sistemática del género rhytidhysteron speg
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INSTITUTO PLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Sección de Estudios de Posgrado
Sistemática del género Rhytidhysteron Speg.
(Dothideomycetes: Ascomycota) en México.
Tesis de Maestría en Biociencias
PRESENTA:
Licenciada en Biología:
AURORA COBOS VILLAGRÁN
DIRECTORES DE TESIS:
DRA. TANIA RAYMUNDO OJEDA
DR. CÉSAR HUGO HERNÁNDEZ RODRÍGUEZ
CIUDAD DE MÉXICO, SEPTIEMBRE 30 DE 2019
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El presente estudio se realizó en el Laboratorio de Micología del Departamento de Botánica
de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional y en el
Laboratorio de Biología Molecular de Bacterias y Levaduras del Departamento de
Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico
Nacional y fue financiado por los siguientes proyectos:
Hongos de los bosques templados y tropicales de México su ecología, importancia
forestal III.
Director: Dr. Ricardo Valenzuela Garza del Proyecto SIP-20170845.
Diversidad de hongos en los bosques de Niebla de México, ecosistema en peligro de
extinción. Importancia forestal Fase I.
Directora: Dra. Tania Raymundo Ojeda del Proyecto SIP-20170846.
Diversidad de hongos de los bosques templados y tropicales de México, su ecología,
importancia forestal y médica Fase IV.
Director: Dr. Ricardo Valenzuela Garza del Proyecto SIP-20180243.
Diversidad de hongos en los bosques de Niebla de México, ecosistema en peligro de
extinción. Importancia forestal Fase II.
Directora: Dra. Tania Raymundo Ojeda del Proyecto SIP-20180244.
Diversidad de hongos de importancia forestal de los bosques tropicales y templados
en México: especies comestibles, tóxicas, medicinales, micorrizógenas y patógenas
Fase I.
Director: Dr. Ricardo Valenzuela Garza del Proyecto SIP-20195222
Diversidad y distribución de Xylariales en la Región Neotropical de México y su
importancia en la identificación bioactivos de interés farmacéutico. Fase I.
Directora: Dra. Tania Raymundo Ojeda del Proyecto SIP-20195221.
Taxonomía, filogenia y extracción de metabolitos secundarios biológicamente activos
de los hongos de las familias Xylariaceae e Hymenochaetaceae del bosque tropical
caducifolio y del bosque mesófilo de montaña en México.
Director: Dr. Ricardo Valenzuela Garza.
Proyecto CONACYT Ciencia Básica: 252934
Con todo mi cariño y admiración:
A mis padres Moisés Cobos y Cecilia Villagrán.
Por ser ejemplo de esfuerzo, trabajo, dedicación y constancia. Gracias por todo su
apoyo y confianza brindada, por creer en mí y siempre inspirarme a ser mejor.
A mis hermanos J. Alfonso y Mariana.
Por todo el apoyo y cariño incondicional que siempre me han dado. Gracias por
acompañarme y ser cómplices de aventuras y adversidades en esta vida.
Agradecimientos:
A la Dra. Tania Raymundo Ojeda por ser mi directora de tesis, por mostrarme más del maravilloso y
fascinante mundo de los hongos, particularmente de los ascomicetos y de los Dothideomycetes, gracias
por tantos aprendizajes, aventuras y viajes en busca de estos asombrosos organismos. Y por supuesto por
el tiempo y dedicación brindado en esta etapa de mi formación.
Al Dr. Ricardo Valenzuela Garza por contar siempre con su apoyo profesional y personal, por hacerme
participe en los proyectos de investigación, sin duda fueron más que viajes de prácticas ya que estuvieron
llenos de aprendizaje, aventuras y buenos momentos. Y por todos los conocimientos brindados a lo largo
de estos años.
Al Dr. Cesar Hugo Hernández Rodríguez y la Dra. María de Lourdes Villa Tanaca, por otorgarme la
confianza y facilidades para realizar el trabajo de laboratorio, y las aportaciones a la mejora del presente
trabajo.
A la Dra. Luz Elena Mateos Cid por el apoyo brindado durante los años de mi formación profesional
(licenciatura y maestría), así como el tiempo y la dedicación para la mejora del presente trabajo.
A la Dra. Rosa Paulina Calvillo Medina por los conocimientos brindados, así como la revisión y mejora
del presente trabajo.
Al posgrado Maestría en Biociencias de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto
Politécnico Nacional, por aceptar el proyecto de tesis y poder realizar mi postgrado.
A Alonso Tolentino, por seguir siendo un pilar en mi vida, creer en mí, gracias por todo tu apoyo y amor.
A los M. en B. Pamela y Alfonso por ser compañeros y cómplices en esta etapa, por tantos buenos
momentos llenos de aprendizajes, gracias por su amistad.
A las maestras Silvia Hernández y Magda Contreras por compartir conocimientos, viajes y aportaciones
de recolecciones.
A todos mis compañeros del laboratorio de Micología, en especial a Andy por su amistad y recolectas
aportadas, a Uriel, Alexis y Marcos por sus recolectas y ayuda brindada.
A mis amigos de toda la vida, Gerard, Esme, Jocelyn, Yeya, Pau y Paloma.
A toda mi familia por ser personas integras, respetables y admirables.
En algún lugar algo increíble está esperando a ser descubierto. Carl Sagan.
i
Contenido.
RESUMEN ....................................................................................................................... 0
ABSTRACT ..................................................................................................................... ii
I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1
I. 1. Estatus taxonómico de Rhytidhysteron ..................................................................... 1
I.2. Caracteres morfológicos ............................................................................................. 2
I.3. Características del marcador molecular ITS .............................................................. 7
I.4. Distribución ................................................................................................................ 8
I.5. Importancia médica del género Rhytidhysteron ......................................................... 8
II. ANTECEDENTES ...................................................................................................... 9
III. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................... 14
IV. HIPÓTESIS .............................................................................................................. 15
V. OBJETIVO GENERAL............................................................................................. 15
V. 1 Objetivos particulares ............................................................................................. 15
VI. MÉTODOS. .............................................................................................................. 16
VI.1. Zonas de estudio .................................................................................................... 16
VI.2. Trabajo de campo .................................................................................................. 18
VI.2.A. Recolección de especímenes ....................................................................... 18
VI.2.B. Obtención de especímenes en fresco .......................................................... 18
VI.3. Trabajo de laboratorio .......................................................................................... 19
VI.3.A. Estudio morfológico ................................................................................... 19
VI.3.B. Preservación y conservación. ..................................................................... 19
VI.3.C. Extracción de ADN, amplificación por PCR, purificación y secuenciación.
................................................................................................................................. 19
VI.4. Trabajo de gabinete............................................................................................... 21
VI.4.A. Descripciones ............................................................................................. 21
VI.4.B. Conservación de los ejemplares ................................................................. 21
VI.4.C. Elaboración de la base de datos de Rhytidhysteron .................................. 22
VI.4.D. Diseño de Oligos ........................................................................................ 22
VI.4.E. Análisis filogenético .................................................................................... 23
VII. RESULTADOS ....................................................................................................... 24
VII.1. Taxonomía de Rhytidhysteron ............................................................................. 24
VII.2. Descripciones de las especies .............................................................................. 26
VII.3. Filogenia ............................................................................................................... 58
VII.4. Distribución de las especies de Rhytidhysteron ................................................... 61
VIII. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 65
VIII.1 Taxonomía ........................................................................................................... 65
VIII.4. Distribución ........................................................................................................ 69
IX. CONCLUSIONES.................................................................................................... 71
X. LITERATURA CITADA .......................................................................................... 72
XI. ANEXOS .................................................................................................................. 80
Anexo I. Preparaciones con Alcohol etílico 70% e Hidróxido de Potasio 5 %.............. 80
Anexo II. Protocolo de Extracción con CTAB (Doyle y Doyle 1987). ......................... 81
Anexo III. Ejemplo de visualización de ADN en un gel de agarosa al 1%. ................... 82
Anexo IV. Protocolo de purificación con el Kit DNA Clean & Concentrator TM- 5 ...... 83
Anexo V. Base de datos del género Rhytidhysteron ....................................................... 84
Anexo VI. Números de acceso de GenBank .................................................................. 85
Índice de cuadros.
Cuadro 1. Especies de Rhytidhysteron en el mundo 11
Cuadro 2. Sitios de recolección y muestreo en el período octubre 2017- noviembre
2018 15
Cuadro 3. Oligos utilizados para la amplificación y secuenciación del gen ITS, y las
condiciones de la PCR 20
Cuadro 4. Caracteres de importancia taxonómica en Rhytidhysteron 24
Cuadro 5. Principales hospederos de Rhytidhysteron 63
Índice de figuras.
Figura 1. Estructura general de un histerotecio de Rhytidhysteron 5
Figura 2. Estructuras de Rhytidhysteron spp. 6
Figura 3. Rhytidhysteron neorufulum 30
Figura 4. Rhytidhysteron rufulum 37
Figura 5. Rhytidhysteron thailandicum 41
Figura 6. Rhytidhysteron esperanzae 44
Figura 7. Rhytidhysteron mexicanum 47
Figura 8. Rhytidhysteron mesophilum 50
Figura 9. Rhytidhysteron cozumelensis 53
Figura 10. Rhytidhysteron neohysterinum 56
Figura 11. Rhytidhysteron sonorensis 59
Figura 12. Filogenia 60
Figura 13. Número de ejemplares de Rhytidhysteron por provincias florísticas de
acuerdo con Rzedowski 2006 61
Figura 14. Distribución de las especies del género Rhytidhysteron en la República
mexicana 63
i
RESUMEN
El género Rhytidhysteron fue descrito por Spegazzini en 1881. Actualmente se
reconocen 21 especies y se encuentra ampliamente distribuido en regiones tropicales
del mundo. En México sólo se ha reportado Rhytidhysteron rufulum; no obstante,
estudios con datos morfológicos y moleculares indican que el género Rhytidhysteron
es más diverso de lo asumido, por lo que en el presente estudio se analizaron las
diferencias morfológicas, moleculares y de distribución, para establecer los límites
filogenéticos y taxonómicos de este género en nuestro país. Se realizaron diez
exploraciones en diversas regiones de la República Mexicana y se recolectaron
especímenes de ramas secas o caídas con la presencia de histerotecios. Con ayuda de
un microscopio estereoscópico se caracterizaron el tamaño, forma, color,
ornamentación de la pared y epitecio de los ascomas. Para el estudio microscópico se
hicieron preparaciones temporales con alcohol al 70% e KOH al 10% a fin de observar
y medir las pseudoparáfisis, ascas y ascosporas. Se realizó el análisis molecular, el
cual consistió en la extracción de ADN mediante el método CTAB, la amplificación
por PCR de los espaciadores internos transcritos (ITS) con los oligos RhytiFar y
RhytiRev, y la secuenciación por el método de Sanger; obtenidas las secuencias se
realizó el análisis filogenético mediante métodos de inferencia filogenética de máxima
verosimilitud utilizando la plataforma en línea PhyML y el programa Mr. Bayes. Se
revisaron un total de 431 especímenes de las cuales se reconocen nueve especies que
son: R. rufulum, se caracteriza por histerotecios de 1-2.5 mm con pared estriada y
epitecio rojo y amarillo cambiando a magenta en KOH al 10%. R. neorufulum presenta
histerotecios de 1.9 -2.8 mm con pared lisa; R. thailandicum, se caracteriza por
histerotecios de 1-1.5 mm con pared estriada y ascosporas de 26-30 µm; R.
esperanzae, forma histerotecios de 3-4.5 mm, un epitecio verde oliváceo, libera
pigmentos amarillos y ascosporas de 50 µm; R. mexicanum, con histerotecios de 2.3-
3.7 mm, epitecio amarillo limón el cual se torna ámbar y ascosporas de 42 µm; R.
mesophilum, histerotecio amarillo-verdoso, epitecio naranja intenso, ascosporas de 46
µm; R. cozumelensis, epitecio rojo-negro, ascosporas de 26-31 µm, sobre enredadera
en bosque subperennifolio; R. neohysterinum, ascosporas con un solo septo
transversal; R. sonorensis, ascosporas de 15-18 µm, verde-oliváceas, con 3-4 septos
transversales y de 1-2 septos longitudinales. La filogenia obtenida del género
Rhytidhysteron indica que este es monofilético y pertenece a la familia Hysteriaceae.
Finalmente, se concluye que el género Rhytidhysteron presenta una alta diversidad de
especies en México, comprobada mediante el análisis de los caracteres morfológicos
y moleculares, lo que lo ubica como el país con mayor número de entidades en este
grupo. La mayoría de los especímenes se han encontrado sobre ramas en
descomposición principalmente en géneros de la familia Fabaceae en el bosque
tropical caducifolio, lo que podría sugerir que en este grupo de plantas representa el
microhábitat en el que Rhytidhysteron spp. se han adaptado mejor.
ii
ABSTRACT
The genus Rhytidhysteron was described by Spegazzini in 1881 and 21 species are
currently recognized and widely distributed in tropical regions of the world. In
Mexico, only Rhytidhysteron rufulum has been reported. However, studies with
morphological and molecular data seem to indicate that the genus Rhytidhysteron is
more diverse than previously assumed, so in this study the morphological, molecular
and distribution differences were analyzed to establish the phylogenetic and
taxonomic limits of this genus in this country. Ten explorations were carried out in
various regions of the Mexico and specimens of dried and fallen branches with visible
hysterothecia were collected. The size, shape, color, ornamentation of the wall and
epithecium of the ascomata were characterized with a stereoscopic microscope. For
the microscopic study, study, wet mount slides were made using, 70% alcohol and
10% KOH solutions in order to observe and measure the pseudoparaphyses, asci and
ascospores. Molecular analysis was performed, which consisted of DNA extraction
using the CTAB method, PCR amplification for the internal transcribed spacer (ITS)
with the RhytiFar and RhytiRev oligos, and sequencing by the Sanger method; once
the sequences were obtained, phylogenetic analysis was carried out through
phylogenetic inference methods of maximum likelihood using the PhyML online
platform and Mr. Bayes program. A total of 400 specimens from which nine species
are recognized were reviewed (all measurements for spores refer to length): R.
rufulum, characterized by 1-2.5 mm ascomata with striated wall and red and yellow
epithecium changing to magenta in KOH10%. R. neorufulum which presents
hysterothecia of 1.9-2.8 mm with a smooth wall; R. thailandicum is characterized by
1-1.5 mm hysterothecia with striated wall and 26-30 µm ascospores; R. esperanzae,
that produces hysterothecia 3-4.5 mm with an olive green epithecium and 50 µm
ascospores. R. mexicanum, with hysterothecia of 2.3-3.7 mm, pale yellow epithecium
which turns to amber color, 42 µm ascospores. R. mesophilum, which displays yellow-
greenish hysterothecia, intense orange epithecium and 46 µm ascospores. R.
cozumelensis, with red and black epithecium, ascospores of 26-31 µm, found on
unidentified creeping plant in subperennial forest. R neohysterinum, producing
ascospores with a single transverse septum. Rhytidhysteron sonorensis, with 15-18
µm olive-green ascospores that bear 3-4 transverse and 1-2 longitudinal septa. The
phylogeny obtained from the genus Rhytidhysteron indicates that it is monophyletic
and belongs to the family Hysteriaceae. Finally, it is concluded that the genus
Rhytidhysteron has a high diversity of species in Mexico, verified by analyzing
morphological and molecular characters, which currently places it as the country with
the highest number of entities in this group. Most specimens have been found on
decomposing branches mainly from genera of the Fabaceae family in the tropical
deciduous forest, which suggest that this group of plants represent the microhabitat in
which Rhytidhysteron spp. have best adapted.
1
I. INTRODUCCIÓN
I. 1. Estatus taxonómico de Rhytidhysteron
El género Rhytidhysteron fue descrito por Spegazzini (1881) con las especies R.
brasiliense Speg. y R. viride Speg.; sin que se designara una especie tipo. Posteriormente,
Clements y Shear (1931) designaron a R. brasiliense como especie tipo para el género
(Samuels y Müller 1979; Yacharoen et al., 2015). En 1979, R. brasiliense y R. viridae fueron
sinonimizados bajo Rhytidhysteron rufulum (Spreng.) Speg. por Samuels y Müller, y de las
11 especies descritas hasta ese momento aceptaron sólo dos especies en el género, R. rufulum
y R. hysterinum (Dufour) Samuels y E. Müll. Sin embargo, posteriormente se demostró que
las conclusiones de Samuels y Müller (1979) se basaban en observaciones superficiales y
falta de conocimiento de los caracteres de importancia taxonómica de los especímenes,
incluyendo la morfología del ascoma y el tamaño de las ascosporas; ya que sólo observaron
la morfología externa del espécimen tipo de R. brasiliense, el que contenía solo un ascoma
antiguo, mientras que señalaron que el espécimen de R. viride era inmaduro y no tenía
ascosporas. Tampoco observaron el espécimen tipo de R. rufulum y solo consideraron las
descripciones publicadas. (Kutorga y Hawksworth, 1997; Thambugala et al., 2016). En el
estudio de Kutorga y Hawksworth (1997) se designó el neotipo para R. rufulum, ya que el
material original no existía; así mismo estos autores observaron los caracteres microscópicos
del ascoma antiguo restante en el material tipo de R. brasiliense. Esta observación reveló que
tanto R. rufulum como R. brasiliense tienen la misma morfología de excípulo, hipotecio y
hamatecio, pero existe una diferencia significativa en el tamaño de las ascoporas, ya que R.
brasiliense tiene ascosporas significativamente más grandes (38-) 40-44 (- 47) × (15-) 17-19
(-21) µm, en comparación con las de R. rufulum: 28-30 (-35) x (8-) 10-12 (-16) µm. Por lo
2
tanto R. rufulum y R. brasiliense son especies diferentes; y es necesario la epitipificación de
R. brasiliense. No obstante, autores como Thambugala, et al. (2016) y Soto-Medina y
Lücking (2017), reconocen a R. brasiliense como la especie tipo del género; mientras que
Sierra-López (2006) menciona que Rhytidhysteron rufulum es la especie tipo.
