómica), dilucidar qué caracteres fenotípicos son análogos, etc.
A fecha de hoy, aunque se ha incrementado exponencialmente el número de genomas secuenciados, la secuenciación rutinaria de todos los aislados ambientales no es factible. Una de las técnicas moleculares que está adquiriendo más relevancia en la taxonomía procariota es el Multilocus Sequence Analysis (MLSA), técnica que se está proponiendo como la futura herramienta que permita delimitar una especie procariota desde un punto de vista genómico y filogenético. El análisis de varios genes distribuidos por todo el genoma, se puede considerar como un muestreo de la secuencia primaria del genoma de un microorganismo y por consiguiente una medida directa de la similitud genómica. No obstante, para poder validar esta aproximación es necesario realizar estudios de correlación entre la similitud de las secuencias génicas concatenadas y los valores de similitud genómica obtenidos mediante hibridación DNA-DNA o genomas secuenciados.
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Aunque el ad hoc committee for the re-evatuation of the species definition consensuó que era necesario trabajar como mínimo con cinco genes de diversa localización en el genoma para obtener la suficiente información como para distinguir entre especies de taxones relacionados (Stackebrandt y col., 2002), otros autores han propuesto reducir el número de genes para tal fin (Zeigler, 2003), siempre que los mismos permitan medir la similitud genómica entre microorganismos con igual o incluso más precisión que con la hibridación DNA-DNA (Zeigler, 2003). Otras ventajas que tiene el MLSA respecto a otras técnicas como la hibridación DNA-DNA, es su bajo coste, reproducibilidad intra- e interlaboratorio, y la capacidad de establecer las relaciones filogenéticas de una manera más precisa. La tecnología de la secuenciación es rápida, barata y reproducible. No obstante, el principal problema que existe hasta la fecha a la hora de aplicar el MLSA en la definición de especie procariota es encontrar la combinación de genes que se pueda aplicar en todos los grupos taxonómicos, pues los genes que correlacionan bien la información genómica en unos grupos taxonómicos pueden no hacerlo en otros. Por ello, los genes que deben ser utilizados en los estudios de MLSA nunca serán los mismos para todos los taxones. Son muchos los estudios que se han realizado en grupos taxonómicos concretos, pero escasos aquellos que han incluido una gran diversidad de grupos taxonómicos diferentes (Frapolli y col., 2007; Alexandre y col., 2008; Martens y col., 2008).
Otra alternativa para la definición de especie, son los parámetros AAI (identidad aminoacídica media) y ANI (identidad nucleotídica media). Ambos son dos parámetros derivados de la comparación de parejas de genomas (cepas), que representa el promedio de la identidad de secuencia que muestran todos los genes ortólogos compartidos (aminoácidos o nucleótidos, respectivamente). Estos parámetros dan una medida robusta de la similitud genómica que presentan las cepas, pudiendo ser utilizados con la misma finalidad que la hibridación DNA-DNA, delimitar el concepto de especie. Se ha visto empíricamente que valores de aproximadamente el 94% de ANI equivalen al valor del 70% de hibridación DNA-DNA utilizado para definir la especie. Estos parámetros se caracterizan porque permiten realizar análisis in silico y crear bases de datos acumulativas. Además, debido a las diferencias en las constricciones evolutivas de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas, los resultados obtenidos con
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las ANI y AAI presentan diferentes niveles de resolución, el primero para microorganismos filogenéticamente relacionados y el segundo para microorganismos distantes (Konstantinos y Tiedje, 2004, 2005; Roselló-Móra, 2005).
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Taxonomía de vibrios
1. Historia del género Vibrio La primera especie de Vibrio fue descrita en Florencia (Italia), 1854, por el médico Filipo Pacini mientras examinaba al microscopio la mucosa intestinal de víctimas mortales del cólera. Se correspondía con Vibrio cholerae, agente causal del cólera, enfermedad de la que se tenía noticias desde tiempos de Hipócrates. Pacini observó que el cólera era una enfermedad contagiosa, en una época en la que la mayoría de los científicos y médicos creían en la teoría miasmática. En la misma época, John Snow (1813-1858) estudió la epidemiología del cólera en varias ciudades de Inglaterra donde fallecieron miles de personas entre 1830 y 1850 a causa de esta enfermedad. En 1883, Robert Koch y su equipo durante una expedición en Alejandría observaron que en el tejido intestinal de todas las víctimas del cólera estaba siempre presente un tipo de bacteria, aunque no lograron cultivarla. Fue a finales de 1883, cuando Koch y su equipo lograron obtener cultivos puros de V. cholerae en placas de gelatina. Además, describieron algunas propiedades del microorganismo como su morfología y movilidad, concluyendo que era el agente causante del cólera. Propusieron medidas preventivas para evitar el contagio de la enfermedad como las mejoras higiénicas en el sistema de suministro de agua además de la filtración del agua de consumo. Los primeros vibrios no patógenos aislados de ambientes acuáticos fueron Aliivibrio (Vibrio) fischeri, V. splendidus y Photobacterium phosphoreum, aislados por el holandés Martinus Beijerinck a finales de 1880.
2. La familia Vibrionaceae La familia Vibrionaceae (Veron, 1965) comprende un gran número de especies con una amplia distribución geográfica asociadas a ambientes acuáticos, principalmente agua de mar y estuarios (Farmer III y Janda, 2005a). El género tipo de la familia es Vibrio y la especie tipo del género Vibrio es V. cholerae. Según The List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature (www.bacterio.cict.fr), a fecha 1 de diciembre de 2009, la familia Vibrionaceae comprende los géneros y especies recogidos en la Tabla 1.
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Tabla 1: Géneros y especies válidamente descritos en la familia Vibrionaceae.
Aliivibrio (Urbanczyk y col., 2007) A. finisterrensis A. logei A. wodanis A. fischeri A. salmonicida
Catenococcus (Sorokin, 1994) C. thiocycli Enterovibrio (Thompson y col., E. calviensis E. nigricans
2002; Pascual y col., 2009) E. coralii E. norvegicus Grimontia (Thompson y col., 2003) G. hollisae Listonella (MacDoonell y L. anguillarum
Colwell, 1986) L. pelagia Photobacterium (Beijerinck, 1889) P. angustum P. halotolerans P. lutimaris
P. aplysiae P. iliopiscarium P. phosphoreum P. aquimaris P. indicum P. profundum P. damselae P. kishitanii P. rosenbergii P. frigidiphilum P. leiognathi P. ganghwense P. lypolyticum
Salinivibrio (Mellado y col., 1996) S. costicola S. proteolyticus S. siamensis Vibrio (Pancini, 1854) V. aerogenes V. gallaecicus V. orientalis V. aestuarianus V. gallicus V. pacinii V. agarivorans V. gazogenes V. parahaemolyticus V. albensis V. gigantis V. pectenicida V. alginolyticus V. hangzhouensis V. penaeicida V. areninigrae V. halioticoli V. pomeroyi V. atypicus V. harveyi V. ponticus V. azureus V. hepatarius V. porteresiae V. brasiliensis V. hispanicus V. proteolyticus V. breoganii V. ichthyoenteri V. rarus V. campbellii V. inusitatus V. rhizosphaerae V. casei V. kanaloae V. rotiferianus V. chagasii V. lentus V. ruber V. cholerae V. litoralis V. rumoiensis V. cincinnatiensis V. mediterranei V. scophthalmi V. comitans V. metschnikovii V. sinaloensis V. coralliilyticus V. mimicus V. splendidus V. crassostreae V. mytili V. superstes V. cyclitrophicus V. natriegens V. tapetis V. diabolicus V. navarrensis V. tasmaniensis V. diazotrophicus V. neonatus V. tubiashii V. ezurae V. neptunius V. vulnificus V. fluvialis V. nereis V. xuii V. fortis V. nigripulchritudo V. furnissii V. ordalii
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3. El género Vibrio Según el Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology (Holt y col., 1994) y el Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology (Farmer III y col., 2005b) el género Vibrio se incluye en el phylum Proteobacteria, dentro de la clase Gammaproteobacteria y está compuesto por organismos Gram negativos, quimioorganotrofos, mesófilos, anaerobios facultativos, oxidasa positivos y capaces de reducir nitratos a nitritos. La mayoría de las especies no puede desnitrificar ni fijar N2. Morfológicamente son bacilos pequeños, rectos, ligeramente curvados, curvados o incluso en forma de coma, con un tamaño que oscila entre 0,5-0,8 x 1,4-2,6 µm. No forman endoesporas ni microcistos. Son móviles en medio líquido por uno o varios (3-12) flagelos polares envainados. Esta flagelación les dota de movilidad quimiotáctica, pudiendo ser crítica en ciertas especies patógenas para poder desarrollar la infección. Además, ciertas especies cuando se cultivan en medio sólido sufren una serie de cambios como es la síntesis de numerosos flagelos laterales que les dota del movimiento tipo deslizamiento o swarming. Los vibrios son capaces de crecer en un medio que contenga D-glucosa como única fuente de carbono y energía, y NH4
+ como única fuente de nitrógeno. Son pocas las especies que requieren factores de crecimiento orgánicos. La mayoría de las especies crece bien en medios que contienen una base de agua de mar. Todas las especies fermentan D-glucosa produciendo ácido, pero raramente gas. Varias especies pueden llevar a cabo la fermentación butanodiólica. La mayoría utiliza D-fructosa, maltosa y glicerol. Unas pocas especies son capaces de crecer a 4 oC, todas crecen a 20 oC, la mayoría crece a 30 oC y muchos de ellas a 35-37 oC. El género incluye especies bioluminiscentes, siendo este carácter variable a nivel intraespecífico. Ciertas especies del género tienen la capacidad de producir fimbrias y/o cápsulas, acumular gránulos de PHB, así como desarrollar pigmentación (Baumann y col., 1984; Nakasone y Iwanaga, 1990; Sun y col., 1994).
Los vibrios son microorganismos asociados fundamentalmente a ambientes acuáticos, cuya distribución depende de la concentración de Na+ y de nutrientes en el medio así como de la temperatura. Están presentes en agua salada, estuarios o en algunos casos en agua dulce, viviendo de forma planctónica o asociados a animales acuáticos. Determinadas especies están asociadas a los tejidos u órganos de ciertos organismos acuáticos hospedadores, estableciendo una relación
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de simbiosis regulando su virulencia y/o bioluminiscencia mediante una comunicación célula a célula o quorum sensing (Milton y col., 1997; Fidopiastis y col., 1998; McDougald y col., 2000; Hammer y Bassler, 2003; Lilley y Bassler, 2000). Del mismo modo, los vibrios pueden estar asociados a la superficie externa de los organismos marinos formando biopelículas, estrategia que les permite sobrevivir durante fases de ayuno y/o de estrés ambiental pues pueden obtener nutrientes, resistir a antibióticos, etc. (Lipp y col., 2002).
Varias especies han sido descritas como patógenas para el hombre, peces, corales, moluscos, artrópodos, así como otros vertebrados e invertebrados (Verdonck y col., 1997; Gómez-Gil y col., 1998; Barbieri y col., 1999; Huys y col., 2001; Denner y col., 2002; Heidelberg y col., 2002; Rosemberg y Ben-Haim, 2002; Sawabe y col., 2003; Vandenberghe y col., 2003).
Dentro del género Vibrio se incluyen patógenos humanos como son (i) V. cholerae, capaz de sintetizar una enterotoxina que desencadena una intensa diarrea acuosa (Wachsmuth y col., 1994); (ii) V. parahaemolyticus, causante de una gastroenteritis en la que juega un papel muy importante una hemolisina (Nishibuchi y Kaper, 1995); (iii) V. vulnificus, causante de una septicemia hemorrágica siendo los polisacáridos capsulares el principal factor de virulencia (Oliver, 2005). Otras bacterias pueden causar infecciones de manera esporádica: Grimontia (Vibrio) hollisae, Photobacterium (Vibrio) damselae, V. alginolyticus, V. cincinnatiensis, V. fluvialis y V. furnisii.
Puesto que muchos vibrios son patógenos de animales criados/cultivados en acuicultura, juegan un papel muy importante en dicho sector. Entre las especies más virulentas se encuentran Listonella (Vibrio) anguillarum; Aliivibrio (Vibrio) salmonicida, V. harveyi, V. ordalii, V. tubiashii y V. vulnificus, pudiendo afectar según el caso a distintas especies de peces, crustáceos, moluscos, etc. (Hjeltnes y Roberts, 1993; Leaño y col., 1998; Austin y Austin, 1999). Además, hay vibrios que están implicados en el blanqueado de los corales: V. mediterranei, V. coralliilyticus, V. fortis, V. harveyi, V. campbellii, V. rotiferianus y Enterovibrio coralii (Ben-Haim y col., 2003; Rosemberg y Ben-Haim, 2002).
Por último, destaca el papel que los vibrios presentan en los ciclos de los nutrientes en los ambientes acuáticos, pues pueden utilizar la materia orgánica disuelta en el agua como fuente de energía y
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carbono (Sherr y Sherr, 2002); aportar ácidos grasos poliinsaturados esenciales a la red trófica (Nichols, 2003); degradar quitina (Suginata y col., 2004) y/o hidrocarburos policíclicos aromáticos contaminantes (Hedlund y Staley, 2001); producir antibióticos y/o compuestos inhibitorios de otras bacterias marinas (Long y Azam, 2001).
4. El clado central del género Vibrio La denominación clado central o core group del género Vibrio tiene su origen en los estudios realizados por Reichelt y col. (1976) que definieron previamente el grupo de hibridación Vibrio (Beneckea) harveyi en base a resultados de hibridación DNA-DNA. Dicho grupo comprendía a las especies B. harveyi y B. campbellii por un lado, B. parahaemolytica y B. alginolytica por otro, y las especies B. natriegens y B. vulnifica como las más distantes del grupo. El grupo se denominó así porque V. harveyi era la especie más antigua del grupo. Además de la elevada similitud en los valores de reasociación DNA-DNA, estas especies estaban relacionadas morfológica, fisiológica y nutricionalmente. En la octava edición del Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology (1974), la especie Beneckea harveyi estaba incluida en el reciente género descrito Lucibacterium, caracterizado por agrupar especies con flagelación peritrica. Además, la especie B. parahaemolytica estaba incluida en el género Vibrio, y la especie B. alginolytica, era considerada un biotipo de la especie B. parahaemolytica (Hendrie y Shewan, 1974). Sin embargo, Reichelt y col. (1976) propusieron incluir en el mismo género Beneckea a todas las especies del grupo “harveyi” debido a la elevada similitud fenotípica y genómica, y al no existir suficientes características como para separarlas en géneros diferentes. Fue entonces cuando se estableció el grupo de hibridación DNA-DNA “harveyi”, dotando a harveyi, campbellii, parahaemolyticus y alginolyticus la categoría de especie. Fue en 1980, cuando Baumann y col. reclasificaron el género Beneckea tras analizar la evolución de las secuencias aminoacídicas de la glutamina sintetasa y la superoxido dismutasa, pasando a pertenecer las seis especies del género Beneckea al género Vibrio (Figura 1). Posteriormente, Brenner y col. (1983) establecieron un valor del 30% de hibridación DNA-DNA para agrupar especies, sugiriendo que V. natriegens, V. pelagius, V. splendidus, V. nereis y quizás V. vulnificus, podían ser incluidas en el grupo de hibridación compuesto por las especies V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. campbellii y V. harveyi, planteándose la posibilidad de definir ese grupo como un nuevo género. En 1992, Dorsch y col. tras
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un estudio filogenético del género Vibrio basado en el análisis de las secuencias parciales del gen 16S rRNA definieron lo que actualmente se conoce como el clado central o core group del género Vibrio. De las 10 especies incluidas en el estudio, V. harveyi, V. campbellii, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. natriegens, V. proteolyticus y V. vulnificus fueron las que presentaron una posición central en el árbol resultante, mientras que las especies Vibrio (Listonella) anguillarum, V. diazotrophicus y V. (Grimontia) hollisae presentaron una posición periférica. Este es el motivo por el que se le denominó clado central del género. Posteriormente, conforme se dispusieron de secuencias del 16S rRNA completas y curadas, las especies V. proteolyticus y V. vulnificus fueron excluidas del clado central (Aznar y col., 1994). Actualmente el clado central lo constituyen las especies V. harveyi, V. campbellii, V. rotiferianus, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. natriegens. La especie V. rotiferianus, que se encuentra estrechamente relacionada con las especies V. harveyi y V. campbellii, fue incluida en el core group tras ser descrita por Gómez-Gil y col. (2003). A fecha de hoy, el clado central también es designado como grupo de V. harveyi tal y como lo definió inicialmente Reichelt y col. (1976). Hasta la fecha, se han realizado varios trabajos de MLSA que confirman las relaciones entre las especies del clado central del género Vibrio que se habían obtenido en los estudios previos, corroborando que este clado se encuentra en una estadio inicial de diversificación, dificultando con ello la diferenciación entre las especies tanto fenotípica como genómicamente (Nhung y col., 2007; Thompson y col., 2007).
Figura 1. Rango de valores de hibridación DNA-DNA entre las especies del clado central del género Vibrio. Aquellas especies que no aparecen conectadas en la red presentan valores de reasociación inferiores al 30% (Datos obtenidos de Baumann y Baumann, 1977; Brenner y col., 1983; Gómez-Gil y col., 2003).
V. harveyi
V. campbellii
V. rotiferianus
V. alginolyticus
V. natriegens
V. parahaemolyticus47-59
61-74 61-67
37-44 48-5666
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V. harveyi. Debido a que algunas cepas presentan luminiscencia, la especie fue descrita por primera vez como “Achromobacter harveyi” por Johnson y Shunk (1936), quiénes la designaron así en honor a E. N. Harvey, un pionero en los estudios de bioluminiscencia. Posteriormente, fue incluida en el género Lucibacterium (Hendrie y col., 1970) y Beneckea (Reichelt y Baumann, 1973), y ubicada finalmente en el género Vibrio (Baumann y col., 1981). Además, las especies patógenas de peces V. carchariae (Grimes y col., 1985) y V. trachuri (Iwamoto y col., 1996) son consideradas sinónimos de V. harveyi en base a estudios moleculares (Pedersen y col., 1998; Gauger y Gómez-Chiarri, 2002; Thompson y col., 2002). V. harveyi es una de las especies heterotróficas dominantes en ambientes acuáticos, principalmente durante los meses cálidos, tanto en estado de vida libre, como comensal en los sistemas digestivos de animales marinos, o como patógeno oportunista y/o primario de animales marinos (Ramesh y col., 1990, Ortigosa y col., 1994; Arias y col., 1999; Makemson y col., 1999; Pujalte y col., 1999).
V. harveyi se ha descrito como patógeno en varias especies de peces de importancia en el sector de la acuicultura y ornamentales (dorada, lubina, salmón, lisa, acedía, caballito de mar, etc.) (Zhang y Austin, 2000; Pujalte y col., 2003a; Zorrilla y col., 2003; López y col., 2009), crustáceos (Lavilla-Pitogo y col., 1998; Bourne y col., 2006), moluscos (Nishimori y col., 1998) y corales (Sutherland y col., 2004), siendo este carácter variable dentro de la especie. Desde la década de los 90, V. harveyi se ha relacionado con infecciones que han causado grandes pérdidas económicas a gran escala en el sector de la acuicultura mundial (Alvarez y col., 1998). La enfermedad que causa se denomina vibriosis luminosa y los síntomas son, entre otros, letargo, necrosis de los tejidos y apéndices, crecimiento lento, metamorfosis aberrantes, malformaciones corporales, bioluminiscencia (el hospedador brilla en la oscuridad) y anorexia (Robertson y col., 1998). La erradicación de V. harveyi resulta difícil y el uso de antibióticos de manera no controlada ha permitido el desarrollo de cepas resistentes a antibióticos (Karunasagar y col., 1994). V. harveyi, así como sus especies hermanas V. campbellii y V. rotiferianus, no son consideradas patógenos humanos de riesgo, siendo esporádicos los casos de infección en humanos (Wilkins y col., 2007).
Los mecanismos de virulencia de V. harveyi no se han dilucidado por completo a fecha de hoy, pues intervienen muchos
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factores, pudiendo variar entre cepas así como entre hospedadores (Zhang y Austin, 2000; Austin y Zhang, 2006). Algunos mecanismos de virulencia son (i) la excreción de productos extracelulares como proteasas, hemolisinas y lipasas (Zhang y Austin, 2000; Teo y col., 2003); (ii) los LPS (Montero y Austin, 1999); (iii) bacteriocinas (Prasad y col., 2005); (iv) el quorum sensing (Henke y Bassler, 2004); (v) la capacidad de formar biopelículas (Karunasagar y col., 1994); (vi) la presencia de fagos en el genoma (Oakey y Owens, 2000) y (vii) la capacidad de secuestrar hierro (Owens y col., 1996).
V. campbellii. Es un vibrio marino descrito por primera vez por Baumann y col. (1971) como Beneckea campbellii en honor al bacteriólogo americano L. L. Campbell, tras aislarla en la costa de Hawaii (Baumann y col., 1971). Presenta valores de reasociación DNA-DNA respecto a V. harveyi que oscilan entre el 61 y el 74% (Reichelt y col., 1976; Brenner y col., 1983). V. campbellii se encuentra tanto en mar abierto como en la costa (Grimes y col., 1986) y puede ser patógena de animales marinos como por ejemplo diversas especies de crustáceos (Defoirdt y col., 2008).
V. rotiferianus. Fue descrita por Gómez-Gil y col. (2003) tras aislar varias cepas a partir de rotíferos así como del agua de los tanques de cultivo de éstos en Bélgica. Sus vecinos filogenéticos más próximos son V. harveyi y V. campbellii. Ha resultado ser patógena de peces como la trucha arcoíris y crustáceos. Causa necrosis de los músculos internos con hemorragias. Algunos de los posibles factores de virulencia son los productos extracelulares que excreta tales como fosfolipasas, caseinasa y gelatinasa, sin embargo no produce hemolisinas (Austin y col., 2005).
V. parahaemolyticus. Fue aislado por primera vez por Fujino y col. en 1951, tras un brote gastroentérico ocurrido en Japón en 1950. Inicialmente fue clasificado como Pasteurella parahaemolytica (Fujino y col., 1951). Posteriormente fue reclasificada como Oceanomonas parahaemolytica (Miyamoto y col., 1961) y Vibrio parahaemolyticus (Sakazaki y col., 1963). En 1971, Baumann y col. describieron la especie Beneckea parahaemolyticus, pero debido a que la cepa tipo de la especie era la misma que la de la especie V. parahaemolyticus, ésta fue transferida al género Vibrio. V. parahaemolyticus es una bacteria patógena que causa brotes esporádicos de gastroenteritis aguda, debido normalmente a la ingesta de peces o moluscos marinos principalmente crudos. La sintomatología de la infección es una
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gastroenteritis con náuseas, vómitos, dolor abdominal y fiebre. La diarrea generalmente es acuosa, aunque a veces es sanguinolenta. Generalmente la patología de la enfermedad no es muy grave, aunque en algunas ocasiones especiales (personas inmunodeprimidas) puede ocasionar la muerte. El tratamiento consiste en una re-hidratación junto con el suministro de antibióticos tipo tetraciclina. Existe una relación entre la virulencia de V. parahaemolyticus y la capacidad de producir una hemolisina para sangre humana (Ljungh y Wadstrom, 1983). No obstante, todavía no están dilucidados todos los mecanismos de la patogénesis, pues posee otros factores de virulencia que pueden estar implicados.
V. alginolyticus. Se asocia a ambientes marinos y algunas cepas pueden ser patógenas para humanos (Furniss y col., 1978; Sakazaki y Balows, 1981). Las primeras cepas de V. alginolyticus aisladas fueron clasificadas como biotipo 2 de la especie V. parahaemolyticus (Sakazaki y col., 1963), aunque posteriormente se describieron como una especie nueva, primero como “Oceanomonas alginolytica” (Miyamoto y col., 1968), después como Beneckea alginolytica (Sakazaki, 1968) y finalmente como Vibrio alginolyticus (Sakazaki y Balows, 1981). Las cepas que son patógenas de humanos afectan a tejidos blandos, ubicándose fundamentalmente en heridas y oídos, aunque también pueden infectar en los ojos (Rubin y Tilton, 1975; Pien y col., 1977). Como ocurre con las otras especies patógenas del clado central del género, los factores de virulencia no están del todo aclarados. Los antibióticos suelen ser la medida paliativa a tomar en caso de infección en humanos.
V. natriegens. Fue designada inicialmente como Pseudomonas natriegens por Payne y col. (1961), tras ser aislada del barro de un pantano salado en la isla de Sapelo, cerca de la costa de Georgia. Posteriormente pasó a denominarse Beneckea natriegens (Baumann y col., 1971) y finalmente Vibrio natriegens (Webb y Payne, 1971). Esta especie se caracteriza por utilizar una amplia variedad de fuentes de carbono en comparación con otros vibrios marinos (Baumann y Baumann, 1984), cosa que facilita su aislamiento e identificación. También se caracteriza por tener un tiempo de generación corto (9,8 min) (Eagon, 1962). Fenotípica y genómicamente es la especie más distante dentro del clado central del género Vibrio.
La metodología que tradicionalmente se ha utilizado para la identificación y tipado de los vibrios se ha basado fundamentalmente en
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caracteres fenotípicos: (i) morfología, bioquímica y fisiología; (ii) métodos serológicos; (iii) perfiles de susceptibilidad a agentes antimicrobianos. La complejidad a la hora de diferenciar fenotípicamente los miembros del clado central del género Vibrio varía según las especies. Diferenciar fenotípicamente entre V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus resulta complejo debido a los escasos caracteres fenotípicos diferenciales que existen entre las tres especies (Tabla 2). Mientras algunos autores sugieren que las especies V. harveyi y V. campbellii pueden ser diferenciadas fenotípicamente (Alsina y Blanch, 1994a, 1994b; Harris y col., 1996), otros autores apoyan la idea de que las pruebas fenotípicas carecen de suficiente poder de resolución para diferenciarlas (Gauger y Gómez-Chiarri, 2002), del mismo modo que Gómez-Gil y col. (2004) señalan la dificultad para diferenciarlas entre sí así como de V. rotiferianus. Una identificación incorrecta de las tres especies ha podido causar una subvaloración de V. campbellii y V. rotiferianus respecto a V. harveyi como patógenos de animales marinos. Las especies V. parahaemolyticus y V. alginolyticus, a diferencia de V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus, sí pueden ser diferenciadas entre sí fenotípicamente, de una manera sencilla y fiable mediante varias pruebas fenotípicas (Tabla 2). Finalmente, en el caso de V. natriegens la identificación fenotípica es muy sencilla, pues presenta bastantes caracteres diferenciales con respecto a las otras cinco especies.
Tabla 2. Caracteres fenotípicos diferenciales entre las especies (1) V. harveyi, (2) V. campbellii, (3) V. rotiferianus, (4) V. parahaemolyticus, (5) V. alginolyticus y (6) V. natriegens. +, positivo para ≥ 90%; (+) positivo para el 75-89%; -, positivo para ≤ el 10%; (-) positivo para 11-25%; v, variable para el 26-74%; nd, no determinado. Alsina y Blanch, 1994a; Gómez-Gil y col., 2003; Farmer III y col., 2005b; Farmer III y Hickman-Brenner, 2006.
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Test 1 2 3 4 5 6 Voges-Proskauer - - - - + - Crecimiento en caldo nutritivo con:
8% NaCl - v - (+) + + 10% NaCl - - - - v -
Lisina descarboxilasa (+) + + + + - Ornitina descarboxilasa v (-) + + v - Utilización de:
L-arabinosa v - + v - v citrato - v - + (+) nd D-manitol + (+) - + + nd melibiosa - - + - - +
Formación de ácido de: L-arabinosa - - + (+) - + amigdalina + - + nd nd nd galactosa v - nd v (-) v sacarosa + - nd - + + salicina - - nd - - + celobiosa - + nd - - (+) lactosa - - nd - - -
Ácidos grasos celulares (%) 14:0 5 4 10 nd nd nd 16:0 14 17 25 nd nd nd 18:1ω7c 21 23 11 nd nd nd
Las especies del clado central del genero Vibrio, debido a su reciente diversificación, poseen una elevada similitud genómica que hace que ciertas técnicas moleculares presenten limitaciones a la hora de identificar y tipificar a nivel inter e intraespecífico (Thompson y col., 2006; Sawabe y col., 2007). Las técnicas moleculares que más repercusión han tenido en el clado central del género Vibrio son la hibridación DNA-DNA, estudios basados en secuencias génicas (MLSA) así como técnicas de fingerprinting. Aunque la hibridación DNA-DNA es necesaria en la mayoría de las ocasiones en las que se quiere describir una nueva especie, no es apropiada para realizar de manera rutinaria identificaciones de aislados. Aunque de manera genérica está establecido un valor del 70% de reasociación DNA-DNA para definir la genomoespecie, algunos autores han sugerido un valor del 80% de reasociación DNA-DNA para definir genomoespecies dentro de la familia Vibrionaceae (Thompson y col., 2004). En el caso del core group, las especies V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus por un lado, y las especies V. parahaemolyticus y V. alginolyticus por otro, presentan valores de reasociación muy próximos al umbral establecido
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para delimitar la genomoespecies, siendo difícil y complejo diferenciarlas entre sí (Baumann y Baumann, 1977; Brenner y col., 1983; Gómez-Gil y col., 2003). (Figura 1, pág. 38).
Debido a los inconvenientes que presenta la hibridación DNA-DNA, se han efectuado estudios para evaluar el potencial que presentan diversas técnicas de tipificación molecular como métodos alternativos para la identificación y clasificación de las especies del core group. Las técnicas más relevantes que se han ensayado hasta la fecha como sustituto de la hibridación DNA-DNA han sido (i) Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP); (ii) Repetitive Extragenic Palindromic Elements PCR (Rep PCR) utilizando el cebador (GTG)5 u otros y (iii) Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Sin embargo, hasta el momento ningún estudio se ha centrado exclusivamente en las seis especies del clado central. Las técnicas AFLP y Rep PCR (GTG)5 han mostrado tener una elevada correlación con los datos de hibridación DNA-DNA, siendo propuestas como sustitutas o complementarias de la técnica estándar para definir la especie. Por el contrario, el potencial poder de resolución ha resultado ser inferior con las técnicas RAPD e ISR 16S-23S (Thompson y col., 2001; Gómez-Gil y col, 2004; Thompson y Swings, 2006). Estas técnicas de tipificación también han sido utilizadas para clasificar e identificar asilados ambientales pertenecientes a la familia Vibrionaceae. En estos estudios, han sido varios los casos donde diversos grupos obtenidos no identificados han resultado ser, tras ser evaluados mediante estudios polifásicos, nuevos taxones (Gómez-Gil y col., 2008; Beaz-Hidalgo y col., 2009).
Otro tipo de técnica que ha sido utilizada para realizar identificaciones y clasificaciones en el clado central del género Vibrio, es el análisis de secuencia del gen 16S rRNA y de otros genes housekeeping. Las relaciones filogenéticas dentro del clado central del género Vibrio son: (i) V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus quedan agrupadas por un lado; (ii) otro linaje lo forman las especies V. parahaemolyticus y V. alginolyticus y (iii) por otro lado, vecina a las especies V. parahaemolyticus y V. alginolyticus se encuentra V. natriegens. (Figura 2).
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Figura 2. Reconstrucción filogenética de las especies del clado central del género Vibrio utilizando las secuencias parciales del 16S rRNA disponibles en las bases de datos públicas para las cepas tipo. El árbol se ha obtenido mediante el método de Neigbour Joining aplicando el modelo evolutivo K2P. La barra representa las sustituciones nucleotídicas por sitio.
Aunque el 16S rRNA se considera el marcador estándar, las similitudes génicas entre las seis especies son superiores al 98% debido a su reciente diversificación. Otros marcadores utilizados para delimitar especies y estudiar la historia evolutiva en la familia Vibrionaceae y más específicamente entre las especies V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus han sido los genes rpoA (subunidad alfa de la RNA polimerasa), pyrH (uridilato quinasa), recA (proteína reparadora de DNA y de la recombinasa), gyrB (subunidad B de la girasa), gapA (gliceraldehido-3-fosfodeshidrogenasa), mreB (subunidad B de una proteína del citoesqueleto tipo actina), ftsZ (proteína implicada en la división celular), y topA (topoisomerasa I) (Thompson y col., 2007). De los ocho genes, topA, pyrH, ftsZ y mreB resultaron ser útiles para diferenciar entre las especies V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus, mientras que los genes gyrB, recA y gapA, resultaron ser los menos resolutivos. No obstante, las conclusiones del trabajo de Thompson y col. (2007) deben ser tomadas con cautela puesto que incluyeron un reducido número de cepas de V. rotiferianus y ninguna de las otras tres especies del clado central, centrando el estudio principalmente en dos especies, V. harveyi y V. campbellii; y no reflejando la complejidad que conlleva resolver todo el core group. Esos mismos marcadores han sido utilizados para inferir la historia evolutiva de la familia Vibrionaceae (Sawabe y col., 2007), estableciéndose que las especies V. harveyi y V. campbellii se diversificaron posiblemente hace 39 millones de años, mientras que V. harveyi respecto a V. parahaemolyticus hace 105 millones de años.
V. harveyi ATCC 14126T (X74706)
V. campbellii ATCC 25920T (X74692)
V. rotiferianus CAIM 577T (AJ316187)
V. parahaemolyticus ATCC 17802T (X74720)
V. alginolyticus ATCC 17749T (X74690)
V. natriegens ATCC 14048T (X74714)
V. cholerae CECT 514T (X76337)
0.005
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5. El género Enterovibrio El género Enterovibrio fue propuesto por Thompson y col. (2002) para acomodar una serie de cepas aisladas de larvas de Scophthalmus maximus y que compartían caracteres fenotípicos con las especies del género Vibrio, aunque filogenéticamente se encontraban más próximas a la especie Grimontia hollisae (basónimo Vibrio hollisae), con una similitud de secuencia del 16S rRNA del 94%. Con aquel conjunto de cepas se propuso la especie E. norvegicus y tres años después, Thompson y col. (2005b) describieron Enterovibrio coralii.
En otros estudios se constató que Vibrio calviensis (Denner y col., 2002) se encuentra filogenéticamente más relacionada con el género Enterovibrio que con el género Vibrio pero sin hacer ninguna propuesta formal de reclasificación (Thompson y col., 2005b; Sawabe y col., 2007). Los miembros del género Enterovibrio comparten muchos caracteres fenotípicos con los miembros de la familia Vibrionaceae, y más concretamente con los del género Vibrio. Diferenciar los enterovibrios de los géneros Photobacterium y Salinivibrio es fácil ya que los miembros del género Enterovibrio, a diferencia de los otros dos, producen indol y no producen acetoína. También se pueden diferenciar del género Salinivibrio porque carecen de actividad gelatinasa. Además, mientras que la mayoría de las especies del género Vibrio y Aliivibrio reducen el nitrato (excepto V. cyclitrophicus, V. gazogenes, V. metschnikovii y A. salmonicida) y utilizan el piruvato (excepto V. halioticoli y V. tapetis) las especies del género Enterovibrio no. También, a diferencia de la mayoría de los vibrios (excepto V. lentus y V. aerogenes), las especies de Enterovibrio no son susceptibles al agente vibriostático O/129. El contenido genómico de G+C mol% en las especies del género Enterovibrio solapa parcialmente con los valores que muestran los vibrios. Las especies del género Enterovibrio presentan perfiles de ácidos grasos específicos y poseen caracteres diferenciales respecto a otras especies ADH e indol positivas de la familia Vibrionaceae (Tabla 3). Las dos especies del género descritas hasta la fecha se han aislado de hospedadores sintomáticos, E. norvegicus a partir de larvas de rodaballo y E. coralii a partir de corales en proceso de “blanqueado”.
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Tabla 3. Caracteres diferenciales entre los géneros de la familia Vibrionaceae. (1) Aliivibrio, (2) Enterovibrio, (3) Grimontia, (4) Photobacterium, (5) Salinivibrio y (6) Vibrio. +, positivo para ≥ 75% de las especies; -, positivo ≤ 25% de las especies; v, resultado variable entre las especies (Thompson y col., 2005b; Urbanczyk y col. 2007).
Carácter 1 2 3 4 5 6 Resistencia a O/129 - + - - - - Actividad gelatinasa - - - - + v Voges-Proskauer - - - + + - Arginina dihidrolasa - + - + + v Producción de indol - + + - - v Utilización de D-alanina - - + - + + G+C genómico mol% 38-42 49,4-50,5 47,1-47,9 40-44 49-50,5 38,8-50,6
Objetivos y Plan de Trabajo
Objetivos y Plan de Trabajo
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El presente estudio se ha enmarcado dentro de un proyecto de investigación que llevó por título Taxonomía, filogenia y conservación de bacterias marinas (CGL-2005-02292), y se ha centrado en un grupo taxonómico complejo de reciente diversificación evolutiva como es el clado central del género Vibrio. Los objetivos planteados en la presente Tesis Doctoral han sido:
1. Evaluar la capacidad de resolución taxonómica que presentan un conjunto de técnicas de tipificación molecular de manera individual así como combinadas (Rep PCR (GTG)5, RAPD M13, RAPD T7 e ISR 16S-23S) para identificar las seis especies constituyentes del clado central del género Vibrio: V. harveyi, V. campbellii, V. rotiferianus, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. natriegens.
