%studio inmunologico de los antigenos cardiacos en el infarto del...
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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA 1
I ZTA PA LA PA
INFORME DE SERVICIO
%STUDIO INMUNOLOGICO DE
CARDIACOS EN EL INFARTO
SOCIA L
LOS ANTIGENOS
DEL MIOCARDIO
r *
bI..
p.
i.+
r 1.- p. I
-1
r- i-
r- ! I. Introducción L-
A . Antecedentes . . . . . . I B. Objetivos . . . . . . . . . P
INDICE
.............................. 1
.............................. 11 C. Justificación .................................... 12
D. Abreviaturas ...................................... 13
A. Extracción de ASCH ............................... 15 B. Fraccionamineto del ASCH por precipitación con su1
fato de amonio ................................... 17 C. Obtencion de mitocondrias ........................ 20
D. Electroforesis en gel de acrilamida . . . . . . . . . . . . . . 22 E. 1nmun.oelectroforesis ............................. 24 F. Contrainmunoelectroforesis ....................... 26
11. Material y métodos
-
. G. M i c r o d o b l e i n m u o o d ~ f u s i Ó n ........................ ~ 2 8 111. -Resultados
A. Obtención de l a s fracciones del ASCH . . . . . . . . . . . . . 30 B . Electroforesis en riel de poliacrilamida . . . . . . . . . . 32 C. Caracterización inmunoserolóaica . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 D. Anticuerpos contra fracciones cardiacas en pacien
tes cardiopatas .................................. 39 I V . Conclusiones ......................................... 47
V. Resumén .............................................. 49 VI. Biblioqrafía ......................................... 5 1
-
I. Introducción.
A. ANTECEDENTES.
La n e c r o s i s de l a f i b r a m u s c u l a r c a r d i a c a l i b e r a a n t í g e n o s
que son c a p a c e s de e s t i m u l a r l a r e s p u e s t a autoinmune ( a u t o a n t i -
c u e r p o s ) . S e ha p o s t u l a d o que los a n t i c u e r p o s p r o d u c i d o s f a v o r e -
cen l a e l i m i n a c i ó n de d e t r i t u s t i s u l a r e s , p r i n c i p a l m e n t e l o s a n -
t i c u e r p o s no f i j a d o r e s de complemento. S i n embargo, cuando l o s
a n t i c u e r p o s f i j a n e l complemento, son c a p a c e s de i n d u c i r o i n -
c r e m e n t a r e l daño en l a f i b r a m i o c á r d i c a . Los a n t i c u e r p o s a n t i -
c o r a z ó n , s e e l e v a n en e l i n f a r t o a l m i o c a r d i o , en e l s índrome de
D r e s s l e r , en l a f i e b r e r e u m á t i c a , en a l g u n a s c a r d i p a t í a s c o n g é n i - t a s , en e l síndrcfme p o s t c a r d i o t o m í a y en a l g u n a s m i o c a r d i t i s (13
24,11,7,12,10,18).
* .
La i n i c i a c i ó n d e l daño en l a s f i b r a s c a r d i á c a s , puede e x p l i -
c a r s e p o r dos mecanismos: I ) l a d e s t r u c c i ó n de l a c é l u l a c a r d i á c a
por d i v e r s o s f a c t o r e s i i b e r a a u t o a n t í g e n o s que e s t i m u l a n l a s í n t e - s i s de l o s a n t i c u e r p o s , y e s t o s a su vez pueden o no mediar e l da -
ño s u b s e c u e n t e en e l m i o c a r d i o ; o b i e n , 2 ) puede e x i s t i r una ano-
m a l í a en e l a p a r a t o inmunocompetente p r e v i a a l i n f a r t o que f a v o r s
ce l a p r o d u c c i ó n de l o s a n t i c u e r p o s c o n t r a e l m i o c a r d i o . A su vez
d i c h a m o d i f i c a c i ó n p o d r í a f a c i l i t a r e l d e s a r r o l l o de u n i n f a r t o
( 1 8 ) .
n L
L a p r e s e n c i a de a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n f u e demostrada po r
e l p e r f i l i nmunosero lóg ico de 37 p a c i e n t e s con i n f a r t o agudo d e l
m i o t a r d i o , a s í como su e v o l u c i ó n de 90 d í a s ( 1 8 ) . Con l a prueba
de hemag lu t inac ión p a s i v a s e v a l o r a r o n l o s a n t i c u e r p o s c o n t r a l o s
an t í genos s o l u b l e s d e l corazón, l o s c u a l e s s e ñ a l a n l a l i b e r a c i ó n
de componentes s o l u b l e s de l a f i b r a c a r d í a c a a l e s p a c i o e x t r a c e l g
l a r . E s t o s son capaces de i n d u c i r l a p roducc ión de a n t i c u e r p o s y
en l a s e r i e de enfermos agudos a p a r e c i o en e l 85.7%. E s t e h a l l a z -
go s u g i e r e que l o s fenómenos de n e c r o s i s t i s u l a r s e i n i c i a n dos
o más semanas p r e v i a s a l cuadro c l í n i c o d e l i n f a r t o y du ran te l a s
t r e s o más semanas de e v o l u c i ó n l o s v a l o r e s promedio de l a r e c í - proca de l o s t í t u l o s de a u t o a n t i c u e r p o s fue ron de 28 a 42. Los su - j e t o s normales no p r e s e n t a n a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n determinados
por h c n a g l u t i n a c i ó n p a s i v a . E l hecho de que 14.3% de l o s p a c i e n - - t e s no p resen tasen a u t o a n t i c u e r p o s puede deberse a que en e s t o s
i n d i v i d u o s no s e s i n t e t i z a r o n , o b i e n , que l a n e c r o s i s fué mínima
y, p o r l o t a n t o , i n s u f i c i e n t e l a c a n t i d a d de au toan t ígenos l i b e r a
dos p a r a e s t i m u l a r a l s i s t ema inmune. También puede deberse a que
no s e d e t e c t a r o n l o s a u t o a n t i c u e r p o s con l a t é c n i c a empleada ( 1 8 ) .
Es p o s i b l e que e x i s t a una r e l a c i ó n e n t r e e l grado de n e c r o s i s y l a
e l e v a c i ó n de l o s a u t o a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n ( 1 8 ) .
L a hemag lu t i nac ión p a s i v a no p e r m i t e e s t a b l e c e r si los a n t i -
cuerpos a n t i c o r a z ó n son capaces de a c t i v a r e l s i s t ema d e l comple - mento h e m o l í t i c o , e l c u a l s e c a r a c t e r i z a po r a m p l i f i c a r o i n c remen
3
tar el proceso inflamatorio y necrótico en el miocardio (7). El
37% de l o s casos desarrollaron anticuerpos fijadores del comple-
mento, principalmente contra los antígenos insolubles de corazón y
en el 9.6% contra l o s antígenos solubles. E l título de l o s anti-
cuerpos anticorazón, por consumo del complenento contra l o s antíge-
nos solubles como l o s insolubles estuvieron presentes durante l o s
90 días de estudio. En sujetos normales no se detectaron anticuer-
pos anticorazón fijadores del complemento, n i en e l 63% de l o s ca-
sos con infarto. Este hallazgo sugiere que no se produjo extensión
de l a necrosis, a diferencia de aquellos que presentaron dichos an-
ticuerpos fijadores del complemento y en los que posiblemente se
produjo un aumento del daño (13,24,7,10,15).
