Proyecto Final

Sistema para el registro del potencial de acción de células

cardíacas con Microelectrodos Intracelulares

Autor: Cristian Pablo Pennisi

Director: Dr. Leonardo Nicola Siri

Comisión Evaluadora :

Ing. Federico Falco

Bioing. Gabriel Gentiletti

Arq. Enzo Grivarello

Ing. José Vilá

Universidad Nacional de Entre Ríos Facultad de Ingeniería - Bioingeniería

Oro Verde - Entre Ríos - Argentina Diciembre de 1998

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Indice Analítico

RESUMEN 7

ORGANIZACIÓN GENERAL DEL DOCUMENTO 8

SECCIÓN 1: OBJETIVOS Y ANTECEDENTES 9

1. CAPÍTULO UNO: OBJETIVOS 10 1.1 OBJETIVOS GENERALES 10 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 10

2. CAPÍTULO DOS: ANTECEDENTES 11 2.1 ACTIVIDAD ELÉCTRICA DEL CORAZÓN 11

2.1.1 El corazón : breve descripción anatómica y fisiológica 11 2.1.2 Origen de la actividad eléctrica del corazón 12

2.1.2.1 Potencial de membrana. 12 2.1.2.2 Modelo de las conductancias en paralelo 13 2.1.2.3 La ecuación de Nernst 14 2.1.2.4 La ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz 14

2.1.3 Potencial de acción cardíaco 14 2.1.3.1 El potencial de acción en el miocardio ventricular 15 2.1.3.2 El potencial de acción en el nódulo sinusal 16

2.1.4 Registro de la actividad eléctrica del corazón 18 2.1.4.1 Métodos in vivo 18 2.1.4.2 Métodos in vitro 20

2.2 METODOLOGÍA PARA EL REGISTRO DEL POTENCIAL DE ACCIÓN CON MICROELECTRODOS INTRACELULARES 22

2.2.1 Sistema ambiental 22 2.2.1.1 Perfusión de solución fisiológica 22 2.2.1.2 El control de la temperatura 24 2.2.1.3 Perfusión de oxígeno 27

2.2.2 Sistema óptico 27 2.2.3 Sistema mecánico 28

2.2.3.1 Mesa antivibratoria 28 2.2.3.2 Micromanipulador 29 2.2.3.3 Elementos de fijación 30

2.2.4 Sistema para el registro analógico de la señal 30 2.2.4.1 Microelectrodos 30 2.2.4.2 Preamplificador 35 2.2.4.3 Guarda electrostática 37 2.2.4.4 Compensación de capacitancia 38 2.2.4.5 Circuito amplificador 39 2.2.4.6 Estimulación del preparado 40 2.2.4.7 Eliminación de interferencias 41

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2.2.4.8 Voltímetro 42 2.2.4.9 Osciloscopio 42

2.2.5 Sistema de adquisición digital de la señal 42 2.2.5.1 Requisitos del hardware 42 2.2.5.2 Requisitos del software 44

2.3 DISEÑO DEL ESPACIO DE TRABAJO 45 2.3.1 El diseño de puestos de trabajo 45 2.3.2 Elección de la postura de trabajo óptima 45 2.3.3 El espacio de trabajo para personal sentado 46

2.3.3.1 Dimensiones del espacio de trabajo 46 2.3.3.2 Area de la superficie horizontal de trabajo 46 2.3.3.3 Altura de la superficie horizontal de trabajo 47

2.3.4 Espacio físico y distribución [18] 48 2.3.4.1 Principios guía de distribución 49 2.3.4.2 Métodos de análisis 49 2.3.4.3 Situación general de los componentes 50 2.3.4.4 Distribución específica de los componentes 50

SECCIÓN 2 : DESARROLLO DEL PROYECTO 52

3. CAPÍTULO TRES : SISTEMA AMBIENTAL 53 3.1 PERFUSIÓN DE SOLUCIÓN FISIOLÓGICA 53 3.2 EL CONTROL DE LA TEMPERATURA 55

3.2.1 Características del sistema 55 3.2.2 Fuente de alimentación 56 3.2.3 Controlador de temperatura 58 3.2.4 Termómetro digital 59

3.3 SISTEMA DE PERFUSIÓN DE OXÍGENO 59 3.4 SISTEMA AUXILIAR DE VACÍO 60 3.5 DISTRIBUCIÓN DE LOS DISTINTOS SISTEMAS 60

4. CAPÍTULO CUATRO : SISTEMA ÓPTICO 62 4.1 LUPA BINOCULAR 62 4.2 SISTEMA DE ILUMINACIÓN 63

4.2.1 Lámpara 63 4.2.2 Fuente de alimentación 63

5. CAPÍTULO CINCO : SISTEMA MECÁNICO 65 5.1 MESA ANTIVIBRATORIA 65

5.1.1 Superficie de trabajo 65 5.1.2 Estructura de acoplamiento 65

5.2 MICROMANIPULADOR 66 5.3 ELEMENTOS DE FIJACIÓN 67

5.3.1 Bases magnéticas 68 5.3.2 Estructura metálica 68

6. CAPÍTULO SEIS : SISTEMA PARA EL REGISTRO ANALÓGICO DE LA SEÑAL 71 6.1 MICROELECTRODOS 71

6.1.1 El electrodo indiferente 71 6.1.2 Vidrio 72 6.1.3 Estirador de micropipetas 72 6.1.4 Llenado 74

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6.2 CIRCUITO ELECTRÓNICO DE REGISTRO 75 6.2.1 Preamplificador 75

6.2.1.1 Conexión física del microelectrodo 75 6.2.1.2 Descripción del circuito 75

6.2.2 Compensación de capacitancia 77 6.2.3 Circuito amplificador 77 6.2.4 Filtro pasabajo 78 6.2.5 Estimulador 81 6.2.6 Eliminación de interferencias 81 6.2.7 Voltímetro digital 82 6.2.8 Osciloscopio 82 6.2.9 Comparación de las características del amplificador con modelos comerciales 82

7. CAPÍTULO SIETE : SISTEMA DE ADQUISICIÓN DIGITAL DE LA SEÑAL 85 7.1.1 Características del hardware 85

7.1.1.1 Computadora personal (PC) 85 7.1.1.2 Placa conversora A/D 86

7.1.2 Características del software : 88 7.1.2.1 Descripción del LabVIEW 88 7.1.2.2 Estrategias y técnicas de adquisición con LabVIEW 89 7.1.2.3 Descripción del programa de adquisición 89

8. CAPÍTULO OCHO : DISEÑO DEL ESPACIO DE TRABAJO 94 8.1 UBICACIÓN FÍSICA 94 8.2 SUPERFICIE DE TRABAJO 95

8.2.1 Mesa antivibratoria 95 8.2.1.1 Área 95 8.2.1.2 Altura 95

8.2.2 Escritorio 96 8.2.2.1 Área 96 8.2.2.2 Altura 96

8.2.3 Espacio físico y distribución 97 8.2.3.1 Situación general de los componentes 97 8.2.3.2 Situación específica de los componentes 99

SECCIÓN 3 : PRUEBAS DEL SISTEMA 102

9. CAPÍTULO NUEVE : PRUEBAS DE BANCO 103 9.1 CONTROL DE TEMPERATURA 103

9.1.1 Prueba en circulación por gravedad 103 9.1.2 Prueba en recirculación 104

9.2 SISTEMA MECÁNICO 105 9.3 SISTEMA ELECTRÓNICO DE REGISTRO 108

9.3.1 Microelectrodos 109 9.3.2 Amplificador y sistema de eliminación de interferencias 111

10. CAPÍTULO DIEZ : VERIFICACIÓN DEL SISTEMA MEDIANTE UN EXPERIMENTO “IN VITRO” 113

10.1 USO DEL SISTEMA COMPLETO 113 10.1.1 Preparación del experimento 113 10.1.2 Realización de los registros 114 10.1.3 Registros obtenidos 115

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SECCIÓN 4 : ASPECTOS ECONÓMICOS 118

11. CAPÍTULO ONCE : ANÁLISIS DE COSTOS 119 11.1 COSTOS DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO 119

11.1.1 Costo de I+D real 119 11.1.1.1 Personal 119 11.1.1.2 Equipamiento 120 11.1.1.3 Materiales 121 11.1.1.4 Gastos preoperativos 122 11.1.1.5 Costo total 122

11.1.2 Costo de I+D a precio de mercado de los factores 122 11.1.2.1 Personal 122 11.1.2.2 Equipamiento 122 11.1.2.3 Materiales 123 11.1.2.4 Gastos preoperativos 123 11.1.2.5 Costo total 123

11.1.3 Comparación de los costos de I+D 123 11.2 ESTIMACIÓN DEL PRECIO DE VENTA 124

11.2.1 Producción en la Universidad 124 11.2.2 Producción fuera de la Universidad 125 11.2.3 Comparación de precios 126

SECCIÓN 5 : APÉNDICES 127

1. APÉNDICE UNO : CONCEPTOS TEÓRICOS ASOCIADOS CON EL CONTROL DE LAS VIBRACIONES. 128

1.1 CARACTERIZACIÓN DE UN SISTEMA ANTIVIBRATORIO 128 1.2 FUNDAMENTOS DE VIBRACIÓN 129

1.2.1 Movimiento armónico simple 129 1.2.2 Frecuencia natural 130 1.2.3 Compliancia 130 1.2.4 Transmisibilidad 131

1.3 ESTRUCTURA DE ACOPLAMIENTO ENTRE SOPORTE DEL MICROELECTRODO Y LA SUPERFICIE DE TRABAJO[] 132 1.4 ESTRUCTURA DE ACOPLAMIENTO ENTRE LA SUPERFICIE DE TRABAJO Y EL SUELO[42] 134

2. APÉNDICE DOS : DESCRIPCIÓN DEL PROGRAMA REALIZADO EN LABVIEW 135

SECCIÓN 6 : BIBLIOGRAFÍA 138

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Resumen

La electrofisiología cardíaca permite estudiar el funcionamiento del corazón a partir de las señales eléctricas de las células que lo componen. Los potenciales de acción de las células cardíacas constituyen uno de los tipos de señales más importantes para la investigación básica. El estudio de los potenciales de acción cardíacos es útil para caracterizar los fenómenos que dan origen a diferentes situaciones fisiológicas y fisiopatológicas del sistema cardiovascular. Por otra parte, la acción terapéutica de drogas cardioactivas puede comprenderse a través del conocimiento del efecto específico sobre determinadas corrientes o canales iónicos de las células cardíacas, que modifican directamente la morfología de los potenciales de acción.

El presente trabajo describe la construcción y puesta a punto de un sistema completo para el registro de potenciales de acción de células cardíacas mediante el uso de la técnica de microelectrodos intracelulares. Se trata de una técnica ‘in vitro’: los registros se llevan a cabo sobre trozos de tejido cardíaco colocados en una cámara que le brinda las condiciones ambientales necesarias. Estas condiciones aseguran la supervivencia de los tejidos por varias horas, durante las cuales se realizan las maniobras experimentales. Los potenciales de acción se miden entre un microelectrodo de vidrio insertado en el interior de una célula y un electrodo de referencia extracelular colocado dentro de la solución de perfusión de la cámara. Para registrar los potenciales de acción en células no automáticas, se utiliza un estimulador electrónico.

El sistema desarrollado consta de las siguientes cuatro partes, agrupadas de acuerdo a la función que cumplen:

Un sistema para el mantenimiento de las condiciones ambientales, constituido por un control de temperatura para baño termostatizado y los medios necesarios para el suministro de solución fisiológica y de oxígeno.

Un sistema para la observación del tejido, que consta de una lupa binocular y un sistema de iluminación.

Un sistema mecánico, para sostener de manera estable el microelectrodo y poder insertarlo en el tejido mediante movimientos precisos, constituido por una mesa antivibratoria, un micromanipulador y una estructura de soporte.

Un sistema electrónico, constituido por un amplificador para acondicionar las señales de los potenciales de acción, un estimulador, un osciloscopio digital para visualizarlas en tiempo real, una placa conversora A/D para digitalizarlas y una PC que maneja el programa de adquisición para la visualización y el almacenamiento de las mismas.

El sistema completo constituye el puesto de trabajo de un operario del Laboratorio, por lo que fueron tenidos en cuenta criterios de diseño ergonómicos para el montaje y la ubicación de los distintos sistemas de control y visualización dentro del mismo.

El sistema se encuentra actualmente en funcionamiento en el Laboratorio de Bioelectricidad de la FI-UNER donde es utilizado a los fines del proyecto de investigación “Efecto de anticuerpos contra receptores β-adrenérgicos sobre las propiedades eléctricas del corazón”.

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Organización general del documento

Los contenidos de este documento se han subdividido en seis secciones, las que se enumeran a continuación :

1. OBJETIVOS Y ANTECEDENTES: se describen los fundamentos teóricos para la delimitación del problema a resolver y un bosquejo general del sistema y los objetivos del proyecto.

2. DESARROLLO DEL PROYECTO: se describen en detalle los desarrollos específicos de cada parte del sistema.

3. PRUEBAS DEL SISTEMA: se describen las pruebas de banco de cada parte y el desempeño del sistema completo en condiciones reales de operación con experimentos ‘in vitro’.

4. ASPECTOS ECONÓMICOS: se detalla el análisis de los costos de investigación y desarrollo de este proyecto. Se realiza además una valoración estimativa de los costos de producción de mismo.

5. APÉNDICES: se desarrollan aspectos teóricos y/o detalles anexos del proyecto.

6. BIBLIOGRAFÍA.

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Sección 1: Objetivos y Antecedentes

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1. CAPÍTULO UNO: OBJETIVOS

En el Laboratorio de Bioelectricidad de la FI-UNER, en el marco del PID ¨Efecto de anticuerpos contra receptores beta-adrenérgicos sobre las propiedades eléctricas del corazón¨ se planteó la necesidad de construir un sistema capaz de llevar a cabo el registro de los potenciales de acción cardíacos, con la técnica de microelectrodos intracelulares. Por lo tanto se generó el presente proyecto, con los siguientes objetivos :

1.1 Objetivos Generales Analizar los considerandos teóricos para optimizar el montaje de un sistema completo para el registro de potenciales de acción cardíacos mediante microelectrodos intracelulares.

1.2 Objetivos Específicos Desarrollar y poner en funcionamiento un puesto de trabajo apto para el registro de potenciales de acción cardíacos mediante microelectrodos intracelulares.

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2. CAPÍTULO DOS: ANTECEDENTES

2.1 Actividad eléctrica del corazón Para poder definir los requisitos que debe cumplir el sistema para el registro de los potenciales de acción, es necesario conocer cuáles son las propiedades del sistema biológico objeto de estudio. Se comenzará entonces con una breve reseña anatómica y fisiológica del corazón, para luego hablar de las propiedades eléctricas de las células que lo componen. Finalmente se enumeran los métodos utilizados para llevar a cabo el registro de dicha actividad eléctrica.

2.1.1 El corazón : breve descripción anatómica y fisiológica El corazón es el órgano central del sistema circulatorio. En el humano está situado hacia el frente de la cavidad torácica, apenas desviado del centro hacia la izquierda a nivel de la axila. Tiene la forma de un cono invertido, con su base hacia arriba a la derecha, y el apex apuntando hacia abajo, a la izquierda y adelante.

Figura 2-1 : El corazón (a) vista anterior (b) vista posterior. Los números indican (1) vena cava superior, (2)

aorta, (3) arteria pulmonar, (4) vena pulmonar, (5) aurícula izquierda, (6) aurícula derecha, (7) ventrículo derecho, (8) ventrículo izquierdo. (adaptada de [1])

Las paredes del corazón están formadas por un músculo hueco, el miocardio, con algunas fibras dispuestas en forma espiral alrededor del cono y otras desde la base hacia el apex. Un tabique muscular a lo largo del eje anatómico divide al corazón en dos partes, una mitad derecha y otra izquierda; el miocardio de la mitad izquierda es considerablemente más grueso que el de la mitad derecha. Cada mitad está subdividida a su vez en dos cámaras, la superior (aurícula) y la inferior (ventrículo) conectadas entre sí por válvulas.

Las aurículas son estructuras de paredes relativamente delgadas que actúan como cámaras receptoras de la sangre que retorna al corazón; aquí el miocardio se halla dispuesto en dos capas. Las aurículas cumplen básicamente las funciones de reservorio elástico y de conducción desde el lecho venoso hacia el ventrículo derecho y desde la circulación pulmonar hacia el ventrículo izquierdo; además de servir de bombas de refuerzo, incrementando el llenado ventricular. Los ventrículos, de paredes gruesas, son los

1

8

3 3

3

6 5 5

4 4 4

2 1

7

2

8

6

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encargados de bombear un cierto volumen de sangre desde un sistema venoso de baja presión hacia un sistema arterial de distribución, de alta presión.

El corazón es entonces una bomba integrada dentro del sistema vascular: su función es asegurar que la sangre fluya continuamente a través de los órganos del cuerpo, proveyéndolos con suficiente oxígeno y nutrientes, y removiendo efectivamente los productos metabólicos de desecho. En términos funcionales, las mitades derecha e izquierda del corazón pueden ser consideradas independientes una de otra.

