Taller 5. Normativa de contaminantes biológicos

Normalización de los métodos de muestreo y análisis muestreo y análisis

Montserrat Gutiérrez Bustillo. Profesora Titular de Complutense de Madrid.

Taller 5. Normativa de contaminantes biológicos

Normalización de los métodos de muestreo y análisis aeropalinológicos.muestreo y análisis aeropalinológicos.

Montserrat Gutiérrez Bustillo. Profesora Titular de Botánica. Universidad Complutense de Madrid.

� En Europa y también en España, el análisis polínico atmosférico como control rutinario del polen en el aire, viene utilizándose desde 1990 aproximadamente.

� Los métodos de ensayo utilizados en la toma de mues tras y en su posterior análisis generalmente siguen las normas d adas por la

Normalización de los métodos de muestreo y análisis aeropalinológicos

posterior análisis generalmente siguen las normas d adas por la International Association for Aerobiology (IAA).

� En España, las estaciones integradas en la Red Espa ñola de Aerobiología (REA), siguen en sus procedimientos de muestreo y análisis su Manual de Calidad y Gestión

Galán Soldevilla, C., Cariñanos González, P., Alcázar Teno, P. & Domínguez Vilches, E.Domínguez Vilches, E.Española de Aerobiología. 61 pags. + CD. Servicio de Publicaciones. Universidad de Córdoba. ISBN 978

En Europa y también en España, el análisis polínico atmosférico como control rutinario del polen en el aire, viene utilizándose desde 1990 aproximadamente.Los métodos de ensayo utilizados en la toma de mues tras y en su posterior análisis generalmente siguen las normas d adas por la

Normalización de los métodos de muestreo y análisis aeropalinológicos

posterior análisis generalmente siguen las normas d adas por la International Association for Aerobiology (IAA).En España, las estaciones integradas en la Red Espa ñola de Aerobiología (REA), siguen en sus procedimientos de muestreo y análisis su Manual de Calidad y Gestión

Galán Soldevilla, C., Cariñanos González, P., Alcázar Teno, P. & Domínguez Vilches, E.-2007-Manual de calidad y gestión de la Red Domínguez Vilches, E.-2007-Manual de calidad y gestión de la Red Española de Aerobiología. 61 pags. + CD. Servicio de Publicaciones. Universidad de Córdoba. ISBN 978-84-690-6354-5

Hasta el momento son muy pocos los intentos realiza dos parala normativa internacional de calidad a estos ensayos.

En España:

Normalización de los métodos de muestreo y análisis aeropalinológicos

El Laboratorio Municipal de Aranjuez implantó un Sistema de gestión de Calidad, en base a la Norma UNECertificación ISO 9001:2000, nº ES05/1709 para identificación de polen en la atmósfera”

El Laboratorio Normativo de Salud Pública de Bilbao solicitó a ENAC en El Laboratorio Normativo de Salud Pública de Bilbao solicitó a ENAC en 2006 y obtuvo la Acreditación , según la Norma UNE17025:2005 para el ensayo “Identificación y recuento de tipos polínicos en aire ambiente”

Hasta el momento son muy pocos los intentos realiza dos para aplicar la normativa internacional de calidad a estos ensayos.

Normalización de los métodos de muestreo y análisis aeropalinológicos

El Laboratorio Municipal de Aranjuez implantó un Sistema de gestión de Calidad, en base a la Norma UNE-EN ISO 9001, obteniendo la

ISO 9001:2000, nº ES05/1709 para “El recuento e identificación de polen en la atmósfera”

El Laboratorio Normativo de Salud Pública de Bilbao solicitó a ENAC en El Laboratorio Normativo de Salud Pública de Bilbao solicitó a ENAC en , según la Norma UNE-EN ISO/IEC

17025:2005 para el ensayo “Identificación y recuento de tipos polínicos en

En relación a la normalización de la metodología, e l análisis polínico atmosférico puede considerarse un “Ensayo de Labora torio” en el “Sector medioambiental” .