2. Evaluar la capacidad de resolución taxonómica que presentan
un conjunto de genes (16S rRNA, recA, pyrH, gyrB, rpoD, rctB y toxR) de manera individual así como concatenando sus secuencias (MLSA) para identificar e inferir correctamente la historia evolutiva de las especies, teniendo en cuenta posibles fenómenos de transferencia horizontal de genes.
3. Evaluar el grado de concordancia entre el MLSA desarrollado
en la presente Tesis Doctoral y la técnica de hibridación DNA-DNA, a los efectos de proponerlo como alternativa a la misma para este grupo de especies.
4. Identificar correctamente un conjunto de 85 Vibrio sp.
identificados inicialmente como V. harveyi mediante caracterización fenotípica y un grupo de 5 Vibrio sp. identificados previamente como V. rotiferianus mediante la técnica Rep PCR (GTG)5.
5. Esclarecer la posición taxonómica de un conjunto de once
aislados de Enterovibrio sp., así como de la cepa tipo (y única existente) de V. calviensis DSM 14347T, mediante un estudio polifásico, haciendo uso del análisis de MLSA optimizado previamente (además de la caracterización fenotípica y de hibridación DNA-DNA).
Material y Métodos
Material y Métodos
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1. Cepas bacterianas, condiciones de cultivo y conservación
En el estudio se han utilizado 134 cepas (Tabla 4) pertenecientes a la familia Vibrionaceae procedentes de colecciones de cultivo, así como un conjunto de cepas ambientales aisladas de muestreos de dorada (Sparus aurata L., 1758), dentón (Dentex dentex L., 1758) y lubina (Dicentrarchus labrax L., 1758) cultivadas en la costa mediterránea durante los años 1996-1997 y 1999-2000 (Company y col., 1999; Pujalte y col., 2003a). Las muestras ambientales se tomaron de los órganos internos (riñón anterior y ocasionalmente hígado) y úlceras de peces sintomáticos y asintomáticos. Las muestras se sembraron en placas de Marine Agar (MA) y Agar Triptona Soja (TSA) suplementado con 1% de NaCl. Tras una incubación inicial de 48-72 h a 20-25 oC, se realizó una primera selección de cepas, incubando las placas posteriormente hasta diez días. Finalmente, se purificaron las colonias recuperadas por triple estría en placas de MA y se identificaron inicialmente mediante una batería de pruebas fenotípicas como presuntos V. harveyi (Pujalte y col., 2003a; 2003b). Los aislados ambientales CAIM 780, R379, R1024, R1117 y R1311 fueron cedidos e identificados como V. rotiferianus en base a la técnica Rep PCR (GTG)5 (Tabla 4) por Gómez-Gil (comunicación personal).
Las cepas se cultivaron de manera rutinaria en Marine agar (MA) y Marine broth (MB) y se incubaron a 20-25 oC durante 24-48 h, en condiciones aerobias. Todas las cepas se conservaron en:
Tubos de agar marino semisólido, sembrados por picadura y conservados a temperatura ambiente en oscuridad.
Suspensión de células en MB suplementado con glicerol al 20% (v/v) y conservadas a -80 oC.
Material y Métodos
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Tabla 4. Cepas utilizadas en la presente Tesis Doctoral, con indicación del origen y año de aislamiento.
Especie Cepa Origen Vibrio harveyi CECT 525T Anfípodo luminiscente muerto (Talorchestia sp.); EEUU Vibrio campbellii CECT 523T Agua de mar; EEUU CAIM 9 Hepatopáncreas de langostino (Penaeus monodon); Filipinas CAIM 128 Hemolinfa de langostino enfermo (Penaeus sp,); México, 2000 CAIM 333 Agua de tanques con crías de camarón azul (Litopenaeus stylirostris); Méjico, 1999 CAIM 392 Larva de langostino carnoso enferma (Penaeus chinensis); China CAIM 415 Agua de tanques con crías de camarón azul (Litopenaeus stylirostris); Méjico, 1999 CAIM 419 Hemolinfa de camarón (Litopenaeus sp.); Méjico, 2001 CAIM 521 Agua de mar; EEUU Vibrio rotiferianus CAIM 577T Agua de tanques de cultivo de rotífero (Brachionus plicatilis); Bélgica, 1999 CAIM 573 Agua de tanques de cultivo de rotífero (Brachionus plicatilis); Bélgica, 1999 CAIM 574 Agua de tanques de cultivo de rotífero (Brachionus plicatilis); Bélgica, 1999 CAIM 575 Agua de tanques de cultivo de rotífero (Brachionus plicatilis); Bélgica, 1999 CAIM 576 Agua de tanques de cultivo de rotífero (Brachionus plicatilis); Bélgica, 1999 Vibrio parahaemolyticus
CECT 511T Paciente intoxicado con "Shirashu"; Japón; 1951 CECT 5305 Pez limón (Seriola dumerili); España, 1998
CECT 5271 Intoxicación alimentaria a partir de berberechos infectados; UK CECT 611 Agua de mar; España, 1981 Vibrio alginolyticus
CECT 521T Intoxicación alimentaria a partir de jurel infectado (Trachurus trachurus); Japón CECT 436 Comida; 1962
CECT 586 Mejillón; Holanda CECT 609 Plancton marino; España Vibrio natriegens CECT 526T Barro de una marisma; EEUU CECT 7465 Ostra; EEUU CECT 7466 Agua de mar; EEUU Vibrio cholerae CECT 514T Heces humanas Vibrio calviensis DSM 14347T Agua del mar Mediterráneo; Francia, 1999 Grimontia hollisae CECT 5069T Heces humanas; Annapolis, EEUU Enterovibrio coralii CAIM 912T Extracto de coral en proceso de blanqueado (Merulina ampliata); Australia, 2002 Enterovibrio norvegicus
CECT 7288T Intestino de larva de rodaballo (Scophthalmus maximus); Noruega,1997 LMG 19840 Intestino de larva de rodaballo (Scophthalmus maximus); Noruega, 1997
LMG 19842 Intestino de larva de rodaballo (Scophthalmus maximus); Noruega, 1997 Enterovibrio sp. 8/13 Riñón anterior de dentón (Dentex dentex); España, 1997 9/1a Riñón anterior de dentón (Dentex dentex); España, 1997 9/1c Riñón anterior de dentón (Dentex dentex); España, 1997 9/2a Riñón anterior de dentón (Dentex dentex); España, 1997 9/2b Riñón anterior de dentón (Dentex dentex); España, 1997 9/5b Riñón anterior de dentón (Dentex dentex); España, 1997 10/6 Riñón anterior de dentón (Dentex dentex); España; 1997 11/2a Riñón anterior de dentón (Dentex dentex); España, 1997 DAl 1-1-5T Riñón anterior de dorada (Sparus aurata); España, 2000 DAl 1-1-4 Riñón anterior de dorada (Sparus aurata); España, 2000 8/6b Dentón (Dentex dentex); IATS; España; 1997 Vibrio sp. (identificados fenotípicamente como V. harveyi)
H1 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H2 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H3 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H4 Dorada (Sparus aurata); España, 2004
H5 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H6a Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H6b Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H7 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H8 Dorada (Sparus aurata); España, 2004
Material y Métodos
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Especie Cepa Origen Vibrio sp. (identificados fenotípicamente como V. harveyi)
H9a Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H9b Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H10 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H11 Dorada (Sparus aurata); España, 2004
H12 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H13 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H14 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H15 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H16 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 H17 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 LCL 1-4-9 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2004 LCL 1-4-10 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2004 Dsint 11 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 Dsint 12 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 Dsint 13 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 Dsint 1 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 Dsint 4 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 Dsint 5 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 Denton10 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 DPD 4-1-13 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 DPD 4-1-12 Dorada (Sparus aurata); España; 2004 DPD 4-1-7 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 DPD 4-1-4 Dorada (Sparus aurata); España, 2004 SA F1s 8/24 Dorada (Sparus aurata); España, 1997 SA F3s 38 Dorada (Sparus aurata); España, 1999 SA F3s 39 Dorada (Sparus aurata); España, 1999 SA F3s 40 Dorada (Sparus aurata); España, 1999 SA F3s 53 Dorada (Sparus aurata); España, 1999 SA F3s 54 Dorada (Sparus aurata); España, 1999 SA F3s 55 Dorada (Sparus aurata); España, 1999 SA F4s 17 Dorada (Sparus aurata); España, 1999 SA F1s 9 Dorada (Sparus aurata); España, 1999 SA F1s 10 Dorada (Sparus aurata); España, 1999 SA F1s 11 Dorada (Sparus aurata); España, 1999 SA F1s 12 Dorada (Sparus aurata); España, 1999 DL F5 57 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-3 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-10 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-31 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-32 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-39 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-79 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-82 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-83 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-84 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-86 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-7 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-11 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-18 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-19 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-20 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-21 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-24 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-26 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-35 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999
Material y Métodos
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Especie Cepa Origen Vibrio sp. (identificados fenotípicamente como V. harveyi)
LPD 1-1-40 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-1-43 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 1999 LPD 1-3-1 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-2 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000
LPD 1-3-7 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-10 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-11 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-12 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-15 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-17 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-18 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-19 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-20 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-24 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-25 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-26 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-27 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-29 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-31 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-32 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-34 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 LPD 1-3-35 Lubina (Dicentrarchus labrax); España, 2000 Vibrio sp. (cedidos por Gómez-Gil como V. rotiferianus)
CAIM 780 Hemolinfa de camarón blanco (Litopenaeus vannamei); Méjico, 2003 R379 Ostra (Crassostrea gigas); Bahía de Alfacs, España, 2005 R1024 Coral (Mussismilia hispida); Brasil, 2005 R1117 Moco de coral (Mussismilia hispida); Brasil, 2005
R1311 Cangrejo araña (Maja brachidactyla); España
Material y Métodos
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2. Caracterización morfológica, bioquímica, fisiológica y quimiotaxonómica Si no se indica lo contrario, las condiciones de incubación fueron 20-25 ºC durante 24-48 h en condiciones aerobias. Excepto los medios MA, MB y TCBS, el resto de medios comerciales y diluyentes se suplementaron con 2% NaCl o con Artificial Sea Water (ASW) a la mitad de concentración para satisfacer las necesidades salinas.
Morfología, movilidad y tamaño celular
Se determinó por observación directa al microscopio óptico de contraste de fases (400× y 1000×) a partir de una suspensión en ASW a la mitad de concentración de células recolectadas en fase de crecimiento exponencial en MA.
Flagelos
La presencia de flagelos se analizó tiñendo suspensiones celulares con el colorante de Ruy (Heimbrook y col., 1989).
Metabolismo Oxidativo-Fermentativo de glucosa (O/F)
Se empleo el medio basal O/F (Difco) rehidratado con ASW a la mitad de concentración y suplementado con los pertinentes carbohidratos al 1% (p/v).
Características coloniales
El crecimiento invasivo sobre agar o swarming se observó a distintos intervalos de tiempo en placas de MA incubadas hasta 7 días (Baumann y Baumann, 1981).
La producción de pigmentos se analizó en placas de MA incubadas hasta 15 días.
El carácter luminiscente de las bacterias se comprobó observando en oscuridad los cultivos crecidos en MA durante 24h.
Reducción de nitratos
La capacidad de reducir nitratos a nitritos se ensayo en caldo nitrato suplementado con NaCl al 1% (p/v) en cultivos crecidos durante 3-5 días, revelando el resultado posteriormente con los reactivos de Griess 1 y 2 (Smibert y Krieg, 1981).
Material y Métodos
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Oxidasa y Catalasa
Se realizaron siguiendo la metodología propuesta por Gerhardt y col. (1994).
L-arginina dihidrolasa (ADH) de Thornley
Se realizó en el medio de Thornley de acuerdo con Baumann y Baumann, (1981).
L-lisina y L-ornitina descarboxilasa (LDC y ODC) y L- arginina dihidrolasa (ADH) de Moeller
Al medio basal de Moeller (Difco) se le añadió el correspondiente aminoácido al 0,5% (p/v) (Lee y Donovan, 1985).
Prueba de Voges-Proskauer (VP)
Se determinó siguiendo la metodología de Furniss y col. (1978).
Medio Tiosulfato/ Citrato/ Sales Biliares/ Sacarosa (TCBS)
Se observó el crecimiento y la producción de ácido a partir de la sacarosa en el medio selectivo y diferencial para vibrios (Oxoid).
Utilización de distintos sustratos como fuente única de carbono y energía
El estudio del espectro nutricional de las cepas se llevó a término utilizando medio basal (BM) suplementado con agar purificado al 1,0% (p/v) y el sustrato correspondiente (Baumann y col., 1984). Se ensayaron cincuenta y tres compuestos, incluyendo carbohidratos, aminoácidos, ácidos orgánicos y aminas. En el estudio se incluyeron un control positivo compuesto por BM, 1,0% (p/v) de agar purificado y 0,5% (p/v) de extracto de levadura y un control negativo compuesto únicamente por BM y 1,0% (p/v) de agar purificado. Las placas se incubaron hasta 15 días (Baumann y col., 1984).
Enzimas hidrolíticas extracelulares
Gelatina, licuefacción
Se utilizó MB suplementado con gelatina (Oxoid) al 12% (p/v). Los tubos se inocularon por picadura y se mantuvieron siete días en incubación. Para la lectura, los tubos se mantuvieron una hora a 4 ºC junto a un control negativo sin inocular. Solo los tubos en los que se hidrolizó la gelatina se mantuvieron líquidos a esta temperatura.
Material y Métodos
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Caseína
Se empleó el medio MA suplementado con leche descremada al 10% (v/v). Tras siete días de incubación, la aparición de halos transparentes alrededor de las colonias se consideró como una prueba positiva.
Tween 80
La presencia de lipasas se determinó por la aparición de un precipitado de cristales blancos (halos opacos) alrededor de las colonias crecidas en agar Tween 80.
Lecitina
Se utilizó el medio MA suplementado con una emulsión estéril de yema de huevo a una concentración final del 5% (v/v). La emulsión se preparó mezclando una yema de huevo en agua destilada 1:1 (v/v). La aparición de un halo opaco alrededor de las colonias se consideró como resultado positivo.
Almidón
La presencia de amilasas se evaluó en placas de MA suplementado con almidón soluble (Panreac) al 0,2% (p/v). Para la lectura del resultado se adicionó lugol. La aparición de una zona no teñida alrededor del crecimiento indicó la presencia de amilasas.
Alginato sódico
La hidrólisis del alginato se testó en placas de MA suplementado con alginato sódico (Sigma) al 2% (p/v). Se consideró como una prueba positiva la aparición de halos claros alrededor de las colonias.
DNA
Se analizó en el medio agar DNAsa (Oxoid). Tras 5-6 días de incubación se añadió a las placas HCl 1N para revelar el resultado. La aparición de halos claros fue indicativo de la presencia de la enzima desoxirribonucleasa.
Producción de indol
Se analizó sembrando las cepas en MB. Después de un periodo de incubación de 48 h se adicionaron unas gotas del reactivo de Kovacs para el indol (Kovacs, 1956). La aparición de un anillo rojo
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en la parte superior del tubo mostró la capacidad del microorganismo de producir indol a partir del triptófano.
Crecimiento a diferentes temperaturas
Las cepas fueron sembradas en placas de MA que fueron incubadas a 4, 15, 28, 37 y 40 ºC hasta 15 días.
Crecimiento a diferentes salinidades
El crecimiento a distintas salinidades se determinó en placas de MA. Para establecer la concentración mínima de sales requerida, se diluyó el medio MA con agua destilada hasta obtener una concentración de sales totales de 0,34, 0,68, 0,85, 1,02, 1,36, 1,7, 2,04, 2,55 y 3,06 % (p/v) (factor de dilución 0,1, 0,2, 0,25, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,75 y 0,9, respectivamente). La disminución en la concentración de nutrientes y de agar por la dilución, se compensó adicionando la cantidad adecuada de peptona, extracto de levadura y agar. Para determinar el valor umbral máximo de salinidad a la que puede crecer cada cepa se adicionó NaCl al MA para obtener concentraciones finales de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 y 15 % (p/v) (Macián y col., 2005).
Caracterización quimiotaxonómica
El análisis de los ácidos grasos y de la composición global (mol %) de bases del genoma se realizó en los servicios de identificación de la DSMZ.
Análisis de los ácidos grasos
Se analizaron mediante cromatografía de gases siguiendo la metodología descrita por Kämpfer y Kroppenstedt (1996). La biomasa fue obtenida a partir de placas de MA que se habían incubado durante 24 h a temperatura 26 ºC y en condiciones aerobias.
Composición global de bases del genoma
El análisis del contenido de G+C genómico se realizó mediante HPLC siguiendo la metodología descrita por Mesbah y col. (1989).
Material y Métodos
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3. Caracterización genético-molecular
3.1. Extracción, purificación y cuantificación del DNA genómico Se siguió el protocolo descrito por Lewington y col. (1987) con algunas modificaciones. A partir de un cultivo en MB en fase estacionaria (1 ml), se concentraron las células centrifugando a 10.000 rpm durante 2 min. El pellet obtenido se resuspendió en 500 µl de tampón salino-EDTA pH 8,0 y se añadió SDS al 25% hasta una concentración final del 2%. A continuación, se adicionó NaCl 5 M hasta una concentración final de 1 M. El cóctel se homogenizó invirtiendo sutilmente el eppendorf varias veces y se incubó a 65 oC durante 6 min. Después se añadió un volumen de cloroformo:alcohol isoamílico 24:1 (v/v) agitando el eppendorf vigorosamente e incubándolo a 37 oC durante 10 min. A continuación se centrifugó el eppendorf a 4.000 rpm durante 30 min a 4 oC. El sobrenadante resultante se transfirió a un nuevo eppendorf, precipitando el DNA al añadir 0,11 volúmenes de acetato de sodio y 0,6 volúmenes de isopropanol. Tras 5 minutos en hielo, se desechó el sobrenadante conservando en el eppendorf el DNA precipitado. El DNA se lavó dos veces con etanol al 70% (v/v) y una con etanol absoluto (v/v). Finalmente se dejó evaporar el etanol y se resuspendio el DNA en SSC 0,1× a 4 oC.
Una vez resuspendido el DNA, se realizó una purificación para eliminar el RNA y las proteínas que hubieran sido arrastradas en la extracción. Para ello, se añadió SSC 10× hasta una concentración final de SSC 1× y RNAsa A (0,5 mg/ml) hasta una concentración final de 10 µg/ml incubándolo 1 hora a 37 oC. Seguidamente se adicionó Proteinasa K (1 mg/ml) hasta una concentración final de 10 µg/ml y se incubó a 37 oC durante 2 h. Finalmente se repitió el protocolo de extracción de DNA genómico descrito anteriormente adicionando cloroformo:alcohol isoamílico y precipitando de nuevo el DNA con acetato de sodio e isopropanol. Tras realizar los correspondientes lavados con etanol se resuspendió el DNA en agua Milli-Q. La concentración del DNA genómico extraído y purificado se determinó espectrofotométricamente utilizando un espectrofotómetro GeneQuant RNA/DNA Calculator (Pharmacia Biotech). Este equipo tiene unas lámparas de deuterio que permiten analizar absorbancias a
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las longitudes de onda: 230, 260 y 280 nm. Se estimó la concentración de DNA genómico asumiendo que una unidad de absorbancia a 260 nm en una cubeta de cuarzo (1 cm ancho) equivale a una concentración de 50 µg/ml de DNA de doble cadena. La pureza de las muestras se determinó por el cociente de las absorbancias a 260 y 280 nm. Valores entre 1,65 y 1,9 se relacionan con un grado de pureza adecuado. Las proteínas absorben a 280 nm (principalmente por residuos de triptófano), de modo que dicho cociente disminuye al aumentar el nivel de contaminación proteica. La presencia de otras impurezas, tales como carbohidratos, EDTA y fenol se correlacionan con valores elevados de absorbancia a 230 nm.
Todos los DNA genómicos se ajustaron a una concentración final de 50 ng/µl con agua pura, libre de contaminantes como DNAsas y RNAsas (Sigma-Aldrich).
3.2. Técnicas de tipificación molecular: fingerprinting Todas las amplificaciones se realizaron en un termociclador PTC-100 MJ Research ThermoCycler. Con el fin de obtener la mayor reproducibilidad se estandarizaron el mayor número posible de variables en cada una de las distintas técnicas analizadas (Taq polimerasa, condiciones electroforéticas, concentración de los DNAs, etc.).
3.2.1. Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Esta técnica permite obtener polimorfismos de productos de amplificación utilizando cebadores de secuencia arbitraria. La reacción se llevó a término utilizando los cebadores M13 (5´-GAAACAGCTATGACCATG-3´) y T7 (5´-AATACGACTCACTATAGG-3´). El cóctel de PCR se preparó en un volumen final de 50 μl conteniendo: 5 μl del tampón de PCR 10x; 2,5 μl de MgCl2 (100 mM); 5 μl de dNTPs (10 mM); 1μl del cebador universal (50 pM); 0,5 µl de Taq polimerasa (5 unidades/µl) (Genotaq) y 5 μl de DNA a una concentración de 50 ng/μl. El proceso de amplificación consistió en (i) un ciclo de 5 min a 94 oC, (ii) cuarenta y cinco ciclos de 40 s a 94 oC, 1 min a 36 oC y 1 min a 72 oC, y (iii) una extensión final de 1 min a 72 oC.
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3.2.2. Repetitive Extragenic Palindromic-PCR (Rep-PCR)
Esta técnica consiste en la amplificación por PCR de fragmentos palindrómicos repetitivos extragénicos. El cebador empleado para la reacción fue el (GTG)5 (5´-GTGGTGGTGGTGGTG-3´), propuesto por Versalovic y col. (1994). Tanto el cóctel de reacción como los ciclos de amplificación que se utilizaron fueron una modificación del protocolo descrito por Gómez-Gil y col. (2004) para la identificación molecular de microorganismos próximos a V. harveyi. La reacción se llevo a cabo en un volumen final de 50 μl compuesto por: 1 μl del cebador (GTG)5 (50 pM); 0,5 µl de Taq polimerasa (5 unidades/µl) (Genotaq); 5 μl del tampón de PCR 10x; 2,5 μl de MgCl2 (100 mM); 5 μl de dNTPs (10 mM); 5 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) y 5 μl de DNA (50 ng/μl). La reacción de amplificación se basó en (i) un ciclo de 2 min a 95 oC, (ii) treinta ciclos de 2 min a 92 oC, 1 min a 40 oC y 5 min a 65 oC, seguido finalmente de (iii) una extensión de 8 min a 65 oC.
3.2.3. 16S-23S rRNA Intergenic Spacer Region PCR (ISR-PCR)
Esta técnica permite analizar el número y tamaño de las regiones intergénicas ubicadas entre los genes 16S y 23S rRNA de los distintos operones que presenta un genoma. La amplificación se realizó utilizando los cebadores: 1387V (5´-GCCTTGTACACWCCGCCC-3´) y 118R (5´-GTTNCCCCATTCRGA-3´).
El cóctel de PCR y las condiciones de amplificación utilizadas se basaron en el trabajo publicado por Chenoll y col. (2003) con ciertas modificaciones. El cóctel de reacción (volumen final de 50 μl) estaba compuesto por 5 μl de tampón de PCR 10x, 1 μl de dNTPs (10 mM), 0,75 μl de MgCl2 (100 mM), 1 μl de cada cebador, directo y reverso (50 pM), 0,5 µl de Taq polimerasa (5 unidades/µl) (Genotaq) y 5 μl de DNA (50 ng/μl) todo ello en un volumen final de 50μl. Las condiciones de amplificación fueron (i) 5 min a 94 oC; seguido por (ii) 35 ciclos a 94 oC durante 30 s, 45 s a 56 oC y 45 s a 72 oC; y (iii) una extensión final a 72 oC durante 10 min.
3.2.4. Análisis de los perfiles electroforéticos
Los productos de amplificación obtenidos en las tres técnicas de tipificación molecular descritas anteriormente se separaron mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa. Se utilizaron geles (11 × 14
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cm) de agarosa de baja EEO (Pronadisa) al 1,2 % (p/v). Se empleó TBE 1× como tampón de electroforesis y se aplicó un voltaje de 90 V hasta que el frente de carrera migró 9 ± 0,5 cm. Se cargaron 15 µl de cada amplificado. Los geles se tiñeron en bromuro de etidio (0,3 mg/ml) y se fotografiaron bajo luz UV. Las imágenes de los geles se captaron usando una cámara de video GelPrinter Plus (TDI) y se guardaron en formato TIFF de 24-bits. Se cargaron dos marcadores de pesos moleculares a ambos flancos de cada gel, (i) 100 Base-Pair Ladder (GE Healthcare) y (ii) 1 KB plus DNA Ladder (Invitrogen), para poder posteriormente normalizar las imágenes de los geles y comparar entre sí los perfiles electroforéticos obtenidos en geles diferentes.
Debido a artefactos metodológicos, puede que una misma cepa no presente perfiles de bandas homogéneos entre sí en procesos de amplificación independientes. Esto puede causar que los resultados no reflejen realmente las diferencias genómicas entre cepas. Por ello, es importante analizar la reproducibilidad de los patrones de bandas en todas las técnicas de tipificación genómica. En este trabajo se constató llevando a cabo un mínimo de tres procesos de amplificación independientes por cada una de las cepas analizadas. Esto permitió seleccionar, tras una inspección ocular, perfiles cuyos número, tamaños e intensidades de bandas eran similares en al menos dos de los tres perfiles electroforéticos obtenidos por cepa. Además, para definir un valor de la reproducibilidad mínima de cada una de las técnicas, se calcularon matrices de similitud con los tres perfiles electroforéticos obtenidos en 25 cepas seleccionadas al azar del total, definiéndose la reproducibilidad mínima como el valor de similitud mínimo que se obtuvo al comparar conjuntamente los tres perfiles de cada una de las 25 cepas.
El análisis numérico de los perfiles obtenidos en cada técnica se realizó con la ayuda del paquete informático GelCompar v4.1 (Applied Maths). En cada una de las tres técnicas descritas anteriormente, se calculó la similitud entre los patrones de bandas en base a las curvas densitométricas (a partir de los valores comprendidos entre 0 y 255 dentro de la escala de grises) de cada una de las carreras (400 valores/curva densitométrica) mediante el coeficiente de similitud de Pearson (Rademaker y col., 2000). Además, con la finalidad de incrementar el poder de resolución de las técnicas, también se obtuvieron matrices de distancias basadas en la concatenación de los patrones electroforéticos obtenidos con Rep PCR (GTG)5, RAPD M13 y
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RAPD T7 (1200 valores/curva densitométrica) en lo que se conoce como “gel combinado” en el programa GelCompar v4.1. Los dendrogramas se construyeron a partir de las matrices de similitud obtenidas para cada una de las técnicas citadas mediante los algoritmos de agrupamiento UPGMA y Ward (Kosman y Leonard, 2005). En todos los casos, se aplicó una corrección de tolerancia en la posición de las bandas del 1% para compensar los posibles errores en el alineamiento de bandas homólogas debido a imperfecciones técnicas. Con cada una de las técnicas (RAPD, Rep PCR, ISR) se generaron dos dendogramas, uno por algoritmo aplicado. A su vez, en cada dendrograma se calculó el coeficiente de correlación cofenética (r), que mide el grado de congruencia entre el dendograma obtenido y la matriz de similitud original, ofreciendo una medida de la fidelidad de las relaciones entre OTU´s reflejadas en el dendrograma. De esta manera se pudo seleccionar el dendrograma con una menor distorsión respecto a los datos originales. Según Rohlf (1992) los valores de correlación cofenética pueden interpretarse de manera subjetiva. Si “r” posee un valor mayor a 0,9 se considera una correlación muy buena; entre 0,9 y 0,8 buena; entre 0,8 y 0,7 mala; y si es inferior a 0,7 muy mala.
Para definir los grupos en los distintos dendrogramas generados, se establecieron de manera particular unos valores umbrales de corte. Dichos valores se determinaron teniendo en cuenta la topología del árbol y las similitudes a las que se relacionaban los OTU´s entre sí. En la medida de lo posible se intentó evitar el agrupamiento de cepas tipo, ya que podría significar que se está utilizando un nivel umbral de similitud que alcanza valores supraespecíficos. Además, en todos los casos los valores umbrales de similitud elegidos fueron inferiores a los valores de similitud obtenidos en los estudios de reproducibilidad.
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3.3. Análisis multigénico (MLSA)
3.3.1. Amplificación y secuenciación de los genes
En el análisis multigénico se estudiaron siete genes: recA (recombinasa A), pyrH (uridilato quinasa), rpoD (factor σ70 de la RNA polimerasa), gyrB (subunidad B de la girasa), rctB (proteína de unión al origen de replicación), toxR (proteína de regulación transmembrana) y 16S rRNA (subunidad 16S del RNA ribosómico). Los cebadores utilizados para la amplificación así como las características más relevantes de los amplicones obtenidos se muestran en la Tabla 5. En todos los casos el cóctel de reacción se realizó en un volumen final de 50 μl, y estaba compuesto por 5 μl de tampón de PCR 10x, 1 μl de dNTPs (10 mM), 0,75 μl de MgCl2 (100 mM), 1 μl de cada cebador, directo y reverso (50 pM), 0,5 µl de Taq polimerasa (5 Unidades/µl) (Genotaq) y 5 μl de DNA (50 ng/μl). Las amplificaciones se realizaron en un termociclador PTC-100 MJ Research ThermoCycler. En el caso de los genes recA, pyrH, rpoD, gyrB, rctB y toxR el proceso de amplificación consistió en (i) 5 min a 95 oC; (ii) 3 ciclos de 1 min a 95 oC, 2 min 15 s a 55 oC y 1 min 15 s a 72 oC; (iii) 30 ciclos de 95 oC durante 35 s, 1 min 15 s a 55 oC y 1 min 15 s a 72 oC; (iv) y una extensión final de 7 min a 72 oC. En el caso del 16S rRNA las condiciones de amplificación fueron (i) 4 min a 94 oC; (ii) seguido por 30 ciclos de 1 min a 94 oC, 1 min 30 s a 52 oC, 2 min a 72 oC; (iii) y finalmente una elongación de 10 min a 72 oC. Los amplicones se examinaron en un gel de agarosa (1,2% (p/v) en TBE) y se tiñeron en bromuro de etidio (0,3 mg/ml). Posteriormente, los productos de amplificación se purificaron con el Ultraclean PCR Clean-up Kit (Mo Bio Laboratories), y se secuenciaron por el método de dideoxy usando un termociclador BigDyeTM v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit, y un secuenciador ABI PRIM 3700 (Applied Biosystems). Los cebadores utilizados para la secuenciación fueron los mismos que los utilizados en la reacción de amplificación pero diluidos 10 veces (5 pmol).
Material y Métodos
69
Tabla 5. Genes, productos génicos y cebadores utilizados en el estudio de MLSA.
Gen Producto génico Cebadores Secuencia de los cebadores (5´ 3´)
recA Recombinasa A recA-01-F recA-02-R
TGARAARCARTTYGGTAAAGG TCRCCNTTRTAGCTRTACC
pyrH Uridilato quinasa
pyrH-04-F pyrH-02-R
ATGASNACBAAYCCWAAACC GTRAABGCNGMYARRTCCA
rpoD Factor σ70 de
la RNA polimerasa
70F 70R
ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT ATAGAAATAACCAGACGTAAGTTNGCYTCNACCATYTCYTTYT
gyrB Subunidad B de la DNA girasa
up1E up2AR
GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYRA AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGYCAT
rctB Proteína de
unión al origen de replicación
rtcBs rtcBas
ATHGARTTYACNGAYTTYCARYTNCAY YTTNCTYTGHATNGGYTCRAAYTCNCCRTC
toxR Proteína
reguladora transmembrana
toxRs toxRas
GANCARGGNTTYGARGTNGAYGAYTC TTDKKTTGNCCNCYNGTVGCDATNAC
16S rRNA
Subunidad 16S rRNA
616 V 609 V 630 R 699 R 97K
AGAGTTTGATYMTGGCTCA TTAGATACCCTRGTAGT CAKAAAGGAGGTGATCC AGGGTTGCGCTCGTTGC
CTGCTGCCTCCCGTA
3.3.2. Detección de los eventos de recombinación
Los posibles eventos de recombinación se detectaron utilizando el paquete informático RDP3 (Martin y col., 2005). Este paquete contiene una serie de programas que permiten identificar secuencias recombinantes, las hipotéticas secuencias parentales, así como los puntos de recombinación. Para ello, utiliza programas basados en dos tipos de metodología:
Métodos filogenéticos: RDP y Bootscanning. Comparan árboles filogenéticos construidos a partir de distintas partes de las secuencias. Si los árboles presentan diferencias en las topologías, se asume que se ha producido una recombinación.
Métodos de sustitución nucleotídica: MaxChi, Chimera, GeneCony y Sis-scan. Buscan en las secuencias nucleotídicas un agrupamiento de sustituciones que se ajuste a una distribución estadística esperada.
Material y Métodos
70
Para minimizar el riesgo de falsos positivos, solo se tomaron en cuenta los eventos de recombinación que fueron identificados por al menos dos métodos. Se aplicó la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. La significación estadística seleccionada fue de P≤ 0,01.
3.3.3. Análisis filogenético
El alineamiento múltiple de las secuencias se realizó usando el programa CLUSTALX (Thompson y col., 1997), teniendo en cuenta el correspondiente alineamiento de aminoácidos en los genes que codifican proteínas. Los alineamientos de las secuencias nucleotídicas se revisaron visualmente para identificar posiciones con un alineamiento dudoso, principalmente en los extremos de las secuencias, y así poder corregirlas u omitirlas. Por defecto, se utilizaron los parámetros de alineamiento aplicados en CLUSTALX. Puesto que las secuencias de los genes codificantes de proteínas presentan diferente pauta de lectura, se alinearon cada uno de los genes de manera individual, concatenando posteriormente las secuencias.
El análisis filogenético se realizó usando el programa PAUP* versión 4.0b10 (Swofford, 2002). Se realizaron los análisis filogenéticos mediante métodos basados en distancias, caracteres y probabilidades. De esta manera, cada gen, así como las secuencias génicas concatenadas, se han analizado mediante Neigbour Joining (NJ), Máxima Parsimonia (MP) y Máxima Verosimilitud (ML). Los análisis con NJ se realizaron aplicando el modelo evolutivo Kimura-2-parametros (Kimura, 1980). Debido al elevado número de taxones presentes en el estudio, los análisis de MP se realizaron mediante una búsqueda heurística. La adición de las secuencias se efectuó mediante el modo “simple” seleccionando a V. harveyi CECT 525T como primer taxón de referencia. Además se buscaron árboles alternativos por reordenación de las ramas o Branch-Swapping aplicando el algoritmo Tree-Bisection-Reconnection (TBR). En el caso de ML, para cada gen se determinó el mejor modelo evolutivo de sustitución nucleotídica mediante el programa MODELTEST 3.7 (Posada y Crandall, 1998; Posada y Buckley, 2004) usando el Akaike Information Criterion (AIC). El AIC es un estimador asintóticamente no sesgado que mide la distancia esperada entre el modelo verdadero y el modelo estimado (Kullback y Leibler, 2003). Finalmente, para todos los árboles se obtuvieron los
Material y Métodos
71
valores de bootstrap (método no paramétrico de remuestreo) implementando 1.000 pseudo-réplicas.
4. Hibridación DNA-DNA Los ensayos de hibridación DNA-DNA se realizaron siguiendo los protocolos descritos por Ziemke y col. (1998) y Urdiain y col. (2008) aplicando algunas modificaciones. Todos los estudios de hibridación DNA-DNA se efectuaron por triplicado, para corroborar los resultados obtenidos.
4.1. Marcaje del DNA El DNA a hibridar se marcó mediante el kit Nick-translation (Roche) utilizando dos dNTPs modificados: Digoxigenina-11-dUTP y Biotina-16-dUTP (Roche). Siguiendo indicaciones del fabricante, por cada muestra de DNA que se quería marcar se preparó una mezcla de dNTPs compuesto por 3 µl dATP (0,4 mM), 3 µl dCTP (0,4 mM), 3 µl dGTP (0,4 mM), 2 µl dTTP (0,4 mM), 0,75 µl Digoxigenina-11-dUTP (1 mM) y 0,25 µl Biotina-16-dUTP (1 mM). Para realizar el marcaje, al DNA (0,5-1 µg en un volumen máximo de 3 µl) se le adicionó 5 µl de la mezcla de dNTPs preparada previamente, 1 µl de tampón de reacción 10x, 1 µl del cóctel enzimático (DNA-Pol-I:DNAsa-I, 50:50) y agua Milli-Q hasta un volumen final de 10 µl. El cóctel preparado se incubó 90 min a 15 oC. El DNA marcado se precipitó posteriormente con 890 µl de etanol absoluto, 40 µl de acetato de sodio 3 M pH 5,2 y 390 µl de agua Milli-Q. Finalmente se centrifugó el cóctel a 13.000 rpm durante 10 min. Tras desechar el sobrenadante, se resuspendió el DNA marcado en agua Milli-Q (100 µl).