En el corazón derecho, la sangre con contenido reducido de oxígeno es vertida a través de las venas cava superior e inferior dentro de la aurícula, desde donde ingresa luego al ventrículo. La sangre en el ventrículo derecho es expulsada hacia los pulmones a través de la arteria pulmonar. Durante su pasaje a través de los pulmones, la sangre libera dióxido de carbono al aire inspirado y toma oxígeno de él, proceso denominado hematosis.

Una vez que esto sucede, la sangre fluye a través de las venas pulmonares hacia la aurícula izquierda, pasando luego hacia el ventrículo, desde donde es bombeada hacia la aorta. Luego, es distribuida a través de arterias grandes y pequeñas, alcanzando finalmente los vasos más pequeños y los capilares en los órganos, donde intercambia con los tejidos las sustancias que transporta. Finalmente, la sangre es recolectada en pequeñas y grandes venas que por último se vacían en las venas cava. La parte del circuito que se desarrolla entre la arteria pulmonar y las venas pulmonares es llamado de circulación pulmonar o menor; la parte que recorre todo el cuerpo es llamado de circulación sistémica o mayor.

2.1.2 Origen de la actividad eléctrica del corazón El corazón es un órgano que presenta una diferenciación estructural y funcional de un mismo tejido básico, el tejido muscular estriado, que permite una optimización de las tres funciones cardíacas relacionadas con la bioelectricidad : la actividad automática (cronotropismo), la propagación del impulso eléctrico (dromotropismo) y la contracción muscular (inotropismo). La función específica del corazón, la actividad contráctil, está controlada por una secuencia muy precisa de señales eléctricas originadas normalmente en una estructura diferenciada (nódulo sinusal) en forma de impulsos eléctricos (potenciales de acción) más o menos periódicos (actividad marcapasos), que son conducidos hacia las aurículas y, con un retardo apropiado, también hacia los ventrículos a través del sistema de conducción (nódulo aurículo-ventricular, haz de His, sus dos ramas y las fibras de Purkinje). Como resultado de esa excitación eléctrica se produce la contracción secuenciada de las aurículas y los ventrículos [2] .

Para describir el comportamiento de las membranas biológicas que poseen propiedades eléctricas, a menudo es conveniente el uso de modelos eléctricos análogos. A continuación se describirán los parámetros que describen las propiedades de las células excitables, en base al modelo más utilizado para representarlas.

2.1.2.1 Potencial de membrana. Se denomina potencial de membrana (Em) al voltaje que se mide entre el interior de una célula y el espacio extracelular que la rodea. En condiciones de reposo el espacio intracelular posee un potencial más negativo que el del espacio extracelular.

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Figura 2-2: Potencial de reposo en una célula cardíaca. (extraída de [3])

Las mayoría de las células poseen un potencial de membrana de aproximadamente -80 mV, producto de diferencias en la concentración de iones dentro y fuera de la célula y en las pemeabilidades membranales a los mismos.

La permeabilidad a los distintos iones está mediada por canales específicos, constituídos por grandes proteínas incrustadas en la membrana celular. Estos canales se abren ante estímulos apropiados, lo que permite a las cargas iónicas atravesar la membrana y crear flujos de corrientes. Se puede encontrar una mayor descripción de los canales iónicos en la referencia [3].

2.1.2.2 Modelo de las conductancias en paralelo Si se supone que cada especie iónica migra a través de la membrana en forma independiente de la presencia de las demás, es posible utilizar una analogía eléctrica para la membrana celular. Se conectan en paralelo una rama para cada ion, cada rama compuesta por una pila de valor Eion en serie con una conductancia. Para la mayoría de las células (excitables o no), en el estado de reposo sólo es necesario considerar las permeabilidades a los iones K+, Cl- y Na+, en ese orden de importancia. El modelo circuital para la membrana en reposo tendrá pues tres ramas en paralelo, una para cada ion, tal como se puede observar en la figura 1.3.

Figura 2-3 : Modelo circuital de conductancias en paralelo para la membrana celular en estado de reposo. A la derecha se representa un circuito equivalente simplificado.

Para un ion determinado, la corriente (Iion) en cada rama está determinada por la resistencia de membrana y el potencial de membrana (Em) de acuerdo con la ley de Ohm :

i g E Eion ion m ion= −.( )

donde gion y Eion son la conductancia de la membrana y el potencial de equilibrio para dicho ion, respectivamente.

interior

exterior

Em Em

ENa

gCl gNa gK

ECl EK Er

interior

Rm

exterior

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2.1.2.3 La ecuación de Nernst La ecuación de Nernst define la relación existente entre las actividades de un ion a cada lado de una membrana semipermeable con el potencial que se establece a través de dicha membrana en condiciones de equilibrio electroquímico.

El potencial de equilibrio de un ion a través de una membrana plasmática está dado por la ecuación de Nernst :

ERTzF

aaion

o

i= ln

donde Eion es el potencial de equilibrio para el ion, R la constante universal de los gases, T la temperatura absoluta, z la valencia del ion, F la constante de Faraday, ao y ai las actividades del ion fuera y dentro de la célula respectivamente. Se utiliza la actividad en lugar de la concentración, ya que esta última incluye a los iones inmovilizados.

En el músculo cardíaco en reposo, donde la concentración extracelular de potasio es aproximadamente 5.4 mM y la concentración intracelular es aproximadamente 120 mM (las actividades correspondientes son aproximadamente 4 y 100 mM), la ecuación de Nernst predice que el potencial de equilibrio del potasio es aproximadamente igual a -86 mV.

Debido a que el potencial de reposo celular es cercano al potencial de reposo para el potasio predicho mediante la ecuación de Nernst, las variaciones en el potasio extracelular influyen directamente sobre el potencial de reposo. Un aumento en la concentración de potasio extracelular causa despolarización, mientras que reducción en el potasio extracelular tiende a hiperpolarizar la membrana.

2.1.2.4 La ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz El potencial de reposo se calcula a través de la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz, que toma en cuenta las permeabilidades y las actividades de todas las especies iónicas que contribuyen al potencial de membrana. Para un membrana permeable al sodio, al cloro y al potasio, esta ecuación es :

ERTzF

P a P a P aP a P a P am

K Ko Na Nao Cl Cli

K Ki Na Nai Cl Clo=

+ ++ +

ln

La contribución de cualquier ion al potencial de membrana esta determinado tanto por el gradiente de actividades a través de la membrana como por la permeabilidad de la membrana a dicho ion. Un gradiente de actividad ausente o una permeabilidad nula cancelaría la contribución de dicho ion al potencial de membrana.

2.1.3 Potencial de acción cardíaco Todas las células del miocardio son capaces de modificar el potencial de reposo para desarrollar una excitación transitoria, conocida como potencial de acción: la distribución de cargas a través de la membrana invierte su polaridad momentáneamente, haciendo el espacio intracelular positivo con respecto al espacio extracelular. Los potenciales de acción son generados por la apertura y cierre de canales iónicos en la membrana plasmática. La morfología del potencial de acción, difiere en las distintas zonas del corazón, como puede verse en la siguiente figura.

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Figura 2-4: Morfología del potencial de acción en las distintas zonas del corazón en mamíferos. La escala de

voltaje está expresada en mV. (adaptada de [3] y [4])

En las células contráctiles del miocardio normalmente se generan potenciales de acción sólo bajo la influencia de un estímulo externo, como por ejemplo el potencial de acción de las células vecinas o el pulso de voltaje de un marcapasos artificial. Este estímulo despolariza la membrana, y si el potencial de membrana alcanza cierto valor umbral, se genera un potencial de acción. Los potenciales de acción normales son siempre muy semejantes entre sí en amplitud y forma.

El potencial de acción que se describe típicamente es el correspondiente al miocardio ventricular, por ser el tejido cardíaco más estudiado. Debe recordarse que el potencial de acción difiere en las distintas zonas del corazón, donde las características distintivas están relacionadas con roles electrofisiológicos particulares. A modo de ejemplo, se describirá en primer lugar el potencial de acción ventricular y luego el del nódulo sinusal. Una descripción más detallada de los otros potenciales así como de los mecanismos que se describirán a continuación puede encontrarse en las referencias [3] y [4]

2.1.3.1 El potencial de acción en el miocardio ventricular El potencial de acción consiste de varias fases, cada una con un flujo de iones distinto en dirección y especie:

Fase 0: corresponde a la despolarización rápida de la membrana, motivada por un rápido aumento de la permeabilidad al Na+; este aumento de conductancia hace tender el potencial de membrana al potencial de equilibrio del Na+ (+52 mV), aunque sin alcanzarlo, elevando el potencial de membrana hasta cerca de los +20 mV. Cuando el voltaje a través de la membrana se invierte (el potencial interior de la célula positivo con respecto al extracelular), el flujo hacia adentro de sodio decrece abruptamente, dando paso a la siguiente fase.

Fase 1: se produce una leve repolarización (rápida y breve), causada por un aumento de la permeabilidad al K+, disminuyendo el potencial de membrana hasta cerca de 0 mV.

AURICULA

300 ms VENTRICULOFIBRAS DE PURKINJE

NODO AV

HAZ DE HIS

NODO SA

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Fase 2: el potencial de membrana permanece cerca de 0 mV por 200-250 ms; esta meseta es característica del músculo cardíaco, y se debe a una corriente lenta y sostenida de Ca++ hacia adentro, casi equilibrada por una corriente de K+ hacia afuera.

Fase 3: luego sigue una repolarización más rápida, de una duración cercana a los 50 ms, donde la corriente de calcio es progresivamente inactivada, predominando la corriente de salida de potasio. Como resultado, el potencial intracelular negativo es restablecido y la membrana se repolariza hasta su potencial de reposo.

Fase 4: el potencial de membrana alcanza el valor de reposo, mantenido principalmente por la corriente saliente de K+.

El potencial de acción puede tener una duración total que va desde 180 a 380 ms, dependiendo de la frecuencia cardíaca.

Figura 2-5 : Relación entre las fases del potencial de acción y los flujos de iones en una célula miocárdica

ventricular de mamífero. El potencial de acción se representa en el trazo superior, mientras que las corrientes generadas por cada uno de los iones se grafican debajo. Para la corriente de potasio se muestran sus tres componentes principales: IK (rectificador tardío), Ito (transitoria de salida) e IK1 (rectificador anómalo).

(adaptada de [3])

2.1.3.2 El potencial de acción en el nódulo sinusal En este grupo de células la diferencia principal en el potencial de acción con el resto del tejido cardíaco es la denominada despolarización diastólica espontánea, despolarización en

tiempo (ms)

tiempo (ms)

2

3 0

4

1

4

10 µA

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fase 4 o “potencial de marcapasos”. Estas células son capaces de autoexcitarse, generando potenciales de acción en forma repetitiva que se propagan a los tejidos adyacentes, los cuales sólo responden ante la presencia de un estímulo en condiciones fisiológicas.

Figura 2-6 : (A) Potencial de acción en el nódulo sinusal de conejo; (B) principales corrientes involucradas.

(adaptada de [4])

El potencial de acción en esta región es más pequeño que en otras (aproximadamente 60 mV pico a pico), con una fase 0 más lenta, por la falta de canales funcionales de Na+. La fase 0 de este potencial de acción es producida en gran parte por la corriente entrante de Ca++.

Como se dijo anteriormente, las células del nódulo sinusal producen un potencial de marcapasos, es decir que son capaces de desarrollar espontáneamente un potencial de acción, a intervalos de tiempo regulares (ritmo sinusal). El ritmo sinusal está regulado por diferentes factores que pueden modificar :

• la pendiente de despolarización diastólica (PP),

• el valor del potencial diastólico máximo (PDM) y/o

• el umbral de activación (PU), alrededor de -40 mV, que da origen a la fase de despolarización rápida, o sea a la fase 0. (ver figura 2.7)

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Figura 2-7 : Factores que diminuyen la frecuencia de disparo del nódulo sinusal. (adaptada de [3])

Estos factores, que regulan la frecuencia de disparo del nódulo sinusal, se deben a la interacción de mecanismos complejos con los canales iónicos de la membrana celular. El estudio de estos mecanismos puede ser llevado a cabo mediante una serie de técnicas electrofisiológicas de registro, cada una de las cuales brinda diferente información. Si bien hoy en día existen técnicas de estudio que son capaces de identificar y caracterizar las corrientes iónicas en parches de membrana con canales únicos (método de “patch-clamp”), no se ha llegado a explicar por completo el mecanismo por el cual las células marcapasos mantienen su ritmicidad espontánea [5].

2.1.4 Registro de la actividad eléctrica del corazón La electrofisiología cardíaca se dedica al estudio del corazón a partir de su actividad eléctrica. Por medio de las señales eléctricas obtenidas del corazón se pueden estudiar los mecanismos involucrados en la generación y transmisión del impulso excitatorio que dan origen a la contracción mecánica. Los estudios de electrofisiología cardíaca permiten explicar la fisiología y fisiopatología de la actividad eléctrica del corazón, y sirven para estudiar los mecanismos de acción de las diferentes estrategias terapéuticas. A continuación se enumeran brevemente los métodos electrofisiológicos empleados para el registro de la actividad eléctrica del corazón, los que pueden ser divididos en métodos “in vivo” e “in vitro”. Una descripción más detallada puede hallarse en la bibliografía específica citada en cada caso.

2.1.4.1 Métodos in vivo Las técnicas de registro “in vivo” permiten el estudio de las señales provenientes del corazón en organismos vivos. Estas son técnicas que, debido a su relativa simpleza y difundida aplicación, se utilizan con mayor frecuencia en la práctica clínica con fines diagnósticos. Se pueden citar:

Electrocardiograma (ECG) :

El ECG fue descripto por primera vez por Einthoven en 1903. La observación fundamental fue que la actividad eléctrica del corazón podía ser registrada mediante electrodos colocados en la superficie del cuerpo, y que dicha actividad poseía un ritmo que coincidía con el pulso.

Los componentes individuales de la señal eléctrica que se registra coinciden con eventos que se producen en las diferentes regiones del corazón. De esta forma, los intervalos entre los componentes específicos de la señal de ECG representan el retardo de tiempo entre la activación de las diferentes regiones del corazón. Por ejemplo, el llamado intervalo PR representa el intervalo de tiempo que hay entre la activación de la

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aurícula y la de los ventrículos, por lo que refleja el retardo de conducción que se produce en el nódulo AV. Las anomalías del ECG representan por lo tanto anomalías en iniciación y propagación de la actividad eléctrica del corazón. Esto ha permitido que el ECG se transforme en una herramienta diagnóstica primaria de enfermedades cardíacas, tales como la hipertrofia o el infarto de miocardio, o de enfermedades de otro tipo que indirectamente afectan al corazón. Ya que la propagación eléctrica en el corazón es unidireccional, puede representarse mediante un vector. La configuración del ECG depende de la localización de los electrodos de registro, los que pueden ubicarse sobre la piel del paciente, en los miembros y/o en el tórax, (ECG de superficie), a través de la cavidad nasofaríngea (ECG intracavitario) o directamente sobre el corazón cuando se está realizando una intervención a tórax abierto. Cada ubicación específica permite una visualización diferente de las componentes del vector cardíaco [6].

Como se mencionó anteriormente la despolarización espontánea de las células marcapaso inicia el ciclo cardíaco. La propagación célula a célula está sincronizada y produce la una activación ordenada de todas las regiones del corazón. La activación comprende fases de despolarización y repolarización, cada una de las cuales produce una señal detectable en el ECG. La señal de ECG está compuesta por diferentes fases, las cuales se identifican mediante las letras P, Q, R, S y T como puede observarse en la Figura 2-8. También puede observarse el correlato temporal de la señal de ECG con los potenciales de acción de las diferentes estructuras cardíacas.

Figura 2-8 : El registro de ECG en relación con los potenciales de acción de las diferentes estructuras

cardíacas. NSA : nódulo sinusal, NAV : nódulo aurículo-ventricular. (extraída de [2])

Potenciales de Acción Monofásicos (MAP) :

Una técnica para registrar actividad eléctrica de manera extracelular, ya sea en animales de laboratorio o en la práctica clínica, es la de los potenciales de acción monofásicos (MAP’s)[6]. Las señales registradas por este método se asemejan en su curso temporal a los potenciales de acción registrados de manera intracelular. Se utilizan dos electrodos especiales de contacto que se insertan mediante cateterización: un electrodo “de punta” no polarizable y un electrodo de referencia, ambos de Ag/AgCl. Mediante el electrodo de punta se ejerce una presión de 10 a 30 gr/mm sobre el tejido, sin llegar a penetrarlo.

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El diámetro de la punta es usualmente de 1 a 2 mm, por lo que se registran varias células a la vez, las que se hallan despolarizadas a causa de la presencia de este electrodo. Las señales son generadas por la despolarización de las células miocárdicas alrededor de la punta del electrodo, las que producen una diferencia de potencial entre la punta y el electrodo de referencia.

Este método ofrece ventajas sobre otras técnicas electrofisiológicas de registro. La mayor ventaja ofrecida por el MAP es que requieren menor cantidad de equipamiento asociado que los potenciales registrados en forma intracelular. Los MAP brindan información cuantitativa acerca del proceso de repolarización, lo que no es posible con el uso de ECG. Se puede mencionar como desventaja que no se obtiene información acerca del potencial de reposo de las células, debido al carácter extracelular de este tipo de registro. Otra desventaja es el hecho de ser una técnica invasiva, ya que como se mencionó previamente es necesario emplear cateterización para la colocación de los electrodos en contacto con la pared del corazón.