Existen variaciones en l a frecuencia de positividad de l o s
anticuerpás anticorazón según l a fuente de l o s antígenos cardíacos,
v.gr: miocardio de ratón, de rata y humano. También se pueden en - contrar diferencias debidas al método empleado para detectar l o s
anticuerpos anticorazón, como l a hemaglutinación pasiva, l a inmuno-
fluorescencia, el consumo de antigammaglobulina y e l consumo del
complemento (18).
Laufer y Friedman ( 1 3 ) en sus experimentos con células cardíg
cas 'observaron que al agregar anticuerpos anticorazón no se modifi-
co el latido de l a s células n i tampoco se encontraron alteracio-
nes de las células al microscopio electrónico, sin embargo, al
añadir complemento hemolítico a l a s células cardíacas con anticuer
I
4
pos a n t i c o r a z ó n l a s c é l u l a s d e j a r o n de l a t i r , y con e l m i c r o s c o p i o
o b s e r v a r o n d e s t r u c c i ó n d e l s a r c o l e m a , edema y v a c u o l a s en l a s m i t o -
c o n d r i a s .
A l a n a l i z a r e l n i v e l s é r i c o d e l complemento en l o s i n d i v i - duos con i n f a r t o d e l , m i o c a r d i o , s e e n c o n t r a r o n v a l o r e s s u b n o r m a l e s
en e l 7 7 % de l o s c a s o s . Este n i v e l subnormal d e l complemento pue-
de d e b e r s e : 1 ) a l p r o c e s o au to inmune humoral con a n t i c u e r p o s f i j a -
d o r e s d e l complemento ( 1 5 ) , o b i e n , 2 ) a l a l i b e r a c i ó n d e m i t o c o n -
d r i a s que s e e n c u e n t r a n en l a f i b r a m u s c u l a r c a r d í a c a y que s o n ca -
*
p a c e s de a c t i v a r a l complemento ( 1 8 ) . Ambos p o s t u l a d o s s u g i e r e n
que l a n e c r o s i s d e l m i o c a r d i o puede s e r man ten ida o i n c r e m e n t a d a
p o r l o s fenf ienos inmunes r e l a c i o n a d o s con e l s i s t e m a d e l complemen -
t o ( 1 5 ) . S i n embargo , s e r equ ie ren e s t u d i o s c u a n t i t a t i v o s d e l o s
componentes d e l complemento h e m o l í t i c o p a r a e s t a b l e c e r s i e l meca-
nismo d e daño e s po r l a a c t i v a c i ó n de l a v í a c l á s i c a o po r l a v í a
a l t e r n a d e l complemento ( 1 8 , 1 6 , 1 5 ) .
La p r o t e í n a - C - r e a c t í v a s e ñ a l a l a p r e s e n c i a d e u n p r o c e s o i n -
f l a m a t o r i o con n e c r o s i s como o c u r r e en e l i n f a r t o agudo d e l m i o c a r
d i o ( 1 8 ) . E n o t r o s c a s o s f u é p o s i t i v a en e l 7 2 . 9 % y 8 6 . 9 % d e l a
p r i m e r a a l a segunda semana r e s p e c t i v a m e n t e , y después d e s c e n d i o
en l a t e r c e r a semana a l 5 7 . 1 % de p o s i t i v i d a d (18 ) . E s t o s h a l l a z g o s
apoyan l a e x i s t e n c i a y l a e v o l u c i ó n d e l p r o c e s o i n f l a m a t o r i o y ne-
c r ó t i c o d e l p a d e c i m i e n t o c a r d í a c o . E n b a s e a l o s h a l l a z g o s s e ñ a l a -
d o s s e c o n s i d e r a c o n v e n i e n t e r e a l i z a r u n e s t u d i o i n m u n o l ó g i c o en
I
5
l o s pacientes con infarto subendocárdico, con infarto "silencioso"
en casos de extensión del infarto, en aquellos con angor inestable
o síndrome intermedio, con angor estable, y también en casos d e in -
suficiencia coronaria electrocardiográfica, pero sin cuadro clíni-
co d e angor. Es factible que los pacientes con síndrome de angor
inestable y con tenedencia a evolucionar hacia el infarto presen-
ten anticuerpos fijadores de complemento, complemento hemolítico
sérico disminuído y presencia de autoanticuerpos anticorazón por
hemaglutinación pasiva. Por otro lado es posible que no existan mo -
dificaciones serológicas en aquellos casos cuya evolución sea ha - cia la estabilización sin necrosis. Surge entonces la posibilidad
de que el primer grupo de pacientes las pruebas serológicas apoyen
la realización del estudio coronariográfico para decidir la indica -
ción quirúrgica y/o tratamiento médico intensivo (13,24,11,7,5,12,
10,15). .
El diagnóstico durante los primeros cinco días del infarto
subendocárdico se establece por el cuadro clínico, la elevación en -
zimática y el estudio electrocardiográfico. En estas circunstancias
también los anticuerpos anticorazón se encuentran elevados. Sin em-
bargo, después de los primeros cinco días en que las enzimas vuelven
a sus niveles normales, los estudios inmunoserológicos pueden rati-
ficar o rectificar el diagnóstico considerado por la impresión clí-
n i c o - e l e c t r o c a r d i o g r á f i c a .
La presencia de los anticuerpos anticorazón demostrados por he
6
maglutfnación pasiva en l o s primeros cinco días del cuadro clínico
del infarto agudo del miocardio indican generalmente, que el daño
al miocardio ocurrio entre dos semanas y tres meses previos al cua - dro clínico de infarto. Además los anticuerpos fijadores del comple-
mento, así como la disminución del complemento hemolítico, señalan
la existencia del proceso inflamatorio-necrótico. Este conocimiento
es igualmente útil en el diagnóstico del infarto "silencioso".
La muerte súbita es en la actualidad uno de l o s problemas más
serios por resolver dentro de la Cardiología y un importante porcen -
taje de estos pacientes con cuadro de insuficiencia coronaria, típi -
co y atípico, acuden a su médico días o semanas antes de su falleci -
miento súbito. La determinación de autoanticuerpos por hemaglutina-
ción pasiva, fijadores del complemento y complemento hemolítico así
como la proteína-C-reactiva, permitiría Sospechar la existencia de
daño miocárdico y por lo tanto se requeriría de una estrecha vigi - lancia para una posible prevensión de la muerte que obedece princi-
palmente al transtorno eléctrico concomitante (13,7,10,18).
En l o s pacientes con anticuerpos anticorazón demostrados por
hemaglutinación pasiva, pero sin anticuerpos fijadores del compley
mento, se considera la posibilidad de que estos anticuerpos sean
"protectores', dado que bloquean la activación del complemento y
además evitarían la unión de l o s linfocitos sensibilizados que son
capaces de liberar linfotoxinas en el miocardio ( 2 4 , 1 7 , 1 2 ) . Se seña-
la este fenómeno debido a que los mecanismos de daño y protección
7
en l a pa togén ia de l a s enfermedades c a r d i o v a s c u l a r e s , e s t á n aún en
c o n t r o v e r s i a , ya que l o s a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n pueden s e r c i t o t ó -
x i c o s (13,11,17) Ó no c i t o t ó x i c o s ( 2 4 , 7 ) .