La clasificación de Rhytidhysteron en categorías de Familia y Orden también ha sido un
problema, debido al carácter apotecioide del ascoma, la morfología del himenio y de las
ascosporas han ocasionado que a lo largo del tiempo, este género haya sido considerado como
una dotideal, pezizal, helotial, facidial o lecanoral; aunque la mayoría de autores han
mostrado una tendencia a situarlo dentro de la familia Patellariaceae, Orden Patellariales
(Von Arx y Müller, 1975); y esto se había seguido generalmente por varios autores como
Barr (1987), Kutorga y Hawksworth (1997), Eriksson (2006), Lumbsch y Huhndorf
(2010).No obstante, Barr (1987) consideraba que Rhytidhysteron debía segregarse en otra
familia ya que en R. rufulum, aunque los parafisoides forman un epitecio bien desarrollado,
la estructura del peridio y los ascos muestran caracteres afines a la familia Hysteriaceae; fue
hasta el año 2009 que este género fue transferido a la familia Hysteriaceae (Orden
Hysteriales) por Boehm et al., (2009a, b) y Schoch et al., (2009), basado en estudios
filogenéticos y datos moleculares. Estas clasificaciones la siguieron en Hyde et al., (2013),
Almeida et al., (2014) y Wijayawardene et al., (2014).
I.2. Caracteres morfológicos
En Rhytidhysteron el ascoma o cuerpo fructífero es de tipo histerotecio (figura 1),
errumpentes o superficiales en la madera sobre la cual crecen, presentan una forma alargada
3
o de bote, simples o en ocasiones ramificados, al principio están cerrados, pero en la madurez
se abren mediante una fisura longitudinal o varias radiales para formar una línea de
dehiscencia, que les permite exponer el himenio para liberar las esporas, presentan una pared
muy gruesa de consistencia carbonácea. La superficie del histerotecio puede ser estriada o
lisa (figura 2 d y e, respectivamente), opaca o brillante y glabra. (Kirk et al., 2008).
El peridio se refiere a la pared del ascoma, el cual a menudo presenta una composición
seudoparenquimática. El aspecto microscópico del peridio puede mostrar una textura
isoradiada o primática (cuando son alargadas o rectangulares dispuestas en filas) y cuando
las células tienen una forma redondeada son de textura isodiamétrica o globulosa angularis
(Yacharoen et al., 2015).
El epitecio se refiere a la estructura que se forma por la anastomosis de las pseudoparáfisis
por encima de las ascas, éste se encuentra bien desarrollado y presenta pigmentos de tonos
amarillos, verdosos, naranjas, rojizos, marrones y negros.
Las pseudoparáfisis son las células estériles filamentosos, simples, ramificados o
anastomosados y con o sin septos.
Las ascas en los histerotecios son siempre de tipo bitunicadas y consta de dos capas: la
ectotúnica o exotúnica que es externa, delgada e inextensible y la endotúnica, interna y
gruesa que se extiende al madurar el asca y permite la liberación de las ascosporas. Cuando
las ascas maduran, la exotúnica se rompe en la región apical y se desliza hacia la base,
mientras que la endotúnica se ensancha y alarga hasta alcanzar el doble o incluso el triple de
4
su tamaño, de esta manera las esporas se liberan sucesivamente a través de un poro situado
en el ápice de la endotúnica (Ulloa y Hanlin. 2006, Kirk et al., 2008).
Las ascosporas son muy variables en su morfología, ya que pueden ser elipsoidales,
fusiformes, cilíndricas, rectas, curvadas, umbonadas o asimétricas.
Por el número y disposición de los septos encontramos: didimosporas, esporas con un sólo
septo transversal, que puede estar en el centro o bien desplazado hacia un extremo;
fragmosporas. Esporas con varios septos transversales; dictiosporas, esporas con septos
transversales y longitudinales, estos últimos pueden ser incompletos o estar presentes en
todos los segmentos y en ocasiones son oblicuos. Las ascosporas pueden presentar
constricciones en alguno o todos los septos. El color de las esporas también es un carácter
variable, se pueden encontrar hialinas solo cuando son inmaduras, y al madurar presentan
tonos oliváceo, marrón, marrón-rojizo (Yacharoen et al., 2015, Ulloa y Hanlin. 2006).
Las características diagnósticas del género Rhytidhysteron Speg. son: histerotecio, elíptica o
irregular, con apertura lenticular o irregular cuando está mojado, perpendicularmente estriado
o no a lo largo del eje largo, negro, rojo o amarillo en el epitecio, cuando está seco el margen
se dobla, formando una hendidura alargada. Peridio compuesto de 1-2 capas, capa externa de
marrón oscuro a negro, células de textura angularis o textura globosa, capa interna de hialinas
a células ligeramente pigmentadas de textura angularis a textura prismática. Hematecio
denso, septado, pseudoparáfisis, ramificado y formando un epitecio oscuro sobre las ascas,
fusionado y ligeramente ensanchado en el ápice, encerrado en una matriz gelatinosa. Ascas
octospóricas, bitúnicadas, cilíndricas, redondeadas en el ápice, con una cámara ocular
distinta. Las ascosporas uniseriadas, se superponen ligeramente, de forma elipsoidal a
5
fusiforme, ligeramente redondeadas o puntiagudas en ambos extremos, 1-3-septos,
constreñidos en el tabique central, de color marrón rojizo a marrón, sin una vaina
mucilaginosa (Méndez-Mayboca et al., 2010, Álvarez et al., 2014, Almeida et al., 2014 y
Thambugala et al., 2016).
Figura 1. Estructura general de un histerotecio de Rhytidhysteron rufulum (Álvarez 2014).
6
Figura 2. Estructuras de Rhytidhysteron spp. A y D. Histerotecios de forma navicular; B-C.
Ascomas apotecioides (maduros), color del epitecio naranja y rojizo, borde del ascoma con
estrías; E. Histerotecios maduros, borde liso; F. Ascas; G-H Corte transversal del
histerotecio, reacción con KOH 10%. I. Células del peridio. J-K. Ascosporas con tres septos
longitudinales.
A
F
C
D E
H
G J
I
L K
B 2 mm 2 mm 2 mm
5 mm 1mm
100 µm
100 µm
20 µm 10 µm
2
0
µ
m
5
0
µ
m
15 µm
7
I.3. Características del marcador molecular ITS
En numerosos estudios de especies fúngicas se ha mostrado que el ADNr nuclear es
adecuado para el análisis de las relaciones filogenéticas a nivel de género y especie. En la
región nuclear se tienen genes que codifican para moléculas de ARN ribosomal (ARNr) y
están ordenados en unidades de transcripción idénticas y muchas veces repetidas (Stansfield,
1992; Rentaría-Alcántara, 2007). Estas unidades están separadas por una secuencia de ADN
espaciadora que no transcribe, denominada IGS (espaciador intergénico). Dichas unidades
están compuestas por genes que codifican para el ARN 18S (SSU ADNr), 5.8S y 28S (LSU
ADNr), y entre estos genes se localizan los espaciadores internos transcritos, denominados
ITS (Alberts et al., 1994).
Los ITS son secuencias divergentes e hipervariables debido a las deleciones e inserciones y
porque acumulan un mayor número de mutaciones, son regiones muy informativas y
representan una huella genómica para cada hongo, por lo tanto, son ampliamente utilizadas
en la identificación y tipificación de especies fúngicas (Rodríguez-Tovar et al., 2004). White
et al. (1990), diseñaron y describieron oligos específicos para amplificar y secuenciar varios
segmentos del ADNr nuclear de hongos, lo que facilitó la realización de estudios
filogenéticos con el uso de estos genes (Rodríguez-Tovar et al., 2004). Chen et al. (2010),
proponen a este marcador molecular como un código de barras estándar para la identificación
de hongos.
En el género Rhytidhysteron se ha utilizado las secuencias nucleares de ADNr de ITS para
realizar los análisis filogenéticos del complejo R. rufulum en Costa Rica, que revelaron la
presencia de cuatro linajes (Murillo et al., 2009). Doilom et al., 2016 utilizaron una
combinación de los marcadores moleculares LSU, SSU, TEF1 junto con el ITS para construir
8
la filogenia de especies de Rhytidhysteron, comprobando la existencia de una nueva especie
R. tectonae. Por otro lado, Thambugala et al., 2016 también ocuparon una combinación de
marcadores moleculares LSU, SSU, EF1-α e ITS obteniendo una filogenia de las especies de
Rhytidhysteron en Tailandia, con la cual comprobaron la existencia de dos nuevas especies,
R. neorufulum y R. thailandicum.
I.4. Distribución
El género Rhytidhysteron es de amplia distribución en zonas tropicales y subtropicales
(Cuadro 1), del planeta (Samuels y Müller 1979), y en su mayoría son las localidades tipo de
las especies. La especie con más amplia distribución es Rhytidhysteron rufulum, frecuente en
zonas tropicales y citada en diversas regiones del mundo: Taiwán (Chen y Hsieh (1996),
Sierra-López (2006) la menciona de Cataluña; Murillo et al., (2009) la citan de amplia
distribución en Costa Rica, e incluyen ejemplares de Estados Unidos de América y Puerto
Rico. Por otro lado, Almeida et al., (2014) citan a R. rufulum de Argentina, Brasil, China,
Costa Rica, Cuba, Dominica, Estados Unidos de América, Filipinas, Francia, Ghana, India,
Islas Cook, Jamaica, Japón, Kenia, Malasia, Micronesia, Nueva Guinea, Nueva Zelanda,
Puerto Rico, Sierra Leone, Tanzania y Tonga. Recientemente se ha citado de las Islas
Andaman, India (Niranjan, et al., 2018).
I.5. Importancia médica del género Rhytidhysteron
Uno de los aspectos anecdóticos del género es que se ha encontrado como patógena de
humanos causante de micosis subcutáneas en pacientes inmunocompetentes como
inmunosuprimidos, en Nueva Delhi, India. (Mishra et al., 2014). El primer caso fue reportado
en 2008 por Chowdhary y colaboradores, diagnosticado como cromoblastomicosis en un
9
paciente inmunosuprimido, que había sufrido un trasplante renal. Mahajan et al., (2014)
reportan un caso en un varón diabético de 72 años con hinchazón suave y sin dolor en el pie
derecho. Recientemente, Chander et al., (2016), reportan dos casos clínicos de
feohifomicosis con formación de nódulos subcutáneos. En todos los casos se realizaron
análisis de las áreas afectadas por medio de biopsias o citología por aspiración con aguja fina
(FNAC), al realizar los exámenes microscópicos observaron cuerpos escleróticos de pared
gruesa, unicelulares, bicelulares o muriformes con tintes marrones (Chowdhary et al., 2008);
hifas gruesas de color marrón (Mishra et al., 2014), hifas largas, gruesas, septadas, tortuosas,
de color café oscuro y sin cuerpos escleróticos (Chander et al., 2016). Posteriormente las
muestras procedieron a cultivarse en diferentes medios de cultivo (Agar Dextrosa Sabouraud
con y sin cicloheximina, Agar Sangre, Agar MacConkey, Papa Dextrosa Agar, Extracto
Malta Agar, entre otros) en espera de su esporulación, al no ser observada después de 20 días
(en promedio), se realizó la identificación del agente por medio de técnicas moleculares en
las cuales todas fueron determinadas como Rhytidhysteron rufulum con un 97- 99% de
homología en el BLAST.
Por otro lado, las secuencias moleculares de estudios sobre hongos patógenos de humanos
causante de feohifomicosis en la India, revelan que la relación filogenética más cercana es
con el género Rhytidhysteron por lo que Chowdhary (2008), Mishra et al., (2014), Mahajan
et al., (2014) y Chander et al., (2016) han indicado a este género como patógeno oportunista
en pacientes inmunosuprimidos.
II. ANTECEDENTES
Durante mucho tiempo se consideraron cuatro especies válidas para el género
Rhytidhysteron, siendo la más frecuente R. rufulum, por lo que Murillo, et al. (2009)
10
realizaron la revisión de especímenes de Costa Rica identificados como Rhytidhysteron
rufulum e indicaron que en este grupo se observaban cuatro linajes distintos, corroborados
por aspectos morfológicos y caracteres químicos reconociendo que R. rufulum es un
complejo de especies (Murillo, et al., 2009; Boehm, et al., 2009b; Yacharoen, et al., 2015;
Doilom, et al., 2016; Thambugala, et al., 2016; Soto-Medina y Lücking, 2017).
Actualmente se reconocen 21 especies adscritas al género Rhytidhysteron de acuerdo con el
Index Fungorum, 2019 (Kirk et al., 2019): R. beccarianum (Ces.) Bat. Y Valle, R. brasiliense
Speg., R. columbiense Soto-Medina y Lücking, R. discolor Speg., R. dissimile (P. Karst.)
Magnes, R. fuscum (Ellis y Everh.) J.L. Bezerra y Kimbr., R. guaraniticum Speg., R.
hysterinum (Dufour) Samuels y E. Müll., R. viride Speg., R. indicum M.P. Sharma y K.S.
Thind, R. javanicum Penz. & Sacc., R. mangrovei Kumar, R. minor (Cooke) A. Pande, R.
neorufulum Thambug. Y K.D. Hyde, R. opuntiae (J.G. Br.) M.E. Barr, R. prosopidis Peck,
R. quercinum (B.G. Desai y V.N. Pathak) M.P. Sharma y Rawla, R. rufulum (Spreng.) Speg.,
R. scortechinii Sacc. y Berl., R. tectonae Doilom y K.D. Hyde, y R. thailandicumThambug.
Y K.D. Hyde.
De todas las especies mencionadas solo cuatro se han descrito utilizando marcadores
moleculares y caracteres morfológicos: Rhytidhysteron tectonae del Norte de Tailandia sobre
Tectona grandis L. (Doilom et al., 2016), en este mismo país, Thambugala y K.D. Hyde,
describen dos especies nuevas: R. thailandicum y R. neorufulum, catalogadas anteriormente
como R. rufulum e indicaron que se esperan muchas especies de este género (Thambugala,
et al., 2016). Recientemente se describió Rhytidhysteron mangrovei sobre Rhizophora
apiculata Blume., de Tailandia (Kumar et al., 2019).
11
En México, sólo se ha citado a R. rufulum de los estados de Sonora (Méndez-Mayboca et al.,
2008, 2010), Oaxaca (Raymundo et al., 2014; Álvarez et al., 2016) y Chacón et al., (2014)
la mencionan de los estados de Chiapas, Guerrero, Nuevo León, Puebla, Querétaro, Quintana
Roo, Sonora, Tabasco, Tamaulipas, Veracruz y Yucatán. López y García (2017) citan R.
rufulum de un bosque mesófilo de Xalapa, Veracruz.
Por otra parte, se han extraído metabolitos secundarios, tales como las Ritidenonas,
compuestos que pertenecen a una rara familia de metabolitos fúngicos conocidos como
espirobisnaftalenos, sustancias activas que tienen una variedad de actividades biológicas
tales como: actividades antibacterianas, antifúngicas, anticancerígenas, antileishmaniales y
antiinflamatorias, que en un futuro podrían servir en la elaboración de nuevos fármacos.
12
Cuadro 1. Especies de Rhytidhysteron en el mundo.
Especie Localidad Características
morfológicas
Hospedero Autores, año
R. beccarianum Sri Lanka Ascomas apoteciales de color marrón
de 1-1.5 mm. Ascas 60 × 6 µm.
Ascosporas 12-15 × 5-6 µm
Angiospermas (Ces.) Bat. Y
Valle 1964
R. brasiliense Cerca de Iguapé el
sur de Brasil
Histerotecios de 1.5-2 mm × 0.8.
Epitecio oscuro. Ascas 230 – 250 × 20
– 30 µm. Ascosporas 40-45 × 15-20
µm
Angiospermas Speg. 1821
R. columbiense Cerro San
Antonio, Cali.
Colombia.
Histerotecios de 1.5-3.0 mm × 1.2-1.8
mm, marrón-negro, y color verde
amarillento en los márgenes Epitecio
marrón- negro. Ascas 175–190 × 14–
18 μm. Ascosporas 38– (43.5) –52 ×
13– (14.7) –18 μm, de 1-3 septos.
Angiospermas Soto-Medina y
Lücking 2017
R. discolor Cerca de Guarapí.
Paraguay
Ascomas apoteciales cambiando de
color pardo-rojizo al anaranjado y
después a coccineo. Borde liso o con
estrías de color marrón a negro,
opacos o lustrosos. Ascosporas
fuliginosas.
Probablemente Celtis
sp.
Speg. 1919
R. dissimile Finlandia Ascomas apoteciales. Epitecio negro.
Ascosporas hialino-amarillas, con 3-5
septos, de 30-46 × 12-20 µm.
(probablemente sobre ramas de pino)
Probablemente Pinus
sp.
(P. Karst.)
Magnes 1997
R. fuscum Jacksonville,
Florida. Estados
Unidos
Ascomas elípticos, triangulares o
irregulares, de 2-3 × 1.5-2 mm. Estrías
bien marcadas. Epitecio color pizarra.
Ascas. 170 × 12-15 µm. Ascosporas
25-30 × 12-14 µm.
Angiospermas (Ellis & Everh.)
J.L. Bezerra y
Kimbr. 1979
R.
guaraniticum
Guarapí. Paraguay Ascomas elíptico-lineares de 1-4 × 1
mm. Epitecio marrón a negro. Ascas
200 × 12-14 µm. Ascosporas 30-34 ×
10-12 µm.
Angiospermas Speg. 1888
R. hysterinum Fontan, Alpes
Marítimos; Puente
del lobo,
Branafan; Luz-
Saint-Sauveur,
Altos Pirineos.
Francia. Nueva
Delhi, India.
Histerotecio hasta 3 mm × 1-2 mm,
tomando la forma apotecial, marrón-
negro, estriado. Epitecio pardo o
rojizo-ferruginoso. Ascosporas de 22-
32 × 10-16 μm (media: 25,6 × 12,2
μm) con un septo transversal central.
Buxus sempervirens,
Diospyros spp., Ilex
spp. y Prosopis spp.
(Dufour) Samuels
y E. Müll. 1980
R. indicum Coorg; Sinhgad,
Pune. India
Ascomas apoteciales a alargados
lisos, de 1.8-3 × 1mm. Ascas 200-220
× 18-20 µm. Ascosporas 30-32 ×
12.14 µm
Scutia indica (Anahosur) M.P.
Sharma y K.S.
Thind 1986
R. javanicum Jardín Botánico de
Buitenzorg,
Bogor, Java.
Indonesia
Ascomas de 1-2 mm de largo, 0,7-1
mm. Epitecio negro. Ascas 170-200 ×
12-14 μm. Ascosporas 32-36 10-
13μm
Angiospermas Penz. Y Sacc.
1898
R. minor Sinhgad, Pune.
India
Ascomas apoteciales. Ascas 137.157
× 7.8-11.7 µm; Ascosporas 20-27.3 ×
6.8-8.5 µm.
Larissa carandas (Cooke) A. Pande
2008
R. neorufulum Provincia de
Chiang Rai.
Tailandia.
Histerotecio: de color negro, coriáceo,
margen liso.
Epitecio de color amarillo. Ascas:
185-220 x 9.5-13 µm.
Angiospermas Thambug. y K.D.