2.1.4.2 Métodos in vitro Las técnicas “in vitro” permiten la obtención de registros eléctricos sobre estructuras aisladas del organismo, las que se mantienen en condiciones viables a partir del suministro de soluciones de perfusión que contienen los nutrientes necesarios. De esta forma es posible la obtención de registros a partir de corazones enteros, trozos de tejido, células y hasta trozos de membrana celular aislados. A continuación se describen las técnicas más comunes de registro.

Electrograma :

El electrocardiograma obtenido de un corazón aislado, produce un registro denominado electrograma. Este método sólo se utiliza en pequeños corazones de animales de experimentación. Los corazones aislados son perfundidos mediante un aparato de Lagendorff, el que le suministra continuamente una solución fisiológica a través de la aorta. (una descripción detallada de este método de perfusión puede hallarse en la referencia [6]). Para realizar el registro de la señal se emplean tres “electrodos”, uno representado por la cánula metálica que se inserta en la aorta, el otro (usado como tierra) conectado a la solución de perfusión y el tercero, por lo general, constituído por un alambre de acero inoxidable insertado en la pared del ventrículo. La posición de este último electrodo determina el eje sobre el cual se realizan las mediciones de la señal y por lo general se coloca en el ápex del ventrículo. Con esta técnica, al igual que con el ECG, pueden evaluarse los intervalos entre los diferentes eventos del ciclo cardíaco, así como también la presencia de arritmias u otras patologías cardíacas. Como ventaja se tiene que los estudios sobre corazones aislados permiten un análisis independiente de ciertas variables que se hallan presentes en el organismo “in vivo”, como por ejemplo la regulación autónomica de la frecuencia cardíaca.

Registro con microelectrodos intracelulares :

En 1949, Ling y Gerard introdujeron el empleo de microelectrodos de vidrio llenos con una solución conductora en el estudio de las células excitables. Efectivamente ellos pudieron registrar el potencial de acción del músculo sartorio de rana. En 1951, Weidmann y Woodbury los adaptaron para el estudio del músculo cardíaco, haciéndolos flexibles por medio de un hilo de tungsteno, lo que les posibilita acompañar los movimientos del corazón. Los registros intracelulares obtenidos con microelectrodos de vidrio han puesto en evidencia las variadas morfologías de los potenciales de acción de

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las distintas estructuras cardíacas y contribuyeron a aclarar los movimientos iónicos que dan lugar a sus fases.

La técnica consiste entonces en insertar un microelectrodo de vidrio lleno con una solución conductora en el interior de una célula y medir la diferencia de potencial con respecto a un electrodo de referencia, colocado en el exterior de la célula. Se pueden medir así potenciales de reposo y potenciales de acción en preparados multicelulares (trozos de tejido) y en preparados unicelulares (células aisladas). Las células cardíacas aisladas se obtienen a través de métodos de disociación enzimática[6].

Registros mediante fijación de voltaje y fijación de corriente :

Estos métodos también utilizan microelectrodos intracelulares, pero se controlan electrónicamente las propiedades eléctricas de la célula. En un método se fija el voltaje (en inglés “voltage clamp”) y en el otro la corriente (“current clamp”) a través de la membrana celular.

Como las conductancias iónicas dependen del potencial de membrana y del tiempo, la técnica de fijación de voltaje permite estudiar el curso temporal de las conductancias iónicas, separadamente de la acción del voltaje (que se mantiene constante). Equivale matemáticamente al método de separación de variables. Si por cualquier circunstancia el tejido modifica su conductancia, se deberá modificar el valor de la corriente necesaria para mantener la relación óhmica. En 1952, Hodgkin y Huxley publicaron determinaciones de las corrientes obtenidas en el axón gigante de calamar mediante la técnica de fijación de voltaje. La utilización de esta técnica demoró algún tiempo en aplicarse al músculo cardíaco, por las dificultades inherentes a la obtención de una fijación del voltaje de manera uniforme en la estructura sincicial de compleja geometría como es el corazón.

Registro mediante “patch-clamp” :

La aparición de métodos relativamente simples que permiten obtener cardiomiocitos aislados mediante disociación enzimática hizo posible superar la mencionada dificultad inherente a la compleja organización geométrica del tejido cardíaco. La técnica de patch-clamp permite hacer una fijación de voltaje de pequeñísimos “parches” de membrana (alrededor de 1 µm de diámetro) para estudiar corrientes que atraviesan canales únicos (“single channel recording”) o la membrana completa de una sola célula aislada (‘whole cell recording”). Este método, descripto por Neher y Sakmann en el año 1976, trajo aparejado un enorme desarrollo en el estudio de las células cardíacas, proporcionando nuevos e importantes datos acerca de sus propiedades electrofisiológicas[7].

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2.2 Metodología para el registro del potencial de acción con microelectrodos intracelulares Como se mencionó al comienzo, el objetivo principal de este proyecto es la construcción y puesta a punto de un sistema para el registro de potenciales de acción cardíaco con microelectrodos intracelulares. Para obtener los registros intracelulares de potenciales de acción, es necesario contar con una estación de trabajo (llamada comunmente ´setup´) que se puede dividir básicamente en cuatro subsistemas, cuyos requisitos se describen a continuación:

2.2.1 Sistema ambiental La realización exitosa de registros de los potenciales de acción cardíacos requiere que el tejido sometido a estudio, denominado comunmente ‘preparado’, permanezca durante varias horas en estado viable. El sistema ambiental comprende entonces los medios necesarios para mantener a la preparación celular en estado viable, el que debe cumplir con los siguientes requisitos :

Contener una concentración de iones y nutrientes similar a la del líquido extracelular del organismo de donde proviene el tejido. Esta solución se conoce como solución fisiológica. Se debe mantener circulando para proveer una renovación constante de los nutrientes (oxígeno y glucosa) y poder eliminar los productos de desecho.

Estar a temperatura controlada, dentro de los rangos de supervivencia celular, que para el caso de los cardiomiocitos está aproximadamente entre los 25 y los 38oC.

Estar a pH controlado, en un rango de 7.25 a 7.45.

Para el mantenimiento de las condiciones ambientales se debe implementar por lo tanto un sistema para suministrar la solución fisiológica, a la que se le deben controlar la temperatura, el pH y la saturación de oxígeno.

2.2.1.1 Perfusión de solución fisiológica Este sistema está destinado al suministro de solución fisiológica al preparado bajo estudio. Para alojar los preparados se utilizan por lo general cámaras de acrílico o policarbonato. El “piso” de la cámara debe poseer un material que permita la inserción de agujas para sostener el tejido. El material que se utiliza por lo general es el “Sylgard®”, un elastómero siliconado fabricado por la compañía Dow Corning.

La solución debe ser ingresada a la cámara a través de tuberías, preferentemente de PVC. La perfusión puede realizarse por gravedad o por bombeo. Es necesario prever además la construcción de un sistema auxiliar que permita descartar la solución que debe ser retirada de la cámara. Puede implementarse un drenaje por gravedad, un sistema de succión o emplearse un bomba. En todos los casos, debido a que la solución fisiológica contiene electrolitos, las tuberías que la transportan se comportan como conductores eléctricos, llevando ruido al lugar de registro. Por lo tanto también es necesario realizar una conexión a tierra de esta “línea” en alguna parte de su recorrido.

La composición iónica de la solución fisiológica depende de la especie cuyo tejido esté bajo estudio. Las soluciones más empleadas para los preparados de cardiomiocitos son el Tyrode con buffer bicarbonato y el Tyrode con buffer HEPES (ver página siguiente). Los denominados sistemas buffer o tampón se agregan para mantener el pH de la solución de perfusión dentro de los límites aceptables.

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Las soluciones buffer contienen un ácido débil y su sal o una base débil y su sal. Poseen la capacidad de resistir a los cambios en la concentración de hidrogeniones cuando se le agregan pequeñas cantidades de ácidos o bases fuertes. Las células poseen naturalmente sistemas buffer, pero su capacidad para mantener un pH constante en soluciones débilmente tamponadas o no tamponadas es muy limitada. La disminución del pH, normalmente conduce a la muerte celular. La acidificación puede ser explicada, al menos en parte, en base a la disociación irreversible de macromoléculas proteicas en péptidos de bajo peso molecular y el consecuente incremento de grupos carboxilo ionizables. El tamponado de la solución de perfusión puede neutralizar esta acidificación del tejido y así evitar su daño[8,9].

Los principales buffers usados son llamados buffers "fisiológicos", ya que exhiben un rango de acción efectivo entre 7,2 y 7,4. A continuación se describen dos de los buffers más usados en preparados de células cardíacas.

• Buffer HEPES:

El buffer HEPES (Ácido sulfónico N-2-Hidropiperazin-N'-2-etano) es un buffer que posee un pK de 7,31 a 37ºC. Es un buffer amino-terciario heterocíclico, por lo que puede interferir con las reacciones amino-aldehídos del tejido. Massie y col. (1972) indican que este buffer es un sustituto no tóxico del buffer bicarbonato en los medios usados para cultivos celulares.

• Buffer bicarbonato:

Este buffer es uno de los más fisiológicos que existen, debido a que se encuentra en los sistemas vivos en la forma bicarbonato/ácido carbónico (CO3HNa/CO3H2). Su acción puede comprenderse si se considera la se considera la ecuación :

CO2 + H2O ⇔ CO3H2 ⇔ CO3H- + H+

Si se agregan iones H+ al sistema, algunos se combinarán con bicarbonato y la reacción se desplazará a la izquierda. Por consiguiente, no todos los iones hidrógeno que se incorporen a la solución quedarán bajo la forma iónica. Si se agrega una base, en cambio, el H+ será extraído en parte y la reacción se desplazará hacia la derecha provocando una disociación del CO3H2 en H+ y CO3H-. Por lo tanto existe una relación inversa entre el H+ y el CO3H- cuando se agrega un ácido o una base al sistema.

Puede verse que el nivel de CO2 (la PCO2) también interviene en la determinación del pH, pero de manera diferente a la que lo hacen los ácidos y bases. Si se agrega o se extrae CO2, en este caso las concentraciones de H+ y de CO3H- cambian en el mismo sentido. Concretamente, el valor de pH está dado por la ecuación de Henderson-Hasselbach :

pH pKCO HCO H

= +−

log[ ][ ]

3

3 2

pK es el valor de pH donde existen iguales cantidades del ácido y de la sal acompañante, que en este caso vale 6,1 a 37oC. La concentración de CO3H2 depende de la presión parcial de CO2 y del coeficiente de solubilidad a. Por lo tanto se puede reescribir la ecuación de la forma:

pHCO Ha PCO

= +−

6 1 3

2, log

[ ].

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Puede verse así que este sistema buffer requiere un nivel constante de CO3H- y de CO2 para cumplir su función. Esto se logra colocando en la solución de perfusión una concentración determinada de bicarbonato y burbujeándola luego con CO2. Este gas se suministra a través de carbógeno, que es una mezcla que contiene 95% de O2 y el restante 5% de CO2. Como se verá más adelante, el O2 también debe burbujearse dentro de la solución de perfusión, por lo que burbujeando carbógeno se realiza una doble función.

2.2.1.2 El control de la temperatura Como se mencionó previamente, en las experiencias de laboratorio “in vitro” los preparados celulares utilizados deben mantenerse bajo determinadas condiciones de temperatura. En ocasiones se debe mantener dentro de límites estrictos la temperatura de la solución que baña los preparados.

Estrategias para mantener la temperatura

Existen distintas estrategias que para calentar y mantener la temperatura de los preparados. Entre ellas podemos citar :

• Calentamiento directo de la solución: en esta estrategia se usan mantas térmicas, que se enrollan alrededor del recipiente que contiene la solución que necesita ser calentada. Son láminas constituidas por una resistencia eléctrica recubierta con una goma de silicona. Pueden aplicarse con cintas adhesivas o cementos especiales para una fijación permanente. Los modelos comerciales se alimentan con tensión alterna de 120 o 220 V y son capaces de suministrar potencias en un rango de 180 a 1440 W[10]. En función de esto último, su precio oscila entre los 100 y los 480 dólares (en EE.UU.). Necesitan de un controlador adicional, que se vende en forma separada, que provee el control de encendido o apagado según se requiera.

Su ventaja estriba en su sencillez y en su fácil montaje. Como principal desventaja se puede citar que no son capaces de un control fino de la temperatura de la solución que llega al preparado, requisito indispensable para nuestra aplicación. Además son difíciles de conseguir en el mercado local.

• Calentamiento indirecto de la solución: en este caso se hace circular a la solución a calentar a través de tuberías sumergidas en un recipiente que contiene líquido a temperatura controlada. Este elemento, que se denomina comunmente baño termostatizado, está constituido por un recipiente donde se puede alojar el líquido calefactor, un elemento capaz de entregar la potencia requerida y algún sistema para controlar la temperatura. Los modelos comerciales se componen básicamente de un recipiente de acero inoxidable donde se aloja el líquido, que se mantiene a la temperatura deseada mediante una resistencia eléctrica. Los baños están diseñados comunmente para una alimentación de línea (220 ó 110 V de corriente alterna) y vienen en rangos de potencia de 500 a 1500W, de acuerdo a la capacidad de agua que alojan.

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Figura 2-9 : Baño termostatizado comercial de 7 litros de capacidad, 1300 W de potencia. Emplea un

control si-no, con el que mantiene la temperatura alrededor de ±0,4oC de la temperatura prestablecida. Posee un agitador mecánico con el que homogeneiza la temperatura. Su valor de catálogo es de U$S 811. (extraída

de [21])

Como ventaja se puede citar, dependiendo del tipo de control utilizado, que mantienen la temperatura del agua que alojan en valores muy estables. Además son fáciles de conseguir en el mercado local y se le pueden realizar modificaciones para adaptarse a las situaciones particulares. Como desventajas se puede citar que ocupan mucho espacio y no se pueden colocar próximos al lugar de registro porque producen interferencias eléctricas en el sistema de registro.

• Calentamiento directo de la cámara: en este tipo de estrategia se utiliza un sistema que es capaz de mantener la temperatura del preparado, calentando o enfriando en forma directa la cámara donde se encuentra el mismo. Para ello se utilizan los denominados dispositivos de efecto Peltier. Los modelos comerciales manejan rangos de temperatura de -20 a 100oC. Necesitan de un volumen de agua circulando para remover o entregar el calor necesario. Entregan potencias del orden de los 300 a 400 W y vienen con un módulo de control que logra un ajuste muy preciso de la temperatura (±0,1oC). Como desventaja se puede citar que producen interferencias electromagnéticas sobre los sistemas de registro y sólo se puede utilizar para volúmenes pequeños. Debido a esto último su aplicación principal es para el termostatizado de platinas de microscopio, donde los preparados son de pequeño tamaño. Además tienen un elevado costo: aproximadamente de 4000 dólares[11,12].

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Figura 2-10 : Platina termostatizada modelo TS-4 de Physitemp. Tiene capacidad para alojar un cápsula de Petri de 35 mm. El módulo lateral posee los elementos Peltier y la tubería de recirculación de agua. (extraída

de [11])

• Calentamiento indirecto de la cámara: en estos sistemas se utiliza un fluido circulante que es capaz de transferir la energía térmica a la cámara donde se aloja el preparado. El control preciso de la temperatura del preparado se logra haciendo circular líquidos frío y caliente a través de un bloque donde se sostiene la cámara. Utilizando estrategias de control adecuadas, una computadora personal envía las señales de apertura y cierre de distintas válvulas que regulan la mezcla del fluido térmico. En la siguiente figura se puede ver un diagrama en bloques de un sistema comercial.

Figura 2-11 : Diagrama en bloques del sistema de control de temperatura TLC-MI de ALA Science.

(extraída de [13])

El modelo de la figura posee un rango de temperaturas de 4 a 45oC y brinda una precisión en el control de ±0.3oC en el baño del preparado. El sistema incluye la interfase para la computadora, el bloque térmico, los sensores de temperatura (termistores) y los accesorios de conexión. La potencia que maneja es de 250 W para calentamiento y 80 W para enfriamiento. Como ventaja se puede decir que se eliminan los problemas de interferencia electromagnética que existen en los sistemas como los descriptos anteriormente. Como desventaja se puede decir que es un sistema muy complejo para para la precisión que alcanza, a la vez que posee un elevado costo (aproximadamente 5000 dólares)[13].

Controladores de temperatura

En los sistemas que utilizan un elemento calefactor para entregar el calor, para regular la potencia que se suministra al mismo se utilizan diversos sistemas de control de temperatura. Para realizar un control preciso de temperatura se emplean controladores de lazo cerrado, donde en todo instante se trata de mantener la variable controlada (temperatura) cercana a un valor de referencia. En todos ellos se dispone un elemento

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transductor de temperatura que sensa la temperatura del elemento a calentar y desarrolla una señal de error, que es igual a la diferencia entre el valor de referencia y el valor actual. Esta señal de error se realimenta para indicar si debe entregarse potencia o no al elemento calefactor. Pueden utilizarse varias estrategias de control. La diferencia entre ellas está en la forma en que la señal de error es realimentada. Así, por ejemplo, la señal de error puede ser multiplicada por una constante (controlador proporcional), integrada (controlador proporcional-integral), etc.