E l i n f a r t o exper imenta l en p e r r o s c u r s a con l a p roducc ión de
a u t o a n t i c u e r p o s c o n t r a corazón f i j a d o r e s d e l complemento. Su e v o l u -
c i ó n s e m o d i f i c o con l a a d m i n i s t r a c i ó n de e s t e r o i d e s , que i n h i b e n
e l p roceso i n f l a m a t o r i o y l a r e s p u e s t a inmune ( 1 8 ) . Ex t rapo lando es -
t o s h a l l a z g o s con e 1 i n f a r t o d e l m ioca rd io humano, puede proponerse
l a a d m i n i s t r a c i ó n de e s t e r o i d e s con l a p o s i b i l i d a d de que s e d i sm i-
nuya e l p roceso inmune y l a n e c r o s i s en e l t e j i d o c a r d í a c o , p r i n c i -
palmente en a q u e l l o s casos con a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n a c t i v a d o r e s
d e l complemento h e m o l í t i c o y con v a l o r e s subnormales d e l complemen-
t o h e m o l í t i c o s é r i c o . Además en base a e s t o s da tos s e p o d r í a n admi-
n i s t r a r e s t e r o i d e s an a lgunos casos de "angor e s t a b l e " o " i n e s t a - b l e " , que p resen ten l a r e spues ta inmune seña lada . Igua lmente e s t a s
pruebas p o d r í a n e s t a b l e c e r s e como un í n d i c e para e s t a b l e c e r e l i n i -
c i o o l a suspens ión d e l t r a t a m i e n t o e s t e r o i d e o , y obse r va r l a e v o l u -
c i o n de l a s l e s i o n e s . O t ros compuestos a n t i i n f l a m a t o r i o s como e l á -
c i d o a c e t i l s a l i c í l i c o pueden t e n e r e f e c t o b e n e f i c 0 en e l i n f a r t o
d e l m ioca rd io .
Una n e c r o s i s t i s u l a r impor t an te l i b e r a an t í genos n u c l e a r e s c a
paces de p rovoca r una r espues ta autoinmune (18 ) . pe ro l o s a u t o a n t i -
cuerpos produc idos desaparecen a l e l i m i n a r s e e l t e j i d o n e c r ó t i c o .
S e han encontrado con t í t u l o s muy b a j o s en e l 6 .4% de l o s casos de
a
infarto del miocardio ( 1 8 ) .
La presencia de anticuerpos antinucleares en sujetos menores
de 55 años o con títulos elevados después de los 55 años ( 7 ) , plan-
tean las siguientes posibilidades: 1 ) que la destrucción del miocar -
dio por el infarto fue importante y 2) la posible asociación con in -
farto pulmonar o de otros organos (v.gr; el hígado).
En el lupus eritematoso existe un componente genético relacio
nado con la respuesta autoinmune humoral, siendo el más relevante,
la elaboración de anticuerpos antinucleares. En ellos las alteracio -
ne electrocardiográficas podrían deberse a los complejos autoinmu - nes que se depositan principalmente en el endotelio de las arterio-
las del miocardio (9).
En el 8% de los casos se encontró relación entre los anticuer
pos antinucleares y la disminución del complemen o hemolítico, sugL
riendo mabor daño en el miocardio, por lo que en estos casos d.eben
acentuarse los cuidados y ser cautelosos en el pronóstico. Los tras -
tornos del ritmo y de la conducción en los infartos del miocardio
pueden ser atribuidos a lesiones autoinmunes ( 1 2 ) . Experimentalmen-
te al aislarse las fibras de Purkinje, es posible desencadenar tras
tornos electrofisiológicos transitorios que pueden explicar las al-
teraciones de la conducción (21).
El factor reumatoide, anticuerpo contra inmunoglobulinas, de-
terminado por la prueba de latex y la de Waller-Rose ( 9 ) resultó p o
sitivo en el 4 . 8 y 15.3% respectivamente. En estos casos la baja po
9
sitividad del factor reumatoide indica que la presencia de los au-
toanticuerpos contra los antígenos cardíacos parece no deberse a
una anomalía general en el aparato inmunocompetente, sino a un fe-
nómeno dirigido contra el tejido cardíaco. Además se apoya esta a-
severación en la baja frecuencia y en los títulos menores de 1 : 4
de los anticuerpos antinucleares .(18).
Para conocer la respuesta inmune general de los individuos con
infarto del miocardio se determinaron las euglobulinas, gammaglobu -
linas y AEL-O. Las euglobulinas que se correlacionan con la IgM
( I S ) se encontraron elevadas en el 33.8% y el resto presentaron ni -
veles normales. Las gammaglobulinas se elevaron en el 65.6%, indi--
cando una respuesta inmune secundaria iniciada probablemente, dos
o más semanas antes del cuadro clínico del infarto del miocardio.
Es conveniente señalar que la elevación de las euglobulinas y ga- - mmaglobulinas incrementan la viscosidad de la sangre y en vis,ta de
que los sistemas de complemento hemolítico, de l a
la fibrinolisis y de las bradiquininas tienen vías
comunes es posible que en el proceso autoinmune se
fenómenos de trombosis intravascular en.el miocard
oagul ación
de regulac
favorecen
0 (9).
de
ón
os
La respuesta inmune contra los agentes externos en sujetos con
infarto del miocardio, se estableció en la prueba de AEL-O. Solo
en el 9 . 1 % se observó la elevación por arriba de 320 U . Tood que
es el nivel normal para la población en general.
El bajo porcentaje de positividad contra antígenos no relacio
1 0
nados con el corazón (factor reumatoide y anticuerpos antinuclea-
res) así como contra antígenos externos AEL-O) sugieren que e l
aumento de las euglobulinas y gammaglobul nas en los pacientes con
infarto del miocardio. se deben fundamentalmente a l o s anticuerpos
contra el corazón.
Sería conveniente establecer la clase de inmunoglobulinas (ISM
o IgG) autoanticuerpo contra antígenos cardíacos, ya que su deter-
minación permitiría conocer con mayor presición la existencia de
un primer infarto por los anticuerpos anticorazón de la clase ISM,
o bién de su repetición de los anticuerpos anticorazón de la cla-
se IgG ( 9 ) .
La formación de los anticuerpos anticorazón puede ocurrir en
otras entidades clínicas, por lo cual se propone realizar’el análi
sis de sueros de sujetos con procesos patológicos pulmonares y he-
‘páticos para establecer con ellos la especificidad de la relación
contra los antígenos cardíacos.
1 1
B.
.- Con el f
más relevantes
.-. proponen los s
._ r .
.-.
L
c-
. -.
OBJETIVOS.
n d e establecer cuá
en los fenómenos de
guientes objetivos;
o cuales son los autoantígenos
autoinmunidad cardiovascular se
1 ) Separa; por fraccionamiento con sulfato de amonio los an - tígenos solubles de corazón humano.