Normalización de los métodos de muestreo y análisis aeropalinológicos

“Ensayos en el sector medioambiental”químicos, microbiológicos, ecotoxicidadquímicos, microbiológicos, ecotoxicidadque se llevan a cabo sobre aguas,residuos, foliares, biota, así comoy atmósfera laborales, junto conmuestreo.

ALCANCE DE ACREDITACIÓN:Norma de referencia/Reference standarsTítulo/Title: Identificación y recuento de tipos polínicos en air e Título/Title: Identificación y recuento de tipos polínicos en air e ambienteÁREA: CALIDAD DEL AIRECATEGORÍA: Categoría 0 (Ensayos en Laboratorio Permanente)Producto o material a ensayar: Describir el producto o matriz a ensayar, definiéndolo tanto como sea preciso

En relación a la normalización de la metodología, e l análisis polínico atmosférico puede considerarse un “Ensayo de Labora torio” en el

Normalización de los métodos de muestreo y análisis aeropalinológicos

medioambiental” . Incluye ensayos físico-ecotoxicidad, biológicos, toma de muestrasecotoxicidad, biológicos, toma de muestrasaguas, lixiviados, suelos, lodos, sedimentos,como emisiones atmosféricas, aire ambiente

con sus correspondientes soportes de

ALCANCE DE ACREDITACIÓN:standars: UNE-EN ISO/IEC 17025: 2005

Identificación y recuento de tipos polínicos en air e Identificación y recuento de tipos polínicos en air e

Categoría 0 (Ensayos en Laboratorio Permanente)Describir el producto o matriz a ensayar,

definiéndolo tanto como sea preciso

Las muestras diarias son preparaciones microscópicas, que un técnico analiza al microscopio óptico (M.O.), identificando y contando los granos de polen presentes en la muestra. Se trabaja a 400 aumentos (Ocular 10x; Objetivo 40x)

¿Cómo se muestrea y analiza el polen atmosférico?son preparaciones microscópicas, que un técnico analiza al

microscopio óptico (M.O.), identificando y contando los granos de polen presentes en la muestra. Se trabaja a 400 aumentos (Ocular 10x; Objetivo 40x)

¿Cómo se muestrea y analiza el polen atmosférico?

Granos de polen

� La identificación se basa en la morfología de estas partículas, que es específica

Es un análisis cualitativo y cuantitativo

partículas, que es específica para determinados grupos de plantas u hongos productores

� Como resultado del análisis de cada muestra obtenemos una relación de tipos morfológicos de polen (espectro diario) cuantificados mediante el valor medio diario mediante el valor medio diario de estas partículas por metro cúbico de aire.

Es un análisis cualitativo y cuantitativo

Informe de resultados

ALCANCE DE ACREDITACIÓN:

Detallar el parámetro o parámetros a ensayar En nuestro caso los tipos polínicos

ACER AcerALNU AlnusALNU AlnusARTE ArtemisiaBETU BetulaCAST CastaneaCOMP CompositaeCORY CorylusCUPR Cupress/TaxCHEN Chenop/AmarantERIC EricaceaeEUCA EucaliptusEUCA EucaliptusFRAX FraxinusLIGU LigustrumMORA Moraceae

ALCANCE DE ACREDITACIÓN:

Detallar el parámetro o parámetros a ensayar tipos polínicos a identificar y contar

OLEA OleaPINU PinaceaePINU PinaceaePLAN PlantagoPLAT PlatanusPOAC PoaceaePOPU PopulusQUER Quercus RUME RumexSALI SalixULMU UlmusURTI UrticaceaeURTI UrticaceaeOTROS:No identificadosTOTALES:

BROU Brousonetia ssp.MORA MoraceaeMORU Morus ssp.

Definición y delimitación del tipo polínico

MORU Morus ssp.

A la familia Moraceae pertenecen los géneros Morus y Brousonetia, con algunas especies utilizadas como ornamentales (M. nigra, M. alba y B. papirifera principalmente). El polen es di-trizonoporado, isopolar y de tamaño pequeño (Broussonetia 14-15 micras) a mediano (Morus 20-24 micras). mediano (Morus 20-24 micras).