Los controladores de lazo cerrado más sencillos, los denominados controladores si/no o apagado/encendido, realimentan la señal de error para indicar si se debe encender o no la alimentación del elemento calefactor. Tienen la ventaja de ser de construcción simple, requiriendo de pocos componentes para su implementación. Como desventaja se puede decir que cuando el sistema presenta retardos temporales (o tiempos muertos) el error en estado estacionario toma valores elevados.

Termómetro

El sistema debe contar con un termómetro independiente para indicar en todo momento la temperatura de la cámara que contiene el preparado. Dado que la temperatura se encuentra controlada dentro de márgenes estrechos, el termómetro debe brindar una lectura precisa, con una resolución menor o igual al margen que se está controlando.

2.2.1.3 Perfusión de oxígeno Se debe implementar un sistema para burbujear oxígeno dentro de la solución que baña los tejidos celulares. El oxígeno se burbujea para mantener el metabolismo celular. En los casos que se utilice el Tyrode con buffer bicarbonato, se burbujea con carbógeno, que como se dijo anteriormente está constituido por un 95% de oxígeno y un 5% de CO2 .

2.2.2 Sistema óptico Comprende los medios destinados a visualizar la preparación. Por el tamaño de los preparados se puede usar un microscopio binocular o lupa de disección con un sistema auxiliar de iluminación. El rango de magnificación que se necesita es relativamente bajo, extendiéndose desde 6X hasta 50X.

La lupa puede apoyarse sobre la base que trae de fábrica, o bien puede atornillarse a la superficie de trabajo. Es conveniente que se la pueda mover para acceder fácilmente a la cámara experimental o para su limpieza.

La iluminación del preparado debe realizarse preferentemente con lámparas halógenas, que pueden alimentarse a través de tensión continua y proporcionan una luz blanca lo suficientemente intensa. La iluminación puede implementarse mediante una variedad de sistemas disponibles comercialmente. En algunos sistemas la luz se trasmite hacia el sitio a iluminar a través de fibras ópticas. Poseen una fuente de alimentación de tensión continua o alterna y se puede variar en forma continua el nivel de iluminación. En lo posible se recomienda utilizar sistemas que permitan colocar la fuente de alimentación fuera de la jaula de Faraday, para evitar las interferencias electromagnéticas sobre el sistema de registro (la función de la jaula de Faraday se discutirá en detalle más adelante, en el apartado 2.2.4.2)

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2.2.3 Sistema mecánico El sistema mecánico comprende todos los medios destinados a posicionar de manera estable el microelectrodo y el preparado. Las vibraciones que se transmitan a la punta del microelectrodo, cuando éste se halla insertado en el interior de una célula, pueden provocar interferencias en los registros que se estén llevando a cabo. Si las vibraciones son de baja amplitud (décimas de micrómetros), pueden introducir ruido en los registros debido a un fenómeno piezoeléctrico, producido en el vidrio del microelectrodo cuando el mismo es sometido a pequeñas deformaciones. Si en cambio las vibraciones son de mayor amplitud (del orden de unos pocos micrómetros) pueden provocar la rotura del microelectrodo o de la célula sobre la que se está llevando a cabo el registro, con la consiguiente interrupción del mismo y las pérdidas de tiempo que esto genera, ya que hay que recambiar el microelectrodo y buscar otro sitio para la inserción.

El sistema antivibratorio por lo general comprende la implementación de una superficie de trabajo libre de vibraciones, así como también un sistema de soporte para el microelectrodo que permita moverlo con facilidad y otorgue una rigidez adecuada. A continuación se describen las características que deben poseer cada uno de los componentes del sistema mecánico.

2.2.3.1 Mesa antivibratoria La superficie de trabajo y las estructuras de acoplamiento entre ésta y el suelo constituyen en conjunto la denominada “mesa antivibratoria”. Las características de una mesa antivibratoria están dadas por las de los elementos que la constituyen y fueron descriptas en los párrafos precedentes. Por lo tanto, en este apartado se realizará una breve descripción de las principales particularidades de los modelos comerciales de las mesas antivibratorias.

Modelos comerciales

Existen varios modelos comerciales de mesas antivibratorias (en la Figura 2-12 se muestra un modelo de mesa antivibratoria comercial). Se puede realizar una clasificación de las mismas de acuerdo al tipo de soporte con el que vienen provistas:

• Mesas con soportes pasivos: poseen aisladores neumáticos sobre las que se apoya la superficie de trabajo. Los aisladores están constituidos por un diafragma de goma sostenido por un cilindro rígido lleno con aire. Poseen frecuencias naturales de resonancia muy bajas (comunmente 1 o 2 Hz). Por encima de estos valores de frecuencia, las vibraciones se atenúan en forma abrupta.

• Mesas con soportes activos: los aisladores pasivos presentan un comportamiento pobre a muy bajas frecuencias, sobre todo en el valor de la frecuencia de resonancia, donde se produce una pequeña amplificación de las vibraciones. Para solucionar esto, se han diseñado soportes que emplean un sistema activo de cancelación de las vibraciones. Mediante sensores se miden las vibraciones producidas y se produce una realimentación sobre actuadores apropiados a fin de cancelar las mismas. Alcanzan así frecuencias de resonancia horizontal menores a 1 Hz.

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Figura 2-12 : Mesa antivibratoria para registros electrofisiológicos de la firma Intracel[14]. La superficie de trabajo está construida por un núcleo en “panal de abejas” entre dos planchas de acero inoxidable de 5 mm

de espesor. Los aisladores de soporte son pasivos y pueden llenarse con aire o nitrógeno a presión. (extraída de [14])

2.2.3.2 Micromanipulador El propósito de este apartado no es realizar una descripción exhaustiva acerca del funcionamiento de los micromanipuladores, sino más bien mencionar cuáles son las características principales que han de tenerse en cuenta a la hora de escoger un micromanipulador para este tipo de aplicación.

Para registrar los potenciales de acción hay que posicionar el microelectrodo dentro las células. En primer lugar se realiza una aproximación “gruesa” hasta las estructuras donde se pretende realizar la penetración, para lo cual el microelectrodo debe poder moverse dentro de rangos de 20 a 40 mm. Una vez escogido el sitio, se lleva a cabo la inserción del microelectrodo en el tejido, hasta alcanzar el interior de una célula (más adelante se explicará en detalle este procedimiento). Teniendo en cuenta las dimensiones de las células (largo 50 a 100 µm ; diámetro 5 a 20 µm), está claro que el movimiento del micromanipulador deberá poseer una resolución del orden de unos pocos micrómetros. Esto último es importante sobre todo en la dirección axial del microelectrodo, a través del cual se realiza la penetración. En el caso más común, este es el eje X del micromanipulador, el cual debe poseer un movimiento fino con resolución menor al diámetro de la célula.

Otro de los requisitos importantes que debe satisfacer el micromanipulador es el de proveer un posicionamiento rígido y estable para el microelectrodo; esto es, no debe presentar desplazamientos relativos ni deriva lenta (“drift”) a partir de su posición de reposo.

Para el posicionamiento de los electrodos de estimulación, pueden usarse micromanipuladores de características menos exigentes en cuanto a la resolución y a la estabilidad, los que por ende resultan más económicos.

Los micromanipuladores que existen hoy en día en el mercado son capaces de satisfacer los requerimientos antes mencionados, superándolos en la mayoría de los casos. Los mas sencillos utilizan transmisión manual de los movimientos y el mecanismo es totalmente mecánico. Existen otros modelos impulsados mediante motores paso a paso, mecanismos hidráulicos o piezoeléctricos. La transmisión de los movimientos se puede controlar a distancia a través de un pequeño teclado o con un joystick[26,29].

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2.2.3.3 Elementos de fijación Una forma adicional de controlar las vibraciones consiste en maximizar la rigidez de los sistemas de soporte del microelectrodo y de la cámara donde se encuentra el preparado. Además, es necesario eliminar cualquier movimiento relativo entre estos dos componentes y la superficie de trabajo. Esto involucra el uso de soportes firmes para el micromanipulador y para la cámara donde se coloca el preparado.

Existen numerosos sistemas que permiten la fijación del micromanipulador a la superficie de trabajo. Los mismos pueden ser sujetados desde varillas metálicas, las que a su vez se fijan a la superficie de trabajo. La fijación puede llevarse a cabo atornillando directamente las varillas a la superficie de trabajo. Otro método consiste en utilizar bases de fijación magnética, cuando la superficie de trabajo es de un material ferromagnético.

2.2.4 Sistema para el registro analógico de la señal El sistema para el registro analógico provee todos los medios necesarios para capturar, acondicionar y visualizar la señal. Un sistema de registro analógico completo debe estar constituido por un microelectrodo, un amplificador de señal, un estimulador, un osciloscopio. También es necesario contemplar un sistema para eliminar las interferencias eléctricas (jaula de Faraday y puestas a tierra).

2.2.4.1 Microelectrodos Los microelectrodos representan los elementos “transductores” del sistema de registro y debido a sus características particulares merecen un tratamiento separado.

Los microelectrodos intracelulares están formados por un alambre de Ag metálica recubierto con AgCl, colocado en el interior de una micropipeta de vidrio llena con una solución electrolítica. Esta solución provee una conexión desde la célula hasta el electrodo. Así, los “electrodos” de vidrio no son más que conductos de geometría apropiada que sirven para establecer la conexión. Por esta razón, se utiliza el término micropipeta para el conducto de vidrio solo (ver Figura 2-13). Cuando se llena con la solución electrolítica y se provee un conexión mediante un electrodo de Ag/AgCl, se los denomina microelectrodos.

Figura 2-13: Las partes de una micropipeta. (adaptada de [42])

Propiedades físicas generales

La precisión con la cual las mediciones pueden ser llevadas a cabo usando microelectrodos, muchas veces está limitada por las propiedades físicas que estos poseen. Es necesario entonces conocer las propiedades físicas de los microelectrodos y tener en cuenta cómo estas propiedades pueden afectar los registros. A continuación se describen brevemente las más importantes. Una discusión más detallada puede encontrarse en las referencias [42] y [15].

• Forma y tamaño

Como se verá más adelante, la forma de las micropipetas depende mucho del tipo de vidrio empleado y del procedimiento de estiramiento. Por lo general, las micropipetas que se

punta

espina

hombro

1 mm

31

fabrican para los microelectrodos intracelulares, tienen una forma aproximadamente cónica en la región de la punta. La resistencia eléctrica es uno de los parámetros que más depende del ángulo subtendido por el cono y la relación diámetro externo/diámetro interno en la punta.

La característica más importante de un microelectrodo es el diámetro de la punta. Para evitar el daño en la célula sobre la que se pretende realizar el registro, se necesita que éste sea menor o igual al 0,5% del diámetro de la célula. Las células nodales tienen diámetros que oscilan entre 5 y 10 µm, y las células miocárdicas contráctiles entre 10 y 20 µm. Esto establece que pueden ser penetradas a lo sumo por microelectrodos de 0,05 µm y 0,1 µm de diámetro en la punta respectivamente. Estos tamaños están por debajo del límite de resolución de los microscopios ópticos. Por lo tanto para obtener una imagen de la punta se recurre al uso de microscopía electrónica de barrido (SEM).

Figura 2-14 : Fotografía tomada con un microscopio electrónico de barrido (magnificación x40000) de la

punta de una micropipeta estirada con el equipo Sutter P-97 (foto provista por el fabricante del equipo)

• Resistencia eléctrica

Debido a la poca facilidad que existe para observar las puntas de las micropipetas a través de la microscopía óptica, la resistencia eléctrica del microelectrodo se vuelve el parámetro más importante para caracterizarlo. Una “regla de oro” establece que cuanto más pequeño sea el diámetro de la punta, mayor será la resistencia. Una resistencia muy elevada afecta el potencial de punta del microelectrodo, genera más ruido e incrementa la constante de tiempo del circuito. Por lo tanto, se puede ver que existe un compromiso entre lograr una resistencia baja y a la vez una punta larga, flexible y con diámetro pequeño.

• Comportamiento mecánico

Se puede decir que las micropipetas que poseen una punta más larga y fina son muy flexibles. Por el contrario, aquellas con punta corta y gruesa resultan muy rígidas. Las micropipetas usadas para el registro intracelular de células cardíacas deben poseer puntas flexibles para no quebrarse cuando el tejido se contrae mecánicamente.

0,5 µm

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Circuito eléctrico equivalente[15]

La Figura 2-15(a) representa a un microelectrodo insertado en el interior de una célula para la medición de los potenciales de acción. La parte (b) de la figura esquematiza el circuito equivalente de esta situación. Tanto el electrodo interno a la micropipeta como el electrodo de referencia pueden ser representados por una resistencia en paralelo con un capacitor, ambos en serie con una pila que representa el potencial de unión electrodo-electrolito. A partir del electrodo interno de la micropipeta se encuentra una resistencia Rl correspondiente a la resistencia del electrolito. Conectado a ella se encuentra la capacitancia distribuida Cd correspondiente a la capacitancia a través de la pared del vidrio. Luego se presentan dos potenciales, asociados con la punta de la micropipeta : un potencial de unión líquida (Ej) que se establece debido a la diferencia de concentración ente el electrolito y el fluido intracelular y otro potencial “de punta” (Et) que se produce debido a que el vidrio de la punta se comporta al igual que un electrodo de membrana de vidrio. El circuito equivalente presenta además las resistencias de los fluidos intracelular (Ri) y extracelular (Re), las que se hallan acopladas al microelectrodo a través de la capacitancia distribuida.

Figura 2-15 : (a) Esquema representando un microelectrodo insertado en el interior de una célula. (b) Circuito equivalente para esta misma situación. Las referencias están en el texto. (adaptada de [15])

El circuito equivalente representado en la figura precedente puede ser simplificado, despreciando algunos componentes y agrupando los parámetros más relevantes. Así, las resistencias de los conductores Rma y Rmb, las resistencias de los fluidos intra y extracelular pueden ser despreciadas, ya que la mayor contribución a la resistencia total está dada por la resistencia Rl de la micropipeta, que se halla en el orden de 1 a 100 MΩ. La capacitancia de los electrodos metálicos puede despreciarse y la capacitancia distribuida puede agruparse en un único capacitor. Todos los potenciales pueden también agruparse en una única fuente. El circuito simplificado es el más empleado para describir el comportamiento de los microelectrodos. El mismo se esquematiza en la Figura 2-16 .

BA

Rma Cma

Ema

Rl

Cd

CmbRmb

Ej

EmbEt

ReRi Em

B

Rl

Cd

al amplificadorA

alambre deconexión

soluciónelectrolítica

micropipeta

líquidoextracelular

célulaelectrodo de

referencia

citoplasma

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Figura 2-16 : Circuito equivalente simplificado del microelectrodo insertado en el interior de una célula. Em representa el potencial de membrana (o de acción), Cd la capacitancia total distribuida, Rl la resistencia del

microelectrodo y Eeq la sumatoria de los potenciales de unión líquida, de punta y de las interfases electrodo-electrolito (adaptada de [15]).

Electrodo de referencia

Para medir la diferencia de potencial entre dos puntos se necesita tener un segundo electrodo, en este caso en el medio extracelular. El electrodo colocado en el baño se conoce como electrodo indiferente o electrodo de referencia. Un método muy difundido consiste en colocar como electrodo de referencia un alambre de Ag/AgCl.

Vidrio utilizado en la fabricación de micropipetas

Los vidrios utilizados para la fabricación de las micropipetas de vidrio pueden ser clasificados en base a sus constituyentes químicos principales, de acuerdo a su temperatura de ablandamiento o bien a sus propiedades eléctricas. Los vidrios más difundidos para la fabricación de microelectrodos se detallan en la siguiente tabla :

Tabla 2-I : Propiedades eléctricas y térmicas de los diferentes vidrios Corning. (modificado de[16])

Vidrio Constante dieléctrica

Temperatura de ablandamiento (oC)

Descripción

7490 3,8 1580 cuarzo

7760 4,5 780 borosilicato

0080 7,2 695 carbonato de sodio

Fabricación de las micropipetas

Las micropipetas se fabrican a partir de tubos capilares de vidrio, mediante un equipo especial denominado estirador de micropipetas. Existe una gran variedad de equipos estiradores comerciales, los que van desde modelos reativamente simples, con controles manuales, hasta modelos más sofisticados, controlados por microprocesador. En todos ellos, el tubo de vidrio se coloca en entre dos mordazas, muy próximo a un filamento destinado al calentamiento. Un vez fijado el tubo, se ejerce un fuerza de tracción sobre el mismo, a la vez que se aplica una corriente eléctrica al filamento, que eleva la temperatura del vidrio y comienza a ablandarlo. Cuando esto ocurre, las mordazas comienzan a

Rl

A

Cd

B

Eeq

Em

Er

RmCm

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separarse gradualmente, la parte central del tubo se estira y se vuelva más delgada. En la mayoría de los estiradores (los denominados de dos etapas), se activa un interruptor cuando el vidrio llegó a estirarse hasta una determinada longitud. Este interruptor activa un mecanismo que provoca un súbito tirón entre ambas mordazas, provocando finalmente la separación del tubo en dos partes, las que constituyen las dos micropipetas.