2 ) Probar por las técnicas de microinmunodifusión, contrain -
munoelectroforesis e inmunoelectroforesis los antígenos fracciona-
dos contra los anticuerpos anticorazón obtenidos experimentalmente.
3) Una vez caracterizados los antígenos cardíacos se enfren-
tan contra sueros humanos de sujetos donadores de sangre, pacientes
con infarto del miocardio, fiebre reumática y otras cardiopatías.
.-
._- ,. I
- I.
1 2
C. J U S T I F I C A C I O N D E L P R O Y E C T O .
Dada la frecuencia de las diversas cardiopatías como causa de
muerte en nuestro país, se requiere enfocar el problema desde diver - cos ángulos, considerando que pudiera existir una participación del
sistema inmune en -la protección o daño cardíaco, los estudios realiza
d o s en la inmunocardiología resultan de gran importancia para enten-
der la etiofisiopatogénia de l q s enfermedades cardiovasculares.
A I C H
A S C H
C I E F
FM C
FMP
I EF RlA
MIR
S,DS
S H
SN .
SS6
SSTE
TEMED
. . 1 3
O . ABREVIATURAS.
A n t í g e n o i n s o l u b l e d e c o r a z ó n humano.
A n t í g e n o s o l u b l e d e c o r a z ó n humano.
Contrainmunoel e c t r o f o r e s i s .
F r a c c i ó n m i t o c o n d r i a l cruda.
F r a c c i ó n m i t o c o n d r i a l pura.
i n m u n o e l e c t r o f o r e s i s .
Mili-amperios.
M,icroinmunodifusiÓn.
D o d e c i l - s u l f a t o d e sodi,o.
S u e r o humano.
Q r b r e n a d a n t e .
Solución sa l i n a d e baratos (sol.uci6n reguladora).
%olw.c1:bn d e s a c a r o s a - t r i s (solution, reguladora).
T e t r a m e t i lieti lamonia.
II. Material y metodos
C-.
. ...
15
A . EXTRACCION DE ANTIGENOS TOTALES DE CORAZON HUMANO.
En el fraccionamiento del corazón humano se obtuvieron dos
partes distintas: Antígenos insolubles de corazón humano (AICH) y
Antígenos solubles de corazón humano (ASCH).
Soluciones empleadas:
a) Soluci6n Salina Borato (SSB) pH 8.4:
Solución reguladora de boratos:
Acido bórico
Tetraborato de sodio
Cloruro de sodio
se aforó a un litro con agua destilada.
La solución de trabajo fué la SSB pH 8 . 4 :
6.18 g
9.35 g
4.38 g
5 partes de solu-
cidn reguladora de boratos y 95 partes de solución salina 0.85% (3)-
PROCEDIMIENTO.
1. Una vez que se obtuvo el corazón humano se procedió a eli-
minar l o s grandes vasos, válvulas cardiacas y tejido graso.
2. El miocardio se fragmentó en porciones de 0.5 cc aproxima-
damente.
3 . Se lavó varias L 6’s con solución SSB pH 8.4 hasta que el
líquido sobrenadante fué claro.
4. Se decantó el exceso d e SSB pH 8.4 y se pesó el miocardio.
\
1 6
5 . S e hornogeneizó en l i c u a d o r a d u r a n t e 5 minutos a l 5 0 % en
SSB pH 8.4.
6 . E l hornogeneizado s e c e n t r i f u g ó a 1 0 O00 rpm d u r a n t e 3 0 m i n
a 4°C.
7 . A l f i n a l i z a r s e obtuvo l a f r a c c i ó n de a n t í g e n o s s o l u b l e s
( s o b r e n a d a n t e ) y l a f r a c c i ó n de a n t í g e n o s i n s o l u b l e s ( p r e c i p i t a d o ) .
8. Los a n t í g e n o s s o l u b l e s de c o r a z ó n humano (ASCH) s e guarda- I
4
ron en a l í c u o t a s y s e c o n g e l a r o n a -20°C.
9 . E l p r e c i p i t a d o s e l a v ó en SSB pH 8.4 y s e c e n t r i f u g ó a
10 O00 rpm d u r a n t e 3 0 m i n u t o s . E s t a o p e r a c i ó n s e r e p i t i ó 3 v e c e s .
10 . S e r e s u s p e n d i ó e l A I C H en SSB pH 8.4 volumen a volumen.
S e guardó en a l í c u o t a s y s e c o n g e l ó a -20°C ( 2 ) . I
i
1 7
c
- *- CUADRO I. OBTENCION DE ANTIGENOS DE CORAZON HUMANO.
Sección del corazón en fragmentos de 5 cc.
I Lavado con SSB pH 8.4 por decantación hasta
que el líquido sobrenadante f u é claro.
Homogeneización del corazón al 50% en SSB pH 8.4
Centrifugación a 1 0 O00 rpm, 30 minutos a 4°C. I
Sobrenadante PreciPitado Antígenos solubles de Lavado con SSB pH 8.4
corazón humano (ASCH). 3 veces, 1 0 O00 rpm,
Determinación de proteína. Antígenos insolubles
Sangrado de conejos. (AICH).
I nmu n i za c i ón .
Sangrado postinmuni-
1 I
30 min. a 4°C.
I I
I I
de corazón humano
zac i ón.
18
B . FRACCIONAMIENTO D E LOS ANTIGENOS S O L U B L E S D E C O R A Z O N
H U M A N O P O R PRECIPITACION C O N SULFATO D E A M O N I O . ,.
1 . S e disolv?Ó s u l f a t o de amonio en
nos s o l u b l e s de c o r a z ó n humano a l 10% ( p e s o / v o
1.a so
m e n )
u c i ó n de a n t g e -
! 2 . Se a g i t ó por 1 0 minutos a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e (20'C). j
3. Se c e n t r i f u g ó a 6 O00 rpm d u r a n t e 1 5 m i n u t o s a 20°C.
4 . E l p r e c i p i t a d o s e r e s u s p e n d i ó con 5 ml de SSB pH 8 . 4 y
se c o n s i d e r ó como l a f r a c c i ó n I de p r o t e í n a s p r e c i p i t a d a s a l 10% d e
s u l f a t o de amonio.
5 . A l s o b r e n a d a n t e s e l e a ñ a d i o s u l f a t o de amonio p a r a 1 1 %
v a r l o a l 20% en l a s o l u c i ó n de ASCH ( p e s o / v o l u m e n ) .
6 . Se r e p i t e n l o s p a s o s a n t e r i o r e s aumentando cada vez 10%
de s u l f a t o de amonio ( p e s o / v o l u m e n ) a l s o b r e n a d a n t e h a s t a o b t e n e r una
f r a c c i ó n VI1 p r e c i p i t a d a con una s a t u r a c i ó n de 7 0 % de s u l f a t o de amo
n i o y u n s o b r e n a d a n t é f i n a l ( S N ) .
7 . Las f r a c c i o n e s ( I a V i i ) y e l
se d i a l i z a r o n c o n t r a SSB pH 8 . 4 h a s t a que
g a t i v a con u n a s o l u c i ó n de c l o r u r o de b a r i o
c l o r h í d r i c o O . 5N.