Hyde 2016.
13
Ascosporas: 27-34 × (6.5-)7-10.6(-
12.5) µm.
R. opuntiae Parque Nacional
Sierra da
Confusiones,
Piauí, Caracol.
Brasil
Histerotecio de 0.5–1.7 × 0.2–0.5 mm.
Epitecio rojo-marrón. Ascas 150–207
× 10–14 μm. Ascosporas de 20–25 ×
7.5–10 μm con 3 septos transversales
y uno longitudinal.
Angiospermas (J.G. Br.) M.E.
Barr 1990
R. prosopidis Austin, Texas.
Estados Unidos
Ascomas o triradiados. Epitecio
amarillo verdoso. Ascas de 177.8-
203.2 × 11.43-12.7 µm. Ascosporas
de 20.32-30.48 x 7.62-10.10 µm.
Prosopis juliflora Peck 1894
R. quercinum Simla, India Ascomas apoteciales de 1 – 3 mm de
diámetro. Epitecio negro y cinabrio
(bermellón). Ascosporas de 19.0-24.7
×7.6-11.4 µm.
Quercus sp. (B.G. Desai &
V.N. Pathak)
M.P. Sharma y
Rawla 1986
R. rufulum Asunción,
Paraguay
Histerotecios 1-3.0 × 0.75-1.0 mm.
Epitecio latericio, naranja, rojo a
negro. Ascas 180 × 18 µm.
Ascosporas 30 × 10-12 µm.
Gran variedad de
dicotiledóneas
(Spreng.) Speg.
1921
R. rufulum
Clado I
Reserva Biológica
Hitoy cerere,
Parque Nacional
Cahuita y Palo
Verde. Costa Rica
Histerotecio con margen liso. Epitecio
canela-rojo.
Ascas (215-)234-256(-269) × (12.6-
)13.9-15.2(-16) µm. Ascosporas
(27.9-)30.9-32.2(-36.9) × (9.2-)10.6-
12.3(-14.3) µm.
Acacia sp. Murillo et al.,
2009.
Clado II Reserva Biológica
Hitoy cerere,
Parque Nacional
Cahuita y Palo
Verde. Costa Rica
Histerotecio con margen estriado,
negro, oliva o grisáceo.
Epitecio de color ocre oscuro. Ascas
(218-)224–257(-284) × (15)15.7–
16.7(-17.3) µm. Ascas (31.3-)32.6-
36.4(-37) × (10.4-)11.7-13(-14.4) µm.
Inga sp.
Terminalia sp.
Murillo et al.,
2009.
Clado III Parque Nacional
Barra Honda y
Palo Verde, Costa
Rica
Ascoma con márgenes estriados y un
disco de color castaño, ámbar o sepia.
Ascas (183-)200-221(-237) ×
(11.6)12.2–13(-13.5) µm. Ascosporas
(25. 8-)29.1-30.3(-31.7) × (8.2-)9.1-
10.5(-11.6) µm.
Acacia sp.
Guazuma ulmifolia
Murillo et al.,
2009.
Clado IV Parque Nacional
Palo Verde. Costa
Rica
Ascoma con margen estriado.
Epitecio color salmón.
Ascas 144-168 × 10.7-11.9 µm.
Ascosporas 23-23.8 × 7.7-9.4 µm
Acacia sp. Murillo et al.,
2009.
R. scortechinii Teviot, Australia Ascomas oblongoelipticos de 1.5-2 x
0.6-0.7 mm. Epitecio de color marrón
rojizo. Ascas 180-200 × 12-14 μm.
Ascosporas 25-27 × 12 μm.
Angiospermas Sacc. y Berl.
1885
R. tectonae Provincia de
Chiang Rai,
Tailandia.
Ascoma 1.2–3.4 mm × 0.3-0.8 μm,
borde liso. Epitecio amarillo. Ascas
(135–) 150–160 (−176) × 10–15.
Ascosporas (19–) 28– 29 (−31) × (8–)
10–12 (−13) μm. 25-27 × 12
Tectona grandis Doilom y K.D.
Hyde 2016
R. thailandicum Provincia de
Chiang Rai,
Tailandia.
Histerotecio: negro, coriáceo. Ascas:
135-160 × 10.5-15 µm. Ascosporas:
20-28(-31) × 7.5-12 µm.
Angiospermas Thambug. y K.D.
Hyde 2016.
R. viride Sur de Brasil Histerotecios verdes, de 1-1.5 × 0.5-
0.6. Ascas 200-250 × 10-12 μm.
Ascosporas 20-30 × 7-9 μm.
Corteza con líquenes Speg. 1821
14
III. JUSTIFICACIÓN
El género Rhytidhysteron presenta amplia distribución de especies en el mundo y no
existe un estudio taxonómico que las englobe. Los caracteres morfológicos utilizados para
separar a las especies descritas no ayudan para definirlas bajo el concepto de especie
morfológica. Actualmente, la taxonomía integrativa al utilizar caracteres morfológicos,
moleculares y ecológicos ha demostrado la delimitación y descripción de nuevas especies en
el género, a pesar de ello, sólo cuatro especies se han validado con el uso de estas
herramientas, sin embargo, diferentes autores han corroborado que Rhytidhysteron es más
diverso de lo asumido, por lo que se esperan muchas más especies del género.
En nuestro país, sólo se ha descrito Rhytidhysteron rufulum de diferentes hábitats (tropicales
y templados) y con características morfológicas distintas y muy variables entre sí, esto,
aunado a la gran diversidad de ecosistemas terrestres que se encuentran en la República
Mexicana, nos lleva a plantear la probabilidad de que exista una mayor diversidad de especies
en el género. Por lo tanto, se realiza el estudio taxonómico, filogenético y de distribución de
las especies de Rhytidhysteron en México, con la finalidad de evaluar los caracteres
morfológicos que nos ayuden a delimitar las especies y con el uso de marcadores moleculares
se pueda tener una filogenia del género que nos permita describir y diferenciar las especies
con mayor presión.
15
IV. HIPÓTESIS
Si las especies de Rhytidhysteron presentan diferencias morfológicas y moleculares,
entonces, la diversidad de especies de este género en México será mayor a la esperada por la
amplia gama de ecosistemas terrestres presentes en el país, que van desde el árido al templado
pasando por el tropical.
V. OBJETIVO GENERAL
Determinar las especies del género Rhytidhysteron en México, mediante análisis
morfológicos y moleculares para establecer los límites taxonómicos, filogenéticos y de
distribución del género.
V. 1 Objetivos particulares
Evaluar los caracteres macro y micromorfológicos importantes en el estudio
taxonómico de Rhytidhysteron.
Obtener las secuencias moleculares ITS para la resolución filogenética.
Proponer hipótesis filogenéticas con la información morfológica y molecular
obtenida.
Determinar los patrones de distribución de las especies.
16
VI. MÉTODOS.
VI.1. Zonas de estudio
El muestreo se llevó a cabo en distintas localidades (Cuadro 2), con diferentes tipos
de vegetación como: el bosque tropical perennifolio (BTP), bosque tropical caducifolio
(BTC), el matorral xerófilo (MX) y el bosque mesófilo de montaña (BMM); las cuales fueron
seleccionadas por las siguientes razones: a) en la mayoría de estas localidades no se tienen
registros previos de Rhytidhysteron rufulum, b) ubicación geográfica que tienen en el país,
es decir, regiones poco exploradas o que son prioritarias para la conservación, así como áreas
naturales protegidas.
Cuadro 2. Sitios de recolección y muestreo en el período octubre 2017- noviembre 2018.
Localidades Coordenadas
geográficas de
las localidades
Región
fisiográfica
Entidad
Federativa
Tipo de
vegetación
Fecha
Reserva de
la Biosfera
El cielo.
La Florida 22°59’28.70” N,
99° 8’26.19” O
Sierra
Madre
Oriental
Tamaulipas BTC,
BMM.
Octubre
2017 y
junio 2018
Sierra
Picachos
(Sabinas
Hidalgo) y
Bustamante
Sombreretillo 26°16’22.80” N,
99°57’40.68” O
Sierra
Madre
Oriental
Nuevo León MX octubre
2017
La Turbina 26°29’15.31”
N,100°12’49.87”
O
Ojo de agua 26°32’59.24”
N,100°34’53.68”
O
Tamasopo Carretera
75D Km 98
22°15’03” N,
100°55’34” O
Sierra
Madre
Oriental
(Huasteca
Potosina)
San Luis
Potosí
BTC noviembre
2017 y
2018 Carretera
Tula-Cerritos
km. 29
22°36’18.09’’N,
100°10’19.74’’O
Ejido El
Cafetal
21°55’33” N,
99°24’44” O
Rancho El
Desengaño
21|51’52” N,
99°22’15” O
Península
de Yucatán
Champotón 19°40’32.44” N,
90°38’22.04” O
Península
de Yucatán
Campeche BTC,
BTSC
enero
2018
17
Tipo de vegetación: bosque tropical caducifolio (BTC), bosque mesófilo de montaña
(BMM), matorral xerófilo (MX), bosque tropical subcaducifolio (BTSC).
Centro de
conservación
y educación
ambiental,
Cozumel
20°29’21.20” N,
86°56’23.05” O
Quintana
Roo
Zona
arqueológica
San Gervasio
20°29’50.84’’N,
86°50’39.23’’O
Honey Cascadas
arcoíris.
Rincón de
Chila
20°16’25.52” N,
-98°12’59.28” O
Puebla BMM febrero
2018
Santiago
Comaltepec,
Ixtlán
La Esperanza 17°37’55.46’’ N
96°22’01’’ O
Sierra de
Juárez
Oaxaca BMM abril 2018
Reserva de
la Biósfera
Tehuacán-
Cuicatlán
Carretera
Tehuacán-
Cuicatlán km
76.
18°13’31.92” N
97°17’36.56” O
Valle de
Cuicatlán
Oaxaca BTC abril 2018
Reserva de
la biósfera
Chamela-
Cuixmala
Vereda
Búho, Eje
Central,
Vereda Tejón
y Vereda
Chachalacas
19°29’34’’ N
105°02’38.26’’
O
Llanura
Costera del
Pacífico
Jalisco BTC septiembre
2018
Reserva de
la biósfera
estatal San
Juan
Xalisco
Cerro San
Juan
21°26’32’’ N
104°54’51’’ O
Llanura
Costera del
Pacífico
Nayarit BTC septiembre
2018
Camino a la
Noria
21°28’34’’ N
104°59’56’’ O
BMM
Carretera
Tepic – San
Blas km 28
21°31’45’’ N
105°09’48’’ O
BTC
Área de
protección
de Flora y
Fauna
Sierra de
Álamos-
Río
Cuchujaqui
Promontorios 27°00’54.1’’ N
109°02’10.5’’ O
Provincia
de Sonora
Sonora BTC octubre
2018
La Sierrita 26°59’01’’ N
108°56’23’’ O
18
VI.2. Trabajo de campo
VI.2.A. Recolección de especímenes
Se realizaron diez exploraciones (Cuadro 2) a las Reservas de la biósfera: el Cielo
(Tamaulipas), Chamela-Cuixmala (Jalisco) y Tehuacán-Cuicatlán (Oaxaca); a los Parques
nacionales: Sierra de Picachos (Nuevo León) y Punta Sur (Quintana Roo); al Área de
protección de flora y fauna: Sierra de Álamos y Río Cuchujaqui (Sonora), y a las localidades:
La Cuchilla y Ojo de agua (Nuevo León), Tamasopo (San Luis Potosí), San Blas (Nayarit),
La Mojonera y Molango (Hidalgo), Honey (Puebla), La Esperanza (Oaxaca), Champotón
(Campeche) e isla Cozumel (Quintana Roo).
VI.2.B. Obtención de especímenes en fresco
Los ejemplares se obtuvieron mediante la búsqueda de ramas secas o caídas, las
cuales fueron revisadas con una lupa de bolsillo para comprobar la presencia de ascomas de
tipo histerotecio o apotecioide, carbonosas. Para la recolección se usó un formón con un
martillo (en el caso de ser ramas muy gruesas), o bien, empleando tijeras de jardinería para
cortarla en trozos más pequeños. Se tomaron fotografías en campo empleando una cámara
digital marca Nikon D7000 con lente macro de 85 mm marca Nikon. Los ejemplares
recolectados se caracterizaron en fresco, tomando los datos morfológicos de los histerotecios
como forma, color del histerotecio y del epitecio, tamaño, hábito de crecimiento y hábitat.
Los colores se describieron de acuerdo con Kornerup y Wanscher (1978). Y fueron
transportados al laboratorio de micología en bolsas de papel estraza o bien en los
contenedores de plástico, ya que en estos se conservan mejor y es más fácil su transporte.
19
VI.3. Trabajo de laboratorio
VI.3.A. Estudio morfológico
Con un microscopio estereoscópico (Zeiss, modelo: 475002) se obtuvieron
características del margen, superficie, así como las medidas del histerotecio. Para el estudio
microscópico se realizaron preparaciones temporales de cortes transversales de los
histerotecios, los cuales se rehidrataron con alcohol al 70% y con KOH 10% (Anexo I) para
observar la reacción de color del epitecio. Estas preparaciones se observaron al microscopio
óptico (Olympus CX31, ZeissK-7 Zeiss (Jena, Alemania) y LABOMED Lx500) para tomar
características de las ascosporas: tamaño, forma, color y número de septos; disposición y
número de ascosporas en las ascas; tamaño y forma de las ascas; forma, tamaño y grosor de
las pseudoparáfisis; así como, el tamaño, forma y grosor de las células del peridio.
VI.3.B. Preservación y conservación.
Para la preservación del material algunos histerotecios se colocaron en una bolsa de
plástico con cierre hermético con sílica gel (para más adelante hacer el cultivo de esta manera
realizar extracción de ADN de estos ejemplares). Posteriormente se guardó el resto de los
ejemplares en un sobre de papel o caja de cartón junto con sus datos de campo.
VI.3.C. Extracción de ADN, amplificación por PCR, purificación y secuenciación.
La extracción de ADN se realizó mediante el método de bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB), de acuerdo con Doyle y Doyle, (1987). Las principales
modificaciones que se realizaron fueron la eliminación del β-mercaptoetanol en la
20
preparación del buffer CTAB, la utilización de los histerotecios mantenidos en sílica gel,
mayor tiempo de incubación y la realización de dos lavados con Etanol 70% frío. (Anexo II).
Las regiones ITS (espaciador interno de la transcripción) del ARN ribosómico, se
amplificaron con los oligos RhytiFar y RhytiRev diseñados para este estudio (Cuadro 3). La
máster mix de amplificación por PCR de genes ITS se formuló en un total de 25 μL de
reacción con 10-100 ng de ADN, 1X de tampón Green GoTaq® Flexi, 2 mM de MgCl2, 0,05
mM de cada DNTP, 1 pM de cada cebador y 1 U de Flexi GoTaq® DNA Polymerase. Las
muestras se amplificaron en el equipo Verity 96-Well Fast Thermal Cycler (thermo Fisher
Scientific). Las condiciones de la PCR se llevaron a cabo usando los siguientes parámetros:
desnaturalización inicial a 94 ° C durante 5 min; 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC
durante 1 minuto, alineación a 59ºC durante 1 minuto y extensión a 72ºC durante 2 minutos;
y una extensión final a 72 ° C durante 10 min. Las condiciones de la PCR (Cuadro 3).
Los productos de extracción, amplificación y purificación se visualizaron en geles de agarosa
al 1% (Anexo III), y se purificaron utilizando el kit DNA Clean & Concentrator TM (Zymo
Research, CA, EE. UU. Anexo IV). Los fragmentos de PCR se secuenciarán por tecnología
Sanger en Macrogen Inc. Company (Seúl Corea). Las secuencias se compararán mediante
BLAST con secuencias de datos de Rhytidhysteron spp. en GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Todas las nuevas secuencias generadas se
depositarán en GenBank.
21
Cuadro 3. Oligos utilizados para la amplificación y secuenciación del gen ITS, y las
condiciones de la PCR.
DI: Desnaturalización inicial; D: Desnaturalización; A: Alineamiento; E: Extensión;
EF: Extensión final.
VI.4. Trabajo de gabinete
VI.4.A. Descripciones
Con los datos obtenidos de los ejemplares en el laboratorio y en campo se realizaron
las descripciones que incluyen: descripción morfológica macro y microscópica de los
histerotecios (tipo de ascoma, tamaño en mm del largo, ancho y altura, forma, ornamentación,
color, consistencia, como se encuentra adherido al sustrato y hábito), del peridio (grosor en
µm, color, número de capas celulares, arreglo y disposición de éstas, tamaño de las células),
las pseudoparáfisis (arreglo, septadas o cenocíticas, diámetro, forma del ápice, color), del
epitecio (grosor en µm, color y reacción en KOH 10%), ascas (tamaño, tipo de asca, arreglo
de las esporas, forma, color y número de esporas) y ascosporas (tamaño, forma, color, número
de septos).
VI.4.B. Conservación de los ejemplares
En cada ejemplar se incluyó una etiqueta de Herbario, anexando los datos tomados en campo
y en algunos casos se incluyeron notas y dibujos sobre la microscopia de este; los ejemplares
Ge
n Nombre Primer DI D A E EF
ITS
RhytiFa
r
5’CTGCGGAAGGATCATTACC3’
94°C
5 min.
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72°C
10
min
RhytiRe
v
5’GCCAGATTTCAAATTTGAGCT
G3’
1
ciclo 35 ciclos
1
ciclo
22
se colocaron en cajas rotuladas con el nombre de la especie, colector, número de colecta y el
estado, para ser depositados en la colección de hongos Gastón Guzmán del Herbario ENCB.
VI.4.C. Elaboración de la base de datos de Rhytidhysteron
Con los especímenes recolectados en este período y los ejemplares de Herbario se
realizó una base de datos en el programa Excel 2016 de la paquetería Office, para la base se
consideraron los siguientes campos: Phylum, Clase, Orden, Familia, Género, Epíteto
específico, Región Fisiográfica, Estado, Municipio, Localidad, Tipo de Vegetación,
Colector, Número de colecta, Fecha, Altitud, Latitud N, Longitud W y observaciones
adicionales (Anexo V). Esta base de datos se utilizó para realizar el mapa de distribución de
los ejemplares; así como un mapa de distribución potencial de Rhytidhysteron spp. con el
programa BIODIVERS.