Llenado de las micropipetas

Los microelectrodos se llenan usualmente con soluciones concentradas de KCl (3M). Esto se debe en primer lugar a que el K+ y el Cl- tienen movilidades similares, lo cual reduce el valor del potencial de unión líquida. Para soluciones con igual composición pero con distinta actividad, el potencial de unión líquida está dado por la expresión :

EjRTF

aa

=+

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟+ − −

+ −

µ µµ µ

. ln'' '

donde Ej representa el potencial de unión líquida, µ+ y µ- la movilidad de los iones positivos y negativos respectivamente, R la constante universal de los gases ideales, T la temperatura absoluta, F la constante de Faraday, a’ y a” las actividades de las soluciones a ambos lados de la unión. Puede verse así que si las movilidades son similares, el potencial Ej será pequeño. Por otra parte, la existencia de una alta concentración de iones en la punta del microelectrodo le otorga al mismo una baja resistencia eléctrica.

El llenado de las micropipetas con solución electrolítica representa una tarea dificultosa, debido al flujo viscoso del aire que debe ser expulsado. De acuerdo a la relación de Hagen-Poiseuille, la resistencia viscosa que presenta un tubo cilíndrico es inversamente proporcional a la cuarta potencia del radio. En un tubo cónico de longitud suficiente, la resistencia viscosa es inversamente proporcional a la tercera potencia del radio, pero aún así la resistencia en contra del flujo a través de una micropipeta es muy elevada. Existen varios métodos para el llenado de las pipetas cada una de las cuales recurre a una técnica diferente[42]. Se diferencian principalmente de acuerdo al tiempo que se tarda para el llenado de las micropipetas, tardándose desde un par de días en algunos hasta unos pocos segundos en otros. En la siguiente figura se pueden ver algunos de ellos.

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Figura 2-17 : Ilustración de algunos métodos para el llenado de las micropipetas. (a) Directamente a través de la punta. Si bien es sencillo, resulta muy lento (b) Directamente a través del vástago, con una jeringa y a presión. Resulta relativamente lento y requiere cierta destreza manual. (c) Por ebullición, calentando a 70-

80oC la solución de agua y metanol dentro del matraz y aplicando luego vacío por el tubo auxiliar. Requiere de un procedimiento complicado y el calor puede dañar las puntas. (d) Por destilación, donde moléculas de agua pura difunden hacia la punta llenándola. Al igual que el primero, resulta muy lento. (e) Por fibra de

vidrio, en la figura se muestran los conductos hidráulicos a cada lado de la fibra. (f) Por fibra de vidrio, en esta figura se muestra el mecanismo de transporte de la burbuja.(extraída de [42])

El método más difundido para el llenado de las micropipetas es el que utiliza la fibra de vidrio interna, ya que sólo se tardan unos pocos segundos para llenar las mismas. Los capilares de vidrio usados para su fabricación poseen una fibra de vidrio de unos 20 µm de diámetro en la pared interna de la pipeta y se los conoce como vidrios “omega dot” por la forma particular que posee su perfil. Su funcionamiento se basa en la existencia de dos conductos hidráulicos (Figura 2-17-e) a ambos lados de la fibra que permiten que la solución avance hacia la punta, transportando en forma simultánea las burbujas de aire en sentido opuesto (Figura 2-17-f).

2.2.4.2 Preamplificador Esta parte del instrumento posee funciones muy importantes. Aunque su nombre lo indique, no necesariamente se produce una amplificación del voltaje de entrada en esta etapa. Sus funciones principales son :

• Debe conducir la señal de entrada (voltaje de membrana) hacia la siguiente etapa del circuito sin introducir ninguna modificación a la misma, es decir con ganancia unitaria dentro de la banda de interés de la señal. Es el tipo de circuito conocido comunmente como “seguidor de voltaje”. (antiguamente “seguidor por emisor” en los circuitos de transistores).

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• Debe prevenir que fluya un valor de corriente elevado a través del microelectrodo.

Especificaciones:

Para describir con mayor detalle cómo se alcanzan estos requisitos, se brinda a continuación una lista de especificaciones que definen a un preamplificador para registro intracelular :

1. Corriente de bias: es la corriente que fluye del terminal de entrada en ausencia de señal aplicada. Debido a que esta corriente atravesará el microelectrodo se necesita que su valor sea pequeño, de lo contrario se produciría un voltaje muy grande a la entrada del amplificador. Si se tolera como máximo un aumento de voltaje de 1 mV y el microelectrodo puede tener una impedancia de hasta 100MΩ, la corriente de bias no debe ser mayor a 10 pA. (ver Figura 2-18)

Figura 2-18 : Efecto de la corriente de bias sobre el voltaje de salida en ausencia de señal aplicada. El sentido de circulación indicado por las flecha es arbitrario.

2. Resistencia de entrada: este parámetro también mide cuánto se opone el preamplificador a que fluya corriente a través de él, en este caso cuando se le aplica un voltaje a la entrada. Normalmente se busca que la resistencia de entrada del preamplificador sea de 100 a 1000 veces superior a la resistencia del microelectrodo (1010 a 1011 Ω). Actualmente los dispositivos con entradas FET presentan muy poco inconveniente en alcanzar valores superiores a 1012 Ω.

Figura 2-19 : Efecto de la impedancia de entrada del amplificador sobre la señal. Como puede verse, si se logra que Rin>>RµE, se tiene que Vi≈Em.

3. Tiempo de establecimiento: esta especificación mide la velocidad con la cual el preamplificador puede seguir señales de variación rápida. El tiempo de establecimiento (ts) es el tiempo requerido para que la salida pase de un 10% a un 90% de su valor final, luego de aplicar un escalón de voltaje en la entrada. Un valor aceptable para ts es 1/(5*fmax), donde fmax es el valor de la mayor componente frecuencial de la señal bajo estudio. El tiempo de establecimiento debe especificarse para valores de resistencia de microelectrodo razonables, por lo general 10 ó 20 MΩ.

4. Rango dinámico de entrada: es el rango de voltajes de entrada con los que trabaja el preamplificador. Por lo general se trabaja con rangos superiores a ±2 V.

Vi Vo

IbiasRµE

x1

Vo = Vi = RµE * Ibias

VoVi

RinRµE

Em

Vo=Vi = Em* Rin Rin+RµE

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5. Deriva y estabilidad : son especificaciones que se dan en diferentes maneras de acuerdo a cada fabricante. Pueden estar expresadas en unidades de voltaje sobre tiempo o sobre temperatura. Un valor aceptable para la deriva térmica debe ser menor a 200 µV/oK.

6. Ancho de banda : esta especificación se expresa en términos de la frecuencia de corte del preamplificador, que es el valor de frecuencia para el cual la amplitud de la salida del mismo cae 3 dB con respecto a su valor a bajas frecuencias. Hay que diferenciar entre el ancho de banda propio del preamplificador (usualmente del orden de los MHz) y el ancho de banda del circuito limitador adicional (un filtro pasabajo) que poseen algunos circuitos. Por lo general, los fabricantes de este tipo de equipos especifican el ancho de banda con respecto al filtro pasabajo incorporado, el cual posee a su vez varias frecuencias de corte. Esto permite establecer el ancho de banda acorde con las necesidades particulares de cada tipo de registro.

7. Amplitud de ruido : es un parámetro que se utiliza para cuantificar la magnitud de ruido introducido en la señal por el preamplificador y se mide en la salida del mismo cuando la entrada se encuentra conectada a tierra. Algunos fabricantes especifican su valor para una resistencia conectada entre la entrada y tierra, lo que introduce una fuente de ruido adicional. La amplitud de ruido puede expresarse en valores de voltaje pico a pico (p-p) o eficaces (rms), los que a su vez dependen del ancho de banda del preamplificador. Una especificación aceptable es de 200 µV (rms) para un ancho de banda de 10 kHz.

8. Velocidad de cambio (slew rate) : este parámetro expresa la razón de cambio del voltaje de salida del amplificador, cuando éste funciona en la región activa normal, en respuesta a un escalón en la señal de entrada que provoca una salida próxima a la saturación. Su valor se indica en V/seg. En este caso, por tratarse de un amplificador con ganancia unitaria que nunca se encuentra cercano a las condiciones de saturación, este parámetro no se tiene en consideración.

2.2.4.3 Guarda electrostática El circuito equivalente del microelectrodo conectado a la entrada del amplificador está representado por una resistencia en paralelo con un capacitor. En la parte (a) de Figura 2-20 se muestra el circuito equivalente, en el cual la resistencia total es prácticamente la del microelectrodo y la capacitancia distribuida está compuesta de tres componentes : la capacidad del microelectrodo y las capacitancias parásitas del cable de conexión y del circuito de entrada.

Tal como se mencionó, la presencia de estas capacidades parásitas trae aparejado un efecto indeseable de filtro pasa bajo, disminuyendo de manera considerable el tiempo de establecimiento de la señal. Este último toma un valor de aproximadamente 2,2*Rµe*Ctot. Por lo tanto la premisa consiste en hacer que la resistencia y la capacitancia distribuida tomen valores pequeños. Para ello existen varias recomendaciones, entre ellas usar microelectrodos de baja resistencia, no colocar los preparados muy profundamente para no sumergir demasiado la punta de la pipeta en la cámara y minimizar el trayecto del cable de conexión del microelectrodo al preamplificador. Las dos primeras recomendaciones se satisfacen fácilmente, pero la tercera requiere que el circuito del preamplificador sea montado y encapsulado próximo al microelectrodo.

Un método adicional de reducir la capacitancia distribuida es la llamada “guarda electrostática”. El principio que se aplica es el siguiente : cuando las placas de un capacitor son sometidas al mismo potencial no se produce flujo de carga alguno en el mismo. En la Figura 2-20(b) puede verse el efecto de colocar un blindaje conectado a tierra alrededor del

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cable de conexión del microelectrodo. El efecto es retrógrado, ya que si bien se elimina la capacitancia Cs, se la reemplaza por una mucho mayor Cc. Si en lugar de ello se adopta el conexionado de la Figura 2-20(c), se observa que el efecto de la capacitancia desaparece ya que ambas placas se encuentran siempre al mismo potencial.

Figura 2-20 : Desarrollo de la guarda electrostática. (a) Los tres componentes de la capacitancia total

distribuida del circuito de entrada. (b) Una guarda a tierra elimina Cs pero la reemplaza por una capacidad mucho mayor Cc..(c) La guarda es mantenida al mismo potencial que la entrada. (extraído de [42])

2.2.4.4 Compensación de capacitancia Para eliminar la capacitancia distribuída algunos preamplificadores proveen lo que se denomina circuito de compensación de capacitancia. El principio que se utiliza es la realimentación positiva de una parte de la señal de salida a través de un capacitor (ver figura siguiente). De esta forma, se coloca un valor “negativo” de capacitancia en paralelo con la capacitancia total distribuida y ésta puede ser disminuida[42].

Figura 2-21 : Circuito de compensación de capacidad

C≈12pF

-

+Vo

RµE ≈10M

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2.2.4.5 Circuito amplificador Esta parte del circuito de registro es la encargada de acondicionar la señal proveniente del preamplificador. Su misión es la de amplificar dicha señal (de ahí su nombre) aunque también cumple con otras funciones. A continuación se describen las características que debe poseer, de acuerdo a la función específica :

Amplificación de la señal a los niveles requeridos por la etapa siguiente : la señal de los potenciales de acción se encuentra en un rango de aproximadamente -100 a +50 mV, A los fines de visualizar la misma, no es necesario proveer amplificación, ya que los instrumentos utilizados comunmente pueden manejar estos rangos. Sin embargo, si se quiere digitalizar la señal para poder almacenarla, será necesario amplificarla para poder aprovechar al máximo la resolución del sistema de conversión analógico/digital (esto se discutirá con más detalla en el apartado 2.2.5)

Corrección del voltaje de offset : como se mencionó previamente, existen una serie de potenciales de offset asociados con la técnica de medición, que aparecen sumados al potencial de membrana que se desea registrar. Se requiere entonces que el circuito amplificador tenga la posibilidad de compensar la presencia de tales potenciales, en un rango de aproximadamente ±200 mV.

Limitador del ancho de banda de la señal : esta sección del circuito se implementa a través de un filtro pasabajo y tiene como finalidad reducir el ancho de banda de la señal antes de ingresarla a la placa conversora. De esta forma se evita el “aliasing” que se produciría si están presentes en la señal componentes frecuenciales que estén por encima de la frecuencia de Nyquist. Este tipo de filtro pasabajo también recibe el nombre de “filtro antialiasing”. De acuerdo a la función de transferencia que lo representa, existen muchos tipos de filtros, cada uno de los cuales posee características que lo hacen más apropiado para una aplicación en particular. Para señales que se analizan en el dominio del tiempo, como es el caso de los potenciales de acción, se recomienda el uso de los filtros Bessel[16], ya que poseen una respuesta al escalón sobreamortiguada. Esto implica que las señales no son distorsionadas al pasar por el filtro. El inconveniente de los filtros Bessel es que presentan una transición suave entre las bandas de paso y de rechazo, por lo que para lograr una separación más abrupta se necesita incrementar el orden del filtro. Un filtro Bessel de orden 4 resulta suficiente para este tipo de aplicación.

Medición de la resistencia del microelectrodo : La medición de la resistencia del microelectrodo resulta útil para verificar el estado del mismo durante la realización de los experimentos. Para ello se utiliza el denominado método de inyección de corriente constante. Se envía una corriente de valor conocido a través del microelectrodo, lo que provocará una diferencia de potencial a la entrada del circuito de medición proporcional a la resistencia. Usualmente los equipos proveen un botón pulsador mediante el cual se activa un circuito que inyecta 1 nA, lo que resulta un valor de 1mV/MΩ. El mismo puede ser leído en el voltímetro asociado al sistema de registro.

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Figura 2-22 : Esquema funcional del método de inyección de corriente constante para la medición de la

resistencia del microelectrodo. (extraído de [42])

2.2.4.6 Estimulación del preparado En la mayoría de los experimentos es necesario iniciar los potenciales de acción mediante estímulos a intervalos controlados. La excepción a esto es el estudio de actividad espontánea, como es el caso del nódulo sinusal. La iniciación regular de los potenciales de acción se logra a través de la estimulación de los tejidos con estímulos eléctricos. Los esímulos pueden ser aplicados tanto intra como extracelularmente. A continuación se mencionan las principales características de cada uno de los métodos.

• Estimulación intracelular: se realiza a través de un microelectrodo de estimulación, que es constructivamente idéntico al utilizado para el registro. En los preparados multicelulares, debe utilizarse un mismo microelectrodo para cumplir ambas funciones. Para estimular una célula aislada es necesario inyectar una corriente despolarizante, que es del orden de unos pocos nA. Debido a las conexiones de baja resistencia existentes entre los miocitos en un tejido, se requiere una cantidad de corriente más grande para los preparados multicelulares, tanto mayor cuanto más grande sea el preparado. El pulso de voltaje necesario se relaciona tanto con el valor de corriente a inyectar como con el de resistencia del microelectrodo. Si por ejemplo se debe inyectar un pulso de corriente de 100 nA a través de un microelectrodo de 10 MΩ, es necesario aplicar un pulso de 1V. Este pulso produce un artefacto considerable sobre el registro si no se toman las medidas para eliminarlo. Los dispositivos modernos poseen circuitos electrónicos que desconectan la entrada del preamplificador durante la aplicación del estímulo. Este método está limitado por los tamaños del preparado, por lo que se usa preferentemente en los registros de potenciales de acción de células aisladas.

• Estimulación extracelular: se utiliza con mayor frecuencia para la estimulación de preparados multicelulares. Se establece un diferencia de potencial entre dos electrodos metálicos que están en contacto con la superficie del preparado, lo que produce la despolarización de las células y la iniciación de un potencial de acción que se propaga a través de todo el tejido. Para minimizar la amplitud de los artefactos introducidos en el electrodo de registro por acople capacitivo, los dos electrodos se colocan muy próximos entre sí (1 o 2mm), lo que produce un campo de estimulación muy localizado. Adicionalmente los conductores que llevan la señal hasta los electrodos y los propios electrodos se trenzan entre sí, dejando separadas solamente las puntas. Como los electrodos no pueden tocarse entre sí, una solución constructiva consiste en fabricar los electrodos con alambres de plata teflonada, a la que se le quita la aislación en la punta.

El electrodo se posiciona en la superficie del preparado con la ayuda de un micromanipulador. No es necesario que los electrodos entren en contacto con el tejido,

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ya que los potenciales de acción pueden ser iniciados aún cuando los electrodos están ubicados muy próximos al preparado (<1mm). De esta manera se evita el daño que se produce por el contacto mecánico sostenido.

Otra forma de aplicar el estímulo en forma extracelular es a través de la llamada “estimulación de campo”. En este caso se utilizan dos electrodos extensos y alejados del tejido a los que se les aplica una diferencia de potencial que produce un campo eléctrico dentro de la totalidad de la cámara experimental. Esto permite estimulación de preparados pequeños, sin el riesgo de daños mecánicos que causan los electrodos de contacto. Sin embargo, puede mencionarse como desventaja que la estimulación de campo activa en forma extensiva los terminales nerviosos del tejido, lo que induce una liberación sustancial de neurotransmisores durante la estimulación.