8 . Se l e s agregf i a z i d a de s o d i o
s o b r e n a d a n t e f i n a l (SN)
é s t a d i 6 una r e a c c i ó n ne-
(BaC12) a l 10% en d c i d o
1 m g / m i ) a l a s f r a c c i o n e s
d e l ASCH p r e c i p i t a d a s con s u l f a t o de a m i n i o y se c o n s e r v a r o n a 4°C.
( F i g . 1 ) .
1 9
CUADRO 11. FRACCIONAMIENTO DE LOS ANTIGENOS SOLUBLES
DE CORAZON HUMANO POR PRECIP ITACION CON
SULFATO DE A M O N I O .
Ant igenos s o l u b l e s de corazón humano,mezcla
Agragar IO% de s u l f a t o de amonio peso/volumen I I 1
A g i t a r La minutos a tempera tura ambiente
C e n t r i f u g a r a 6 000 rpm p o r 15 min. a 20°C. I
r Sobrenadante t 10% s u l f a t o
I Bo tón resuspender con
I de antonio peso/vo?urnen. SSB pt! 8 .4
A g z t a r 19 min. a temp. am- D i a l i z a r c o n t r a SSB pH 8.4 I
b i e n t e .
Centrifugar a 6 QQO rpm,
p o r 15 m i n . a 20'C.
I I
F r a c c i ó n I (pro te ína ' s p r e -
c i p i t a d a s a l 10% de s u l f a t o -
de amonio) .
I I . Sobrenadante + 10% s u l f a t o
(peso/votumen)
Sobrenadante f i n a l [SN) I
Botón . F r a c c i ó n V I 1 t e í n a s p r e c i p i t a d a s de s a t u r a c i ó n de su1
( p r o -
a t o 1 70%
. , i
20
C . OBTENCION DE MITOCONDRIAS Y SUEROS ANTI-MITOCONDRIAS.
Las mitocondrias y l o s sueros anti-mitocondrias de corazón
fueron proporcionados por la Biol. Guillermina García R. (6).
Se obtuvieron mitocondrias de corazón humano por homogeneiza -
cion del tejido con arena purificada y solución reguladora de saca -
rosa 0.25 M, tris 4.9 mM pH 7.4 (SSTE) y centrifugación diferencial
A estas mitocondrias se le denominó "fracción mitocondrial cruda"
(FMC) . En seguida se purificó la fracción mitocondrial cruda por
centrifugación en gradiente discontinuo de sacarosa para obtener
así la "fracción mitocondrial pura" (FRP).
La fracción de gammaglobulinas antimitocondrias fue obtenida
por inmunizaciones en conejos Nueva Zelanda ( Dryctaqus cuniculus) -
!
!
21
CUADRO III. PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE MITOCONDRIAS.
Corazón, a 4°C.
Elimi,naciÓn del tejido conjintivo, grandes vasos y válvulas.
I Corte en trozos de aproximadamente.3 cc.
I Homogeneización con arena y mortero a 4°C.
I I
Resuspención en SSTE pH 7.4.
I Centrifugación a 2 500 rpm, 10 min a 4°C.
I Botón se elimina
- 1 Sobrenadante pH 7.4.
/
I Centrifugación 9 O00 rpm,iO min a 4°C.
I
Botón
Centr
Botón
Centr
I I
se resuspende en SSTE,pH 7.4
fugación 9 000 rpm,lO min a 4°C.
se resuspende en SSTE (FMC).
fugación en gradiente discontinuo
Sobrenadant! s e elimina
I I Sobrenadante se elimina
I de sacarosa (10-50%), 2 horas, 12 500 rpm a 4°C (FMP).
22
D. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA.
1. Preparación de los geles ( 2 2 ) :
Fosfato de sodio 0.2 M con dodecil-sulfato d e sodio (SDS)
al 0.2%. . 12.5 ml
Acrilamida al 40% 4.69 ml
Bisacrilamida al 2% 2.54 ml
Tetrametiletilarnonio (TEMED) 0.03 ml
se agregaron los reactivos en forma sucesiva y con agitación constan
te e inmediatamente se llenaron los tubos de vidrio (7.5 x 0.5 cm.)
con pipeta Pasteur, luego se cubrieron con agua destilada para favo-
recer la polimerización y se dejaron a 2OoC hasta el momento de uti-
lizarlos . 2. Procesamiento de las muestras:
Solución A. Fosfato de sodio 0.1 M pH 7.0 10.0 ml
Dodecil-sulfato de sodio (SDS) 1.0 !l
Beta-mercaptoetanol 1.0 ml
Solución B.
Fosfato de sodio 0.2 M-SOS 0.2% 5.0 ml
Beta-mercaptoetanol . 0.5 ml
Azul d e bromofenol 5.0 ml
Glicerina 5.0 ml
A 90 u1 de los antígenos con una concentración proteíca de 1 mq/ml
se l e s a g r e g ó 10 u 1
m i n u t o s , después s e
se d e j a r o n a 4°C P O
23
de l a s o l u c i ó n A y s e i n c u b a r o n a 56°C p o r 15
es a ñ a d i ó 70 u1 de l a s o l u c i ó n B, se a g i t a r o n y
48 h o r a s .
3. E l e c t r o f o r e s i s .
Se e x t r a j o e l agua d e l a s u p e r f i c i e de l o s g e l e s d e a c r i l a m i -
d a , s e a g r e g a r o n 100 u1 d e l a m u e s t r a t r a t a d a sobre e l ex t r emo supe-
r i o r d e l g e l . Se r e a l i z ó l a e l e c t r o f o r e s i s en una cámara u t i l i z a n d o . una s o l u c i ó n r e g u l a d o r a d e f o s f a t o d e s o d i o 0 . 1 M pH 7 . 0 , s e a p l i c a -
! i
r o n 4 m A po r cada t u b o h a s t a que l a m u e s t r a p e n e t r o a l g e l , p o s t e - r i o r m e n t e s e aumento a 8 m A po r t u b o .
A l f i n a l i z a r l a e l e c t r o f o r e s i s s e e x t r a j o e l g e l , s e m i d i ó e l
f r en te de l c o l o r a n t e , s e c o l o c a r o n en u n a s o l u c i ó n f i j a d o r a d u r a n t e
48 h o r a s
S o l u c i ó n f i j a d o r a :
. Acido t r i c l o r o a c é t i c o 5 7 . 0 g
Acido s u l f o s a l i c í l i c o 1 7 . 0 g
Me t a n o l 150 .0 m l
Agua d e s t i l a d a 350 .0 ml
Se p r o c e d i ó a t e ñ i r con a z u l b r i l l a n t e d e Coomasie d u r a n t e
90 m i n u t o s y s e c o n t r a s t a r o n l a s bandas con s o l u c i ó n d e c o l o r a n t e .
S o l u c i ó n d e c o l o r a n t e :
Metano1 5 0 . 0 m l
Acido a c é t i c o 75 .0 ml
Agua d e s t i l a d a 8 7 5 . 0 ml
24
E. INMUNOELECTROFORESIS.
Se realizó de acuerdo al método de Grabar y Williams ( 8 ) con
ligeras modificaciones.