4.2. Hibridación DNA-DNA Entre 15 y 50 ng del DNA marcado fueron mezclados con 15 µg de DNA no marcado adicionando agua Mili-Q hasta un volumen final de 72 µl. Dicha mezcla se desnaturalizó a 100 oC durante 10 minutos, enfriándolo posteriormente en hielo. A continuación se añadieron 28 µl de tampón PB 1 M pH 6,8. La mezcla se incubó durante 16 horas a la temperatura óptima de reasociación, 30 oC por debajo de la Tm del DNA homólogo (Rosselló-Móra, 2006). En el caso de las especies pertenecientes al clado central del género Vibrio, así como las del género Enterovibrio, la temperatura de hibridación fue 60 oC. La
Material y Métodos
72
solución se recubrió con 50 µl de aceite mineral (Sigma) para evitar la evaporización durante la incubación.
Tm G C 182,2
2,44
Para cada ensayo se hibridaron los DNAs homólogos y heterólogos objeto de estudio. La separación de las cadenas simples y dobles resultantes de la hibridación se realizó en una matriz de hidroxiapatita siguiendo el protocolo descrito por Brenner y col. (1969). En primer lugar, se equilibró la matriz de hidroxiapatita (Sigma). Para ello se resuspendió la hidroxiapatita en agua Milli-Q a una concentración del 10% (p/v), mezclándola vigorosamente. Se centrifugó la mezcla a 13.000 rpm durante 1 min, desechando el sobrenadante. A continuación, se realizaron 3 lavados con tampón PB 0,14 M, resuspendiendo, centrifugando y desechando el sobrenadante en cada lavado. Finalmente, la hidroxiapatita ya equilibrada se resuspendió en PB 0,14 M a una concentración del 10% (p/v) (200 µl hidroxiapatita/matriz). Finalmente se centrifugó la hidroxiapatita, desechando el sobrenadante y obteniendo de esta manera matrices de hidroxiapatita con 0,02 g. En general, se prepararon dos matrices de hidroxiapatita por cada reacción de hibridación, pues de cada reacción de hibridación individual (tanto de DNAs homólogos como de DNAs heterólogos) se eluyeron las cadenas simples y dobles por duplicado.
Tras eliminar el aceite mineral de los microtubos donde tuvieron lugar las reacciones de hibridación, se añadió a cada mezcla de hibridación 100 µl de agua Mili-Q, obteniendo de esta manera un volumen final de 200 µl por reacción de hibridación. De los 200 µl, se transfirieron 50 µl a cada una de las dos matrices de hidroxiapatita equilibrada (0,02 g). A continuación se homogenizó el producto de hibridación con la hidroxiapatita y se incubó a una temperatura correspondiente a la Tm-35 oC durante 15 min. Tras la incubación, se centrifugó a 13.000 rpm durante 2 min, transfiriendo los 50 µl del sobrenadante (conteniendo las cadenas simples) a un nuevo tubo de reacción. Con el fin de eluir completamente las cadenas simples, se realizaron otros dos lavados con 450 y 500 µl de PB 0,14 M, respectivamente. En ambos casos, tras una incubación de 5 min a la Tm-35 oC, los tubos se centrifugaron y el sobrenadante de cada lavado se transfirió al tubo que contenía los primeros 50 µl. De esta manera se
Material y Métodos
73
obtuvo para cada reacción de hibridación y por duplicado, 1 ml de PB 0,14 M con las cadenas simples.
A continuación se procedió a eluir las cadenas dobles, retenidas en la matriz de hidroxiapatita. Se realizaron dos lavados con 200 µl de PB 0,4 M, centrifugando en cada lavado a 13.000 rpm durante 1 min. El sobrenadante obtenido con las cadenas dobles se depositó en un tubo nuevo. En total, para cada reacción de hibridación y por duplicado se recuperaron 400 µl de PB 0,4 M con las cadenas dobles. Para finalizar, los DNAs de cadena doble recuperados se desnaturalizaron a 100 oC durante 10 min, enfriándolos posteriormente en hielo.
Además, por cada reacción de hibridación se preparó una curva patrón compuesta por 4 µl de DNA marcado diluidos en 800 µl de PB 0,14 M y SDS al 0,2%, realizando diluciones seriadas 1/2 de la mezcla hasta una dilución final 1/256. Posteriormente se desnaturalizó el DNA de cada dilución a 100 oC durante 10 min y se enfrió en hielo.
4.3. Revelado y detección del DNA eluido Para realizar el revelado y la detección del DNA marcado con digoxigenina, se utilizaron placas de microtitulación recubiertas de estreptavidina, “Streptawell”. En cada pocillo se depositaron 2 µl de BSA al 10% (p/v) (Sigma) junto con 200 µl de las cadenas simples o dobles eluidas con PB 0,14 M y PB 0,4 M, respectivamente, incubándose durante 2 h en agitación a 28 oC. En la placa de microtitulación también se incluyó la curva patrón. Tras la incubación, los pocillos fueron lavados tres veces con PBS pH 7,2 para eliminar el DNA no unido a la estreptavidina de los pocillos. A continuación se añadió a cada pocillo la solución de detección compuesta por 200 µl de PBS pH 7,2 con 0,03 unidades de anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina (Roche) y 2 µl de BSA al 0,1%. Se realizó una incubación durante 1 hora a 28 oC y en agitación. Tras la incubación con el anticuerpo, los pocillos se lavaron de nuevo con PBS pH 7,2 (tres veces) para eliminar el anticuerpo no unido al DNA. Para realizar el revelado, se añadió a cada pocillo la solución reveladora compuesta por 0,25 µg de p-nitrofenil fosfato disuelto en 250 µl de coating buffer e incubando a 37 oC sin agitación. La cuantificación de la reacción colorimétrica se realizó midiendo la absorbancia de los pocillos
Material y Métodos
74
a 405 nm a partir de los primeros 30 min y a intervalos de tiempo regulares hasta que se saturó la reacción.
4.4. Tratamiento de los datos de hibridación DNA-DNA Todas las hibridaciones, tanto homólogas como heterólogas, se procesaron simultáneamente. Para cada hibridación individual se eluyeron las cadenas simples y dobles por duplicado, de manera que se obtuvo un valor medio de los valores de absorbancia. La tasa de unión entre los DNAs o Binding Ratio (BR) se expresó como el porcentaje medio de DNA marcado liberado con PB 0,4 M (cadenas dobles) comparado con el total de DNA marcado liberado (cadenas dobles y simples).
BRDS x 2
SS x 5 DS x 2 x 100
La tasa de unión relativa o Relative Binding Ratio (RBR) de los DNAs heterólogos se obtuvo porcentualizando los valores de BR de los DNA heterólogos respecto a los valores de BR de los DNAs homólogos.
RBR BR DNAs heterólogosBR DNAs homólogos
x 100
5. Análisis de correlación Se determinaron las correlaciones que existen entre las similitudes génicas obtenidas con los genes individuales y concatenados (n=904), las similitudes obtenidas con las técnicas de tipado molecular (Rep PCR (GTG)5, RAPD M13, RAPD T7, ISR 16S-23S y gel combinado) (n=904) y los valores de hibridación DNA-DNA (n=62) obtenidos en la presente Tesis Doctoral así como de fuentes bibliográficas (Reichelt y col., 1976; Gómez-Gil y col., 2003, 2004). Las correlaciones se analizaron mediante los coeficientes de correlación de Pearson y de Spearman. Independientemente del coeficiente aplicado, se obtuvo un P-valor (t-student) para cada correlación obtenida con el fin de evaluar si era estadísticamente significante. Además, con el fin de determinar si las distintas variables analizadas presentaban una distribución normal o no, se aplicó el estadístico de Kurtosis. Este estadístico mide el grado de alejamiento de los datos hacia una
Material y Métodos
75
distribución normal en relación a cómo de altas son las colas de la distribución de los datos. Si la distribución de los datos no presenta colas (los datos se distribuyen más o menos uniformemente en un intervalo de valores), el valor obtenido con el estadístico de Kurtosis es negativo. Si la distribución presenta colas elevadas, el valor obtenido con el estadístico es positivo. No obstante, para que una distribución sea considerada normal, el valor obtenido con el estadístico de Kurtosis debe oscilar entre -2 y +2, alcanzándose el óptimo con un valor igual a cero. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete informático STATGRAPHICS Centurion v16.0.1.
Resultados y Discusión
1. Técnicas de tipificación molecular
1. Técnicas de tipificación molecular
81
Durante una serie de muestreos microbiológicos realizados en los años 1999, 2000 y 2004 en dorada (Sparus aurata L.), lubina (Dicentrarchus labrax L.) y dentón (Dentex dentex L.) criados en piscifactorías situadas en el litoral mediterráneo, se aisló un conjunto de cepas que se identificaron inicialmente mediante una caracterización fenotípica (Pujalte y col., 2003a, 2003b). Entre el total de aislados, 85 cepas fueron identificadas como V. harveyi. Dado que una parte de las mismas resultó ser virulentas para lubina y teniendo en cuenta las dificultades conocidas para la diferenciación fenotípica correcta de esta especie respecto a V. campbellii y V. rotiferianus, se consideró conveniente comprobar mediante técnicas genético-moleculares la identidad de las cepas presuntivamente identificadas como V. harveyi.
En un primer estudio, se aplicaron las técnicas Rep PCR (GTG)5, RAPD M13, RAPD T7, ISR 16S-23S y “gel combinado” a los 85 aislados ambientales identificados fenotípicamente como V. harveyi y a las cepas tipo y de referencia de las especies V. harveyi y V. campbellii.
En 2003, al describirse la nueva especie V. rotiferianus (Gómez-Gil y col., 2003), y dada su proximidad a V. harveyi y V. campbellii, también se incluyeron en el estudio la cepa tipo de la nueva especie así como un conjunto de cuatro cepas de referencia.
Finalmente, en 2008 se incrementó el número de especies consideradas en este apartado, incluyendo las restantes especies del clado central del género Vibrio, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. natriegens que habían sido previamente analizadas como parte del estudio de MLSA (apartado 2 de la presente Tesis Doctoral). Además, se incluyeron cinco cepas ambientales cedidas por Gómez-Gil e identificadas en su laboratorio como V. rotiferianus mediante la técnica Rep PCR (GTG)5 (CAIM 780, R379, R1024, R1117, R1311).
A partir de células crecidas en MA a 25 ºC durante 24h se llevó a cabo la extracción, purificación y cuantificación del DNA genómico siguiendo la metodología descrita en el punto 3.1 del Material y Métodos. Las amplificaciones y los análisis de los perfiles electroforéticos obtenidos se realizaron siguiendo la metodología expuesta en el punto 3.2 del Material y Métodos. A los aislados ambientales se les ha denominado Vibrio sp. hasta que no se ha
Resultados y Discusión
82
confirmado su identidad mediante las diferentes técnicas genético-moleculares.
El análisis de los perfiles electroforéticos se ha realizado utilizando las curvas densitométricas y obteniendo dos dendrogramas (UPGMA y Ward) para cada una de las técnicas de tipificación. La razón por la que se han utilizado las curvas densitométricas es que los distintos amplicones obtenidos puede que no se encuentren en cantidades equimolares, resultando ser aconsejable analizar sus intensidades. Puesto que ni las topologías de los árboles ni las similitudes entre los OTU´s han coincidido al aplicar UPGMA y Ward, se ha calculado el coeficiente de correlación cofenética, con el fin de determinar el dendrograma óptimo. Este coeficiente mide el grado de correlación entre la matriz de similitud y el agrupamiento obtenido. En todos los casos, los dendrogramas obtenidos con UPGMA han presentado valores de correlación cofenética mayores que con Ward, por lo que se han seleccionado esos para realizar el análisis detallado de los agrupamientos obtenidos. Aunque no se muestran, todos los árboles obtenidos con Ward han generado dos grandes grupos muy distantes entre sí. Dentro de cada gran grupo las cepas se han asociado en pequeños grupos con una similitud muy elevada entre ellos. Por el contrario, los dendrogramas obtenidos con UPGMA han mostrado un mayor número de grupos, relativamente distantes entre ellos.
El análisis de los perfiles electroforéticos basados en la presencia/ausencia de bandas, utilizando tanto el algoritmo de Dice como el de Jaccard, ha permitido observar el efecto que tiene la utilización de una metodología distinta a la recomendada para estas técnicas. Todos los dendrogramas han agrupado las cepas “por geles”, es decir muchas de las cepas incluidas en un gel de electroforesis han aparecido agrupadas en los diferentes dendrogramas. Esto indica que las cepas no se han agrupado por sus similitudes genómicas, sino como consecuencia de la metodología aplicada.
A continuación se muestran los resultados obtenidos mediante el coeficiente de correlación de Pearson y el algoritmo UPGMA para cada una de las cuatro técnicas individuales (400 valores/curva densitométrica), así como con el “gel combinado”, que consiste en una combinación de los perfiles de las técnicas Rep PCR (GTG)5, RAPD M13 y RAPD T7 (1200 valores/curva densitométrica). Como se
1. Técnicas de tipificación molecular
83
discutirá posteriormente, en el gel combinado no se han incluido los perfiles obtenidos con la técnica ISR 16S-23S debido al reducido valor en el coeficiente de correlación cofenética que ha mostrado esta técnica. La Tabla 6 recoge la información relativa a las cinco técnicas utilizadas, tal como número de bandas, % de reproducibilidad mínima, coeficiente de correlación cofenética obtenido con UPGMA y Ward, y valor umbral para definir grupos. Los dendrogramas resultantes, las identidades de las cepas con cada uno de los análisis, así como las matrices de similitud obtenidas se pueden ver en la Figura 3 y las Tablas 7 y 8, respectivamente.
La nomenclatura utilizada para nombrar los grupos generados ha sido numérica, según su orden de aparición en el dendrograma. Además, a los grupos que han incluido una única cepa tipo con una o más cepas ambientales o de referencia, se les ha denominado grupo específico de especie, y han sido etiquetados con el número natural correspondiente seguido de la inicial de la especie (por ejemplo 1H se corresponde con el grupo 1, grupo específico de la especie V. harveyi). Las cepas ambientales y/o de referencia incluidas en un grupo específico de especie han sido consideras como de la misma especie que la cepa tipo. A los grupos que han incluido dos o más cepas tipo, se les ha etiquetado con el número natural correspondiente, seguido de las iniciales de las diferentes especies (por ejemplo 1HC, corresponde al grupo 1 que incluye las especies V. harveyi y V. campbellii) y se les ha considerado grupos no específicos de especie. En el caso de los grupos que no han incluido ninguna cepa tipo, únicamente han sido etiquetados con el correspondiente número natural, sin ninguna inicial, considerándolos como grupos no identificados.
Rep PCR (GTG)5
Los perfiles de bandas obtenidos con la técnica Rep PCR (GTG)5 presentan una media de 13,6 ± 4,1 bandas, con un número máximo de 22 bandas y un mínimo de 4. La reproducibilidad mínima de esta técnica ha sido elevada pues muestra un valor del 96,6%. El coeficiente de correlación cofenética obtenido con UPGMA es del 0,85, mientras que con Ward es del 0,68. El valor umbral para definir grupos se ha establecido en un 52% de similitud. Aplicando este valor se han definido cinco grupos en el árbol.
Resultados y Discusión
84
El grupo 1H es específico de especie y está compuesto por la cepa tipo de la especie V. harveyi y 64 Vibrio sp. procedentes de los muestreos realizados en la costa mediterránea. Estas cepas presentan una serie de bandas comunes en los perfiles electroforéticos de 700, 870, 1100 y 1150 pb, siendo consideradas las bandas de 870, 1100 y 1150 pb como bandas diagnosticas de grupo.
El grupo 2C también es específico de especie y está compuesto por las cepas tipo y de referencia de la especie V. campbellii CECT 523T, CAIM 419 y CAIM 521. También se encuentra el aislado R379 identificado por Gómez-Gil como V. rotiferianus.
El grupo 3ANR, a diferencia de los anteriores no es específico de especie pues agrupa a las cepas tipo y de referencia de las especies V. rotiferianus, V. natriegens y V. alginolyticus, excepto la cepa de referencia de V. alginolyticus CECT 586, que no se une a ningún grupo definido y presenta una similitud del 25% respecto a la cepa tipo. Además, en este grupo también se encuentran los vibrios identificados fenotípicamente como V. harveyi H3, H6a, H6b, H9a, LPD 1-3-2 y SA F3s 54, así como los aislados R1024, R1117 y R1311, cedidos e identificados por Gómez-Gil como V. rotiferianus utilizando la técnica Rep PCR (GTG)5. Todas las cepas de este grupo presentan una banda común en los perfiles electroforéticos de 620 pb.
El grupo 4 no incluye ninguna cepa tipo. Está constituido por las cepas de referencia de V. campbellii CAIM 9, CAIM 128, CAIM 333, CAIM 392, CAIM 415, así como un total de trece aislados ambientales. A excepción de la cepa H10, las restantes cepas fueron aisladas del mismo hospedador, en la misma piscifactoría y el mismo año. Teniendo en cuenta los valores de reproducibilidad mínima obtenidos con esta técnica, ciertas cepas de este grupo pueden ser consideradas clones. Todas las cepas de este grupo presentan una banda diagnostica de 1250 pb.
El último grupo definido, 5P, incluye únicamente las cepas tipo y de referencia de la especie V. parahaemolyticus, siendo considerado por consiguiente específico de especie.
Los aislados H15, CAIM 780, así como la cepa de referencia de V. alginolyticus CECT 586 no se han incluido en ningún grupo.
1. Técnicas de tipificación molecular
85
RAPD M13
Los patrones de bandas obtenidos mediante la técnica de tipificación RAPD M13 muestran un número medio de bandas de 7,6 ± 3,1, con un valor mínimo y máximo de bandas de 3 y 19, respectivamente. La reproducibilidad de esta técnica ha sido del 95,6% y el coeficiente de correlación cofenética obtenido con UPGMA es del 0,87%, mientras que con Ward es del 0,59%. Se ha establecido un valor del 50% de similitud al cual definir los diferentes grupos. Con dicho umbral, se han establecido 10 grupos en el dendrograma, con diferencias notables en el número de cepas que contienen.
El grupo 1H está compuesto por la cepa tipo de la especie V. harveyi, junto con 63 aislados ambientales identificados fenotípicamente como V. harveyi. Todas las cepas de este grupo presentan cinco bandas comunes de 550, 650, 800, 1200 y 1750 pb.
Vecino al grupo 1H se encuentra el grupo 2, grupo no identificado constituido únicamente por los aislados ambientales H10 y H15. Ambas cepas fueron aisladas del mismo lugar.
El grupo 3N, es un grupo específico de especie que alberga la cepa tipo y las dos cepas de referencia de V. natriegens incluidas en el estudio. Las tres cepas presentan una banda común de 650 pb.
El grupo 4C, al igual que el anterior, también es específico de especie y en él se encuentran las cepas tipo y de referencia de la especie V. campbellii.
En el grupo 5 se agrupan once cepas ambientales que proceden todas del mismo origen. En el caso de las cepas LPD 1-1-20 y LPD 1-1-21, se han obtenido valores de similitud por encima de los valores obtenidos en los estudios de reproducibilidad, por lo que pueden ser consideradas clones.
Los grupos 6 y 7, son grupos no identificados y en ellos se agrupan dos y cuatro aislados ambientales, respectivamente. Las cepas del grupo 6 fueron obtenidas del mismo muestreo que las cepas del grupo 5, mientras que las cepas del grupo 7 proceden de otro muestreo.
Resultados y Discusión
86
En el grupo 8AR, se incluyen las cepas tipo y de referencia de V. alginolyticus, excepto la cepa CECT 586, y V. rotiferianus. Este grupo al incluir dos cepas tipo se considera no específico de especie.
El siguiente grupo definido es el 9P, grupo específico de especie compuesto por las cepas tipo y de referencia de la especie V. parahaemolyticus. Las cuatro cepas que quedan incluidas en este grupo presentan un perfil similar con tres bandas comunes de 500, 770 y 820 pb que presentan un carácter diagnóstico.
El último grupo establecido es el 10, formado por los aislados R379, R1024, R1117 y CAIM 780, identificados por Gómez-Gil como V. rotiferianus.
Las cepas SA F3s 54, CECT 586, LPD 1-3-2 y R1311 no se han incluido en ningún grupo.
RAPD T7
Los patrones de bandas obtenidos con la técnica RAPD T7 presentan una media de 6,6 ± 2,8 bandas con un número máximo de 12 bandas y un número mínimo de 1. La reproducibilidad mínima de esta técnica ha sido del 97,1%. El dendrograma obtenido presenta valores de similitud entre cepas reducidos, llegando a valores incluso del 25%. Se ha establecido un valor umbral de similitud del 63% para delimitar los grupos. Con dicho valor se han generado 6 grupos. El coeficiente de correlación cofenética obtenido con UPGMA ha sido 0,81, mientras que con Ward ha sido 0,51.
El primer grupo, 1H, es específico de especie y está compuesto por la cepa tipo de la especie V. harveyi junto con 30 aislados ambientales identificados todos fenotípicamente como V. harveyi. Estas cepas presentan dos bandas comunes de 740 y 2300 pb.
El grupo 2C, también es específico de especie y agrupa las cepas tipo y de referencia de V. campbellii incluidas en el estudio y 20 cepas ambientales procedentes de diferentes muestreos realizados en piscifactorías de la Comunidad Valenciana.
El siguiente grupo formado es el 3R. También es específico de especie, y en él además de situarse las cepas tipo y de referencia de la especie V. rotiferianus, también se incluyen 21 cepas ambientales
1. Técnicas de tipificación molecular
87
identificadas fenotípicamente como V. harveyi. Todas las cepas de este grupo presentan una banda de 740 pb en común con las cepas de los grupos 1H y 2C.
El grupo 4ANP incluye las cepas tipo y de referencia de las especies V. alginolyticus, incluyendo la cepa CECT 586, V. natriegens y V. parahaemolyticus. Además, se incluyen los Vibrio sp. R379, SA F3s 54, R1311, R1024, CAIM 780 y R1117 identificadas previamente por Gómez-Gil como V. rotiferianus. Todos los perfiles electroforéticos de este grupo presentan una banda común diagnóstica de 620 pb.
Finalmente, los grupos 5 y 6 no han sido identificados, pues no incluyen ninguna cepa tipo. El grupo 5 agrupa seis cepas ambientales y el 6 tres. Todas estas cepas poseen un mismo origen, y algunas presentan valores de similitud relativamente altos entre ellas.
Las cepas LPD 1-3-2, LPD 1-1-39 y LPD 1-3-11 no se han incluido en ningún grupo al nivel umbral de similitud definido.
ISR 16S-23S
Los perfiles electroforéticos obtenidos ofrecen una media de 5,1±1,9 bandas, con un número máximo de bandas de 8 y un mínimo de 1. Se observa que la gran mayoría de cepas presenta dos bandas comunes con tamaños de 580 y 820 pb, aunque no hay ninguna banda con carácter diagnóstico de grupo. La reproducibilidad mínima de esta técnica ha sido del 97,3%. El coeficiente de correlación cofenética obtenido con UPGMA ha sido 0,66, mientras que con Ward ha sido 0,42. Se ha determinado un valor umbral de similitud para definir grupos del 70%, obteniéndose así cinco grupos.
El grupo 1HR, es un grupo no específico de especie que agrupa las cepas tipo y de referencia de las especies V. harveyi y V. rotiferianus. También quedan incluidas las cepas de referencia de la especie V. alginolyticus CECT 436, CECT 586 y CECT 609, una cepa de referencia de la especie V. campbellii, así como 43 cepas ambientales procedentes de diversas piscifactorías.
El grupo 2C es específico de la especie V. campbellii, pues agrupa las cepa tipo y de referencia de dicha especie excepto las cepas CAIM 128, CAIM 415 y CAIM 521. También se incluyen 27 Vibrios sp. identificados fenotípicamente como V. harveyi.
Resultados y Discusión
88
El siguiente grupo es el 3A. Es un grupo específico de la especie V. alginolyticus, donde se ubica la cepa tipo de la especie junto con la cepa de referencia V. campbellii CAIM 128, nueve aislados ambientales identificados como Vibrio harveyi, así como las cepas CAIM 780, R1117 y R1311.
El grupo 4NP no es específico de especie pues reúne las cepas tipo y de referencia de las especies V. parahaemolyticus y V. natriegens.
En último lugar se encuentra el grupo 5, constituido por tres aislados ambientales identificados fenotípicamente como V. harveyi, una cepa de referencia de V. campbellii CAIM 521, así como las cepas R379 y R1024.
Como en los anteriores análisis, en este dendograma también han aparecido cepas aisladas, no incluidas en ningún grupo al nivel umbral establecido. En este caso son los aislados SA F3s 55, H15 y LPD 1-1-86.
“Gel combinado” de las diferentes técnicas de tipificación molecular
Cuando se combinan los perfiles electroforéticos de dos o más técnicas de tipificación molecular se está incrementando la cantidad de información genómica que, de una manera indirecta, se está analizando de los genomas. Eso se refleja en un incremento en la complejidad de los perfiles electroforéticos y con ello, en un aumento del poder de resolución del análisis. Puesto que el coeficiente de correlación cofenética que se ha obtenido con la técnica ISR 16S-23S aplicando UPGMA se considera “muy malo”, se ha prescindido de sus perfiles, combinando los perfiles electroforéticos de las restantes tres técnicas Rep PCR (GTG)5, RAPD M13 y RAPD T7.
El dendrograma que se ha generado aplicando el algoritmo de UPGMA ha presentado un gran número de OTU´s con similitudes muy reducidas entre ellos. Se ha seleccionado un valor umbral del 50% para definir los grupos.
El grupo 1H es específico de la especie V. harveyi. En él se encuentran la cepa tipo de la especie y 65 aislados ambientales
1. Técnicas de tipificación molecular
89
identificados inicialmente por Pujalte y col. (2003a, 2003b) como V. harveyi.
El siguiente grupo, 2C, al igual que el anterior también es específico de especie pues incluye las cepas tipo y de referencia de V. campbellii, así como doce cepas ambientales, que proceden todas del mismo muestreo excepto la cepa H10.
El grupo 3R también es específico de especie e incluye todas las cepas tipo y de referencia de la especie V. rotiferianus analizadas en el estudio. Además, incluye la cepa ambiental LPD 1-3-2.
El grupo 4 agrupa únicamente cuatro cepas ambientales con un mismo origen, aunque presentan entre ellas valores de similitud relativamente bajos.
El grupo 5P es un grupo específico de especie y lo forman las cepas tipo y de referencia de la especie V. parahaemolyticus.
El siguiente grupo, 6A, es específico de especie y agrupa a las cepas tipo y de referencia de la especie V. alginolyticus, incluida la cepa CECT 586.
El grupo 7 reúne cuatro de los aislados identificados y cedidos por Gómez-Gil como V. rotiferianus mediante la técnica Rep PCR (GTG)5, que al no unirse a ninguna cepa tipo, no quedan identificadas con la técnica “gel combinado”.
El último grupo generado con este valor umbral, es el grupo 8N, grupo específico de la especie V. natriegens.
Como en los anteriores dendrogramas, en éste también han quedado cepas aisladas que no se han incluido en ningún grupo. Concretamente son las cepas LPD 1-1-79, H15, CAIM 780 y SA F3s 54.
Resultados y Discusión
90
Tabla 6. Número medio de bandas de los perfiles electroforéticos; mínima reproducibilidad de las diferentes técnicas de tipificación molecular; coeficiente de correlación cofenética (CCC) obtenido al generar los dendrogramas aplicando los algoritmos UPGMA y Ward; y el valor umbral al cual se han definido los diferentes grupos en los dendrogramas.
Rep PCR (GTG)5
RAPD M13
RAPD T7
ISR 16S-23S
Gel combinado
Nº bandas 13,7±4,2 7,6±3,2 6,6±2,8 5,2±1,9 -
Reproducibilidad (%) 96,6 95,6 97,1 97,3 -
CCC
UPGMA 0,85 0,87 0,81 0,66 0,90
Ward 0,68 0,59 0,51 0,42 0,68
Valor umbral (%) 52 50 63 70 50
De las cuatro técnicas individuales analizadas en el estudio, los valores más altos en el número de bandas (valor medio, desviación y rango), se han obtenido con la técnica Rep PCR (GTG)5, mientras que ISR 16S-23S es la técnica que ha generado los valores más bajos (Tabla 6). Sin embargo, es el “gel combinado” la técnica que ofrece perfiles más complejos. Tal y como era de esperar, las técnicas con perfiles electroforéticos complejos, son aquellas que han definido mayor número de grupos específicos de especie y los que mayor coeficiente de correlación cofenética presentan. Una posible explicación a la diferencia en la complejidad de los perfiles electroforéticos es el tamaño genómico analizado con cada una de las técnicas. Mientras que las técnicas Rep PCR (GTG)5, RAPD M13 y RAPD T7 muestrean todo el genoma del microorganismo, la técnica ISR 16S-23S analiza el número y tamaño de los operones ribosomales que presenta un microorganismo en el genoma. En el caso de agrupar los perfiles de diferentes técnicas, la cantidad analizada del genoma es todavía mayor.
Como se ha explicado en el apartado de Material y Métodos, la reproducibilidad se ha constatado llevando a cabo un mínimo de tres procesos de amplificación independientes por cada una de las cepas analizadas, de manera que se han tenido en consideración aquellos perfiles electroforéticos cuyos número, tamaño e intensidades de bandas eran similares en al menos dos de los tres obtenidos por cepa.
1. Técnicas de tipificación molecular
91
El número y el tamaño de las bandas son parámetros que se han mantenido constantes, observándose algunas variaciones en las intensidades de las bandas. Además, para definir el valor de reproducibilidad mínima de cada técnica se han calculado matrices de similitud con los tres perfiles electroforéticos obtenidos en 25 cepas seleccionadas al azar del total, definiéndose la reproducibilidad mínima como el valor de similitud mínimo que se ha obtenido al comparar conjuntamente los tres perfiles de cada una de las 25 cepas. A pesar de estandarizar la mayor cantidad de variables posibles en cada una las técnicas aplicadas, la reproducibilidad no ha sido en ningún caso del 100%. Esto indica que parte de las diferencias en los perfiles electroforéticos son debidas a factores metodológicos. No obstante, los valores obtenidos no han sido muy bajos, variando entre 97,3% en el caso de la técnica ISR 16S-23S y 95,6% en el caso de RAPD M13. Como era de esperar, la técnica que ofrece perfiles más sencillos es la que mayor reproducibilidad presenta, de manera que las técnicas con perfiles electroforéticos más complejos presentan valores de reproducibilidad más bajos. Muchas veces, la falta de reproducibilidad en las técnicas de tipado molecular se puede explicar por la falta de estandarización en la metodología y en el material utilizado en los estudios. Es muy importante utilizar siempre el mismo programa de amplificación, Taq polimerasa, concentración de nucleótidos, etc., pues es la manera de poder comparar geles de diferentes días. Además, la reproducibilidad también se correlaciona directamente con las condiciones de amplificación utilizadas. Cuando se utilizan condiciones poco restrictivas (baja temperatura de annealing y altas concentraciones de Mg2+) el nivel de reproducibilidad mínima se va reduciendo puesto que se incrementan las uniones inespecíficas entre el/los cebador/es y el DNA genómico. Los resultados aquí presentados muestran la importancia de estandarizar la mayor cantidad posible de variables metodológicas y de diseñar un protocolo de amplificación óptimo, con el fin de que los resultados sean una verdadera medida indirecta de las diferencias genómicas entre cepas.
Los mayores valores del coeficiente de correlación cofenética se han obtenido, en todos los casos, con el algoritmo aglomerativo UPGMA. Todos los coeficientes de correlación cofenética obtenidos con el algoritmo de Ward han sido inferiores al 0,7%, por lo que se incluyen dentro de la categoría de correlación “muy mala” (Rohlf, 1992). Puesto que los dendrogramas obtenidos con el algoritmo de Ward no
Resultados y Discusión
92
reflejan con fidelidad las relaciones entre los OTU´s, no se han tenido en cuenta para intentar identificar los aislados ambientales. En el caso de los algoritmos obtenidos con UPGMA se han obtenido valores de coeficiente de correlación cofenética entre 0,9 y 0,8 (buena) en todos los casos, excepto con la técnica ISR 16S-23S donde el coeficiente de correlación ha sido de 0,66. Este valor de correlación se considera “muy malo”, por lo que las agrupaciones mostradas en el árbol están distorsionadas respecto a la matriz de similitud original. El mayor valor del coeficiente de correlación cofenética se ha obtenido con la técnica “gel combinado” (Tabla 6).
Tabla 7. Grupos generados en las diferentes técnicas de tipificación molecular. Los números naturales, indican el número del grupo en el que se incluyen las cepas. Las letras H, C, R, P, A y N indican que en ese grupo se encuentra la cepa tipo de la especie V. harveyi, V. campbellii, V. rotiferianus, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. natriegens, respectivamente. -, cepa no incluida en ningún grupo. En negrita se destacan las cepas que han sido incluidas en el estudio posterior de MLSA.