Los distintos tipos de estimulación recién descriptos necesitan de un equipo estimulador electrónico. La forma de estímulo más común generada por estos aparatos consiste en un pulso rectangular. Se puede estimular a tensión o a corriente constante. La mayoría de los estimuladores poseen controles para el intervalo entre estímulos, la duración de cada estímulo y la amplitud del mismo.

2.2.4.7 Eliminación de interferencias La interferencia o ruido presente en el sistema de registro puede deberse a una variedad de causas, principalmente a la presencia de campos eléctricos y magnéticos. Otra causa común de interferencias son los instrumentos conectados a tierra en forma inadecuada. A continuación se discuten algunos aspectos fundamentales a tener en cuenta para la eliminación de las interferencias eléctricas.

Interferencias por campos eléctricos : debido a la alta impedancia del circuito de entrada, las interferencias por acople capacitivo desde conductores que están a un potencial diferente que el microelectrodo se vuelven considerables. Una forma de reducir la interferencia es interponer un material conductor conectado a tierra entre la fuente de interferencia y el microelectrodo. En forma práctica esto se consigue “encerrando” al circuito de registro dentro de la denominada jaula de Faraday. La jaula de Faraday puede construirse con mallas de alambre conductor, montadas en estructuras apropiadas, o mediante hojas de aluminio. Para proveer un blindaje eléctrico efectivo la jaula de Faraday debe estar conectada al mismo punto de tierra que se utilice para los instrumentos electrónicos (la puesta a tierra se discute en detalle más adelante).

Interferencias por campos magnéticos : Los transformadores o motores colocados próximos al sistema de registro, producen líneas de flujo disperso que puede inducir una fuerza electromotriz en los conductores del circuito de registro. Para solucionar este inconveniente hay que evitar la colocación de este tipo de fuentes de interferencia próximas al sitio de registro, blindar magnéticamente mediante el uso de pantallas y evitar la presencia bucles en los cables de registro[42].

Puestas a tierra defectuosas o incorrectas : Los instrumentos electrónicos deben conectarse a una masa común, para minimizar la interferencia de 50Hz. La jaula de Faraday, la lupa binocular, la superficie de al mesa antivibratoria y las bases magnéticas deben ser conectadas a una masa común. Se recomienda construir un terminal central de tierra, constituido por conectores tipo “banana”, donde se puedan conectar todos los instrumentos indicados. De esta forma el potencial de tierra de todos los instrumentos es el mismo. Esto evita que se produzcan corrientes eléctricas entre los instrumentos que se encuentran operando con potenciales de referencia diferentes : los denominados bucles de

42

tierra. También es importante la conexión de el tercer conductor de los cables de alimentación de los instrumentos, el que además de proveer un blindaje adicional en los equipos, debe estar presente por una cuestión de seguridad del personal[42].

2.2.4.8 Voltímetro El voltímetro es uno de los dispositivos de salida del sistema, que permite medirr el valor medio del potencial registrado por el microelectrodo. Es útil para visualizar el valor del potencial de punta del microelectrodo cuando el mismo se halla sumergido dentro del baño, antes de penetrar al preparado. Se puede así compensar muy precisamente a cero este potencial mediante el control de offset descripto precedentemente. Además sirve para mostrar el valor de la resistencia del microelectrodo cuando se acciona el pulsador de inyección de corriente. Se recomienda el uso de voltímetros digitales, con una resolución de 3 y ½ dígitos, para permitir la visualización de potenciales en un rango de ±199.9 mV[42].

2.2.4.9 Osciloscopio El osciloscopio es otro de los dispositivos destinados a la salida de la señal de los potenciales de acción en tiempo real. El único requisito importante es la capacidad que debe poseer el instrumento de poder visualizar la señal de tan baja repetitividad como los potenciales de acción (≤3Hz aproximadamente). Para ello hay que usar un osciloscopio digital, ya que con uno analógico el trazo para señal de tan baja frecuencia desaparece muy rápidamente de la pantalla impidiendo su correcta visualización. Existen modelos de osciloscopios con memoria analógica, pero su precio es extremadamente caro.

2.2.5 Sistema de adquisición digital de la señal Hasta aquí se han discutido los componentes del sistema de registro que permiten una visualización en tiempo real de las señales provenientes del amplificador. Sin embargo es necesario contar con un sistema de captura que permita su almacenamiento y facilite el posterior procesamiento y análisis. Para ello se emplea un sistema de adquisición, constituido por dispositivos físicos (hardware) y por programas (software). El hardware esta compuesto por una computadora personal (PC-IBM compatible) y una placa conversora analógico-digital (A/D). El software está compuesto por el sistema operativo y el programa específico para realizar el manejo de los datos.

2.2.5.1 Requisitos del hardware

1. PC :

Las características fundamentales que deben considerarse para definir la PC necesaria para esta aplicación son las siguientes : Tipo de placa madre (motherboard), velocidad del microprocesador, capacidad de almacenamiento del disco rígido, capacidad de memoria RAM, tipo de adaptador de video y tipo de monitor. También hay que considerar el tipo de unidades de disquette y de CD-ROM necesarias, si se requiere impresora, mouse y otros dispositivos periféricos[16]. Para poder definir estas características habrá que tener en cuenta el sistema operativo que se escogerá para el manejo de la PC. También habrá que considerar los requisitos particulares del software de adquisición y de la aplicación que se está desarrollando, como ser necesidades de almacenamiento, de salida de datos por impresora, etc.

2. Placa conversora A/D :

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La placa conversora o placa de adquisición, es la encargada de transformar las señales provenientes del amplificador, que están en forma analógica, para que puedan ser interpretadas por la PC, que opera en forma digital. Por lo general, las placas también poseen salidas en forma analógica y/o digital, contadores digitales y algunos controladores accesorios. Los principales parámetros que definen una placa conversora A/D, pueden resumirse de la siguiente manera:

• Número de entradas analógicas : es el número máximo de señales de entrada que pueden ser digitalizadas en forma multiplexada.

• Frecuencia de muestreo : este parámetro especifica con qué velocidad se llevan a cabo las sucesivas conversiones.

• Resolución : es el número de bits que el conversor utiliza para representar la señal analógica en forma digital.

• Rango : este parámetro se refiere a los niveles mínimo y máximo de voltaje con los que el conversor A/D puede trabajar. Por lo general se cuenta con varios rangos de trabajo posibles. Para un placa el rango más pequeño es el que posee mayor resolución.

• Ganancia : algunas placas proveen un valor de ganancia programable para incrementar el voltaje de la señal. La resolución, el rango y el valor de ganancia determinan en conjunto cuál es el mínimo valor de voltaje detectable por la placa, el que representa el denominado bit menos significativo (LSB).

• Linealidad, precisión relativa y offset : son parámetros que definen cuánto puede desviarse el valor digital de la salida del conversor del valor que debe entregar en condiciones ideales. Estos parámetros se expresan en relación al LSB.

• Salidas analógicas : algunas placas conversoras proveen salidas analógicas que pueden ser usadas para generar estímulos o señales de control apropiadas desde la PC. Para definir este parámetro de una placa hay que especificar principalmente número y tipo de salidas, rango de voltajes, tiempo de establecimiento y resolución.

• Entrada y salida digital : las entradas/salidas digitales (D-I/O) pueden utilizarse en los sistemas de adquisición para el control de procesos, generación de patrones, comunicación con periféricos, etc. Lo importante para definir las D-I/O es el número de líneas digitales disponibles, la frecuencia a la cual se pueden transmitir/recibir datos y la capacidad de manejo de tales líneas.

• Temporización : la circuitería de temporización de las placas conversoras sirve para la temporización, detección y conteo de eventos, generación de ondas cuadradas, pulsos, etc. Para definir esta característica hay que especificar número y tipo de contadores presentes en la placa, resolución (no de bits) de los mismos y frecuencia del reloj (clock).

• Control de Acceso Directo a Memoria (DMA): algunas placas pueden operar usando DMA para aumentar la velocidad de transferencia de los datos que son adquiridos.

Para definir la elección de la placa conversora también será importante tener en cuenta :

• Programas que se utilizan para su configuración y/o manejo.

• Costo y facilidad de obtención en el mercado nacional.

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2.2.5.2 Requisitos del software Como se mencionó previamente, el software está constituido por el sistema operativo de manejo de la PC y el programa de adquisición.

1. Sistema operativo :

El sistema operativo sirve para controlar y administrar los recursos de la PC. La elección del sistema operativo para el manejo de la PC es una cuestión sencilla. Se debe utilizar un sistema operativo que permita el funcionamiento del programa de adquisición y demás programas utilitarios que se necesiten en el ámbito del laboratorio. Esto último involucra planillas de cálculo, procesadores de texto, procesadores estadísticos, etc.

2. Programa de adquisición :

El programa de adquisición permite el manejo de las señales provenientes del experimento. Esto implica que, mediante el uso del programa, las señales se pueden visualizar, almacenar y/o procesar. Para obtener un programa de adquisición se puede recurrir a dos posibilidades :

• Comprar un programa específico de adquisición para señales electrofisiológicas, sin invertir tiempo de programación pero perdiendo la libertad de realizar modificaciones al mismo.

• Utilizar un lenguaje de programación para construir la aplicación que más se adecue a los requisitos del trabajo, invirtiendo cierto tiempo en la programación de la misma.

La elección depende, entre otras, de la flexibilidad necesaria para la aplicación. Además habrá que considerar la relación costo/beneficio entre adquirir un programa hecho vs. desarrollar un programa.

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2.3 Diseño del espacio de trabajo En los puestos de trabajo para la realización de registros electrofisiológicos, la disposición de los distintos elementos está generalmente regida por las preferencias de quienes lo utilizan[16]. Aun así, es necesario seguir ciertos lineamientos que son comunes al diseño de puestos de trabajo en general. El espacio de trabajo, a la vez que debe cumplir los requisitos de mantener los preparados celulares y de servir para realizar los registros, debe ser confortable y de uso sencillo para los usuarios. En este capítulo se brindarán los conceptos teóricos fundamentales asociados con el diseño de espacios de trabajo que serán tenidos en cuenta en la implementación del presente proyecto.

2.3.1 El diseño de puestos de trabajo Conjuntamente con la sensación de desconfort y el aumento de fatiga experimentado por un hombre que debe realizar tareas en posturas desfavorables, las malas posturas pueden implicar, a largo plazo, perturbaciones funcionales graves. Así, si una parte del cuerpo experimenta regularmente una sobrecarga estática, el funcionamiento del organismo sufre alteraciones[17]. Más aun, pueden cometerse errores en el desarrollo normal de la tarea debido a la fatiga causada por una mala disposición de los elementos de trabajo, los controles y/o los “displays” visuales (en ergonomía se utiliza la palabra “display” para definir a cualquier estímulo proveniente del medio que provoca una entrada de información en el ser humano. Si el display es visual, obviamente la entrada será captada con el sentido de la visión).

En el caso de los sistemas para registro usados en electrofisiología, tal como es el caso del presente proyecto, el operador trabaja en un puesto desde donde debe adquirir diferentes posturas. Estas provocan extensiones para alcanzar controles ubicados a diferentes alturas, movimientos del cuello cuando el área de trabajo a visualizar así lo exige, movimientos precisos de las manos para acceder con el microelectrodo dentro de las células, etc. Por lo tanto es menester realizar un estudio racional de las alturas de los comandos y las superficies de trabajo, así como también de la disposición de los diferentes elementos de trabajo y equipos utilizados.

2.3.2 Elección de la postura de trabajo óptima La postura de trabajo óptima debe establecerse en base a un análisis de las actividades específicas que han de realizarse y los tipos de personas que deben utilizar el espacio[18]. Por la característica de las tareas realizadas en un puesto de trabajo como el descripto anteriormente, se ha considerado conveniente escoger la postura de sentado. Permitir que el operario se siente lo alivia de tener que mantenerse de pie, lo cual reduce la carga de trabajo estático muscular requerida para mantener rígidas las articulaciones del pie, de la rodilla, de la cadera y de la espina dorsal, además de reducir el consumo de energía. La postura de sentado es mejor para la circulación que la de pie. Cuando la persona está de pie, la sangre y los fluidos de los tejidos tienden a acumularse en las piernas, tendencia que se reduce cuando se está sentado. Estar sentado ayuda al operario a adoptar posturas más estables, que le permitirán llevar a cabo las tareas que requieren movimientos más finos o precisos[17].

A pesar de estas ventajas, el operario sentado tiene desventajas en otros aspectos, por lo que es necesario lograr una situación de compromiso. Tal vez lo más importante es que su movilidad queda restringida severamente. Este hecho puede solucionarse en parte haciendo

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más accesibles los diferentes controles manuales que deben ser operados durante la realización de la tarea y/o adecuando el asiento al sitio particular (permitiéndole girar y deslizarse, por ejemplo).

2.3.3 El espacio de trabajo para personal sentado

2.3.3.1 Dimensiones del espacio de trabajo El espacio en el que se desenvuelve una persona que está desempeñando una tarea en posición de sentado se denomina envoltura del espacio de trabajo[18]. Dentro de la envoltura tridimensional de un espacio de trabajo, las consideraciones más específicas del diseño del área de trabajo se refieren a las superficies horizontales (dimensiones, perfiles, alturas, etc.), verticales e inclinadas (dimensiones, posiciones, ángulos, etc.). Estas características deben determinarse, preferentemente, sobre la base de mediciones de dimensiones estructurales y funcionales (mediciones antropométricas) de las personas que habrán de utilizar el sistema[18].

2.3.3.2 Area de la superficie horizontal de trabajo Muchos tipos de actividades manuales se efectúan sobre superficies horizontales, tales como bancos de trabajo, mesas o mesadas. Por lo que respecta a tales superficies de trabajo, se propuso considerar dos áreas: una normal y una máxima (Barnes, 1963). Estas dos áreas aparecen en la Figura 2-23 y se han descripto de la siguiente manera :

Area normal : es el área que puede alcanzarse con una extensión del antebrazo, manteniendo la parte superior del brazo en su posición lateral natural.

Area máxima : es el área que puede alcanzarse al extender el brazo a partir del hombro.

Sin embargo, investigaciones afines realizadas por otro investigador (Squires, 1956) han servido como base para proponer un perfil algo diferente de la superficie de trabajo que tiene en cuenta la interrelación dinámica del movimiento del antebrazo en cuanto el codo también se mueve. El área que queda así circunscrita se superpone con el área propuesta por Barnes. El área propuesta por este último es la que goza de mayor aceptación[18].

Figura 2-23 : Dimensiones (en pulgadas y en cm) de áreas de trabajo normal y máxima en un plano

horizontal, propuestas por Barnes, junto con un área de trabajo normal que, propuesta por Squires, aparece en sobreimpresión a fin de mostrar las diferencias. (extraída de [18])

47

2.3.3.3 Altura de la superficie horizontal de trabajo El amplio espectro de tareas realizadas por personal sentado ante mesas y bancos de trabajo, además de la enorme variedad de diferencias individuales, excluyen evidentemente que se establezca una altura única y universal apropiada a tales superficies. A modo general puede enunciarse una regla que establece que la superficie de trabajo debería estar a un nivel tal que los brazos pudieran colgar de forma relativamente natural, con una posición relajada del hombro y con el antebrazo aproximadamente horizontal o ligeramente inclinado hacia abajo[18].

La altura de la superficie de trabajo también depende de la tarea que ha de realizarse sobre al misma. Como regla general se establece que las tareas que requieren mayor precisión manual deben llevarse a cabo sobre superficies más altas.

La superficie de trabajo que resulta más apropiada en general esta muy relacionada, en cuanto a la altura, con la altura del asiento, espesor de la superficie y grosor del muslo. Siempre que sea posible deben proveerse algunas características ajustables, tales como la altura del asiento, la posición del pie, o la altura de la superficie de trabajo.

La Figura 2-24 muestra las consideraciones antropométricas que entran en el diseño de un espacio de trabajo de laboratorio, con características similares al diseño a realizar en el presente trabajo. La figura de al izquierda pone de manifiesto la relación existente entre la mujer, de menor tamaño, con la mesa y la pared del laboratorio. La repisa debe estar dentro de la extensión de la persona en posición de sentada (área máxima de la envoltura de trabajo). La misma consideración puede hacerse para el caso de instrumentos y controles que estén ubicados lateralmente. La altura del ojo desempeña también un importante papel, no sólo a lo referente al trabajo con microscopio, sino también en lo relativo a la visibilidad de los diferentes controles y displays existentes a su alrededor. Dentro de ciertos límites cabe confiar en la regulación de altura del asiento para adecuarla a la del microscopio y superficie de la mesa. La figura de la derecha muestra la mismas relaciones citadas, pero referidas a un hombre de mayor tamaño.

