Str Base

Blgo. Cusihuallpa Auccatinco, Walter

Repeticiones cortas en tándem

Términos y problemas del ADNSe define los términos y tecnologías del ADN que se usan en aplicaciones forenses. También aborda asuntos científicos, de evidencia y otros de tipo legal que surgen como resultado de los usos ampliados de las pruebas de ADN y los bancos de datos de AD

¿Qué es el ADN?¿Qué es el ADN?

El ADN se llama El ADN se llama en ocasiones un en ocasiones un plano genético ya plano genético ya que contiene todas que contiene todas las instrucciones las instrucciones que determinan las que determinan las características características genéticas de un genéticas de un individuo.individuo.

¿Dónde se encuentra el ADN?El ADN de una persona es el mismo en la sangre, la saliva, los tejidos, el cabello, el semen y otros materiales biológicos. Los materiales biológicos pueden estar presentes el escenario de un delito aunque no se puedan ver a simple vista.

                  Estructura del ADN                                  El ADN está formado por cuatro elementos fundamentales llamados bases. Los elementos fundamentales son: Citosina, Guanina, Timina, Adenina.Éstas se conocen comúnmente comoC, G, T, A.Es el orden (secuencia) de estos elementos fundamentales lo que determina las características genéticas de cada persona.

Reglas del ADNEl alfabeto de cuatro letras del ADN de C, G, T y A siempre sigue ciertas reglas. Las bases sólo se pueden emparejar de modo específico: C sólo se enlaza con G y T sólo se enlaza con A. C-G G-C T-A A-T La combinación específica de estas bases mediante enlaces químicos se conoce como apareamiento de bases.

                  

Apareamiento de basesTodo el ADN de una célula se llama genoma. El genoma humano tiene aproximadamente 3 mil millones de pares de bases. Dado que puede haber billones de combinaciones de pares de bases, los científicos pueden informar de modo confiable acerca de los análisis de ADN. Es el orden específico (secuencia) de estas combinaciones de pares de bases lo que determina la individualidad genética de cada persona.

Regiones codificantes contra no codificantes El ADN tiene regiones codificantes y no codificantes. Las regiones codificantes son responsables de fabricar las proteínas y con frecuencia se llaman genes. Las regiones no codificantes son esas piezas de ADN entre las regiones codificantes que no fabrican ninguna proteína conocida.Aproximadamente el 95% del ADN de una persona está compuesto de ADN no codificante que en ocasiones se llama "ADN basura" porque no codifica ninguna característica física o proteína. El nombre "basura" no implica falta de confiabilidad para las pruebas de identificación.

a) ADN cromosómico (genómico): ADN repetido en tandem o VNTR (acrónimo inglés por Variable Number of Tandem Repeats), que puede ser: - Minisatélite o MVR (minisatellite variant repeats): secuencia de unas 30 pb (pares de bases). - Microsatélite o STR (short tandem repeats): secuencia de 2 a 6 pb, normalmente 4. Por ejemplo, la secuencia ACTTACTTACTT ... ACTT puede aparecer repetida 8 veces en un locus y 12 veces en otro locus. Así, un individuo puede ser homocigoto 8-8, heterocigoto 8-12 u homocigoto 12-12.

b)ADN mitocondrial (ADN mt): Presenta herencia materna y es más estable que el ADN cromosómico. Se suelen analizar dos regiones hipervariables del “lazo D”.

c)Polimorfismo del cromosoma Y: Se analizan microsatélites (STRs) y el polimorfismo de nucleótidos simples (SNPs).

¿QUÉ ADN SE ANALIZA?

                                 

PolimorfismoEl 99.9% de todo el ADN es el mismo entre los humanos. Los científicos usan una pequeña porción del 0.1% restante para las pruebas de ADN debido a su gran variabilidad entre la gente. Esta variabilidad se llama polimorfismo.  

Biología básica de las pruebas forenses de identidad de ADN

                                                       

Marcadores de ADN"Marcador de ADN" se refiere a una ubicación cromosómica específica que se analiza en el laboratorio forense de ADN.          

