úsqueda computacional de inhibidores de la bomba de

Búsqueda computacional de inhibidores de la bomba de expulsión

MtrCDE de Neisseria gonorrhoeae

Manuel José Ruiz Munevar

Director: Dr. Gian Pietro Miscione Codirector: Dr. Alejandro Reyes Muñoz

Trabajo de tesis presentado para el grado de Microbiólogo

Departamento de Ciencias Biológicas

Facultad de Ciencias Universidad de los Andes

Colombia

Mayo, 2018

i

Abstract

Neisseria gonorrhoeae is the etiologic agent of the sexually transmitted infection gonorrhea.

Current treatments are composed, mainly, of azithromycin and ceftriaxone, but recently

azithromycin resistant isolates have been found. This resistance is due to the overexpression of

the MtrCDE efflux pump, which made it an important druggable target so that azithromycin’s

efficacy could be restored. We conducted virtual screenings (VS) targeting MtrD’s proximal and

distal binding sites, on molecular dynamics (MD)-generated conformations. The VS was

performed with the Asinex Elite Library, using different docking scoring functions. Potential

inhibitors were found that could lock the protein’s conformation, preventing extrusion and

further binding of the pump’s substrates. This occurs through interactions with a hydrophobic

trap and a GLY-rich loop, important characteristics of inhibition in a similar pump. Further

analyses are required to assess inhibition efficacy of the compounds found, but the results

obtained are encouraging thanks to the interactions with the GLY-rich loop and the hydrophobic

trap.

ii

Resumen

Neisseria gonorrhoeae es el agente etiológico de la infección de transmisión sexual gonorrea.

Los tratamientos actuales están compuestos, principalmente, por azitromicina y ceftriaxona, pero

recientemente aislamientos resistentes a la azitromicina han sido encontrados. Esta resistencia ha

sido asociada a la sobreexpresión de la bomba de expulsión MtrCDE, de forma que esta proteína

se convirtió en un objetivo farmacológico importante para restaurar la eficacia de la azitromicina.

Se llevaron a cabo tamizajes in silico sobre el bolsillo distal y bolsillo próximo de MtrD, a partir

de conformaciones generadas por dinámicas moleculares. El tamizaje in silico se realizó con la

librería Elite de Asinex, utilizando diferentes funciones de puntuación de docking. Se

encontraron potenciales inhibidores, que podrían bloquear la conformación de la proteína,

previniendo la extrusión de estos y evitando la unión de sustratos de la bomba. Esto ocurre a

través de interacciones con una trampa hidrofóbica y con un loop rico en glicina, características

importantes de la inhibición de una bomba de expulsión similar. Análisis experimentales son

necesarios para evaluar la eficiencia de inhibición de los compuestos encontrados, pero los

resultados encontrados son alentadores gracias a las interacciones con la trampa hidrofóbica y el

loop rico en glicina.

iii

Agradecimientos

Madre y Padre, gracias por todo el apoyo, consejos y ayuda que me dieron durante toda la

carrera. Nada de esto hubiera sido posible sin ustedes. Infinitas gracias por todo!

Dr. Gian Pietro Miscione, infinitas gracias por todo el apoyo en los últimos dos años. Gracias por

darme la oportunidad de trabajar en el COBO y darme todas las herramientas para aprender de

Química Computacional. Gracias por toda la confianza para poder desarrollarme como

investigador. Gracias por todas las oportunidades y puertas que me abriste.

Dr. Alejandro Reyes Muñoz, infinitas gracias por abrirme la puerta al mundo académico en

segundo semestre y por el apoyo para entregar la tesis. También, muchas gracias por dictar la

clase que me cambió la vida (Biología Celular) y que me puso en este rumbo.

Dorian Armando Acevedo, gracias por todos los consejos y apoyo durante el desarrollo de la

tesis. Gracias por toda la ayuda con las partes más químicas y por todas las horas que invertimos

en aprender como usar bien todas las herramientas.

Sebastián Franco Ulloa, gracias por enseñarme como usar Schrödinger y a hacer dinámicas

moleculares con GROMACS. Gracias por la paciencia en resolver mis dudas y por todo el apoyo

en la etapa final de la tesis.

Santiago Movilla y Luis Castañeda, gracias por siempre atender mis dudas y por estar pendientes

durante el desarrollo de la tesis. Gracias por el buen ambiente de trabajo y por todos los buenos

momentos.

Jonathan Hurtado y Andrés Ballesteros, gracias por la constante ayuda y apoyo con todos los

problemas con los que me enfrenté.

COBO, sin ustedes esta experiencia, indudablemente, no hubiera sido tan productiva y

disfrutable. Gracias por todo el aprendizaje!

iv

Contenido

Abstract ............................................................................................................................................ i

Resumen .......................................................................................................................................... ii

Agradecimientos ............................................................................................................................ iii

1. Introducción ................................................................................................................................ 1

2. Métodos....................................................................................................................................... 7

2.1 Simulación de docking .......................................................................................................... 7

2.2 Tamizaje in silico .................................................................................................................. 7

2.3 Dinámica molecular .............................................................................................................. 8

3. Metodología y Resultados........................................................................................................... 9

3.1 Preparación de la estructura de MtrD ................................................................................... 9

3.2 Obtención de conformaciones de MtrD para el tamizaje virtual. ....................................... 12

3.2.1 Generación de complejos MtrD-azitromicina y MtrD-MBX3135 .............................. 13

3.2.2 Dinámicas moleculares de MtrD, MtrD-azitromicina y MtrD-MBX3135 .................. 15

3.2.3 Análisis de clustering de las cavidades A e I en las dinámicas moleculares ............... 29

3.3 Tamizaje in silico para encontrar potenciales inhibidores de MtrD ................................... 38

3.3.1 Preparación de la librería Asinex Elite Library para el tamizaje in silico ................... 39

3.3.2 Preparación de grids para las cavidades A e I ............................................................. 40

3.3.3 Resultados tamizaje in silico ........................................................................................ 40

4. Discusión................................................................................................................................... 48

4.1 Estructura de MtrD y conformaciones obtenidas por MD .................................................. 48

4.2 Tamizaje in silico ................................................................................................................ 48

5. Conclusiones ............................................................................................................................. 50

6. Referencias ................................................................................................................................ 52

7. Anexos ...................................................................................................................................... 55

7.1 Tablas .................................................................................................................................. 55

7.2 Figuras................................................................................................................................. 58

1

1. Introducción

Neisseria gonorrhoeae es un diplococo Gram negativo y es el agente etiológico de la enfermedad

de transmisión sexual (ETS) gonorrea, también conocida como gonococia. La infección por este

patógeno se da por contacto, y la colonización ocurre en el sitio anatómico de exposición (puede

ocurrir en la faringe, recto, uretra y cuello uterino); alternativamente puede haber infección en

los ojos de recién nacidos (Workowski, 2013). Complicaciones por esta ETS en mujeres

incluyen infertilidad, embarazos ectópicos, y dolor pélvico crónico (Workowski, 2013).

Recientemente el tratamiento de la gonococia ha sufrido disminuciones en su eficacia por la

evolución y prevalencia de cepas de N. gonorrhoeae resistentes a antibióticos (Kirkcaldy, 2016).

El único tratamiento aprobado por el CDC (Centers for Disease Control and prevention, Centro

de Control y prevención de Enfermedades) es una terapia dual, que incluye la aplicación de

ceftriaxona (cefalosporina) por inyección y azitromicina (macrolido) por vía oral (Kirkcaldy,

2016). La función de este tipo de terapias duales gira en torno a la dificultad probabilística de

que una población de bacterias que están en un proceso infectivo activo desarrolle

simultáneamente resistencia a dos antibióticos, cuyos mecanismos de acción difieran. De forma

que, si en la población de N. gonorrhoeae algunos individuos tienen una menor susceptibilidad a

la ceftriaxona, la azitromicina será capaz de disminuir la población bacteriana hasta un nivel que

el sistema inmune pueda manejar, y vice versa. El tratamiento dual tiene la ventaja de tratar la

gonococia eficientemente en todos los sitios de infección, pocos efectos colaterales, bajo precio y

facilidad de administración; características no compartidas por otros tratamientos (Kirkcaldy,

2016). Además, no se recomienda el uso de otros tratamientos por la alta prevalencia de

gonococos resistentes a demás antibióticos (Kirkcaldy, 2016).

En 2013, el 0.6% de los casos reportados de gonococia a la CDC presentaban una reducción en

la susceptibilidad a la azitromicina (Kirkcaldy, 2016). Esta reducción se toma como un MIC

2.0 g/mL, siendo MIC (de las siglas en inglés Minimum Inhibitory Concentration) la

concentración más baja de un antibiótico que inhibe visiblemente el crecimiento del

microorganismo en un cultivo (Kirkcaldy, 2016). En 2014, el 2.5% de los casos reportados

presentaban reducción en la susceptibilidad a la azitromicina (Kirkcaldy, 2016). A medida que

las MICs aumentan, los gonococos pueden crecer en presencia de concentraciones altas del

antibiótico en cuestión (Kirkcaldy, 2016). Esto es una señal de resistencia potencial inminente,

dado que, si las concentraciones del antibiótico necesario para controlar la infección aumentan

hasta un nivel crítico, la dosis necesaria sobrepasaría niveles terapéuticos, implicando que la

cantidad de antibiótico necesaria para controlar la infección pasaría a ser citotóxica para el

individuo con gonococia (Kirkcaldy, 2016).

El aumento de la prevalencia de cepas de N. gonorrhoeae que presentan una reducción en la

susceptibilidad a la azitromicina, 5 años después que los MICs de cefalosporinas (como la

ceftriaxona) aumentaran, resalta el posible desarrollo de resistencia al único tratamiento

recomendado para la gonococia (Kirkcaldy, 2016). En el reporte de Kirkcaldy, 2016, de los 125

aislamientos de cepas de gonococos con susceptibilidad reducida a la azitromicina 48.8% eran

resistentes a tetraciclina, 22.4% a penicilina, y 8.8% a ciprofloxacina. Esta información

2

demuestra la situación crítica del tratamiento para la gonococia, dado que si hay un desarrollo de

resistencia contra la azitromicina y ceftriaxona no habrá forma de curar quienes porten esta

infección.

La reducción de la susceptibilidad de N. gonorrhoeae a la azitromicina ha sido asociada a la

actividad de la bomba de expulsión codificada por los genes mtrCDE, que impide la entrada del

antibiótico al citoplasma, cuando esta se encuentra sobreexpresada (Zarantonelli, Borthagaray,

Lee, & Shafer, 1999). Estos genes constituyen una unidad transcripcional y sufren regulación

negativa por MtrR, una proteína codificada por mtrR; gen adyacente pero divergente al operón

mtrCDE (Zarantonelli et al., 1999). La sobreexpresión de MtrCDE, y subsecuente reducción de

la susceptibilidad a azitromicina, está asociada a tres mutaciones. La primera, y más frecuente (5

de 6 aislamientos resistentes a azitromicina), es una deleción de un par de bases en la región

espaciadora entre la caja -35 y -10 del promotor de mtrR. La segunda, presente en 4 de 6

aislamientos resistentes a azitromicina, es una mutación con pérdida de sentido en el codón 45 de

mtrR, cambiando de glicina a ácido aspártico. La tercera, y menos frecuente (1 de 6 aislamientos

resistentes a azitromicina), es una inserción de un dinucleótido TT en la misma región que la

primera mutación (Zarantonelli et al., 1999). La primera mutación aumenta por un factor de 10 la

reducción de susceptibilidad a la azitromicina de N. gonorrhoeae, y se conoce que abroga la

transcripción de mtrR y aumenta la transcripción del operón mtrCDE. La segunda mutación

disminuye la afinidad de MtrR por la región promotora de mtrCDE, reduciendo su capacidad de

regulación negativa del operón. La tercera mutación aumenta la región espaciadora de 17

nucleótidos a 19 nucleótidos, que resulta desfavorable para el reconocimiento por la RNA

polimerasa de las cajas -35 y -10 de la región promotora de mtrR. El efecto de estas tres

mutaciones culmina en la sobreexpresión de la bomba de expulsión MtrCDE. La presencia de un

mayor número de estas bombas en la membrana de N. gonorrhoeae incrementa su capacidad de

exportar la azitromicina al exterior de la célula, lo que explica la reducción en susceptibilidad y

resistencia a este antibiótico.

La bomba de expulsión MtrCDE está compuesta por una proteína de membrana interna (MtrD),

que transduce energía electroquímica y está encargada del reconocimiento de sustratos, y una

proteína de membrana externa formadora del conducto (MtrE), que están conectadas por una

proteína periplásmica de fusión de membrana (MtrC), que se encuentra anclada a la membrana

interna (Janganan et al., 2011). MtrCDE se ensambla con una estequiometria de

MtrD:MtrC:MtrE de 3:6:3 (Janganan, Bavro, Zhang, Borges-Walmsley, & Walmsley, 2013),

siendo MtrC quien estabiliza la interacción entre MtrE y MtrD al unirse sobre sus superficies. El

funcionamiento de esta proteína se da en cuatro etapas (Janganan et al., 2013) y estas se pueden

ver en la Figura 1. En la primera MtrC y MtrD se encuentran acomplejadas, y al reconocer un

antibiótico en el periplasma se ensamblan con MtrE. En la segunda, al estar MtrCDE

ensamblada, las puertas primaria y secundaria del canal de MtrE se abren. En la tercera, protones

se unen a MtrD, ocasionando cambios conformacionales que llevan a la transferencia del

antibiótico al canal interno de la proteína, a través del cual es expulsado. En la cuarta, ocurre otro

evento de translocación de protones que resulta en el desensamblaje de MtrCD-E y la proteína

vuelve a la primera etapa (Janganan et al., 2013). A medida que MtrD pasa por estas cuatro

etapas adopta tres conformaciones diferentes: acceso, unión y expulsión (Janganan et al., 2013).

La conformación de acceso hace referencia al estado de la proteína antes de reconocer un

sustrato, la conformación de unión es aquella que MtrD adopta al unirse al sustrato y la

3

conformación de expulsión ocurre cuando se forma el complejo MtrCDE y ocurre la expulsión

del sustrato.

Figura 1. Los cuatro estados de expulsión por MtrCDE, adaptada de Janganan et al., 2013.

En otros experimentos se ha demostrado que la inactivación o deleción de alguna de las proteínas

que forman estas bombas de expulsión tripartitas (compuesta por tres partes, por ejemplo las tres

proteínas MtrC, MtrD y MtrE) atenúan la bacteria (Piddock, 2014). Esta atenuación ocurre

independientemente de la especie bacteriana e impide a la bacteria de que infecte a su hospedero,

sea este una planta, pájaro o mamífero (Piddock, 2014). La inhibición de la expulsión, llevada a

cabo por las bombas tripartitas, también reduce la habilidad de la bacteria de formar biopeliculas

(Piddock, 2014) y de adquirir resistencia a antibióticos que sean sustratos de estas bombas (Ricci

& Piddock, 2009). Esto último ocurre porque estas bombas de expulsión no son específicas y su

rango de sustratos es amplio, incluyendo una variedad de antibióticos con diferentes mecanismos

de acción, antisépticos y desinfectantes, detergentes (entre ellas sales biliares), ácidos grasos,

metales pesados, solventes, y factores de virulencia (Venter, Mowla, Ohene-Agyei, & Ma,

2015). Por esto estas bombas de expulsión son parte importante de la patogenicidad bacteriana,

virulencia, y formación de biopeliculas (Venter et al., 2015). Para el caso de los antibióticos, las

bombas de expulsión son capaces de remover la mayoría de estos compuestos hasta que la

4

bacteria haya tenido tiempo de adquirir resistencia a un antibiótico por mecanismos más

específicos (Venter et al., 2015).