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A B C D E F G H I

76,2 60,9 45,7 76,2-91,4 86,4-96,5 68,5 30,5-38,1 99,1(max) 106,7(max)

Figura 2-24 : Consideraciones antropométricas para zonas de laboratorio, tanto para operarios masculinos como femeninos. Las medidas del cuadro están dadas en centímetros. (adaptada de [17])

Las consideraciones de la Figura 2-24 son válidas para el diseño de la superficie de trabajo donde se ubicará la cámara con el preparado. Para el caso de la superficie donde irá colocada la PC, se deben contemplar otras consideraciones. De acuerdo con Tougas y col.[19], en el diseño de puestos de trabajo que incluyan el uso de una PC, las pautas más importantes a tener en cuenta son las siguientes:

• Monitor: en lo posible debe poder ajustarse su altura e inclinación. El mismo debe estar de frente al operador. La distancia entre los ojos y la pantalla debe estar en un rango de 45 a 70 cm.

• Teclado: altura recomendada en el orden de los 64 a 76 cm. Debe colocarse en un sitio tal que permita el apoyo de los antebrazos del operador sobre la mesa.

• Mesa: dado que no se debe realizar un trabajo de precisión, la altura de la misma debe estar unos 5 a 10 cm por debajo de la línea de los codos.

• Silla: debe ser de altura ajustable para poder adaptarse a cada usuario en particular..

2.3.4 Espacio físico y distribución [18] La distribución de los distintos componentes del sistema dentro del espacio físico puede ejercer efectos sobre las personas, incluyendo sus trabajos, su comodidad e incluso su

49

bienestar físico. El término componente se refiere virtualmente a cualquier aspecto relevante, como podrían ser los displays, controles, materiales, equipos o áreas de trabajos. Como hipótesis razonable se establece que cualquier componente dado tiene, por lo general, una situación optima desde la que llevar a cabo su finalidad. Este optimo debe afirmarse sobre las características biomecánicas, antropométricas y de sensibilidad humana implicadas. Por supuesto, los componentes deberían estar situados, con preferencia, en sus lugares óptimos, pero puesto que esto con frecuencia no es posible hay que establecer a veces prioridades. A continuación se mencionan algunos de los factores que se tienen en cuenta para establecer la prioridades.

2.3.4.1 Principios guía de distribución 1. Principio de la importancia : este principio trata de la importancia operacional, es decir,

el grado en el que la realización de la actividad con el componente es vital para alcanzar los objetivos del sistema o cualquier otra consideración.

2. Principio de la frecuencia de uso : tal como dice el nombre, este concepto se aplica a la frecuencia con la que se utiliza algún componente.

3. Principio funcional : el principio funcional de distribución procura agrupar los componentes según su función.

4. Principio de la secuencia de uso : por lo que respecta al uso de ciertos ítems, existen secuencias o modelos de relaciones que aparecen con frecuencia durante la operación del sistema.

Está claro que no existe o no se puede aplicar de una forma fehaciente una sola pauta válida para todas las situaciones. Pero, de una manera muy general, y además de la premisa del optimo, las nociones de importancia y de frecuencia probablemente son aplicables, sobre todo, a las fases más básicas de situar componentes de un área general en un espacio de trabajo; a su vez, los principios de frecuencia de uso y de funcionalidad tienden a aplicarse más a la distribución de los componentes dentro de un área general.

2.3.4.2 Métodos de análisis En los procesos de diseños resulta útil la recolección de datos relacionados con el espacio físico. Los tipos de datos más importantes se relacionan con las actividades u operaciones humanas que hayan de llevarse a cabo. Los criterios relevantes de tales actividades incluyen la frecuencia, sus secuencias e interrelaciones, su importancia y el tiempo que se les dedica. En alguna circunstancias también pueden utilizarse los criterios subjetivos de comodidad, conveniencia o preferencia.

El análisis de actividad se lleva a cabo mediante diversas técnicas. Si existe un modelo previo en el que basarse, el análisis puede realizarse mediante observación de su uso, filmaciones, secuencias fotográficas, etc. Otros métodos para obtener datos incluyen el uso de entrevistas o cuestionarios con personal experimentado en el uso del sistema. Se pueden obtener así datos relativos a la frecuencia de uso, importancia o facilidad de manejo. En el caso de sistemas nuevos, los parámetros deben inferirse de cualquier tentativa de esquema, plano o concepto que estén disponibles. Algunas veces tales intentos de distribución pueden comprobarse mediante el uso de prototipos o modelos físicos.

En el caso que desarrollamos en el presente trabajo, los datos fueron obtenidos a partir de la experiencia personal del director del proyecto. Se recopilaron datos adicionales mediante entrevistas con otros usuarios experimentados, visitas a sistemas que están

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funcionando actualmente e información recopilada de bibliografía, que por cierto es muy escasa.

2.3.4.3 Situación general de los componentes Aunque las situaciones óptimas de algunos componentes específicos dependerían, probablemente, de factores situacionales, cabe indicar ciertas generalizaciones sobre ciertas clases de componentes, que se discutirán a continuación :

Displays visuales : Se considera que la línea normal de visión está 15o por debajo del horizonte. La sensibilidad visual, acompañada por movimientos moderados de ojos y cabeza, permite una exploración visual bastante completa de un área alrededor del la línea normal de la visión. El área que permite una visión más conveniente (y por lo tanto la generalmente preferida para los displays visuales) se ha considerado como la definida por un círculo, de un radio de unos 10 a 15o alrededor de la línea normal de la visión. Estudios complementarios (Haines y Gilliland, 1973) determinaron que esta área es más un óvalo que un círculo, y que debe ser el sitio de preferencia para la ubicación de los displays que cumplan funciones más críticas.

Controles manuales : La situación óptima de los instrumentos de control manual es, naturalmente, una función del tipo de control, del modo de operación y de los criterios adecuados de realización (precisión, fuerza, velocidad, etc.). En el caso práctico que se considera en el presente trabajo, se puede pensar a los diversos controles existentes como controles ubicados sobre paneles. Algunos de los controles que están ubicados sobre paneles pueden ser operados con mayor efectividad de acuerdo a su ubicación física. En la Figura 2-25 puede observarse una serie de áreas preferidas para cuatro clases de instrumentos de control, basándose en sus prioridades relativas.

Figura 2-25: Áreas preferidas de superficie vertical y límites para diferentes clases de controles manuales. (adaptada de [18])

2.3.4.4 Distribución específica de los componentes Una vez que se ha tomado una determinación sobre situaciones generales de los componentes (tales como controles y displays), el siguiente proceso es el de distribuir

Area máxima de superficie plana para controles secundarios

Límite preferencial para otros controles secundarios

Controles de emergencia y controles secundarios de

precisión y ajuste

Controles primarios

Distancia de derecha a izquierda del punto de referencia del asiento, en centímetros.

100

75

50

25

0 -50 50-25 250

51

aquellos componentes que están dentro de una misma área general (por ejemplo los diferentes botones, perillas e indicadores de un sólo instrumento). Existen dos aspectos del proceso, a saber : la distribución básica de los componentes y el espacio entre ellos.

Disposición de los componentes : La distribución de grupos de componentes puede basarse en los principios de secuencia o de función. Allí donde existan secuencias comunes o relaciones frecuentes en el uso de displays, controles u otros componentes, la disposición debería hacerse de modo que se facilite el proceso secuencial de movimiento (de las manos, de ojos, etc.). Cuando no existen secuencias comunes o fijas, los componentes deben agruparse sobre la base de la función. En tales casos, los diversos grupos deberían quedar claramente indicados mediante bandas, colores, sombreados o de cualquier otro modo. Un ejemplo de tal agrupamiento se muestra en la Figura 2-26.

Figura 2-26 : Ejemplo de controles y displays agrupados según su función, en el que los diferentes grupos

aparecen claramente indicados. (adaptada de [18])

Espaciamiento de los instrumentos de control : La idea básica es la de reducir las distancias entre los componentes, para aumentar la eficacia de las operaciones que se realizan. Existe sin embargo un límite para la ubicación de los mismos, que está establecido por el espacio mínimo que impide que se toquen otros controles cuando se opera un determinado control. La ubicación debe basarse principalmente en la combinación de factores antropométricos y en la precisión de los movimientos requeridos para accionar el componente. Asimismo existen diversas tablas, que ofrecen las distancias recomendadas entre instrumentos de control, para su aplicación en el diseño de instrumentos y equipos que hagan uso de ellos.

52

Sección 2 : Desarrollo del proyecto

53

3. CAPÍTULO TRES : SISTEMA AMBIENTAL

Tal como se enunció previamente, para lograr las condiciones ambientales óptimas para el preparado, básicamente hay que contemplar los siguientes subsistemas :

Perfusión de solución fisiológica

Control de la temperatura

Perfusión de oxígeno

A continuación se describirá en detalle la manera en que fueron implementados cada uno de ellos en este proyecto.

3.1 Perfusión de solución fisiológica En el Laboratorio Bioelectricidad de la FI-UNER, donde se llevó a cabo la construcción del sistema, el modelo animal con el que se trabaja es el conejo neocelandés. Para las preparaciones de tejido cardíaco de estos animales, la solución de perfusión que se utiliza es el Tyrode con buffer bicarbonato[20], cuya composición es la siguiente (en gramos por litro y en milimoles por litro):

Sustancia gr/lt [mMol] NaCl 8 135 KCl 0,2 2,7 CaCl2 0,2 1,7 MgSO4 0,2 1,6 NaHCO3 1 5,95 glucosa 1 5,5

El preparado es colocado en una cámara de acrílico. La cámara fue fabricada especialmente para este desarrollo, y sus características principales se pueden ver en la siguiente figura :

Figura 3-1 : Esquema de la cámara fabricada para alojar el preparado. Medidas en mm.

base rellena con elastómero (espesor 2 mm)

33

perforación para insertar tuberías de entrada o salida

de solución acrílico transparente de 5

mm de espesor

50 22

54

Para proveer de solución a la cámara se utilizó un sistema de tuberías de PVC transparente, que tienen un diámetro externo de 3,5 mm y un diámetro interno de 2 mm. Para realizar distintas derivaciones e interrupciones del flujo se utilizaron llaves de tres vías tipo Luer, las que fueron colocadas sobre un tablero de distribución. Estas llaves están constituidas por un cuerpo de policarbonato, con vástagos de poliuretano y asas de HDPE (polietileno de alta densidad)[21].

Figura 3-2 : Fotografía de dos modelos distintos de llaves de tres vías tipo Luer.

Se implementaron dos modos diferentes para la perfusión de la cámara:

Perfusión por gravedad: en este modo se suministra continuamente solución fresca al preparado. Para ello se cuenta con un reservorio colocado a un altura aproximada de 2,30 mts. que contiene la solución. El líquido circula entonces por gravedad. En parte de su recorrido (próximo a su ingreso en la cámara) la tubería se encuentra sumergida dentro de un baño termostatizado. Esto se realiza para elevar al nivel deseado la temperatura del líquido (la justificación para su uso se discute más adelante, en este mismo capítulo). Para que la cámara cuente con un nivel constante de líquido, se descarta el excedente con un tubo de succión. Para proveer la succión en el tubo se construyó un sistema auxiliar de vacío, que se describirá luego. El sistema permite además el ingreso de agua destilada para el lavado de las tuberías.

Recirculación: en determinadas ocasiones es necesario someter al preparado a concentraciones conocidas de determinados agentes (drogas cardioactivas, sueros en experimentación, fármacos, etc.). Por lo general resulta demasiado costoso preparar grandes volúmenes de solución que contengan las concentraciones deseadas de los agentes, para perfundir al preparado por gravedad. Por lo tanto se hace necesario recurrir a este modo de perfusión, en el cual un volumen conocido de solución (con una concentración predeterminada del agente) permanece circulando en un circuito cerrado. La circulación continua se logra en este caso por medio de una bomba peristáltica de rodillos y un sistema de tuberías de Tygon®. El Tygon® es un material termoplástico transparente hecho en base a PVC, que posee propiedades elásticas aptas para este tipo de sistema de bombeo. En el modo recirculación, la solución también es calentada antes de su ingreso a la cámara.

Figura 3-3 : Bomba peristáltica usada para la recirculación (MasterFlex-9440). Puede variarse la velocidad en forma continua de 40 hasta 200 rpm, pudiendo bombear desde 0,08 hasta 46 ml/min. (extraída de [21])

llave de encendido e inversión de marcha

perilla de variación de la velocidad

cabezal de 6 rodillos

mangueras de Tygon

55

El esquema funcional de este sistema completo de perfusión de solución se brinda en la siguiente figura.

Figura 3-4 : Sistema completo de perfusión de solución fisiológica. Se pueden apreciar los dos circuitos posibles para realizar la perfusión : por gravedad, desde el reservorio, o mediante recirculación, con la bomba. En el diagrama las llaves se encuentran en posición de circulación de solución por gravedad.

3.2 El control de la temperatura

3.2.1 Características del sistema En el caso particular de este trabajo, el requisito que debe cumplir el control de temperatura es mantener la temperatura de la solución en un margen muy estrecho: ±0.1oC respecto de la temperatura preestablecida.

De las estrategias descriptas en el capítulo 2 (apartado 2.2.1.2), la más adecuada para la aplicación del presente trabajo resultó ser la segunda: calentamiento indirecto de la solución. Entre las razones para su elección se pueden citar su bajo costo y la posibilidad de desarrollar los sistemas complementarios con relativa facilidad. El esquema del sistema desarrollado puede verse en la Figura 3-5.

El líquido debe circular siempre por tuberías plásticas (PVC) para evitar su contaminación con iones metálicos. Las tuberías que atraviesan el líquido del baño termostatizado se colocaron a manera de “serpentina” atravesando un bloque de aluminio. El bloque, debido a que posee una capacidad calorífica mayor que la del agua, actúa como un filtro pasabajo, y de esta manera resulta poco sensible a variaciones bruscas de la temperatura del baño.

posición dela llave:

SOLUCIÖN

posición de la llave:CERRADO

posición de la llave:POR GRAVEDAD

baño termostatizado

aguasolución

tablero dedistribución

bombaperistálticadesagote

preparadotubo desucción

cámara

56

Figura 3-5 : Esquema funcional del sistema de control de temperatura con todos sus componentes.

Una consideración importante en la implementación del sistema es evitar la pérdida de calor en el trayecto que el líquido tiene que recorrer entre el baño y la cámara. Para ello hay que situar el baño próximo a la cámara, pero aparece entonces el problema de la interferencia electromagnética en el sistema de registro. Además, aunque el baño se coloque lo suficientemente lejos, la solución circulante es conductora. Por lo tanto, el ruido eléctrico que produzca el baño al encender la resistencia de calefacción se acoplará en forma capacitiva y será sensado por el sistema de registro. Para solucionar este inconveniente se decidió realizar la alimentación de potencia del elemento calefactor con tensión continua.

El desarrollo del sistema se divide entonces en dos partes: el diseño de la fuente de alimentación de potencia y el del controlador propiamente dicho. Se desarrolló además un termómetro digital para indicar la temperatura de la cámara.

3.2.2 Fuente de alimentación La fuente de alimentación de tensión continua debe poder suministrar la potencia necesaria para calentar la cantidad de agua contenida en el baño. Para el volumen de agua que se pretende calentar, los baños comerciales poseen una potencia del orden de los 500 W para 220 V de tensión alterna.

Se realizó rectificación de onda completa de la tensión alterna. Esto fue llevado a cabo mediante un puente de diodos de 12A de corriente máxima.

Para cuantificar la proporción de tensión alterna superpuesta a la continua que se tiene en la salida de una fuente de alimentación se utiliza el denominado factor de rizado o ripple. Su valor es igual a la tensión eficaz de la ondulación residual dividido por el valor de tensión continua. Para los fines de este trabajo, se considera en base a datos empíricos que un factor de rizado del 1% resulta aceptable. Para obtener un factor de rizado igual al 1% hay que calcular el valor del capacitor de acuerdo a la siguiente relación[22]:

CIV r

=490* *

Donde V e I son, respectivamente, la tensión y corriente continua a suministrar y r representa el factor de rizado. Por lo tanto, para suministrar una potencia de 500 W se tiene una tensión continua V = 220 V * 1,41= 311,12 V (recordar que hay que tomar el valor máximo de la tensión de alimentación alterna, que es el valor al que se cargan los capacitores) y una corriente I = P / V = 500 W/ 311,12 V = 1,6 A. De aquí :

controladorde

temperatura

solución deperfusión

bloque de aluminio

sensor de T

fuente depotencia

baño termostatizado

elemento calefactorburbujeo paraagitación mecánica

preparado

cámara

57

C F= =1 6

490 31112 0 011049

,* , * .

µ

Resultó imposible encontrar capacitores en el mercado nacional que cumplan con el requisito de capacidad 1000 µF y tensión de ruptura mayor a 300 V. Se hallaron capacitores de valores adecuados de capacidad, pero la tensión máxima de los mismos era a lo sumo de 250 V. Por lo tanto se replanteó el diseño de la fuente desde el punto de vista de la tensión de suministro, la que fue reducida a 110 V. De esta forma, los nuevos valores requeridos para los parámetros de la fuente resultan :

IPV

WV

A

C F

= = = =

= =

500110 1 41

500155 5

3 21

3 21490 155 5 0 01

4212 8

* , ,,

,* , * ,

, µ

Por lo tanto la fuente fue diseñada para suministrar 150 V de tensión continua con una corriente máxima de 3.2 A y el filtrado fue implementado con un capacitor electrolítico de 4700 µF, con tensión máxima de 250 V.

D?