1. Técnicas de tipificación molecular
93
Especie Cepa Rep PCR (GTG)5
RAPD M13
RAPD T7
ISR 16S-23S
Gel combinado
V. harveyi CECT 525T 1H 1H 1H 1HR 1H V. campbellii CECT 523T 2C 4C 2C 2C 2C CAIM 9 4 4C 2C 2C 2C CAIM 128 4 4C 2C 3A 2C CAIM 333 4 4C 2C 2C 2C CAIM 392 4 4C 2C 2C 2C CAIM 415 4 4C 2C 1HR 2C CAIM 419 2C 4C 2C 2C 2C CAIM 521 2C 4C 2C 5 2C V. rotiferianus CAIM 577T 3ANR 8AR 3R 1HR 3R CAIM 573 3ANR 8AR 3R 1HR 3R CAIM 574 3ANR 8AR 3R 1HR 3R CAIM 575 3ANR 8AR 3R 1HR 3R CAIM 576 3ANR 8AR 3R 1HR 3R V. natriegens CECT 526T 3ANR 3N 4ANP 4NP 8N CECT 7465 3ANR 3N 4ANP 4NP 8N CECT 7466 3ANR 3N 4ANP 4NP 8N V. parahaemolyticus CECT 511T 5P 9P 4ANP 4NP 5P CECT 5305 5P 9P 4ANP 4NP 5P CECT 5271 5P 9P 4ANP 4NP 5P CECT 611 5P 9P 4ANP 4NP 5P V. alginolyticus CECT 521T 3ANR 8AR 4ANP 3A 6A CECT 436 3ANR 8AR 4ANP 1HR 6A CECT 586 - - 4ANP 1HR 6A CECT 609 3ANR 8AR 4ANP 1HR 6A Vibrio sp. H2 1H 1H 3R 1HR 1H H3 3ANR 7 2C 3A 4 H4 1H 1H 3R 1HR 1H H5 1H 1H 3R 1HR 1H H6a 3ANR 7 3R 5 4 H6b 3ANR 7 3R 5 4 H7 1H 1H 3R 1HR 1H H8 1H 1H 3R 1HR 1H H9a 3ANR 7 3R 5 4 H9b 1H 1H 3R 1HR 1H H10 4 2 2C 1HR 2C H11 1H 1H 1H 1HR 1H H12 1H 1H 3R 1HR 1H H13 1H 1H 3R 1HR 1H H14 1H 1H 3R 1HR 1H H15 - 2 2C - - H16 1H 1H 3R 1HR 1H H17 1H 1H 3R 1HR 1H LCL 1-4-9 1H 1H 3R 1HR 1H
Resultados y Discusión
94
Especie Cepa Rep PCR (GTG)5
RAPD M13
RAPD T7
ISR 16S-23S
Gel combinado
Vibrio sp. LCL 1-4-10 1H 1H 3R 2C 1H Dsint 11 1H 1H 1H 2C 1H Dsint 12 1H 1H 1H 2C 1H Dsint 13 1H 1H 1H 2C 1H Dsint 1 1H 1H 1H 2C 1H Dsint 4 1H 1H 1H 2C 1H Dsint 5 1H 1H 1H 2C 1H Denton10 1H 1H 1H 2C 1H DPD 4-1-13 1H 1H 2C 3A 1H DPD 4-1-12 1H 1H 1H 3A 1H DPD 4-1-7 1H 1H 1H 3A 1H DPD 4-1-4 1H 1H 1H 3A 1H SA F1s 8/24 1H 1H 1H 2C 1H SA F3s 38 1H 1H 3R 1HR 1H SA F3s 39 1H 1H 3R 1HR 1H SA F3s 40 1H 1H 3R 1HR 1H SA F3s 53 1H 1H 3R 1HR 1H SA F3s 54 3ANR - 4ANP 1HR 10 SA F3s 55 1H 1H 1H - 1H SA F4s 17 1H 1H 1H 2C 1H SA F1s 9 1H 1H 1H 2C 1H SA F1s 10 1H 1H 1H 2C 1H SA F1s 11 1H 1H 1H 2C 1H SA F1s 12 1H 1H 1H 2C 1H DL F5 57 1H 1H 3R 1HR 1H LPD 1-1-3 1H 1H 5 1HR 1H LPD 1-1-10 1H 1H 5 2C 1H LPD 1-1-31 1H 1H 5 1HR 1H LPD 1-1-32 1H 1H 5 1HR 1H LPD 1-1-39 1H 1H - 1HR 1H LPD 1-1-79 4 1H 5 1HR - LPD 1-1-82 1H 5 2C 1HR 1H LPD 1-1-83 1H 1H 2C 1HR 1H LPD 1-1-84 4 5 2C 1HR 2C LPD 1-1-86 4 5 2C - 2C LPD 1-1-7 1H 5 2C 1HR 1H LPD 1-1-11 4 5 2C 2C 2C LPD 1-1-18 4 5 2C 3A 2C LPD 1-1-19 4 5 2C 1HR 2C LPD 1-1-20 4 5 2C 3A 2C LPD 1-1-21 4 5 2C 3A 2C LPD 1-1-24 4 5 2C 2C 2C LPD 1-1-26 4 6 2C 2C 2C LPD 1-1-35 4 5 2C 2C 2C
1. Técnicas de tipificación molecular
95
Especie Cepa Rep PCR (GTG)5
RAPD M13
RAPD T7
ISR 16S-23S
Gel combinado
Vibrio sp. LPD 1-1-40 4 6 2C 2C 2C LPD 1-3-1 1H 1H 5 2C 1H LPD 1-3-2 3ANR - - 3A 3R LPD 1-3-7 1H 1H 1H 1HR 1H LPD 1-3-10 1H 1H 1H 1HR 1H LPD 1-3-11 1H 1H - 1HR 1H LPD 1-3-12 1H 1H 1H 1HR 1H LPD 1-3-15 1H 1H 1H 1HR 1H LPD 1-3-17 1H 1H 1H 1HR 1H LPD 1-3-18 1H 1H 1H 1HR 1H LPD 1-3-19 1H 1H 1H 2C 1H LPD 1-3-20 1H 1H 1H 2C 1H LPD 1-3-24 1H 1H 6 1HR 1H LPD 1-3-25 1H 1H 6 1HR 1H LPD 1-3-26 1H 1H 2C 2C 1H LPD 1-3-27 1H 1H 1H 1HR 1H LPD 1-3-29 1H 1H 2C 1HR 1H LPD 1-3-31 1H 1H 6 2C 1H LPD 1-3-32 1H 1H 1H 2C 1H LPD 1-3-34 1H 1H 1H 2C 1H LPD 1-3-35 1H 1H 1H 1HR 1H CAIM 780 - 10 4ANP 3A - R379 2C 10 4ANP 5 7 R1024 3ANR 10 4ANP 5 7 R1117 3ANR 10 4ANP 3A 7 R1311 3ANR - 4ANP 3A 7
Resultados y Discusión
96
De las cinco técnicas de tipificación molecular empleadas en la presente Tesis Doctoral, únicamente el análisis del “gel combinado” ha agrupado a las seis especies en grupos específicos, donde las cepas de referencia se han agrupado con su correspondiente cepa tipo. La técnica RAPD M13 ha generado cuatro grupos específicos de especie, las técnicas RAPD T7 y Rep PCR (GTG)5 han generado tres grupos cada una y finalmente la ISR 16S-23S ha generado dos. En el caso de las técnicas Rep PCR (GTG)5 e ISR 16S-23S no todas las cepas de referencia de las especie V. campbellii se han agrupado con la cepa tipo. Además, en la técnica ISR 16S-23S sucede lo mismo con la especie V. alginolyticus.
De los resultados obtenidos mediante este conjunto de técnicas de tipificación molecular se puede concluir que éstas ofrecen diferente grado de complejidad en los perfiles electroforéticos y con ello diferencias a la hora de crear grupos específicos de especie. La técnica “gel combinado” es la que mayor número de grupos específicos de especie ha generado, diferenciando completamente las seis especies del clado central del género Vibrio y la que mayor coeficiente de correlación cofenética ha presentado, por lo que la identidad de los aislados ambientales obtenida con esta técnica ha sido considerada como la más veraz. Ninguna de las cinco técnicas de tipado molecular ha identificado a los 85 aislados ambientales como V. harveyi. Dependiendo de la técnica, las cepas ambientales también han sido identificadas como V. campbellii, V. rotiferianus y V. alginolyticus. En algunos casos, ciertas cepas han sido incluidas en grupos no específicos de especie, en grupos no identificados o han quedado de manera individual fuera de los grupos generados. Respecto a las cinco cepas identificadas por Gómez-Gil como V. rotiferianus mediante la técnica Rep PCR (GTG)5, cabe señalar que no han sido identificadas como tal con ninguna de las cinco técnicas, ni siquiera utilizando la misma técnica de tipado. La causa de la incongruencia en la identificación de estas cepas ambientales es que, además del valor umbral utilizado para definir los grupos, su identidad también depende de las cepas tipo y de referencia incluidas en el estudio.
A pesar de que el “gel combinado” es la técnica que mayor número de grupos específicos de especie ha generado y mayor coeficiente de correlación cofenética ofrece, la necesidad de procesar tres técnicas individuales de tipificación, combinando sus perfiles
1. Técnicas de tipificación molecular
97
electroforéticos, hace que este análisis pierda utilidad práctica a la hora de identificar los aislados ambientales.
Figura 3. Dendrogramas basados en los datos de Rep PCR (GTG)5, RAPD M13, RAPD T7, ISR 16S-23S y “gel combinado”. Los análisis se han basado en los coeficientes de correlación de Pearson de las curvas densitométricas, aplicando el algoritmo aglomerativo de UPGMA. En el dendrograma “gel combinado” se han etiquetado en negrita las cepas analizadas en el capítulo 2 de la presente Tesis Doctoral.
Resultados y Discusión
98
Rep PCR (GTG)5
90807060504030 100
1H
3ANR
2C
4
5P
450
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
4.00
E+3
pb
V. harveyi Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp.Vibrio sp. Vibrio sp.Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. V. campbellii V. campbellii V. campbellii Vibrio sp.Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. V. alginolyticus V. alginolyticus V. alginolyticus Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp.Vibrio sp. Vibrio sp.V. natriegens V. natriegens V. natriegens V. rotiferianus V. rotiferianus V. rotiferianus V. rotiferianus V. rotiferianus V. campbellii V. campbellii V. campbellii V. campbellii V. campbellii Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. V. parahaemolyticus V. parahaemolyticusV. parahaemolyticusV. parahaemolyticusV. alginolyticus
CECT 525T
H4H5DL F5 57LPD 1-3-12LPD1-3-27LPD 1-3-19DPD 4-1-13DPD 4-1-12DPD 4-1-7DPD 4-1-4LPD 1-3-7LPD 1-3-17Dsint 12Dsint 13LPD1-3-34LPD 1-3-18Denton 10Dsint 1Dsin 5LPD1-3-32LPD1-3-35LPD1-3-24LPD1-3-26SA F1s 9SA F1s 11SA F4s 17SA F1s 10SA F1s 12H16H17H11H14LCL 1-4-10LCL 1-4-9LPD 1-3-1LPD 1-3-11LPD 1-1-7Dsint 11LPD 1-3-15LPD1-3-20LPD1-3-29LPD1-3-25LPD1-3-31LPD 1-1-10LPD 1-1-82LPD 1-1-31LPD 1-1-32LPD 1-1-39LPD 1-1-3LPD 1-1-83Dsint 4SA F1s 8/24LPD 1-3-10SA F3s 40SA F3s 53SA F3s 39SA F3s 38SA F3s 55H9bH13H12H2H7H8H15CECT 523T
CAIM 419CAIM 521R379LPD 1-3-2H3SA F3s 54CECT 436CECT 521T
CECT 609H6aH6bH9aR1311R1024R1117CECT 7466CECT 7465CECT 526T
CAIM 574CAIM 577T
CAIM 573CAIM 575CAIM 576CAIM 128CAIM 415CAIM 392CAIM 9CAIM 333LPD 1-1-18LPD 1-1-20LPD 1-1-21H10LPD 1-1-79LPD 1-1-19LPD 1-1-26LPD 1-1-40LPD 1-1-84LPD 1-1-11LPD 1-1-86LPD 1-1-24LPD 1-1-35CAIM 780CECT 5305CECT 5271CECT 511T
CECT 611CECT 586
1. Técnicas de tipificación molecular
99
RAPD M13
10080604020 200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
2000
V. harveyi Vibrio sp. Vibrio sp.Vibrio sp.Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. V. natriegensV. natriegensV. natriegensV. campbellii V. campbellii V. campbellii V. campbellii V. campbellii V. campbellii V. campbellii V. campbellii V. alginolyticus Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. Vibrio sp. V. rotiferianus V. rotiferianus V. rotiferianus V. rotiferianus V. rotiferianus V. alginolyticus V. alginolyticus V. alginolyticus V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus V. parahaemolyticusV. parahaemolyticus Vibrio sp.Vibrio sp.Vibrio sp.Vibrio sp.Vibrio sp.
CECT 525T
SA F1s 8/2DPD 4-1-7LPD 1-1-39LPD 1-1-83LPD 1-1-3LPD 1-1-10LPD 1-1-32LPD 1-1-79LPD 1-1-31LPD 1-3-10LPD 1-3-11LPD 1-3-1LPD 1-3-18LPD 1-3-17LPD 1-3-19LPD 1-3-29LPD 1-3-32LPD 1-3-31LPD 1-3-34H4H5H11LCL 1-4-9H14H17LCL 1-4-10H16SA F4s 17SA F1s 11SA F1s 9SA F1s 10SA F1s 12DL F5 57Dsint 5Denton 10Dsint 1Dsint 4DPD 4-1-13DPD 4-1-12Dsint 11Dsint 13Dsint 12DPD 4-1-4SA F3s 39SA F3s 53SA F3s 40SA F3s 38SA F3s 55H9bH12H13H7H8H2LPD 1-3-20LPD 1-3-24LPD 1-3-25LPD 1-3-35LPD 1-3-15LPD 1-3-26LPD 1-3-27LPD 1-3-7LPD 1-3-12SA F3s 54H10H15CECT 526T
CECT 7465CECT 7466CECT 523T
CAIM 419CAIM 521CAIM 128CAIM 415CAIM 392CAIM 9CAIM 333CECT 586LPD 1-1-24LPD 1-1-35LPD 1-1-82LPD 1-1-19LPD 1-1-11LPD 1-1-84LPD 1-1-86LPD 1-1-20LPD 1-1-21LPD 1-1-18LPD 1-1-7LPD 1-1-26LPD 1-1-40H6aH6bH3H9aLPD 1-3-2CAIM 577T
CAIM 573CAIM 574CAIM 575CAIM 576CECT 521T
CECT 609CECT 436CECT 511T
CECT 611CECT 5271CECT 5305R379R1024CAIM 780R1117R1311
pb
3000
6
5
4C
3N
2
1H
9P
8AR
7
10
Resultados y Discusión
100
RAPD T7
10090807060504030
V. harveyi CECT 525T
Vibrio sp. DPD 4-1-12Vibrio sp. H11Vibrio sp. LPD 1-3-17Vibrio sp. LPD 1-3-18Vibrio sp. Sa F4s 17Vibrio sp. Sa F1s 10Vibrio sp. Sa F1s 9Vibrio sp. Sa F1s 11Vibrio sp. Sa F1s 12Vibrio sp. Dsint 1Vibrio sp. Dsint 11Vibrio sp. Dsint 12Vibrio sp. Dsint 13Vibrio sp. LPD 1-3-27Vibrio sp. LPD 1-3-32Vibrio sp. LPD 1-3-34Vibrio sp. LPD 1-3-35Vibrio sp. Denton 10Vibrio sp. LPD 1-3-12Vibrio sp. LPD 1-3-15Vibrio sp. LPD 1-3-19Vibrio sp. LPD 1-3-7Vibrio sp. LPD 1-3-10Vibrio sp. LPD 1-3-20Vibrio sp. Dsint 5Vibrio sp. Dsint 4Vibrio sp. SA F1s 8/24Vibrio sp. Sa F3s 55Vibrio sp. DPD 4-1-7Vibrio sp. DPD 4-1-4V. campbellii CECT 523T
V. campbellii CAIM 419V. campbellii CAIM 9Vibrio sp. LPD 1-1-24Vibrio sp. LPD 1-1-35Vibrio sp. LPD 1-1-86Vibrio sp. H3Vibrio sp. LPD 1-1-26Vibrio sp. LPD 1-1-40Vibrio sp. LPD 1-3-26V. campbellii CAIM 415V. campbellii CAIM 521Vibrio sp. LPD 1-1-82Vibrio sp. LPD 1-1-19Vibrio sp. LPD 1-1-84Vibrio sp. LPD 1-1-11Vibrio sp. LPD 1-1-7Vibrio sp. LPD 1-1-83Vibrio sp. LPD 1-1-18Vibrio sp. LPD 1-1-20Vibrio sp. LPD 1-1-21V. campbellii CAIM 128V. campbellii CAIM 333V. campbellii CAIM 392Vibrio sp. LPD 1-3-29Vibrio sp. H15Vibrio sp. DPD 4-1-13Vibrio sp. H10Vibrio sp. H9bVibrio sp. H12Vibrio sp. H14Vibrio sp. H13Vibrio sp. DL F5 57Vibrio sp. H16Vibrio sp. H17Vibrio sp. LCL 1-4-9Vibrio sp. LCL 1-4-10Vibrio sp. H2Vibrio sp. H9aVibrio sp. H7Vibrio sp. SA F3s 38Vibrio sp. SA F3s 40Vibrio sp. SA F3s 39Vibrio sp. SA F3s 53Vibrio sp. H4Vibrio sp. H5Vibrio sp. H8Vibrio sp. H6aVibrio sp. H6bV. rotiferianus CAIM 573V. rotiferianus CAIM 577T
V. rotiferianus CAIM 575V. rotiferianus CAIM 576V. rotiferianus CAIM 574Vibrio sp. R379Vibrio sp. SA F3s 54V. natriegens CECT 526T
V. natriegens CECT 7465V. alginolyticus CECT 436V. alginolyticus CECT 521T
Vibrio sp. R1311V. alginolyticus CECT 609V. natriegens CECT 7466V. parahaemolyticus CECT 611V. parahaemolyticus CECT 5271V. parahaemolyticus CECT 530V. parahaemolyticus CECT 511T
Vibrio sp. R1024V. alginolyticus CECT 586Vibrio sp. CAIM 780Vibrio sp. R1117Vibrio sp. LPD 1-1-3Vibrio sp. LPD 1-1-32Vibrio sp. LPD 1-1-31Vibrio sp. LPD 1-1-10Vibrio sp. LPD 1-1-79Vibrio sp. LPD 1-3-1Vibrio sp. LPD1-3-2Vibrio sp. LPD 1-1-39Vibrio sp. LPD 1-3-24Vibrio sp. LPD 1-3-31Vibrio sp. LPD 1-3-25Vibrio sp. LPD1-3-11
200
400
600
800
1000
1200
1400
2000
2500
pb
6
5
4ANP
2C
1H
3R
1. Técnicas de tipificación molecular
101
ISR 16S-23S
1009080706050 pb
V. harveyi CECT 525T
Vibrio sp. SA F3s 38Vibrio sp. SA F3s 39Vibrio sp. SA F3s 53Vibrio sp. SA F3s 40Vibrio sp. H2Vibrio sp. H7Vibrio sp. H8Vibrio sp. LPD 1-3-27V. campbellii CAIM 415V. rotiferianus CAIM 573V. rotiferianus CAIM 574V. rotiferianus CAIM 575V. rotiferianus CAIM 576V. rotiferianus CAIM 577T
Vibrio sp. H10Vibrio sp. LPD 1-3-18Vibrio sp. H9bVibrio sp. H12Vibrio sp. H11Vibrio sp. H13Vibrio sp. H14Vibrio sp. LPD 1-3-35Vibrio sp. DL F5 57Vibrio sp. H5Vibrio sp. H4Vibrio sp. LPD 1-3-7Vibrio sp. LPD 1-3-17Vibrio sp. LPD 1-3-25Vibrio sp. LPD 1-3-12Vibrio sp. LPD 1-3-15Vibrio sp. LPD 1-3-10Vibrio sp. LPD 1-3-11Vibrio sp. LPD 1-3-24Vibrio sp. LPD 1-3-29Vibrio sp. H16Vibrio sp. H17Vibrio sp. LCL 1-4-9Vibrio sp. LPD 1-1-32Vibrio sp. LPD 1-1-39Vibrio sp. LPD 1-1-31Vibrio sp. LPD 1-1-79Vibrio sp. LPD 1-1-83Vibrio sp. LPD 1-1-3Vibrio sp. LPD 1-1-82Vibrio sp. LPD 1-1-7Vibrio sp. LPD 1-1-19V. alginolyticus CECT 609V. alginolyticus CECT 436V. alginolyticus CECT 586Vibrio sp. SA F3s 54Vibrio sp. LPD 1-1-84Vibrio sp. LPD 1-1-24Vibrio sp. LPD 1-1-26Vibrio sp. LPD 1-1-10Vibrio sp. LPD 1-3-34Vibrio sp. Dsint 4Vibrio sp. LPD 1-3-26Vibrio sp. Dsint 12Vibrio sp. Dsint 1Vibrio sp. LCL 1-4-10Vibrio sp. Dsint 11Vibrio sp. Dsint 13Vibrio sp. SA F1s 8/24Vibrio sp. LPD 1-1-11Vibrio sp. LPD 1-3-32Vibrio sp. LPD 1-3-31
Vibrio sp. LPD 1-3-1Vibrio sp. LPD 1-3-20
Vibrio sp. LPD 1-1-35Vibrio sp. LPD 1-1-40Vibrio sp. Dsint 5Vibrio sp. LPD 1-3-19V. campbellii CAIM 9Vibrio sp. Denton 10V. campbellii CAIM 333V. campbellii CAIM 392V. campbellii CECT 523T
V. campbellii CAIM 419Vibrio sp. SA F1s 10Vibrio sp. SA F1s 11Vibrio sp. SA F1s 12Vibrio sp. SA F4s 17Vibrio sp. SA F1s 9Vibrio sp. R1117Vibrio sp. R1311V. alginolyticus CECT 521T
Vibrio sp. LPD 1-1-20Vibrio sp. LPD 1-1-21Vibrio sp. LPD 1-1-18V. campbellii CAIM 128Vibrio sp. DPD 4-1-7Vibrio sp. DPD 4-1-4Vibrio sp. DPD 4-1-12Vibrio sp. DPD 4-1-13Vibrio sp. CAIM 780Vibrio sp. H3Vibrio sp. LPD 1-3-2V. parahaemolyticus CECT 5271V. parahaemolyticus CECT 511T
V. parahaemolyticus CECT 5305V. parahaemolyticus CECT 611V. natriegens CECT 526T
V. natriegens CECT 7465V. natriegens CECT 7466Vibrio sp. SA F3s 55Vibrio sp. H6bVibrio sp. H6aVibrio sp. H9aV. campbellii CAIM 521Vibrio sp. R379Vibrio sp. R1024Vibrio sp. H15Vibrio sp. LPD 1-1-86
400
600
800
1000
1200
1400
1600
2000
1HR
3A
2C
4NP
5
Resultados y Discusión
102
Gel combinado
V. harveyi CECT 525T
Vibrio sp. Dsint 4Vibrio sp. SA F1s 8/24Vibrio sp. H14Vibrio sp. H17Vibrio sp. H11Vibrio sp. H16Vibrio sp. LCL 1-4-9Vibrio sp. LCL 1-4-10Vibrio sp. Dsint 1Vibrio sp. Dsint 5Vibrio sp. Denton 10Vibrio sp. Dsint 12Vibrio sp. Dsint 13Vibrio sp. Dsint 11Vibrio sp. SA F1s 9Vibrio sp. SA F1s 11Vibrio sp. SA F4s 17Vibrio sp. SA F1s 10Vibrio sp. SA F1s 12Vibrio sp. DL F5 57Vibrio sp. LPD 1-3-32Vibrio sp. LPD 1-3-34Vibrio sp. LPD 1-3-35Vibrio sp. LPD 1-3-18Vibrio sp. LPD 1-3-29Vibrio sp. LPD 1-3-26Vibrio sp. LPD 1-3-27Vibrio sp. LPD 1-3-7Vibrio sp. DPD 4-1-13Vibrio sp. DPD 4-1-12Vibrio sp. DPD 4-1-7Vibrio sp. DPD 4-1-4Vibrio sp. LPD 1-3-10Vibrio sp. LPD 1-3-11Vibrio sp. LPD 1-3-15Vibrio sp. LPD 1-3-17Vibrio sp. LPD 1-3-12Vibrio sp. LPD 1-3-19Vibrio sp. H4Vibrio sp. H5Vibrio sp. LPD 1-3-24Vibrio sp. LPD 1-3-25Vibrio sp. LPD 1-3-31Vibrio sp. LPD 1-3-1Vibrio sp. LPD 1-1-31Vibrio sp. LPD 1-1-32Vibrio sp. LPD 1-1-10Vibrio sp. LPD 1-1-3Vibrio sp. LPD 1-1-39Vibrio sp. LPD 1-1-83Vibrio sp. LPD 1-1-82Vibrio sp. LPD 1-1-7Vibrio sp. H7Vibrio sp. H8Vibrio sp. H2Vibrio sp. SA F3s 55Vibrio sp. SA F3s 39Vibrio sp. SA F3s 53Vibrio sp. SA F3s 40Vibrio sp. SA F3s 38Vibrio sp. H9bVibrio sp. H12Vibrio sp. H13Vibrio sp. LPD 1-3-20Vibrio sp. LPD 1-1-79Vibrio sp. H15V. campbellii CECT 523T
V. campbellii CAIM 419V. campbellii CAIM 521V. campbellii CAIM 9V. campbellii CAIM 333V. campbellii CAIM 128V. campbellii CAIM 415V. campbellii CAIM 392Vibrio sp. LPD 1-1-84Vibrio sp. LPD 1-1-86Vibrio sp. LPD 1-1-24Vibrio sp. LPD 1-1-35Vibrio sp. H10Vibrio sp. LPD 1-1-11Vibrio sp. LPD 1-1-19Vibrio sp. LPD 1-1-18Vibrio sp. LPD 1-1-20Vibrio sp. LPD 1-1-21Vibrio sp. LPD 1-1-26Vibrio sp. LPD 1-1-40V. rotiferianus CAIM 577T
V. rotiferianus CAIM 573V. rotiferianus CAIM 574V. rotiferianus CAIM 575V. rotiferianus CAIM 576Vibrio sp. LPD 1-3-2Vibrio sp. H6aVibrio sp. H6bVibrio sp. H9aVibrio sp. H3V. parahaemolyticus CECT 611V. parahaemolyticus CECT 511T
V. parahaemolyticus CECT 5271V. parahaemolyticus CECT 5305Vibrio sp. CAIM 780V. alginolyticus CECT 436V. alginolyticus CECT 521T
V. alginolyticus CECT 609V. alginolyticus CECT 586Vibrio sp. R1117Vibrio sp. R1024Vibrio sp. R379Vibrio sp. R1311V. natriegens CECT 7465V. natriegens CECT 7466V. natriegens CECT 526T
Vibrio sp. SA F3s 54
100908070605040
1H
3R
2C
6A
5P
4
8N
7
1. Técnicas de tipificación molecular
103
Tabla 8. Número de cepas en cada grupo y valores de similitud intra- e intergrupos obtenidos en las técnicas Rep PCR (GTG)5, RAPD M13, RAPD T7, ISR 16S-23S y “gel combinado”.
RAPD M13
Nº cepas 1H 2 3N 4C 5 6 7 8AR 9P 10
1H 64 55
2 2 45 61
3N 3 36 36 77
4C 8 32 32 32 55
5 11 32 32 32 48 51
6 2 32 32 32 43 43 96
7 4 32 32 32 35 35 35 70
8AR 8 27 27 27 27 27 27 27 51
9P 4 27 27 27 27 27 27 27 45 82
10 4 18 18 18 18 18 18 18 18 18 52
Rep PCR (GTG)5
Nº cepas 1H 2C 3ANR 4 5P
1H 65 63
2C 4 36 64
3ANR 20 36 50 56
4 18 36 45 45 53
5P 4 25 25 25 25 54
RAPD T7
Nº cepas
1H 2C 3R 4ANP 5 6
1H 31 68
2C 28 60 64
3R 26 44 44 68
4ANP 17 44 44 44 72
5 6 28 28 28 28 63
6 3 28 28 28 28 30 76
Resultados y Discusión
104
ISR 16S-23S
Nº cepas
1HR 2C 3A 4NP 5
1HR 52 74
2C 3 70 79
3A 2 66 66 76
4NP 27 61 61 61 81
5 6 54 54 54 54 66
Gel combinado
Nº cepas 1H 2C 3R 4 5P 6A 7 8N
1H 66 62
2C 20 39 52
3R 6 39 46 52
4 6 39 45 45 66
5P 4 30 30 30 30 76
6A 4 30 30 30 30 40 59
7 4 30 30 30 30 40 44 61
8N 3 30 30 30 30 40 44 46 86
2. Multilocus Sequence Analysis
2. Multilocus sequence analysis
107
El MLSA es una de las técnicas que más relevancia está adquiriendo en los últimos años en los estudios taxonómicos por su gran poder de resolución a la hora de realizar clasificaciones/ identificaciones y con ello inferir relaciones filogenéticas, siendo considerada la aproximación más actual para la delimitación de una especie procariota. Hasta la fecha no existe un conjunto de genes que ofrezca un poder de resolución óptimo en todos los grupos taxonómicos procariotas. De esta manera, para cada grupo taxonómico hay que definir la combinación específica de genes que resulte ser óptima. La finalidad de este apartado ha sido evaluar el poder de resolución y la capacidad de inferir las relaciones filogenéticas de 7 genes housekeeping (recA, pyrH, rpoD, gyrB, rctB, toxR y 16S rRNA), tanto de manera individual como concatenando sus secuencias, en un clado de especies de reciente diversificación, como es el core group del género Vibrio.
En el estudio se han incluido las cepas tipo y de referencia de las especies V. harveyi, V. campbellii, V. rotiferianus, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. natriegens, utilizando la cepa tipo de V. cholerae como grupo externo para enraizar los árboles generados. Además, se han incluido 18 cepas ambientales seleccionadas como representantes de los diferentes grupos definidos con las técnicas de tipificación molecular del apartado 1 de la presente Tesis Doctoral (Tabla 4 y 20). La selección de los representantes se realizó en un análisis preliminar con la técnica “gel combinado”, donde únicamente se incluyeron las cepas tipo y de referencia de las especies V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus, así como los 85 aislados ambientales identificados fenotípicamente como V. harveyi (imagen no mostrada). Posteriormente, para completar el análisis de fingerprinting, se incluyeron en el análisis las cepas tipo y de referencia de las especies V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. natriegens, así como las cepas ambientales identificadas previamente por Gómez-Gil. El nuevo dendrograma (Figura 3) que se ha obtenido con el “gel combinado” presenta 114 cepas y algunos de los grupos formados no coinciden con los obtenidos en el análisis preliminar. Este es el motivo por el que la selección de los aislados ambientales para llevar a cabo el estudio de MLSA carece de razón justificada teniendo en cuenta el actual dendrograma de “gel combinado”, si bien todas las cepas seleccionadas sí están distribuidas en todos los grupos formados, excepto el grupo 4 (Figura 3). Para completar el estudio sería
Resultados y Discusión
108
conveniente analizar, con el fin de esclarecer sus identidades, todas las cepas que no han sido incluidas en ningún grupo así como las cuatro cepas ambientales que constituyen el grupo 4, y que han sido identificadas fenotípicamente como V. harveyi.
Tras extraer, purificar y ajustar la concentración de los DNAs de las 44 cepas utilizadas en este trabajo, se han amplificado, purificado y secuenciado los siete genes seleccionados para el estudio del MLSA siguiendo la metodología expuesta en los puntos 3.1 y 3.3 del Material y Métodos, excepto seis secuencias del gen 16S rRNA que se han obtenido de bases de datos públicas (Tabla 20, pág. 215). Inicialmente se han concatenado las secuencias nucleotídicas de los siete genes, infiriéndose las relaciones filogenéticas entre cepas. El análisis de secuencias génicas concatenadas permite optimizar la resolución taxonómica al incluir más sitios informativos y minimiza el posible efecto que pueden tener los eventos de recombinación ocurridos en los diferentes genes. De esta manera, asumiendo que los resultados obtenidos con el MLSA basado en siete genes son una buena medida de las relaciones genómicas entre cepas, se ha aceptado como correcta la identificación de los diferentes aislados ambientales que nos ha proporcionado esta técnica.
La selección de los seis genes codificantes de proteínas utilizados en este estudio, se ha realizado teniendo en cuenta que todos ellos habían sido analizados previamente en algunas especies de la familia Vibrionaceae (Le Roux y col., 2005; Thompson y col., 2005a; Thompson y col., 2007; Urbanczyk y col., 2007; Rameshkumar y col., 2008). Además, todos los genes han presentado las siguientes características: (i) un tamaño adecuado para ser secuenciado; (ii) suficiente cantidad de sitios informativos; (iii) una tasa de evolución más rápida que el 16S rRNA pero lo suficientemente lenta como para conservar información filogenética; (iv) una distribución física de los genes dispersa en los genomas, y (v) una única copia en el genoma.
2. Multilocus sequence analysis
109
Análisis de los siete genes concatenados
La concatenación de los siete genes ha generado una secuencia de 5492 nt. Los árboles obtenidos mediante los análisis de NJ, MP y ML se muestran en la Figura 4. En todos los árboles, las cepas tipo y de referencia de las seis especies del clado central se han agrupado en clados monofiléticos bien definidos. El orden de enramado que han presentado las seis especies en el árbol obtenido mediante NJ ha coincidido, a diferencia de los árboles de MP y ML, con los datos de hibridación DNA-DNA bibliográficos (Reichelt y col., 1976; Brenner y col., 1983; Gómez-Gil y col., 2003). Por un lado, se han presentado las especies V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus, por otro lado se han agrupado las especies V. alginolyticus y V. parahaemolyticus, quedando V. natriegens como la especie más distante respecto al conjunto. En relación a la identidad de los aislados ambientales incluidos en el análisis, de los trece aislados identificados fenotípicamente como V. harveyi, nueve (SA F3s 40, H2, DL F5 57, SA F1s 10, SA F4s 17, LPD 1-1-10, LPD 1-3-1, LPD 1-3-27, LPD 1-3-35) han resultado ser verdaderos V. harveyi y cuatro V. rotiferianus (LPD 1-1-11, LPD 1-1-24, LPD 1-1-84, LPD 1-1-86). Los aislados identificados con la técnica Rep PCR (GTG)5 por Gómez-Gil como V. rotiferianus (CAIM 780, R379, R1024, R1117 y R1311) han resultado ser V. campbellii. Estas cinco últimas cepas forman un subclado dentro del clado de V. campbellii, en proceso de divergencia respecto a las cepas tipo y de referencia de la especie. A partir de este punto de la presente Tesis Doctoral, se considerarán como correctas las identidades de las trece cepas ambientales derivadas de este análisis multigénico, hasta que se corrobore posteriormente en los estudios de hibridación DNA-DNA.
Figura 4. Árboles obtenidos mediante los métodos de NJ, ML y MP basados en las secuencias parciales de los genes 16S rRNA, recA, pyrH, rpoD, gyrB, rctB y toxR concatenadas (5492 nt). Barra, el número se corresponde, en NJ y ML con el número de sustituciones nucleotídicas por sitio, y en MP con el número de cambios nucleotídicos entre nodos. En los nodos se muestran los valores de bootstrap iguales o mayores al 75% como porcentaje de 1000 pseudoréplicas.
Resultados y Discusión
110
7 genes concatenados NJ Vibrio harveyi CECT 525T
Vibrio harveyi LPD 1-3-1
Vibrio harveyi LPD 1-3-27
Vibrio harveyi DL F5 57
Vibrio harveyi LPD 1-1-10
Vibrio harveyi LPD 1-3-35
Vibrio harveyi SA F4s 17
Vibrio harveyi SA F1s 10
Vibrio harveyi H2
Vibrio harveyi SA F3s 40
Vibrio campbellii CECT 523T
Vibrio campbellii CAIM 419
Vibrio campbellii CAIM 521
Vibrio campbellii CAIM 128
Vibrio campbellii CAIM 392
Vibrio campbellii CAIM 333
Vibrio campbellii CAIM 415
Vibrio campbellii CAIM 9
Vibrio campbellii R1311
Vibrio campbellii R1117
Vibrio campbellii R1024
Vibrio campbellii CAIM 780
Vibrio campbellii R379
Vibrio rotiferianus CAIM 577T
Vibrio rotiferianus CAIM 575
Vibrio rotiferianus CAIM 576
Vibrio rotiferianus CAIM 574
Vibrio rotiferianus CAIM 573
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T
Vibrio parahaemolyticus CECT 611
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271
Vibrio alginolyticus CECT 521T
Vibrio alginolyticus CECT 436
Vibrio alginolyticus CECT 609
Vibrio alginolyticus CECT 586
Vibrio natriegens CECT 526T
Vibrio natriegens CECT 7466
Vibrio natriegens CECT 7465
Vibrio cholerae CECT 514T
100
90
89
100
100
100
100
100
100
93
98
100
81
100
100
100
100
100
100
89
100
100
76
100
100
100
100
84
0.1
2. Multilocus sequence analysis
111
7 genes concatenados ML
76
Vibrio harveyi CECT 525T
Vibrio harveyi DL F5 57
Vibrio harveyi LPD 1-3-27
Vibrio harveyi LPD 1-3-1
Vibrio harveyi LPD 1-1-10
Vibrio harveyi SA F1s 10
Vibrio harveyi SA F4s 17
Vibrio harveyi LPD 1-3-35
Vibrio harveyi SA F3s 40
Vibrio harveyi H2
Vibrio campbellii CECT 523T
Vibrio campbellii CAIM 419
Vibrio campbellii CAIM 521
Vibrio campbellii CAIM 128
Vibrio campbellii CAIM 9
Vibrio campbellii CAIM 415
Vibrio campbellii CAIM 333
Vibrio campbellii CAIM 392
Vibrio campbellii CAIM 780
Vibrio campbellii R1024
Vibrio campbellii R1117Vibrio campbellii R1311
Vibrio campbellii R379
Vibrio rotiferianus CAIM 577T
Vibrio rotiferianus CAIM 576
Vibrio rotiferianus CAIM 575
Vibrio rotiferianus CAIM 574
Vibrio rotiferianus CAIM 573
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86
Vibrio alginolyticus CECT 521T
Vibrio alginolyticus CECT 436
Vibrio alginolyticus CECT 609
Vibrio alginolyticus CECT 586
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T
Vibrio parahaemolyticus CECT 611
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305
Vibrio natriegens CECT 526T
Vibrio natriegens CECT 7466
Vibrio natriegens CECT 7465
Vibrio cholerae CECT 514T
0.1
100
100
100
99
100
100
100
77
100
100
100
76
100
83
100
87
100
100
100
100
100
100
76
100
Resultados y Discusión
112
Vibrio harveyi CECT 525T
Vibrio harveyi DL F5 57
Vibrio harveyi LPD 1-3-27
Vibrio harveyi LPD 1-3-1
Vibrio harveyi LPD 1-1-10
Vibrio harveyi SA F1s 10
Vibrio harveyi SA F4s 17
Vibrio harveyi LPD 1-3-35
Vibrio harveyi SA F3s 40
Vibrio harveyi H2
Vibrio campbellii CECT 523T
Vibrio campbellii CAIM 419
Vibrio campbellii CAIM 521
Vibrio campbellii CAIM 128
Vibrio campbellii CAIM 9
Vibrio campbellii CAIM 415
Vibrio campbellii CAIM 333
Vibrio campbellii CAIM 392
Vibrio campbellii CAIM 780
Vibrio campbellii R1024
Vibrio campbellii R1117
Vibrio campbellii R1311
Vibrio campbellii R379
Vibrio rotiferianus CAIM 577T
Vibrio rotiferianus CAIM 576
Vibrio rotiferianus CAIM 575
Vibrio rotiferianus CAIM 574
Vibrio rotiferianus CAIM 573
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86
Vibrio alginolyticus CECT 521T
Vibrio alginolyticus CECT 436
Vibrio alginolyticus CECT 609
Vibrio alginolyticus CECT 586
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T
Vibrio parahaemolyticus CECT 611
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305
Vibrio natriegens CECT 526T
Vibrio natriegens CECT 7466
Vibrio natriegens CECT 7465
Vibrio cholerae CECT 514T
200
7 genes concatenados MP
100
75
99
100
100
98
96
79
100
96
80
100
96
100
100
95
100
98
100
100
94
100
100
100
93
80
79
100
99
2. Multilocus sequence analysis
113
Análisis de los genes individuales
A continuación, se han inferido las relaciones filogenéticas de las 44 cepas con cada uno de los genes de manera individual, analizando los posibles eventos de recombinación que hayan podido ocurrir, con el fin de justificar las inferencias filogenéticas aberrantes. La información de las secuencias nucleotídicas utilizadas se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9. Información de las secuencias. nt, número de nucleótidos analizados; MP, número de sitios informativos en Máxima Parsimonia; Modelo ML, modelo evolutivo óptimo aplicado en ML y estimado utilizando el AIC (Akaike Information Criterium) con el programa MODELTEST; TVM, “Modelo Transversional”; I, proporción de sitios invariables; G, distribución del parámetro gamma; GTR, “Modelo General Time-Reversible”; TrN, “Modelo Tamura y Nei”; HKY, “Modelo Hasegawa, Kishino y Yano”.