VI.4.D. Diseño de Oligos
Se descargaron secuencias de las especies del género Rhytidhysteron, que tuvieran
secuenciada la región ITS, del GenBank
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=Rhytidhysteron, Cuadro 4.) las cuales se
alinearon en el programa Seaview 4.0 (Gouy y Gascuel, 2010), y se buscaron aquellas
regiones con el 100% de apareamiento en ambos extremos de las secuencia, cabe señalar que
los criterios que debe tener un oligo son las siguientes: tamaño entre 18 y 30 nucleótidos, la
base nitrogenada al final del extremo 3´ debe ser rico en Guaninas (G) o Citosinas (C), las
temperaturas de alineamiento debe ser muy cercanas, el contenido de G-C debe estar entre el
40-60%; no deben favorecer horquillas ni ser complementarios.
23
VI.4.E. Análisis filogenético
Para el análisis de máxima parsimonia se utilizaron secuencias de referencia
depositadas en las bases de datos NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) de
fragmentos de los genes ITS de géneros y especies relacionados a Rhytidhysteron rufulum;
Hysterobrevium mori (Schwein.) E. Boehm y C.L. Schoch, y Gloniopsis praelonga
(Schwein.) Underw. y Earle, se emplearon como grupos externos del taxón (Anexo VI).
Se verificaron los datos de secuencias usando Bioedit v7.0.9.0 (Hall, 1999) y se alinearán
usando el algoritmo Clustal W en Clustal X v2.1 (Larkin et al., 2007). Los alineamientos
fueron editados en Seaview v 4.6 (Gouy et al., 2010). La identificación de las especies se
realizará mediante métodos de inferencia filogenética de máxima verosimilitud utilizando la
plataforma en línea RAxML (https://cme.h-its.org/exelixis/web/software/raxml/index.html)
(Stamatakis, 2014) y el programa Mr. Bayes (Ronquist et al., 2012). Se utilizó jModelTest,
que es un modelo de sustitución de nucleótidos de mejor ajuste. Por último, se construyeron
los árboles filogenéticos, los cuales se editaron utilizando la herramienta de dibujo de Árbol
V1.4.2.
24
VII. RESULTADOS
VII.1. Taxonomía de Rhytidhysteron
Los caracteres de mayor importancia para la determinación de las especies de
Rhytidhysteron fueron: el tamaño del histerotecio, ya que tanto el largo como el ancho
variaron de una especie a otra; ornamentación de la pared y del borde del histerotecio (Fig.
2e) es decir, si son lisos o estriados, en este sentido la única especie que presentó peridio
completamente liso es R. neorufulum, las demás especies se pueden diferenciar por el
tamaño, color y estrías del peridio; el color del epitecio es un carácter plástico, definido por
el grado de madurez de los histerotecios, como bien lo mencionan Thambugala et al., (2016);
sin embargo, en el color de la reacción con KOH al 10% sí se observan las diferencias entre
una especie y otra, por lo que la reacción debe ser considerada en próximas descripciones de
las especies de este género. Si bien el tamaño de las ascosporas causa conflictos en R.
rufulum, al ser un rango de tamaños muy amplio, sí son distintivas entre las demás especies
de Rhytidhysteron. Y por último el aspecto ecológico, el tipo de vegetación donde se
encuentran, ya que R. rufulum se encuentra en matorral xerófilo y bosque tropical
caducifolio, mientras que, las demás especies se encuentran en bosque de Quercus, bosque
mesófilo de montaña y bosque subperennifolio.
25
Cuadro 4. Caracteres de importancia taxonómica en el género Rhytidhysteron.
Especie
Tamaño del histerotecio (mm) Color del epitecio Células del
peridio
Ascosporas
Tipo de
vegetación Región fisiográfica
largo ancho alto En
fresco
con KOH
10%
R. neorufulum (1.9-)2.3-
2.8(-3.0) 0.7-1.0
(0.5-)1.1-
1.3 naranja violeta isodiamétricas
=26.6
9.4 µm BTC
Costa del Golfo de México,
Costa Pacífica, Península de
Yucatán, Sierra Madre
Oriental
R. rufulum 1.0-3.0 0.5-1.5 0.5-1.0
rojo,
naranja-
rojizo,
amarillo
o negro
violeta,
morado isodiamétricas
=26 8.8 µm
BTC, MX
Altiplanicie, Costa del
Golfo de México, Costa
Pacífica, Depresión del
Balsas,
Península de Yucatán,
Planicie Costera del
Noroeste, Serranías
Meridionales Sierra Madre
Oriental
R. thailandicum 1.0-1.5(-
1.9)
0.4-0.6 (-
0.9) 0.6-1.0
rojo
oscuro violeta isodiamétricas
=28 10.6
µm
BTC, BPQ,
MX
Altiplanicie, Costa del
Golfo de México, Costa
Pacífica Depresión del
Balsas, Sierra Madre
Oriental, Valle de
Tehuacán-Cuicatlán,
R. esperanzae (2.0-)3.0-
4.5
(1.2-)2-
3.0
(1.0-)1.7-
2.4
color
gris
verdoso
amarillo-
verdoso isodiamétricas 45 x 17.2 BMM
Serranías Meridionales
R. mexicanum (2.3-)3.3-
3.7
(1.4-)2.1-
2.4 1.5
amarillo
limón ámbar isoradiadas 43.7 x 13.5 BQ, MX
Serranías Meridionales
R. mesophilum (2.5-) 2.7-
3.5 (-4.2)
1.0-1.5 (-
1.9) 1.4-1.75 naranja púrpura isoradiadas 44.2 x 13.6 BMM/BPQ Sierra Madre Oriental
R. cozumelensis (1.3-)1.5-
2.1(-2.5)
(0.5-)1.0-
1.6
(0.8)1.0-
1.7 (1.9) amarillo morado isodiamétricas
=28 10.2
µm BTC Península de Yucatán
R. neohysterinum (1.5-)1.9-
2.3 (-2.5)
(0.7-)1.0-
1.6(-2.2)
(0.7)0.9-
1.1 naranja morado isoradiadas
=26.6
9.4 µm MX
Altiplanicie, Sierra Madre
Oriental
R. sonorensis 1.3-2.3 0.8-1.0 0.4-0.5 (-
1.0)
rojo,
naranja isodiamétricas 16.5 x 7.1 BTC, MX
Planicie Costera del
Noroeste
26
VII.2. Descripciones de las especies
Se identificaron nueve especies del género Rhytidhysteron en México, de las cuales
una ya se había descrito anteriormente, dos son nuevos registros para el país y seis son nuevas
para la ciencia.
1. Rhytidhysteron neorufulum Thambugala y K.D. Hyde, in Thambugala, Hyde,
Eungwanichayapant, Romero y Liu, Cryptog. Mycol. 37(1): 110 (2016. Holotype
MFLU 14-0608. Figura 3.
Histerotecios de (1.9)2.3-2.8(3) mm de largo, 0.7-1 mm de ancho, (0.5) 1.1-1.3 mm de alto,
naviculares alargados y en ocasiones triradiados (figura 3 A-B), escasamente presentan la
forma apotecial negros a verde opaco, carbonosos a coriáceos, superficiales, solitarios a
gregarios, no presenta estrías en el borde del margen, es decir margen liso (figura 3 B), sin
embargo presenta una líneas a lo largo de ascoma de forma paralela al borde del histerotecio,
con surco o hendidura longitudinal y se vuelve lenticular (cuando maduros o con la
humedad), abriendo de forma irregular a discoidal, tomando la forma apotecial, exponiendo
el himenio. Peridio con un grosor entre 50 - 60 µm (en la parte media del histerotecio) y en
la base se engruesa hasta 250µm, compuesto por una capa delgada de células
pseudoparenquimáticas, de color marrón oscuro a negro en la parte superior, de textura
isodiamétrica o globosa-angularis (figura 3 D), de (7-)10 -13 (-15) 6-7 (-9) µm, de paredes
gruesas de 1µm. Epitecio naranja a naranja rojizo, en reacción con KOH 10% cambia a
violeta, la reacción es muy rápida. Pseudoparáfisis de 1-2 µm de diámetro con la parte apical
más ensanchada de hasta 4 µm de diámetro, filamentosas, hialinas y densas formando el
epitecio. Ascas bitunicadas (figura 3 E), de 238 15 µm, claviformes a cilíndricas, hialinas,
uniseriadas, octospóricas, con un pedicelo corto. Ascosporas (figura 3 F) de (28.8-) 31.2-
27
33.6 (-36.8) (10.4-) 11.2-12 µm ( = 32 11 µm, n=30), elipsoidales a fusiformes,
ligeramente redondeadas o puntiagudas en ambos extremos, amarillentas cuando están
inmaduras, de color marrón rojizo a marrón cuando maduran, con tres septos longitudinales,
constreñidas en el tabique central.
Material estudiado. MÉXICO, Campeche, municipio Calakmul, Reserva de la Biósfera
Calakmul, diciembre 4, 2010, T. Raymundo 3622, s/n (ENCB), R. Valenzuela 14153, 14153ª
(ENCB); municipio Champotón, Autopista Champotón-Campeche Km. 180, enero 19, 2018,
T. Raymundo 7234 (ENCB). Colima, municipio Manzanillo, Oeste de la Bahía de Santiago.
Carretera a Barra de Navidad, octubre 26, 1967, G. Guzmán 6232, (ENCB); Humedales, a 4
Km al N de Manzanillo, 12 julio 2016, R. Valenzuela 16708, 16717, 16718, 16719, 16729,
16732, 16747 (ENCB); A. Camargo s/n. (ENCB). Jalisco, municipio de La Huerta, Camino
Bosque de la Enseñanza Estación Biológica Chamela, septiembre 27, 2013, I. Álvarez 519,
522 (ENCB); Camino Eje Central. Reserva de la Biósfera Chamela-Cuixmala, septiembre
22, 2012, T. Raymundo 4431, 4434, 4442 (ENCB); septiembre 28, 2013, I. Álvarez 535, 536,
537 (ENCB); septiembre 16, 2018, A. Cobos-Villagrán 2057, 2058 (ENCB), A. Hernández-
Zamora 326, 341 (ENCB); Camino Búho. Reserva de la Biósfera Chamela-Cuixmala,
septiembre 23, 2012, T. Raymundo 4449 (ENCB); septiembre 15, 2018, A. Cobos-Villagrán
2033, 2034, 2035, 2035ª, 2038, 2039, 2040, 2041, 2050, 2056, 2059 (ENCB), S. Bautista-
Hernández 921, 925 (ENCB), A. Gay AG15091813, A. Hernández -Zamora 319 (ENCB), T.
Raymundo 7844, 7837 (ENCB), R. Valenzuela 18533, 18538 (ENCB); Camino Chachalacas.
Reserva de la Biósfera Chamela-Cuixmala, septiembre 16, 2018, A. Cobos-Villagrán 2066
(ENCB); Camino Tejón. Reserva de la Biósfera Chamela-Cuixmala, septiembre 16, 2018,
28
A. Cobos-Villagrán 2062, 2063 (ENCB). Nayarit, municipio Xalisco, Cerro San Juan,
Reserva de la biósfera estatal San Juan Xalisco, septiembre 28, 2018, T. Raymundo 7908,
7909 (ENCB), M. Sánchez 1305 (ENCB); municipio San Blas, Carretera Tepic - San Blas
Km 27, septiembre 29, 2018, T. Raymundo 7963, 7977 (ENCB), R. Valenzuela 18667
(ENCB), M. Sánchez 1384 (ENCB). Oaxaca, municipio San Pedro Tututepec. Juquila, Km
7.2 del camino Los Azufres-La Grúa. Parque Nacional Laguas de Chacahua, noviembre 12,
2011, T. Raymundo 4119 (ENCB), Km 5 del camino Los Azufres-La Grúa. Parque Nacional
Laguas de Chacahua, noviembre 02, 2013, D. Castro-Bustos 249 (ENCB). Quintana Roo,
municipio Cozumel, Centro de conservación y educación ambiental. Parque Museo de
Cozumel, enero 19, 2018, A. Cobos-Villagrán 915 (ENCB); Alrededores del Transcaribe
API, enero 21, 2018, A. Cobos-Villagrán 960, 961, 963 (ENCB), T. Raymundo 7346
(ENCB), R. Valenzuela (ENCB), 18019, 18022, 18025, 18025ª; Zona arqueológica San
Gervasio. Chen-tuk, enero 21, 2018, T. Raymundo 7337 (ENCB); junio 17, 2018, A. Cobos-
Villagrán 1840, 1841, 1843 (ENCB), A. Bernal 132 (ENCB); Parque Ecológico Punta Sur,
junio 16, 2018, A. Cobos-Villagrán 1816 (ENCB). San Luis Potosí, junio 14, 2009, Nolasco
y González 8 (ENCB); municipio Tamasopo, Potreo del Hotel Real Kímera. Ejido Los
Cafetales, noviembre 03, 2017, A. Cobos-Villagrán 787, 790, 791 (ENCB). Tabasco.
Municipio Emiliano Zapata, UMA Los Manatíes, julio 19, 2015, E. Escudero-Leyva 484
(ENCB), R. Valenzuela 15609, s/n (ENCB); julio 20, 2015, E. Escudero-Leyva s/n.
Tamaulipas, municipio Gómez Farías, La Florida. Reserva de la Biósfera El Cielo, octubre
05, 2017, A. Cobos-Villagrán 534 (ENCB), T. Raymundo 6803, 6804, 6813 (ENCB), R.
Valenzuela 17412, 17413, 17423 (ENCB); junio 24, 2018, A. Cobos-Villagrán 1861
(ENCB); La Florida. Ejido El nacimiento. Reserva de la Biósfera El Cielo, junio 25, 2018,
29
A. Cobos-Villagrán 1904, 1917 (ENCB); junio 26, 2018, A. Cobos-Villagrán 1932, 1949,
1950, 1951, (ENCB).
Hábitat. Solitario a gregario, sobre madera en descomposición de Bursera en el bosque
tropical caducifolio en un gradiente altitudinal de los 0 a los 190, hasta los 1090 msnm; y
ocasiona una pudrición blanda.
Distribución. Esta especie ha sido descrita recientemente en Chiang Rai Province, Tailandia
(Thambugala, et al., 2016) e Islas Andaman, India (Niranjan, et al., 2018). En el presente
estudio se registra por primera vez para México.
Notas taxonómicas: Rhytidhysteron neorufulum se distingue perfectamente de otras especies
porque el borde del margen de los histerotecios es completamente liso, es decir no tiene
estrías ni ningún otro tipo de ornamentación. Los especímenes mexicanos presentan los
mismos caracteres morfológicos que los descritos en Tailandia.
30
Figura 3. Rhytidhysteron neorufulum. A-B. Histerotecios. B. Margen liso. Corte transversal del
histerotecio. D. Células del peridio. E. Asca. F. Ascosporas.
31
2. Rhytidhysteron rufulum (Spreng.) Speg. Anales Sociedad Científica Argentina
90(1-6): 177, 1921. Tipo: PUERTO RICO, C. Sprengel s.n., In: Plantarum Cryptogamicarum
Tropicarum Pugillus: 50. 1820. Kongl. Vetenskaps Academiens Handlingar (Espécimen tipo
no designado ni se menciona en que herbario se depositó). Figura 4.
Histerotecios de 1-3.0 mm de largo, 0.5-1.5 mm de ancho, 0.5-1.0 mm de alto, naviculares,
alargados, rectos o flexuosos cuando jóvenes, con los extremos agudos, algunos son
triradiados, negros, carbonosos, errumpentes o superficiales, gregarios o solitarios, borde
estriado (figura 4 A-B), con surco o hendidura longitudinal y se vuelve lenticular (cuando
maduros o con la humedad), abriendo de forma irregular a discoidal, tomando la forma
apotecial de 2-4 mm de diámetro, exponiendo el himenio. Peridio (figura 4 D) de 40-72 μm
de grosor, adelgazándose hacia la parte media y el extremo basal, en la parte apical más
gruesa; compuesto por capas de células pseudoparenquimáticas de textura isodiamétrica o
globosa-angularis, de 9.6-12 8-8.8 μm, de paredes gruesas, 1.6-2.4 μm de grosor. Epitecio
de 25.6-32 μm de ancho, color rojo, naranja a naranja rojizo, negro o amarillo cambiando a
violeta o morado intenso con KOH 10% (figura 4 C). Pseudoparáfisis de 1.6-2.4 μm hasta
3.2-4.0 μm de ancho en el extremo apical, filamentosas, capitadas, hialinas, septadas,
ramificadas hacia el ápice, fuertemente anastomosadas por encima de las ascas formando el
epitecio. Ascas bitunicadas (figura 4 E), de 142.5-169.7 12-14.4 μm, cilíndricas, hialinas,
uniseriadas, octospóricas, de paredes gruesas, con la base sinuosa. Ascosporas (figura 4 F)
de 22.4-30.4 8-9.6 μm, ( = 26 8.8 µm, n=30), elipsoides a oblongas, fusiformes,
ligeramente curvadas, de color marrón a marrón rojizo, con tres septos transversales,
cingulados, de pared gruesa y lisa.
32
Material estudiado. MÉXICO, Campeche, municipio Calakmul, Reserva de la Biósfera
Calakmul, diciembre 3, 2010, T. Raymundo 3643, 3573, 3594, (ENCB), R. Valenzuela
14156 (ENCB); diciembre 4, 2010, T. Raymundo 3617, 3646 (ENCB). Municipio
Champotón, Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 70, enero 03, 2018, T. Raymundo
7215, 7217, 7219 (ENCB), R. Valenzuela 17783 (ENCB). Autopista Champotón-Campeche
Km. 180, enero 19, 2018, A. Cobos-Villagrán 852, 853, 854, 855, 864, (ENCB). Estado de
México, municipio San Marcos Tecomaxusco, Carretera Tecomaxusco, octubre 03, 2015, A.
Barbosa 21 (ENCB). Municipio Chiautla, Cerro Promesas, San Antonio Tepetitlán, octubre
15, 2017, M. Sánchez 1040, 1043, 1046, 1047 (ENCB). Hidalgo, municipio Huichapan, A.
Cobos-Villagrán (ENCB). Municipio Molango de Escamilla, Laguna Atezca, junio 01, 2018,
R. Valenzuela (ENCB). Guerrero, municipio Cocula, R. Valenzuela 14355 (ENCB). Nayarit,
municipio Xalisco, Cerro San Juan, Reserva de la biósfera estatal San Juan Xalisco,
septiembre 28, 2018, T. Raymundo 7910 (ENCB); municipio Tepic, Camino a la Noria.
Reserva de la biósfera estatal San Juan Xalisco, septiembre 28, 2018, M. Sánchez 1324
(ENCB), municipio San Blas, Carretera Tepic - San Blas Km 31, septiembre 29, 2018, M.