Broussonetia

Definición y delimitación del tipo polínico

pertenecen los con

B. El polen es y de tamaño 15 micras) a

Morus

TIPO POLÍNICO TÁXONCEDR Cedrus ssp. (PinaceaePINA Pinaceae

Definición y delimitación del tipo polínico

PINU Pinus ssp. (Pinaceae

Polen de Cedrus, muy grande de 80el de Pinus algo mas pequeño (50

Pinaceae)

Definición y delimitación del tipo polínico

Pinaceae)

muy grande de 80-110 micrasalgo mas pequeño (50-80 micras)

Indicar los límites de detecciónrango de medida en los ensayos cuantitativos, de acuerdo a los siguientes criterios:

Análisis culitativo y cuantitativo

Límite de detección . Para los análisis cualitativos indicar únicamente este límite

Rango de medida. Para análisis cuantitativos indicar siempre el límite Inferior del rango de medida (límite de cuantificación). Además, incluir el límite superior cuando existan limitaciones técnicas debidas a equipos, materiales de referencia o patrones que utiliza el laboratorio

En el caso particular de ensayos microbiológicos y biológicos no será necesario incluir el rango de medida.

límites de detección en los ensayos cualitativos y el en los ensayos cuantitativos, de acuerdo a

Análisis culitativo y cuantitativo

. Para los análisis cualitativos indicar

Para análisis cuantitativos indicar siempre el límite Inferior del rango de medida (límite de cuantificación). Además, incluir el límite superior cuando existan limitaciones técnicas debidas a equipos, materiales de referencia o patrones

ensayos microbiológicos y no será necesario incluir el rango de medida.

Es un análisis cualitativo y cuantitativo

� Los granos de polen son partículas tridimensionales de tamaño y forma variable dispersas de forma no homogénea en el aire

� Durante el muestreo los granos de polen presentes en el aire quedan adheridos a la superficie de la muestra

� En la muestra de polen atmosférico, el análisis al Microscopio Óptico nos permite conocer el número de granos de polen que han quedado permite conocer el número de granos de polen que han quedado adheridos a una parte, estadísticamente representativa, de la superficie total de la muestra (“análisis cuantitativo”)

� Por su morfología adscribimos estos granos de polen a un determinado tipo polínico (“análisis cualitativo)

Los resultados del análisis cuantitativo se expresan mediante dos valores numéricos:1. la concentración media de 1. la concentración media de

a lo largo de un día2. la incertidumbre que está asociada a la dispersión del

resultado o intervalo dentro del cual tenemos cierta fiabilidad de que se encuentra el valor verdadero

Es un análisis cualitativo y cuantitativo

Los granos de polen son partículas tridimensionales de tamaño y forma variable dispersas de forma no homogénea en el aireDurante el muestreo los granos de polen presentes en el aire quedan adheridos a la superficie de la muestraEn la muestra de polen atmosférico, el análisis al Microscopio Óptico nos permite conocer el número de granos de polen que han quedado permite conocer el número de granos de polen que han quedado adheridos a una parte, estadísticamente representativa, de la superficie total de la muestra (“análisis cuantitativo”)Por su morfología adscribimos estos granos de polen a un determinado tipo polínico (“análisis cualitativo)

Los resultados del análisis cuantitativo se expresan mediante dos valores numéricos:

la concentración media de granos de polen/m3 de aire la concentración media de granos de polen/m3 de aire

la incertidumbre que está asociada a la dispersión del resultado o intervalo dentro del cual tenemos cierta fiabilidad de que se encuentra el valor verdadero

Análisis cuantitativo 1. El límite de cuantificación es de 1 grano de polen/ m2. No existe ningún procedimiento idóneo para el cálcu lo de la

incertidumbre de medida en el análisis polínico atm osférico

Guía para la expresión de la incertidumbre en los ensayos cuantitativos

En todos los laboratorios que actualmente realizan análisis polínico atmosférico se utiliza como límite mínimo de detección un grano de

Guía para la expresión de la incertidumbre en los ensayos cuantitativos(G-ENAC-09/Rev. 1 Julio 2005)

“En este documento se considera sólo la incertidumbre de medida en los ensayos cuantitativos. La comunidad científica tiene todavía que formular una estrategia para los resultados de los ensayos cualitativos”.