Gen nt MP (%) Modelo ML
recA 768 123 (16) TVM+I+G
pyrH 552 94 (17) GTR+I+G
rpoD 780 180 (23) GTR+I+G
gyrB 939 207 (22) TVM+I+G
rctB 591 177 (30) TrN+I+G
toxR 477 267 (56) TVM+I+G
16S rRNA 1385 28 (2) HKY+I
El rango de tamaño de los amplicones obtenidos ha oscilado desde 477 nt (toxR) a 1385 nt (16S rRNA). No existe una relación directa entre el número de nucleótidos y el número de sitios informativos para el análisis de MP. El amplicón con el mayor número de nucleótidos (16S rRNA) ha sido el que menor número de sitios informativos (MP) ha presentado y viceversa, el amplicón con el menor número de nucleótidos (toxR) ha sido el que mayor número de sitios informativos (MP) ha presentado (Tabla 9).
Resultados y Discusión
114
Tabla 10. Distancias nucleotídicas entre cepas (%). Variabilidad intraespecífica (negrita) e interespecífica (gris) obtenida para V. harveyi (10 cepas), V. campbellii (13 cepas), V. rotiferianus (9 cepas), V. parahaemolyticus (4 cepas), V. alginolyticus (4 cepas) y V. natriegens (3 cepas).
16S rRNA 1 2 3 4 5 6
1. V. harveyi 0,0-0,1
2. V. campbellii 0,8-2,2 0,0-1,2
3. V. rotiferianus 0,2-1,3 0,1-1,7 0,0-0,6
4. V. parahaemolyticus 1,2-2,4 0,4-1,4 0,4-1,2 0,0-0,1
5. V. alginolyticus 1,0-2,4 0,4-1,2 0,4-1,2 0,1-0,5 0,0-0,2
6. V. natriegens 1,2-2,4 0,6-1,3 0,7-1,3 0,4-0,6 0,3-0,6 0,0-0,1
recA 1 2 3 4 5 6
1. V. harveyi 0,0-2,0 2. V. campbellii 2,1-4,4 0,0-4,0
3. V. rotiferianus 2,5-4,2 0,10-4,1 0,0-3,3
4. V. parahaemolyticus 8,6-10,9 7,9-10,8 8,2-10,9 0,4-3,1
5. V. alginolyticus 5,7-7,4 4,6-7,6 4,8-7,4 9,0-12,0 0,6-7,3
6. V. natriegens 9,0-10,4 8,9-10,6 9,6-10,4 9,7-12,1 9,9-11 1,2-1,9
gyrB 1 2 3 4 5 6
1. V. harveyi 0,0-0,7 2. V. campbellii 0,5-12,2 0,0-13,2
3. V. rotiferianus 8,5-9,2 4,7-13,3 0,0-0,9
4. V. parahaemolyticus 14,0-14,8 13,6-14,9 13,7-14,8 0,5-1,3
5. V. alginolyticus 11,0-12,0 1,4-13,5 12,2-13,7 13,1-14,0 0,5-2,4
6. V. natriegens 16,4-17,2 14,7-16,9 14,7-15,6 11,9-12,4 14,6-14,9 1,1-1,4
pyrH 1 2 3 4 5 6
1. V. harveyi 0,0-0,4 2. V. campbellii 4,3-6,6 0,0-4,2
3. V. rotiferianus 6,8-8,6 2,2-7,6 0,0-6,3
4. V. parahaemolyticus 8,1-9,0 8,9-11,2 10,9-11,6 0,2-0,7
5. V. alginolyticus 12,0-13,5 12,4-13,6 11,7-13,4 7,6-8,5 0,2-2,7
6. V. natriegens 10,2-11,2 10,0-11,4 9,8-10,3 4,6-5,5 7,9-9,2 0,6-0,9
rctB 1 2 3 4 5 6
1. V. harveyi 0,0-0,8 2. V. campbellii 18,1-19,9 0,0-9,0
3. V. rotiferianus 22,4-23,3 13,7-17,3 0,0-0,2
4. V. parahaemolyticus 20,4-21,1 16,2-19,2 19,0-19,9 0,8-1,5
5. V. alginolyticus 22,5-26,1 16,5-22,7 20,4-22,5 7,3-20,6 1,7-14,4
6. V. natriegens 23,9-24,6 21,1-23,6 24,8-25,7 20,3-21,7 19,9-23,0 0,5-0,8
2. Multilocus sequence analysis
115
rpoD 1 2 3 4 5 6
1. V. harveyi 0,0-0,4 2. V. campbellii 4,0-4,9 0,1-4,4
3. V. rotiferianus 13,1-13,9 13,6-14,9 0,0-2,3
4. V. parahaemolyticus 10,4-11,0 10,3-11,3 15,4-17,2 0,0-0,1
5. V. alginolyticus 11,3-12,4 10,5-11,5 15,7-17,1 13,2-13,7 0,1-1,0
6. V. natriegens 13,3-14,2 13,5-15,4 18,0-20,1 14,4-15,5 13,9-15,1 1,1-1,9
toxR 1 2 3 4 5 6
1. V. harveyi 0,0-0,6 2. V. campbellii 28,9-32,2 0,0-22,8
3. V. rotiferianus 57,1-58,5 56,6-63,1 0,0-1,6
4. V. parahaemolyticus 43,5-44,9 41,9-46,2 60,6-64,4 0,2-1,1
5. V. alginolyticus 43,0-45,0 39,2-47,4 56,1-58,2 27,5-32,9 0,5-20,4
6. V. natriegens 55,7-65,9 51,1-64,8 58,3-66,2 46,1-51,7 39,6-46,1 0,6-0,8
7 genes concatenados 1 2 3 4 5 6
1. V. harveyi 0,0-0,5 2. V. campbellii 6,0-8,5 0,1-6,4
3. V. rotiferianus 10,8-11,4 9,0-11,3 0,0-1,7
4. V. parahaemolyticus 11,8-12,4 11,2-11,9 13,3-14,0 0,5-0,9
5. V. alginolyticus 11,6-12,2 9,1-11,8 12,7-13,2 9,5-11,2 0,9-4,7
6. V. natriegens 13,8-14,7 13,1-14,2 14,4-14,8 11,8-12,3 11,9-12,4 0,8-0,8 rpoD, rctB y toxR concatenados 1 2 3 4 5 6
1. V. harveyi 0,0-0,4 2. V. campbellii 14,6-15,8 0,1-9,9
3. V. rotiferianus 26,0-26,7 23,6-25,1 0,0-1,4
4. V. parahaemolyticus 21,4-21,9 20,0-21,0 26,9-27,6 0,4-0,6
5. V. alginolyticus 22,5-24,2 19,9-22,9 26,5-27,9 15,2-20,3 1,5-9,6
6. V. natriegens 26,6-28,8 25,2-27,5 30,1-30,9 24,4-25,5 22,7-24,2 0,8-1,1
Para cada gen se han obtenido tres árboles filogenéticos mediante los métodos de NJ, MP y ML siguiendo la metodología expuesta en Material y Métodos (Figura 5; pág. 118).
16S rRNA
El árbol de NJ inferido con este gen (pág. 119), se caracteriza por agrupar únicamente a las especies V. harveyi, V. parahaemolyticus y V. natriegens en clados monofiléticos. En el caso de las especies V. campbellii y V. rotiferianus, las cepas tipo y de referencia quedan agrupadas en dos clados diferentes, aunque a una similitud tan elevada que se puede considerar un mismo clado. Los cinco aislados ambientales de la especie V. campbellii se incluyen en un mismo grupo, grupo que presenta una posición periférica a los de las especies V.
Resultados y Discusión
116
harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus. Los aislados ambientales de la especie V. rotiferianus quedan incluidos en un mismo clado situado en la periferia del grupo que incluye las cepas tipo y de referencia de la misma especie, excepto la cepa LPD 1-1-86 que se sitúa en la periferia del clado de V. harveyi. En el caso de la especie V. alginolyticus, las cepas tipo y de referencia CECT 521T, CECT 436 y CECT 609 quedan agrupadas en un mismo clado, mientras que la cepa CECT 586 presenta una posición periférica al resto de cepas pertenecientes al clado central incluidas en el estudio. Los árboles obtenidos con los métodos ML y MP (págs. 120 y 121), son similares al obtenido con NJ, excepto que en MP el clado de los cinco aislados ambientales de la especie V. campbellii se une al clado de V. natriegens.
recA
El árbol obtenido mediante NJ (pág. 122), se caracteriza por agrupar a las especies V. harveyi, V. parahaemolyticus y V. natriegens en clados monofiléticos. La cepa tipo de la especie V. campbellii aparece junto con cinco cepas de referencia. Las cepas tipo y de referencia de V. rotiferianus se encuentran en un mismo grupo junto con el aislado LPD 1-1-24. Por otro lado, los aislados ambientales de V. campbellii se unen a la cepa de referencia CAIM 128. Las cepas ambientales de V. rotiferianus LPD 1-1-11, LPD 1-184 y LPD 1-1-86 se asocian a la cepa de referencia de V. campbellii CAIM 9. Finalmente, la cepa tipo de V. alginolyticus se une junto con las cepas de referencia CECT 436 y CECT 609. Sin embargo, la cepa de referencia de V. alginolyticus CECT 586 aparece de manera individual y presenta una posición externa a los grupos de V. harveyi, V. campbellii, V. rotiferianus y V. alginolyticus. En el caso de los árboles obtenidos con ML y MP (págs. 123 y 124), las topologías resultantes son similares a las obtenidas con NJ aunque con determinados cambios puntuales. En el caso de ML, la única discrepancia es la posición de las cepas CAIM 780 y CAIM 128 de V. campbellii, pues aparecen en el mismo grupo donde se encuentra la cepa tipo de la especie. En el caso de MP, las cepas de referencia de V. campbellii CAIM 333 y CAIM 392 no aparecen junto a la cepa tipo, sino con los aislados ambientales de la misma especie.
2. Multilocus sequence analysis
117
gyrB
El árbol filogenético basado en NJ (pág. 125) se caracteriza por agrupar en clados monofiléticos las especies V. harveyi, V. rotiferianus, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus y V. natriegens. En el caso de la especie V. campbellii, la cepa tipo aparece con las cepas de referencia CAIM 419 y CAIM 521. El resto de cepas de referencia de V. campbellii quedan agrupadas en un mismo clado junto con los aislados ambientales de la misma especie, excepto la cepa R379. Esta última cepa se sitúa en el clado de la especie V. alginolyticus. El árbol obtenido con MP (pág. 127) es similar al obtenido con NJ. Sin embargo, no ocurre lo mismo con el de ML (pág. 126), pues las cepas tipo y de referencia de la especie V. campbellii CECT 523T, CAIM 128, CAIM 419 y CAIM 521 aparecen juntas en el mismo clado que la cepa tipo de la especie V. harveyi, dejando de ser consideradas monofiléticas.
pyrH
El árbol filogenético basado en NJ (pág. 128) se caracteriza por agrupar las cepas tipo y de referencia de las especies V. harveyi, V. campbellii, V. rotiferianus, V. alginolyticus, V. natriegens y V. parahaemolyticus en clados monofiléticos. Las cepas ambientales de las especies V. campbellii y V. rotiferianus excepto la cepa LPD 1-1-11, quedan agrupadas en un mismo clado, en lugar de agruparse con sus correspondientes cepas tipo y de referencia. Los árboles basados en ML y MP (págs. 129 y 130) han presentado la misma topología que el árbol basado en NJ.
rctB
En el árbol basado en NJ (pág. 131), las seis especies se agrupan en clados monofiléticos, excepto la cepa tipo de V. alginolyticus CECT 521T, que se sitúa en una posición externa al clado de la especie V. parahaemolyticus. En el caso de los árboles basados en MP y ML (págs. 132 y 133), se crean los mismos grupos monofiléticos que en NJ, aunque existe alguna diferencia. En MP, la cepa CECT 521T sí que se une al clado de la especie V. alginolyticus, aunque en un aposición periférica. En ML, esta cepa también se sitúa en el clado de la especie V. alginolyticus, sin embargo la similitud entre el clado de V. alginolyticus y el de V. parahaemolyticus es muy elevada.
Resultados y Discusión
118
rpoD
En el árbol obtenido con el método de NJ (pág. 134), las cepas tipo, de referencia y ambientales incluidas en el estudio de las seis especies del clado central del género Vibrio se agrupan en clados monofiléticos. Lo mismo ocurre cuando se infieren las filogenias con los métodos ML y MP (págs. 135 y 136).
toxR
Los árboles obtenidos con este gen mediante NJ, ML y MP (págs. 137 a 139) se han caracterizado por agrupar a las seis especies del core group en clados monofiléticos.
Figura 5. Árboles obtenidos mediante los métodos de NJ, ML y MP basados en las secuencias parciales de los genes 16S rRNA, recA, pyrH, rpoD, gyrB, rctB y toxR de manera individual. Barra, el número se corresponde en NJ y ML con el número de sustituciones nucleotídicas por sitio, y en MP con el número de cambios nucleotídicos entre nodos. En los nodos se muestran los valores de bootstrap iguales o mayores al 75% como porcentaje de 1000 pseudoréplicas.
2. Multilocus sequence analysis
119
16S rRNA NJ Vibrio harveyi CECT 525T (AY750575)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM204838)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM204842)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM204839)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM204840)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM204836)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM204843)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM204844)
Vibrio harveyi H2 (FM204837)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM204841)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM204864)
Vibrio campbellii CECT 523T (X74692)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM204850)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM204849)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM204848)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM204847)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM204846)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM204845)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM204851)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM204858)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM204860)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM204859)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM204857)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (AJ316187)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM204862)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM204861)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM204863)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM204852)
Vibrio campbellii R1117 (FM204855)
Vibrio campbellii R1024 (FM204853)
Vibrio campbellii R379 (FM204854)
Vibrio campbellii R1311 (FM204856)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (X74720)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM204865)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM204866)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM204867)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM204868)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM204870)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (X74690)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999825)
Vibrio natriegens CECT 526T (X74714)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999824)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM204869)
Vibrio cholerae CECT 514T (X76337)
98
100
99
97
85
98
90
77
85
99
0.01
Resultados y Discusión
120
16S rRNA ML Vibrio harveyi CECT 525T (AY750575)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM204841)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM204836)
Vibrio harveyi H2 (FM204837)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM204838)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM204839)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM204840)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM204842)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM204844)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM204843)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM204864)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM204861)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM204862)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM204863)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM204857)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM204858)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM204859)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM204860)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (AJ316187)
Vibrio campbellii CECT 523T (X74692)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM204845)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM204846)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM204847)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM204848)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM204849)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM204850)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM204851)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM204852)
Vibrio campbellii R1117 (FM204855)
Vibrio campbellii R379 (FM204854)
Vibrio campbellii R1311 (FM204856)
Vibrio campbellii R1024 (FM204853)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (X74720)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM204865)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM204866)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM204867)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM204870)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM204868)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (X74690)
Vibrio natriegens CECT 526T (X74714)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999824)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999825)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM204869)
Vibrio cholerae CECT 514T (X76337)
0.01
100
83
100
94
100
75
100
86
100
2. Multilocus sequence analysis
121
16S rRNA MP
99
Vibrio harveyi CECT 525T (AY750575)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM204836)
Vibrio harveyi H2 (FM204837)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM204838)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM204839)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM204840)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM204841)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM204842)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM204844)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM204843)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM204864)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM204861)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM204863)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM204862)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM204857)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM204858)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM204859)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM204860)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (AJ316187)
Vibrio campbellii CECT 523T (X74692)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM204845)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM204846)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM204847)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM204848)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM204849)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM204850)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM204851)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (X74720)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM204865)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM204866)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM204867)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM204852)
Vibrio campbellii R1117 (FM204855)
Vibrio campbellii R379 (FM204854)
Vibrio campbellii R1024 (FM204853)
Vibrio campbellii R1311 (FM204856)
Vibrio natriegens CECT 526T (X74714)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999824)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999825)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (X74690)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM204868)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM204870)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM204869)
Vibrio cholerae CECT 514T (X76337)
20
91
81
94
100
80
92
98
92
Resultados y Discusión
122
Vibrio harveyi CECT 525T (FM204794)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM204801)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM204802)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM204797)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM204800)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM204795)
Vibrio harveyi H2 (FM204796)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM204803)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM204798)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM204799)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM204804)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM204810)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM204811)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM204809)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM204808)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM204807)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM204821)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM204820)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM204819)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM204818)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM204817)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM204823)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM204806)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM204812)
Vibrio campbellii R379 (FM204814)
Vibrio campbellii R1024 (FM204813)
Vibrio campbellii R1117 (FM204815)
Vibrio campbellii R1311 (FM204816)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM204805)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM204825)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM204824)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM204822)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM204831)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM204832)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM204834)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM204833)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM204826)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999813)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999812)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM204827)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM204830)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM204828)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM204829)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM204835)
100
98
100
100
100
100
93
99
100
77
98
95
99
89
99
92
86
80
76
80
96
77
90
99
0.1
recA NJ
2. Multilocus sequence analysis
123
recA ML Vibrio harveyi CECT 525T (FM204794)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM204801)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM204802)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM204797)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM204800)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM204795)
Vibrio harveyi H2 (FM204796)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM204798)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM204799)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM204803)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM204804)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM204810)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM204811)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM204809)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM204806)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM204812)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM204807)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM204808)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM204823)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM204817)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM204818)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM204819)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM204820)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM204821)
Vibrio campbellii R379 (FM204814)
Vibrio campbellii R1024 (FM204813)
Vibrio campbellii R1117 (FM204815)
Vibrio campbellii R1311 (FM204816)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM204822)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM204824)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM204825)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM204805)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM204831)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM204832)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM204834)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM204826)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999812)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999813)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM204833)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM204827)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM204830)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM204828)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM204829)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM204835)
0.1
100
100
100
100
100
100
100
80
100
100
100
81
100
84
80
Resultados y Discusión
124
recA MP Vibrio harveyi CECT 525T (FM204794)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM204801)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM204802)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM204797)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM204800)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM204795)
Vibrio harveyi H2 (FM204796)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM204798)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM204799)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM204803)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM204804)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM204810)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM204811)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM204809)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM204821)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM204820)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM204819)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM204818)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM204817)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM204823)
Vibrio campbellii R379 (FM204814)
Vibrio campbellii R1024 (FM204813)
Vibrio campbellii R1311 (FM204816)
Vibrio campbellii R1117 (FM204815)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM204812)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM204806)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM204807)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM204808)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM204822)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM204824)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM204825)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM204805)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM204831)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM204832)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM204834)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM204826)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999813)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999812)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM204833)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM204827)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM204830)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM204828)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM204829)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM204835)
20
84
92
85
95
98
100
82
90
98
100
92
93
100
100
100
94
2. Multilocus sequence analysis
125
gyrB NJ Vibrio harveyi CECT 525T (FM202583)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202590)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202589)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202592)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202584)
Vibrio harveyi H2 (FM202585)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202586)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202591)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202587)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202588)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202595)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202593)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202599)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202600)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202598)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202594)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202596)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202601)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202597)
Vibrio campbellii R1024 (FM202602)
Vibrio campbellii R1311 (FM202605)
Vibrio campbellii R1117 (FM202604)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202610)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202609)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202608)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202607)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202606)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202611)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202612)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202613)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202614)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202620)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202621)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202623)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202622)
Vibrio campbellii R379 (FM202603)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202616)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202618)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202617)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202619)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202615)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999819)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999818)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202624)
100
100
97
93
93
100
89
89
96
100
99
75
94
100
79
100
96
100
10091
99
0.1
Resultados y Discusión
126
gyrB ML Vibrio harveyi CECT 525T (FM202583)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202587)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202591)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202588)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202592)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202584)
Vibrio harveyi H2 (FM202585)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202586)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202590)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202593)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202599)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202600)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202589)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202595)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202594)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202598)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202601)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202596)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202597)
Vibrio campbellii R1117 (FM202604)
Vibrio campbellii R1311 (FM202605)
Vibrio campbellii R1024 (FM202602)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202610)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202609)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202608)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202607)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202606)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202614)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202613)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202612)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202611)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202620)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202621)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202623)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202622)
Vibrio campbellii R379 (FM202603)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202616)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202617)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202619)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202618)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202615)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999819)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999818)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202624)
0.1
100
76
85
75
100
91
76
100
100
100
91
81
91
99
100
83
100
89
2. Multilocus sequence analysis
127
gyrB MP Vibrio harveyi CECT 525T (FM202583)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202584)
Vibrio harveyi H2 (FM202585)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202589)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202592)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202587)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202588)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202595)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202591)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202586)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202590)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202593)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202599)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202600)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202610)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202609)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202608)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202607)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202606)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202614)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202613)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202612)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202611)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202594)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202598)
Vibrio campbellii R1024 (FM202602)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202601)
Vibrio campbellii R1117 (FM202604)
Vibrio campbellii R1311 (FM202605)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202596)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202597)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202620)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202621)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202623)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202622)
Vibrio campbellii R379 (FM202603)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202615)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999819)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999818)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202616)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202617)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202619)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202618)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202624)
20
77
99
100
93
100
97
90
100
100
95
96
99
91
88
100
100
100
100
75
Resultados y Discusión
128
pyrH NJ Vibrio harveyi CECT 525T (FM202541)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202544)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202545)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202546)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202547)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202550)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202548)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202549)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202542)
Vibrio harveyi H2 (FM202543)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202551)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202556)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202557)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202553)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202554)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202552)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202555)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202558)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202571)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202572)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202570)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202559)
Vibrio campbellii R379 (FM202561)
Vibrio campbellii R1311 (FM202563)
Vibrio campbellii R1024 (FM202560)
Vibrio campbellii R1117 (FM202562)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202568)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202565)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202567)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202566)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202564)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202569)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202578)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202581)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202579)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202580)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202573)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999814)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999815)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202574)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202577)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202576)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202575)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202582)
99
100
77
100
79
100
89
100
96
100
86
8387
98
100
0.1
2. Multilocus sequence analysis
129
pyrH ML Vibrio harveyi CECT 525T (FM202541)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202544)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202545)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202546)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202547)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202548)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202549)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202550)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202542)
Vibrio harveyi H2 (FM202543)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202551)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202552)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202553)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202554)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202555)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202558)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202556)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202557)
Vibrio campbellii R1117 (FM202562)
Vibrio campbellii R1024 (FM202560)
Vibrio campbellii R1311 (FM202563)
Vibrio campbellii R379 (FM202561)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202559)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202572)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202571)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202570)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202568)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202567)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202566)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202565)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202564)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202569)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202573)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999814)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999815)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202574)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202576)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202577)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202575)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202578)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202579)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202581)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202580)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202582)
0.1
100
100
96
95
82
75
97
77
76
100
76
98
Resultados y Discusión
130
pyrH MP
100
Vibrio harveyi CECT 525T (FM202541)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202544)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202545)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202546)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202547)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202548)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202549)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202550)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202542)
Vibrio harveyi H2 (FM202543)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202551)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202552)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202553)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202554)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202555)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202558)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202556)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202557)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202570)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202571)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202572)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202559)
Vibrio campbellii R379 (FM202561)
Vibrio campbellii R1311 (FM202563)
Vibrio campbellii R1024 (FM202560)
Vibrio campbellii R1117 (FM202562)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202569)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202564)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202565)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202566)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202567)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202568)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202580)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202581)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202579)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202578)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202573)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999814)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999815)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202574)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202576)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202577)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202575)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202582)
20
90
79
94
100
100
92
97
75
100
97
85
2. Multilocus sequence analysis
131
rctB NJ Vibrio harveyi CECT 525T (FM202625)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202632)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202631)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202634)
Vibrio harveyi H2 (FM202627)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202626)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202633)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202630)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202629)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202628)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202635)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202641)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202642)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202636)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202637)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202640)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202638)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202639)
Vibrio campbellii R1117 (FM202646)
Vibrio campbellii R1311 (FM202647)
Vibrio campbellii R379 (FM202645)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202643)
Vibrio campbellii R1024 (FM202644)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202652)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202648)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202649)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202651)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202650)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202655)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202654)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202653)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202656)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202658)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202661)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202659)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202660)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202662)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202664)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202663)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202665)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202657)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999820)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999821)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202666)
100
100
100
81100
96
90
79
100
79
8499
99
100
9899
98
95
100
95
0.1
Resultados y Discusión
132
rctB ML
100
Vibrio harveyi CECT 525T (FM202625)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202628)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202633)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202629)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202630)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202631)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202632)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202634)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202626)
Vibrio harveyi H2 (FM202627)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202635)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202641)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202642)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202638)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202639)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202636)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202637)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202643)
Vibrio campbellii R1024 (FM202644)
Vibrio campbellii R379 (FM202645)
Vibrio campbellii R1117 (FM202646)
Vibrio campbellii R1311 (FM2026479)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202652)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202651)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202650)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202649)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202648)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202656)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202655)
Vibrio rotiferianus LPD 1 1-24 (FM202654)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202653)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202658)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202661)
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Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202660)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202662)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202663)
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Vibrio natriegens CECT 526T (FM202657)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999820)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999821)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202666)
0.1
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202640)
77
88
89
79
86
100
100
100
100
80
100
2. Multilocus sequence analysis
133
rctB MP
100
Vibrio harveyi CECT 525T (FM2026259)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202626)
Vibrio harveyi H2 (FM202627)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202631)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202632)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202634)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202628)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202633)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202629)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202630)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202652)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202651)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202650)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202649)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202648)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202656)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202655)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202654)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202653)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202635)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202641)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202642)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202638)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202639)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202636)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202637)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202640)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202643)
Vibrio campbellii R1024 (FM202644)
Vibrio campbellii R379 (FM202645)
Vibrio campbellii R1117 (FM202646)
Vibrio campbellii R1311 (FM202647)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202658)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202661)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202659)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM2026609
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202662)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202663)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202665)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202664)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202657)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999820)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999821)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202666)
20
100
81
90
98
98
77
97
100
97
90
96
100
100
75
100
78
Resultados y Discusión
134
rpoD NJ Vibrio harveyi CECT 525T (FM202498)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202507)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202504)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202503)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202502)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202506)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202505)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202499)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202501)
Vibrio harveyi H2 (FM202500)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202508)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202514)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202511)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202509)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202513)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202512)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202510)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202515)
Vibrio campbellii R1024 (FM202517)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202516)
Vibrio campbellii R379 (FM202518)
Vibrio campbellii R1117 (FM202519)
Vibrio campbellii R1311 (FM202520)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202525)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202521)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202524)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202523)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202522)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202528)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202529)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202527)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202526)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202535)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202538)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202536)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202537)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202532)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202531)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202534)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202533)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202530)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999816)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999817)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202539)
91
100
82
100
99
100
89
100
100
100
99
81
100
100
80
100
0.1
2. Multilocus sequence analysis
135
rpoD ML Vibrio harveyi CECT 525T (FM202498)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202499)
Vibrio harveyi H2 (FM202500)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202501)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202502)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202503)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202504)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202507)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202505)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202506)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202508)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202514)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202509)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202512)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202513)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202511)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202510)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202515)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202516)
Vibrio campbellii R379 (FM202518)
Vibrio campbellii R1117 (FM202519)
Vibrio campbellii R1311 (FM202520)
Vibrio campbellii R1024 (FM202517)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202525)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202524)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202523)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202522)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202521)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202529)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202528)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202527)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202526)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202531)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202532)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202533)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202534)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202535)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202538)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202536)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202537)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202530)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999816)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999817)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202539)
0.1
100
82
76
100
92
100
76
84
92
79
100
100
85
100
92
Resultados y Discusión
136
rpoD MP
99
Vibrio harveyi CECT 525T (FM202498)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202499)
Vibrio harveyi H2 (FM202500)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202501)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202502)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202503)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202504)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202507)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202505)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202506)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202508)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202514)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202509)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202511)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202512)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202513)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202510)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202515)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202516)
Vibrio campbellii R379 (FM202518)
Vibrio campbellii R1117 (FM202519)
Vibrio campbellii R1311 (FM202520)
Vibrio campbellii R1024 (FM202517)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202531)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202532)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202533)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202534)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202535)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202538)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202536)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202537)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202525)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202524)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202523)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202522)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202521)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202529)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202528)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202527)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202526)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202530)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999816)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999817)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202539)
20
87
80
100
95
100
75
100
100
100
86
100
100
77
100
2. Multilocus sequence analysis
137
toxR NJ Vibrio harveyi CECT 525T (FM202678)
Vibrio harveyi H2 (FM202680)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202681)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202679)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202686)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202687)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202684)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202685)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202683)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202682)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202688)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202694)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202695)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202691)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202692)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202693)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202689)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202690)
Vibrio campbellii R1311 (FM202700)
Vibrio campbellii R379 (FM202696)
Vibrio campbellii R1024 (FM202697)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202698)
Vibrio campbellii R1117 (FM202699)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202711)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202712)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202713)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202714)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202715)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202718)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202716)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202717)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999823)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999822)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202710)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202708)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202709)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202707)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202706)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202705)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202704)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202703)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202701)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202702)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202719)
100
89
79
96
100
80
91
100
80
100
97
77
77
100
99
100
90
92
99
100
75
99
97
84
100
0.1
Resultados y Discusión
138
toxR ML Vibrio harveyi CECT 525T (FM202678)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202679)
Vibrio harveyi H2 (FM202680)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202681)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202682)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202683)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202684)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202685)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202686)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202687)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202688)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202694)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202695)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202689)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202690)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202691)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202692)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202693)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202696)
Vibrio campbellii R1117 (FM202699)
Vibrio campbellii R1311 (FM202700)
Vibrio campbellii R1024 (FM202697)
Vibrio campbellii R379 (FM202698)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202711)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202712)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202713)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202714)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202715)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202716)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202718)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202717)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202710)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999822)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999823)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202705)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202708)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202709)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202704)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202703)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202702)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM2027019)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202706)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM2027079
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202719)
0.5
100
80
100
90
96
91
100
100
100
80
2. Multilocus sequence analysis
139
Vibrio harveyi CECT 525T (FM202678)
Vibrio harveyi SA F3s 40 (FM202679)
Vibrio harveyi H2 (FM202680)
Vibrio harveyi DL F5 57 (FM202681)
Vibrio harveyi SA F1s 10 (FM202682)
Vibrio harveyi SA F4s 17 (FM202683)
Vibrio harveyi LPD 1-1-10 (FM202684)
Vibrio harveyi LPD 1-3-1 (FM202685)
Vibrio harveyi LPD 1-3-27 (FM202686)
Vibrio harveyi LPD 1-3-35 (FM202687)
Vibrio campbellii CECT 523T (FM202688)
Vibrio campbellii CAIM 419 (FM202694)
Vibrio campbellii CAIM 521 (FM202695)
Vibrio campbellii CAIM 9 (FM202689)
Vibrio campbellii CAIM 128 (FM202690)
Vibrio campbellii CAIM 333 (FM202691)
Vibrio campbellii CAIM 392 (FM202692)
Vibrio campbellii CAIM 415 (FM202693)
Vibrio campbellii CAIM 780 (FM202696)
Vibrio campbellii R1117 (FM202699)
Vibrio campbellii R379 (FM202698)
Vibrio campbellii R1024 (FM202697)
Vibrio campbellii R1311 (FM202700)
Vibrio natriegens CECT 526T (FM202710)
Vibrio natriegens CECT 7465 (FM999822)
Vibrio natriegens CECT 7466 (FM999823)
Vibrio alginolyticus CECT 521T (FM202715)
Vibrio alginolyticus CECT 609 (FM202718)
Vibrio alginolyticus CECT 436 (FM202716)
Vibrio alginolyticus CECT 586 (FM202717)
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T (FM202711)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305 (FM202712)
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271 (FM202713)
Vibrio parahaemolyticus CECT 611 (FM202714)
Vibrio rotiferianus CAIM 577T (FM202705)
Vibrio rotiferianus CAIM 576 (FM202704)
Vibrio rotiferianus CAIM 575 (FM202703)
Vibrio rotiferianus CAIM 574 (FM202702)
Vibrio rotiferianus CAIM 573 (FM202701)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11 (FM202706)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84 (FM202708)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86 (FM202709)
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24 (FM202707)
Vibrio cholerae CECT 514T (FM202719)
20
toxR MP
88
100
99
100
98
99
93
76
92
100
92
100
100
100
80
100
99
100
Resultados y Discusión
140
Con el fin de detectar los posibles eventos de recombinación se han analizado las 44 secuencias de cada gen siguiendo la metodología expuesta en Material y Métodos. En el análisis se han señalado diversos eventos de recombinación en los genes recA, rpoD, gyrB, rctB y toxR (Tabla 11), pero únicamente los eventos de recombinación acontecidos en los genes gyrB y rctB han afectado a la topología de los árboles generados. En el caso de gyrB, todas las cepas de V. harveyi así como las cepas de V. campbellii CECT 523T, CAIM 128, CAIM 419 y CAIM 521 han sufrido un evento de recombinación de 280 nt de longitud, cuyo putativo donador ha sido una cepa de identidad taxonómica desconocida. Esto ha hecho que todas estas cepas se agrupen juntas entre sí en el mismo clado y distantes al resto de cepas de V. campbellii (árboles de gyrB, Figura 5). En el mismo gen, otra cepa de V. campbellii (R379) y las cuatro cepas de V. alginolyticus han sufrido otro evento de recombinación que ha afectado a un fragmento de 256 nt. Este hecho explica la ubicación de la cepa R379 dentro del clado de V. alginolyticus (árboles de gyrB, Figura 5). Finalmente, la cepa CECT 521T de V. alginolyticus ha sufrido un evento de recombinación que afecta a un fragmento de 169 nt del gen rctB con respecto a la cepa CECT 5305 de V. parahaemolyticus. Esto explica la proximidad de la cepa tipo de V. alginolyticus al clado de V. parahaemolyticus cuando se analiza el gen rctB (árboles de rctB, Figura 5), incrementando los valores de distancias intraespecíficas con dicho gen.
Teniendo en cuenta la topología de los árboles generados, se puede concluir que los genes 16S rRNA, recA, gyrB y pyrH no son adecuados para la resolución de las seis especies del core group del género Vibrio. Sin embargo, los otros tres genes, rctB, rpoD y toxR, sí que pueden, de manera individual, diferenciar cada una de las seis especies, aunque la posición relativa de cada una de ellas puede variar dependiendo del gen y del método analítico aplicado para obtener el árbol (Figura 5).
2. Multilocus sequence analysis
141
Tabla 11. Eventos de recombinación detectados en los genes que codifican proteínas utilizados en este estudio, así como los p-valores obtenidos con los diferentes métodos de detección de recombinación.