Sánchez 1328 (ENCB). Nuevo León, municipio de Sabinas Hidalgo, Sombreretillo, Sierra
de Picachos, octubre 27, 2017, A. Cobos-Villagrán 682, 685, 686 (ENCB); Camino de
Sombreretillo a Rancho La Sardina, Sierra de Picachos, octubre 27, 2017, A. Cobos-
Villagrán 688, 689, 691, 692, 693, 695, 696, 697, 698, 703, 705,706 (ENCB); A faldas de la
Sierra de Picachos, octubre 27, 2017, A. Cobos-Villagrán 715, 718, 719, 724, 726, 727, 729,
730, 732 (ENCB); T. Raymundo 7029 (ENCB); Rancho La Sardina, Sierra de Picachos,
octubre 27, 2017, A. Cobos-Villagrán 733 (ENCB); La Cuchilla Parque La Turbina, octubre
28, 2017, A. Cobos-Villagrán 741, 744, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 756, 757, 762,
33
764 (ENCB), T. Raymundo 7049 (ENCB), R. Valenzuela 17569, 17588, 17589, 17603
(ENCB); municipio Bustamante, Ojo de agua, octubre 28, 2017, A. Cobos-Villagrán 765,
766, 767, 768, 769. Oaxaca, municipio Ixtlán de Juárez, A orilla del río Santa María, marzo
02, 2014, E. Escudero-Leyva 374, 383, 385 (ENCB); Santa María Yahuiche, marzo 02, 2014,
I. Ortega-López 226 (ENCB); municipio Vega de Sol, Rancho Gavilán, Tuxtepec, febrero
01, 2014, I. Ortega-López 220 (ENCB); El Zuzul, Tuxtepec, E. Escudero-Leyva s/n (ENCB);
municipio San Miguel Santa Flor, Cuicatlán, Palomora, julio 07, 2014, D. Castro-Bustos 341;
Llano mesa, agosto 10, 2015, A. Cobos-Villagrán 213 (ENCB); municipio Santa María
Chilchotla, Teotitlán, Cueva Blanca, San Miguel Nuevo, julio 09, 2014, T. Raymundo 5167
(ENCB); municipio Santiago Laollaga, Istmo de Tehuantepec, Cerro Negro, octubre 25,
2014, E. Escudero-Leyva 38 (ENCB), M. Ramírez-Aguirre 12 (ENCB), R. Valenzuela
15991,15992, 15993, 15994, 16063 (ENCB); municipio San Pedro Tututepec. Juquila, Km
4 del camino Los Azufres-La Grúa. Parque Nacional Laguas de Chacahua, noviembre 12,
2011, T. Raymundo 4095 (ENCB), R. Valenzuela 14595 (ENCB); Km 5 del camino Los
Azufres-La Grúa. Parque Nacional Laguas de Chacahua, noviembre 12, 2011, T. Raymundo
4103, 4104 (ENCB), R. Valenzuela 14603, 14604 (ENCB), I. Álvarez 336 (ENCB); Km 7.2
del camino Los Azufres-La Grúa. Parque Nacional Laguas de Chacahua, noviembre 12,
2011, T. Raymundo 4115, 4118, 4140 (ENCB), R. Valenzuela 14615, 14618, 14619
(ENCB), K. Victoria 24 (ENCB), C. Salinas 34 (ENCB); noviembre 02, 2013, R. Valenzuela
15339 (ENCB); municipio Candelaria, Pochutla, Finca cafetalera "El Pacífico", marzo 15,
2014 D. Castro-Bustos 267 (ENCB). Querétaro, municipio Arroyo seco, Puente de Ayutla,
octubre 16, 2016, M. Contreras 1005 (ENCB). Quintana Roo, municipio Cozumel, Centro
de conservación y educación ambiental. Parque Museo de Cozumel, enero 19, 2018, A.
34
Cobos-Villagrán 915 (ENCB); Alrededores del Transcribe API, enero 21, 2018 R.
Valenzuela 18024 (ENCB), T. Raymundo 7346, 7348 (ENCB); Parque Ecológico Punta
Sur, junio 16, 2018, A. Cobos-Villagrán 1811, 1817, 1820, 1821, 1823, 1824, 1825 (ENCB),
Raymundo 7663 (ENCB); Zona arqueológica San Gervasio. Chen-tuk, junio 17, 2018, A.
Cobos-Villagrán 1844, 1845, 1861 (ENCB). San Luis Potosí, municipio Tamasopo,
Carretera Río Verde-Cd. Valles Km 64, noviembre 01, 2007, T. Raymundo y R. Valenzuela
1905 (ENCB); El Sauz, Km. 28, agosto 30, 2009, T. Raymundo 3266 (ENCB); agosto 31,
2009, J. Jaimes y H. Luna 26, 30 (ENCB); octubre 12, 2009, T. Raymundo y R. Valenzuela
s/n (ENCB), T. Raymundo s/n (ENCB); Carretera Río Verde-Cd. Valles Km 70, septiembre
09, 2015, T. Raymundo5805, 5819, R. Valenzuela 16241 (ENCB); Potreo del Hotel Real
Kímera. Ejido Los Cafetales, noviembre 03, 2017, A. Cobos-Villagrán 788,793, 798, 801,
802, 803(ENCB), Puente de Dios, Huasteca Potosina, noviembre 04, 2017, S. Bautista-
Hernández 1001; municipio Rayón, Cerro al NE del cafetal, noviembre 29, 2012, I. Álvarez
319 (ENCB); Carretera Cd. Valles-San Luis Potosí Km 67, A. Cobos-Villagrán 920
(ENCB)¸municipio El Naranjo, Cerro al N de Micos, Ciudad Valles, I. Álvarez 328,329,330
(ENCB); municipio Guadalcazár, Carretera Cerritos-entronque a Tula Km 26, octubre 09,
2017, A. Cobos-Villagrán 645, 646 (ENCB), T. Raymundo 7005 (ENCB); Carretera 75-D,
San Luis-Cd. Valles Km. 98, noviembre 02, 2017, A. Cobos-Villagrán 772, 774(ENCB);
municipio Aquismón, Río Tampaón, alrededores de la Cascada Tamul, noviembre 03,2018,
T. Raymundo 8149 (ENCB), R. Valenzuela 18849 (ENCB), S. S. Salazar 39 (ENCB).
Sonora, municipio Benjamín Hill, Las Ánimas, Planicie Central del Desierto Sonorense,
agosto 17, 2009, T. Raymundo 3173 (ENCB); municipio Carbó, San Luis, Desierto
Sonorense, agosto 17, 2009, T. Raymundo 3140, 3168 (ENCB); municipio Álamos, El
35
Cajón, APFF Sierra Álamos-Río Cuchujaqui, Octubre 14, 2013, T. Raymundo 4801, 4802,
4810, 4817, 4822 (ENCB), D. Castro-Bustos 110, 118, 119, 120, 131 (ENCB); Promontorios,
APFF Sierra Álamos-Río Cuchujaqui, octubre 07, 2014, T. Raymundo 5411, 5414, 5443
(ENCB), R. Valenzuela 15808, 15819, 15828, 15829, 15831, 15833, 15847 (ENCB); Rancho
La Sierrita, APFF Sierra Álamos-Río Cuchujaqui, octubre 15, 2013, E. Escudero-Leyva 253
(ENCB); Octubre 07, 2014, T. Raymundo 5440 (ENCB); octubre 08, 2014, T. Raymundo
5466, 5477, 5478, 5483 (ENCB), R. Valenzuela 15856 (ENCB); octubre 28, 2018, A.
Cobos-Villagrán 2083, 2084, 2085, 2086 (ENCB), T. Raymundo 8082 (ENCB), R.
Valenzuela 18762 (ENCB), S. Bautista-Hernández. 9687 (ENCB); Sobre camino a Los
Cantiles, Rancho La Sierrita, APFF Sierra Álamos-Río Cuchujaqui, octubre 09, 2014;T.
Raymundo 5523, 5532, 53533 (ENCB), R. Valenzuela 15901, 15903(ENCB); municipio San
Miguel Horcasitas, octubre 19, 2013, R. Valenzuela15284, s/n (ENCB), T. Raymundo 4864,
4872 (ENCB), E. Escudero-Leyva 279 (ENCB); Camino a Promontorios, APFF Sierra
Álamos-Río Cuchujaqui, octubre 27, 2018, A. Cobos-Villagrán 2067, 2068, 2069, 2070,
2071, (ENCB), T. Raymundo 8045 (ENCB), R. Valenzuela 18731 (ENCB); municipio San
Javier, Carretera Yecora-La Colorada Km. 135, octubre 03, 2016, R. Valenzuela 16962,
16963, 16996, 16970 (ENCB); Octubre 05, 2016, R. Valenzuela 17127, 17137
(ENCB).Tabasco, municipio Emiliano Zapata, UMA Los Manatíes, julio 19, 2014, T.
Raymundo 5214 (ENCB); julio 20, 2014, E. Escudero-Leyva 613 (ENCB), T. Raymundo
5220 (ENCB),R. Valenzuela 15620, 15631 (ENCB).Tamaulipas, municipio Gómez Farías,
La Florida. Reserva de la Biósfera El Cielo, junio 24, 2018, A. Cobos-Villagrán 1862
(ENCB); junio 25, 2018, A. Cobos-Villagrán 1891, 1892, 1893, 1900, 1902, 1903, 1909,
1910, 1912, 1913, 1914, 1915, 1916 (ENCB); junio 26, 2018, A. Cobos-Villagrán 1938
36
(ENCB); Ejido El Azteca, pasando el río. Reserva de la Biósfera El Cielo, junio 27, 2018, A.
Cobos-Villagrán 1978 (ENCB), U. Rodríguez s/n (ENCB); Sendero a Alta Cima, junio 27,
2018, G. Dávila 168 (ENCB).
Hábitat. Esta especie crece gregaria sobre madera en descomposición de diversas
angiospermas (Prosopis spp., Helietta parvifolia, Bougainvillea glabra, Acacia
cochliacantha entre otras), en bosque tropical caducifolio y matorral xerófilo, desde los 0 a
los 1636 hasta los 2475 msnm, ocasionando una pudrición blanda.
Distribución. Taiwán (Chen y Hsieh 1996); Cataluña, España (Sierra-López 2006). Costa
Rica, Estados Unidos, Puerto Rico (Murillo et al., 2009); Argentina, Brasil, China, Costa
Rica, Cuba, Dominica, Estados Unidos de América, Filipinas, Francia, Ghana, India, Islas
Cook, Jamaica, Japón, Kenia, Malasia, Micronesia, Nueva Guinea, Nueva Zelanda, Puerto
Rico, Sierra Leone, Tanzania y Tonga (Almeida et al., (2014); Tailandia (Thambugala, et al.,
2016) e Islas Andaman, India (Niranjan, et al., 2018).En México Rhytidhysteron rufulum, se
ha citado anteriormente del estado de Sonora (Méndez-Mayboca et al., 2010), Oaxaca
(Raymundo et al., 2014; Álvarez et al., 2016), de Chiapas, Guerrero, Nuevo León, Puebla,
Querétaro, Quintana Roo, Sonora, Tabasco, Tamaulipas, Veracruz y Yucatán (Chacón et al.,
2014),y Xalapa, Veracruz (López y García 2017); se cita por primera vez para los estados de
Campeche, Colima, Estado de México, Hidalgo, Jalisco, Nayarit y San Luis Potosí.
Notas taxonómicas: Rhytidhysteron rufulum se caracteriza por presentar epitecio de color
naranja- naranja rojizo, sin embargo, pueden presentar variabilidad de colores hasta llegar a
negro debido al grado de madurez de las esporas. R. rufulum es la especie con mayor
distribución en el país.
37
Figura 4. Rhytidhysteron rufulum. A-B. Histerotecios. B. Margen estriado. C-D. Corte transversal del
histerotecio D. Coloración con KOH 10 %. E. Asca. F. Ascosporas.
38
3. Rhytidhysteron thailandicum Thambugala y K.D. Hyde in Thambugala, Hyde,
Eungwanichayapant, Romero y Liu, Cryptog. Mycol. 37(1): 110 (2016). HOLOTIPO:
TAILANDIA, MFLU 14-0607. Figura 5.
Histerotecios de 1.0-1.5 (-1.9) largo, 0.4-0.6 (-0.9) ancho, 0.6-1.0 mm alto, en forma de
conchas, globosos a subglobosos, comprimidos en el ápice y deprimidos, negros, carbonosos,
errumpentes, solitarios o dispersos raramente gregarios, borde estriado, involutos, con surco
o hendidura longitudinal irregular, sin embargo, no forman la abertura lenticular (forma
apotecial) en la madurez o con humedad (figura 5 A). Peridio de un grosor regular de 66.5-
76 µm, ligeramente más grueso en la base hasta 95 µm, compuesto por células
pseudoparenquimáticas, de textura isodiamétrica o globosa-angularis, de 10-12 5-7 µm, de
paredes delgadas, 1 µm de grosor, carbonosas, de color marrón a marrón oscuro (figura 5 C).
Epitecio rojo oscuro en reacción con KOH 10% cambia a violeta. Pseudoparáfisis de 3 µm
de ancho, filamentosas, capitadas hialinas, septadas, densas, fuertemente anastomosadas por
encima de las ascas formando el epitecio. Ascas bitunicadas (figura 5 D), de 170-185 12-
13 µm, clavadas a cilíndricas, hialinas, uniseriadas o parcialmente superpuestas,
octospóricas, con pedicelo corto y apicalmente redondeado con una cámara ocular.
Ascosporas de 26-28 (-30) (9.6-) 10.4-11 (-12) µm, ( = 28 10.6 µm, n=30), elipsoides,
umbonadas en ambos extremos, amarillentas a pardas con tres septos transversales (figura 5
E).
Material estudiado. MÉXICO, Campeche, municipio Champotón, Carretera Champotón-Cd.
Del Carmen Km. 68, 03. I. 2018, T. Raymundo 7209, 7214, 7216, 7218 (ENCB), R.
Valenzuela 17771, 17777, 17775, 17779, 17781 (ENCB); 19. I. 2018, R. Valenzuela 17906
39
(ENCB); Hidalgo, municipio Molango de Escamilla Laguna Atezca, 01.VI.2018, T.
Raymundo 4279, 4386, 7639 (ENCB). Oaxaca, municipio San Mateo Peñasco, San Isidro,
Dto. Tlaxiaco, S. Bautista-Hernández s/n (ENCB). Puebla, municipio de San José
Miahuatlán, Carretera Tehuacán-Cuicatlán Km 76. Reserva de la Biósfera Tehuacán-
Cuicatlán, junio 1, 2013, T. Raymundo 4564, 4565 (ENCB); marzo 01, 2014, R. Valenzuela
14963 (ENCB), mayo 27, 2016, T. Raymundo 6100, 6101, (ENCB); R. Valenzuela 16601,
16605 (ENCB), P. Reyes 30 (ENCB); noviembre 24, 2016, T. Raymundo, 6343, 6344, 6345,
6346, 6347, 6348 (ENCB); R. Valenzuela 17070, 17071, 17073, 17074 (ENCB); mayo 21,
2017, J. Cuellar y D. Serrano 3 (ENCB); mayo 22, 2017, T. Raymundo6646 (ENCB), R.
Valenzuela 17270, 17271, 17273 (ENCB); abril28, 2018, A. Cobos-Villagrán970, 971, 972,
973, 974, 975 (ENCB). San Luis Potosí, municipio Guadalcazár, Carretera Cerritos-
entronque a Tula, Km 26, octubre 09, 2017, A. Cobos-Villagrán 645, 646 (ENCB), T.
Raymundo 7005(ENCB); municipio Tamasopo, Rancho El Desengaño, Torrencillas.
Carretera Cd. Valles-Río Verde Km 37-38, noviembre 04, 2017, A. Cobos-Villagrán 824,
825 (ENCB), S. Bautista-Hernández s/n (ENCB). Sonora, municipio Álamos, El Cajón,
APFF Sierra Álamos-Río Cuchujaqui, octubre 14, 2013, D. Castro-Bustos 132 (ENCB);
Rancho La Sierrita, APFF Sierra Álamos-Río Cuchujaqui, octubre 15, 2013, R. Valenzuela
15253 (ENCB), T. Raymundo 4834 (ENCB).
Hábitat. Dispersos, sobre madera en descomposición de leguminosas en el matorral xerófilo,
en regiones con clima árido y semiárido, en un gradiente altitudinal de los 342 a los 1281,
hasta 1882 msnm, y ocasiona una pudrición blanda.
40
Distribución. Chiang Rai Province, Tailandia (Thambugala, et al., 2016) e Islas Andaman,
India (Niranjan, et al., 2018). En el presente estudio se registra por primera vez para México.
Notas taxonómicas: Esta especie se caracteriza por presentar los ascomas más pequeños hasta
1.5 mm de largo, el material revisado concuerda con las descripciones previas de R.
tailandicum, descrita en Tailandia y citada en la India. (Thambugala, et al., op. cit y Niranjan,
et al., op. cit).
41
Figura 5. Rhytidhysteron thailandicum. A. Histerotecios. B. Corte transversal del histerotecio, C.
Células del peridio. D. Asca. E. Ascosporas.
42
4. Rhytidhysteron esperanzae Cobos-Villagrán A., R. Valenzuela., T. Raymundo.
Tipo. MÉXICO. Oaxaca. La Esperanza, Carretera Oaxaca-Tuxtepec Km 51. Santiago
Comaltepec, mayo 23, 2017, T. Raymundo 6579 (Holotipo: ENCB).
Figura 6.
Histerotecios de (2- ) 3.4.5 mm de largo, (1.2) 2-3 mm de ancho, (1-) 1.7-2.4 mm de alto,
naviculares, alargados, rectos o flexuosos, con los extremos agudos, verde grisáceo,
carbonosos, opaco, superficiales, solitarios, raramente gregarios, borde estriado, involutos,
con surco o hendidura longitudinal y se vuelve lenticular (cuando maduros o con la
humedad), abriendo de forma discoidal, tomando la forma apotecial de 3-4 mm de diámetro,
exponiendo el himenio (figura 6 A-B). Peridio de 60- 220 µm de grosor, adelgazándose en
la parte apical, en la parte media y la base es más gruesa, compuesto por compuesto de 2
capas de células pseudoparenquimáticas, de textura isodiamétrica o globosa-angularis, la
capa externa de color marrón oscuro a negro y la capa interna ligeramente pigmentadas a
hialinas, de 11 x 10 µm, de paredes gruesas, 3µm de grosor, carbonoso, glabro (figura 6 D).