Actualmente no hay inhibidores de bombas de expulsión (EPIs, Efflux Pumps Inhibitors) siendo

utilizados en tratamientos clínicos (Venter et al., 2015), pero si existen EPIs que han sido

probados experimentalmente (Vargiu, Ruggerone, Opperman, Nguyen, & Nikaido, 2014). Para

que una molécula se considere como un EPI, en teoría, debería (i) tener sinergia con antibióticos

empleados en la actualidad, (ii) restaurar la eficacia de los antibióticos para los cuales ha surgido

resistencia, (iii) reducir la incidencia de la emergencia de patógenos resistentes a antibióticos,

(iv) reducir la habilidad de los patógenos de infectar al hospedero dada la atenuación causada por

la inhibición de la expulsión, (v) prevenir el desarrollo de biopeliculas con una alta resistencia a

antibióticos (Venter et al., 2015). La similitud estructural entre las diferentes bombas de

expulsión tripartitas de diferentes bacterias Gram negativas sugiere que EPIs desarrollados para

cualquier una de ellas, podrían llegar a ser efectivas en otros patógenos (Venter et al., 2015).

Existen varias formas de potencialmente inhibir el funcionamiento de una bomba de expulsión.

Brevemente estas serían, explicadas por Venter et al. (2015), (i) controlar la red regulatoria

responsable por la transcripción de las proteínas que las conforman, (ii) alterar la estructura

molecular de los antibióticos para reducir su afinidad con la bomba de expulsión, (iii) prevenir el

ensamblaje de la bomba tripartita interrumpiendo la interacción entre MtrD y MtrC, (iv)

bloqueando el sitio de unión de MtrD con un sustrato competitivo de alta afinidad, (v)

manteniendo MtrD en una conformación inactiva que no permite el reconocimiento de

antibióticos, (vi) bloqueando el canal de MtrE, y (vii) impedir la translocación de protones que

MtrD requiere para el ensamblaje/desensamblaje de la bomba de expulsión. Estos mecanismos

de inhibición tienen ventajas y desventajas, pero dado que el propósito es llevar los EPIs a un

tratamiento clínico algunos de estos mecanismos pueden ser descartados. El mecanismo (ii) tiene

la desventaja de que al alterar la estructura química del antibiótico posiblemente este también

estará perdiendo afinidad por su blanco, haciendo que pierda eficiencia como tratamiento. El

mecanismo (vi) posee una desventaja, y es que por similitud entre las estructuras tipo poro de las

células sería un desafío lograr que el EPI fuera selectivo para poros bacterianos. Un EPI con el

mecanismo (vii) seguramente también afectaría translocación de protones en células humanas,

haciéndolo citotóxico e inutilizable. Por otro lado, el mecanismo (iv) parece ser una buena

estrategia para lograr la inhibición de MtrCDE por dos razones. La primera siendo que como sus

sustratos incluyen moléculas como antibióticos hay una mayor probabilidad de encontrar un

inhibidor con una farmacocinética similar a la de estos compuestos (no sería citotóxico y podría

ser distribuido hasta los sitios de infección). La segunda siendo que ya existen inhibidores

comprobados experimentalmente, que funcionan de acuerdo a este mecanismo, para AcrB

(proteína de membrana interna de AcrAB-TolC); una bomba de expulsión tripartita homologa a

MtrCDE. Además, buscar una molécula con potencial inhibitorio basado en similitud estructural

y química a inhibidores conocidos es una estrategia comúnmente utilizada.

MtrCDE hace parte de la familia RND (Resistance Nodulation Division) de bombas de expulsión

(Li, Plésiat, & Nikaido, 2015). Las bombas de esta familia son tripartitas y usan la fuerza protón-

motriz como fuente de energía (Li et al., 2015). AcrAB – TolC es una bomba de expulsión de la

familia RND constitutivamente expresada en Escherichia coli, y esta ha sido estudiada

extensivamente como el prototipo de las bombas tripartitas de esta familia. Una propiedad

5

común de los sustratos de AcrB, y otras bombas de la familia RND, es la presencia de un

dominio hidrofóbico (Li et al., 2015), siendo esta amplia especificidad algo sorprendente, pero

sin embargo puede ser explicada. Cuando una enzima captura su sustrato hidrofílico del medio

acuoso es necesario romper los puentes de hidrogeno entre el sustrato y las moléculas de agua

que lo rodean. De forma que la unión estable a la enzima va a depender de interacciones fuertes

y precisas con los residuos que componen el sitio activo, para poder superar la barrera energética

de la separación del solvente. En otras palabras, el sitio de unión debe ser pequeño y

cuidadosamente diseñado para lograr unirse astringentemente al sustrato. Por otro lado, los

sustratos de las bombas de expulsión que capturan compuestos con dominios hidrofóbicos no

estarán estabilizados por el medio acuoso, y su presencia representa un alto costo entrópico que

acompaña el ordenamiento de las moléculas de agua alrededor del sustrato. Por esto, el sitio de

unión de estas bombas es amplio y puede acomodar un amplio rango de diversidad de moléculas

con pequeñas disminuciones en la energía libre de unión (Li et al., 2015). Tanto en MtrD como

en AcrB, se han descrito dos bolsillos dentro de la cavidad de reconocimiento de sustrato:

bolsillo próximo y bolsillo distal (Li et al., 2015). Estos difieren cuanto a su localización dentro

de la cavidad, siendo el bolsillo distal el que se encuentra en la parte más profunda del sitio de

reconocimiento.

Existen otras similitudes entre AcrB y MtrD, y una de las más importantes para este estudio es la

presencia del loop rico en glicina. En AcrB está compuesto por los residuos 614 a 621 (Vargiu et

al., 2014) y en MtrD por los residuos 610 a 618 (Bolla et al., 2014). Este loop ayuda en el

transporte de los sustratos de la bomba al canal interno de expulsión, y está asociado al

mecanismo de inhibición de inhibidores de AcrB cuando se impide su movimiento (Vargiu et al.,

2014). Otra similitud importante es la presencia de una trampa hidrofóbica, que en AcrB está

compuesta por los residuos PHE-136, PHE-178, PHE-610 y PHE-628 (Vargiu et al., 2014) y en

MtrD está compuesta por PHE-136, TYR-325, PHE-568 y PHE-623 (determinada

computacionalmente en este trabajo). A pesar de no estar completamente conservada en MtrD,

con respecto a AcrB, la sustitución de fenilalanina por tirosina no ocasiona perdida de función

dado que ambos son amino ácidos hidrofóbicos. Esta trampa ha sido asociada a un mayor índice

de inhibición de los inhibidores de AcrB que interactúan con ella (Sjuts et al., 2016).

Un ejemplo de EPIs es MBX2319, una molécula con un núcleo piranopiridina, que fue

determinada computacionalmente (Vargiu et al., 2014) y luego probada con éxito

experimentalmente (Sjuts et al., 2016). Este inhibidor, y sus derivados, actúan sobre la bomba de

expulsión AcrAB-TolC (Vargiu et al., 2014), homologa de MtrCDE (Janganan et al., 2013).

MBX2319 disminuye el MIC de la eritromicina, el antibiótico del cual se deriva la azitromicina,

en un factor de 8 (Vargiu et al., 2014). Este inhibidor sirvió como base para luego desarrollar

nuevos inhibidores a través de substituciones sistemáticas en los sustituyentes del núcleo

piranopiridina (Sjuts et al., 2016). Estos nuevos inhibidores (MBX2931, MBX3132, MBX3135)

presentan una ligera mejora, en el caso de MBX2931, hasta una mejora considerable con

MBX3132 y MBX3135. Estos últimos en concentraciones 10 veces menores que las de

MBX2319 son 10-20 veces más potentes, respectivamente (Sjuts et al., 2016). MBX2319, y sus

derivados, inhiben AcrB al impedir el movimiento de un loop rico en glicinas, cuya función

radica en arrastrar los sustratos desde la cavidad de reconocimiento hacia el canal interno de la

bomba (Vargiu et al., 2014). También encontraron en varios cristales y simulaciones de docking

que estos inhibidores se unen cerca de una trampa hidrofóbica, que estabiliza la interacción y

6

mejora su capacidad de inhibición (Sjuts et al., 2016). Estos estudios de EPIs para AcrB

mostraron que las bombas de expulsión tripartitas tienen dos bolsillos de unión de ligandos

(Vargiu et al., 2014). El primero se denomina bolsillo distal, donde se han cocristalizado

sustratos de la bomba; y el segundo se denomina bolsillo próximo, donde se han cocristalizado

inhibidores, como los de la familia MBX.

Existen otros inhibidores de AcrB con mecanismos de inhibición similares. Por ejemplo, D13-

9001 inhibe competitivamente AcrB al unirse al sitio de unión de sustratos fuertemente, de forma

que impide que ocurran los cambios conformacionales en la proteína que llevan a la expulsión.

De esta forma, impide la unión de sustratos típicos y su subsecuente expulsión (Vargiu et al.,

2014). El compuesto D13-9001 se une principalmente a través de interacciones con la trampa

hidrofóbica, que lo ancla eficazmente en el sitio de unión. Los inhibidores NMP y PAβN

impiden el movimiento del loop rico en glicina, atascando AcrB en una conformación, lo que

impide la expulsión de los inhibidores y la unión de otros sustratos (Vargiu et al., 2014). Estos

dos últimos inhibidores no están dentro de la trampa hidrofóbica, pero están unidos en su

periferia (Vargiu et al., 2014).

La búsqueda de EPIs para MtrD puede realizarse a través de tamizaje in silico, un método que ha

demostrado tener capacidades predictivas cuanto a actividad potencial de moléculas como EPIs.

Ohene-Agyei, Mowla, Rahman, & Venter (2014) utilizaron esta metodología para buscar

posibles inhibidores de AcrB desde una librería de 50 fitoquímicos. A partir de docking

molecular de estos compuestos llegaron a 6 potenciales EPIs, que luego llevaron a experimentos

in vitro. Otro ejemplo del éxito de estos métodos computacionales es la investigación de

Sandhaus, Chapagain, & Tse-Dinh, 2018, donde utilizaron estructuras generadas por dinámicas

moleculares de la proteína TopI de Mycobacterium tuberculosis para realizar tamizaje in silico.

En este estudio encontraron compuestos activos con IC50 de 2 µM, que es suficientemente bajo

para ser considerado como potencialmente terapéutico. En ambos ejemplos encontraron una

fuerte correlación entre los resultados in silico e in vitro, demostrando que el tamizaje virtual es

una herramienta poderosa para preseleccionar compuestos con potencial actividad como

inhibidores.

Descubrir EPIs para la bomba de expulsión MtrCDE es importante, puesto que su uso, en teoría,

restauraría la eficacia de antibióticos para los cuales N. gonorrhoeae es resistente. Esto es de

especial importancia para la azitromicina, uno de los dos únicos antibióticos para los cuales este

patógeno aún es susceptible, pero que ya está empezando a perder eficacia. La pérdida de la

azitromicina como tratamiento para la gonococia tiene graves consecuencias, como infecciones

intratables que resultan en la muerte del hospedero. Encontrar un EPI para MtrD sería un primer

paso para prolongar la vida útil de los tratamientos actuales, y comprando tiempo para el

desarrollo de una nueva generación de tratamientos antibacterianos.

Por todas estas razones, se desarrolló un estudio computacional, realizando una campaña de

tamizaje in silico sobre diferentes conformaciones de MtrD generadas por dinámicas

moleculares, buscando compuestos potencialmente afines al bolsillo próximo y al bolsillo distal.

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2. Métodos

2.1 Simulación de docking

El proceso de docking involucra la predicción de la conformación y orientación de un ligando en

un sitio de unión determinado (Kitchen, Decornez, Furr, & Bajorath, 2004), y esto se puede

realizar con un solo ligando o una biblioteca de compuestos. Además este software hace un

ranking de los ligandos, dando puntajes independientes para cada conformación y cada posición

(o pose) favorable de estas (Kitchen et al., 2004).

El software Glide, utilizado en este trabajo, determina el sitio de unión a través del grid. Este

ultimo es una representación estructural de los residuos y todos sus átomos, que se encuentran

dentro de una caja de volumen determinado, y tiene en cuenta las potenciales interacciones que

pueden tener los amino ácidos que componen el sitio de unión. Esta caja determina el espacio

donde el software intentará localizar el ligando, y dentro de ella hay otra caja más pequeña que

determina donde debe ir el centro de masa del ligando al cual se le está haciendo el docking.

Los ligandos son preparados con el software LigPrep, que calcula diferente posibles

conformaciones de cada ligando. De esta forma se tiene en cuenta la variabilidad conformacional

de cada molécula que será utilizada en el proceso de docking.

De acuerdo a lo anterior, Glide posicionará cada una de las conformaciones generadas de los

ligandos dentro del grid, y además le permite tener cierta flexibilidad a los ligandos. De esta

forma las moléculas pueden acomodarse a la cavidad, mostrando una interacción más cercana a

la que se esperaría observar en el sistema biológico. Luego de obtener las diferentes poses utiliza

una función de scoring que le otorga un puntaje a cada una de ellas en 𝑘𝑐𝑎𝑙

𝑚𝑜𝑙.

La función de scoring es un acercamiento a la energía libre de unión de estos compuestos, y la

que utiliza Glide está basada en información experimental (Friesner et al., 2004). Las

limitaciones de esta función es que no tiene en cuenta la solvatación del sistema ni la energía del

receptor y ligando aislados; por esto es un acercamiento a la energía libre de unión (Friesner

et al., 2004). Siendo así, aquellos compuestos que presentan un puntaje más grande y más

negativo, serán los que el software predice que tendrán una mayor afinidad por el receptor.

2.2 Tamizaje in silico

El tamizaje in silico hace referencia al uso de diferentes funciones de scoring para evaluar una

librería de compuestos. Esta evaluación se relaciona con la potencial afinidad de los compuestos

con relación a un receptor, y aquellas moléculas que lleguen al final del tamizaje in silico tendrán

una mayor probabilidad de ser afines a la proteína siendo evaluada; en este caso el componente

MtrD de la bomba de expulsión MtrCDE de N. gonorrhoeae. Pero como se trata de miles de

compuestos es necesario llevar a cabo el tamizaje in silico por etapas, de otra forma el costo

computacional sería demasiado alto.

8

Primero, se utiliza una función de scoring de baja precisión para evaluar las poses de docking de

miles de compuestos en poco tiempo, y con sus resultados se eliminan de consideraciones los

compuestos con menor afinidad al receptor. Segundo, se utiliza una función de scoring más

exigente para evaluar cientos de compuestos y nuevamente filtrarlos para que permanezcan

aquellos con mayor afinidad al receptor siendo estudiado. Finalmente, se utiliza una función de

scoring de alta precisión para ordenar los mejores 100 compuestos provenientes de la librería.

En este trabajo se utilizaron las siguientes funciones de scoring, de menor a mayor precisión:

High-Throughput Virtual Screening (HTVS), Standard Precision (SP) y Extra Precision (XP).

El docking a través de HTVS tiene como propósito evaluar grandes librerías de compuestos, ya

que su muestreo conformacional está mucho más limitado que en el docking SP. En otras

palabras, HTVS limita el numero de conformaciones del complejo ligando – receptor a ser

evaluadas y limita el muestreo torsional del ligando dentro del receptor (Manual de Glide). La

función de scoring SP tiene en cuenta interacciones lipófilas, puentes de hidrogeno entre átomos

neutros, puentes de hidrogeno entre un átomo neutro y un átomo cargado, puentes de hidrogeno

entre átomos cargado, interacciones entre metales y átomos aceptores aniónicos, incorpora las

contribuciones energéticas Coulombianas y de van der Waals de la interacción ligando –

receptor, y finalmente introduce un modelo de solvatación al medir la exposición del ligando a

posibles moléculas de agua en el sitio de unión (Friesner et al., 2004). La función de scoring XP

se diferencia de SP en varios factores (Friesner et al., 2006). El primero siendo que realiza un

muestreo conformacional más exhaustivo, de forma que evalúa un mayor numero de posiciones

del ligando dentro del sitio de unión (Friesner et al., 2006). También tiene categorías más

especificas de las interacciones con diferentes puntajes de docking; por ejemplo, en vez de

agrupar todos los puentes de hidrogeno entre átomos cargados tiene cinco categorías diferentes

para darle un puntaje a este tipo de interacción (Friesner et al., 2006).