Genes recA rpoD gyrB gyrB rctB toxR
Nucleótidos 181 150 280 256 169 87
Receptoras V. parahaemolyticus V. harveyi V. harveyi V. alginolyticus V. alginolyticus V. campbellii
CECT 5305 CECT 525T CECT 525T CECT 521T CECT 521T CECT 523T
CECT 5271 SA F3s 40 SA F3s 40 CECT 436 CAIM 419
H2 H2 CECT 586 CAIM 521
DL F5 57 DL F5 57 CECT 609
SA F1s 10 SA F1s 10 V. campbellii
SA F4s 17 SA F4s 17 R379
LPD 1-1-10 LPD 1-1-10
LPD 1-3-1 LPD 1-3-1
LPD 1-3-27 LPD 1-3-27
LPD 1-3-35 LPD 1-3-35
V. campbellii V. campbellii
CECT 523T CECT 523T
CAIM 9 CAIM 128
CAIM 128 CAIM 419
CAIM 333 CAIM 521
CAIM 392
CAIM 415
CAIM 419
CAIM 521T
CAIM 780
R379
R1024
R1117
R1311
Donadoras desconocida V. rotiferianus desconocida desconocida V. parahaemolyticus V. harveyi
LPD 1-1-84 CECT 5305 CECT 525T
Análisis
RDP 1,2E-3 1,4E-3
Geneconv 2,3E-3 5,3E-7
Bootscan 2,7E-3 1,6E-3 8,6E-10 9,3E-4
MaxChi 8,0E-5 8,0E-3 4,2E-5 4,5E-6 1,0E-9 4,0E-4
Chimera 4,8E-1 8,1E-4 2,4E-4 1,4E-9 3,2E-3
SiScan 1,3E-4 2,8E-6 1,6E-11
Resultados y Discusión
142
En el estudio también se han analizado, en el caso de los genes codificantes de proteínas, las secuencias aminoacídicas mediante los análisis de MP y NJ, aplicando en este último la corrección de Poisson. Tal y como era de esperar, las secuencias aminoacídicas han resultado ser menos discriminativas entre especies debido al carácter más conservador de las secuencias de aminoácidos. Este hecho es debido principalmente a la naturaleza degenerada del código genético, ya que muchas de las sustituciones nucleotídicas, principalmente en la tercera posición de cada codón, son sinónimas y no acarrean un cambio en el aminoácido codificado.
Los rangos de las similitudes de secuencia intraespecíficas que se han obtenido han sido: 16S rRNA (98,8-100 %), recA (92,7-100 %), pyrH (93,7-100 %), rpoD (95,6-100 %), gyrB (86,8-100 %), rctB (85,6-100 %), toxR (77,2-100 %). Los rangos de las similitudes de secuencia interespecíficas han sido: 16S rRNA (97,6-99,9 %), recA (88,0-99,9 %), pyrH (86,4-97,8 %), rpoD (81,8-96,0 %), gyrB (82,8-99,5 %), rctB (73,9-92,7 %), toxR (33,8-72,5 %) (Tabla 10). Tomando como modelo la figura mostrada en un estudio previo de MLSA realizado por Martens y col. (2007), la Figura 6 muestra la resolución taxonómica de cada gen, definida como el grado de solapamiento o hueco que se crea entre la distancia intraespecífica máxima y la distancia interespecífica mínima, representada como porcentaje de las similitudes génicas. En las secuencias génicas del 16S rRNA, el solapamiento que se ha dado entre la distancia intraespecífica máxima y la interespecífica mínima es excesivamente grande, careciendo dicho gen casi por completo de poder de resolución. Los genes recA, gyrB, pyrH y rctB han mostrado también un cierto grado de solapamiento. En el caso de los genes gyrB y rctB, el solapamiento que se ha dado podría ser atribuido a los eventos de recombinación detectados en algunas cepas. En el caso de pyrH, la baja resolución ha afectado únicamente a las especies V. campbellii y V. rotiferianus, pues varias cepas de dichas especies han presentado una posición parafilética entre sí. La resolución del gen recA ha sido inferior, resultando ser de menor utilidad en este grupo de organismos. Finalmente, los genes rpoD y toxR han mostrado un solapamiento muy pequeño el primero y un gran hueco el segundo, siendo por tanto los genes que han resultado tener un mayor poder de resolución
2. Multilocus sequence analysis
143
Figura 6. Resolución taxonómica en relación al rango de similitudes (%) intraespecíficas (gris) e interespecíficas (negro).
Análisis de los tres genes concatenados
Con el objeto de optimizar (número de genes concatenados vs. poder de resolución) el análisis basado en MLSA, se ha realizado una segunda aproximación donde se han concatenando los tres genes con mayor poder de resolución: toxR, rpoD y rctB (Figura 7). Las secuencias concatenadas han generado una secuencia de 1848 nt. Como se muestra (Figura 7), las reconstrucciones filogenéticas obtenidas mediante NJ, MP y ML han sido en esencia las mismas que las obtenidas con los siete genes concatenados, donde las seis especies del clado central del género Vibrio se agrupan en clados monofiléticos y donde las relaciones filogenéticas entre las especies coinciden con los datos bibliográficos (Reichelt y col., 1976; Brenner y col., 1983; Gómez-Gil y col., 2003) No obstante, se han obtenido diferentes resultados sobre el orden relativo de evolución de los taxones con los diferentes métodos de reconstrucción filogenética . Por otro lado, la resolución en términos de similitud de secuencia interespecífica ha sido superior con los tres genes concatenados que con los siete genes concatenados, puesto que en esta segunda aproximación no se incluyen genes con un reducido poder de resolución, como es el caso del gel 16S rRNA, que atenúan el poder de resolución de las secuencias concatenadas (Figura 6).
recA100%
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
rpoDgyrB rctB
33.8%
toxR16S
rRNA7 genes
(5492 nt)3 genes
(1848 nt)
Concatenados pyrH
Resultados y Discusión
144
Figura 7. Árboles obtenidos mediante los métodos de NJ, ML y MP basados en las secuencias parciales de los genes rpoD, rctB, y toxR concatenadas (1848 nt). Barra, el número se corresponde en NJ y ML con el número de sustituciones nucleotídicas por sitio, y en MP con el número de cambios nucleotídicos entre nodos. En los nodos se muestran los valores de bootstrap iguales o mayores al 75% como porcentaje de 1000 pseudoréplicas.
2. Multilocus sequence analysis
145
3 genes concatenados NJ Vibrio harveyi H2
Vibrio harveyi SA F3s 40
Vibrio harveyi CECT 525T
Vibrio harveyi LPD 1-3-35
Vibrio harveyi LPD 1-1-10
Vibrio harveyi SA F4s 17
Vibrio harveyi SA F1s 10
Vibrio harveyi DL F5 57
Vibrio harveyi LPD 1-3-1
Vibrio harveyi LPD 1-3-27
Vibrio campbellii CECT 523T
Vibrio campbellii CAIM 419
Vibrio campbellii CAIM 521
Vibrio campbellii CAIM 128
Vibrio campbellii CAIM 392
Vibrio campbellii CAIM 333
Vibrio campbellii CAIM 415
Vibrio campbellii CAIM 9
Vibrio campbellii R1117
Vibrio campbellii R1311
Vibrio campbellii R379
Vibrio campbellii CAIM 780
Vibrio campbellii R1024
Vibrio rotiferianus CAIM 577T
Vibrio rotiferianus CAIM 575
Vibrio rotiferianus CAIM 576
Vibrio rotiferianus CAIM 573
Vibrio rotiferianus CAIM 574
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271
Vibrio parahaemolyticus CECT 611
Vibrio alginolyticus CECT 609
Vibrio alginolyticus CECT 436
Vibrio alginolyticus CECT 521T
Vibrio alginolyticus CECT 586
Vibrio natriegens CECT 526T
Vibrio natriegens CECT 7465
Vibrio natriegens CECT 7466
Vibrio cholerae CECT 514T
87
100
100
93
86
100
99
100
100
100
100
84
82
100
100
77
100
100
100
100
100
100
100
95
100
87
0.1
Resultados y Discusión
146
3 genes concatenados ML
100
Vibrio harveyi CECT 525T
Vibrio harveyi SA F3s 40
Vibrio harveyi H2
Vibrio harveyi DL F5 57
Vibrio harveyi LPD 1-3-27
Vibrio harveyi SA F1s 10
Vibrio harveyi SA F4s 17
Vibrio harveyi LPD 1-3-1
Vibrio harveyi LPD 1-1-10
Vibrio harveyi LPD 1-3-35
Vibrio campbellii CECT 523T
Vibrio campbellii CAIM 419
Vibrio campbellii CAIM 521
Vibrio campbellii CAIM 9
Vibrio campbellii CAIM 128
Vibrio campbellii CAIM 415
Vibrio campbellii CAIM 333
Vibrio campbellii CAIM 392
Vibrio campbellii CAIM 780
Vibrio campbellii R1024
Vibrio campbellii R379
Vibrio campbellii R1117
Vibrio campbellii R1311
Vibrio rotiferianus CAIM 577T
Vibrio rotiferianus CAIM 576
Vibrio rotiferianus CAIM 575
Vibrio rotiferianus CAIM 574
Vibrio rotiferianus CAIM 573
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11
Vibrio parahaemolyticus CECT 511
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305
Vibrio parahaemolyticus CECT 611
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271
Vibrio alginolyticus CECT 521T
Vibrio alginolyticus CECT 436
Vibrio alginolyticus CECT 609
Vibrio alginolyticus CECT 586
Vibrio natriegens CECT 526T
Vibrio natriegens CECT 7465
Vibrio natriegens CECT 7466
Vibrio cholerae CECT 514T
0.1
94
100
100
100
100
90
100
83
100
100
97
100
100
100
100
100
100
100
100100
100
2. Multilocus sequence analysis
147
Vibrio harveyi CECT 525T
Vibrio harveyi SA F3s 40
Vibrio harveyi H2
Vibrio harveyi LPD 1-1-10
Vibrio harveyi LPD 1-3-35
Vibrio harveyi LPD 1-3-1
Vibrio harveyi SA F1s 10
Vibrio harveyi SA F4s 17
Vibrio harveyi LPD 1-3-27
Vibrio harveyi DL F5 57
Vibrio campbellii CECT 523T
Vibrio campbellii CAIM 419
Vibrio campbellii CAIM 521
Vibrio campbellii CAIM 9
Vibrio campbellii CAIM 333
Vibrio campbellii CAIM 392
Vibrio campbellii CAIM 415
Vibrio campbellii CAIM 128
Vibrio campbellii CAIM 780
Vibrio campbellii R1024
Vibrio campbellii R379
Vibrio campbellii R1117
Vibrio campbellii R1311
Vibrio natriegens CECT 526T
Vibrio natriegens CECT 7465
Vibrio natriegens CECT 7466
Vibrio alginolyticus CECT 521T
Vibrio alginolyticus CECT 436
Vibrio alginolyticus CECT 609
Vibrio alginolyticus CECT 586
Vibrio parahaemolyticus CECT 511T
Vibrio parahaemolyticus CECT 5271
Vibrio parahaemolyticus CECT 611
Vibrio parahaemolyticus CECT 5305
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-11
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-24
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-84
Vibrio rotiferianus LPD 1-1-86
Vibrio rotiferianus CAIM 573
Vibrio rotiferianus CAIM 574
Vibrio rotiferianus CAIM 575
Vibrio rotiferianus CAIM 576
Vibrio rotiferianus CAIM 577T
Vibrio cholerae CECT 514T
200
3 genes concatenados MP
97
100
100
100
98
97
100
100
78
100
100
100
100
99
95
100
95
100
76
100
100
Resultados y Discusión
148
En estudios previos, Thompson y col. (2005a) analizaron cuatro genes (rpoA, pyrH, recA y 16S rRNA) para identificar y reconstruir la filogenia de las especies pertenecientes a la familia Vibrionaceae. En ese estudio, las especies quedaban claramente definidas a una distancia de al menos 98%, 94% y 94% de similitud de secuencia con los genes rpoA, recA y pyrH, respectivamente. Además, los clados obtenidos coincidían con los obtenidos anteriormente en estudios polifásicos. Más concretamente, las especies V. harveyi y afines mostraron entre sí menos del 96,5%, 97% y 95% de similitud en los genes rpoA, recA y pyrH, respectivamente. Estos resultados difieren de los obtenidos en la presente Tesis Doctoral, pues los valores interespecíficos de similitud máximos obtenidos en el clado central han sido 99,9 % y 97,8 % con los genes recA y pyrH, respectivamente, presentando un menor poder de resolución, a la hora de diferenciar entre las especies. Hay que destacar que en el trabajo de Thompson y col. (2005a) únicamente se incluyeron las cepas tipo de las especies, de modo que no se tuvo en cuenta la variabilidad intraespecífica, no pudiendo compararse con los resultados de la presente Tesis Doctoral.
Posteriormente, Thompson y col. (2007) utilizaron los genes recA, pyrH, gyrB, gapA, mreB, ftsZ, y topA, en un estudio de MLSA aplicado a las especies V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus, con el fin de resolver las relaciones taxonómicas entre las mismas. Los autores concluyeron que los genes topA, pyrH, ftsZ y mreB son útiles para diferenciar entre las tres especies. Por el contrario, las relaciones filogenéticas obtenidas con los genes gyrB, recA y gapA, fueron menos precisas, apareciendo grupos parafiléticos y/o polifiléticos. La secuencia concatenada de los siete genes mostró que las especies V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus son especies bien definidas que han evolucionado por mutaciones puntuales más que por THG. Es importante mencionar que en este trabajo se incluyeron un reducido número de cepas de V. rotiferianus y ninguna de las otras tres especies integrantes del clado central. Los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral coinciden en señalar el reducido poder de resolución que presentan los genes recA y gyrB en el grupo de V. harveyi, pero sin embargo muestran que pyrH no es apropiado para diferenciar V. campbellii de V. rotiferianus.
Nhung y col. (2007) compararon la utilidad del gen dnaJ para la identificación de 57 especies del género Vibrio en comparación con los genes 16S rRNA, recA, rpoA y hsp60. El valor medio de similitud de
2. Multilocus sequence analysis
149
secuencia del gen dnaJ entre las 57 especies fue del 77,9%, valor considerablemente menor que el obtenido con el gen 16S rRNA (97,2%), indicando el gran poder de resolución de dicho gen. No obstante, dicho valor de similitud es superior al valor de similitud máximo interespecífco obtenido en la presente Tesis Doctoral con el gen toxR (72,5%). Además el gen dnaJ resultó ser más adecuado que los genes recA y rpoA para diferenciar entre V. harveyi y V. rotiferianus. Sin embargo, de nuevo en este trabajo sólo se analizaron las cepas tipo de las especies sin incluir otras cepas, por lo que no se pudo evaluar la variabilidad intraespecífica.
Sawabe y col. (2007) utilizaron los genes 16S rRNA, rpoA, recA, pyrH, gapA, mreB, ftsZ, gyrB y topA para dilucidar la historia evolutiva de los vibrios. En este estudio se vio que las especies del clado central, con los nueve genes concatenados, presentan unas similitudes de secuencia entre el 90,1% y el 96,2%, y en el caso de las secuencias concatenadas aminoacídicas entre el 97,2% y el 99,4%. En el estudio determinaron que las especies V. harveyi y V. campbellii se diversificaron hace 0,39 X 108 años y V. harveyi respecto a V. parahaemolyticus 1,05 X 108 años. En este estudio se incluyó V. mytili dentro del core group.
Además, estudios taxonómicos recientes basados en datos de MLSA, han sido la base de la descripción de nuevos taxones. Le Roux y col. (2005) describieron la especie V. gigantis basándose en árboles de genes individuales que comparaban las cuatro cepas de la nueva especie respecto a las cepas tipo del clado de V. splendidus. De entre los cuatro genes que codifican proteínas utilizados en el estudio, gyrB fue el menos resolutivo, mientras que los otros tres genes, rpoD, rctB y toxR, fueron los que mejor discriminaban entre especies. Estos resultados concuerdan plenamente con los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral, donde esos tres genes han presentado el mayor poder de resolución. El clado de V. splendidus actualmente lo constituyen nueve especies estrechamente relacionadas genómica y filogenéticamente de manera similar a las especies del clado central del género. La última especie descrita perteneciente al clado de V. splendidus ha sido V. gallaecicus (Beaz-Hidalgo y col., 2009). En la descripción de la especie, los autores realizaron un análisis multigénico utilizando cuatro genes housekeeping como parte de la descripción polifásica de la especie. El gen recA es el que mayores distancias dio entre la nueva especie y las restantes especies del clado V. splendidus,
Resultados y Discusión
150
mientras que los genes rpoA y atpA, a pesar de ser genes housekeeping, presentaron distancias interespecíficas mínimas con valores similares a los obtenidos con el gen 16S rRNA.
Urbanczyk y col. (2007) propusieron un nuevo género Aliivibrio en la familia Vibrionaceae, para acomodar a V. fischeri y especies afines, tras analizar las secuencias de los genes recA, rpoA, pyrH, gyrB y 16S rRNA, así como sus secuencias concatenadas. Rameshkumar y col. (2008) analizaron, en la descripción de la nueva especie V. porteresiae, las secuencias concatenadas de cuatro genes: 16S rRNA, rpoA, recA y pyrH. En estos dos últimos trabajos, el papel del MLSA fue menos relevante pues las inferencias filogenéticas que presentaban podían ser apoyadas simplemente con las secuencias del 16S rRNA. De este modo, ninguno de estos estudios previos donde se aplicó el MLSA sirvió como ejemplo para la discriminación entre especies estrechamente relacionadas.
3. Validación de las técnicas
3. Validación de las técnicas
153
Con el fin de validar las diferentes técnicas de fingerprinting y el análisis de MLSA, aplicados en los apartados 1 y 2 de la presente Tesis Doctoral para la identificación y clasificación de las seis especies del clado central del género Vibrio, éstas deben de ser correlacionadas con la hibridación DNA-DNA, técnica estándar utilizada en taxonomía procariota para la definición de especie genómica. En un primer paso se han obtenido valores de hibridación DNA-DNA entre diferentes representantes de los clados de V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus generados en el estudio de MLSA basado en los siete genes concatenados (CECT 525T, SA F1s 10, SA F4s 17, DL F5 57, CECT 523T, CAIM 333, CAIM 392, R1024, CAIM 577T, LPD 1-1-84 y LPD 1-1-86). Los experimentos de hibridación DNA-DNA se han realizado siguiendo la metodología expuesta en el apartado 4 del Material y Métodos. Este análisis ha permitido corroborar las identidades de las cepas asumidas como correctas en el apartado 2 de esta Tesis Doctoral.
En la Tabla 12 se muestran los valores de hibridación obtenidos entre las diferentes cepas. Si se comparan dichos valores con las identidades de las cepas asumidas en el estudio de MLSA basado en los siete genes concatenados, se observa que éstas eran correctas. Las cepas CECT 525T, SA F1s 10, SA F4s 17 y DL F5 57 se corresponden con la especie V. harveyi; CECT 523T, CAIM 333, CAIM 392 y R1024 con V. campbellii; y CAIM 577T, LPD 1-1-84 y LPD 1-1-86 con V. rotiferianus.
Los valores de reasociación DNA-DNA intraespecíficos obtenidos han sido siempre superiores al valor umbral del 70%, siendo V. harveyi la especie con los valores más altos (de 96 al 100%) y V. campbellii con los más bajos (del 71 al 80%) (Tabla 12). Estos resultados coinciden con la baja diversidad genética intraespecífica de la especie V. harveyi observada en el estudio previo de MLSA así como en los estudios realizados por Thompson y col. (2007). Los valores de hibridación DNA-DNA interespecíficos obtenidos fueron siempre mayores al 45%, alcanzándose en algunos casos valores próximos al 70% entre cepas ambientales de V. campbellii y V. harveyi respecto a la cepa tipo de V. rotiferianus. Estos valores de hibridación DNA-DNA tan elevados coinciden con los observados entre las especies V. harveyi y V. campbellii en estudios previos (Reichelt y col., 1976; Brenner y col., 1983), y V. rotiferianus respecto a las otras dos especies vecinas (Gómez-Gil y col., 2003, 2004) (Tabla 13). Dentro del clado
Resultados y Discusión
154
central del genero Vibrio las especies V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus forman un subgrupo de reciente especiación.
Tabla 12. Valores de reasociación DNA-DNA (%) entre cepas representativas de las especies V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus (n=11). Cada valor mostrado se corresponde con la media de al menos tres replicas independientes.
Valores de reasociación DNA-DNA (%) obtenidos con el DNA marcado
DNA no marcado V. harveyi CECT 525T
V. campbellii CECT 523T
V. rotiferianus CAIM 577T
V. harveyi CECT 525T
100 50 - SA F1s 10 96 49 59 SA F4s 17 100 54 69 DL F5 57 99 51 59
V. campbellii CECT 523T - 100 - CAIM 333 58 71 58 CAIM 392 64 80 68 R1024 65 78 69
V. rotiferianus CAIM 577T 55 52 100 LPD 1-1-84 53 46 86 LPD 1-1-86 64 57 78
En una segunda fase de este apartado, se han correlacionado los valores de similitud entre cepas obtenidos con las técnicas de fingerprinting y MLSA, aplicados en los apartados 1 y 2, con los de hibridación DNA-DNA, con el fin de validar estas técnicas para la identificación y clasificación de las especies del core group del género Vibrio. Para ello, se han utilizado los datos de hibridación DNA-DNA obtenidos previamente en este apartado, así como los datos bibliográficos de hibridación DNA-DNA de cepas incluidas en este estudio (n=62) (Reichelt y col., 1976; Gómez-Gil y col., 2003, 2004) (Tabla 12 y 13).
3. Validación de las técnicas
155
Tabla 13. Valores de reasociación DNA-DNA (%) obtenidos de la literatura y utilizados junto con los valores obtenidos en este estudio (Tabla 12) para correlacionar los valores de reasociación DNA-DNA y los valores de similitud de secuencia del análisis MLSA (tres y siete genes concatenados). *Reichelt y col. (1976); †Gómez-Gil y col. (2003); ‡Gómez-Gil y col. (2004); nd, no hay datos.
CECT 525T
CECT 523T
CAIM 577T
CECT 526T
CECT 511T
CECT 521T
V. harveyi CECT 525T 100 62* 69† 66† 38* 52* 54*
V. campbellii CECT 523T 63* 69‡ 100 65† 39* 53* 53*
V. campbellii CAIM 128 61‡ nd nd nd nd nd
V. campbellii CAIM 333 57‡ nd nd nd nd nd
V. campbellii CAIM 415 65‡ 82‡ nd nd nd nd
V. campbellii CAIM 521 66* 89* nd 40* 53* 50*
V. rotiferianus CAIM 577T 66‡ 65‡ 100 nd nd nd
V. natriegens CECT 526T 41* 39* nd 100 54* 53*
V. parahaemolyticus CECT 511T 50* 58* nd 49* 100 63*
V. alginolyticus CECT 521T 54* 55* nd 48* 66* 100
Antes de realizar las comparaciones entre las técnicas, se ha estudiado el tipo de distribución (normal o no) que presentan los valores de las diferentes variables/técnicas examinadas en este apartado, con el fin de evaluar si las correlaciones deben calcularse mediante un test paramétrico o no paramétrico. Para este análisis se ha aplicado el estadístico de Kurtosis siguiendo la metodología expuesta en el apartado 5 del Material y Métodos. Los resultados han sido: 1,55 (hibridación DNA-DNA); -1,17 (16S rRNA); -1,49 (recA); -1,31 (gyrB); -0,30 (pyrH); 0,93 (rctB); -1,98 (rpoD); -0,91 (toxR); -0,14 (3 genes concatenados); -0,30 (7 genes concatenados); 1,59 (Rep PCR (GTG)5); 5,73 (RAPD M13); -0,58 (RAPD T7); -0,21 (ISR 16S-23S) y 5,96 (“gel combinado”). De entre todas las variables, únicamente dos, RAPD M13 y “gel combinado”, no han presentado una distribución normal de los valores. Así pues, para obtener las correlaciones obtenidas con RAPD M13 y “gel combinado” ha sido conveniente aplicar un estadístico no paramétrico como es el test de Spearman.
Resultados y Discusión
156
Correlación entre la técnica MLSA y la hibridación DNA-DNA
En este apartado, se ha calculado la correlación entre la matriz de datos de hibridación DNA-DNA y las matrices de similitud correspondientes a los siete genes individuales, los siete genes concatenados y los tres genes más resolutivos concatenados (rctB, rpoD y toxR). Todas las variables correlacionadas en esta parte del estudio han presentado una distribución normal de los valores, por lo que se ha aplicado únicamente el coeficiente de correlación de Pearson. En cada correlación se han analizado 62 parejas de valores. Los coeficientes obtenidos respecto a la hibridación DNA-DNA han sido: 0,46 (16S rRNA); 0,62 (recA); 0,65 (rpoD); 0,68 (pyrH); 0,69 (gyrB); 0,74 (toxR); 0,79 (tres genes concatenados); 0,81 (rctB) y 0,84 (siete genes concatenados). Todas las correlaciones han presentado un P-valor inferior al 0,05, indicando que son estadísticamente significativas con un nivel de confianza del 95%. De esta manera, el análisis de las secuencias concatenadas de los siete genes además de representar el de mayor poder de resolución (apartado 2 de la presente Tesis Doctoral), es el que mayor correlación ha mostrado con la técnica hibridación DNA-DNA. Sin embargo, los genes individuales que mayor poder de resolución han presentado (toxR y rpoD) muestran una correlación menor que el gen rctB con la técnica estándar para delimitar la genomoespecie.
Son pocos los estudios realizados hasta la fecha que hayan validado los estudios de MLSA con la técnica hibridación DNA-DNA. Más concretamente, en la familia Vibrionaceae no se tiene constancia de ello, siendo éste por consiguiente el primer estudio realizado. Martens y col. (2008) correlacionaron en el género Ensifer, la técnica MLSA basada en los genes atpD, dnaK, gap, glnA, gltA, gyrB, pnp, recA, rpoB, thrC y 16SrRNA con la hibridación DNA-DNA. Los valores de correlación obtenidos fueron desde 0,78 (16S rRNA) a 0,92 (con los genes recA, rpoB, gyrB, dnaK, glnA, gltA y thrC concatenados). El gen que de manera individual presentó una mayor correlación fue rpoB (0,91). Los valores de correlación de los genes recA, gyrB y 16S rRNA obtenidos por Martens y col. (2008) fueron superiores a los obtenidos en la presente Tesis Doctoral. Adékambi y col. (2008) obtuvieron un valor de 0,82 cuando correlacionaron los valores de hibridación DNA-DNA con las similitudes de las secuencias génicas del gen rpoB en el género Mycobacterium.
3. Validación de las técnicas
157
Una razón por la que pueden existir discrepancias en los valores de correlación obtenidos en los diferentes estudios, incluso analizando los mismos genes, es que éstos pueden presentar historias evolutivas diferentes en los distintos grupos taxonómicos. De esta manera, si un gen ha sufrido THG, puede que el valor de correlación obtenido se vea afectado. Además, hay que tener en cuenta los múltiples factores implicados en los experimentos de hibridación DNA-DNA, donde los valores obtenidos pueden variar según la metodología aplicada e incluso aplicando la misma metodología. Así, los valores de correlación bajos encontrados en esta Tesis Doctoral pueden deberse a que el conjunto de especies estudiado representa un grupo filogenéticamente muy compacto, que incluye cepas con valores de hibridación DNA-DNA intraespecíficos muy bajos.
Figura 8. Relación entre valores de reasociación DNA-DNA y valores de similitud génica de los genes rctB, rpoD, y toxR concatenados (n=62)
Independientemente de la bondad de la correlación, desde el punto de vista práctico, lo que interesa es la distancia que se establece entre cepas que son de especies diferentes respecto a la distancia entre cepas de la misma especie. En la Figura 8 se representan los valores de hibridación DNA-DNA con respecto a los valores de similitud de los tres genes de mayor poder de resolución concatenados, rpoD, rctB y toxR (n=62). En esa representación se pueden definir dos valores
65
70
75
80
85
90
95
100
30 40 50 60 70 80 90 100
Sim
ilitu
d de
sec
uenc
ia (
%)
Reasociación DNA-DNA (%)
Este estudioReichelt y col. (1976)Gomez-Gil y col. (2004)Gomez-Gil y col.(2003)
Resultados y Discusión
158
umbrales: por encima del 90,3% de similitud de secuencia, dos cepas pueden ser consideradas de la misma especie y por debajo del 85,2% pueden ser consideradas de especies diferentes. Estos resultados son satisfactorios, pues mediante la comparación de secuencias nucleotídicas y sin necesidad de realizar experimentos de hibridación DNA-DNA, se pueden diferenciar de una manera fiable las especies del clado central del género Vibrio, incluso a pesar de ser especies estrechamente relacionadas.
Con todos los resultados obtenidos hasta este punto, se puede considerar el MLSA como una técnica apropiada para sustituir a la hibridación DNA-DNA en la familia Vibrionaceae a la hora de definir una especie bacteriana. Sin embargo, tal y como se ha comentado anteriormente, la elección de los genes housekeeping es de gran importancia pues no todos son realmente útiles en todos los grupos taxonómicos, sobre todo si las cepas que se están analizando pertenecen a especies muy cercanas. Este estudio ha mostrado la importancia de incluir un número razonable de cepas por especie, y no únicamente las cepas tipo, pues de esta manera se puede medir la variabilidad intraespecífica y compararla con la interespecífica. Esto puede generar una infravaloración del poder de discriminación de los genes utilizados. Para proponer el MLSA como una técnica sustituta de la hibridación DNA-DNA, es muy importante validar el método mediante la correlación entre ambas. Los resultados han mostrado que de los seis genes analizados que codifican proteínas solo dos, toxR y rpoD, sirven para identificar de una manera no ambigua las especies del clado central del género Vibrio. Los otros genes, recA, pyrH, gyrB y rctB, han presentado un reducido poder de resolución, y en algunos aspectos incluso no han mostrado una ventaja con respecto al gen del 16S rRNA. La concatenación de los siete genes ha presentado la mayor correlación entre las similitudes de secuencia y los valores de hibridación DNA-DNA (0,84). Sin embargo, el poder de resolución taxonómico en términos de la distancia que se establece entre las similitudes de secuencia intra- e interespecíficas no ha sido tan bueno como el que han presentado las secuencias concatenadas de los genes rpoD, rctB y toxR (Figura 6).
3. Validación de las técnicas
159
Correlación entre las técnicas de tipificación molecular y la hibridación DNA-DNA
En este apartado se han correlacionado las técnicas Rep PCR (GTG)5, RAPD M13, RAPD T7, ISR 16S-23S y “gel combinado”, respecto a la hibridación DNA-DNA (n=62), con el fin de validarlas en el clado central del género Vibrio. Los valores obtenidos con el estadístico de Kurtosis han mostrado que excepto las técnicas RAPD M13 y “gel combinado”, todas las demás variables han podido ser correlacionadas aplicando un test paramétrico, como es el coeficiente de correlación de Pearson. No obstante, las variables que no presentan una distribución normal también han sido analizadas con el coeficiente de correlación de Pearson con el fin de poder comparar los resultados obtenidos con datos bibliográficos. Además, para poder correlacionar las variables RAPD M13 y “gel combinado”, se han calculado las correlaciones utilizando un test no paramétrico como es el coeficiente de correlación de Spearman. Aunque no se ha utilizado en la presente Tesis Doctoral, otra alternativa posible para aplicar un test paramétrico cuando alguna variable no presenta una distribución normal es modificar los datos, por ejemplo mediante una transformación logarítmica. El coeficiente de correlación de Spearman se calcula con el rango de valores en lugar de con los propios valores tal y como ocurre en el coeficiente de correlación de Pearson. De esta manera, el coeficiente de correlación de Spearman es menos sensible a valores extremos que el de Pearson.
Los valores de correlación obtenidos tras aplicar el coeficiente de correlación de Pearson entre las diferentes técnicas de tipificación molecular y la técnica hibridación DNA-DNA han sido de 0,74; 0,58; 0,45; 0,33 y 0,14 con el “gel combinado”, RAPD M13, Rep PCR (GTG)5, RAPD T7 e ISR 16S-23S, respectivamente. Todas las correlaciones obtenidas han sido estadísticamente significativas con un 95% de confianza, excepto con la ISR 16S-23S (Tabla 14). El mayor valor de correlación se ha obtenido con el “gel combinado”, pues al agrupar diferentes perfiles electroforéticos se está muestreando de una manera más extensa las relaciones genómicas entre cepas. La técnica de tipificación que de manera individual ha presentado una mayor correlación ha sido el RAPD M13, técnica que así mismo ha generado un mayor número de grupos específicos de especie en el apartado 1. Por otro lado, la técnica ISR 16S-23S es la que menor número de grupos específicos de especie ha generado y la que menor correlación
Resultados y Discusión
160
ha presentado respecto a la hibridación DNA-DNA, siendo incluso no significativa dicha correlación.
La correlación obtenida con el “gel combinado” es elevada si se tienen en cuenta los datos bibliográficos. Gómez-Gil y col. (2004) tras correlacionar las técnicas AFLP, Rep PCR (GTG)5, Rep PCR, Box PCR e ISR 16S-23S respecto a la hibridación DNA-DNA obtuvieron valores de 0,76; 0,68; 0,44; 0,40 y -0,14, respectivamente. Este estudio fue realizado con las especies V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus, comparando 50 valores, excepto con la técnica ISR 16S-23S donde compararon 39. Aunque el presente trabajo puede ser comparado con el realizado por Gómez-Gil y col. (2004), hay que tener en cuenta que el número de cepas de la especie V. rotiferianus incluidas en aquel estudio fue muy reducido en comparación con las cepas incluidas de las especies V. harveyi y V. campbellii. Además, en aquel trabajo no se incluyeron las otras tres especies del clado central V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. natriegens, especies con una elevada similitud genómica. El mayor valor de correlación se obtuvo con la técnica AFLP, valor que puede ser equiparable al resultado obtenido en el presente estudio con el “gel combinado”. La correlación obtenida con la técnica Rep PCR (GTG)5
ha sido ligeramente inferior a la obtenida por Gómez-Gil y col. (2004), aunque estadísticamente es significativa. En ambos estudios, la técnica ISR 16S-23S ha sido la que menor valor de correlación ha ofrecido respecto a la técnica de hibridación DNA-DNA, en un caso con un valor positivo y en otro con un valor negativo. Además, en ambos casos dichas correlaciones no han sido significativas a un nivel de confianza del 95%.
A continuación se ha calculado la correlación utilizando un estadístico no paramétrico, el coeficiente de correlación de Spearman. Los valores de correlación obtenidos han sido 0,53; 0,33; 0,22; 0,19 y 0,14 con las técnicas “gel combinado”, RAPD T7, Rep PCR (GTG)5, ISR 16S-23S y RAPD M13, respectivamente. De manera similar a los resultados obtenidos con el coeficiente de correlación de Pearson, es el “gel combinado” el que muestra una mayor correlación respecto a la hibridación DNA-DNA. La técnica que de manera individual ha presentado una mayor correlación ha sido el RAPD T7. Así mismo, a excepción de la correlación con el “gel combinado” y RAPD T7, todas las otras correlaciones obtenidas han sido estadísticamente no significativas. Todos los valores de correlación obtenidos con este
3. Validación de las técnicas
161
estadístico son iguales o inferiores a los obtenidos con el estadístico paramétrico, excepto para la técnica ISR 16S-23S.
Tabla 14. Coeficientes de correlación de Pearson y Spearman entre valores de similitud obtenidos con las diferentes técnicas de tipado molecular, distancias génicas y valores de hibridación DNA-DNA (n=904, excepto la hibridación DNA-DNA donde n=62). *, valores no significativos (P≥ 0,05).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Coeficiente de Pearson
1. Rep PCR (GTG)5
2. RAPD M13 0,57
3. RAPD T7 0,29 0,30
4. ISR 16S-23S 0,22 0,40 0,21
5. “Gel combinado” 0,70 0,78 0,58 0,41
6. Gen rctB 0,54 0,55 0,31 0,19 0,69
7. Gen rpoD 0,33 0,38 0,14 0,20 0,53 0,73
8. Gen toxR 0,39 0,50 0,24 0,24 0,61 0,82 0,92
9. Tres genes 0,44 0,51 0,23 0,23 0,65 0,88 0,92 0,97
10.Siete genes concatenados 0,48 0,50 0,23 0,28 0,65 0,83 0,84 0,86 0,89
11. Hibridación DNA-DNA 0,45 0,58 0,33 0,14* 0,74 0,81 0,65 0,74 0,79 0,84
Coeficiente de Spearman
1. Rep PCR (GTG)5
2. RAPD M13 0,24
3. RAPD T7 0,22 0,19
4. ISR 16S-23S 0,15 0,30 0,17
5. “Gel combinado” 0,45 0,43 0,70 0,38
6. Gen rctB 0,32 0,70 0,29 0,07 0,42
7. Gen rpoD 0,11 0,09 0,11 0,19 0,34 0,56
8. Gen toxR 0,12 0,14 0,17 0,24 0,32 0,57 0,89
9. Tres genes 0,15 0,09 0,16 0,17 0,37 0,71 0,91 0,93
10.Siete genes concatenados 0,35 0,15 0,27 0,29 0,55 0,78 0,77 0,77 0,85
11. Hibridación DNA-DNA 0,22* 0,14* 0,33 0,19* 0,53 0,52 0,50 0,60 0,58 0,71
Validación de las identidades de los aislados ambientales analizados en el apartado 1
Una vez validadas las identidades de los aislados ambientales incluidos en el estudio de MLSA mediante la hibridación DNA-DNA, se ha procedido a validar los grupos generados en los estudios de tipificación molecular. De entre las técnicas de fingerprinting aplicadas se ha escogido el “gel combinado” para validar las identidades, puesto que es la única técnica que ha separado las seis especies del clado
Resultados y Discusión
162
central en grupos independientes y la que mayor valor de correlación ha presentado con la hibridación DNA-DNA (Figura 3). El resto de técnicas de tipificación no han sido satisfactorias para la identificación de las seis especies del core group puesto que ninguna ha generado grupos específicos de todas las especies.