Epitecio de color gris verdoso el cual se vuelve amarillo al reaccionar con KOH 10% (figura
6 B-C). Pseudoparáfisis de hasta 4 µm de ancho, filiformes, rectas, parte apical más
ensanchada, hialina, ramificadas, con un septo, fuertemente anastomosadas por encima de
las ascas formando el epitecio. Ascas bitunicadas (figura 6 E), de (250-) 265-270 µm (18-
) 19-20 µm, cilíndricas, ápice redondeado, hialinas, uniseriadas, octospóricas, de paredes
gruesas, con un pedicelo corto. Ascosporas de (42-) 45-47 (-49) (15-) 17-19 (-23) µm, ( =
45 17.2 µm, n=30), elipsoidales a fusiformes, redondeadas o puntiagudas en ambos
extremos, de color marrón rojizo a marrón cuando están maduras, con tres septos
transversales, cingulados, de pared gruesa y lisa (figura 6 F).
43
Material estudiado. MÉXICO, Oaxaca, Distrito de Ixtlán, municipio de Santiago
Comaltepec, La Esperanza, Carretera Oaxaca-Tuxtepec Km 51., mayo 22, 2017, R.
Valenzuela 17206 (ENCB); mayo 23, 2017, T. Raymundo 6579 ENCB), A. Cobos-Villagrán
498 (ENCB); mayo 25, 2017, E. Campero 3 (ENCB), abril 30, 2018, A. Cobos-Villagrán
1119 (ENCB), A. Gay AG30041814 (ENCB).
Hábitat. Solitario, sobre madera en descomposición de Oreomunnea mexicana en el bosque
mesófilo de montaña, a una latitud de 1600 msnm, y ocasiona una pudrición blanda.
Distribución. México (en el presente trabajo).
Notas taxonómicas: R. esperanzae, se caracteriza por presentar un epitecio de color gris
verdoso que en reacción con KOH 10% presenta una coloración verde-amarillenta, muy
diferente al que presenta R. rufulum y R. neorufulum que es violeta, presenta ascosporas
mucho más grandes de hasta 50 µm de largo, que en R. rufulum el máximo son de 30 µm y
en R. mexicanum son de 44 µm; otro aspecto importante es que se encuentra en un bosque
mesófilo de montaña sobre Oreomunnea mexicana.
44
Figura 6. Rhytidhysteron esperanzae. A-B. Histerotecios. B. Margen estriado y epitecio gris
verdoso. C. Corte transversal del histerotecio. D. Células del peridio. E. Asca. F. Ascosporas.
45
5. Rhytidhysteron mexicanum Cobos-Villagrán, A., R. Valenzuela., Calvillo-Medina,
T. Raymundo. Tipo. MÉXICO. CDMX, Sierra de Guadalupe, Cerro del Chiquihuite, Colonia
San Juan Ticomán, Ciudad de México, junio 24, 2016, R. Valenzuela 17107 (Holotipo:
ENCB). Figura 7.
Histerotecios de 2-4 mm de largo, 1.5-2.5 mm de ancho, 1.5 mm de alto, naviculares,
alargados, rectos o flexuosos cuando jóvenes, con los extremos agudos, negros, carbonosos,
errumpentes o superficiales, gregarios, raramente solitarios, borde estriado, involutos, con
surco o hendidura longitudinal conspicuo y se vuelve lenticular (cuando maduros o con la
humedad), abriendo de forma irregular a discoidal, tomando la forma apotecial, 2.5-4 mm de
diámetro, exponiendo el himenio (figura 7 A-B). Peridio de 19-38 μm de grosor en la parte
apical en la parte media de 104.5-114 μm y en parte apical más gruesa de 123-180 μm,
compuesto por células pseudoparenquimáticas de textura isoradiada prismática, de 10-15
10-14 μm, de paredes delgadas, 1.0 μm de grosor, carbonoso, glabro (figura 7 D). Epitecio
de 5.7-13.3 μm de grosor, de color amarillo limón el cual se vuelve ámbar al reaccionar con
KOH 10% (figura 7 B-C). Pseudoparáfisis de 3.0 μm hasta 3.2-4.0 μm de ancho en el
extremo apical, filamentosas, capitadas, hialinas, sin septos, ramificadas, fuertemente
anastomosadas por encima de las ascas formando el epitecio. Ascas bitunicadas, de 285-297
(-304) 16-17 μm, cilíndricas, hialinas, uniseriadas, octospóricas, de paredes gruesas, con la
base sinuosa (figura 7 E). Ascosporas de (34-) 36-40 (-44) (10-) 11-12 (-15) μm, ( = 44
13.5 μm, n=30), elipsoides a oblongas, fusiformes, ligeramente curvadas, de color marrón a
marrón rojizo, con tres septos transversales, cingulados de pared gruesa y lisa (figura 7 F).
46
Material estudiado. Paratipo: Estado de México. Parque estatal Sierra de Guadalupe,
Coacalco de Berriozábal, julio 30, 2011, I. Álvarez 183 (ENCB); agosto 28, 2011, I. Álvarez
210, 314a (ENCB); junio 24, 2016, R. Valenzuela 17107 (ENCB).
Hábitat. Esta especie crece gregaria sobre madera de angiospermas no determinada y en
descomposición en bosque de Quercus a una altitud de 2415 a 2975 msnm, ocasionando una
pudrición blanda.
Distribución. México (en el presente trabajo).
Notas taxonómicas: R. mexicanum, se caracteriza por presentar la típica forma histerioide
cuando es joven y al madurar llega a ser apotecioide y permanecer así incluso al deshidratar,
el epitecio es verdoso y al reaccionar con hidróxido de potasio 5% cambia a amarillo dorado
una especie similar es R. rufulum del cual se diferencia fácilmente por el color del rojo a
naranja del epitecio que cambia a coloración violeta al reaccionar con hidróxido de potasio
5% y el tamaño de las ascosporas en el primero son de 22.4-30.4 × 8-9.6 μm, mientras que,
en el segundo son de 34-44 × 10-15 μm.
47
Figura 7. Rhytidhysteron mexicanum. A-B. Histerotecios. B. Margen estriado y epitecio amarillo
limón. C. Corte transversal del histerotecio con KOH 10%. D. Células del peridio. E. Ascas. F.
Ascosporas.
48
6. Rhytidhysteron mesophilum Cobos-Villagrán, A., R. Valenzuela. y T. Raymundo.
Tipo. MÉXICO. Municipio Molango de Escamilla, Laguna Atezca, junio 01, 2018. A. Trejo
74 (Holotipo: ENCB). Figura 8.
Histerotecios de (2.5-) 2.7-3.5 (-4.2) mm de largo, 1.0-1.5 (-1.9) mm de ancho, 1.4-1.75 mm
de alto, naviculares, en algunos con una constricción por el centro dando la apariencia de
estar segmentado, alargados, rectos o flexuosos cuando jóvenes, con los extremos agudos,
negros, carbonosos, superficiales, gregarios, borde estriado, con surco o hendidura
longitudinal y cuando maduros o con la humedad abren de forma linear pero no forman
apotecios, sin embargo, si exponen el himenio (figura 8 A-B). Peridio de 62.5-75 µm de
grosor, en la parte media ensanchándose más (112.5-125 µm), compuesto por dos capas de
células pseudoparenquimáticas de textura isoradiada o primática, la capa más externa es de
color negro con verde amarillento y la interna hialina (figura 8 D). Epitecio de color naranja
intenso en reacción KOH10% cambia a púrpura tornándose más claro después de unos
minutos Pseudoparáfisis de 2.0-2.5 μm hasta 3.0 μm de ancho, filamentosas, capitadas,
hialinas, ramificadas hacia el ápice, fuertemente anastomosadas por encima de las ascas
formando el epitecio. Ascas bitúnicadas de 267-282 x 15.5-16 µm, cilíndricas, hialinas,
uniseriadas, octospóricas, con la base sinuosa (figura 8 E). Ascosporas de (38-) 40-44 (-46)
12-14 µm, ( = 44.2 13.6, n=30), elipsoides a oblongas, marrón claras, con tres septos
transversales, cingulados, de pared gruesa y lisa (figura 8 F).
Material estudiado. Paratipo: MÉXICO, Hidalgo, municipio Molango de Escamilla, Laguna
Atezca, junio 01, 2018. C. Herrera 40 (ENCB), A. Cobos-Villagrán 1800.
49
Hábitat. Esta especie crece gregaria sobre madera en descomposición en el bosque mesófilo
de montaña, a una altitud de 1281 msnm, y ocasiona una pudrición blanda.
Distribución. México (en el presente trabajo).
Notas taxonómicas: Esta especie se caracteriza por presentar histerotecio de color verde
amarillento, podría confundirse con R. esperanzae, por encontrarse en bosques mesófilos y
ascosporas; sin embargo, se distingue por el color del epitecio, en el primero es naranja y en
el segundo es grisáceo-verde oliva y el hospedero es diferente. También tiene afinidad a R.
columbiense al presentar un borde amarillento y el largo de las ascosporas de 38-43.5 (-52)
µm coincide, pero el epitecio es de distinto color, ascas mucho mayores y ascosporas menos
anchas 13-14.7 (-18) µm.
50
Figura 8. Rhytidhysteron mesophilum. A-B. Histerotecios. B. Margen estriado y epitecio naranja
intenso.C. Corte transversal del histerotecio. D. Células del peridio. E. Asca. F. Ascosporas.
51
7. Rhytidhysteron cozumelensis Cobos-Villagrán, A., R. Valenzuela y T. Raymundo.
Tipo. MÉXICO. Quintana Roo, municipio Cozumel, Zona arqueológica San Gervasio Chen-
tuk, enero 21, 2018, A. Cobos-Villagrán 1842 (Holotipo: ENCB). Figura 9.
Histerotecios de 2.5-7-3.5 (-4.2) mm de largo, 1.1-1.5 (-1.9) mm de ancho, (0. 8-) 1.0-1.9
mm de alto, naviculares o subglobosos, comprimidos en el ápice, negros, carbonosos,
errumpentes, solitarios, borde estriado, aunque no muy marcado, involutos, con surco o
hendidura longitudinal irregular, sin embargo, no forman la abertura lenticular (forma
apotecial) en la madurez o con humedad, pero abren de forma linear exponiendo el himenio
(figura 9 A-B). Peridio de 45-100 μm de grosor, en la parte basal más ancha, compuesto por
células pseudoparenquimáticas (figura 9 D), textura isoradiada o primática. Epitecio rojo o
completamente negro (figura 9 B), el cual cambia a color morado poco intenso al reaccionar
con KOH 10%. Pseudoparáfisis de 2.5 µm de ancho, filamentosas, hialinas, septadas,
fuertemente anastomosadas, formando el epitecio. Ascas bitunicadas (figura 9 E), de 182-
191 12-13 μm, cilíndricas, redondeadas en el ápice, hialinas, uniseriadas, octospóricas.
Ascosporas de 26-29 (-31) 9-11 (-13) μm, ( = 28 10.2 μm, n=30), elipsoidales a
fusiformes, redondeadas en ambos extremos, de color marrón oscuro, con tres septos
transversales, cingulados, de pared gruesa y lisa (figura 9 F).
Material estudiado. Paratipo: MÉXICO, Quintana Roo, municipio Cozumel, Zona
arqueológica San Gervasio Chen-tuk, enero 21, 2018, T. Raymundo 7321 (ENCB), A.
Cobos-Villagrán 921(ENCB), R. Valenzuela 17985; junio 17, 2018, A. Cobos-Villagrán
1838,1842 (ENCB).
52
Hábitat. Esta especie crece solitaria sobre madera en descomposición de enredaderas (muy
abundantes en el área de colecta) en el bosque subperennifolio a nivel del mar, y ocasiona
una pudrición blanda.
Distribución. México (en el presente trabajo).
Notas taxonómicas: Se distingue de R. rufulum al tener una vegetación completamente
diferente a la reportada para esta especie, ya que esta se en una vegetación subperennifolia.
El tamaño del histerotecio de 1.3-2.5, es más largo que en R. rufulum, pared con estrías,
aunque no muy marcadas como se aprecian en R. rufulum. En la filogenia (Fig.3), se agrupa
al clado III definido por Murillo y colaboradores para Costa Rica, morfológicamente coincide
en el largo de las ascosporas (25.8-) 29.1-30.3 (-31.7) µm.
53
Figura 9. Rhytidhysteron cozumelensis. A-B. Histerotecios. B. Margen estriado y epitecio negro.
Corte transversal del histerotecio con KOH 10%. D. Células del peridio. E. Asca. F. Ascosporas.
54
8. Rhytidhysteron neohysterinum Cobos-Villagrán, A., R. Valenzuela y T.
Raymundo. Tipo. MÉXICO. San Luis Potosí, municipio Guadalcazár, Carretera 75-D, San
Luis-Cd. Valles Km. 98, noviembre 02, 2017, A. Cobos-Villagrán 772 (Holotipo: ENCB).
Figura 10.
Histerotecios de (1.5-) 1.9-2.3 (-2.5) mm de largo, (0.7-) 1.0-1.6 (-2.2)mm de ancho, (0.7-)
0.9-1.1 mm de alto, naviculares, rectos o flexuosos cuando jóvenes, con los extremos agudos,
negros, carbonosos, superficiales, solitarios, dispersos raramente gregarios, borde estriado
con estrías muy separadas entre sí (anchas), con surco o hendidura longitudinal y se vuelve
lenticular (cuando maduros o con la humedad), abriendo de forma irregular, raramente abre
de forma apotecial, exponiendo el himenio (figura 10 A-B). Peridio de un grosor regular de
µm, de paredes delgadas, 1 µm de grosor, de color marrón a negro, compuesto por células
pseudoparenquimáticas de textura isoradiada o prismáticas, carbonoso (figura 10 D).
Epitecio naranja en reacción con KOH 10% cambia a morado. Pseudoparáfisis de µm de
ancho, filamentosas, densas, capitadas, hialinas, septadas, fuertemente anastomosadas por
encima de las ascas formando el epitecio. Ascas bitunicadas (figura 10 E), de 160-185 µm,
clavadas a cilíndricas, hialinas, uniseriadas, octospóricas. Ascosporas de (23-) 24.8-29 (-31)
(8.5-) 8.8-10 (-11.2) µm ( = 26.6 9.4 µm, n=30), elipsoides ambos extremos
redondeados, de color pardo a marrón claro, con un septo transversal, de pared gruesa y lisa
(figura 10 F).
Material estudiado. San Luis Potosí, municipio Guadalcazár, Carretera 75-D, San Luis-Cd.
Valles Km. 98, noviembre 02, 2017, A. Cobos-Villagrán 773, 775, 776, 777 (ENCB);
55
municipio Tamasopo, Potrero del Hotel Real Kímera. Ejido Los Cafetales, noviembre 03,
2017, A. Cobos-Villagrán 786 (ENCB).
Hábitat. Dispersos, sobre madera en descomposición de leguminosas en el bosque tropical
caducifolio y matorral xerófilo.
Distribución. México (en el presente trabajo).
Notas taxonómicas: R. neohysterinum se caracteriza por presentar un solo septo transversal
en las ascosporas, lo que lo diferencia de todas las especies de Rhytidhysteron que tienen tres
septos transversales. Una especie afín por el tamaño de las ascosporas es R. hysterinum,
aunque estas son ligeramente mayores de 22-32 x 10-16 (Sierra-López, 2006), en
comparación con R. neohysterinum (23-29 x 8.5-10), pero se separa por la forma y color de
estas; además de la distribución, ya que R. hysterinum sólo se ha descrito de Europa y su
distribución se limita a la península Ibérica y Francia, asimismo Samuels y Müller (1979),
mencionan que esta especie se desarrolla sobre madera de Buxus spp., menos frecuente sobre
Ilex sp., Diospyros sp. o Prosopis sp; y Sierra-López (2006) y Tello-Mora (2013) la citan
sobre Buxus sempervirens, especie que no se distribuye de manera natural en el continente
americano y mucho menos en México.
56
Figura 10. Rhytidhysteron neohysterinum. A-B. Histerotecios. B. Margen estriado y epitecio naranja.
Corte transversal del histerotecio. D. Células del peridio. E. Asca. F. Ascosporas.
57
9. Rhytidhysteron sonorensis. Cobos-Villagrán, A., R. Valenzuela y T.
Raymundo. Tipo. MÉXICO. Sonora, San Javier, Carretera Yecora - La Colorada Km. 135.
Octubre 3, 2016. T. Raymundo 6333 (Holotipo: ENCB). Figura 11.
Histerotecios de 1.3-2.3 mm de largo, 0.8-1.0 mm de ancho, 0.4-0.5 (-1.0) mm de alto,
alargados a elipsoides, oblongos o subglobosos, rectos o ligeramente flexuosos, con los
extremos redondeados rara vez agudos, negros, carbonosos, errumpentes a superficiales,
gregarios, bordes sin estrías, con surco o hendidura longitudinal profunda, cuando maduros
o con la humedad, abre de forma irregular, exponiendo el himenio, pero nunca toma la forma
apotecial (figura 11 A-B). Peridio de un grosor regular de µm, de paredes delgadas, 1 µm de
grosor, de color marrón a negro, compuesto por células pseudoparenquimáticas de textura
isodiamétrica o globosa-angularis, carbonoso (figura 11 D). Epitecio de color naranja oscuro
a rojo, en reacción con KOH 10% cambia a (figura 11 B). Ascas bitúnicadas, de 89 - 105(-
121) x 11-12 μm, clavadas, anchas, hialinas, uniseriadas, octospóricas, con pedicelos cortos
(figura 11 E). Ascosporas (15-) 16-18 7-8 µm ( = 16.5 7.1 µm, n=30), elipsoidales a
obovoides, extremos obtusos, verde-oliváceos, con 3-4 septos transversales y de 1-2 septos
longitudinales, generalmente con un tabique longitudinal en las células intermedias,
constreñidos en el segundo o tercer tabique, ligeramente constreñidos en los tabiques
medianos, asimétricas, de paredes gruesas y lisas (figura 11 F).
Material examinado: MÉXICO. Sonora, San Javier, Carretera Yecora - La Colorada Km.
135. Octubre 3, 2016. T. Raymundo 6335 y 6338. R. Valenzuela 16954, 16955 y 16957.
Hábitat: Saprobio sobre madera de planta no identificada.
58
Distribución. Distribución. México (en el presente trabajo).
Notas taxonómicas: R. sonorensis se distingue por presentar esporas tipo didimosporas, es
decir que tiene de tres a cuatro septos transversales y de uno a dos septos longitudinales. Una
especie afín es R. opuntiae, por el tipo de espora, sin embargo, las ascosporas son más
grandes 27 13 μm (Brown, 1953) y 20–25 7.5-10 μm (Almeida et al., 2014), contra (15-
) 16-18 7-8 µm); otra característica que los diferencia es el hospedero sobre el que se
encuentra, ya que lo reportan sobre Opuntia fulgida de acuerdo con Brown (1953) y en
nuestro caso no se logró determinar al hospedero.