Por esto, al final del tamizaje in silico se tienen dos puntuaciones por cada ligando, XP docking

score y SP docking score. La diferencia es la precisión de la función de puntuación para la

afinidad, siendo XP la más precisa de acuerdo a lo mencionado previamente.

Luego de pasar por estos tres cálculos el tamizaje in silico provee una lista de compuestos

enriquecida, en otras palabras con una alta proporción de compuestos potencialmente activos.

2.3 Dinámica molecular

Las dinámicas moleculares son simulaciones cuyo propósito es estudiar el comportamiento

dependiente de tiempo de sistemas microscópicos (De Vivo, Masetti, Bottegoni, & Cavalli,

2016). Esto se logra solucionando las ecuaciones diferenciales de segundo orden representadas

por la segunda ley de Newton para cada átomo en el sistema, teniendo en cuenta las

interacciones con los demás átomos (De Vivo et al., 2016). Esta aproximación sirve para

partículas masivas, como el núcleo, mientras que el movimiento de los electrones se toma como

un promedio (De Vivo et al., 2016). Para lograr esto, se introduce una función de energía

potencial empírica y el modelo que surge de esta representación simplificada es el force field

(FF).

9

El FF es una ecuación que contiene términos que representan las interacciones intramoleculares

de los átomos. Estos términos describen variaciones en la energía potencial como función del

estiramiento de enlaces, flexión y torsión entre átomos involucrados en enlaces (De Vivo et al.,

2016). El estiramiento y flexión de enlaces comparte la misma forma funcional, siendo esta su

descripción como potenciales harmónicos con valores de referencia asignados. Por otro lado, los

términos torsionales, por su periodicidad intrínseca son definidos como una serie de cosenos de

M términos para cada ángulo diedro (De Vivo et al., 2016). Estos tres grupos de contribuciones

energéticas son los términos de enlace del FF. Además de estos están los términos de no enlace,

siendo estas las interacciones de van de Waals y electrostáticas. Estas contribuciones actúan

sobre todos los pares de átomos del sistema que no se tuvieron en cuenta en los términos de

enlace. Las interacciones de van der Waals son tratadas con un potencial 12 – 6 de Lennard-

Jones y las interacciones electrostáticas tienen en cuenta las cargas parciales de cada par de

átomos y la permisividad relativa del sistema (De Vivo et al., 2016).

Con esta información es posible calcular el comportamiento del sistema a través del tiempo, y en

este trabajo se utilizó esta herramienta para encontrar diferentes conformaciones de la proteína

MtrD.

3. Metodología y Resultados

3.1 Preparación de la estructura de MtrD

Actualmente solo hay una estructura cristalográfica de MtrD (PDB 4MT1), representada en la

Figura 2, con una resolución de 3.54 Å y hecha con difracción de rayos X (Bolla et al., 2014).

Este cristal representa la conformación de acceso de la proteína, ya que el cristal obtenido se

asemeja más a la conformación de acceso de AcrB, que a las conformaciones de unión y

expulsión de AcrB (Bolla et al., 2014). Al realizar la cristalografía encontraron que en este cristal

el loop rico en glicinas, asociado a los inhibidores de AcrB, está conservado en MtrD (Bolla et

al., 2014). Esta estructura presentaba tres mutaciones: L626F, A839E y R861S (esta

nomenclatura significa que en el cristal la LEU-626 presente en MtrD se mutó a fenilalanina).

Todas las mutaciones se deshicieron in silico usando Maestro, la interfaz gráfica de la suite de

Schrödinger. Se utilizó la herramienta de minimización de estructuras de Maestro para

reacomodar las cadenas laterales de estos residuos dentro de la cavidad. Esta herramienta busca

mínimos energéticos locales, y es necesaria en este paso ya que al agregar los átomos de los

residuos nuevos estos pueden quedar en posiciones no favorables (por ejemplo, demasiado cerca

de átomos de residuos aledaños).

10

Figura 2. Representación gráfica del trímero MtrD (PDB 4MT1) en el software Maestro. Se pueden ver los

protómeros de colores diferentes: verde, blanco y rojo.

Dadas las limitaciones de este método de cristalografía la estructura está incompleta, ya que no

posee ningún hidrogeno. Para agregar los hidrógenos se utiliza el software Protein Preparation

Wizard (Madhavi Sastry, Adzhigirey, Day, Annabhimoju, & Sherman, 2013). Con este programa

también se revisó que no hubieran átomos faltantes en los residuos y se borraron las moléculas

de aguas residuales del cristal. Eliminar las moléculas de agua del cristal es estándar del método,

excepto cuando se trate de un sitio catalítico donde se conozca que el agua participe de la

catálisis, o cuando se conoce que las moléculas de agua son esenciales para la unión entre el

ligando y el receptor. Se removió el dominio transmembranal de MtrD, marcado con colores en

un protómero de MtrD en la Figura 3, puesto que por limitaciones de recursos computacionales

no es posible hacer simulaciones incluyendo la membrana. Además, los sitios de unión están

suficientemente lejanos a este dominio para inferir que no hay interacciones, de forma que

incluir el dominio transmembranal doblaría el costo computacional sin ofrecer información

adicional. La estructura de la proteína preparada y cortada, representada en la Figura 4, fue

utilizada en los procedimientos siguientes.

11

Figura 3. Protómero de MtrD con dominio periplásmico en blanco y dominio transmembranal marcado con

colores. Las hélices en verde, azul, naranja y rosado fueron las que se eliminaron de la estructura.

12

Figura 4. Estructura final de MtrD a ser utilizada en los pasos siguientes.

3.2 Obtención de conformaciones de MtrD para el tamizaje virtual.

Para hacer el tamizaje in silico sobre MtrD se utilizaron ocho conformaciones de esta proteína.

Dos conformaciones A0 (i y ii) provendrían de una dinámica molecular (MD) de MtrD sin

ligandos, enfocando el tamizaje en el bolsillo distal, donde la proteína estaría en un estado

relajado, como se encontraría previamente al reconocimiento de un sustrato. Dos conformaciones

I0 (i y ii) tendrían el mismo origen de la conformación A0, pero el tamizaje se enfocaría en el

bolsillo próximo. Las conformaciones A1 (i y ii) provendrían de una MD de MtrD con

azitromicina en el bolsillo distal, donde se enfocaría el tamizaje. De la estructura sacada de la

MD se remueve el antibiótico, de forma que el bolsillo distal estaría en la conformación que

adopta cuando tiene un sustrato unido; lo que permitiría el docking de ligandos que podrían no

acomodarse en A0 por impedimentos estéricos. Las conformaciones I1 (i y ii) provendrían de

una MD de MtrD con MTX3135 en el bolsillo próximo, donde se enfocaría el tamizaje. Se retira

MTX3135 de la estructura, y el bolsillo próximo quedaría en la conformación que adopta al tener

un ligando unido; permitiendo el docking de ligandos que podrían no acomodarse en I0. La

extracción de las conformaciones de cada cavidad está resumida en el Diagrama 1. Se

escogieron solamente dos conformaciones de cada cavidad por el costo computacional inherente

de cada tamizaje in silico. Se decidió evaluar ambos bolsillos para abarcar una mayor diversidad

de compuestos, de forma que los potenciales EPIs encontrados en este estudio puedan inhibir

desde el bolsillo próximo o el bolsillo distal.

13

Diagrama 1. Representación gráfica de la extracción de las diferentes conformaciones de las cavidades A1/A0

e I1/I0 de sus respectivas dinámicas moleculares. “Conf. Cav.” quiere decir conformaciones de la cavidad.

3.2.1 Generación de complejos MtrD-azitromicina y MtrD-MBX3135

Dado que MtrD no ha sido cocristalizada con ningún ligando se realizaron dos docking

moleculares con el software Glide (Halgren et al., 2004) para obtener los complejos de MtrD con

azitromicina y el inhibidor de AcrB MBX3135.

3.2.1.1 Preparación de azitromicina y MBX3135

La estructura de la azitromicina, Figura 5, se descargó de la base de datos DrugBank (Wishart et

al., 2018). La estructura de MBX3135, Figura 6, se obtuvo del PDB 5ENR, del cual se eliminó

la proteína, aguas y sales, dejando solamente la información estructural del inhibidor. Ambas

estructuras fueron preparadas para el docking utilizando el software LigPrep (Schrodinger,

2017a), cuya función principal es generar estructuras 3D de los ligandos a partir de estructuras

2D, como la descargada del DrugBank. Además en la preparación se generaron diferentes

conformaciones, estados de ionización a un pH de 7.0 2.0, al cual se encuentra N. gonorrhoeae

(Morse & Hebeler, 1978), tautomeros, y variaciones de los centros quirales. También, cuando

necesario, se agregaron los hidrógenos que no estaban en la estructura inicial.

1 1

14

Figura 6. Estructura de MBX3135.

Se obtuvieron 4 conformaciones de MBX3135 y 5 conformaciones de la azitromicina.

3.2.1.2 Preparación de grids de cavidades A e I

El grid es un archivo donde la forma y las propiedades del sitio de unión del receptor están

representados, y este determina el lugar de la proteína donde se hará la exploración de la

posición de los ligandos. Estos fueron preparados utilizando las coordenadas del centro de la

cavidad A y la cavidad I con el software Glide (Halgren et al., 2004), específicamente el

componente Receptor Grid Generation. Las coordenadas del centro de las cavidades se

determinaron por comparación visual, teniendo en cuenta la posición de los ligandos de los

cristales de AcrB cocristalizados con eritromicina (PDB 4ZJL) y MBX3135 (PDB 5ENR).

Se obtuvieron dos archivos de grid, uno para la cavidad A (donde se haría el docking de la

azitromicina) y otro para la cavidad I (donde se haría el docking de MBX3135).

3.2.1.3 Docking de azitromicina y MBX3135 en MtrD

Se realizaron dos ensayos de docking con Glide (Halgren et al., 2004) utilizando la función de

puntuación XP (Extra Precision). El primero utilizando el grid sobre la cavidad A y las

conformaciones preparadas de azitromicina, y el segundo utilizando el grid sobre la cavidad I y

las conformaciones preparadas de MBX3135.

Se escogieron las poses con el mejor puntaje de cada uno de los ligandos. De forma que se

obtuvieron tres archivos estructurales de MtrD: la proteína sola, el complejo MtrD-azitromicina

y el complejo MtrD-MBX3135.

Figura 5. Estructura de la azitromicina.

15

Como referencia, el mejor puntaje XP de docking de la azitromicina fue -8.584 𝑘𝑐𝑎𝑙

𝑚𝑜𝑙 y el mejor

puntaje de docking de MBX3135 fue -6.581 𝑘𝑐𝑎𝑙

𝑚𝑜𝑙. La azitromicina quedó anclada a MtrD por

cinco interacciones: 1 puente de hidrogeno aromático con la cadena lateral de TYR-77, un

puente de hidrogeno y un puente salino con la cadena lateral de GLU-669, y dos puentes de

hidrogeno con el backbone de PHE-612 y SER-613. La azitromicina interactúa con la punta del

loop rico en glicina, que es una interacción esperada ya que este loop está encargado de

movilizar este sustrato al canal interno de expulsión. El inhibidor de AcrB, MBX3135, solo

quedó anclado a MtrD por un puente de hidrogeno con la cadena lateral de TYR-325, uno de los

componentes de la trampa hidrofóbica.

3.2.2 Dinámicas moleculares de MtrD, MtrD-azitromicina y MtrD-MBX3135

Se realizaron tres simulaciones de MD, una para cada complejo y una para la proteína sin

ligandos, de 150ns utilizando Desmond (Desmond, 2017). Las MD calculan la posición de los

átomos dentro del sistema a través del tiempo (Franco, 2016), solucionando iterativamente las

ecuaciones de Newton de movimiento para cada átomo (Franco, 2016).

Estas MD se realizan para obtener conformaciones que tengan una alta probabilidad de ser

adoptadas por la proteína en un sistema biológico, con el propósito de evitar utilizar la estructura

cristalográfica de MtrD. La razón de esto es que aunque la estructura en el PDB es verosímil,

tiene la desventaja de haber sido obtenida bajo condiciones no biológicas. Para realizar este

cristal MtrD se encontraba a temperatura ambiente, menor a la temperatura a la que se

encontraría en la membrana de N. gonorrhoeae, y en solución con buffer Na-HEPES (20mM) y

Cymal-6 (0.05%) (Bolla et al., 2014). Además al formar un cristal la proteína se encuentra

deshidratada, cuando generalmente esta se encontraría en solución acuosa; en otras palabras la

conformación determinada por el cristal proviene de un ambiente químico ajeno al ambiente

biológico. Otra razón para no utilizar la estructura cristalográfica de MtrD es que las proteínas

son dinámicas, y el cristal representa solamente una de las posibles estructuras que puede adoptar

MtrD, que no necesariamente es una conformación común al sistema biológico por las razones

previamente mencionadas. Dado esto, realizar MD para obtener conformaciones más cercanas a

las presentes en la bacteria es una buena estrategia, puesto que MtrD estaría en solución acuosa y

podría relajar su estructura hasta llegar a un mínimo energético conformacional a través del

tiempo de MD. Idealmente, este mínimo energético conformacional sería más cercano a la

estructura adoptada por MtrD en N. gonorrhoeae.

Otro motivo para realizar las MD es el cambio conformacional de las cavidades a través del

tiempo, con y sin ligando, ya que con diferentes formas de las cavidades se podría explorar una

mayor parte del espacio químico ocupado por la librería de moléculas a ser utilizada en el

tamizaje virtual. Si se fuera a utilizar solamente una conformación de la cavidad se estarían

sesgando los resultados del tamizaje in silico a esa superficie específica, disminuyendo

considerablemente la diversidad química de los potenciales EPIs que obtendríamos. Se esperaría

obtener, preferiblemente, una alta diversidad química, puesto que este estudio es un primer

acercamiento para encontrar inhibidores para MtrD, y entre más candidatos existan mayor la

probabilidad que alguno de ellos sea activo.

16

Para realizar la MD se utilizó el force field OPLS_2005. Se usó un time step de 2.0fs. Se

emplearon condiciones de frontera periódica. El radio cutoff de interacciones coulombianas fue

de 9.0Å. Las simulaciones se realizaron en el ensemble NPT y la temperatura se mantuvo a 310K

con el termostato Noose-Hoover chain, con un tiempo de relajación de 1.0ps. La presión se

mantuvo a 1.01325 bar usando el baróstato Martyna-Tobias-Klein, con un tiempo de relajación

de 2.0ps, y estilo de acoplamiento isotrópico. Se utilizó el modelo de solvente explicito TIP3P y

se neutralizó la carga de la proteína con iones de sodio. Información estructural de la proteína a

través de la dinámica fue guardada cada 75ps, resultando en una trayectoria compuesta por 2000

frames (o 2000 archivos estructurales provenientes de la dinámica) y 150ns de simulación.

3.2.2.1 Justificación de las restricciones aplicadas a la proteína durante las dinámicas moleculares

Para las tres simulaciones se aplicaron restricciones en dos regiones de la proteína durante los

150ns de simulación. La primera región a la que se le restringió el movimiento de los átomos del

backbone fue la frontera con el dominio transmembranal que fue previamente removido,

ilustrada en la Figura 7 en la parte inferior del protómero de MtrD. Esta restricción es necesaria

ya que el dominio transmembranal en un sistema biológico le otorga una estabilidad intrínseca a

la proteína por anclarla a la membrana, sin ella la restricción de los átomos del backbone en la

frontera simularía dicha estabilidad sin comprometer la integridad estructural de la proteína. La

segunda región a la que se le restringió el movimiento de los átomos del backbone está

compuesta por tres hélices cortas de la parte superior del dominio periplásmico de MtrD,

ilustrada en la Figura 7 en la parte superior del protómero de MtrD. Esta restricción fue

necesaria puesto que en dinámicas moleculares anteriores, restringiendo solamente la primera

región, la proteína colapsaba, perdiendo la estructura que estaba cristalizada. Este colapso puede

ser explicado por el hecho que en el sistema biológico MtrD se encuentra acomplejada a MtrC,

siendo la región de contacto los surcos entre los protómeros del dominio periplásmico de MtrD

(Janganan et al., 2013), interacción que preserva la integridad estructural de MtrD. Esta

restricción estaría simulando la presencia y acción estabilizadora de MtrC en las dinámica

moleculares. No se consideró simular el complejo MtrCD, en vez de aplicar restricciones en la

región superior de MtrD, ya que actualmente no existen estructuras cristalográficas del complejo

ni de MtrC sola.