1 . Solución reguladora de Tris-barbital pH 8.6:
Trisma base
Acido barbitúrico
Barbiturato d e sodio
Azida de sodio
Agua desionizada
2. Placas de agarosa al 0.85%
Agarosa
Solución reguladora de tris-
. barbital 0.02M, pH 8 .6
Azída de sodio
11.56
4.93
18.5
2 .0
2 .0
0.85
50.0
o. 1
ml .
9
Agua destilada 50.0 ml
Se colocaron 3 ml de agarosa fundida por cada portaobjetos y
se dejó gelificar a 2O"C, se guardaron en.cámara húmeda a 4°C duran-
te 24 horas.
La electrofores
ción amortiguadora de
antigen0 en los p o z o s
ca se utilizó azul de
s se real
tr i s- bar b
como ind
bromof eno
zó en una cámara conteniendo s o
tal pH 8.6. Se depositaron 30 u
cador de l a movilidad electrofo
u -
de.
éti-
unido a albúmina sérica bovina, la
25
c u a l se d e j o m i g r a r 1.5 cm h a c i a e l ánodo; po r tach p o r t a o b j e t o s s e
a p l i c a r o n 2.5 mA.
* Pos te r i o rmen te s e c o r t a r o n c a n a l e s de 2 por 65 mm e n t r e l o s PO - zos y s e c o l o c a r o n lOOul de suero , s e incubaron l a s l a m i n i l l a s en cá -
mara húmeda a 20°C po r 78 horas pa ra que s e r e a l i z a r a l a inmunodifu-
s i ó n . En segu ida s e l a v a r o n l a s p l a c a s por t r e s d í a s con SSB pH 8.4
hac iendo dos cambios d i a r i o s . S e d e j a r o n en agua d e s t i l a d a 1 hora y
s e seca ron con pape l f i l t r o a 40°C, s e t i ñ e r o n con a z u l b r i l l a n t e de
Coomasie du ran te 5 minutos .
S o l u c i ó n c o l o r a n t e :
Metanol a l 50% 454. O
Ac ido a c é t i c o 92.0
Agua d e s t i l a d a 454.0'
Azul b r i l l a n t e de Coomasie 1.25
S e c o n t r a s t a r o n l a s bandas con s o l u c i ó n d e c o l o r a n t e .
S o l u c i ó n deco lo ran te :
Ac ido a c é t i c o 5b.O
Metanol 50.0
G 1 i c e r o l 10.0
Agua d e s t i l a d a 890. O
F i na lmen te se seca ron a 40°C.
m l
m l
m l
9
m l
m l
m l
m l
2 6
F. C O N T R A I N M U N O E L E C T R O F O R E S I S .
1. S o l u c í ó n r e g u l a d o r a de b a r b i t a l s ó d i c o pH 8 . 6 :
. B a r b i t a l s ó d i c o 1 8 . 0 g
Ac ido c l o r h í d r i c o 1N 1 3 . 0 ml
Azida de s o d i o 1 . 0 g
Agua d e s i o n i z a d a a 2 0 0 0 . 0 m l
2 . P l a c a s de a g a r o s a a l 0 . 6 % :
Agarosa 0 . 6 g
Sol. r e g u l a d o r a de b a r b i t a l pH 8 . 6 5 0 . 0 ml
Agua d e s t i l a d a 5 0 . 0 m l
Azida de s o d i o 0 . 1 g
P o r c a d a l a m i n i l l a s e c o l o c a r o n 3 ml de a g a r o s a f u n d i d a , se
d e j ó g e l i f i c a r a 20°C y s e guardaron a 4°C por 2 4 h o r a s en cámara h Ú - meda.
E n cada pozo de l a l a m i n i l l a s e c o l o c a r o n 10 u1 d e l a n t í g e n o
e n f r e n t a n d o l o con 10 u 1 de s u e r o . La e l e c t r o f o r e s i s s e r e a l i z ó en
una cámara con s o l u c i ó n r e g u l a d o r a de b a r b i t a l pH 8 . 6 y a p l i c a n d o
2 . 5 mA por l a m i n i l l a . S e u t i l i z ó como i n d i c a d o r de m i g r a c i ó n a z u l
de bromofenol -a lbúmina s é r i c a , b o v i n a , d e j a n d o l o c o r r e r 1 . 5 cm h a c i a
e l ánodo.
S e i n c u b ó en cámara húmeda a 20°C d u r a n t e 72 h o r a s . Se l a v ó
con SSB pH 8 . 4 por t r e s d í a s h a c i e n d o dos cambios d i a r i o s a 4°C. S e
27
d e j a r o n e n a g u a d e s t i l a d a por 1 h o r a y s e s e c a r o n c o n papel f i l t r o a
4 O O C . Se t i ñ e r o n por 5 m i n u t o s c o n azul b r i l l a n t e d e C o o m a s i e y s e
c o n t r a s t a r o n c o n s o l u c i d n decolorante.
.-.
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28
6 . MICRODOBLEINMUNODIFUSION.
1 . P r e p a r a c i ó n d e l a g a r a l 1 . 5 % :
Agar 1 . 5 g
S o l u c i ó n s a l i n a - b o r a t o (SSB) pH 8 . 4 100.0 .ml
Azida de s o d i o 0 . 1 g
Se funde e l a g a r en baño María a e b u l l i c i ó n .
2 . S e montan l o s moldes de l u c i t a c o b r e p o r t a o b j e t o s en una me-
s a n i v e l a d a y s e v a c i a e l a g a r y s e d e j a g e l i f i c a r a t e m p e r a t u r a am-
b i e n t é . p o r 30 m i n u t o s .
3. S e guardan en cámara humeda a 4 ° C d u r a n t e 24 h o r a s .
4 . Para r e a l i z a r l a prueba de inmunodi fus ión s e e x t r a e e l a g a r
de los pozos y s e c o l o c a n 50 u 1 de a n t i g e n 0 y a n t i c u e r p o en l o s pozos
c o r r e s p o n d i e n t e s .
5. S e d e j a d i f u n d i r d u r a n t e 5 d í a s a 20°C en cámara húmeda.
6 . Se l a v a con SSB pH 8 . 4 a 4 0 C h a c i e n d o dos cambios a l d í a d u -
r a n t e t r e s d í a s .
7 . Se t l ñ e con A z u l de Coomasie por 5 minutos y
8 . S e c o n t r a s t a con s o l u c i ó n d e c o l o r a n t e de á c i d o a c é t i c o y me-
tano l .
I I I. Resultados
30
A. OBTENCION DE LAS FRACCIONES DEL ANTIGEN0 SOLUBLE DE
CORAZON HUMANO.
Se consideró como ASCH al sobrenadante obtenido de una centrifl
gación a 10,000 rpm por 30 minutos de un homogenizado de corazón h u -
mano, mientras que el AICH correspondió al botón.
De la ragmentación del ASCH con sulfato de amonio a concentra-
ciones crec entes se obtuvieron 7 fracciones ( I - V I I ) y un sobrenadac
te final(SN . La tabla I muestra el volúmen final, la concentración
de proteína determinada por el método de Lowry para cada fracción,
así como la cantidad de proteína final, en miligramos, para cada una.
