t17-07tesis regeneracion invitro de 3 varied a des de crisantemo
DESCRIPTION
Tesis realizada en colombia crisantemos de corte albatros blanca y amarilla y una rosadaTRANSCRIPT
Regeneración in vitro de tres variedades de Crisantemo
(Dendranthema grandiflora) vía organogénesis y
embriogénesis somática
HodsonHodson, E., , E., CancinoCancino, G. , G. ForeroForero a.a.Unidad de BiotecnologUnidad de Biotecnologíía Vegetal a Vegetal
IINTRODUCCINTRODUCCIÓÓNN
Colombia es el segundo exportador mundial de
flores frescas de corte
4211 Toneladas anuales
Valor estimado
US$11.513.470
La floricultura en Colombia genera en forma directa e indirecta 163.300 empleos
Países importadores de flores Colombianas
El 98% de la producción total de flores se exporta
Crisantemo (Dendrathema grandiflora)
Esta especie presenta una alta demanda en el
exterior y es ampliamente cultivada a
nivel interno
Puccinia horiana
La producción de crisantemo se ve seriamente afectada por el ataque de hongos patogenos,
requiere de grandes cantidades de fungicidas, lo cual incrementa los costos a nivel económico y ecológico
La evaluación de sistemas de
regeneración in vitro de plantas de crisantemo vía organogénesis o
embriogénesissomática, constituye un
primer paso para la transformación genética
a b c
White albatross Escapade Yellow albatross
a b c
White albatross Escapade Yellow albatross
Objetivo: Evaluar la respuesta de regeneración in vitro, a partir de discos de hoja vía organogénesis y
embriogénesis somática de tres variedades de crisantemo (Dendrathema grandiflora) cultivadas en Colombia
a b c
White albatross Escapade Yellow albatross
MMateriales ateriales yyMMéétodostodos
Establecimiento y propagación de
segmentos nodaleslas tres variedades de
D. grandiflora
40REPETICIONES
13.324.8316TRATAMIENTOS
3REPLICAS
8.873.224.441.61
00
BAP (µM)
ANA (µM)
OORGANOGRGANOGééNESISNESIS
Medio de cultivo: Murshige & Skoog (1962)
IIndividualizacindividualizacióón, n, enraizamientoenraizamiento y y endurecimentoendurecimentode las plantas de las plantas regeneradasregeneradas
Individualización y Enraizamiento
Medio de cultivo Murashige & Skoog (1962)
Condiciones durante el Endurecimiento:
Cámara húmeda
Sustrato : turba
Organogénesis
212.26
70
-4.52
40REPETICIONES
-3.39
15TRATAMIENTOS
3REPLICAS
141.12
Tiempos de exposición(días)
2,4-D (µM)
EEmbriogmbriogéénesisnesis somsomáática tica
Medio de cultivo: Mum B (May & Trigiano, 1991; Urban et al, 1994)
IIndividualizacindividualizacióón y n y endurecimentoendurecimentode las plantas de las plantas regeneradasregeneradas
Individualización: Medio de cultivo Mum B
Condiciones durante el endurecimiento:
Cámara Húmeda
Sustrato : turba
Embriogénesis somática
RResultados y esultados y DDiscusiiscusióón n
El medio Murashige & Skoog (MS) y las condiciones de incubación establecidas son adecuados para
el establecimiento y multiplicación de los segmentos nodalesde las tres variedades en estudio
Wambagu et al., 1981; Dabin et al., 1983; Kushal, 1994;Khan et al., 1994; Haq et al., 1999
RRegeneraciegeneracióón n viaviaOOrganogrganogéénesisnesis
Variedad White Albatross
12 DDS 14 DDS (29X) 20 DDS (29X)
40 DDS
Estado individualización
Planta enraizada
FFrecuencias de regeneracirecuencias de regeneracióón de brotes n de brotes
• Se requiere de un balance de BAP y ANA para obtener una regeneración exitosa en D. grandifloraLedger et al., 1991 Arbos, 1992; Courtney-Gutterson et al., 1993; Renou et al., 1993;
Khan et al., 1994; Kushai et al., 1994; Seiichi et al., 1995; Roxas et al., 1996; Sangwan et al., 1998
• La variación de los niveles exógenos de citoquininas en plantas, puede causar incrementos en las concentraciones de auxinas endógenas y a su vez las auxinas controlan los niveles endógenos
de citoquininas activas (Coenen & Lomas et al., 1997)
EEscapadescapade
Frecuencia de regeneración de brotes: 73 %Número promedio de brotes por explante: 4.9