atmosférico se utiliza como límite mínimo de detección un grano de polen/m 3 de aire , y en ningún caso se utiliza un

El límite de cuantificación es de 1 grano de polen/ m3 de aireNo existe ningún procedimiento idóneo para el cálcu lo de la incertidumbre de medida en el análisis polínico atm osférico

Guía para la expresión de la incertidumbre en los ensayos cuantitativos

En todos los laboratorios que actualmente realizan análisis polínico límite mínimo de detección un grano de

Guía para la expresión de la incertidumbre en los ensayos cuantitativos

En este documento se considera sólo la incertidumbre de medida en los ensayos cuantitativos. La comunidad científica tiene todavía que formular una estrategia para los resultados de los ensayos cualitativos”.

límite mínimo de detección un grano de caso se utiliza un límite superior

� Dadas las características del muestreo y el análisis, la probabilidad de detectar en la muestra la presencia de un solo grano de polen/mes muy alta

� Es muy frecuente que un tipo polínico alcance niveles de concentración media diaria superiores a los 1000 granos de polen/m

Mediante un cálculo matemático muy simple que relaciona:

Análisis cuantitativo

Mediante un cálculo matemático muy simple que relaciona:• superficie total de captación de la muestra • superficie media de un grano de polen

para que la muestra llegara a estar saturada habría que recoger 640.000 granos de polen, que aproximadamente equivalen a 44 .000 granos de polen/m 3 de aire/día

� Los resultados que habitualmente se obtienen quedan muy lejos de esas � Los resultados que habitualmente se obtienen quedan muy lejos de esas cifras.

Por ello, y por la ausencia de legislación al respe cto, no parece necesario fijar un nivel máximo de detección. Simplemente deb e darse el valor numérico obtenido en el análisis, para cada tipo po línico.

Dadas las características del muestreo y el análisis, la probabilidad de detectar en la muestra la presencia de un solo grano de polen/m3 de aire,

Es muy frecuente que un tipo polínico alcance niveles de concentración media diaria superiores a los 1000 granos de polen/m3

Mediante un cálculo matemático muy simple que relaciona:Mediante un cálculo matemático muy simple que relaciona:superficie total de captación de la muestra (672 x 106 micras 2)superficie media de un grano de polen (35x30= 1050 micras 2)

para que la muestra llegara a estar saturada habría que recoger 640.000 granos de polen, que aproximadamente equivalen a 44 .000 granos de

Los resultados que habitualmente se obtienen quedan muy lejos de esas Los resultados que habitualmente se obtienen quedan muy lejos de esas

Por ello, y por la ausencia de legislación al respe cto, no parece necesario fijar un nivel máximo de detección. Simplemente deb e darse el valor numérico obtenido en el análisis, para cada tipo po línico.

Análisis cualitativo

El resultado de un análisis cualitativo también se caracteriza por dos valores:1. el primero corresponde a la respuesta binaria SI/NO, en nuestro caso

PRESENCIA/AUSENCIA de un determinado “tipo polínico”2. es la probabilidad de error asociada a la decisión que hemos tomado.2. es la probabilidad de error asociada a la decisión que hemos tomado.

En nuestro caso los parámetros de calidad aplicable s, deberían medir el riesgo de identificación errónea, directam ente relacionado con la posibilidad de discriminación de los tipos p olínicos por su particular morfología (comparación con un patrón).

Para que la probabilidad de error sea pequeña es muy importante:Para que la probabilidad de error sea pequeña es muy importante:1. La formación específica de los Técnicos de Laboratorio que realizan

los análisis. Este requisito es el más importante

2. La comparación con los materiales de referencia (Requisitos de calidad) un patrón

El resultado de un análisis cualitativo también se caracteriza por dos

el primero corresponde a la respuesta binaria SI/NO, en nuestro caso PRESENCIA/AUSENCIA de un determinado “tipo polínico”es la probabilidad de error asociada a la decisión que hemos tomado.es la probabilidad de error asociada a la decisión que hemos tomado.