VII.3. Filogenia
Se realizaron sesenta extracciones de ADN, de las cuales se obtuvieron treinta y seis
secuencias y de estas secuencias se utilizaron veinticuatro para los análisis filogenéticos
(Anexo VI). Se obtuvo una filogenia con las secuencias del anexo VI, mediante el método
bayesiano con el programa Mr. Bayes v3.2 (Figura 12) se ocuparon como grupos externos a
Hysterobrevium mori, y Gloniopsis praelonga (Hysteriaceae).
59
Figura 11. Rhytidhysteron sonorensis. A-B. Histerotecios. B. Epitecio rojizo-naranja. C. Corte
transversal del histerotecio. D. Células del peridio. E. Asca. F. Ascosporas.
a
b
60
Figura 12. Análisis Bayesiano de los representantes de Rhytidhysteron y como grupo externo
Hysterobrevium mori. En los nodos se indican los valores de probabilidad posterior
Bayesiana.
R. thailandicum
R. cozumelensis
R. rufulum
R. mexicanum
R. rufulum
R. neorufulum
R. mesophilum
A
C
D
E
R. esperanzae
R. rufulum*
F
B
61
VII.4. Distribución de las especies de Rhytidhysteron
Del total de los especímenes recolectados en este estudio 237 (54.99%) y de la
revisión de Herbario 194 (45.01%), se tiene un total de 431 ejemplares, los cuales se localizan
en nueve de las 17 provincias florísticas de acuerdo con Rzedowski (2006). De tal manera
que la Costa pacífica es la mejor representada con 134 ejemplares equivalentes al 31%,
seguidas por la Sierra Madre Oriental con 82 ejemplares (19%), la Provincia Altiplanicie con
58 ejemplares (13%), y la Costa del Golfo de México con 40 ejemplares, equivalentes al 9%
(Figura 13).
Figura 13. Número de ejemplares de Rhytidhysteron por provincias florísticas de acuerdo con
Rzedowski 2006.
c
Altiplanicie
13%
Costa del Golfo de
México
9%
Costa Pacífica
31%Depresión del
Balsas
1%
Península de
Yucatán
8%
Planicie Costera
del Noroeste
5%
Serranías
Meridionales
7%
Sierra Madre
Oriental
19%
Valle de
Tehuacán-
Cuicatlán
7%
NÚMERO DE EJEMPLARES POR PROVINCIAS
FLORÍSTICAS DE MÉXICO
62
En la figura 14 se muestra un mapa con la distribución de las especies de Rhytidhysteron,
donde observamos que R. rufulum es la especie más abundante con 240 ejemplares y con la
distribución más amplia; encontrándose en ocho de las 17 provincias: Altiplanicie (51
ejemplares), Costa del Golfo de México (20 ejemplares), Costa pacífica (70 ejemplares),
Depresión del Balsas (1 ejemplar), Península de Yucatán (15 ejemplares), Planicie Costera
del Noreste (15 ejemplares), Serranías Meridionales (15 ejemplares) y Sierra Madre Oriental
(46 ejemplares). Seguidas de R. neorufulum con 99 ejemplares, que se distribuye en cinco
provincias: tanto en la Costa pacífica (53 ejemplares), como en la Costa del Golfo de México
(10 ejemplares), Península de Yucatán (16 ejemplares), Serranías Meridionales (3
ejemplares), y Sierra Madre Oriental (17 ejemplares). Y R. thailandicum, con 54 ejemplares,
que se distribuye en la Altiplanicie (3 ejemplares), Costa del Golfo de México (10
ejemplares), Costa Pacífica (3 ejemplares), Depresión del Balsas (1 ejemplar), Sierra Madre
Oriental (6) y Valle de Tehuacán–Cuicatlán (31 ejemplares).
Las especies nuevas tienen una distribución mucho menor, restringidas únicamente a la
localidad tipo, así R. esperanzae y R. mexicanum sólo se distribuyen en las Serranías
Meridionales con seis y cuatro ejemplares, respectivamente. R. mesophilum se localiza en la
Sierra Madre Oriental con tres ejemplares y R. cozumelensis en la Península de Yucatán, de
igual manera con tres ejemplares. R. sonorensis se restringe a la Planicie Costera del Noroeste
con seis ejemplares y R. neohysterinum sólo se localiza en la Altiplanicie (4 ejemplares) y la
Sierra Madre Oriental (1 ejemplar).
63
Figura 14. Distribución de las especies del género Rhytidhysteron en la República Mexicana.
64
Cuadro5. Principales hospederos de Rhytidhysteron
Tipo de vegetación: bosque tropical caducifolio (BTC), bosque mesófilo de montaña (BMM), matorral xerófilo (MX), bosque tropical subcaducifolio
(BTSC).
Especie Espécimen Hospedero Familia Región fisiográfica Tipo de
vegetación
Rhytidhysteron neorufulum
R. Valenzuela 16717-16719, 16729,
16729, 16732, 16747.
A. Camargo s/n
Bursera sp. Burseraceae Costa Pacífica BTC
Rhytidhysteron rufulum A. Cobos-Villagrán 688-692, 695-
697. Acacia sp. Fabaceae Altiplanicie MX
Rhytidhysteron rufulum A. Cobos-Villagrán 2069, 2070,
2087 Acacia cochliacantha Fabaceae Costa Pacífica MX
Rhytidhysteron rufulum A. Cobos-Villagrán 682, 685, 686 Bougainvillea glabra Nyctaginaceae Altiplanicie MX
Rhytidhysteron rufulum
A. Cobos-Villagrán 715, 718, 732,
751, 752.
T. Raymundo 7029.
Celtis pallida Cannabaceae Altiplanicie MX
Rhytidhysteron rufulum A. Cobos-Villagrán 741, 750, 757,
762. Helietta parvifolia Rutaceae Altiplanicie MX, BTC
Rhytidhysteron thailandicum A. Cobos-Villagrán 645, 646.
T. Raymundo 7005. Helietta parvifolia Rutaceae Altiplanicie MX
Rhytidhysteron thailandicum
A. Cobos-Villagrán 970-975.
J. Cuellar y D. Serrano 3.
P. Reyes 30.
T. Raymundo 4564, 4565, 6100,
6101, 6343-6348, 6646.
R. Valenzuela 16601, 16605,
17070-17074, 17270-17273.
Acacia sp. Fabaceae Valle de Tehuacán-Cuicatlán BTC
Rhytidhysteron thailandicum A. Cobos-Villagrán 824, 825.
S. Bautista-Hernández s/n Ehretia anacua Boraginaceae Mesoamericana de Montaña BTC
Rhytidhysteron esperanzae
A. Cobos-Villagrán 498, 1119.
Campero E. 3,
A. Gay AG30041814.
T. Raymundo 6579.
R. Valenzuela 17206.
Oreomunnea
mexicana Juglandaceae Mesoamericana de Montaña BMM
65
VIII. DISCUSIÓN
VIII.1 Taxonomía
Los caracteres morfológicos con mayor peso taxonómico para diferenciar a las
especies de Rhytidhysteron son el tamaño de los histerotecios, la reacción del epitecio en
KOH al 10%, la textura del peridio y el tamaño de las ascosporas. De tal manera que con
respecto al tamaño del histerotecio, R. esperanzae presentó los de mayor longitud y ancho,
hasta 4.5 mm, y 3.0 mm, respectivamente; en comparación con los de R. thailandicum que
son los más pequeños con apenas 1.9 mm, aunque R. mexicanum y R. mesophilum también
presentan ascomas grandes, la media de estas dos especies oscila entre 3.5 y 3.7 mm. En
cuanto a la reacción del KOH al 10%, en algunos casos fue resolutiva, ya que es una
característica única de la especie, como podemos observar en el caso de R. esperanzae y R.
mexicanum; sin embargo, en la mayoría de los casos no fue así, ya que R. neorufulum, R.
rufulum, R. thailandicum, R. neohysterinum las coloraciones son muy parecidas del rojo o
anaranjado al violeta, morado o púrpura, tal vez lo que cambia es el tiempo de reacción, ya
que en unas suele ser muy rápida y el color se “desprende” volviéndose hialino
completamente, mientras que en otros la reacción perdura. En cuanto a la textura del peridio
se diferencian dos tipos: isodiamétrica o globulosa-angularis e isoradiada o prismáticas, del
primer tipo están presentes en R. neorufulum, R. rufulum, R. thailandicum, R. esperanzae,
Rhytidhysteron sonorensis y del segundo R. cozumelensis, R. mesophilum, R. mexicanum, y
R. neohysterinum. Cabe mencionar que este carácter solo ha sido estudiado en la familia
Patellariaceae por Yachaeron et al., 2015, sin embargo, al tener la misma composición del
peridio (o excípulo) en Hysteriaceae se utilizó como un carácter de importancia taxonómica
en este género.
66
Respecto al tamaño de las ascosporas podemos apreciar las diferencias en las medias (que
se obtuvieron del promedio de 30 medidas diferentes de ascosporas maduras), ya que los
intervalos de tamaño siguen siendo un problema debido al solapamiento de estas medidas.
Las ascosporas más grandes son de R. esperanzae, de 45 17.2, seguidas de R. mesophilum,
de 44.2 13.6 y R. mexicanum, de 43.7 13.5 µm, mientras que las más son de R. sonorensis,
16.5 7.1. A pesar de que los tamaños son muy parecidos en el largo también hay diferencias
en cuanto al ancho y la forma que tienen estas.
VIII.2 Filogenia
En la filogenia obtenida del género Rhytidhysteron se observa que este género es
monofilético y pertenece a la familia Hysteriaceae, tal y como lo sugieren Boehm et al.,
(2009a, b), Schoch et al., (2009), Hyde et al. (2013), Almeida et al. (2014), y Wijayawardene
et al., (2014). En este análisis se formaron seis clados (A-F), en comparación con la filogenia
obtenida por Murillo et al., (2009) con cuatro clados (I-IV) y los cuatro clados (A-D)
derivados de la filogenia de Thambugala et al., (2016), cabe señalar que Murillo et al., (2009)
solo utilizaron el marcador ITS del mismo modo que en nuestro análisis; y Thambugala et
al., (2016) además del ITS emplearon una combinación con otros marcadores moleculares
(LSU, SSU y EF1-α).
En el Clado A, se agrupan los aislados R14, R22, R37, R10, R35, R27, R8, R26 y R4 con
una probabilidad posterior bayesiana de 0.73 a 1 y corresponden a Rhytidhysteron
thailandicum especie con los histerotecios más pequeños de 1.0 a 1.5 mm de longitud y
perdido surcado, con distribución en matorral xerófilo de la Reserva de la Biosfera Cuicatlán,
67
Altiplanicie de San Luis Potosí y Sierra de Picachos en Nuevo León; en la planicie costera
del pacífico, Sonora y la Sierra Madre Oriental en Tamaulipas.
En el clado B, se agrupan los aislados del clado III (reportado por Murillo et al., 2009), que
corresponden a hongos con epitecio ámbar-marrón, ascosporas de (25.8) 29.1-30.3 (31.7)
µm, lo que concuerda con la descripción de R. cozumelensis (R13), dichos especímenes se
caracterizan por formar histerotecios de 1.3-2.5 0.5-1.8 mm y ascosporas de (26) 27-29
(31) 9-11 (13) µm, en este trabajo se reconoce como una entidad no descrita por lo que se
le asignará un nuevo epíteto, su distribución es restringida a bosque tropical subperennifolio
en la Península de Yucatán.
El clado C se segrega del clado anterior con una probabilidad posterior bayesiana de 1, dando
paso a dos ramas: R29 y R6 que se separan entre sí con una probabilidad posterior bayesiana
de 1, lo cual nos indica que se trata de la misma especie pero diferente a R. cozumelensis y
R. rufulum; denominada R. mexicanum, que se confirma con la morfología que presenta esta
especie, ya que posee esporas más grandes de (34) 36-40(44) (10) 11-12 (15) µm (que las
reportadas para R. rufulum), color del epitecio amarillo limón que en reacción con KOH 10%
cambia a color ámbar y se encuentra en un bosque de Quercus en la Sierra de Guadalupe,
Estado de México, vegetación no citada para R. rufulum.
Dentro del clado D se agrupan 3 subclados, el primero de ellos corresponde al clado II de
Murillo et al.(2009), y por otro lado se agrupan las especies de R. rufulum de Tailandia y en
una sola rama R3, la cual corresponde a R. esperanzae, la cual se diferencia por tener un
epitecio de color ocre que en reacción con KOH 10% presenta una coloración verde-
amarillenta, muy diferente al que presenta R. rufulum y R. neorufulum que es violeta,
ascosporas mucho más grandes de hasta 50 μm de largo (en R. rufulum el máximo son de 30
68
μm y en R. esperanzae son de 44 μm), se distribuye en el bosque mesófilo de montaña sobre
Oreomunnea mexicana en Sierra Norte, Oaxaca.
En el clado E se agrupan los aislados R15, R7, R62, R61, R18 y R16, que corresponden a R.
neorufulum, en este mismo clado también se agrupan secuencias del clado I (reportado por
Murillo et al., 2009), lo cual podría indicar que se tratan de la misma especie, el carácter
diagnóstico de esta especie es tener el margen del histerotecio liso y ascosporas de (28) 30-
33 (36) (9) 10-11 (12). Distribuyéndose en los bosques tropicales caducifolios a nivel de
mar en la Costa Pacífica, en los estados de Sonora, Nayarit, Jalisco, y Colima; y del Golfo
de México en Tabasco; la Península de Yucatán en Quintana Roo; y también en la Sierra
Madre Oriental (Tamaulipas).
Por ultimo en el clado F en una sola rama del aislado R25, el cual no se agrupó con ninguno
de los anteriores clados, con una probabilidad posterior bayesiana de 0.81, lo cual nos indica
que se trata de una especie nueva R. mesophilum, que se confirma con los datos morfológicos:
histerotecio de color verde amarillento, epitecio naranja y ascosporas de (38)40-44 (46) 12-
14 µm, creciendo en el bosque mesófilo de montaña de Molango, Hidalgo, en la Sierra Madre
Oriental.
Thambugala et al., (2016) mencionan que algunos estudios (Boehm et al., 2009b; Murillo et
al., 2009; Yacharoen et al., 2015) han señalado las variaciones morfológicas y filogenéticas
de las diferentes colecciones moleculares (secuencias) de Rhytidhysteron, de manera que las
colecciones similares a R. rufulum de otros países pueden contener nuevas especies. En
Tailandia se describieron dos nuevas especies basadas en sus colecciones de Rhytidhysteron,
mientras que, Murillo et al., (2009) reportan que el complejo de R. rufulum en Costa Rica se
69
divide en cuatro clados distintos. De modo que de la colección de secuencias de
Rhytidhysteron obtenidas en México, se obtuvieron cuatro nuevas especies.
VIII.4. Distribución
La distribución del género Rhytidhysteron se concentra en ecosistemas tropicales y
secos en la región neotropical de México, de tal manera que, R. rufulum y R. neorufulum con
el 81.75 % de los especímenes se localizó en bosque tropical caducifolio, uno de los
principales tipos de vegetación en nuestro país, abarcando cerca del 8% de la superficie de la
República, y desarrollándose entre 0 y 1 900 msnm de altitud (Rzedowski, 2006), lo cual
coincide con Samuels y Müller (1979) y Thambugala et al., (2016), que R. rufulum se
distribuye en zonas tropicales. Cabe señalar que R. rufulum es una especie generalista, capaz
de utilizar diferentes sustratos (Murillo et al., 2009), lo cual podría explicar la amplia
distribución de esta especie.
R. thailandicum se distribuye en matorral xerófilo considerando que este ecosistema ocupa
aproximadamente el 40% de la superficie del país y por consiguiente es el más vasto de los
tipos de vegetación de México (Rzedowski 2006), en la mayoría de los casos se encontró
sobre Fabáceas.
R. esperanzae y R. mesophilum, se distribuyen en el bosque mesófilo de montaña, vegetación
que se estima cubre el 0.5 % del territorio mexicano, el límite altitudinal inferior es de 600
m hasta los 1000 m, llegando hasta 2700, enclavados en la Sierra Madre Oriental y Serranías
Meridionales (Rzedowski, 2006).
R. mexicanum. Los Bosques de Quercus o encinares son comunidades vegetales muy
características de las zonas montañosas de México, Rzedowski (2006) indica que se
encuentran desde el nivel del mar hasta los 3100 msnm, aunque en su mayoría se haya en
70
altitudes entre los 1200 y 2800 m. Se desarrollan en climas templados lo cual podría indicar
por qué Rhytidhysteron es poco frecuentes en este tipo de vegetación, tal y como lo señala
Murillo et al., (2009).
R. cozumelensis. El bosque subperennifolio, se desarrolla entre los 0 y 1000 msnm y es uno
de los tipos de vegetación más exuberantes que existen en la Tierra. (Rzedowski 2006).
71
IX. CONCLUSIONES
Se determinaron nueve especies de Rhytidhysteron: dos nuevos registros para el país
(R. neorufulum y R. thailandicum); cuatro nuevas especies para la ciencia (R.
cozumelensis, R. esperanzae, R. mesophilum y R. mexicanum.
Los caracteres morfológicos con mayor peso taxonómico para diferenciar a las
especies de Rhytidhysteron son: tamaño de los histerotecios, la reacción del epitecio
en KOH al 10%, textura del peridio y talla de las ascosporas.
El análisis de los caracteres morfológicos y moleculares de Rhytidhysteron comprobó
que en México se presenta una alta diversidad de especies de este género.
El análisis filogenético obtenido sustenta que el género Rhytidhysteron es
monofilético y se obtuvieron seis clados (A-F) bien soportados.
Rhytidhysteron rufulum es una especie abundante con amplia distribución en bosque
tropical caducifolio y matorral xerófilo de México, se ubica en toda la región
neotropical, principalmente en la Planicie Costera del Pacífico.
La mayoría de las especies de Rhytidhysteron en México tienen una distribución en
ecosistemas tropicales y secos, en un gradiente altitudinal de los 0 a los 1600 msnm.
En el bosque tropical caducifolio se localizó el 50% de las especies de Rhytidhysteron
lo que podría indicar que en este tipo de vegetación es donde mejor se ha adaptado el
grupo.
La mayoría de los especímenes se encontraron sobre ramas de árboles recién muertos
o en descomposición principalmente en géneros de la familia Fabaceae.
México es el país con mayor diversidad de especies del género Rhytidhysteron con
nueve especies, seguidos de Tailandia e India con cinco especies cada uno.
72
X. LITERATURA CITADA
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XI. ANEXOS
Anexo I. Preparaciones con Alcohol etílico 70% e Hidróxido de Potasio 5 %.