Para validar los grupos generados en el “gel combinado” se han comparado dichos grupos con los valores de hibridación DNA-DNA, así como con la información derivada del estudio de MLSA.
En el grupo 1H, se encuentran la cepa tipo de la especie V. harveyi junto con un total de 65 aislados, entre los que se encuentran SA F3s 40, H2, DL F5 57, SA F1s 10, SA F4s 17, LPD 1-1-10, LPD 1-3-1, LPD 1-3-27, LPD 1-3-3. Estas nueve cepas fueron identificadas fenotípicamente, por MLSA e hibridación DNA-DNA como V. harveyi. Con estos resultados, se puede considerar que la técnica “gel combinado” sí identifica a la especie V. harveyi.
El grupo 2C agrupa a las cepas tipo y de referencia de V. campbellii junto con doce cepas ambientales. Entre ellas se encuentran las cepas LPD 1-1-11, LPD 1-1-24, LPD 1-1-84 y LPD 1-1-86 que fueron identificadas fenotípicamente como V. harveyi, y por hibridación DNA-DNA como V. rotiferianus.
En el caso concreto de la especie V. rotiferianus, las cepas tipo y de referencia se sitúan en el grupo 3R, junto con el aislado ambiental LPD 1-3-2 (que no ha sido analizado en el estudio de MLSA), mientras que las cepas ambientales se incluyen en el grupo 2C (V. campbellii). Con estos resultados se puede concluir que el “gel combinado” no sirve para diferenciar entre las especies V. campbellii y V. rotiferianus, pues aunque sí distingue las cepas tipo y de referencia, no ocurre lo mismo con los aislados ambientales.
El grupo 4 está formado por cuatro cepas ambientales identificadas fenotípicamente como V. harveyi. Ninguna de ellas se ha incluido en el estudio de MLSA, por lo que su identidad queda pendiente de futuros estudios.
El grupo 7 no ha sido identificado e incluye cuatro de las cinco cepas identificadas por Gómez-Gil como V. rotiferianus (R379, R1024, R1117 y R1311), y que han resultado ser V. campbellii por MLSA e hibridación DNA-DNA.
3. Validación de las técnicas
163
Los grupos 5P, 6A y 8N, son grupos específicos de especie y agrupan únicamente a las cepas tipo y de referencia de las especies V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. natriegens, respectivamente. Además, no incluyen ningún aislado ambiental. Este resultado es el esperado, pues en el estudio únicamente se han incluido cepas ambientales identificadas como V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus fenotípicamente, por hibridación DNA-DNA y/o MLSA. Esto muestra que el “gel combinado” sí que permite diferenciar las tres especies.
Las cepas LPD 1-1-79, H15, CAIM 780 y SA F3s 54 han quedado aisladas en el “gel combinado”. De ellas, la cepa CAIM 780 ha sido identificada correctamente como V. campbellii mediante hibridación DNA-DNA y MLSA, pero el resto de cepas no han sido analizadas con estas técnicas, por lo que su identidad queda pendiente de hacer en un futuro.
Tras comparar los resultados del “gel combinado” con la hibridación DNA-DNA y el MLSA se puede concluir que la combinación de Rep PCR (GTG)5, RAPD M13 y RAPD T7, permite diferenciar las especies V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. natriegens, pero no V. campbellii y V. rotiferianus. Estos resultados confirman que algunos grupos considerados como específicos de especie en el análisis de fingerprinting han resultado no serlo al analizarlos con la hibridación y el MLSA. Además, no conviene olvidar que la amplificación, combinación y análisis de diferentes técnicas de tipificación molecular es un trabajo laborioso y que a menudo plantea problemas de reproducibilidad incluso en el mismo laboratorio. Por todo ello, esta técnica no es apropiada para la identificación de la especies del clado central del género Vibrio. Por contra, la técnica MLSA basada en los genes rpoD, rctB y toxR concatenados presenta una buena correlación con la hibridación DNA-DNA, diferencia a las seis especies y permite inferir las relaciones filogenéticas entre las mismas, y por tanto ha resultado óptima para la identificación/clasificación de estas especies.
4. Taxonomía del género Enterovibrio
4. Taxonomía del género Enterovibrio
167
En el transcurso de dos muestreos microbiológicos realizados en dorada (Sparus aurata L.) y dentón (Dentex dentex L.) criados en el litoral mediterráneo, se aislaron del riñón anterior once cepas (DAL 1-1-5T, DAL 1-1-4, 8/6b, 8/13, 9/1a, 9/1c, 9/2a, 9/2b, 9/5b, 10/6 y 11/2a) (Tabla 4 y 21) que se intentaron identificar mediante una caracterización fenotípica básica (Company y col., 1999; Pujalte y col., 2003b). Estas once cepas, a diferencia de las cepas identificadas presuntivamente como V. harveyi (apartado 1), no pudieron ser identificadas fenotípicamente. Con el fin de esclarecer la identidad de las mismas, se realizó un análisis comparativo de secuencias génicas parciales del 16S rRNA (≈1000 pb) frente a las bases de datos de las herramientas en línea BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y RDP (http://rdp.cme.msu.edu). Los resultados mostraron que ocho de los aislados estaban estrechamente relacionados con la especie E. coralii (8/13, 9/1a, 9/1c, 9/2a, 9/2b, 9/5b, 10/6 y 11/2a) al presentar un elevado valor de similitud de secuencia (aprox. 98-99%). Las otras tres cepas, DAL 1-1-5T, DAL 1-1-4 y 8/6b, también se relacionaron con esa especie, así como con E. norvegicus y V. calviensis, aunque las distancias que presentaban respecto a dichas especies (≈96-97%) sugerían que se trataba de un nuevo taxón del género Enterovibrio (Stackebrandt y Ebers, 2006). Sin embargo, la vinculación taxonómica de las once cepas con el género fue totalmente inesperada, pues en la caracterización fenotípica inicial, los aislados parecían ser no fermentativos. Esto condujo a realizar un análisis polifásico exhaustivo para dilucidar la posición taxonómica de los once aislados, incluyendo una amplia caracterización fenotípica, un análisis filogenético basado en las secuencias individuales y concatenadas de tres genes, 16S rRNA, rpoD y recA, y estudios de hibridación DNA-DNA.
Con fines comparativos, se han incluido las cepas tipo de las dos especies válidamente descritas hasta la fecha en el género Enterovibrio, E. coralii CAIM 912T y E. norvegicus CECT 7288T, así como la especie V. calviensis DSM 14347T (Tabla 4 y 21), con el fin de esclarecer su posición taxonómica. Como ya se ha mencionado, son varios los estudios que muestran que esta especie se encuentra filogenéticamente más próxima al género Enterovibrio que al propio género Vibrio (Thompson y col., 2005a; Sawabe y col., 2007).
En la caracterización fenotípica básica inicial, las once cepas ambientales resultaron ser bacilos o cocobacilos Gram negativos, móviles, oxidasa positivos, incapaces de fermentar anaeróbicamente la
Resultados y Discusión
168
glucosa en el medio decarboxilasa de Moeller suplementado con el 2% (p/v) de NaCl. Sin embargo, la incubación de las cepas en el medio O/F suplementado con glucosa y ASW a la mitad de concentración confirmó que todas las cepas ambientales eran capaces de fermentar la glucosa en anaerobiosis tras 2-3 días de incubación, si bien, la producción de ácido durante las primeras 24h resultó ser débil, cosa que dificultó la asignación inequívoca de dichas cepas a la familia Vibrionaceae.
El crecimiento en el medio TCBS también fue lento y escaso en la mayoría de los casos dando lugar a colonias verdes (no utilizan la sacarosa). Ninguna de las cepas hidrolizó extracelularmente gelatina, caseína, almidón, lecitina ni alginato. Todas las cepas crecieron entre 15 y 28 oC, pero no a 4 ni 40 oC. Además, todas las cepas requirieron NaCl para crecer, y crecieron bien en medios con salinidad total entre 0,9 y 6% (p/v), pero no con más de 7% ni con menos de 0,4% de salinidad total.
Las características fenotípicas descritas hasta este punto fueron similares en las once cepas. Sin embargo, tal y como apuntaba el análisis de las secuencias parciales del gen 16S rRNA, tres de ellas fueron claramente diferentes del resto de cepas ambientales, mientras que la restantes presentaron mayor similitud con E. coralii:
Las cepas 8/13, 9/1a, 9/1c, 9/2a, 9/2b, 9/5b, 10/6 y 11/2a, además de las características fenotípicas generales descritas anteriormente, fueron capaces de crecer entre 0,9 y 7% de salinidad total en MA (el crecimiento fue variable al 8% y negativo al 9% o más) y entre 15 y 37 oC pero no a 4 ni a 40 oC. La reacción del indol en MB fue positiva, la prueba de la ADH de Thornley fue negativa en periodos de incubación cortos (hasta 48 h) revertiendo a positivo en seis de las ocho cepas tras un periodo de incubación más prolongado. La reacción de la LDC, ODC y del Voges-Proskauer fue negativa. Las cepas redujeron nitrato a nitrito aunque no a nitrógeno molecular. Las únicas actividades hidrolíticas extracelulares que presentaron fueron frente al Tween 80 y al DNA. Las cepas no utilizaban una gran variedad de compuestos como fuentes de carbono y energía únicas en medio basal (Tabla 15). Ninguna de las ocho cepas desarrolló pigmentación. Estos datos han mostrado que las ocho cepas ambientales presentan las características fenotípicas de la especie E. coralii, aunque con algunos cambios respecto a la descripción original de la especie: la ADH y la producción de indol son variables.
4. Taxonomía del género Enterovibrio
169
Tabla 15. Crecimiento en fuentes de carbono y energía únicas.
Cepas: 1, E. nigricans 8/6b; 2, E. nigricans DAl 1-1-4; 3, E. nigricans DAl 1-1-5T; 4, E. coralii 8/13; 5, E. coralii 9/1a; 6, E. coralii 9/1c; 7, E. coralii 9/2a; 8, E. coralii 9/2b; 9, E. coralii 9/5b; 10, E. coralii 10/6; 11, E. coralii 11/2a; 12, E. coralii CAIM 912T; 13, E. norvegicus CECT 7288T; 14, E. calviensis DSM 14347T. +, positivo; -, negativo; (+), débil. Todas las cepas crecieron con extracto de levadura y fueron negativas en: L-arabinosa, D-xilosa, D-trehalosa, L-ramnosa, lactosa, melibiosa, salicina, amigdalina, D-glucuronato, D-galacturonato, butirato, L-leucina, L-treonina, L-tirosina, L-ornitina, L-lisina, L-sarcosina.
Crecimiento con: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
D-ribosa (+) - - + (+) + + + - - + + + + D-glucosa + (+) (+) + (+) + + + - - + + + + D-fructosa + - - + (+) + + + - - + + + + D-galactosa - - - + (+) + + + - - + + + + D-manosa + - (+) + (+) + + + - - + + + + maltosa - - - - - - - - - - - + + - D-celobiosa - - - - - - - - - - - - - + sacarosa - - - - - - - - - - - + - + D-gluconato (+) - (+) + (+) + + + - - + + + + NAG (+) (+) (+) + (+) + (+) (+) - - (+) + + + glicerol - - (+) (+) - (+) - - - - (+) + + + D-manitol - - - + + + + + - - + + + + D-sorbitol - - - - - - - - - - - (+) (+) (+) m-inositol - - - - - - - - - - - (+) (+) (+) D-glicerato - - - - - - - - - - - (+) + (+) D-sacarato - - - - - - (+) (+) - - - - - - acetato - - (+) + - - - + - - - + + + piruvato - - - + - + + + - - (+) + + (+) propionato - - - + - - (+) (+) - - - + + + citrato - - - + (+) - (+) (+) - - (+) + + + t-aconitato - - - - - - - - - - - - + + 2-oxoglutarato - - - - (+) (+) (+) (+) - - - + + + succinato - - - + (+) + + + - - + + + + fumarato - - - + (+) + + + - - + + + + malato - - - - - (+) (+) (+) - - (+) + + + lactato (+) - - + (+) + + + - - (+) + + + 3-hidroxibutirato - - - - - - - - - - - - + + glicina - - - (+) - + - - - - - - + + L-serina - - - - - + - - - - - + + + L-glutamato (+) (+) (+) (+) - + (+) (+) - - (+) + + + L-alanina - - - (+) - + (+) (+) - - - + + + L-arginina - - - - - - (+) - - - - (+) (+) - L-citrulina - - - - - - (+) - - - - + + + L-aspartato - - - - - - - - - - - + + (+) L-histidina - - - - - - - - - - - + + + putrescina - - - - - (+) - (+) - - - + + (+)
Resultados y Discusión
170
Por otro lado, las cepas DAL 1-1-5T, DAL 1-1-4 y 8/6b, además de las características generales que comparten con los anteriores ocho aislados, resultaron ser células de 1,0-1,5 µm de longitud y 0,4-0,7 µm de ancho. Sus colonias presentaron una morfología redonda, con bordes lisos y de superficie brillante. Las cepas crecieron en MA, en medios con una base de agua de mar y en TSA suplementado con 1% NaCl. En dichos medios, las cepas DAL 1-1-5T y DAL 1-1-4 desarrollaron una pigmentación negra/marrón oscura ligeramente difusible (Figura 9).
Figura 9. E. nigricans DAL 1-1-5T crecida en MA a 20-24 oC durante 5 días. Se muestra la pigmentación producida por la cepa.
Ninguna de las tres cepas produjo swarming ni luminiscencia. La capacidad de reducir nitratos a nitritos fue variable, no obstante ninguna de las tres cepas lo redujo a nitrógeno molecular. En el medio O/F produjeron ácido en condiciones anaerobias a partir de D-manosa, sacarosa (débil) y melibiosa (débil y únicamente la cepa 8/6b). Ninguna de las tres cepas fue capaz de fermentar los siguientes carbohidratos: D-ribosa, D-xilosa, L-arabinosa, D-fructosa, D-galactosa, trehalosa, L-ramnosa, maltosa, celobiosa, lactosa, amigdalina, salicina, D-manitol, D-sorbitol y myo-inositol. En condiciones aerobias, la cepa 8/6b (pero no DAL 1-1-4 ni DAL 1-1-5T) produjo ácido a partir de D-fructosa, D-galactosa, lactosa, melibiosa, D-manitol y D-sorbitol. Los únicos
4. Taxonomía del género Enterovibrio
171
sustratos que fueron capaces de hidrolizar extracelularmente fueron el Tween 80 y el DNA, siendo la hidrólisis de éste último débil. La respuesta en la prueba de la ADH de Thornley fue variable, mientras que tuvieron una respuesta negativa en las pruebas LDC, ODC, indol y VP. Las fuentes únicas de carbono y energía utilizadas en el medio basal (Baumann y Baumann, 1984) fueron: D-glucosa, D-manosa, N-acetil D-glucosamina, D-gluconato y L-glutamato; han sido variables para: D-ribosa, D-fructosa, fumarato, acetato, lactato y glicerol; fueron negativas para: L-arabinosa, D-xilosa, trehalosa, D-galactosa, L-ramnosa, maltosa, celobiosa, sacarosa, lactosa, melibiosa, salicina, amigdalina, D-manitol, D-sorbitol, mio-inositol, D-glicerato, D-sacarato, D-glucuronato, D-galacturonato, piruvato, propionato, butirato, citrato, trans-aconitato, 2-oxoglutarato, succinato, malato, 3-hidroxibutirato, glicina, L-leucina, L-serina, L-treonina, L-alanina, L-arginina, L-tirosina, L-ornitina, L-citrulina, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-sarcosina y putrescina (Tabla 15).
En el estudio, también se ha caracterizado fenotípicamente la cepa tipo de la especie V. calviensis DSM 14347T. La caracterización fenotípica ha resultado ser similar a la detallada por Denner y col. (2002), excepto que en este estudio la cepa DSM 14347T, a diferencia de la descripción original, utiliza como fuentes únicas de carbono y energía los sustratos D-glucosa, D- fructosa y N-acetil D-glucosamina pero no D-manosa.
El análisis de ácidos grasos celulares de las cepas DAL 1-1-5T y 8/6b ha mostrado que ambas cepas presentan un perfil muy similar entre sí, existiendo únicamente diferencias en la cantidad relativa de los ácidos grasos comunes y en la presencia/ausencia de algunos ácidos grasos minoritarios. Los ácidos grasos más abundantes han resultado ser: 16:1ω7c y/o iso-15:0 2-OH (43-50% en las cepas analizadas), 16:0 (18-19%) y 18:1ω7c (11-15%). También se han detectado, aunque en menor cantidad (1-5%) los siguientes ácidos grasos: 12:0, 12:0 3-OH, 14:0, 14:0 3-OH/iso-16:1, iso-16:0 y 16:1ω9c (Tabla 16). Además, se ha calculado el contenido de G+C mol% genómico de la cepa DAL 1-1-5T mediante HPLC, obteniéndose un valor de 47,9 mol%.
Resultados y Discusión
172
Tabla 16. Composición celular (%) de ácidos grasos de las cepas de E. nigricans sp. nov. y especies afines.
En todos los casos se detalla el medio y la temperatura (oC) utilizados para el crecimiento de las cepas, así como la fuente bibliográfica. MA, agar marino (Difco); TSA, triptona soja agar (Oxoid) suplementado con 1,5% (p/v) NaCl; BA, agar sangre.
1: E. nigricans DAL 1-1-5T, MA, 26 ºC, este estudio 2: E. nigricans 8/6b, MA, 26 ºC, este estudio 3: E. norvegicus LMG 19839T, MA, 28 ºC, Thompson y col. (2002) 4: E. norvegicus LMG 19839T, TSA, 28 ºC, Thompson y col. (2002) 5: E. norvegicus CCUG 47417T, BA, Tª ambiente, http://www.ccug.se 6: E. coralii CC17T, TSA, 28 ºC, Thompson y col. (2005b) 7: E. calviensis DSM 14347T, MA, 26 ºC, este estudio 8: E. calviensis CCUG 4831T, MA, 30 ºC, http://www.ccug.se 9: Grimontia hollisae LMG 17719T, TSA, 28 ºC, Thompson y col. (2003) 10: G. hollisae CCUG 13625T, BA, 30 ºC, http://www.ccug.se
4. Taxonomía del género Enterovibrio
173
Ácido graso / cepa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
12:0 2,5 3,1 3,4 4,2 3,6 3 3,4 1,8 5 2,0
14:0 1,7 3,9 1,3 2,7 2,4 4 0,6 1,2 3 4,0
15:0 1,1 0,4 - - 0,5 - - 0,5 - 0,2
16:0 18,4 18,9 19,3 20,9 17,2 16 15,4 17,2 14 23,7
17:0 0,5 0,3 1,4 - 0,5 - 0,8 1,3 - 0,4
18:0 0,7 0,8 2,4 1,8 0,5 2 0,7 2,9 2 3,4
14:1ω5c 0,2 - - - - - - - - -
15:1ω8c 0,5 0,2 - - 0,3 - 0,5 0,3 - -
16:1ω5c 0,5 0,5 - - 0,2 - 0,5 - - 0,2
16:1ω7c/iso-15:0 2-OH 49,3 43,5 36,2 35,8 39,8 32 45,2 32,4 31 29,9
16:1ω9c 2,9 2,4 3,1 3,5 4,8 4 4,8 3,7 4 3,1
17:1ω6c 0,3 - - - - - 0,5 - - -
17:1ω8c 1,6 0,8 2,1 - 1,3 1 2,5 1,9 - 0,7
18:1ω7c 11,8 14,7 14,8 15,0 12,1 23 18,7 18,5 23 17,6
18:1ω9c 0,8 0,6 3,1 2,7 2,4 5 1,5 3,1 5 2,9
18:2ω6,9c/anteiso-18:0 - - - - 1,5 - - - - 0,3
19:1ω6c/desconocido 18,84 - - - 0,9 - - - 0,5 - -
20:1ω7c - - - - - - - 0,4 - 0,4
iso-13:0 2-OH - - - - 2,9 - - 2,5 - 1,7
iso-14:0 3-OH 0,2 0,2 - - - - - 0,4 - -
iso-14:0 0,1 0,5 - 0,6 0,3 - - - - -
iso-16:0 1,7 2,4 2,6 2,9 1,5 1 0,3 3,1 - 0,7
iso-18:0 0,3 0,6 1,0 - - - - 1,0 - 0,3
19:0 ciclo ω9c - - - - 1,3 - - - - -
10:0 3-OH 0,1 0,1 - - - - - - - -
11:0 3-OH 0,1 - - - - - 0,2 - - -
12:0 2-OH - 0,2 - - 0,2 - - - - -
12:0 3-OH 1,4 2,0 2,9 1,9 1,9 2 1,9 2,7 4 3,3
14:0 3-OH/iso-16:1 I 2,6 3,1 2,4 2,5 2,0 3 1,7 2,5 5 3,7
11-Metil 18:1ω7c - - - - - - - - - 0,4
Desconocido 10,92 - - - - 0,3 - - - - 0,6
Desconocido 11,95 - - - - 0,3 - - - - -
Desconocido 12,48 - - - 1,1 1,2 - - 0,5 - 0,6
Desconocido 15,27 - - - - 1,1 - - 1,1 - -
Desconocido 17,32 - - - - 0,3 - - 0,6 - -
Resultados y Discusión
174
Para esclarecer las relaciones filogenéticas de los aislados ambientales y de la especie V. calviensis, se ha realizado un estudio de MLSA utilizando los genes 16S rRNA, recA y rpoD. Como se ha mostrado en los apartado 2 y 3 de la presente Tesis Doctoral, el MLSA ha resultado ser una técnica con suficiente poder de resolución como para diferenciar las especies del clado central del género Vibrio, así como para dilucidar las relaciones filogenéticas de las mismas. Puesto que las dos especies válidamente descritas hasta la fecha del género Enterovibrio se encuentran en una fase avanzada de diversificación, con un 95,5% de similitud del gen 16S rRNA entre ambas (Thompson y col., 2005b), se ha optado por utilizar un reloj molecular de lenta evolución (16S rRNA), un gen con una tasa de evolución intermedia (recA) y un gen óptimo para especies de reciente diversificaron (rpoD). De esta manera, se han analizado las relaciones filogenéticas de las especies tanto de una manera general como detallada. La amplificación, secuenciación y análisis filogenético de los genes se ha realizado siguiendo la metodología expuesta en el apartado 3.3 del Material y Métodos. Se han analizado las secuencias de 19 cepas pertenecientes a las cepas tipo, de referencia y ambientales de las especies E. nigricans sp. nov., E. coralii, E. norvegicus, V. calviensis, V. cholerae y G. hollisae. Algunas de las secuencias de los genes 16S rRNA y recA analizadas han sido obtenidas de bases de datos (Tabla 21, pág. 216). El tamaño de los amplicones obtenidos ha sido 786 nt (recA), 876 nt (rpoD), 1348 nt (16S rRNA) y 3010 nt (secuencias concatenadas de los tres genes). Para cada gen, así como para las tres secuencias génicas concatenadas, se han obtenido tres árboles basados en NJ, MP y ML. En la Figura 10, se muestran los 16 árboles obtenidos mediante los métodos de NJ, aplicando el modelo evolutivo de Kimura-2-parámetros; ML, aplicando los modelos evolutivos TVM+I+G (16S rRNA), TrNef+G (recA), GTR+I+G (rpoD) y GTR+I+G (tres genes concatenados); y MP, para cada uno de los tres genes individuales, así como con sus secuencias concatenadas. Los árboles obtenidos mediante NJ, ML y MP han presentado, en la mayoría de los casos, la misma topología (Figura 10). En todos los árboles obtenidos, ocho de los aislados ambientales (8/13, 9/1a, 9/1c, 9/2a, 9/2b, 9/5b, 10/6 y 11/2a) han generado un clado compacto e independiente junto la cepa tipo de E. coralii CAIM 912T, mientras que los aislados DAL 1-1-5T, DAL 1-1-4 y 8/6b se han agrupado en un mismo clado, vecino a las especies E. coralii, E. norvegicus y V. calviensis (Figura 10). La Tabla 17 muestra los porcentajes de similitud de secuencia intra- e
4. Taxonomía del género Enterovibrio
175
interespecíficas. Los porcentajes mínimos de similitud de secuencia intraespecíficos han sido 99,1% (16S rRNA), 97,9% (recA), 99% (rpoD) y 98,8% (secuencias concatenadas). Los valores de similitud intraespecíficos han sido superiores al porcentaje máximo interespecífico encontrado en cada gen (97,6%; 88,3%; 87,6% y 92,3%, respectivamente; Tabla 17). Las otras tres cepas ambientales (DAL 1-1-5T, DAL 1-1-4 y 8/6b) también han aparecido en todos los árboles formando un clado monofilético compacto e independiente del resto de clados que incluían las cepas tipo de las especies válidamente descritas hasta la fecha en el género Enterovibrio. En el caso del gen rpoD y las secuencias concatenadas de los tres genes, el clado compuesto por estas tres cepas ha tenido como especie más cercana E. coralii en los seis árboles obtenidos (NJ, MP y ML). Los elevados valores de bootstrap han confirmado la robustez del patrón de enramado obtenido. Sin embargo, los tres árboles obtenidos con el gen 16S rRNA y el árbol de MP de recA han mostrado alguna diferencia topológica, pues el clado formado por estas tres cepas se ha situado entre E. norvegicus y V. calviensis. Por otro lado, en los árboles de NJ y ML de recA este clado se ha unido a otro que incluía E. coralii, E. norvegicus y V. calviensis (Figura 10). Las topologías de estos dos últimos árboles han presentado un menor apoyo en el análisis de bootstrap. En cualquier caso, e incluso a pesar de que el orden relativo de evolución no ha podido ser dilucidado, no hay duda que los tres aislados (DAL 1-1-5T, DAL 1-1-4 y 8/6b) forman un grupo monofilético, compacto e independiente del resto de clados que incluyen las cepas tipo de las restantes especies válidamente descritas en el género Enterovibrio. Además, se ha confirmado que la especie V. calviensis realmente pertenece al género Enterovibrio. En todos los análisis filogenéticos V. calviensis aparece junto con la especie E. norvegicus a una mayor o menor distancia, de modo que el género Enterovibrio es monofilético, quedando las especies G. hollisae y V. cholerae como grupos externos al mismo. En términos de similitud de secuencia, G. hollisae ha tenido de media un mayor número de diferencias nucleotídicas con respecto a las especies del género Enterovibrio que los propios Enterovibrios entre ellos mismos (Tabla 17, pág. 182).
Resultados y Discusión
176
Figura 10. Árboles obtenidos mediante los métodos de NJ, ML y MP basados en las secuencias parciales de los genes 16S rRNA, recA y rpoD de manera individual, así como con sus secuencias concatenadas. Barra, el número se corresponde, en NJ y ML con el número de sustituciones nucleotídicas por sitio, y en MP con el número de cambios nucleotídicos entre nodos. En los nodos se muestran los valores de bootstrap iguales o mayores al 75% como porcentaje de 1000 pseudoréplicas.
100
100
77
99
86 100
Enterovibrio coralii 9/2b (AM42729)
Enterovibrio coralii 9/5b (AM942730)
Enterovibrio coralii 11/2a (AM942732)
Enterovibrio coralii 10/b (AM942731)
Enterovibrio coralii 9/2a (AM942728)
Enterovibrio coralii 9/1c (AM942727)
Enterovibrio coralii 9/1a (AM942726)
Enterovibrio coralii 8/13 (AM942725)
Enterovibrio coralii CAIM 912T (AJ842343)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-5T (AM942722)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-4 (AM942723)
Enterovibrio nigricans 8/6b (AM942724)
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T (AJ316208)
Enterovibrio norvegicus LMG19840 (AJ316207)
Enterovibrio norvegicus LMG 19842 (AJ37193)
Vibrio calviensis DSM 14347T (AF118021)
Grimontia hollisae CECT 5069T (AJ514909)
Vibrio cholerae CECT 514T (X76337)
0.02
16S rRNA NJ
Enterovibrio coralii 9/2b
Enterovibrio coralii 9/5b
Enterovibrio coralii 11/2a
Enterovibrio coralii 10/b
Enterovibrio coralii 9/2a
Enterovibrio coralii 9/1c
Enterovibrio coralii 9/1a
Enterovibrio coralii 8/13
Enterovibrio coralii CAIM 912T
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-5T
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-4
Enterovibrio nigricans 8/6b
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T
Enterovibrio norvegicus 19840
Enterovibrio norvegicus 19842
Vibrio calviensis DSM 14347T
Grimontia hollisae CECT 5069T
Vibrio cholerae CECT 514T
0.02
81
96
93
100
88
99
16S rRNA ML
4. Taxonomía del género Enterovibrio
177
Enterovibrio coralii 9/2b (AM942729)
Enterovibrio coralii 9/5b (AM942730)
Enterovibrio coralii 11/2a (AM942732)
Enterovibrio coralii 9/1c (AM942727)
Enterovibrio coralii 10/b (AM942731)
Enterovibrio coralii 9/2a (AM942728)
Enterovibrio coralii 9/1a (AM942726)
Enterovibrio coralii 8/13 (AM942725)
Enterovibrio coralii CAIM 912T (AJ842343)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-5T (AM942722)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-4 (AM942723)
Enterovibrio nigricans 8/6b (AM942724)
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T (AJ316208)
Enterovibrio norvegicus LMG 19840 (AJ316207)
Enterovibrio norvegicus LMG 19842 (AJ437193)
Vibrio calviensis DSM 14347T (AF118021)
Grimontia hollisae CECT 5069T (AJ514909)
Vibrio cholerae CECT 514T (X76337)
10
99
99
99
90
100
71
16S rRNA MP
78
63
100
100
82
100
100
100
Enterovibrio coralii CAIM 912T (AM942063)
Enterovibrio coralii 8/13 (AM942064)
Enterovibrio coralii 9/1a (AM942065)
Enterovibrio coralii 9/2a (AM942066)
Enterovibrio coralii 9/2b (AM942068)
Enterovibrio coralii 9/1c (AM942067)
Enterovibrio coralii 9/5b (AM942069)
Enterovibrio coralii 10/b (AM942070)
Enterovibrio coralii 11/2a (AM942071)
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T (AM942075)
Enterovibrio norvegicus R-3717 (AJ842350)
Enterovibrio norvegicus LMG 19840 (AJ842349)
Vibrio calviensis DSM 14347T (AM942077)
Enterovibrio nigricans 8/6b (AM942074)
Enterovibrio nigricans DAL1-5-4 (AM942073)
Enterovibrio nigricans DAL 1-5-5T (AM942072)
Grimontia hollisae CECT 5069T (AM942076)
Vibrio cholerae CECT 514T (AM942078)
0.02
recA NJ
Resultados y Discusión
178
94
99
99
99
100
Enterovibrio coralii CAIM 912T (AM942074)
Enterovibrio coralii 8/13 (AM942064)
Enterovibrio coralii 9/1a (AM942065)
Enterovibrio coralii 9/2a (AM942066)
Enterovibrio coralii 9/2b (AM942068)
Enterovibrio coralii 9/1c (AM942067)
Enterovibrio coralii 9/5b (AM942069)
Enterovibrio coralii 10/b (AM942070)
Enterovibrio coralii 11/2a (AM942071)
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T (AM942075)
Enterovibrio norvegicus R-3717 (AJ842350)
Enterovibrio norvegicus LMG 19840 (AJ842349)
Vibrio calviensis DSM 14347T (AM942077)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-5T (AM942072)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-4 (AM942073)
Enterovibrio nigricans 8/6b (AM942074)
Grimontia hollisae CECT 5069T (AM942076)
Vibrio cholerae CECT 514T (AM942078)
0.02
recA ML
100
100
99
100
100
70
Enterovibrio coralii 11/2a (AM942071)
Enterovibrio coralii 10/b (AM942070)
Enterovibrio coralii 9/5b (AM942069)
Enterovibrio coralii 9/1C (AM942067)
Enterovibrio coralii 9/2b (AM942068)
Enterovibrio coralii 9/2a (AM942066)
Enterovibrio coralii 9/1a (AM942065)
Enterovibrio coralii 8/13 (AM942064)
Enterovibrio coralii CAIM 912T (AM942063)
Enterovibrio nigricans DAL 1-5-5T (AM942072)
Enterovibrio nigricans DAL 1-5-4 (AM942073)
Enterovibrio nigricans 8/6b (AM942074)
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T (AM942075)
Enterovibrio norvegicus R-3717 (AJ842350)
Enterovibrio norvegicus LMG 19840 (AJ842349)
Vibrio calviensis DSM 14347T (AM942077)
Grimontia hollisae CECT 5069T (AM942076)
Vibrio cholerae CECT 514T (AM942078)
10
recA MP
4. Taxonomía del género Enterovibrio
179
76
Enterovibrio coralii 10/b (AM942058)
Enterovibrio coralii 9/5b (AM942057)
Enterovibrio coralii 9/1c (AM942054)
Enterovibrio coralii 9/2a (AM942055)
Enterovibrio coralii 9/2b (AM942056)
Enterovibrio coralii 9/1a (AM942053)
Enterovibrio coralii 8/13 (AM942052)
Enterovibrio coralii 11/2a (AM942059)
Enterovibrio coralii CAIM 912T (AM942051)
Enterovibrio nigricans 8/6b (AM942050)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-4 (AM942049)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-5T (AM942048)
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T (AM942062)
Vibrio calviensis DSM 14347T (AM942047)
Grimontia hollisae CECT 5069T (AM942061)
Vibrio cholerae CECT 514T (AM942060)
0.02
100
99
100
99
99
90
rpoD NJ
99
Enterovibrio coralii 11/2a (AM942059)
Enterovibrio coralii 10/b (AM942058)
Enterovibrio coralii 9/5b (AM942057)
Enterovibrio coralii 9/1c (AM942054)
Enterovibrio coralii 9/2a (AM942055)
Enterovibrio coralii 9/2b (AM942056)
Enterovibrio coralii 9/1a (AM942053)
Enterovibrio coralii 8/13 (AM942052)
Enterovibrio coralii CAIM 912T (AM942051)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-5T (AM942048)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-4 (AM942049)
Enterovibrio nigricans 8/6b (AM942050)
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T (AM942062)
Vibrio calviensis DSM 14347T (AM942047)
Grimontia hollisae CECT 5069T (AM942061)
Vibrio cholerae CECT 514T (AM942060)
0.02
100
96
97
85
82
82
rpoD ML
Resultados y Discusión
180
73
92
95
100
100
99
Enterovibrio coralii 11/2a (AM942059)
Enterovibrio coralii 10/b (AM942058)
Enterovibrio coralii 9/5b (AM942057)
Enterovibrio coralii 9/1c (AM942054)
Enterovibrio coralii 9/2a (AM942055)
Enterovibrio coralii 9/2b (AM942056)
Enterovibrio coralii 9/1a (AM942053)
Enterovibrio coralii 8/13 (AM942052)
Enterovibrio coralii CAIM 912T (AM942051)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-5T (AM942048)
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-4 (AM942049)
Enterovibrio nigricans 8/6b (AM942050)
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T (AM942062)
Vibrio calviensis DSM 14347T (AM942047)
Grimontia hollisae CECT 5069T (AM942061)
Vibrio cholerae CECT 514T (AM942060)
10
rpoD MP
10097
99
100
100
10093
Enterovibrio coralii 11/2a
Enterovibrio coralii 9/5b
Enterovibrio coralii 9/2b
Enterovibrio coralii 10/b
Enterovibrio coralii 9/2a
Enterovibrio coralii 9/1c
Enterovibrio coralii 9/1a
Enterovibrio coralii 8/13
Enterovibrio coralii CAIM 912T
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-5T
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-4
Enterovibrio nigricans 8/6b
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T
Vibrio calviensis DSM 14347T
Grimontia hollisae CECT 5069T
Vibrio cholerae CECT 514T
0.02
100
3 genes concatenados NJ
4. Taxonomía del género Enterovibrio
181
97
100
100
100
100
72
Enterovibrio coralii 9/2b
Enterovibrio coralii 9/5b
Enterovibrio coralii 11/2a
Enterovibrio coralii 9/1c
Enterovibrio coralii 10/b
Enterovibrio coralii 9/2a
Enterovibrio coralii 9/1a
Enterovibrio coralii 8/13
Enterovibrio coralii CAIM 912T
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-5T
Enterovibrio nigricans DAL 1-1-4
Enterovibrio nigricans 8/6b
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T
Vibrio calviensis DSM 14347T
Grimontia hollisae CECT 5069T
Vibrio cholerae CECT 514T
0.02
3 genes concatenados ML
80
100
100
100
100
Enterovibrio coralii 9/2b
Enterovibrio coralii 9/5b
Enterovibrio coralii 11/2a
Enterovibrio coralii 9/1c
Enterovibrio coralii 10/b
Enterovibrio coralii 9/2a
Enterovibrio coralii 9/1a
Enterovibrio coralii 8/13
Enterovibrio coralii CAIM 912T
Enterovibrio nigricans DAL 1.1.5T
Enterovibrio nigricans DAL 1.1.4
Enterovibrio nigricans 8/6b
Enterovibrio norvegicus CECT 7288T
Vibrio calviensis DSM 14347T
Grimontia hollisae CECT 5069T
Vibrio cholerae CECT 514T
10
95
97
3 genes concatenados MP
Resultados y Discusión
182
Tabla 17. Similitud de secuencia (%) inter- e intraespecífica en los géneros Enterovibrio y Grimontia, para los genes 16S rRNA, recA, y rpoD, así como para las secuencias concatenadas de los tres genes. Se muestra la variabilidad intraespecífica en negrita obtenida con E. nigricans (3 cepas), E. coralii (9 cepas) y E. norvegicus (3 cepas, únicamente para 16S rRNA y recA).