Se puede apreciar que las fracciones I, 11, 111, y I V que correspon-
den a las proteínas precipitadas a una saturación del 10, 20, 30 y
40 por ciento respectivamente, presentarón una elevada Concentración
de proteína y de éstas destaca la fracción I11 con la mayor cantidad
de proteína por volúmen (32.75 mg/ml), mientras que las proteínas prg
-cipitadas al 70% de saturación y el SN final presentaron concentracig
nes bajas de proteína.
E l volúmen inicial d e la solución de ASCH fué de 190 ml con una
concentración de proteína de 5.3 mg/ml, lo que equivale a 1007 mg de
protefna total. Al final del tratamiento con sulfato de amonio se r e
cuperaron 762.19 mg, lo que implica u n rendimiento del 75.7% en cuan
t o a proteína se refiere.
I I I
I
31
TABLA I. Concentración de proteína de l a s fracciones de
antígknos solubles de corazón humano precipita -
das con sulfato de amonio.
** Fracción Volumen ( m i ) Proteína*(mg/mi) Proteína total ( m g )
I
I 1
11.1
I V
. v V I
V I I
s E4
5.3
8.1
7.8
6.5
26.0
7.5
35.5
243.0
10.9
23.5
32.75
14.15
5.62
0.64
O. 38
0.0096
57.77
190.35
255.45
91.97
146.12
4.80
13.49
2.24
Total 339.7 762.19
* Cuantificación de proteína por el método de Lowry.
Concentración inicial del ASCH total= 1007mg/190ml. **
3 2
Una vez que se cuantificó proteína en cada una d e las fracciones
se ajustaron las concentraciones a 1 2 mg/ml. Siendo necesario para ello,
en el caso de las fracciones 11, 111 y IV agregar SSB pH 8 . 4 y para el
resto :e concentró por centrifugación a través de membranas de Amicón
(CF-50A) a 1500 rpm.
B. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA.
La tabla I 1 muestra el número de bandas obtenidas por electrofore -
sic en gel de acrilamida con SDS, reveladas con azul brillante de Cooma -
sie, para l o s antígenos solubles totales (ASCH) y sus fracciones. (Fiq.2)
Se hicieron pasar electroforeticamente a travPs del gel de acri -
lamida muestras de 52 ug de proteína para cada fracclón. Las fraccio.
nes 1 1 , V I y VI1 del ASCH presentaron 12 bandas, en las fracciones I11
y V se observaron 1 1 bandas en cada una, las fracciones I y IV presenta - ron 9 y 8 bandas respectivamente, mientras que en el gel donde se pro-
bó el sobrenadante ( S N ) no se detectó ninguna banda.
C. CARACTERIZACION INMUNOSEROLOGICA.
Con el fin de establecer un patrón inmunológico de los antígenos
cardiacos, éstos se e'nfrentaron contra diversos antisueros.
La tabla I11 muestra el promedio de sistemas antígeno-anticuerpo
que se observaron por MID de la mezcla de ASCH y sus fracciones con di - versos antisueros obtenidos experimentalmente en conejos. En esta tabla I
* T i n c i ó n c o n
A n t í g e n o s s **
33
1 .¡ I
d o d e c i l s u l f a t o d e sodio. I
T A B L A 1 1 . A n á l i s i s c u a l i t a t i v o d e l a s f r a c c i o n e s c a r d i a c a s p o r e l e c t r o f o r e s i s en gel de p o l i a c r i l a m i d a c o n
F r a c c i ó n N ú m e r o d e bandas obtenidas"
ASCH** 1 1
I*** 9 I 1 1 2
I 1 1 1 1
I V V
V I
V I I
S N
8
1 2
1 1 1 2
O
a z u
1 ub
b r i l l a n t e
e s d e C o r a
d e Coomasie.
6 n h u m a n o t o t a l e I .
*** F r a c c i o n e s del A S C H o b t e n i d a s por p r e c i p i t a c i ó n c o n sulfato.
r- Fig 2. E s q u e m a d e l a s b a n d a s r e s u l t a n t e s d e l a e l e c t r o f o r e s i s en gel d e p o l i a c r i l a m i d a ( P A G E ) t e ñ i d a s c o n azul h r i l l a n t e d e Coomasie. S e m u e s t r a c a d a f r a c c i ó n del ASCI! c o n el n ú m e r o d e b a n d a s c o r r e s p o n d i e n t e , e x c e p t o para el SN d o n d e n o s e
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se aprecia que los ASCH totales y sus fracciones presentan, en general,
tanta o mayor reactividad contra el suero anti-AICH que con el suero ho - mólogo y que el SN no presenta reacción positiva con ninguno de estos
dos ailtisueros (Fig3 ) ! Existe además, una alta incidencia de antigenos
que son reconocidos por el antisuero humano y que estan presentes en t o
das las fracciones incluso en el SN y especialmente en la fracción 111,
en donde se detectan entre 5 y 7 bandas en las diversas pruebas realiza -
das por MID y siendo el promedio de 6.
Con fines comparativos se probó también con suero antisarcolema
de corazón humano (2), el resultado del enfrentamiento de este antisue
ro con el ASCH dió un promedio de 4.2 bandas.
Por otro lado, la mayor reactividad para el suero antisarcolema
la tiene la fracción I precipitada con 10% de sulfato de amonio, mien-
tras que con la fracción que correspodió al sobrenadante no se apreció
ninguna banda de identidad. Y al enfrentar los antígenos cardíacos con
suero antigamma globulina humano se detectó un promedio de 3.5 bandas
para el ASCH completo y en las’fracciones I, 1 1 , I 1 1 y I V se obtuvieron
2, 4, 3 y 3 bandas en promedio,respectivamente. El resto de las fraccio
nes no presentó reacción con el antisuero humano.
En la tabla IV se reporta los resusltados del enfrentamiento de
los antígenos en estudio con la misma serie de antisueros por CIEF, en
donde se aprecia que algunas fracciones, comparativamente con la MID.
ya no tuvieron reacción positiva, por ejemplo, las fracciones V y VI1 al probarse con el antisuero contra ASCH; las fracciones V I y V I 1 con-
tra el AICH o la fracción VI contra el suero antisarcolema y el antiga
mmaglobulina humano y por CIEF se detecta la reacción entre el SN Y el
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F i g 3. M i c r o i n m u n o d i f u s i ó n (MID) r e p r e s e n t a t i v a . Pozos c e n t r a l e s = a n t i s u e r o c o n t r a a n t í g e n o s s o l u b l e s d e c o r a z ó n (anti-ASCH). 1 . f r a c c i ó n I del A S C H ; 2) f r a c c i ó n 11; 3) f r a c c i ó n 1 1 1 ; 4 I f r a c c i ó n I V ; 5) f r a c c i ó n V ; 6) f r a c c i ó n V I ; 7 ) f r a c c i ó n V I I ; 8) S N ; 9 ) A S C H total.
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39
antisuero de sarcolema humano, lo cual no ocurrio por HID.