Reactivos:
Alcohol etílico 70%
Alcohol etílico………700 mL
Agua destilada………300 mL
Hidróxido de potasio 10 %
Hidróxido de potasio…… 23.3g
Agua destilada……………250 mL
Elaboración de las preparaciones:
1. Observando bajo el microscopio estereoscópico, se miden los histerotecios (largo, ancho
y alto), posteriormente se hace un corte transversal de los histerotecios.
2. El corte se coloca en un portaobjetos y se añade una gota de Alcohol etílico 70%, se
hidratar durante un minuto.
3. Se añade una gota de hidróxido de potasio 5%.
4. Se observa bajo el microscopio óptico con el objetivo de 10x, para localizar los
histerotecios, en 40x las ascas y pseudoparáfisis; y en 100x con aceite de inmersión, las
ascosporas.
5. Con la reglilla del microscopio se medirán:
Ascas (largo y ancho)
Ascosporas (largo, ancho)
6. Se determinará el color de las esporas
81
Anexo II. Protocolo de Extracción con CTAB (Doyle y Doyle 1987).
PRECALENTAMIENTO DEL amortiguador CTAB.
1. Antes de iniciar la extracción se debe de preparar el buffer, adicionando: PVP-40 y
amortiguador:
CTAB PVP-40
0.5 ml 0.02g
5.0 ml 0.20g
20.0m1 0.80g
2. El buffer CTAB + PVP-40 se calienta a 65 °C en un baño María, manteniendo la
temperatura del amortiguador hasta la extracción.
EXTRACCIÓN DE ADN.
3. Se pesa de 20-30 mg de histerotecios (previamente deshidratados en sílica gel); se colocan
en un mortero y se agrega nitrógeno líquido.
4. Cuando el nitrógeno se evapora, triturar la muestra con ayuda de un pistilo hasta obtener
un polvo fino.
5. Se agrega 1000 µL del amortiguador CTAB precalentado (CTAB+ PVP-40).
6. La muestra con el amortiguador CTAB se homogeniza con el mismo pistilo, y con una
micropipeta se transfiere a un tubo Eppendorf de 1.5 mL.
7. La muestra se incuba a 65 °C durante 3 h.
8. La muestra se retira de la incubadora y se adiciona 500 µL, de Cloroformo-alcohol
isoamílico 24:1. Se mezclan por inversión con las manos hasta formar una emulsión y dejar
reposar durante 30 min.
9. Centrifugar por 10 min a 13 000 rpm.
10. Recuperar la fase acuosa y colocarla en un nuevo tubo Eppendorf estéril de 1.5 µL.
11. Adicionar 500 µL de isopropanol frío.
12. Mezclar bien y dejar en el congelador (-20°C) durante 12 h.
13. Centrifugar por 10 min a 13000 rpm.
14. Desechar el líquido, sin tocar o perder el pellet que se forma en el fondo del tubo.
15. Adicionar 500 µL de etanol 70 % frío e invertir el tubo varias veces.
82
16. Centrifugar por 10 min a 13,000 rpm.
17. Adicionar 500 µL de etanol 70 % frío e invertir el tubo varias veces.
18. Centrifugar por 10 min a 13,000 rpm.
19. Desechar el líquido sin perder el pellet y secar el pellet en una centrifugadora al vacío
durante 10-15 min.
20. Resuspender el DNA con 50 µL de amortiguador TE.
Anexo III. Ejemplo de visualización de ADN en un gel de agarosa al 1%.
R1 R2 R3 R4a R4b R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11
83
Anexo IV. Protocolo de purificación con el Kit DNA Clean & Concentrator TM- 5
1. En un tubo Eppendorf de 1.5 ml, adicionar de 2-7 volúmenes de amortiguador “binding”
a cada volumen de muestra de ADN (ver tabla de abajo). Mezclar brevemente por Vortex.
Aplicación Amortiguador “Binding”:
Muestra Ejemplo
ADN genómico (> 2 kb) 2:1 200 µL: 100 µL
Producto de PCR 5:1 500 µL: 100 µL
2. Transferir la mezcla a una columna ZYMO-SpinTMen un tubo colector.
3. Centrifugar por 30 seg a 13,000 rpm.
4. Añadir 200 µL de DNA Wash Buffer a la columna. Centrifugar por 30 seg a 13,000 rpm.
Repetir el paso del lavado.
5. Adiccionar ≥ 6 µL DNA amortiguador de elución directamente a la columna e incubara
temperatura ambiente durante un minuto
Transferir la columna a un tubo Eppendorf de 1.5 mL y centrifugar por 30 seg. Retirar la
columna.
84
Anexo V. Base de datos del género Rhytidhysteron
Phylum Clase Orden Familia GéneroEpiteto
específico Estado Localidad
Municipi
o
Región
FisiográficaRegiones
Tipo de
VegetaciónColector
Núemro de
colectaFecha Altitud LN LW
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Reserva de la Biósfera CalakmulCalakmul Costa del Golfo de MéxicoCaribea BTP T. Raymundo 3646 Diciembre 4, 2010239 18°06'52.30" -89°48'30.76"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronneorufulum Campeche Reserva de la Biósfera CalakmulCalakmul Costa del Golfo de MéxicoCaribea BTP T. Raymundo 3622 Diciembre 4, 2010239 18°06'52.30" -89°48'30.76"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronneorufulum Campeche Reserva de la Biósfera CalakmulCalakmul Costa del Golfo de MéxicoCaribea BTP R. Valenzuela 14153 Diciembre 4, 2010239 18°06'52.30" -89°48'30.76"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronneorufulum Campeche Reserva de la Biósfera CalakmulCalakmul Costa del Golfo de MéxicoCaribea BTP R. Valenzuela 14153a Diciembre 4, 2010239 18°06'52.30" -89°48'30.76"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronneorufulum Campeche Reserva de la Biósfera CalakmulCalakmul Costa del Golfo de MéxicoCaribea BTP T. Raymundo s/n Diciembre 4, 2010239 18°06'52.30" -89°48'30.76"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Reserva de la Biósfera CalakmulCalakmul Costa del Golfo de MéxicoCaribea BTP T. Raymundo 3573 Diciembre 3, 2010239 18°06'52.30" -89°48'30.76"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Reserva de la Biósfera CalakmulCalakmul Costa del Golfo de MéxicoCaribea BTP T. Raymundo 3643 Diciembre 3, 2010239 18°06'52.30" -89°48'30.76"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Reserva de la Biósfera CalakmulCalakmul Costa del Golfo de MéxicoCaribea BTP R. Valenzuela 14156 Diciembre 3, 2010239 18°06'52.30" -89°48'30.76"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Reserva de la Biósfera CalakmulCalakmul Costa del Golfo de MéxicoCaribea BTP T. Raymundo 3594 Diciembre 3, 2010239 18°06'52.30" -89°48'30.76"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Reserva de la Biósfera CalakmulCalakmul Costa del Golfo de MéxicoCaribea BTP T. Raymundo 3617 Diciembre 4, 2010239 18°06'52.30" -89°48'30.76"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Autopista Champotón-Campeche Km. 180ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC A. Cobos-Villagrán 852 Enero 19, 20180 19°40'32.04" -90°38'21.78"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Autopista Champotón-Campeche Km. 180ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC A. Cobos-Villagrán 853 Enero 19, 20180 19°40'32.04" -90°38'21.78"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Autopista Champotón-Campeche Km. 180ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC A. Cobos-Villagrán 854 Enero 19, 20180 19°40'32.04" -90°38'21.78"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Autopista Champotón-Campeche Km. 180ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC A. Cobos-Villagrán 855 Enero 19, 20180 19°40'32.04" -90°38'21.78"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Autopista Champotón-Campeche Km. 180ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC A. Cobos-Villagrán 864 Enero 19, 20180 19°40'32.04" -90°38'21.78"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronneorufulum Campeche Autopista Champotón-Campeche Km. 180ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC T. Raymundo 7234 Enero 19, 20180 19°40'32.04" -90°38'21.78"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronthailandicum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 68ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC T. Raymundo 7209 Enero 03, 20180 18º57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronthailandicum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 69ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC T. Raymundo 7214 Enero 03, 20180 18º57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronthailandicum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 75ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC R. Valenzuela 17771 Enero 03, 20180 18º57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronthailandicum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 76ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC R. Valenzuela 17777 Enero 03, 20180 18º57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 70ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC T. Raymundo 7215 Enero 03, 20180 18º57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 72ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC T. Raymundo 7217 Enero 03, 20180 18º57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 74ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC T. Raymundo 7219 Enero 03, 20180 18º57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronrufulum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 78ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC R. Valenzuela 17783 Enero 03, 20180 18º57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronthailandicum Campeche Autopista Champotón-Campeche Km. 180ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC R. Valenzuela 17906 Enero 19, 20180 19°40'32.04" -90°38'21.78"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronthailandicum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 71ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC T. Raymundo 7216 Enero 03, 20180 18º 57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronthailandicum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 73ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC T. Raymundo 7218 Enero 03, 20180 18º 57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronthailandicum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 76ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC R. Valenzuela 17775 Enero 03, 20180 18º 57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronthailandicum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 77ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC R. Valenzuela 17779 Enero 03, 20180 18º 57' 03" -91°16'36"
Ascomycota DothideomycetesHysterialesHysteriaceaeRhytidhysteronthailandicum Campeche Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 78ChampotónCosta del Golfo de MéxicoCaribea BTC R. Valenzuela 17781 Enero 03, 20180 18º 57' 03" -91°16'36"
85
Anexo VI. Números de acceso de GenBank
ITS Colector y número de
colecta Localidad Latitud Longitud
MÉXICO R3 Campero, E 3 La Esperanza. Km 79
carretera Tuxtepec-Oaxaca, Oaxaca
17°37'55.46'' 96°22'01''
R4 R. Valenzuela 17270
Reserva de la Biósfera Tehuacán-Cuicatlán,
Oaxaca
18°13'31.92" 97°17'36.56"
R6 R. Valenzuela 17107
Parque estatal Sierra de Guadalupe, Estado de
México
19°35'29.90" 99° 07'02.41"
R7 R. Valenzuela 16717
Humedales, a 4 Km al N de Manzanillo, Colima
19°07'49.11'' 104°17'27.49''
R8 S. Bautista-Hernández
San Isidro, Dto. Tlaxiaco, Oaxaca
17°09'16.39" 97°31'43.12"
R10 A. Cobos-Villagrán 825
Rancho El Desengaño, Torrencillas. Carretera Cd. Valles-Río Verde Km 37-
39, San Luis Potosí
21°51'52'' 99°22'15''
R11 R. Valenzuela 18024
Alrededores del Trancaribe API, Quintana
Roo
20º29'43" 86º 57' 35"
R12 A. Cobos-Villagrán 1909
La Florida. Ejido El nacimiento. Reserva de la
Biósfera El Cielo
22°59'23.64" -99°08'37.68''
R13 A. Cobos-Villagrán 1842
Zona arqueológica San Gervasio. Chen-tuk,
Quintana Roo
20º29'54" 86º 50' 43"
R14 T. Raymundo 7214
Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 69,
Campeche
18º57'03" 91º 16' 36"
R15 I. Álvarez 536 Camino Eje Central. Reserva de la Biósfera
Chamela-Cuixmala, Jalisco
19°30'07.8'' 105°02'37.8''
R16 E. Escudero-Leyva 613
UMA Los Manatíes, Tabasco
17°47'44.01'' 91° 46' 49.22''
R18
R20 R. Valenzuela 14619
Km 7.2 del camino Los Azufres-La Grúa. Parque
Nacional Laguas de Chacahua, Oaxaca
15°58'44.05" 97°44'32.85"
R22 R. Valenzuela 17781
Carretera Champotón-Cd. Del Carmen Km. 78,
Campeche
18º57'03" 91º 16' 36"
R25 A. Trejo 74 Laguna Atezca, Hidalgo 20°48'32" 98°44'52"
R26 T. Raymundo 7005
Carretera Cerritos-entronque a Tula, Km 26,
San Luis Potosí
22°36'18.09'' 100°10'19.74''
R28 D. Castro-Bustos 249
Km 5 del camino Los Azufres-La Grúa. Parque
Nacional Laguas de Chacahua
15°58'54.12" -97°45'22.76"
R27 R. Valenzuela 15253
Rancho La Sierrita, APFF Sierra Álamos-Río
Cuchujaqui, Sonora
26°58'25'' 108°56'41.75''
86
R29 M. Sánchez 1043
Cerro del Azteca o Promesas, San Antonio Tepetitlán, Estado de
México
19°35'7.74 98°52'3.77"
R31 A. Cobos-Villagrán 685
Sombreretillo, Sierra de Picachos, Nuevo León
26º17'39.12" -99º 57' 51.12"
R34 A. Cobos-Villagrán 751
La Cuchilla. La Turbina, Nuevo León
26°29'10.68'' 100°12'50.25''
R35 A. Cobos-Villagrán 769
Ojo de agua, Nuevo León 26°32'55.62" 100°34'57.78"
R36 T. Raymundo 7049
La Cuchilla. La Turbina, Nuevo León
26°29'10.68'' 100°12'50.25''
R37 T. Raymundo 7639
Laguna Atezca, Hidalgo 20°48'32" 98°44'52"
R51 S. Bautista-Hernández 925
Camino Búho. Reserva de la Biósfera Chamela-
Cuixmala
19°29'34" -105°02'38.26"
R54 A. Cobos-Villagrán 2112
Carretera cd. Valles-San Luis Potosí Km 67, San
Luis Potosí
21°52'59'' 99°27'15''
R61 A. Cobos-Villagrán 1932
La Florida. Ejido El nacimiento. Reserva de la
Biósfera El Cielo, Tamaulipas
22°59'23.64" 99° 8'37.68"
R62 T. Raymundo 7908
Cerro San Juan, Reserva de la biósfera estatal San Juan
Xalisco. Nayarit
21°26'32'' 104°54'51''
COSTA RICA Rhytidhysteron
clado I EU020017 Palo Verde, National Park 10:21:21.4000 85:19:11.3000
Rhytidhysteron clado I
EU020018 Palo Verde, National Park 10:21:21.4000 85:19:11.3000
Rhytidhysteron clado I
EU020019 Hitoy Cerere Biological Reserve
09:40:23.0000 _83:01:27.0000
Rhytidhysteron clado I
EU020020 Cahuita National Park 09:44:07.0000 _82:50:11.7000
Rhytidhysteron clado I
EU020021 Hitoy Cerere Biological Reserve
09:40:23.0000 _83:01:27.0000
Rhytidhysteron clado I
EU020022 Cahuita National Park 09:44:07.0000 _82:50:11.7000
Rhytidhysteron clado I
EU020023 Cahuita National Park 09:44:07.0000 _82:50:11.7000
Rhytidhysteron clado I
EU020024 Hitoy Cerere Biological Reserve
09:40:23.0000 _83:01:27.0000
Rhytidhysteron clado I
EU020025 Hitoy Cerere Biological Reserve
09:40:23.0000 _83:01:27.0000
Rhytidhysteron clado I
EU020027 Hitoy Cerere Biological Reserve
09:40:23.0000 _83:01:27.0000
Rhytidhysteron clado I
EU020028 Palo Verde, National Park 10:21:21.4000 85:19:11.3000
Rhytidhysteron clado I
EU020029 Palo Verde, National Park 10:21:21.4000 85:19:11.3000
Rhytidhysteron clado II
EU020046 Cahuita National Park 09:44:07.0000 _82:50:11.7000
Rhytidhysteron clado II
EU020047 Cahuita National Park 09:44:07.0000 _82:50:11.7000
Rhytidhysteron clado II
EU020048 Palo Verde, National Park 10:21:21.4000 85:19:11.3000
Rhytidhysteron clado II
EU020051 Palo Verde, National Park 10:21:21.4000 85:19:11.3000
Rhytidhysteron clado II
EU020053 Hitoy Cerere Biological Reserve
09:40:19.9768 83:01:44.5992
Rhytidhysteron clado II
EU020055 Cahuita National Park 09:44:07.0000 _82:50:11.7000
Rhytidhysteron clado II
EU020057 Hitoy Cerere Biological Reserve
09:40:19.9768 83:01:44.5992
87
Rhytidhysteron clado II
EU020058 Cahuita National Park 09:44:07.0000 _82:50:11.7000
Rhytidhysteron clado II
EU020060 Cahuita National Park 09:44:07.0000 _82:50:11.7000
Rhytidhysteron clado II
EU020064 Palo Verde, National Park 10:21:21.4000 85:19:11.3000
Rhytidhysteron clado III
EU020033 Barra Honda National Park
10:10:29.8000 _85:22:19.4000
Rhytidhysteron clado III
EU020034 Palo Verde, National Park 10:20:30.4000 85:21:58.0000
Rhytidhysteron clado III
EU020035 Barra Honda National Park
10:10:29.8000 _85:22:19.4000
Rhytidhysteron clado III
EU020036 Palo Verde, National Park 10:20:30.4000 85:21:58.0000
Rhytidhysteron clado III
EU020037 Palo Verde, National Park 10:20:30.4000 85:21:58.0000
Rhytidhysteron clado III
EU020038 Barra Honda National Park
10:10:29.8000 _85:22:19.4000
Rhytidhysteron clado III
EU020040 Barra Honda National Park
10:10:29.8000 _85:22:19.4000
Rhytidhysteron clado III
EU020037 Palo Verde, National Park 10:20:30.4000 85:21:58.0000
Rhytidhysteron clado III
EU020042 Palo Verde, National Park 10:20:30.4000 85:21:58.0000
Rhytidhysteron clado IV
EU020041 Palo Verde, National Park 10:21:21.4000 85:19:11.3000
ESTADOS UNIDOS
R. rufulum MK607509
R. rufulum MH211888 Florida
TAILANDIA
R. rufulum KU377560 D. A. Daranagama
020
Chiang Rai Province, Horticultural Research
Center
R. rufulum KJ418112 S. Yacharoen
R. rufulum KJ418118 S. Yacharoen
R. rufulum KJ546124 S. Yacharoen
R. rufulum KJ546126 S. Yacharoen
R. thailandicum KU377559 K. M. Thambugala
008
Chiang Rai Province, Mae Fah Luang University
Garden
R. neorufulum KU377562 K. M. Thambugala
021
Chiang Rai Province, Mae Fah Luang
R. neorufulum KU377561 K. M. Thambugala
003
Chiang Rai Province, Horticultural Research
Center
R. neorufulum MH062956
R. tectonae KU144936 R. Phookamsak MFLU 15–3207
Chiang Rai Province, Muang District
INDIA
R. rufulum AM711974 R. rufulum KY310737 R. rufulum KU236375 R. rufulum KU236376 R. rufulum MH077555 Andaman Islands
R. thailandicum MH037556