17

Figura 7. Protómero cortado de MtrD. Marcado en rojo donde se aplicaron las restricciones de movimiento.

3.2.2.2 Análisis de las dinámicas moleculares de MtrD, MtrD-azitromicina y MtrD-MBX3135

La calidad de las dinámicas moleculares se evalúa de acuerdo a la convergencia del RMSD

(Root Mean Squared Deviation) de la proteína a través del tiempo de cálculo. El RMSD evalúa

la distancia de los átomos en cada frame con relación a la estructura original sobre la cual se

realiza la MD, dando información sobre cambios conformacionales de la proteína. De forma que

si el RMSD es de 3Å significa que en promedio los átomos del sistema están a 3Å de su posición

original. El RMSD se puede calcular en relación a la proteína completa, al backbone, a las

cadenas laterales o exclusivamente algunos residuos. También se puede considerar, o

comúnmente, desconsiderar los hidrógenos, puesto que estos están constantemente en

movimiento y no aportan información cuanto a la conformación estructural de la proteína.

La convergencia a un valor de RMSD sugiere que la proteína llegó a un equilibrio

conformacional, de forma que puede ser tomado como una representación del sistema biológico.

Este análisis se realizó utilizando el componente Simulation Interactions Diagram del software

Desmond (Desmond, 2017), que toma la trayectoria del sistema para calcular el RMSD sobre los

C del backbone de la proteína.

3.2.2.2.1 Análisis dinámica molecular MtrD

18

En la Figura 8 se puede observar que la MD de MtrD sin ligandos se estabiliza y el RMSD

converge a 4.0Å a partir de los 40ns de simulación. Esto significa que las estructuras de la

proteína con relevancia biológica aparecen a partir de este punto y todos los análisis siguientes se

realizaran excluyendo conformaciones de MtrD anteriores a los 40ns.

Figura 8. Análisis de RMSD de C de MtrD por 150ns.

3.2.2.2.2 Análisis dinámica molecular MtrD – azitromicina

En la Figura 9 se puede observar en que la MD de MtrD acomplejada a la azitromicina la

proteína se estabiliza y converge a 4.2Å a partir de los 20ns de simulación. Hay una fluctuación

de 0.6Å a los 115ns que se mantiene constante hasta el final de la MD. Esta fluctuación puede

ser explicada por la rotación de algunos residuos o la reacomodación de alguno de los loops

presentes en la proteína. Como a partir de los 115ns el RMSD se mantiene estable, la relevancia

biológica de las conformaciones de la proteína a través de la simulación se mantiene desde los

20ns hasta el final. Esto significa que las estructuras de la proteína con relevancia biológica

aparecen a partir de este punto y todos los análisis siguientes se realizaran excluyendo

conformaciones de MtrD anteriores a los 20ns.

En la Figura 9 también se puede observar el RMSD del ajuste de la azitromicina en el sitio de

unión. Este indica que la azitromicina no converge a una posición dentro de la cavidad A, pero

esto es de esperar dado que de acuerdo al funcionamiento de la bomba de expulsión la

azitromicina debería migrar hacia el canal interior de la proteína. Dadas las limitaciones de este

sistema (solamente MtrD, sin MtrCE) y de las MD, que no pueden simular cambios estructurales

causados por movimiento de protones, es de esperar que la azitromicina esté inquieta en la

19

cavidad. Además, como la azitromicina fue introducida en la proteína por un proceso de docking

es normal que a esta le cueste acomodarse.

Figura 9. Análisis de RMSD de C del backbone de MtrD y del ajuste de la azitromicina a la proteína por

150ns.

3.2.2.2.3 Análisis dinámica molecular MtrD – MBX3135

En la Figura 10 se puede observar en que la MD de MtrD acomplejada a MBX3135 la proteína

se estabiliza y converge a 4.2Å a partir de los 20ns de simulación. Esto significa que las

estructuras de la proteína con relevancia biológica aparecen a partir de este punto y todos los

análisis siguientes se realizaran excluyendo conformaciones de MtrD anteriores a los 20ns.

En la Figura 10 también se puede observar el RMSD del ajuste de MBX3135 en el sitio de

unión. Este indica que MBX3135 converge a una posición dentro de la cavidad I. Hay una

fluctuación entre los 30ns y 50ns, y esto se puede explicar porque la amida-sustituida de

MBX3135 es flexible y cambia de posición en la cavidad. Después de este movimiento la

posición de la amida-sustituida se mantiene estable hasta el final de la simulación. Hay una gran

diferencia entre el ajuste de la azitromicina en la cavidad A y el ajuste de MBX3135 en la

cavidad I, pero esto se puede interpretar como que esta última cavidad no hace parte de la ruta

hacia el canal interno de expulsión. Al no hacer parte de la vía hacia el canal de expulsión

permite una unión más estable de sustratos que en la cavidad A, ya que una de las funciones de la

cavidad A, al hacer parte de la vía hacia el canal de expulsión, es movilizar sus sustratos.

20

Figura 10. Análisis de RMSD de C del backbone de MtrD y del ajuste de MBX3135 a la proteína por 150ns.

3.2.2.3 Determinación de amino ácidos de las cavidades A e I

La determinación de los amino ácidos que interactúan con la azitromicina y MBX3135, a través

del tiempo, se realizó en dos partes. Primero, a través del análisis realizado por el componente

Simulation Interactions Diagram del software Desmond (Desmond, 2017), que también

determina el tipo y duración de las interacciones del ligando con amino ácidos específicos de la

proteína. Este análisis caracteriza las interacciones como puentes de hidrogeno, contactos

hidrofóbicos, interacciones iónicas y puentes de agua. Este paso se realizó con el propósito de

definir los amino ácidos que se tendrían en cuenta en el análisis de clustering de las cavidades

A1/A0 e I1/I0 de las dinámicas moleculares.

El software determina que una interacción es un puente de hidrogeno por criterios geométricos.

Estos son que la distancia entre un átomo del residuo y uno del ligando es de 2.5 Å, y entre estos

átomos uno es donador y el otro es receptor. También tiene en cuenta si el ángulo Donador –

Hidrogeno – Receptor es 120º, y si el ángulo Hidrogeno – Receptor – ‘Átomos enlazados al

receptor’ es 90º.

Generalmente los contactos hidrofóbicos involucran interacciones entre un amino acido

hidrofóbico y un grupo aromático o alifático en el ligando, pero el software también incluye las

interacciones π – catión en esta categoría. Entre los contactos hidrofóbicos (esta categoría),

además, están las interacciones π – π stacking y otras interacciones no específicas. Los criterios

geométricos que usa el software para determinar si la interacción es un contacto hidrofóbico son:

para π – catión, una distancia de 4.5 Å entre el aromático y el grupo cargado; para π – π stacking,

21

dos grupos aromáticos cara-a-cara o cara-a-borde; para no específicas, una distancia >3.6 Å entre

una cadena lateral hidrofóbica y de un carbono aromático o alifático del ligando.

Las interacciones iónicas, o interacciones polares, son determinadas por el software si hay dos

átomos con cargas opuestas a una distancia >3.7Å y no hay un enlace de hidrogeno involucrado

en la interacción.

Los puentes de agua son interacciones de puentes de hidrogeno entre la proteína y el ligando

mediados por una molécula de agua. Los criterios geométricos para los enlaces de hidrogeno de

este tipo de interacción son relajados en comparación a los criterios estándares de enlaces de

hidrogeno. Estos criterios son: una distancia de 2.7Å entre el átomo donador y el átomo receptor,

un ángulo Donador – Hidrogeno – Receptor es 110º, y si un ángulo Hidrogeno – Receptor –

‘Átomos enlazados al receptor’ es 80º.

El segundo método usado para evaluar los amino ácidos de las cavidades fue inspección visual

de la dinámica molecular. El objetivo de este análisis es escoger amino ácidos que no interactúen

con el ligando de acuerdo al software, pero que cierren la cavidad alrededor del ligando.

Además, a través de la inspección visual, se determinó si algunos de los amino ácidos que

interactuaban con el ligando de acuerdo al software no pertenecían a la cavidad. El criterio

utilizado fue si la interacción ocurría exclusivamente por un movimiento del backbone que

posicionaba temporalmente el residuo dentro de la cavidad, de forma que en el resto de la

dinámica el amino acido en cuestión no pertenezca al sitio de unión. También para eliminar

amino ácidos que interactúan con el ligando, de acuerdo al software, pero que la interacción

ocurre por movimientos del backbone, cambiando la orientación del residuo hacia el ligando

solamente durante la interacción y que en el resto de la dinámica esté orientada hacia fuera de la

cavidad.

3.2.2.3.1 Determinación amino ácidos de la cavidad A

Esta determinación se realizó con la MD del complejo MtrD – azitromicina, y se analizaron las

interacciones de los residuos de MtrD y de la azitromicina en la cavidad A.

22

Figura 11. Contactos entre la azitromicina y residuos de la cavidad A de MtrD y la fracción de la dinámica en

que ocurrieron.

En la Figura 11 podemos observar en el eje X los residuos con los que la azitromicina interactuó

a través de la MD, y en el eje Y podemos ver la fracción de la MD sobre la que ocurrieron. Un

valor de 1 significa que la interacción ocurrió durante toda la MD, pero como algunos residuos

pueden tener más de una interacción simultánea pueden haber valores superiores a 1.

Esto último solo ocurrió para la SER-81, que interactuó principalmente con la azitromicina por

puentes de hidrogeno y por poco tiempo por puentes de agua. Los residuos SER-89, SER-91, y

THR-93 tuvieron principalmente interacciones del tipo puentes de agua y ocurrieron entre 60% y

70% de la MD. El residuo PHE-816 tuvo exclusivamente interacciones hidrofóbicas con la

azitromicina y estas ocurrieron durante el 60% de la MD. El residuo GLU-863 tuvo interacciones

de puentes de hidrogeno, puentes de hidrogeno a través de moléculas de agua, y brevemente

interacciones iónicas con la azitromicina.

23

Figura 12. Número de contactos de la azitromicina con los residuos de la cavidad A.

En la Figura 12 se puede observar el número de contactos de la azitromicina con cada residuo de

la cavidad A a través del tiempo de simulación. Es importante resaltar que la MD se estabilizó a

los 20ns, de forma que las interacciones que ocurren antes de este momento no son de interés, y

los residuos que exclusivamente tengan contacto con el antibiótico en la franja de tiempo 0 –

20ns no hacen parte de la cavidad A; al menos en lo que concierne a este análisis. De acuerdo a

esto se eliminan de consideración 6 residuos, que aparecen en amarillo oscuro en la Tabla 1.

Luego se procedió a la visualización de la MD analizando cada uno de los amino ácidos que de

acuerdo al software estaban interactuando con la azitromicina. El propósito de esta visualización

es determinar si la cadena lateral del residuo en cuestión está orientada hacia la cavidad, o si las

interacciones con la azitromicina se dan por rotaciones infrecuentes del backbone durante la MD,

de forma que la cadena lateral se orienta hacia la azitromicina en el instante de la interacción. En

otras palabras, este análisis se realiza con el propósito de separar los residuos que están

orientados hacia la cavidad, pero que interactúan con poca frecuencia con el ligando (y que

hacen parte del sitio de unión), de los residuos que no están orientados hacia la cavidad y solo

24

interactúan instantáneamente con el ligando cuando ocurre una rotación del backbone (y que no

hacen parte del sitio de unión). De acuerdo a esto se eliminaron de consideración 11 residuos,

que aparecen en rojo en la Tabla 1.

Finalmente, se realizó una visualización de la cavidad A con los residuos que no fueron

eliminados de consideración marcados. El objetivo era determinar si la cavidad A estaba

totalmente rodeada, en otras palabas si se formaba una esfera de amino ácidos alrededor de la

posición de la azitromicina. Se encontró que hacía falta completar una faceta de esta esfera, y el

residuo más cercano que la completaba era la GLY-717, que aparece en azul en la Tabla 1. A

pesar de que este residuo no interactuara con la azitromicina se agregó a la lista de amino ácidos

que componen la cavidad A, ya que se supone que en esta cavidad va a haber interacción con una

gran variedad molecular química; por lo que la ausencia de interacción con la azitromicina no es

importante.

Tabla 1. Residuos que interactúan con la azitromicina en la MD (rojo y negro), residuos que fueron eliminados

de consideración para la composición de la cavidad A (rojo), y residuos que fueron agregados a la composición

de la cavidad A (azul). CL – cadenas laterales.

Polar, CL sin

carga

No polar, CL

alifáticas

No polar, CL

aromáticas CL carga - CL carga +

Asparagina 135 Alanina 39 Fenilalanina 136 Glutamato 669 Lisina 823

Glutamina 812 Alanina 40 Fenilalanina 612 Glutamato 863

Glutamina 859 Glicina 614 Fenilalanina 816

Prolina 664 Glicina 717 Tirosina 77

Prolina 665 Glicina 858

Serina 134 Isoleucina 43

Serina 611 Leucina 668

Serina 613 Leucina 92

Serina 79 Metionina 570

Serina 81 Valina 38

Serina 860 Valina 814

Serina 89 Valina 90

Serina 91

Treonina 42

Treonina 44

Treonina 80

Treonina 93

25

En la Tabla 1 podemos observar los 19 residuos que componen la cavidad A de MtrD, siendo

estos los que están en negro y en azul. En la Figura 13 se puede ver la cavidad formada por estos

19 residuos (en rojo). Esta información se podrá utilizar para el análisis de clustering de la

cavidad A.

Figura 13. Cavidad A (en rojo), formada por los 19 residuos mostrados en la Tabla 1.

3.2.2.3.2 Determinación amino ácidos de la cavidad I

Esta determinación se realizó con la MD del complejo MtrD – MBX3135, y se analizaron las

interacciones de los residuos de MtrD y de MBX3135 en la cavidad I.

26

Figura 14. Contactos entre MBX3135 y residuos de la cavidad I de MtrD y la fracción de la dinámica en que

ocurrieron.

En la Figura 14 podemos observar en el eje X los residuos con los que MBX3135 interactuó a

través de la MD, y en el eje Y podemos ver la fracción de la MD sobre la que ocurrieron. Un

valor de 1 significa que la interacción ocurrió durante toda la dinámica, pero como algunos

residuos pueden tener más de una interacción simultánea pueden haber valores superiores a 1.

Se puede observar en la Figura 14 que los residuos GLN-34 y GLN-566 interactuaron

principalmente a través de puentes de agua con MBX3135, durante el 70% y 30% de la MD,

respectivamente. La PRO-665 interactuó con el inhibidor de AcrB durante casi toda la MD,

principalmente por puentes de hidrogeno, durante 85% de la MD, por puentes de agua, durante

más o menos 10% de la MD, y brevemente por interacciones hidrofóbicas. La PHE-612

interactuó con MBX3135 principalmente por interacciones hidrofóbicas, durante 35% de la MD,

y por puentes de agua, durante 10% de la MD. Los residuos PRO-664, ILE-667 y LEU-670

tuvieron interacciones exclusivamente hidrofóbicas, durante 20%, 30% y 25% de la MD,

respectivamente. La ASN-135 tuvo interacciones de puentes de agua y puentes de hidrogeno con

MBX3135.