ANA 4.83 µM y BAP 4.44 µM (T14)
WWhitehite AAlbatrosslbatross
ANA 4.83 µM + BAP 13.32 µM (T16)Frecuencia de regeneración de brotes: 62.5%
Número promedio de brotes por explante: 14.45
YYellowellow AAlbatrosslbatross
ANA 4.83 µM y BAP 4.44 µM (T14)Frecuencia de regeneración de brotes: 57.3%
Número promedio de brotes por explante: 3.58
La capacidad de regeneración de brotes de crisantemo vía organogénesis es dependiente de la
variedad
Protoplastos (Sauvadet et al., 1990)Pétalos florales (Malure et al., 1991)
Embriones somáticos (May and Trigiano et al., 1991)Discos de hoja (Sherman et al., 1998)
Perdida del potencial de regeneración en algunas especies, por acumulación masiva de poliaminas
causada por el estrés generado durante el cultivo in vitro del tejido vegetal
(Aribaud, et al., 1994; Martín et al., 1997)
IIndividualizacindividualizacióón y n y EEnraizamientonraizamiento
El medio con MS sales completas, sin reguladores de crecimiento, favorece la elongación y el enraizamiento de
los brotes, en contraste con lo requerido por otras variedades
Hill 1968, Langhans 1972, Kaul et al. 1990, Tian et al. 1993, Rout et al. 1996, Sherman et al. 1998
97
100
97
92
87
90
Endurecimiento(%)
Yellow albatross
White albatross
Escapade
Variedad Enraizamiento(%)
Frecuencias de enraizamiento y endurecimiento
EEmbriogmbriogéénesisnesis somsomáática tica
Variedad Escapade Vista estereoscópica 93.5 X
Mum B + 2,4-D 2.26 µM
La composición del medio de cultivo Mum Bfavoreció la respuesta embriogénica
La interacción adecuada de citoquinina - auxina estimula estados tempranos de diferenciación celular
La citoquinina incrementa la sensibilidad del tejido al estimulo de la auxina y este incremento de sensibilidad
favorece la desdiferenciación celular
Ambos reguladores participan en la dinámica del ciclo celular, importante en el proceso de diferenciación y
posterior desarrollo de embriones somáticos (Aloni, 1995).
21
14
21
Tiempo de exposición
(días)
T9
T8
T9
T
Yellow albatross
White albatross
Escapade
Variedad
2.26
2.26
2.26
Concentración2,4-DµM
Inducción embriones: Tratamientos mas efectivos
1
1.4
2
NúmeroBr/Exp
5.3
5.7
51.14
Brotes(%)
T9
T8
T9
T
Yellow albatross
White albatross
Escapade
Variedad
8472.03
8676.4
8969.4
Plantas completas
(%)
Masas Pro-embrionicas
(%)
Formación de masas pre-embrionicasy desarrollo de brotes
• Efecto positivo del 2,4-D sobre la inducción de embriogénesis somática en las tres variedades
evaluadas (Bhattacharya et al., 1990; Fujii & Shimizu, 1990)
• La adicción exógena de auxinas (2-4D) puede producir un aumento sustancial de los niveles de
AIA endógenos(Pasternak et al. 2003)
• La maduración y germinación de los embriones,ocurren sin adición de auxinas
(Sherman et al., 1998 )
EEndurecimiento ndurecimiento De las plantas regeneradas De las plantas regeneradas
Es posible endurecer y transferir exitosamente a
suelo las plantas de la tres variedades en estudiopropagadas in vitro,
utilizando cámara húmeda y sustrato turba
Plantas obtenidas víaVariedad
97
100
97
Organogénesis Embriogénesis
100
80
90
Endurecimiento(%)
Yellow albatross
White albatross
Escapade
Frecuencias de enraizamiento y endurecimiento
• Alta capacidad morfogenética en los segmentos nodales de D.grandiflora
• El medio MS con ANA 4.83 µM y BAP 4.44-13.32 µM, permite regeneración de plantas vía
organogénesis de D.grandiflora.• Hay elongación y enraizamiento espontáneo de
brotes obtenidos vía organogénesis en medio MS sin reguladores de crecimiento
CConclusionesonclusiones regeneraciregeneracióón n D. grandifloraOrganogénesis
• El 2,4-D (2.26 µM) favorece la inducción de embriones somáticos a partir de discos foliares de
las tres variedades de D.grandiflora
• El medio de cultivo Mum B sin reguladorespermite la germinación de los embriones
somáticos y el desarrollo de brotes
CConclusionesonclusiones regeneraciregeneracióón n D. grandifloraEmbriogénesis
Entidades financiadoras