En nuestro caso los parámetros de calidad aplicable s, deberían medir el riesgo de identificación errónea, directam ente relacionado con la posibilidad de discriminación de los tipos p olínicos por su particular morfología (comparación con un patrón).

Para que la probabilidad de error sea pequeña es muy importante:Para que la probabilidad de error sea pequeña es muy importante:La formación específica de los Técnicos de Laboratorio que realizan los análisis. Este requisito es el más importante

materiales de referencia (Requisitos de

Requisitos de calidad del material de referencia

Nuestros materiales de referencia, para la

atmosférico van a ser:

1. Los pliegos de herbario con las muestras de las pla ntas que nos han 1. Los pliegos de herbario con las muestras de las pla ntas que nos han servido para la obtención del polen, debidamente et iquetados.

2. Las preparaciones polínicas para M.O. correspondien tes a los tipos polínicos a identificar y que integran la palinotec a.

1. Debe estar a cargo de un profesional calificado responsable de la compra, recepción y distribución.

Somos nuestros propios proveedores

1. Se debe mantener un registro central o archivo que contenga toda la información relativa a las propiedades del material de referencia.

2. Se debe verificar la calidad del material de referencia cuando las condiciones hayan sido alteradas y rutinariamente, una vez al año.

Requisitos de calidad del material de referencia

Nuestros materiales de referencia, para la identificación del polen

Los pliegos de herbario con las muestras de las pla ntas que nos han Los pliegos de herbario con las muestras de las pla ntas que nos han servido para la obtención del polen, debidamente et iquetados.

Las preparaciones polínicas para M.O. correspondien tes a los tipos polínicos a identificar y que integran la palinotec a.

Debe estar a cargo de un profesional calificado responsable de la compra, recepción y distribución.

Somos nuestros propios proveedores

Se debe mantener un registro central o archivo que contenga toda la información relativa a las propiedades del material de referencia.

Se debe verificar la calidad del material de referencia cuando las condiciones hayan sido alteradas y rutinariamente, una vez al año.

El captador volumétrico succiona un cierto volumen de aire (10 litros en la superficie de captación.Las esporasadheridas a la superficie captadora que se desplaza a

PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE TRABAJO PARA LA TOMA Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS CON EL CAPTADOR VOLUMÉTRICO

adheridas a la superficie captadora que se desplaza a una velocidad uniforme de 2 mm/hora mediante un mecanismo de relojería.

� Condiciones para la ubicación del captador� Mantenimiento� Verificación del flujo de succión� Criterios de validación de muestras

El captador volumétrico succiona un cierto volumen de (10 litros ±1 por minuto) que incide directamente

en la superficie de captación.esporas y los granos de polen presentes quedan

adheridas a la superficie captadora que se desplaza a

PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE TRABAJO PARA LA TOMA Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS CON EL CAPTADOR VOLUMÉTRICO

adheridas a la superficie captadora que se desplaza a una velocidad uniforme de 2 mm/hora mediante un mecanismo de relojería.

Condiciones para la ubicación del captadorMantenimientoVerificación del flujo de succiónCriterios de validación de muestras

PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE TRABAJO PARA EL RECUENTO E IDENTIFICACION DEL POLEN ATMOSFÉRICO

� El método de recuento que generalmente se utiliza es el de 4 barridos horizontales continuos a lo largo de toda la preparación a 40x10 aumentos

� Estos barridos deben ser equidistantes entre si y del borde de la � Estos barridos deben ser equidistantes entre si y del borde de la preparación en el caso del primer y último barrido

� La superficie analizada corresponde al 10

PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE TRABAJO PARA EL RECUENTO E IDENTIFICACION DEL POLEN ATMOSFÉRICO

El método de recuento que generalmente se utiliza es el de 4 barridos horizontales continuos a lo largo de toda la preparación a 40x10

Estos barridos deben ser equidistantes entre si y del borde de la Estos barridos deben ser equidistantes entre si y del borde de la preparación en el caso del primer y último barridoLa superficie analizada corresponde al 10-12 % de superficie total

Muchas gracias a todos por su Muchas gracias a todos por su atención!

montseg@ucm.es

Muchas gracias a todos por su Muchas gracias a todos por su atención!

montseg@ucm.es