27

Figura 15. Número de contactos de MBX3135 con los residuos de la cavidad I.

En la Figura 15 se puede observar el número de contactos de MBX3135 con cada residuo de la

cavidad I a través del tiempo de simulación. Es importante resaltar que la MD se estabilizó a los

20ns, de forma que las interacciones que ocurren antes de este momento no son de interés, y los

residuos que exclusivamente tengan contacto con el antibiótico en la franja de tiempo 0 – 20ns

no hacen parte de la cavidad I; al menos en lo que concierne a este análisis. De acuerdo a esto se

eliminan de consideración 6 residuos, que aparecen en amarillo oscuro en la Tabla 2.

Luego se procedió a la visualización de la MD analizando cada uno de los amino ácidos que de

acuerdo al software estaban interactuando con MBX3135. El propósito de esta visualización es

determinar si la cadena lateral del residuo en cuestión está orientada hacia la cavidad, o si las

interacciones con MBX3135 se dan por rotaciones infrecuentes del backbone durante la MD, de

forma que la cadena lateral se orienta hacia MBX3135 en el instante de la interacción. De

acuerdo a esto se eliminaron de consideración 17 residuos, que aparecen en rojo en la Tabla 2.

28

Finalmente, se realizó una visualización de la cavidad I con los residuos que no fueron

eliminados de consideración marcados. El objetivo era determinar si la cavidad I estaba

totalmente rodeada, en otras palabas si se formaba una esfera de amino ácidos alrededor de la

posición de MBX3135. Se encontró que no hacía falta completar ninguna faceta de esta esfera.

Tabla 2. Residuos que interactúan con MBX3135 en la MD (rojo y negro), residuos que fueron eliminados de

consideración para la composición de la cavidad A (rojo). CL – cadenas laterales.

Polar, CL sin

carga

No polar, CL

alifáticas

No polar, CL

aromáticas CL carga - CL carga +

Asparagina 135 Alanina 132 Fenilalanina 136 Glutamato 669 Arginina 133

Glutamina 34 Glicina 567 Fenilalanina 330 Arginina 174

Glutamina 566 Glicina 614 Fenilalanina 568 Arginina 861

Glutamina 859 Glicina 673 Fenilalanina 610 Lisina 823

Prolina 562 Glicina 675 Fenilalanina 612

Prolina 664 Glicina 857 Fenilalanina 623

Prolina 665 Glicina 858 Tirosina 325

Prolina 666 Isoleucina 667 Tirosina 35

Serina 134 Leucina 670 Tirosina 77




Serina 674 Valina 662

Serina 677

Serina 79

Serina 91

Treonina 42

Treonina 93

En la Tabla 2 podemos observar los 22 residuos que componen la cavidad I de MtrD, siendo

estos los que están en negro. En la Figura 16 se puede ver la cavidad formada por estos 22

residuos (en azul) Esta información se podrá utilizar para el análisis de clustering de la cavidad I.

29

Figura 16. Cavidad I (en azul), formada por los 22 residuos mostrados en la Tabla 2.

3.2.3 Análisis de clustering de las cavidades A e I en las dinámicas moleculares

El clustering conformacional es una herramienta que nos permite encontrar conformaciones de

las cavidades que ocurran con frecuencia, lo que indica que en un sistema biológico estas

conformaciones tendrán una mayor probabilidad de que puedan ser encontradas. La forma de

determinar esto es la población de los clusters; por ejemplo, un cluster con 500 frames de un total

de 2000, tendría un frame representativo que mostraría la conformación que adopta la cavidad el

25% del tiempo. Además, nos permite encontrar conformaciones diferentes de las cavidades,

información estructural importante para realizar el proceso de tamizaje in silico sobre diferentes

estados de los sitios de unión para aumentar el espacio químico que se podría explorar para

encontrar potenciales inhibidores. En síntesis, el clustering permite la extracción de

conformaciones de las cavidades A e I que sean frecuentes y diferentes entre ellas.

El análisis de clustering se realiza con el componente RMSD Based Clustering of Frames from

Desmond Trajectory del software Desmond (Desmond, 2017). Este utiliza la trayectoria de las

MD, escogiendo frames a un intervalo especificado, y luego los superpone antes de calcular el

RMSD. El intervalo escogido fue de 1 frame, de forma que se analizaron los 2000 frames de las

3 trayectorias. Luego, se calcula una matriz de RMSD de pares de átomos especificados, en este

30

caso siendo aquellos pertenecientes a los residuos que componen las cavidades A o I. Esta matriz

de RMSD se utiliza en el clustering jerárquico aglomerante, con un numero especificado de

clusters para terminar el análisis. Se determinó que el resultado fueran 10 y 15 clusters, ya que

estos valores eran los que mejor mostraban la variabilidad conformacional de las cavidades A e I.

En otras palabras, este cálculo agrupa los frames de la trayectoria de acuerdo a la similitud

conformacional de las cavidades A e I de acuerdo al RMSD de los pares de átomos de los

residuos que componen los sitios de unión. Además, nos provee con el frame representativo de

cada cluster, siendo este el que representa la conformación de la cavidad a la que las demás del

mismo cluster menos difieren.

3.2.3.1 Clustering de la cavidad A0

Este cálculo se realizó con la trayectoria de MtrD sin ligandos sobre los átomos que componen la

cavidad A, y se obtuvieron 10 (Figura 17) y 15 clusters (Figura 18). La cavidad A0 tiene la

misma composición que A1, pero en una conformación relajada. Cabe resaltar que esta MD se

estabilizó a los 40ns, que corresponde al frame 533, de forma que los clusters formados por

frames anteriores a este no son de interés. Esto elimina de consideración, en el clustering que

resulta en 10C (10 clusters) (Figura 17), de C5 a C10 (cluster 5 a cluster 10); en el clustering

que resulta en 15C (Figura 18), se eliminan de consideración C7 y de C9 a C15.

31

Figura 17. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad A en la trayectoria de MtrD,

especificando un resultado de 10 clusters.

En la Figura 17 se pueden observar las diferentes conformaciones que adopta la cavidad A0

cuando estas se dividen en 10C, de los cuales los únicos que están en la etapa posterior a la

estabilización de la MD son C1 a C4. El cluster más poblado es C3, con 411 frames, seguido de

C2, con 291 frames, y luego de C1, con 205 frames. Algo interesante de este clustering es que

muestra como la cavidad A0 de MtrD visita dos veces la conformación que representa C1.

32

Figura 18. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad A en la trayectoria de MtrD,




estabilización de la MD son C1 a C6 y C8. El cluster más poblado es C4, con 294 frames,

seguido de C8, con 278 frames, y luego de C1, con 205 frames.

Comparando la Figura 17 y la Figura 18 podemos ver que C1 está conservado en ambos

clustering, lo que indica que son conformaciones con un RMSD muy cercano entre ellas. Si lo

contrario fuera cierto este cluster se dividiría en clusters menos poblados, como ocurrió con C2 –

10C (C2 de 10C). La división de C2 – 10C en C2 y C3 – 15C sugiere que este cluster contiene

conformaciones de A0 que difieren entre ellas, de forma que tiene una alta variabilidad

conformacional, resultado que no conviene para el propósito de este análisis. C3 – 10C se dividió

en C4 – 15C y C5 – 15C, siendo este último compuesto también por 100 frames de C5 – 10C,

que comparte similitudes estructurales con la proteína antes de la convergencia de la MD.

Dado esto, se escogerán las estructuras representativas de C1 y C4 – 15C para realizar el

tamizaje in silico sobre la cavidad A0. C1 – 15C porque está conservado en ambos clustering y

C4 – 15C porque es el más poblado compuesto por frames posteriores a la convergencia de MD.

No se escogió C3 – 10C, aunque fuera el más poblado, por contener frames que se agrupan en

15C con estructuras de la proteína antes de la convergencia.

33

3.2.3.2 Clustering de la cavidad I0

Este cálculo se realizó con la trayectoria de MtrD sin ligandos sobre los átomos que componen la

cavidad I, y se obtuvieron 10 (Figura 19) y 15 clusters (Figura 20). La cavidad I0 tiene la

misma composición que I1, pero en una conformación relajada. Cabe resaltar que esta MD se

estabilizó a los 40ns, que corresponde al frame 533, de forma que los clusters formados por

frames anteriores a este no son de interés. Esto elimina de consideración, en el clustering que

resulta en 10C (Figura 19), C3 y de C5 a C10; en el clustering que resulta en 15C (Figura 20),

se eliminan de consideración de C4, C5 y de C8 a C15.

Figura 19. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad I en la trayectoria de MtrD,


En la Figura 19 se pueden observar las diferentes conformaciones que adopta la cavidad I0


estabilización de la MD son C1, C2 y C4. El cluster más poblado es C1, con 802 frames, seguido

de C4, con 292 frames, y luego de C2, con 198 frames.

34

Figura 20. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad I en la trayectoria de MtrD,





seguido de C2, con 311 frames, luego de C7, con 209 frames, y finalmente por C3, con 198

frames.

Comparando la Figura 19 y la Figura 20 podemos ver que C1 – 10C se divide en C1 y C2 –

15C, sugiriendo que los dos últimos comparten características estructurales. C2 – 10C está

conservado en ambos clustering, pero cambia de nomenclatura a C3 – 15C. C4 – 10C se divide

en C6 y C7 – 15C.


tamizaje in silico sobre la cavidad I0. C1 – 15C se escogió sobre C2 – 15C, siendo que ambos

provienen del mismo cluster de 10C, porque entre los dos es el más poblado y porque la

orientación de los residuos que componen la cavidad I cambian en las estructuras representativas

de C1 y C2 – 15C. C3 – 15C en vez de C7 – 15C, aunque este último esté más poblado, porque

está conservado en ambos clustering.

3.2.3.3 Clustering de la cavidad A1

35

Este cálculo se realizó con la trayectoria de MtrD – azitromicina sobre los átomos que componen

la cavidad A, y se obtuvieron 10 (Figura 21) y 15 clusters (Figura 22). Cabe resaltar que esta

MD se estabilizó a los 20ns, que corresponde al frame 266, de forma que los clusters formados

por frames anteriores a este no son de interés. Esto elimina de consideración, en el clustering que

resulta en 10C (Figura 21), de C5 a C10; en el clustering que resulta en 15C (Figura 22), se

eliminan de consideración C7 y C9 a C15.

Figura 21. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad A en la trayectoria de MtrD –

azitromicina , especificando un resultado de 10 clusters.



estabilización de la MD son de C1 a C4. El cluster más poblado es C4, con 574 frames, seguido

de C3, con 472 frames, luego de C2, con 342 frames, y finalmente C1, con 136 frames.

36

Figura 22. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad A en la trayectoria de MtrD –

azitromicina, especificando un resultado de 15 clusters.




seguido de C5, con 302 frames, luego de C6, con 272 frames, y finalmente C3, con 258 frames.


clustering. C3 – 10C se divide en C3 y C4 – 15C. C4 – 10C, el cluster más poblado de este

clustering, se divide en C5 y C6 – 15C, siendo C5 – 15C el más poblado de estos dos.


tamizaje in silico sobre la cavidad A1. C2 – 15C se escogió porque está conservado en ambos

clustering y porque es el cluster más poblado de 15C. C5 – 15C se escogió por ser el segundo

cluster más poblado de 15C.

3.2.3.4 Clustering de la cavidad I1

37

Este cálculo se realizó con la trayectoria de MtrD – MBX3135 sobre los átomos que componen

la cavidad I, y se obtuvieron 10 (Figura 23) y 15 clusters (Figura 24). Cabe resaltar que esta

MD se estabilizó a los 20ns, que corresponde al frame 266, de forma que los clusters formados

por frames anteriores a este no son de interés. Esto elimina de consideración, en el clustering que

resulta en 10C (Figura 23), de C5 a C10; en el clustering que resulta en 15C (Figura 24), se

eliminan de consideración de C7 a C15.

Figura 23. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad I en la trayectoria de MtrD –

MXB3135, especificando un resultado de 10 clusters.



estabilización de la MD son de C1 a C4. El cluster más poblado es C1, con 519 frames, seguido

de C3, con 450 frames, luego de C2, con 386 frames, y finalmente C4, con 217 frames.

38

Figura 24. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad I en la trayectoria de MtrD –

MXB3135, especificando un resultado de 15 clusters.



estabilización de la MD son C1 a C6. El cluster más poblado es C1, con 519 frames, seguido de

C4, con 391 frames, luego de C6, con 219 frames, y finalmente C2, con 209 frames.


clustering y tiene una población muy alta. C3 – 10C se divide en C4 y C5 – 15C, pero C5 – 15C

tiene una población de solamente 59 frames. En esta división también se puede apreciar como la

cavidad I1 visita una misma conformación, representada por más de una vez a través de la MD.

C2 – 10C se divide en C2 y C3 – 15C.


tamizaje in silico sobre la cavidad I1. C1 – 15C se escogió porque está conservado en ambos

clustering y porque es el cluster más poblado de 15C. C4 – 15C se escogió por ser el segundo

cluster más poblado de 15C.

3.3 Tamizaje in silico para encontrar potenciales inhibidores de MtrD

El tamizaje in silico es un proceso que permite encontrar moléculas potencialmente afines a un

sitio de unión a partir de una librería de miles de compuestos. Se realiza utilizando cálculos de

docking sucesivos, y con funciones de scoring cada vez más exigentes a medida que se va

filtrando la librería. El propósito de este paso es encontrar potenciales inhibidores de MtrD, o

39

moléculas que sean afines a la cavidad A o I, y que interrumpan su funcionalidad al mantenerse

unidos a las cavidades impidiendo que MtrD reconozca la azitromicina.

Este proceso se realizó con el componente Virtual Screening Workflow (VSW) de Glide

(Halgren et al., 2004), al cual se le provee un archivo con la librería de compuestos cuya afinidad

va a ser determinada, los receptores sobre los cuales se medirá la afinidad, y las características de

los docking a realizar. La librería utilizada fue Asinex Elite Library, con 103175 compuestos. Se

utilizaron en total 8 conformaciones de MtrD, 4 de la cavidad A (2 de A1 y 2 de A0) y 4 de la

cavidad I (2 de I1 y 2 de I0). Se realizó un tamizaje in silico por cada receptor, todos utilizando

la misma librería.

VSW realiza un primer docking con todos los compuestos de la librería con el algoritmo High

Throughput Virtual Screening (HTVS), y después del docking se le pidió que mantuviera 5% de

los mejores compuestos. Luego hace un segundo docking con los mejores compuestos de HTVS

con el algoritmo Standard Precision (SP), y después del docking se le pidió que mantuviera los

mejores 200 compuestos. Finalmente, realiza un tercer docking con el algoritmo Extra Precision

(XP), que utiliza una versión distinta de Glide (Friesner et al., 2006), sobre los mejores 200

compuestos de SP, y se le pidió que reportara solamente los mejores 100 compuestos. Esta

metodología está ilustrada en el Diagrama 2.

Diagrama 2. Ilustración de la metodología empleada para el tamizaje in silico.

3.3.1 Preparación de la librería Asinex Elite Library para el tamizaje in silico

La preparación de los ligandos se realizó solamente para el primer tamizaje in silico, y para los

demás se utilizó el archivo de los ligandos preparados. La preparación tuvo la misma

metodología a aquella en la sección 3.2.1.1, y luego de la preparación se realizó un proceso de

filtraje. El filtraje se realizó con el software QikProp (Schrodinger, 2018), que calcula

40

propiedades farmacéuticamente relevantes de los compuestos a partir de su estructura 3D. Entre

estas propiedades están las que menciona la regla de cinco de Lipinski (Lipinski, Lombardo,

Dominy, & Feeney, 2001), que luego utiliza para eliminar las moléculas que no la cumplan.

Además se eliminan compuestos con grupos reactivos.

El resultado de la preparación y filtraje de la librería Asinex Elite Library fue un archivo con

95422 compuestos y 326365 conformaciones.