1 2 3 4 5 16S rRNA
1. E. nigricans 99,9-100 2. E. coralii 96,7-97,6 99,1-100 3. E. norvegicus 96,8-97,2 95,2-96,3 100 4. E. calviensis 97,5-97,6 96,5-97,2 97,3-97,4 - 5. G. hollisae 96,0 95,1-96,1 95,1-95,8 95,1 -
recA 1. E. nigricans 98,8-100 2. E. coralii 86,0-87,0 97,9-100 3. E. norvegicus 83,6-84,2 87,2-88,0 99,6-99,9 4. E. calviensis 84,7-84,9 87,4 88,0-88,3 - 5. G. hollisae 80,9-82,3 82,1-82,2 80,6-80,7 81,0 -
rpoD 1. E. nigricans 98,9-100 2. E. coralii 87,0-87,6 99,0-100 3. E. norvegicus 76,6 75,1-76,3 - 4. E. calviensis 80,0-80,6 78,5-80,4 78,9 - 5. G. hollisae 74,7-74,9 76,7-78,1 73,8 76,1 -
Genes concatenados 1. E. nigricans 99,3-100 2. E. coralii 91,8-92,3 98,8-100 3. E. norvegicus 88,8-89,0 88,6-89,2 - 4. E. calviensis 90,1-90,3 90,0-90,6 90,8 - 5. G. hollisae 87,3-87,7 87,6-88,1 86,7 87,2 -
Para confirmar la identidad de los aislados ambientales, también se han realizado varios estudios de hibridación DNA-DNA. Los ensayos se han llevado a cabo siguiendo la metodología expuesta en el apartado 4 del Material y Métodos, marcando los DNAs de las cepas DAL 1-1-5T y 8/13 e hibridándolos con el resto de cepas ambientales aisladas así como con V. coralii CAIM 912T (Tabla 18). Se han seleccionado las cepas DAL 1-1-5T y 8/13 como representantes de los dos grupos obtenidos en el estudio de las secuencias génicas:
4. Taxonomía del género Enterovibrio
183
a) La cepa 8/13 ha presentado valores por encima del 70% con respecto a las cepas ambientales 9/1a, 9/1c, 9/2a, 9/2b, 9/5b, 10/6 y 11/2a. A su vez, la cepa 8/13 ha mostrado un valor de hibridación DNA-DNA del 97,6% con E. coralii CAIM 912T (Tabla 18).
b) La cepa DAL 1-1-5T ha dado valores de hibridación por encima del 70% respecto a las cepas DAL 1-1-4 y 8/6b, mientras que ha presentado valores entre el 36 y el 63% respecto al resto de cepas ambientales aisladas de peces y la cepa tipo de E. coralii CAIM 912T.
Tabla 18. Valores de hibridación DNA-DNA (%) entre E. nigricans y E. coralii. Cada valor se corresponde con la media de tres experimentos independientes.
DNA marcado
DNA no marcado DAl 1-1-5T 8/13
E. nigricans sp. nov. DAl 1-1-5T 100 53,2 DAl 1-1-4 94,5 59,1 8/6b 73,2 57,6
E. coralii CAIM 912T 52,2 97,6 8/13 47,3 100 9/1a 50,3 84,0 9/1c 62,3 74,0 9/2a 59,3 78,0 9/2b 36,0 79,2 9/5b 43,6 82,4 10/6 53,0 100,8 11/2a 63,5 78,0
Resultados y Discusión
184
Tras el análisis polifásico realizado, se puede concluir que las cepas 8/13, 9/1a, 9/1c, 9/2a, 9/2b, 9/5b, 10/6 y 11/2a pertenecen a la especie E. coralii puesto que (i) fenotípicamente son muy similares a la cepa tipo CAIM 912T; (ii) en todos los análisis filogenéticos aparecen las ocho cepas ambientales y la cepa tipo de dicha especie formando un clado monofilético; (iii) la cepa 8/13 presenta valores de reasociación DNA-DNA por encima del 70% con las cepas 9/1a, 9/1c, 9/2a, 9/2b, 9/5b, 10/6, 11/2a y CAIM 912T, indicando que pertenecen a la misma especie, E. coralii. Como parte del trabajo, los ocho aislados han sido depositados en la Colección Española de Cultivos Tipo como 8/13 =CECT 7488, 9/1a =CECT 7489, 9/1c =CECT 7490, 9/2a =CECT 7491, 9/2b =CECT 7492, 9/5b =CECT 7493, 10/6 =CECT 7494 y 11/2a =CECT 7495. Hay que señalar, que este es el primer estudio donde se ha aislado E. coralii de pez, pues la cepa tipo, única cepa conocida de la especie hasta la fecha, fue aislada de muestreos realizados en corales enfermos en proceso de blanqueado.
Por su parte, los tres aislados DAL 1-1-5T, DAL 1-1-4 y 8/6b (i) poseen caracteres fenotípicos diferenciales respecto a las otras especies del género Enterovibrio; (ii) en los estudios filogenéticos basados en las secuencias génicas del 16S rRNA, recA, rpoD, así como en las secuencias concatenadas (MLSA), aparecen siempre agrupadas en un clado monofilético distante respecto al resto de clados que incluyen las cepas tipo de las especies válidamente descritas en el género; y (iii) en los estudios de hibridación DNA-DNA las tres cepas presentan un valor por encima del 70% entre sí, pero inferior con respecto al resto de cepas ambientales y la cepa tipo de E. coralii CAIM 912T. Por todo ello se proponen las tres cepas como pertenecientes a una nueva especie dentro del género Enterovibrio.
Descripción de Enterovibrio nigricans sp. nov.
Enterovibrio nigricans sp. nov. (ni´gri.cans. L. part. adj, nigricans negruzco).
Las células se caracterizan por ser bacilos o cocobacilos móviles Gram negativos. Miden 1,0-1,5 µm de longitud y 0,4-0,7 µm de ancho. Son quimioorganotrofos y anaerobios facultativos, capaces de fermentar glucosa sin producción de gas en condiciones anaerobias. Son oxidasa positiva. Algunas cepas reducen nitrato a nitrito, pero no a
4. Taxonomía del género Enterovibrio
185
N2. Son capaces de crecer en medios que contienen una base de agua de mar así como en MA, donde algunas cepas producen un pigmento negro/marrón oscuro ligeramente difusible. Las colonias son redondas, con bordes lisos y de superficie brillante. También crecen en TSA suplementado con el 1% de NaCl (p/v). No producen swarming ni luminiscencia. El crecimiento en agar TCBS es escaso y lento, produciendo colonias verdes (no fermentan la sacarosa). Crecen entre 15-28 ºC pero no a 4 ni a 37 ºC. Requieren NaCl para crecer. Crecen bien en medios que contienen 0,9-6,0% de salinidad total, sin embargo no crecen en medios con 0,4 ni 7% o con mayor salinidad. En el medio O/F, producen ácido bajo condiciones anaerobias a partir de D-manosa, sacarosa (débil) y melibiosa (débilmente y únicamente la cepa 8/6b). Los siguientes carbohidratos no son fermentados: D-ribosa, D-xilosa, L-arabinosa, D-fructosa, D-galactosa, trehalosa, L-ramnosa, maltosa, celobiosa, lactosa, amigdalina, salicina, D-manitol, D-sorbitol y myo-inositol. La cepa 8/6b, pero no DAL 1-1-4 ni DAL 1-1-5T, producen en condiciones aerobias ácido a partir de D-fructosa, D-galactosa, lactosa, melibiosa, D-manitol y D-sorbitol. Ninguna de las cepas es capaz de hidrolizar caseína, gelatina, almidón, alginato ni lecitina, aunque si Tween 80 y DNA (este último débilmente). El test de la ADH de Thornley es variable. Las pruebas lisina descarboxilasa, ornitina descarboxilasa, indol y Voges-Proskauer son negativas. Las fuentes únicas de carbono y energía que utilizan en el medio basal (Baumann y Baumann, 1984) son: D-glucosa, D-manosa, N-acetil D-glucosamina, D-gluconato y L-glutamato; son variables para: D-ribosa, D-fructosa, fumarato, acetato, lactato y glicerol; son negativas para: L-arabinosa, D-xilosa, trehalosa, D-galactosa, L-ramnosa, maltosa, celobiosa, sacarosa, lactosa, melibiosa, salicina, amigdalina, D-manitol, D-sorbitol, mio-inositol, D-glicerato, D-sacarato, D-glucuronato, D-galacturonato, piruvato, propionato, butirato, citrato, trans-aconitato, 2-oxoglutarato, succinato, malato, 3-hidroxibutirato, glicina, L-leucina, L-serina, L-treonina, L-alanina, L-arginina, L-tirosina, L-ornitina, L-citrulina, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-sarcosina y putrescina. Los ácidos grasos más abundantes son: 16:1ω7c y/o iso-15:0 2-OH (43-50%), 16:0 (18-19%) y 18:1ω7c (11-15%). También se detectan, aunque en menor cantidad (1-5%) los siguientes ácidos grasos: 12:0, 12:0 3-OH, 14:0, 14:0 3-OH/iso-16:1, iso-16:0 y 16:1ω9c.
La cepa tipo de la especie es DAL 1-1-5T (=CECT 7320T =CAIM 661T), aislada de riñón anterior de dorada (Sparus aurata L.) criada en
Resultados y Discusión
186
la costa mediterránea española. La cepa tipo produce un pigmento negro, es negativa para la ADH y positiva para la reducción de nitrato a nitrito. Su contenido en G+C es 47,9 mol%.
Los resultados obtenidos con MLSA han confirmado que V. calviensis es realmente un miembro del género Enterovibrio. En todos los casos, V. calviensis se relaciona con la cepa tipo del genero E. norvegicus, presentando siempre una posición más cercana a ella que a E. coralii o E. nigricans sp. nov. No obstante, los resultados de la caracterización fenotípica de la cepa tipo, y única conocida, obtenidos en este estudio muestran algunas discrepancias con la descripción original de V. calviensis que apoyan la transferencia de V. calviensis al género Enterovibrio y la enmienda de la descripción de la especie (Tabla 19).
Descripción de Enterovibrio calviensis comb. nov.
Enterovibrio calviensis (cal.vi.en´sis N.L. masc. adj. calviensis relacionado con la Bahía de Calvi, Corsica, de donde se aisló la cepa tipo). Basónimo: Vibrio calviensis Denner y col. 2002. La descripción de la especie es la misma que la detallada por Denner y col. (2002) para V. calviensis, con las siguientes modificaciones: utiliza D-glucosa, D-fructosa y N- acetil D-glucosamina, pero no D-manosa como fuente única de carbono y energía. La cepa tipo designada en la publicación original es RE35F/12T =DSM 14347T =CIP 107077T. Sin embargo, en el resumen, es citada dos veces como RE35/F12 (Denner y col., 2002). Según StrainInfo (http://www. straininfo.net) otras equivalencias de la cepa tipo son ATCC BAA-606T y CCUG 48319 BT. Como parte de este estudio, la cepa tipo ha sido también depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 7414T.
4. Taxonomía del género Enterovibrio
187
Finalmente, como consecuencia del estudio realizado se ha hecho necesario enmendar la descripción del género Enterovibrio realizada por Thompson y col. en 2002.
Enmienda de la descripción del género Enterovibrio Thompson y col. 2002
La actual descripción del género es la misma que la original (Thompson y col., 2002) con las siguientes modificaciones: la actividad de la ADH, producción de indol, reducción de nitrato y susceptibilidad al agente vibriostático O/129 son caracteres variables entre las especies. Los principales ácidos grasos son 16:1ω7c/iso-15:0 2-OH (32-50%), 16:0 (15-21%) y 18:1ω7c (11-23%). Otros ácidos grasos detectados (hasta el 5%) en todas las especies, incluso bajo diferentes condiciones de crecimiento, son 16:1ω9c, 18:1ω9c, 12:0, 14:0, 14:0 3-OH/iso-16:1, 12:0 3-OH, 18:0 e iso-16:0. El contenido de G+C mol% en su genoma es de 47-50 mol%.
Tabla 19. Caracteres fenotípicos diferenciales entre E. nigricans sp. nov. y otras especies del género Enterovibrio, determinados en este estudio.
E. nigricans sp. nov. (n=3; 8/6b, DAL 1-1-4 y DAL 1-1-5T); E. coralii (n=9; 8/13, 9/1a, 9/1c, 9/2a, 9/2b, 9/5b, 10/6, 11/2a y CAIM 912T); E. norvegicus (n=1; CECT 7288T) y E. calviensis comb. nov. (n=1; DSM 14347T). +, positivo; -, negativo; v, variable entre cepas
Características E. nigricans E. coralii E. norvegicus E. calviensis Pigmentación v - - - Producción de indol - + + - Crecimiento a/en:
4 ºC - - + + 37 ºC - + + - 7% de salinidad - + + + L-alanina - + + + D-manitol - + + +
Conclusiones
Conclusiones
191
1. Ninguna de las técnicas moleculares de tipificación empleadas de manera individual ha ofrecido un resultado satisfactorio en la identificación de las especies del clado central del género Vibrio. Es necesaria la combinación de tres de ellas, Rep PCR (GTG)5, RAPD M13 y RAPD T7, en lo que se conoce como “gel combinado”, para obtener una buena aproximación a la identidad de los aislados. El “gel combinado” permite diferenciar entre todas las especies excepto entre V. campbellii y V. rotiferianus.
2. La técnica “gel combinado”, respaldada por los análisis de MLSA y de hibridación DNA-DNA, ha mostrado que no todos los aislados identificados fenotípicamente como V. harveyi lo son realmente.
3. Los análisis de MLSA e hibridación DNA-DNA han mostrado que los aislados identificados como V. rotiferianus mediante la técnica Rep PCR (GTG)5 no se corresponden con dicha especie. Además, esta técnica no permite obtener resultados reproducibles entre laboratorios.
4. Los genes utilizados en el estudio de MLSA difieren ampliamente en su capacidad de resolución de las diferentes especies del clado central del género Vibrio. Los resultados han sido satisfactorios con los genes rpoD, rctB y toxR, pero no con los genes 16S rRNA, recA, pyrH y gyrB, independientemente del método filogenético aplicado.
5. La resolución de algunas cepas en los análisis de secuencias génicas individuales se ha visto afectada por fenómenos de transferencia horizontal. Este hecho refuerza la necesidad de concatenar varios genes para corregir los efectos de dicho proceso. Asimismo, el caso de V. alginolyticus con el gen rctB demuestra que se debe utilizar siempre más de un representante de cada especie y no únicamente la cepa tipo, como sucede en muchos estudios.
6. La resolución óptima en los estudios de MLSA para la identificación de las especies del clado central del género Vibrio, así como para su reconstrucción filogenética, se ha obtenido con la concatenación de los siete genes analizados. A efectos puramente identificativos, la concatenación de los tres genes más resolutivos (rpoD, rctB y toxR) permite una perfecta definición de las especies,
Conclusiones
192
minimizando el esfuerzo respecto a la concatenación de los siete genes.
7. La comparación de los valores de correlación de los datos de hibridación DNA-DNA con el “gel combinado” y con MLSA, es claramente favorable al segundo, tanto si se emplean tres como siete genes concatenados. Esto, unido al resto de ventajas que el MLSA presenta, permite concluir que constituye una aproximacion idónea para la identificación y clasificación de este grupo de especies, pudiéndose proponer como una alternativa fiable a la hibridación DNA-DNA.
8. Las dos especies más problemáticas con cualquiera de las técnicas empleadas (tipado molecular, MLSA e hibridación DNA-DNA), han sido V. campbellii y V. rotiferianus, ya que han mostrado siempre una mayor divergencia intraespecífica, y en los análisis filogenéticos han formado a menudo grupos parafiléticos. V. harveyi, en cambio, ha presentado un menor nivel de divergencia intraespecífica y ha aparecido siempre como un clado monofilético de reciente aparición respecto al resto de especies del grupo.
9. El estudio polifásico (análisis fenotípico, hibridación DNA-DNA y MLSA) de las cepas DAL 1-1-5T, DAL 1-1-4 y 8/6b ha permitido concluir que constituyen una nueva especie del género Enterovibrio, para la que se propone el nombre de E. nigricans sp. nov., y la cepa DAL 1-1-5T (=CECT 7320T =CAIM 661T) como cepa tipo.
10. La caracterización fenotípica y el estudio de MLSA de la cepa Vibrio calviensis DSM 14347T han permitido concluir que su clasificación como especie de Vibrio es incorrecta y debe ser reclasificada como una especie del género Enterovibrio, E. calviensis comb. nov.
11. La inclusión en el género Enterovibrio (Thompson y col., 2002) de E. nigricans sp. nov. y de E. calviensis comb. nov., ha hecho necesario enmendar la descripción del género en lo que respecta a los caracteres arginina dihidrolasa, producción de indol, reducción de nitrato y susceptibilidad al agente vibriostático O/129.
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Tablas suplementarias
Tablas suplementarias
215
Tabla 20. Cepas incluidas en este estudio de MLSA, así como los números de acceso de las secuencias nucleotídicas. En cursiva aparecen aquellas secuencias que fueron obtenidas de bases de datos públicas.
Cepa Especie 16S rRNA recA pyrH rpoD gyrB rctB toxR
CECT 525T V. harveyi AY750575 FM204794 FM202541 FM202498 FM202583 FM202625 FM202678 SA F3s 40 V. harveyi FM204836 FM204795 FM202542 FM202499 FM202584 FM202626 FM202679 H2 V. harveyi FM204837 FM204796 FM202543 FM202500 FM202585 FM202627 FM202680 DL F5 57 V. harveyi FM204838 FM204797 FM202544 FM202501 FM202586 FM202628 FM202681 SA F1s 10 V. harveyi FM204839 FM204798 FM202545 FM202502 FM202587 FM202629 FM202682 SA F4s 17 V. harveyi FM204840 FM204799 FM202546 FM202503 FM202588 FM202630 FM202683 LPD 1-1-10 V. harveyi FM204841 FM204800 FM202547 FM202504 FM202589 FM202631 FM202684 LPD 1-3-1 V. harveyi FM204842 FM204801 FM202548 FM202505 FM202590 FM202632 FM202685 LPD 1-3-27 V. harveyi FM204843 FM204802 FM202549 FM202506 FM202591 FM202633 FM202686 LPD 1-3-35 V. harveyi FM204844 FM204803 FM202550 FM202507 FM202592 FM202634 FM202687 LPD 1-1-11 V. rotiferianus FM204861 FM204822 FM202569 FM202526 FM202611 FM202653 FM202706 LPD 1-1-24 V. rotiferianus FM204862 FM204823 FM202570 FM202527 FM202612 FM202654 FM202707 LPD 1-1-84 V. rotiferianus FM204863 FM204824 FM202571 FM202528 FM202613 FM202655 FM202708 LPD 1-1-86 V. rotiferianus FM204864 FM204825 FM202572 FM202529 FM202614 FM202656 FM202709 CECT 523T V. campbellii X74692 FM204804 FM202551 FM202508 FM202593 FM202635 FM202688 CAIM 9 V. campbellii FM204845 FM204805 FM202552 FM202509 FM202594 FM202636 FM202689 CAIM 128 V. campbellii FM204846 FM204806 FM202553 FM202510 FM202595 FM202637 FM202690 CAIM 333 V. campbellii FM204847 FM204807 FM202554 FM202511 FM202596 FM202638 FM202691 CAIM 392 V. campbellii FM204848 FM204808 FM202555 FM202512 FM202597 FM202639 FM202692 CAIM 415 V. campbellii FM204849 FM204809 FM202556 FM202513 FM202598 FM202640 FM202693 CAIM 419 V. campbellii FM204850 FM204810 FM202557 FM202514 FM202599 FM202641 FM202694 CAIM 521 V. campbellii FM204851 FM204811 FM202558 FM202515 FM202600 FM202642 FM202695 CAIM 780 V. campbellii FM204852 FM204812 FM202559 FM202516 FM202601 FM202643 FM202696 R379 V. campbellii FM204854 FM204814 FM202561 FM202518 FM202603 FM202645 FM202698 R1024 V. campbellii FM204853 FM204813 FM202560 FM202517 FM202602 FM202644 FM202697 R1117 V. campbellii FM204855 FM204815 FM202562 FM202519 FM202604 FM202646 FM202699 R1311 V. campbellii FM204856 FM204816 FM202563 FM202520 FM202605 FM202647 FM202700 CAIM 573 V. rotiferianus FM204857 FM204817 FM202564 FM202521 FM202606 FM202648 FM202701 CAIM 574 V. rotiferianus FM204858 FM204818 FM202565 FM202522 FM202607 FM202649 FM202702 CAIM 575 V. rotiferianus FM204859 FM204819 FM202566 FM202523 FM202608 FM202650 FM202703 CAIM 576 V. rotiferianus FM204860 FM204820 FM202567 FM202524 FM202609 FM202651 FM202704 CAIM 577T V. rotiferianus AJ316187 FM204821 FM202568 FM202525 FM202610 FM202652 FM202705 CECT 526T V. natriegens X74714 FM204826 FM202573 FM202530 FM202615 FM202657 FM202710 CECT 7465 V. natriegens FM999824 FM999812 FM999814 FM999816 FM999818 FM999820 FM999822 CECT 7466 V. natriegens FM999825 FM999813 FM999815 FM999817 FM999819 FM999821 FM999823 CECT 511T V. parahaemolyticus X74720 FM204827 FM202574 FM202531 FM202616 FM202658 FM202711 CECT 5305 V. parahaemolyticus FM204865 FM204828 FM202575 FM202532 FM202617 FM202659 FM202712 CECT 5271 V. parahaemolyticus FM204866 FM204829 FM202576 FM202533 FM202618 FM202660 FM202713 CECT 611 V. parahaemolyticus FM204867 FM204830 FM202577 FM202534 FM202619 FM202661 FM202714 CECT 521T V. alginolyticus X74690 FM204831 FM202578 FM202535 FM202620 FM202662 FM202715 CECT 436 V. alginolyticus FM204868 FM204832 FM202579 FM202536 FM202621 FM202663 FM202716 CECT 586 V. alginolyticus FM204869 FM204833 FM202580 FM202537 FM202622 FM202664 FM202717 CECT 609 V. alginolyticus FM204870 FM204834 FM202581 FM202538 FM202623 FM202665 FM202718 CECT 514T V. cholerae X76337 FM204835 FM202582 FM202539 FM202624 FM202666 FM202719
Tablas suplementarias
216
Tabla 21. Cepas incluidas en la descripción de la nueva especie E. nigricans sp. nov., enmienda del género Enterovibrio y reclasificación de V. calviensis. Las secuencias cuyos números de acceso aparecen en cursiva fueron obtenidas de bases de datos públicas. ND, Secuencia no disponible.
Cepa 16S rRNA recA rpoD
E. norvegicus
CECT 7288T AJ316208 AM942075 AM942062
LMG 19840 AJ316207 AJ842349 ND
LMG 19842 AJ437193 AJ842350 ND
E. coralii
CAIM 912T AJ842343 AM942063 AM942051
8/13 AM942725 AM942064 AM942052
9/1a AM942726 AM942065 AM942053
9/1c AM942727 AM942067 AM942054
9/2a AM942728 AM942066 AM942055
9/2b AM942729 AM942068 AM942056
9/5b AM942730 AM942069 AM942057
10/6 AM942731 AM942070 AM942058
11/2a AM942732 AM942071 AM942059
E. nigricans
DAl 1-1-5T AM942722 AM942072 AM942048
DAl 1-1-4 AM942723 AM942073 AM942049
8/6b AM942724 AM942074 AM942050
V. calviensis DSM 14347T AF118021 AM942077 AM942047
G. hollisae CECT 5069T AJ514909 AM942076 AM942061
V. cholerae CECT 514T X76337 AM942078 AM942060
Anexos
Anexos
219
Caracterización e identificación fenotípica
A. Medios de cultivo
Caldo marino (MB) o Marine broth deshidratado (Difco 2216) 37,4 g o Agua destilada 1.000 ml Esterilizar a 121 oC, 20 min
Agar marino (MA) o MB 1.000 ml o Agar bacteriológico 15 g Esterilizar a 121 oC, 20 min
Agua de mar artificial (ASW) o NaCl 23,38 g o MgSO4·7H2O 24,65 g o KCl 1,50 g o CaCl2·2H2O 2,20 g o Agua destilada 1.000 ml Esterilizar a 121 oC, 20 min
Medio Basal (Baumann y Baumann, 1981) o NH4Cl 1 g o K2HPO4 75 mg o FeSO4·7H2O 28 mg o Tris-HCl pH 7,5 (400 mM) 250 ml o ASW 500 ml o Agua destilada 1.000 ml
Esterilizar a 121 oC, 20 min
Caldo para la reducción de nitratos o Triptona 10 g o KNO3 2 g o NaCl 10 g o Agua destilada 1.000 ml
Ajustar el pH a 7,2 y esterilizar a 120 oC, 20 min
O/F medio basal (Difco) (Modificado) o Triptona 2 g o Glucosa 1 g o NaCl 5 g
Anexos
220
o K2HPO4 0,3 g o Azul de bromotimol 0,08 g o Agar 2 g o ASW 500 ml o Agua destilada 500 ml
Ajustar el pH a 6,8 y esterilizar a 115 oC, 15 min
Medio de Thornley para la descarboxilación de L-arginina o Peptona 1 g o L-arginina 10 g o Rojo de fenol 10 mg o Agar 3 g o Medio Basal sin Tris-HCl 1.000 ml
Ajustar el pH a 7,0 y esterilizar a 115oC, 15 min
Medio de Moeller para la descarboxilación de aminoácidos o Decarboxylase medium base (Difco) 9 g o Aminoácido (Arg, Lys u Orn) 5 g o NaCl 10 g o Agua destilada 1.000 ml
Esterilizar a 121 oC, 20 min
Medio semisólido para Voges-Proskauer (Furniss y col., 1978) o Extracto de levadura 1 g o Triptona 7g o Soyotona 5 g o D-Glucosa 10 g o NaCl 10 g o Agar 3 g o Agua destilada 1.000 ml
Esterilizar a 115 oC, 15 min
Medio Tiosulfato/Citrato/Sales-Biliares/Sacarosa (TCBS) o Medio TCBS deshidratado (Oxoid) 88 g o Agua destilada 1.000 ml
Hervir hasta disolver el medio. No autoclavar
Medio Gelatina-MB o Gelatina (Oxoid) 12 g o MB 100 ml
Ajustar el pH a 7,2 y esterilizar 121 oC, 20 min
Anexos
221
Agar caseína o MA 1.000 ml o Leche descremada 100 ml
Esterilizar por separado el MA y la leche descremada (120 oC, 20 min). Dejar enfriar hasta los 50 oC aprox. y mezclar antes de verter en placas
Agar Tween 80 o Peptona 10 g o NaCl 20 g o CaCl2 0,1 g o Agar bacteriológico 15 g o Tween 80 10 ml o Agua destilada 1.000 ml Esterilizar a 121 oC, 20 min
Agar lecitina o MA 1.000 ml o Emulsión de yema de huevo 50 ml Preparar la emulsión de yema de huevo batiéndola con agua destilada 1:1 (v/v)
Agar almidón o MA 1.000 ml o Almidón 2 g
Ajustar a pH 7,2 y esterilizar a 121 oC, 20 min
Agar alginato o MA 1.000 ml o Alginato sódico 20 g
Ajustar a pH 7,2 y esterilizar a 121oC, 20 min
Agar DNAsa o Medio agar DNAsa (Oxoid) 39 g o Agua destilada 1.000 ml Esterilizar a 121 oC, 20 min
B. Reactivos y colorantes para pruebas fenotípicas
Colorante de Ruy Preparar mezclando las soluciones I y II en una proporción 10:1
Anexos
222
Solución I (mordiente) o Fenol (5% en H2O) 10 ml o Ácido tánico 2 g o AlK(SO4)2 (sol. saturada) 20 ml
Solución II (Colorante) o Cristal violeta 12 g o Etanol 100 ml
Reactivo para la prueba de la oxidasa o Clorhidrato de tetrametil-p-fenilen-diamina 1 g o Agua destilada 100 ml
Preparar en el momento de utilizar, no almacenar
Reactivos para la lectura de la reducción de los nitratos
Solución A o Sulfanilamida 5 g o Ácido clorhídrico 1,5 N 50 ml o Agua destilada 300 ml
Disolver la sulfanilamida en la disolución resultado de la mezcla del ácido clorhídrico y el agua destilada. Completar con agua destilada hasta 500 ml
Solución B o N-1-Naftil-etilendiamina, dihidrocloruro 0,1 g o Agua destilada 100 ml
Guardar en frasco topacio. La solución no es estable más de un mes
Reactivos para la lectura de la prueba VP
Solución A o α-Naftol 5 g o Alcohol etílico 100 ml
Solución B o KOH 40 g o Creatina 0,3 g o Agua destilada 100 ml
Anexos
223
Reactivos para la extracción de DNA genómico
Tampón salino-EDTA (pH 8,0) o NaCl 4,4 g o EDTA 1,9 g o Agua destilada 500 ml
Sodio Dodecil Sulfato (SDS) al 25% (p/v) o SDS 62,5 g o Agua Mili-Q 250 ml
NaCl (5 M) o NaCl 73,05 g o Agua destilada 250 ml
Acetato de Sodio (pH 7,0) o CH3COONa 123,04 g o EDTA 1,9 g o Agua destilada 500 ml
SSC 10x (pH 7,0) o NaCl 21,9 g o Tri-Sodio Citrato 11,02 g o Agua destilada 250 ml
RNAsa A (0,5 mg/ml) o RNAsa A 500 µg o SSC 2x 1 ml
Proteinasa K (1 mg/ml) o Proteinasa K 1 mg o Agua Mili-Q 1 ml
Electroforesis
TBE 10x o Tris base 108 g o Ácido bórico 55 g o EDTA 7,44 g o Agua Mili-Q 1.000 ml
Ajustar a pH 8,3
Anexos
224
Reactivos para la hibridación DNA-DNA
Acetato de sodio 3M (pH 5,2) o CH3COONa 246 g o Agua Milli-Q 1.000 ml
Tampón Fosfato (PB) 1 M o Na2HPO4
45,00 g o NaH2PO4 28,62 g o Agua Mili-Q 500 ml
Tampón Fosfato Salino (PBS) pH 7,2 o NaCl 17,53 g o Na2HPO4 0,70 g o KH2PO4 0,20 g o Agua Mili-Q 1.000 ml
Coating Buffer pH 9,6 o Na2CO3 0,794 g o NaHCO3 1,302 g o MgCl2,6H2O 0,311 g o Agua Mili-Q 1.000 ml
Glosario de Tablas y Figuras
Glosario de Tablas y Figuras
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Tablas Página
1. Géneros y especies válidamente descritos en la familia Vibrionaceae ................................................................................. 34
2. Caracteres diferenciales entre las especies del clado central del género Vibrio ............................................................... 42
3. Caracteres diferenciales entre los diferentes géneros de la familia Vibrionaceae ...................................................................... 47
4. Cepas utilizadas en la presente Tesis Doctoral, con indicación del origen y año de aislamiento ................................... 56
5. Genes, productos génicos y cebadores utilizados en el estudio de MLSA ........................................................................... 69
6. Número medio de bandas de los perfiles electroforéticos; mínima reproducibilidad de las diferentes técnicas de tipificación molecular; coeficiente de correlación cofenética (CCC) obtenido al generar los dendrogramas aplicando los algoritmos UPGMA y Ward; y el valor umbral al cual se han definido los diferentes grupos en los dendrogramas .................... 90
7. Grupos generados en las diferentes técnicas de tipificación molecular ....................................................................................... 92
8. Número de cepas en cada grupo y valores de similitud intra- e intergrupos obtenidos en las técnicas Rep PCR (GTG)5, RAPD M13 y T7, ISR 16S-23S y “gel combinado” ........ 103
9. Información de las secuencias: número de nucleótidos analizados, número de sitios informativos en Máxima Parsimonia; Modelo evolutivo óptimo aplicado en ML ................ 113
10. Distancias nucleotídicas intra- e interespecíficas obtenidas en el estudio de MLSA ................................................................ 114
11. Eventos de recombinación detectados en los genes que codifican proteínas ...................................................................... 140
Glosario de Tablas y Figuras
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12. Valores de reasociación DNA-DNA (%) entre cepas representativas de las especies V. harveyi, V. campbellii y V. rotiferianus obtenidas en este estudio ................................... 154
13. Valores de reasociación DNA-DNA (%) obtenidos de la literatura ...................................................................................... 155
14. Coeficiente de correlación de Pearson y Spearman entre valores de similitud obtenidos con las diferentes técnicas de tipado molecular, distancias génicas y valores de hibridación DNA-DNA ................................................................. 161
15. Crecimiento de E. nigricans sp. nov. y especies afines en fuentes únicas de carbono y energía .......................................... 169
16. Composición celular de ácidos grasos de las cepas de E. nigricans sp. nov. y especies afines ........................................... 176
17. Similitud de secuencia inter- e intraespecífica en los géneros Enterovibrio y Grimontia, para los genes 16S rRNA, recA, rpoD, así como para las secuencias concatenadas de los tres genes ................................................. 182
18. Valores de hibridación DNA-DNA entre E. nigricans y E. coralii .......................................................................................... 183
19. Caracteres fenotípicos diferenciales entre E. nigricans sp. nov. y otras especie del género Enterovibrio, determinadas en este estudio ........................................................................... 187
20. Cepas incluidas en este estudio de MLSA, así como los números de acceso de las secuencias nucleotídicas ................ 215
21. Cepas incluidas en la descripción de la nueva especie E. nigricans sp. nov., enmienda del género Enterovibrio y reclasificación de V. calviensis ................................................... 216
Glosario de Tablas y Figuras
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Figuras Página
1. Valores de hibridación DNA-DNA bibliográficos de las especies del clado central del género Vibrio ................................. 38
2. Árbol filogenético de las especies del clado central del género Vibrio basado en las secuencias nucleotídicas del gen 16S rRNA ............................................................................... 45
3. Dendrogramas obtenidos con las diferentes técnicas de tipificación molecular: Rep PCR (GTG)5, RAPD M13, RAPD T7 e ISR 16S-23S ......................................................................... 97
4. Árboles obtenidos mediante los métodos de NJ, ML y MP basados en las secuencias parciales de los genes 16S rRNA, recA, pyrH, rpoD, gyrB, rctB, toxR concatenadas (5492 nt) ...................................................................................... 109
5. Árboles obtenidos mediante los métodos de NJ, ML y MP basados en las secuencias parciales de los genes 16S rRNA, recA, pyrH, rpoD, gyrB, rctB y toxR de manera individual ..................................................................................... 118
6. Resolución taxonómica en relación al rango de similitudes génicas intraespecíficas e interespecíficas ................................. 143
7. Árboles obtenidos mediante los métodos de NJ, ML y MP basados en las secuencias parciales de los genes rpoD, rctB, y toxR concatenadas (1848 nt) ........................................... 144
8. Relación entre valores de reasociación DNA-DNA y valores de similitud génica de los genes rctB, rpoD, y toxR concatenados .............................................................................. 157
9. Foto de E. nigricans DAL 1-1-5T. Se muestra la pigmentación producida por la cepa ........................................... 170
10. Reconstrucción filogenética del género Enterovibrio. Árboles obtenidos mediante los métodos de NJ, ML y MP basados en las secuencias parciales de los genes 16S rRNA, recA y rpoD de manera individual, así como con sus secuencias concatenadas ........................................................... 176