Biología básica de las pruebas forenses de identidad de ADN

STR (repeticiones cortas en tándem)Mientras que la historia de las pruebas forenses de identidad humana de ADN datan de 1985, los marcadores de ADN más extensamente usados se definen por sus características de 'Repeticiones cortas en tándem' (STR) en el cromosoma.                  

Repeticiones cortas en tándem (STRs) son secuencias de ADN que tienen 2 a 6 pares base de largo. El número de repeticiones en los marcadores STR es altamente variable entre los individuos, lo que hace a los STRs útiles en la identificación humana. Los STRs son usados para crear los perfiles genéticos que ayudan a identificar criminales, probar paternidad y otras relaciones familiares, e identificar restos encontrados en áreas de desastre.

Varios tipos de STR se pueden analizar en una prueba o multiplicados , haciendo el proceso del análisis más rápido que las tecnologías anteriores.Los STR multiplicados son muy valiosos porque pueden producir resultados que son muy confiables para identificación, incluso con muestras biológicas antiguas o muy pequeñas

Este método examina una subclase de regiones VNTR de la molécula de ADN que tienden a repetirse en segmentos cortos, adyacentes o en tándem . La tecnología STR puede usar pequeñas cantidades de ADN parcialmente degradado y tiene un muy alto nivel de distinción fina.Los STR 'Multiplex' son grupos de marcadores STR genéticamente independientes que se pueden examinar al mismo tiempo. Estos multiplexes han demostrado ser muy exitosos y proporcionan la base de las entradas de bases de datos de ADN locales, estatales y nacionales.

Historia y desarrollo del análisis forense de ADNTipificación de ADN: solicitud de tándems cortosLas pruebas de ADN de vanguardia tecnológica utilizan la tecnología de repeticiones cortas en tándem (STR), que combina las mejores funciones de RFLP y PCR.

En este ejemplo, la repetición de cuatro bases es ATGC:

GATTCATGCATGCATCGACCATA

                                                             

Detección del ADN: KitsTodos estos kits se han diseñado para permitir el análisis de 13 loci claves del sistema de índice de ADN combinado (CODIS), que constan de un conjunto de 13 marcadores de STR que se han adoptado a nivel nacional para efectos forenses. CODIS se refiere a la Base de datos de ADN nacional, que es un depósito de perfiles de ADN de delincuentes convictos, muestras de escenas del crimen y personas extraviadas, y en el que se pueden realizar búsquedas. Acceda a información sobre CODIS en http://www.fbi.gov/hq/lab/html/codis1.htm.

¿Qué son los 13 loci principales del CODIS?

En 1997, el FBI anunció la selección de 13 loci STR que formarían el núcleo central de la base de datos nacional de los EE.UU., llamada CODIS. Todos los STR del CODIS son secuencias repetitivas tetraméricas. Todos los laboratorios forenses o criminalísticos que usan el sistema CODIS pueden contribuir a una base de datos nacional. Los analistas de ADN como Bob Blackett pueden también buscar coincidencias entre el perfil de ADN de pruebas obtenidas en la escena de un crimen y los perfiles de ADN ya disponibles en la base de datos.

El FBI (Federal Bureau of Investigation, Oficina Federal de Investigación de los Estados Unidos) ha sido un líder en el desarrollo de tecnología de tipificación de ADN para su uso en la identificación de autores de delitos violentos.

Hay muchas ventajas en el sistema STR de CODIS: El sistema CODIS ha sido adoptado por numerosos analistas de ADN forense. Los alelos STR se pueden determinar con rapidez empleando ensayos comerciales (kits).  Los alelos STR son discretos (es decir, de número reducido) y se comportan según los principios establecidos de genética de poblaciones. Los datos son digitales y, por tanto, adecuados para las bases de datos informatizadas.  Laboratorios de todo el mundo están contribuyendo al análisis de frecuenica de alelos STR en distintas poblaciones humanas.  Los perfiles STR se pueden determinar a partir de cantidades muy pequeñas de ADN.

                                                                           Acceda a la información sobre CODIS en http://www.fbi.gov/hq/lab/html/codis1.htm.