En cuanto a l o s resultados obtenidos por medio d e la prueba de
inmunoelectroforesis (IEF) y como l o muestra la tabla V, las frac:-
ciones del ASCH presentan un qrado de positividad mayor que el obser -
vado en la CIEF e incluso que en la MID, lleoando a haber promedios
de bandas-de 5.7, como en el caso de la fracción V contra el anti-
suero contra l o s ASCH, sin embarqo este elevado ranqo de positividad
solo se observa en este caso, contra el antisuero homolooo, mientras
que en el resto de-los antisueros lleaa a haber menos
D. ANTICUERPOS CONTRA FRACCIONES CARDIACAS CARDIOPATAS.
reacción.
EN PACIENTES
CARACTERISTICAS CLINICAS DE PCBLACION ESTUDIADA.
Se realizó un estudio para conocer y evaluar la incidencia de
anticuerpos contra las fracciones precipitadas del ASCK con diferen -
tes porcentajes de saturación de sulfato de amonio con una población
de 60 individuos clasificados en 7 qrupos de acuerdo alsdiannóstico
clínico en: pacientes con infarto agudo del miocardio, ateroesclero-
sis e insuficiencia coronaria, miocardiopatía, cardiopatía conqéni - ta, otros padecimientos y personas aparentemente sanas en el momen-
to de la prueba. (Tabla VI).
Aunque los grupos estudiados son pequeños vale la pena resaltar
que la distribución por sexo es similar en el infarto del miocardio
y miocardiopatía, pero es variable en l o s otros qrupos. En relación
.
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TABLA VI. C a r a c t e r i s t i c a s c l í n i c a s d e l a p o b l a c i ó n estudiada.
Diagnóstico. *
S e x o ( % ) E d a d + p r o m e d i o M ( - d.e.) P a c i e n t e s
i n f a r t o a g u d o del 8 50.0 50.0 69.6 '!' 11.95
miocardio.
I n s u f i c i e n c i a c o r o n a r í a 26 34.6 65.4 65 .2 2 10.17
y ateroesclerosis.
M i o c a r d i o p a t í a . 4 50 .0 50.0 37.7 17 .01
C a r d i o p a t í a r e u m á t i c a 7 85.7 14.3 42.8 11.79
C a r d i o p a t í a c o n g é n i t a 6 33.3 66.6 15.5 2 2 1
O t r o s p a d e c i m i e n t o s 3 66.6 33.3 44.0 2 7.0
S a n o s 2 100 O 34.5 2 2.12
* + Edad p r o m e d i o - d e s v i a c i 6 n e s t a n d a r .
4 2
a la edad, en general, el promedio es mayor a 30 años, excepto en el
grupo de cardiopatías congénitas donde fué de 1 5 aRos, pero con una
desviación estandard grande.
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'ESTUDIO SEROLOGIC0
Los resultados de
sueros de pacientes por
tabla VII. El número de
1.36, lo cual apoya
I
DE LA POBLACION.
a prueba de las fracciones cardíacas con los
doblemicroinmunodifusión se muestran en la
sistemas antíqenos-anticuerpo fue en prome-
que probablemente los autoantíqenos cardia-
son pocos y que la reactividad fue menor en las fracciones V I ,
y el SN.
En cuanto a la CIEF se encontró menor actividad de l o s sueros de
entes contra éstas fracciones cardiacas, especialmente la IV, V,
VI1 y e}. SN. Los sueros positivos tuvieron en general de 1 a 2
emas antígeno-anticuerpo, es decir bandas (Tabla VII). '
Cuando se utilizó la IEF los resultados positivos fueron esca - - y con el suero de algunos pacientes practicamente no se encontró
positividad (Tabla I X ) .
Por MID se necontró que, en general, hay un mayor porcentaje
d e positividad entre los'sueros de los individuos cardiopatas contra
l o s ASCH totales y las fracciones obtenidas con sulfato de amonio
al 10% (fracción I ) y al 4 0 % (fracción IV).de saturación. Se obser-
VÓ una tendencia similar en todos los qrupos estudiados (Fig 4 ) .
Usando C I E F e IEF l o s resultados fueron similares. La diferencia c o n
sistió fundamentalmente en los valores porcentuales de nositividad.
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, Porcentajes de pacientes con anticuerpos ar icorazón. Porcentaje de p o s i t i vidad para cada fracción del PSCtt ( I - V I 1 y SN) en los diferentes qrupos de pacientes: in fa r to agudo del miocardio; ateroesclerosis; mi?
cardiopatía ; cardiopatía reumática; cardiooatía congénita y
sanos.
IV. Conclusiones
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- Los antisueros e troles positivos
nientes de indiv duos cardiopatas o
aborados en conejos fueron Útiles como con-
para compararlos con los anticuerpos prove-
sanos. Así como para es-
nas séricas de las diver -
genos solubles de corazón.
de diferentes antíqenos
tablecer la contaminación con prote
sas fracciones obtenidas de los ant
- Los resultados señalan la presencia
en los precipitados así como la presencia de distintas espe-
cificidades de los anticuerpos de los grupos de pacientes es-
tudiados y que hay contaminantes séricos en las fracciones.
- A pesav de ser pequeña la muestra de pacientes se puede apre - ciar que aquellos con fiebre reumática presentan anticuerpos
contra todas las fracciones incluso contra el sobrenadante.
- La técnica más sensible y adecuada para este tipo de estudios
resultó ser la microinmunodifusión ( K I D ) .
V. Resumen
4 9
RESUMEN
Previamente habíamos demostrado la presencia de anticuerpos con - tra un extracto crudo de corazón humano en pacientes cardiopatas.
Con el fin de iniciar la caracterización de l o s antíqenos existentes
en el extracto d e corazón se fraccionó a este orecipitándolo con con-
centraciones crecientes de sulfato d e amonio. F1 análisis por elec--
troforesis en acrilamida reveló de 8 a 1 2 componentes proteicos y en I el sobrenadante final no se demostró ninquna proteína. Cada fracción
se analizó por microdoble inmunodifusión frente a los sueros de 34
pacientes con infarto del miocardio ( IFI ) , 4 con miocardiopat a (MC),
6 con cardiopatía congénita (CC) y 7 con cardiopatía reumát ca (CRI
Los porcentajes de positividad fueron l o s sipuientes: ._
% d e sulfato de amonio 10 2 0 30 40 5 0 60 7 0 S N Sueros
IM 61 58 4 1 5 2 4 4 13 5 0 MC 7 5 5 0 25 5 0 25 O O 0 CR 7 1 4 2 4 2 57 4 2 1 4 1 4 14 cc 4 0 16 33 1 6 16 O O 0
En todas las fracciones se demostró la presencia de antíaenos al hacerlos reaccionar previamente frente a un suero hiperinmune con tra e l extracto crudo, incluyendose el sobrenadante (SEI) que f ué el que menor porcentaje de positividad presentó frente a l o s sueros de
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*-. pacientes. Los r e s u l t a d o s i n d i c a n l a presencia d e d i f e r e n t e s a n t í g e - ..- n o s e n l o s d i f e r e n t e s p r e c i p i t a d o s c o n d i f e r e n t e s a n t i c u e r D o s e n l o s
4 g r u p o s d e p a c i e n t e s e s t u d i a d o s . En e s t u d i o s f u t u r o s s e a n a l i z a r á
el SN, y a q u e f u é l a Ú n i c a f r a c c i ó n q u e r e a c c i o n ó c o n l o s p a c i e n t e s
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VI. Bibliografia
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