3.3.2 Preparación de grids para las cavidades A e I

La preparación de los grids se realizó antes del VSW, de forma que a este se le proveyeron los 8

grids preparados. Se utilizó el componente Receptor Grid Generation de Glide (Halgren et al.,

2004) para este proceso.

3.3.2.1 Preparación grids de la cavidad A0 y A1

Se prepararon 2 grids para la cavidad A0 a partir de las estructuras representativas de C1 y C4 –

15C, y 2 grids para la cavidad A1 a partir de las estructuras representativas de C2 y C5 – 15C. El

centro del grid se determinó utilizando los 19 residuos que componen la cavidad A, mostrados en

la Tabla 1.

Se obtuvieron 4 grids: A0 – C1, A0 – C4, A1 – C2 y A1 – C5.

3.3.2.2 Preparación grids de la cavidad I0 e I

Se prepararon 2 grids para la cavidad I0 a partir de las estructuras representativas de C1 y C3 –

15C, y 2 grids para la cavidad I1 a partir de las estructuras representativas de C1 y C4 – 15C. El

centro del grid se determinó utilizando los 22 residuos que componen la cavidad I, mostrados en

la Tabla 2.

Se obtuvieron 4 grids: I0 – C1, I0 – C3, I1 – C1 y I1 – C4.

3.3.3 Resultados tamizaje in silico

Se realizaron 8 tamizajes in silico con los compuestos preparados en la sección 3.3.1, y los 8

grids preparados en la sección 3.3.2. Cada tamizaje resultó en 100 compuestos, resultando en un

total de 800 compuestos; de los cuales 400 estaban asociados a la cavidad A y los otros 400

asociados a la cavidad I.

Los resultados para cada cavidad se agruparon, independientemente de si venían de la estructura

relajada (A0/I0) o de la estructura con un ligando (A1/I1), puesto que son la misma cavidad en

conformaciones diferentes. El propósito de este estudio es encontrar los ligandos que presenten

la mejor afinidad para la cavidad A e I, en cualquier conformación que sea frecuente en la

proteína.

41

3.3.3.1 Resultados del tamizaje in silico de la cavidad A0 y A1

Los 20 compuestos más afines a la cavidad A (incluye A0 y A1) están presentados en la Tabla 3.

Se puede observar que todos los puntajes de docking XP son mayores al puntaje de docking XP

de la azitromicina. Este se obtuvo en la sección 3.2.1.3, y el valor fue de -8.584 𝑘𝑐𝑎𝑙

𝑚𝑜𝑙. Esta

comparación es meramente de referencia, ya que la azitromicina es un sustrato de la proteína, y

no un inhibidor. De forma que la información que se puede inferir de esta comparación es que de

acuerdo al software estas 20 moléculas son más afines a la cavidad A de MtrD que la

azitromicina. Siendo así, existe la posibilidad que estos compuestos, o algunos de ellos, sean

capaces de unirse a la proteína con mayor afinidad y disrumpir su funcionamiento. En otras

palabras, los resultados encontrados para la Cavidad A son lo esperado de moléculas con

potencial inhibitorio: presentar una mayor afinidad por la proteína que un sustrato común.

Es importante resaltar que el compuesto AEM 17368541 aparece en la lista en las posiciones 1 y

19 (Tabla 3). Se decidió mantener la lista de esta manera ya que este compuesto tuvo excelentes

puntajes de docking en dos grids diferentes (CavA1-Clu2, posición 1, y CavA0-Clu4, posición

19), siendo uno de ellos el mejor puntaje para la cavidad A. Además, en cada grid interactuó con

residuos diferentes: en CavA1-Clu2 tuvo interacciones con los residuos PHE-623, GLU-669,

SER-134, TYR-325 y VAL-38, principalmente a través de puentes de hidrogeno y enlaces π –

catión; en CavA0-Clu4 tuvo interacciones con ASP-83, PHE-610, GLY-614, GLU-669 y SER-

611, principalmente a través de puentes de hidrogeno, enlaces π – catión y puentes salinos.

Tabla 3. Resultados del tamizaje in silico de la cavidad A de MtrD.

A-Rank Compound

code

XP score

(kcal/mol)

SP score

(kcal/mol) Grid

1 AEM 17368541 -11.366 -11.272 CavA1-Clu2

2 SYN 15662120 -11.125 -10.522 CavA1-Clu2

3 ADM 12232132 -11.030 -11.030 CavA0-Clu1

4 LMG 15227407 -10.983 -9.318 CavA0-Clu1

5 SYN 15662268 -10.871 -10.768 CavA1-Clu2

6 LEG 14688228 -10.681 -10.283 CavA0-Clu1

7 LMK 17710488 -10.497 -10.334 CavA0-Clu1

8 ADM 13809111 -10.308 -9.751 CavA0-Clu1

9 LEG 17710735 -10.307 -10.116 CavA0-Clu1

10 SYN 20067946 -10.184 -9.825 CavA0-Clu1

11 LEG 15407554 -10.114 -9.094 CavA1-Clu2

12 SYN 15543837 -10.099 -10.016 CavA1-Clu2

13 AOP 18546356 -10.093 -9.870 CavA1-Clu2

42

14 ADM 13302999 -10.075 -9.898 CavA1-Clu2

15 AEM 14468192 -10.063 -9.832 CavA1-Clu2

16 LEG 17217288 -10.026 -10.017 CavA0-Clu1

17 AEM 10821016 -10.025 -9.962 CavA0-Clu1

18 AEM 17368395 -10.018 -9.963 CavA0-Clu4

19 AEM 17368541 -10.013 -9.919 CavA0-Clu4

20 SYN 15410027 -9.978 -9.318 CavA1-Clu2

Los compuestos 2, 3, 5, 6, 8, 10, 14, 15, 16, 18, y 19 (diez compuestos) tienen interacciones con

uno o más residuos del loop rico en glicina, que está asociado a la inhibición de AcrB. Los

residuos del loop involucrados en estas interacciones son PHE-610, SER-611, PHE-612, SER-

613 y GLY-614. Las interacciones con estos residuos varían entre π – π stacking, con los

residuos aromáticos, puentes de hidrogeno con el backbone y con cadenas laterales, puentes de

hidrogeno aromáticos, e interacciones π – catión.

Todos los compuestos, excepto el 12 y 13, están entre 1.75 – 3.28 Å del loop rico en glicina. Las

dos excepciones están a 4.98 y 5.35 Å, respectivamente. Esto sugiere que, aunque la posición de

algunos de estos compuestos no cumpla los criterios geométricos de interacción, en el sistema

biológico pueden haber interacciones directamente con loop, o que estos compuestos sean

capaces de impedir su movimiento dada su cercanía.

En la cavidad A hay cuatro residuos aromáticos que forman una trampa hidrofóbica (Figura 25),

que parece ser aquella previamente descrita en AcrB (Sjuts et al., 2016). Los residuos son PHE-

136, TYR-325, PHE-568 y PHE-623, y estos tienen interacciones del tipo π – π stacking con los

compuestos 1, 2, 5, 11, 12, 13, 15 y 20 (ocho compuestos). Esta trampa parece estabilizar los

compuestos con anillos aromáticos, aumentando su afinidad por la cavidad A. En la Figura 25 se

puede apreciar, en líneas azules discontinuas, las diferentes formas en que puede ocurrir esta

interacción con el compuesto 2, dependiendo de la orientación del ligando y de las cadenas

laterales. Estos compuestos interactúan con uno hasta cuatro residuos que componen la trampa.

Figura 25. Compuesto 2 dentro de la trampa hidrofóbica de MtrD. Líneas

discontinuas en azul son representaciones de las posibles interacciones de

π – π stacking que hay entre la trampa y el ligando.

TYR-325

PHE-623

PHE-568

PHE-136

43

El residuo GLU-669 interactúa con todos los compuestos excepto el 14. Las interacciones con

este residuo incluyen hasta: dos puentes de hidrogeno, con la cadena lateral y/o el backbone; dos

puentes salinos, con la cadena lateral; dos puentes de hidrogeno aromáticos, con la cadena lateral

y/o el backbone. El compuesto 13 tiene hasta cinco interacciones con este residuo (Figura 26),

uno o dos puentes de hidrogeno con la cadena lateral, o un puente salino en vez de un puente de

hidrogeno, y dos puentes de hidrogeno aromáticos, uno con la cadena lateral y el otro con el

backbone. Estos resultados sugieren que GLU-669 es de alta importancia para el reconocimiento

de sustratos, puesto que tuvo interacciones con 95% de los mejores 20 potenciales inhibidores

para la cavidad A.

Figura 26. Interacción entre el compuesto 13 y el residuo GLU669. Líneas discontinuas en azul claro, amarillo

y rosado son, respectivamente, representaciones de interacciones de puentes de hidrogeno aromáticos, puentes

de hidrogeno y puente salino.

Las demás interacciones de estos compuestos se pueden ver en detalle en la Tabla A1, en

anexos.

En la Figura 27 se puede apreciar la estructura de los mejores 10 potenciales inhibidores para la

cavidad A (la estructura de los compuestos 11 a 20 está en la Figura A1, en anexos). Los

compuestos 2 y 10 son derivados del benzimidazole funcionalizados en diferentes posiciones.

Los compuestos 1 y 5 son derivados del indol funcionalizados en diferentes posiciones. Los

compuestos 7, 8 y 9 comparten el mismo núcleo pyrazolo[1,5-a]pyrimidina-7(4H)-one

funcionalizados en diferentes posiciones. El compuesto 3 es un derivado de la indolina,

funcionalizado en las posiciones 2 y 7. El compuesto 4 es un derivado de (3-2H)-4H-Chromen-4-

one, funcionalizado en la posición 2. El compuesto 6 es un derivado del imidazol, funcionalizado

en la posición 2.

GLU-669

44

Figura 27. Los 10 compuestos más afines a la cavidad A de MtrD.

Los compuestos encontrados para la cavidad A se encuentran anclados a la proteína

principalmente por puentes de hidrogeno y secundariamente por interacciones del tipo π – π

stacking. La mayoría de estos compuestos presenta entre 4 y 6 puentes de hidrogeno y entre 1 a 4

interacciones π – π stacking, lo que explica porque los puntajes de docking son tan altos. Los

puentes de hidrogeno son la interacción que más estabiliza una interacción proteína – ligando,

seguida de las interacciones π – π stacking (Kitchen et al., 2004). Además, 18 de los mejores 20

compuestos están a una distancia menor a 3.28Å del loop rico en glicina, y 10 de estos 18

presentan interacciones directas con el loop. Esto sugiere que los compuestos encontrados

pueden bloquear el movimiento del loop rico en glicina, sea por impedimento estérico o por

interacciones directas, emulando el mecanismo de inhibición de MBX3135 en AcrB. Otra

característica común de 8 de los mejores 20 compuestos es estar dentro de una trampa

hidrofóbica compuesta por 4 residuos, cuya presencia no había sido confirmada en MtrD, pero si

en AcrB, y cuyas interacciones están asociadas a una mejora en el índice de inhibición de los

mejores inhibidores de AcrB (Sjuts et al., 2016). Los altos puntajes de docking y las

características previamente mencionadas aportan confianza a que algunos de los compuestos

encontrados sean inhibidores de MtrD.

45

3.3.3.2 Resultados tamizaje in silico de la cavidad I0 e I1

Los 20 compuestos más afines a la cavidad I (incluye I0 e I1) están presentados en la Tabla 4. Se

puede observar que todos los puntajes de docking XP son mayores al puntaje de docking XP de

MBX3135. Este se obtuvo en la sección 3.2.1.3, y el valor fue de -6.581 𝑘𝑐𝑎𝑙

𝑚𝑜𝑙. Esta comparación

es meramente de referencia, ya que MBX3135 es un inhibidor de AcrB, y no de MtrD. De forma

que la información que se puede inferir de esta comparación es que de acuerdo al software estas

20 moléculas son más afines a la cavidad I de MtrD que MBX3135. Es importante resaltar que

dada la similitud estructural entre AcrB y MtrD estos resultados sugieren que las moléculas

encontradas, al tener un mejor puntaje de docking que MBX3135, tienen una muy buena

probabilidad de unirse a la Cavidad I con suficiente afinidad para ocasionar inhibición.

Tabla 4. Resultados del tamizaje in silico de la cavidad I de MtrD.

I-Rank Compound Code XP score

(kcal/mol)

SP score

(kcal/mol) Grid

1 SYN 20121713 -12.249 -12.249 CavI1-Clu1

2 LEG 20112752 -11.981 -11.981 CavI1-Clu1

3 SYN 20111262 -11.748 -11.748 CavI1-Clu1

4 SYN 20011339 -11.643 -11.643 CavI1-Clu1

5 AEM 17457717 -11.619 -11.528 CavI1-Clu1

6 ART 17731821 -11.576 -11.161 CavI1-Clu1

7 LMK 20989244 -11.421 -11.421 CavI1-Clu1

8 AEM 17457954 -11.362 -11.267 CavI1-Clu1

9 SYN 20045816 -11.357 -11.357 CavI1-Clu1

10 SYN 20119221 -11.309 -11.309 CavI1-Clu1

11 SYN 22338318 -11.217 -11.185 CavI1-Clu1

12 ART 20458851 -11.189 -11.152 CavI1-Clu1

13 AEM 17458517 -11.029 -10.936 CavI1-Clu1

14 SYN 24376253 -10.985 -9.651 CavI0-Clu3

15 SYN 22873506 -10.975 -10.234 CavI0-Clu3

16 SYN 26081504 -10.901 -10.490 CavI1-Clu1

17 AEM 17457261 -10.649 -10.554 CavI1-Clu1

18 SYN 15653212 -10.608 -10.119 CavI1-Clu1

19 SYN 26081481 -10.578 -10.168 CavI1-Clu1

20 AOP 22313704 -10.544 -10.522 CavI1-Clu1

46

En la cavidad I solamente cinco compuestos mostraron interacciones con el loop rico en glicina.

Estos fueron el 5, 8, 13, 16 y 19 y todos interactuaron exclusivamente con el residuo PHE-610,

principalmente por π – π stacking, y en una ocasión por puentes de hidrogeno aromáticos con la

cadena lateral. A pesar de esta falta de interacciones directas con el loop en comparación a los

compuestos encontrados para la cavidad A, todos excepto los compuestos 6, 12, 15 y 17 están

entre 2.01 – 3.61 Å. Las excepciones están entre 4.33 – 7.70 Å. Nuevamente, esto sugiere que a

pesar de que los compuestos encontrado por el tamizaje no aparenten interactuar directamente

con el loop, están suficientemente cerca para ser un impedimento estérico, de forma que podrían

inhibir MtrD por un mecanismo similar al de MBX3135 en AcrB.

Los compuestos 1, 2, 3, 9, 10, 11 y 12 interactúan con dos residuos de la trampa hidrofóbica,

PHE-568 y TYR-325, exclusivamente por puentes de hidrogeno, y puentes de hidrogeno

aromáticos para el compuesto 1. Estos compuestos están sobre la trampa (Figura 28), no dentro

de ella como los compuestos encontrados para la cavidad A.

Figura 28. Compuesto 1 sobre la trampa hidrofóbica. Líneas descontinuas en azul claro y en amarillo son,

respectivamente, representaciones de interacciones de puentes de hidrogeno aromáticos y puentes de

hidrogeno.

No se encontró ningún patrón discernible en las interacciones de los mejores 20 compuestos con

la cavidad I, a diferencia de la cavidad A. Las demás interacciones de estos compuestos se

pueden ver en detalle en la Tabla A2, en anexos.

En la Figura 29 se puede apreciar la estructura de los mejores 10 potenciales inhibidores para la

cavidad I (la estructura de los compuestos 11 a 20 está en la Figura A2, en anexos). Los

PHE-136

PHE-623 PHE-568

TYR-325

47

compuestos 1, 2, 3, 4, 9 y 10 son derivados del glycoluril sustituidos en la misma posición, pero

con diferente estereoquímica. Los compuestos 5, 7 y 8 son compuestos derivados del

fluorobenceno sustituidos en diferentes posiciones. El compuesto 6 es un derivado del 1,7-

Diazaindene sustituido en las posiciones 2 y 3.