Biología básica de las pruebas forenses de identidad de ADNMarcadores STRSe llevó a cabo una investigación para seleccionar marcadores de ADN de las regiones polimórficas (variables) no codificantes del genoma humano con objeto de realizar las pruebas forenses de identidad. En los Estados Unidos, la Base de datos nacional de ADN (CODIS) requiere el uso de 13 marcadores STR:

                             •Dientes •Botellas de agua •Guantes •Aretes •Relojes •Peines •Anteojos •Marcas de mordidas •Condones •Cepillos de dientes •Chicle mascado •Palillos •Pañuelos desechables usados •Estampillas y sobres que se han lamido •Sombreros o cintas de pelo •Botellas o latas •Colillas •Ropa

Fuentes potenciales de pruebas de ADNHay fuentes potenciales de pruebas de ADN cuando hay material biológico que entra en contacto con objetos. Algunos ejemplos de objetos en los que se puede encontrar ADN son:

1. Extracción del ADN Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Para los ensayos de paternidad lo más habitual es usar células bucales del interior de la mejilla. Otras fuentes de ADN procedente de la escena de un delito pueden ser sangre, semen, tejido de una víctima mortal, células del folículo capilar o incluso saliva. El ADN extraído de las pruebas policiales se comparará con el ADN extraído de muestras de referencia, de individuos conocidos. 

Métodos para el análisis de los 13 loci STR del CODIS

2. Amplificación por PCR Los cebadores de ADN se han optimizado para permitir la amplificación de múltiples loci STR en una sola mezcla de reacción. Ajustando cuidadosamente la distancia desde los cebadores hasta la secuencia tetramérica repetitiva, los productos de diferentes loci no se solaparán durante la electroforesis en gel.

En los resultados parciales que se muestran arriba, se están analizando al mismo tiempo los tres STR (D3S1358, vWA y FGA). Las longitudes de los ADN amplificados se muestran mediante la escala de 100 a 320 pb de la parte superior de la figura. El área central, con múltiples picos, corresponde a patrones de referencia que contienen los alelos conocidos para cada locus STR. Observe que los alelos de los tres loci diferentes no se solapan. El área inferior muestra los alelos de la madre de Bob Blackett, Nuria, para los loci D3S1358, vWA y FGA. Los alelos de Nuria se han comparado con los patrones de referencias mediante ordenador y están rotulados. La interpretación de este resultado indica que el genotipo de Nuria es (15,15) en el locus D3S1358, (14,16) en el vWA y (24,25) en el FGA

Tras la reacción de PCR, se añaden a la mezcla de reacción patrones de longitud de ADN internos y se separan los ADN según su longitud en un aparato de electroforesis capilar. Los picos de ADN se van detectando según salen del gel, mediante activación por láser. Los aparatos de secunciación que se usan para separar los alelos y detectarlos son del mismo tipo que los que se usan actualmente en el Proyecto de Secuenciación del Genoma Humano, con una salida de datos digital que se puede analizar mediante programas de ordenador específicos.

3. Detección de los ADN tras la amplificación por PCR  Los cebadores de PCR en los preparados comerciales (kits) empleados para el análisis de STR tienen moléculas fluorescentes unidas de forma covalente al cebador. Para ampliar el número de loci diferentes que se pueden analizar en una sola reacción de PCR, se usan múltiples conjuntos de cebadores con marcadores fluorescentes de diferente "color".

El PCR es un proceso en tres pasos:1.Extracción

2.Amplificación 3.Detección

                                                                      

                                                                                

                                                                                                                                       

                       

El producto comercial que utiliza Bob Blackett para la amplificación por PCR se denomina AmpFLSTR™ Profiler Plus™ PCR Amplification Kit, de la casa Applied Biosystems. En él se analizan nueve STR empleando tres conjuntos de cebadores, cada uno con un marcador fluorescente de distinto color. En la figura de arriba se representan los picos de fluorescencia azul obtenidos para 3 de los STR, fluorescencia verde para otros 3 y fluorescencia amarilla (mostrado en negro) para otros 3. Los picos en rojo son los patrones de tamaño de ADN. Mediante un programa de ordenador específico se muestran los diferentes colores en secciones separadas de datos y se determina la longitud exacta de los ADN. Un décimo marcador, denominado AMEL, se usa para diferenciar el ADN de los varones (X, Y) y de las mujeres (X, X).

MUCHAS GRACIAS

Blgo. Cusihuallpa Auccatinco, Walter