Figura 29. Los 10 compuestos más afines a la cavidad I de MtrD.

Los compuestos encontrados para la cavidad I se encuentran anclados a la proteína

principalmente por puentes de hidrogeno. La mayoría de estos compuestos presenta entre 5 y 7

puentes de hidrogeno, lo que explica porque los puntajes de docking son tan altos. Los 7 mejores

compuestos para la cavidad I presentan puntajes de docking superiores al de los mejores 20

compuestos encontrados para la cavidad A. Estos mejores 7 compuestos para la cavidad I tienen

entre 6 y 7 puentes de hidrogeno, lo que explica los valores más altos que aquellos encontrados

para la cavidad A.

Además, 18 de los mejores 20 compuestos están a una distancia menor a 3.61Å del loop rico en

glicina, pero solo 5 de estos 18 presentan interacciones directas con el loop. Esto sugiere que los

48

compuestos encontrados pueden bloquear el movimiento del loop rico en glicina, sea por

impedimento estérico o por interacciones directas, emulando el mecanismo de inhibición de

MBX3135 en AcrB. Los altos puntajes de docking y las características previamente mencionadas

aportan confianza a que algunos de los compuestos encontrados sean inhibidores de MtrD.

4. Discusión

4.1 Estructura de MtrD y conformaciones obtenidas por MD

La estructura de MtrD que fue utilizada en todos los experimentos estaba truncada, ya que se

eliminó por completo el dominio transmembranal. Para las simulaciones de docking este cambio

no presenta pérdidas de fidelidad al sistema biológico, dado que estas se realizan sobre un grid,

que no incluye toda la proteína. Ninguno de los grids que se utilizaron incluían el dominio

transmembranal, de forma que la ausencia del dominio transmembranal no afectaría los

resultados obtenidos.

El truncamiento de MtrD sí resulta en pérdidas de información en las dinámicas moleculares,

puesto a que el comportamiento de esta proteína es influenciado por estar anclada a una

membrana lipídica. El anclaje implica una limitación del movimiento predominantemente en la

región inferior de MtrD, disminuyendo gradualmente hacia las partes superiores de la proteína;

lo que implica que en la región media de la proteína también habría rigidez estructural. Las

restricciones de movimiento a los átomos de la frontera entre el dominio transmembranal y el

dominio periplásmico, en las dinámicas moleculares, no representarían bien la limitación de

movimiento otorgada por el anclaje. Estas restricciones no reducirían el movimiento de la región

media de la proteína, ni simularían la reducción gradual de esta limitación de movimiento.

Además, en el sistema biológico MtrD se encuentra en complejo con MtrC, que se une a los

surcos interprotomericos en la parte superior de la proteína (Janganan et al., 2013), y en

consecuencia tiene su movimiento restringido por esta interacción. Se intentó simular esta

limitación restringiendo algunos átomos de la parte superior, pero esto ignora la influencia

electrostática de los residuos de MtrC sobre MtrD. Dadas ambas dificultades para simular

verídicamente el movimiento de MtrD en el espacio periplásmico, es posible que las

conformaciones que se obtuvieron en las dinámicas moleculares no sean conformaciones que

ocurran en el sistema biológico. A pesar de esta posibilidad, se debe tener en cuenta que la

metodología empleada ya había sido validada, de forma que los resultados encontrados en este

estudio son muy prometedores (Vargiu et al., 2014).

A pesar de esto, se mantuvieron las restricciones previamente explicadas ya que en estudios

anteriores, que resultaron exitosos, realizaron dinámicas con AcrB truncada y aplicaron

restricciones de movimiento sobre los átomos de la frontera entre el dominio transmembranal y

periplásmico (Vargiu et al., 2014). En este estudio lograron simular apropiadamente el

comportamiento de AcrB y elucidar el mecanismo de inhibición de MBX3135, lo que respalda la

aplicación de este modelo truncado para MtrD.

4.2 Tamizaje in silico

49

El propósito de utilizar 4 grids en el tamizaje es poder explorar una mayor parte del espacio

químico de moléculas potencialmente afines a la cavidad A de MtrD. Por esto, se espera que en

los 400 compuestos que llegaron a la última etapa del tamizaje no aparezcan muchos duplicados.

A pesar de esto, la presencia de duplicados no es un resultado negativo, puesto que esto sugiere

que los compuestos repetidos son afines a la cavidad A en diferentes conformaciones. No hubo

ningún compuesto que mostrará afinidad por los 4 grids utilizados para explorar la cavidad A,

pero si se encontraron 2 compuestos comunes entre CavA – Clu2, CavA0 – Clu1 y CavA0 –

Clu4 y 1 compuesto en común entre CavA – Clu5, CavA0 – Clu1 y CavA0 – Clu4. El mayor

número de compuestos compartidos fue de 12, entre CavA0 – Clu1 y CavA0 – Clu4. El hecho

que en el tamizaje in silico solo se encontraron 12 compuestos en común de ~104.000, muestra

que las conformaciones extraídas de las dinámicas moleculares eran suficientemente diferentes, y

se logró explorar una mayor parte del espacio químico. La variedad molecular de los mejores

compuestos obtenidos hubiera sido distinguidamente menor si se hubiera usado solo un grid.

Para la cavidad I se encontraron muy pocos resultados en común. Entre CavI – 1 y CavI – 4 se

encontraron 7 compuestos comunes, y no hubo ningún resultado que apareciera para tres de los

grids. Nuevamente, mostrando que el análisis de clustering fue efectivo determinando

conformaciones diferentes de las cavidades a partir de las dinámicas moleculares.

Los resultados del tamizaje in silico para la cavidad A son muy prometedores, puesto que se

logró determinar que muchos de los compuestos más afines están dentro de la trampa hidrofóbica

e interactúan con, o están cercanos a, el loop rico en glicina. Ambas interacciones han sido

caracterizadas para los inhibidores conocidos de AcrB, y sugieren que los potenciales inhibidores

encontrados podrían tener un mecanismo de acción similar. Además, la mayoría de los

compuestos encontrados tienen un carbonilo cercano a un grupo polar; que parece estar anclando

los compuestos al residuo GLU-669. La azitromicina también está anclada a MtrD a través de un

puente de hidrogeno y un puente salino con GLU-669, lo que soporta la hipótesis de que este es

un residuo importante en el reconocimiento de sustratos de MtrD.

Ninguno de los compuestos en la cavidad I estaba dentro de la trampa hidrofóbica, aunque

muchos sí interactuaban con, o estaban cercanos a, el loop rico en glicina. Pero, los mejores

puntajes de docking fueron los de los compuestos afines a esta cavidad [I]. Estos resultados

sugieren que los mejores compuestos de esta cavidad, aunque no compartan el mecanismo de

inhibición de MBX3135 en AcrB, presenten un modo de acción completamente diferente que de

igual manera resulte en la inhibición de MtrD. A pesar de esto, los compuestos encontrados para

la cavidad A son más alentadores, ya que sus posiciones parecen reflejar el mismo

comportamiento inhibitorio de MBX3135 en AcrB y presentan excelentes puntajes de docking.

Indudablemente, el siguiente paso es realizar ensayos experimentales con estos potenciales

inhibidores para determinar su eficacia in vivo. El hecho de que los compuestos encontrados para

la cavidad I tuvieron mejores puntajes de docking que los compuestos encontrados para la

cavidad A puede ser explicado por el numero de puentes de hidrogeno. Los compuestos de la

cavidad I con un mayor puntaje de docking (los mejores 7) presentaban, en promedio, más

puentes de hidrogeno que los mejores 20 de la cavidad A.

Otro factor que soporta la plausibilidad de haber encontrado moléculas potencialmente

inhibitorias para MtrD es la diferencia entre las interacciones de los compuestos encontrados con

50

la proteína y de la azitromicina con la proteína. No solo los puntajes de docking de los

compuestos encontrados fueron mejores que el puntaje de la azitromicina, si no que la mayoría

de estos compuestos presentaban un mayor numero de interacciones con MtrD, lo que

aumentaría la energía necesaria para deshacer estas interacciones.

Al comparar las poses de los mejores compuestos de la cavidad A con la pose de la azitromicina,

es claro que el antibiótico no interactúa con la trampa hidrofóbica, a diferencia de los mejores

compuestos determinados por el tamizaje in silico. La mayoría de estos compuestos se encuentra

dentro de la trampa, de forma que se podría explicar a través de esta interacción diferencial la

posible inhibición de MtrD por los compuestos encontrados, y la no inhibición de esta bomba de

expulsión por su sustrato. Además, la azitromicina se encuentra anclada a MtrD por dos puentes

de hidrogeno y un puente salino (desconsiderando los puentes de hidrogeno con dos residuos

pertenecientes al loop rico en glicina, ya que estas interacciones están asociadas a la expulsión

del sustrato y no su permanencia en la cavidad A). Mientras que los compuestos encontrados en

el tamizaje in silico para la cavidad A muestran, por lo general, un mayor numero de

interacciones y otros tipos de interacciones (por ejemplo, la presencia de interacciones

Una vez se haya determinado cuales compuestos presentan la mayor actividad se puede realizar

un análisis exhaustivo de su mecanismo de acción. Se deberían realizar dinámicas moleculares, y

determinar las contribuciones atómicas del inhibidor a la energía libre de unión con respecto a la

proteína a lo largo de la dinámica. De esta forma, se podría encontrar cuales grupos funcionales

del inhibidores son los que menos contribuyen a la formación del complejo MtrD – inhibidor,

para que estos sean modificados de forma que la afinidad del inhibidor aumente; disminuyendo

la concentración necesaria de este compuesto para ocasionar inhibición.

Cuando se haya desarrollado un inhibidor de MtrD comprobado experimentalmente y

optimizado computacionalmente, este podría ser aplicado en conjunto con la terapia dual

actualmente utilizada. La ventaja de esta terapia trial sería una mayor disminución en la

probabilidad del desarrollo de la resistencia al tratamiento, ya que se ha demostrado que la

inhibición de las bombas de expulsión impide la generación de resistencia a través de otros

mecanismos por parte de la bacteria (Piddock, 2014), y además haría con que la terapia evada

exitosamente la resistencia actual de N. gonorrhoeae a la azitromicina.

5. Conclusiones

▪ Se lograron obtener diferentes conformaciones de la cavidad de reconocimiento de

sustratos de MtrD a partir de dinámicas moleculares, utilizando la herramienta de

clustering.

▪ Se encontró que los compuestos que se anclaron a la cavidad A se posicionan dentro de

una trampa hidrofóbica y que estaban cercanos a, o interactúan con, un loop rico en

glicina, ambas características encontradas en los inhibidores de AcrB.

▪ Se encontró que los compuestos que se anclaron a la cavidad I se posicionan cerca de la

trampa, pero no interactuaban con ella. Sí interactuaban con, o estaban cercanos a, el loop

rico en glicina.

51

▪ Se encontraron potenciales inhibidores de MtrD muy prometedores, que podrían restaurar

la eficacia de la azitromicina como tratamiento de la gonococia.

▪ Para lograr un mayor acercamiento al sistema biológico, se puede utilizar MtrD sin

truncar, anclada a una membrana y en complejo con MtrC. De esta forma, las

conformaciones obtenidas por dinámicas moleculares serían más confiables.

▪ Se puede expandir el tamizaje in silico para que tenga en cuenta moléculas presentes en

otras bases de datos, por ejemplo ZINC15.

▪ Se debe probar experimentalmente si los compuestos encontrados en este trabajo

ocasionan la inhibición de MtrD.

52

6. Referencias

Bolla, J. R., Su, C.-C., Do, S. V., Radhakrishnan, A., Kumar, N., Long, F., … Yu, E. W.

(2014). Crystal Structure of the Neisseria gonorrhoeae MtrD Inner Membrane Multidrug

Efflux Pump. PLoS ONE, 9(6), e97903. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097903

De Vivo, M., Masetti, M., Bottegoni, G., & Cavalli, A. (2016). Role of Molecular Dynamics

and Related Methods in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry, 59(9), 4035–4061.

https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5b01684

Franco, S. (2016). Aplicación de Mecánica Molecular para el Descubrimiento de Nuevos

Inhibidores de Topoisomerasas IIA Microbianas (Tesis de pregrado). Universidad de los

Andes, Colombia.

Friesner, R. A., Banks, J. L., Murphy, R. B., Halgren, T. A., Klicic, J. J., Mainz, D. T., …

Shenkin, P. S. (2004). Glide: A New Approach for Rapid, Accurate Docking and Scoring. 1.

Method and Assessment of Docking Accuracy. Journal of Medicinal Chemistry, 47(7),

1739–1749. https://doi.org/10.1021/jm0306430

Friesner, R. A., Murphy, R. B., Repasky, M. P., Frye, L. L., Greenwood, J. R., Halgren, T.

A., … Mainz, D. T. (2006). Extra Precision Glide: Docking and Scoring Incorporating a

Model of Hydrophobic Enclosure for Protein−Ligand Complexes. Journal of Medicinal

Chemistry, 49(21), 6177–6196. https://doi.org/10.1021/jm051256o

Halgren, T. A., Murphy, R. B., Friesner, R. A., Beard, H. S., Frye, L. L., Pollard, W. T., &

Banks, J. L. (2004). Glide: A New Approach for Rapid, Accurate Docking and Scoring. 2.

Enrichment Factors in Database Screening. Journal of Medicinal Chemistry, 47(7), 1750–

1759. https://doi.org/10.1021/jm030644s

Janganan, T. K., Bavro, V. N., Zhang, L., Borges-Walmsley, M. I., & Walmsley, A. R.

(2013). Tripartite efflux pumps: energy is required for dissociation, but not assembly or

opening of the outer membrane channel of the pump: Characterization of MtrCDE tripartite

pump. Molecular Microbiology, 88(3), 590–602. https://doi.org/10.1111/mmi.12211

Janganan, T. K., Bavro, V. N., Zhang, L., Matak-Vinkovic, D., Barrera, N. P., Venien-Bryan,

C., … Walmsley, A. R. (2011). Evidence for the Assembly of a Bacterial Tripartite

Multidrug Pump with a Stoichiometry of 3:6:3. Journal of Biological Chemistry, 286(30),

26900–26912. https://doi.org/10.1074/jbc.M111.246595

Kirkcaldy, R. D. (2016). Neisseria gonorrhoeae antimicrobial susceptibility surveillance—the

gonococcal isolate surveillance project, 27 sites, United States, 2014. MMWR. Surveillance

Summaries, 65.

Kitchen, D. B., Decornez, H., Furr, J. R., & Bajorath, J. (2004). Docking and scoring in

virtual screening for drug discovery: methods and applications. Nature Reviews Drug

Discovery, 3(11), 935–949. https://doi.org/10.1038/nrd1549

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097903

https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5b01684

https://doi.org/10.1021/jm0306430

https://doi.org/10.1021/jm051256o

https://doi.org/10.1021/jm030644s

https://doi.org/10.1111/mmi.12211

https://doi.org/10.1074/jbc.M111.246595

https://doi.org/10.1038/nrd1549

53

Li, X.-Z., Plésiat, P., & Nikaido, H. (2015). The Challenge of Efflux-Mediated Antibiotic

Resistance in Gram-Negative Bacteria. Clinical Microbiology Reviews, 28(2), 337–418.

https://doi.org/10.1128/CMR.00117-14

Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., & Feeney, P. J. (2001). Experimental and

computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and

development settingsq. Advanced Drug Delivery Reviews, 24.

Madhavi Sastry, G., Adzhigirey, M., Day, T., Annabhimoju, R., & Sherman, W. (2013).

Protein and ligand preparation: parameters, protocols, and influence on virtual screening

enrichments. Journal of Computer-Aided Molecular Design, 27(3), 221–234.

https://doi.org/10.1007/s10822-013-9644-8

Morse, S. A., & Hebeler, B. H. (1978). Effect of pH on the growth and glucose metabolism

of Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity, 21(1), 87–95.

Ohene-Agyei, T., Mowla, R., Rahman, T., & Venter, H. (2014). Phytochemicals increase the

antibacterial activity of antibiotics by acting on a drug efflux pump. MicrobiologyOpen, 3(6),

885–896. https://doi.org/10.1002/mbo3.212

Piddock, L. J. V. (2014). Understanding the basis of antibiotic resistance: a platform for drug

discovery. Microbiology, 160(Pt_11), 2366–2373. https://doi.org/10.1099/mic.0.082412-0

Ricci, V., & Piddock, L. J. V. (2009). Only for substrate antibiotics are a functional AcrAB-

TolC efflux pump and RamA required to select multidrug-resistant Salmonella

Typhimurium. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 64(3), 654–657.

https://doi.org/10.1093/jac/dkp234

Sandhaus, S., Chapagain, P. P., & Tse-Dinh, Y.-C. (2018). Discovery of novel bacterial

topoisomerase I inhibitors by use of in silico docking and in vitro assays. Scientific Reports,

8(1). https://doi.org/10.1038/s41598-018-19944-4

Schrodinger. (2017a). LigPrep (Versión Schrodinger Release 2017-4) [Software de

computador].

Schrodinger. (2017b). Desmond Molecular Dynamics System (Versión Schrodinger Release

2017-4) [Software de computador].

Schrodinger. (2018). QikProp (Versión Schrodinger Release 2018-1) [Software de

computador].

Sjuts, H., Vargiu, A. V., Kwasny, S. M., Nguyen, S. T., Kim, H.-S., Ding, X., … Opperman,

T. J. (2016). Molecular basis for inhibition of AcrB multidrug efflux pump by novel and

powerful pyranopyridine derivatives. Proceedings of the National Academy of Sciences,

113(13), 3509–3514. https://doi.org/10.1073/pnas.1602472113

https://doi.org/10.1128/CMR.00117-14

https://doi.org/10.1007/s10822-013-9644-8

https://doi.org/10.1002/mbo3.212

https://doi.org/10.1099/mic.0.082412-0

https://doi.org/10.1093/jac/dkp234

https://doi.org/10.1038/s41598-018-19944-4

https://doi.org/10.1073/pnas.1602472113

54

Vargiu, A. V., Ruggerone, P., Opperman, T. J., Nguyen, S. T., & Nikaido, H. (2014).

Molecular Mechanism of MBX2319 Inhibition of Escherichia coli AcrB Multidrug Efflux

Pump and Comparison with Other Inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,

58(10), 6224–6234. https://doi.org/10.1128/AAC.03283-14

Venter, H., Mowla, R., Ohene-Agyei, T., & Ma, S. (2015). RND-type drug efflux pumps

from Gram-negative bacteria: molecular mechanism and inhibition. Frontiers in

Microbiology, 6. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00377

Wishart, D. S., Feunang, Y. D., Guo, A. C., Lo, E. J., Marcu, A., Grant, J. R., Sajed, T.,

Johnson, D., Li, C., Sayeeda, Z., Assempour, N., Iynkkaran, I., Liu, Y., Maciejewski, A.,

Gale, N., Wilson, A., Chin, L., Cummings, R., Le, D., Pon, A., Knox, C., Wilson, M.

DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018. Nucleic Acids Res. 2017

Nov 8. doi: 10.1093/nar/gkx1037.

Workowski, K. (2013). Chlamydia and gonorrhea. Annals of Internal Medicine, 158(3),

ITC2–1.

Zarantonelli, L., Borthagaray, G., Lee, E.-H., & Shafer, W. M. (1999). Decreased

Azithromycin Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Due to mtrR Mutations. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, 43(10), 2468–2472.

https://doi.org/10.1128/AAC.03283-14

https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00377

55

7. Anexos

7.1 Tablas

Tabla A1. Interacciones de los mejores 20 compuestos encontrados en el tamizaje in silico de la

cavidad A. Residuos del loop rico en glicina en verde.

Rank Compound Code Residuo Interacciones

Distancia

GLY-rich loop

(Å)

Grid

Fenilalanina 623 Pi-cation CL

Glutamato 669 H-bond / SaltBridge / Aromatic H-bond CL

Serina 134 H-bond CL

Tirosina 325 Pi-cation CL

Valina 38 H-bond BB

Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL


Fenilalanina 623 Pi-pi stacking / Aromatic H-bond CL


Serina 611 H-bond BB

Tirosina 325 Pi-pi stacking CL

Fenilalanina 612 Aromatic H-bond BB

Glutamato 669 2 H-bond / Aromatic H-bond CL

Serina 860 2 H-bond CL/BB

Serina 89 H-bond CL

Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL

Serina 79 H-bond CL





Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge / Aromatic H-bond CL



Alanina 40 H-bond BB



Glutamato 863 SaltBridge CL


Glutamina 859 H-bond CL

Serina 79 H-bond CL


Fenilalanina 612 H-bond BB



Lisina 823 H-bond CL








Glutamina 859 2 H-bond CL




Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL / 2 Aromatic H-bond CL/BB

Leucina 668 H-bond BB




Glutamato 669 H-bond BB / 2 SaltBridge / Aromatic H-bond CL


Valina 38 H-bond BB

Asparagina 135 H-bond CL




Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge CL / 2 Aromatic H-bond CL/BB



Glicina 717 2 H-bond CL

Lisina 823 Pi-cation / Aromatic H-bond CL

Fenilalanina 612 H-bond BB / Pi-pi stacking CL

Serina 89 H-bond CL

Serina 91 H-bond CL











Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge CL


Tirosina 77 H-bond CL

Glicina 858 H-bond BB

Glutamato 669 Aromatic H-bond CL



Serina 860 2 H-bond BB/CL

Aspartato 83 H-bond / SaltBridge CL









Fenilalanina 136 Pi-cation CL / H-bond BB

Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL / Aromatic H-bond BB


LMG 15227407 2.80

1

2

3

4

AEM 17368541

SYN 15662120

ADM 12232132

2.14

1.81

2.10

7 LMK 17710488 1.97

2.08ADM 138091118 CavA0-Clu1

5 SYN 15662268 2.23

2.526 LEG 14688228

2.34LEG 1540755411

5.35SYN 1554383712

3.009 LEG 17710735

2.34SYN 2006794610

2.45AEM 1446819215

2.13LEG 1721728816

4.98AOP 1854635613

2.06ADM 1330299914

2.08AEM 1736854119

2.48SYN 1541002720

17 3.28AEM 10821016

1.75AEM 1736839518

CavA0-Clu4

CavA-Clu2

CavA0-Clu1

CavA-Clu2

CavA-Clu2

CavA0-Clu1

CavA0-Clu1

CavA0-Clu4

CavA-Clu2

CavA-Clu2

CavA-Clu2

CavA0-Clu1

CavA0-Clu1

CavA-Clu2

CavA-Clu2

CavA-Clu2

CavA0-Clu1

CavA0-Clu1

CavA0-Clu1

56

Rank Compound Code Residuo Interacciones

Distancia

GLY-rich loop

(Å)

Grid




Tirosina 325 Pi-cation CL

Valina 38 H-bond BB



Fenilalanina 623 Pi-pi stacking / Aromatic H-bond CL




Fenilalanina 612 Aromatic H-bond BB

Glutamato 669 2 H-bond / Aromatic H-bond CL


Serina 89 H-bond CL


Serina 79 H-bond CL





Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge / Aromatic H-bond CL









Serina 79 H-bond CL


Fenilalanina 612 H-bond BB



Lisina 823 H-bond CL












Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL / 2 Aromatic H-bond CL/BB





Glutamato 669 H-bond BB / 2 SaltBridge / Aromatic H-bond CL


Valina 38 H-bond BB

Asparagina 135 H-bond CL




Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge CL / 2 Aromatic H-bond CL/BB



Glicina 717 2 H-bond CL

Lisina 823 Pi-cation / Aromatic H-bond CL

Fenilalanina 612 H-bond BB / Pi-pi stacking CL

Serina 89 H-bond CL

Serina 91 H-bond CL











Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge CL


Tirosina 77 H-bond CL


Glutamato 669 Aromatic H-bond CL



Serina 860 2 H-bond BB/CL










Fenilalanina 136 Pi-cation CL / H-bond BB

Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL / Aromatic H-bond BB


LMG 15227407 2.80

1

2

3

4

AEM 17368541

SYN 15662120

ADM 12232132

2.14

1.81

2.10

7 LMK 17710488 1.97

2.08ADM 138091118 CavA0-Clu1

5 SYN 15662268 2.23

2.526 LEG 14688228

2.34LEG 1540755411

5.35SYN 1554383712

3.009 LEG 17710735

2.34SYN 2006794610

2.45AEM 1446819215

2.13LEG 1721728816

4.98AOP 1854635613

2.06ADM 1330299914

2.08AEM 1736854119

2.48SYN 1541002720

17 3.28AEM 10821016

1.75AEM 1736839518

CavA0-Clu4

CavA-Clu2

CavA0-Clu1

CavA-Clu2

CavA-Clu2

CavA0-Clu1

CavA0-Clu1

CavA0-Clu4

CavA-Clu2

CavA-Clu2

CavA-Clu2

CavA0-Clu1

CavA0-Clu1

CavA-Clu2

CavA-Clu2

CavA-Clu2

CavA0-Clu1

CavA0-Clu1

CavA0-Clu1

57

Tabla A2. Interacciones de los mejores 20 compuestos encontrados en el tamizaje in silico de la

cavidad I. Residuos del loop rico en glicina en verde.

Rank Compound Code Residuo InteraccionesDistancia GLY-

rich loop (Å)Grid

ASN135 H-bond CL

GLN34 2 H-bond CL/BB

PHE136 H-bond BB

PHE568 Aromatic H-bond CL

TYR325 H-bond CL

ARG133 H-bond CL

ASN135 H-bond CL


PHE136 H-bond BB


TYR325 H-bond CL

ARG133 H-bond CL

ASN135 H-bond CL


PHE136 H-bond BB


TYR325 H-bond CL

ARG133 H-bond CL

ASN135 H-bond CL


PHE136 H-bond BB


TYR325 H-bond CL

GLN34 Aromatic H-bond BB

PHE136 2 H-bond CL/BB

PHE610 Pi-pi stacking CL

PRO665 Aromatic H-bond BB

GLN34 H-bond CL

GLN566 H-bond CL


ASN135 Aromatic H-bond CL


GLN566 H-bond CL

PHE136 2 H-bond BB

PRO665 H-bond BB


PHE136 2 H-bond BB



ARG133 H-bond CL

ASN135 H-bond CL


PHE136 H-bond BB


TYR325 H-bond CL

ASN135 H-bond CL

GLN34 H-bond CL

PHE136 H-bond BB


SER134 Aromatic H-bond BB

TYR325 H-bond CL

ARG133 H-bond CL

GLN34 3 H-Bond 2CL/BB

PHE136 Aromatic H-bond BB

TYR325 Aromatic H-bond CL

TYR35 Pi-pi stacking CL

GLN34 2 H-bond CL

GLN566 Aromatic H-bond CL

PHE136 H-bond BB



PHE136 2 H-bond BB

PHE610 2 Pi-pi stacking CL


GLN566 H-bond CL


SER674 H-bond CL

VAL663 2 H-bond BB

PRO562 H- Bond / Aromatic H-bond BB

SER674 2 H-bond CL/BB

SER860 H- bond CL


PHE136 H- bond CL


GLN34 H-bond BB


PRO665 H-bond BB


ALA132 Aromatic H-bond BB

GLN34 2 Aromatic H-bond CL/BB

PHE136 2 H-bond BB

SER91 Aromatic H-bond CL


PHE136 H-bond BB


GLN34 H-bond BB

PHE136 H-bond BB

PRO665 H-bond / Aromatic H-bond BB

CavI-Clu1SYN 200458169

CavI-Clu12.09AEM 174579548

CavI-Clu12.67LMK 209892447

CavI-Clu14.86ART 177318216

5

CavI-Clu12.09SYN 200113394

CavI-Clu12.91AOP 2231370420

CavI-Clu1

CavI-Clu12.84SYN 201217131

2.24

CavI-Clu12.85SYN 201112623

CavI-Clu12.57LEG 201127522

CavI-Clu12.01AEM 17457717

2.57SYN 2608148119

CavI-Clu12.13SYN 1565321218

CavI-Clu15.32AEM 1745726117

CavI-Clu12.01SYN 2608150416

CavI0-Clu34.33SYN 2287350615

CavI0-Clu33.61SYN 2437625314

CavI-Clu12.13AEM 1745851713

CavI-Clu17.70ART 2045885112

CavI-Clu13.29SYN 2233831811

CavI-Clu12.14SYN 2011922110

58

.

7.2 Figuras

Rank Compound Code Residuo InteraccionesDistancia GLY-

rich loop (Å)Grid

ASN135 H-bond CL


PHE136 H-bond BB


TYR325 H-bond CL

ARG133 H-bond CL

ASN135 H-bond CL


PHE136 H-bond BB


TYR325 H-bond CL

ARG133 H-bond CL

ASN135 H-bond CL


PHE136 H-bond BB


TYR325 H-bond CL

ARG133 H-bond CL

ASN135 H-bond CL


PHE136 H-bond BB


TYR325 H-bond CL





GLN34 H-bond CL

GLN566 H-bond CL


ASN135 Aromatic H-bond CL


GLN566 H-bond CL

PHE136 2 H-bond BB

PRO665 H-bond BB


PHE136 2 H-bond BB



ARG133 H-bond CL

ASN135 H-bond CL


PHE136 H-bond BB


TYR325 H-bond CL

ASN135 H-bond CL

GLN34 H-bond CL

PHE136 H-bond BB


SER134 Aromatic H-bond BB

TYR325 H-bond CL

ARG133 H-bond CL

GLN34 3 H-Bond 2CL/BB


TYR325 Aromatic H-bond CL


GLN34 2 H-bond CL

GLN566 Aromatic H-bond CL

PHE136 H-bond BB



PHE136 2 H-bond BB

PHE610 2 Pi-pi stacking CL


GLN566 H-bond CL


SER674 H-bond CL

VAL663 2 H-bond BB

PRO562 H- Bond / Aromatic H-bond BB

SER674 2 H-bond CL/BB

SER860 H- bond CL


PHE136 H- bond CL


GLN34 H-bond BB


PRO665 H-bond BB


ALA132 Aromatic H-bond BB

GLN34 2 Aromatic H-bond CL/BB

PHE136 2 H-bond BB

SER91 Aromatic H-bond CL


PHE136 H-bond BB


GLN34 H-bond BB

PHE136 H-bond BB

PRO665 H-bond / Aromatic H-bond BB

CavI-Clu1SYN 200458169

CavI-Clu12.09AEM 174579548

CavI-Clu12.67LMK 209892447

CavI-Clu14.86ART 177318216

5

CavI-Clu12.09SYN 200113394

CavI-Clu12.91AOP 2231370420

CavI-Clu1

CavI-Clu12.84SYN 201217131

2.24

CavI-Clu12.85SYN 201112623

CavI-Clu12.57LEG 201127522

CavI-Clu12.01AEM 17457717

2.57SYN 2608148119

CavI-Clu12.13SYN 1565321218

CavI-Clu15.32AEM 1745726117

CavI-Clu12.01SYN 2608150416

CavI0-Clu34.33SYN 2287350615

CavI0-Clu33.61SYN 2437625314

CavI-Clu12.13AEM 1745851713

CavI-Clu17.70ART 2045885112

CavI-Clu13.29SYN 2233831811

CavI-Clu12.14SYN 2011922110

59

Figura A1. Compuestos 11 a 20 de la cavidad A.

11 13

12

15

17

14

16

18

19

20

60

Figura A2. Compuestos 11 a 20 de la cavidad I.

11

13

12

15

17

14

16

18

19

20

úsqueda computacional de inhibidores de la bomba de

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