Puente 12 A

250 V4700 uF

Fusible 5A

Interruptor principal

Fusible 3A

Vo = 150 V (cc)Vi = 110 V (ca)

NA

relé

Figura 3-6 : Circuito de la fuente de alimentación de corriente continua.

Las características adicionales que se consideraron fueron:

Protección contra cortocircuitos: se implementó a través de dos fusibles (ver circuito). El primero (5 A) se colocó para proteger al transformador de alimentación 220/110 V ante posibles fallas en el circuito. El segundo (3 A) se colocó para proteger al circuito de la fuente ante posibles cortocircuitos en la salida.

Interruptor de comando remoto para conectar o desconectar la carga: esta etapa es la encargada de activar o desactivar la alimentación de la carga cuando el controlador lo requiera. Como se verá más adelante, el controlador produce una señal de control TTL, que es igual a 0 V cuando se quiere apagar la fuente y 5 V cuando se la quiere encender. Se implementó con un optotriac MOC 3011[23], conectado como indica la figura, que activa la bobina de un relé encargado de conectar / desconectar la carga.

110 - 12Vtransformador

1N4001

10uF

interruptor NA

RELE

MOC 3011

OPTOTRIAC

TIC226

180 2K4

0.1uF

+5V

Entrada

110 V(ca)

señal TTL (delcontrolador detemperatura)

330

Figura 3-7 : Circuito de comando remoto para activar/desactivar la fuente de alimentación.

(comando remoto)

58

3.2.3 Controlador de temperatura Como se mencionó previamente, el controlador de temperatura debe ser capaz de mantener la temperatura preestablecida del baño dentro de un rango de ±0.1ºC. En primer lugar se implementó un controlador del tipo encendido-apagado. Se alcanzó el rango establecido tomando las siguientes consideraciones :

Se utilizó un sensor de temperatura con una constante de tiempo relativamente rápida (1.4 segundos en agua agitada): el AD590 de Analog Devices[24]

Se realizó un burbujeo de aire para agitar el líquido del baño. Esto logra homogeneizar la temperatura del mismo más rápido y produce una transferencia más efectiva de la energía calórica, ya que se pasa de convección simple a convección forzada.

Se colocaron trozos de poliestireno expandido (Telgopor®) en la superficie del líquido calefaccionado para evitar el intercambio de calor con el ambiente.

El esquema general del controlador es el siguiente :

Figura 3-8 : Diagrama de bloques del controlador de temperatura. En la llave selectora M indica la posición de medición del valor actual de temperatura y P la del valor de temperatura prestablecido para el baño.

El AD590 es un sensor de temperatura integrado, que produce una corriente de salida proporcional a la temperatura absoluta (1 µA/oK). El siguiente circuito de acondicionamiento fue implementado para obtener una salida de 100 mV/oC.

4K7

10 K

LM 136 - 5V

10 uF

10 K

3

26

7

4 5 1 8

CA3140

20 K

20 K 82 K

10 K-VCC

-VCC

+VCC

-VCC

AD 590

+VCC

SALIDA1uA/ Ksensor

(remoto)salida

100 mv/oC(al comparador

y llave)

Figura 3-9 : Circuito del controlador de temperatura : acondicionador de señal.

Acondicionador de señal

Comparador

Visor numérico de 3 ½ dígitos

Sensor (1µA /oK) 100 mV/oC Salida TTL

(a la fuente de alimentación)

Llave selectora

V ref P M

59

Un comparador, que posee una tensión de referencia en una de sus entradas y la salida del circuito anterior en la otra, provee la señal de control para la fuente de potencia.

SALIDA TERMOMETRO

3

26

7

4 5 1 8

CA3140

multivueltas

5K

-VCC

+VCC

+5V

1K

SALIDA

comparador

Vref

salida TTL :(a la fuente dealimentación)

del acondicionador deseñal

Figura 3-10 : Circuito del controlador de temperatura : comparador y Vref.

De esta forma, cuando la tensión a la salida del circuito que mide la temperatura esté por debajo del nivel de comparación, la salida del comparador será un nivel bajo (0 V), y cuando esté por encima, la salida será un nivel alto (5 V). Esta señal se envía al circuito de la fuente descripto en el apartado anterior.

Al circuito se le agregó un visor numérico de cristal de cuarzo líquido (LCD) de 3 y ½ dígitos, que indica la temperatura real del baño o la temperatura preestablecida para el mismo, mediante una llave selectora.

3.2.4 Termómetro digital Para medir la temperatura en la cámara experimental se construyó un termómetro digital. Se utilizó el sensor AD590, y el circuito empleado para su implementación es exactamente igual que el recién descripto para la etapa de medición de temperatura del controlador (Figura 3-9, bloque acondicionador más el visor numérico). Para la visualización del valor de temperatura se empleó un visor numérico LCD de 3 y ½ dígitos, que otorga al instrumento una resolución de 0,1oC. El instrumento permite medir temperaturas en el rango de 0 a 50oC, con una precisión de ± 0,1oC

3.3 Sistema de perfusión de oxígeno Este sistema se utiliza para burbujear oxígeno dentro de la solución que baña los tejidos celulares cuando se utiliza Tyrode con buffer HEPES como solución fisiológica. En el caso de utilizarse Tyrode con buffer bicarbonato, hay que burbujear carbógeno (95% de O2 y 5% de CO2). Como se dijo anteriormente, en el Laboratorio se utiliza el Tyrode con Buffer bicarbonato, por lo que el burbujeo se realiza con carbógeno.

El gas se suministra a partir de un cilindro a presión. La presión se reduce mediante un reductor. También se tiene un flujímetro con válvula cónica para poder regular la salida del gas de manera precisa.

La instalación se llevó a cabo utilizando tuberías de PVC de 5 mm de diámetro para la sección principal y 3 mm de diámetro para las secciones secundarias. Al igual que en el caso del sistema para la solución, se utilizaron llaves de tres vías tipo Luer, las que fueron colocadas en un tablero para realizar las interrupciones o derivaciones necesarias. La línea principal lleva el gas hasta el tablero de distribución, desde donde salen las dos ramas

60

secundarias: una para burbujear dentro del reservorio de solución y otro par burbujear dentro de la cámara.

El esquema funcional del sistema completo de perfusión de gas se brinda en la Figura 3-11 conjuntamente con el resto de los sistemas de mantenimiento de las condiciones ambientales.

3.4 Sistema auxiliar de vacío El sistema de vacío se necesita para retirar el líquido sobrante de la cámara, ya que en el modo de perfusión por gravedad la solución fresca está ingresando continuamente a la misma. Para ello se coloca el extremo de un tubo por el que se realiza succión a una altura correspondiente al nivel de líquido deseado. El vacío se realiza mediante una bomba neumática dentro de un reservorio (trampa) en el que se recolecta el líquido que se retira de la cámara. En este diseño, el aire a presión que sale por el otro extremo de la bomba se aprovecha para realizar agitación del agua del baño termostatizado. En la Figura 3-11 se puede ver la disposición en el sistema de los elementos recién descriptos.

3.5 Distribución de los distintos sistemas A continuación se realiza un esquema funcional de los sistemas de perfusión para el mantenimiento de las condiciones ambientales, donde se esquematiza cada uno de sus componentes.

61

Figura 3-11 : Esquema completo del sistema de mantenimiento de las condiciones ambientales.

baño termostatizado agua solución

tablero de distribución

preparado

cámara

bomba peristálticadesagote

trampa de agua bomba de

vacío

tubo de carbógeno

carbógenoaire comprimido/vacío

aguasolución

62

4. CAPÍTULO CUATRO : SISTEMA ÓPTICO

El sistema óptico empleado para la visualización de los preparados consiste en una lupa binocular de disección y un sistema de iluminación, constituido por una lámpara halógena y una fuente de alimentación de tensión continua. A continuación se describen las características de cada uno de ellos.

4.1 Lupa binocular Se utilizó una lupa binocular de disección de WPI, modelo PZM (Precision Stereo Zoom Microscope)[29]. La misma posee las siguientes características :

Oculares : de 10X y 20X

Zoom : desde 0,7X hasta 4X

Objetivo : 1X

Rango de magnificación : 7X a 40X (ocular de 10X) - 14X a 80X (ocular de 20X)

Distancia de trabajo : 90 mm.

Campo de visión : 27,1 a 4,8 mm (ocular de 10X) - 15,7 a 2,8 mm (ocular de 20X)

La lupa se coloca sobre la superficie de trabajo de la mesa antivibratoria y se la utiliza para controlar el procedimiento de aproximación del microelectrodo al preparado. No fue fijada a la mesa, por lo que se la puede retirar cuando es necesario. En nuestro caso en particular, la lupa también se utiliza para realizar la disección fina del preparado una vez que se extrajo el corazón del animal, previamente al montaje final en la cámara.

Considerando el tamaño de los preparados (aproximadamente 5 a 10 mm de diámetro), para una visualización adecuada resulto más conveniente el uso de los oculares de10X. En la Figura 4-1 se muestra una fotografía de la lupa recién descripta, con detalles de los movimientos que permite.

Figura 4-1 : Lupa binocular utilizada en la implementación de este trabajo. (extraída de [29])

ajuste del zoom

ajuste de la distancia de enfoque

ajuste de la distancia de trabajo y de rotación respecto a la base

oculares intercambiables

distancia de trabajo

63

4.2 Sistema de iluminación El sistema de iluminación consiste de una lámpara halógena (dicroica) que se coloca cercana a la cámara, y una fuente de iluminación de tensión continua, situada fuera de la jaula de Faraday.

4.2.1 Lámpara Se utilizó una lámpara dicroica de 12 V de tensión de alimentación y 50 W de potencia. Se la colocó en un portalámparas que posee un brazo articulado, lo que permite el movimiento del haz de luz producido hasta la posición deseada.

El portalámparas y el sistema articulado originalmente pertenecían a un modelo comercial para lámparas de 220 V, por lo que fue necesario modificarlo para adaptarse a la lámpara dicroica. En primer lugar se cambió el receptáculo de la lámpara, cambiándose por uno con zócalo bi-pin. Adicionalmente se reemplazó el cable original, de 2x0,75 mm de sección, por dos cables de 2 mm de sección con aislación especial para alta temperatura. Esto último se realizó teniendo en cuenta que la lámpara necesita 50W/12 V=4,16 A de corriente máxima.

4.2.2 Fuente de alimentación Como se mencionó en el capítulo 2, el sistema de iluminación debe cumplir con el requisito de no introducir ruido en el sistema de registro. Por lo tanto la fuente de alimentación para la lámpara es de corriente continua.

El circuito implementado consiste en una fuente de alimentación regulada y variable., capaz de suministrar los 12V de tensión continua con una corriente de 5A. Permite variar el valor de tensión para modificar el nivel de iluminación que recibe el preparado. El circuito emplea un regulador ajustable de 5 A de corriente de trabajo, el LM338 de National Semiconductor[25]. En la siguiente figura se esquematiza el circuito utilizado para su construcción.

Vin2

AD

J1

+Vout 3LM338

1N06

120

500

.1uF 1uF220/18 V

puente 10A

LAMPARA

Interruptor

Alimentación 220 V (CA)

500

Figura 4-2 : Circuito de la fuente de alimentación de corriente continua empleada en el sistema de

iluminación.

Mediante el accionamiento del potenciómetro de 500Ω se puede ajustar el nivel de tensión de salida, lo que hace variar la iluminación que incide sobre el preparado. El valor del mismo y de la resistencia en serie fue calculada a partir de la siguiente relación :

VoRR

= +⎛⎝⎜

⎞⎠⎟1 25

21

1, *

64

donde Vo es la tensión de salida de la fuente, R1 es igual a 120Ω y R2 es la suma del potenciómetro más la resistencia en serie. En el nivel máximo (12V), la suma de las resistencias debe ser igual a 1032 y en el nivel mínimo (6V), la suma debe valer 456. De aquí la elección de 500Ω para el potenciómetro y 500Ω para la resistencia en serie. Esto otorga un rango de 6,25 a 11,66 V, lo cual resulta aceptable.

De esta manera, la capacidad de ajustar el nivel de iluminación, sumado a la posibilidad que ofrece la lámpara de poder moverse, permite lograr diferentes modalidades de iluminación/contraste sobre el preparado.

65

5. CAPÍTULO CINCO : SISTEMA MECÁNICO

En este capítulo se describen todos los medios necesarios para posicionar de manera firme y estable al microelectrodo, la cámara para alojar el preparado y sus sistemas auxiliares. Como se mencionó en el apartado 2.2.3, los componentes principales de este sistema de soporte lo constituyen la mesa antivibratoria y el micromanipulador. Además se cuenta con un sistema estructural que se apoya sobre la superficie de la mesa antivibratoria y sirve para mantener rígidamente unidos al micromanipulador, la cámara del preparado y sus sistemas auxiliares.

5.1 Mesa antivibratoria Se comentará en primer lugar la construcción de la superficie de trabajo y luego la estructura de soporte, las que en conjunto constituyen la mesa antivibratoria. Los fundamentos teóricos en que se basó el diseño, se discuten en el apéndice I.

5.1.1 Superficie de trabajo El material escogido para la construcción de la superficie de trabajo fue el acero. De todos los materiales disponibles, es el que mejor cumplió con el requisito de la relación rigidez/masa y que a su vez resultó el más apropiado para implementar un sistema de apoyo firme y sencillo para el micromanipulador. Tal sistema de apoyo está construido con barras de acero y bases magnéticas, y será descripto en detalle más adelante, en el apartado 5.3.

La superficie de trabajo fue construida entonces a partir de una plancha de acero SAE 1020 de ¾ de pulgada de espesor (19,05 mm). La misma fue cortada en forma rectangular de 700 mm de ancho por 450 mm de profundidad, tal que el peso resultó ser de unos 50 Kg. Fue cepillada en una de sus caras para proveer una superficie libre de imperfecciones y así lograr un mejor agarre de las bases magnéticas. La cara inferior fue sometida a un tratamiento anticorrosivo (líquido fosfatizante + convertidor de óxido), mientras que la superficie de trabajo sólo fue limpiada con líquido fosfatizante. En aquellos lugares donde no se efectúa la colocación de las bases magnéticas, se colocó un plástico autoadhesivo (ConTact®) para proteger la superficie de la corrosión ante posibles salpicaduras.

5.1.2 Estructura de acoplamiento La estructura de acoplamiento de la superficie de trabajo con el piso se compone de una base pesada y aisladores neumáticos. La base está compuesta por dos patas de madera rellenas con arena, sobre las cuales se apoya una losa de hormigón armado.

Los aisladores son tres cámaras de motocicleta infladas en forma parcial, que están colocadas sobre la losa de hormigón. Fueron ubicadas de manera que soporten uniformemente el peso de la superficie de acero. Además se colocó una tabla de madera aglomerada entre la superficie de acero y las cámaras, para distribuir mejor el peso. Las dimensiones son iguales en ancho y en largo que la losa de hormigón, pero con un espesor de 10 mm.

Las patas están construidas en forma de “cajones” con madera terciada de 20 mm de espesor y con una base ancha de madera dura de 25 mm de espesor. Se las llenó con arena secada en horno a 120oC. Este procedimiento se realizó para eliminar la humedad y los

66

elementos orgánicos que pudieran con el tiempo deteriorar la madera. La losa de hormigón apoya sobre la arena a través de dos tacos de madera de 120 x 320 x 200 mm. En la figura 5.1 se brinda información detallada acerca de la disposición física así como también de las dimensiones de todos los componentes de la mesa antivibratoria.

Figura 5-1: Esquema de la mesa antivibratoria desarrollada, mostrando sus diferentes componentes. De

arriba hacia abajo se encuentran: superficie de acero, madera aglomerada, cámaras de motocicleta, losa de hormigón armado, tacos de madera y patas llenas con arena. El dibujo se ha representado en una escala

aproximada. Medidas en mm.

5.2 Micromanipulador Se utilizaron dos micromanipuladores : uno para el microelectrodo y otro para los electrodos de estimulación. Ambos estaban disponibles en el Laboratorio antes de iniciar este proyecto, por lo que no fue necesario adquirirlos.

67

Se consideró utilizar el de mejor calidad para posicionar el microelectrodo. El mismo es un Narishige, modelo MM3[26], y se muestra en la figura 5.2. Posee las siguientes características:

Rango de movimientos : eje X: 40mm ; eje Y: 20mm ; eje Z: 40 mm ; eje X (movimiento fino): 7mm

- graduación mínima: 10µm ; - rotación completa del tambor 250µm.

Precio de catálogo: U$S 890.

Figura 5-2 : Micromanipulador Narishige modelo MM3 empleado en la implementación de este trabajo. En la figura se indican las funciones de cada control y también se representaron los ejes de referencia. (extraída

de [29])

Como se puede ver en la figura, el micromanipulador posee un orificio de 12 mm de diámetro dentro del cual se inserta una varilla metálica. Tal varilla se ajusta con un tornillo para poder sostener al micromanipulador desde el soporte. Como se verá en el apartado siguiente, el soporte empleado en este caso es una base magnética.

Para el posicionamiento de los electrodos de estimulación se utilizó un micromanipulador TAURUS de WPI[29], que posee las siguientes características :

Rango de movimientos : eje X: 35mm ; eje Y: 15mm ; eje Z: 25mm ; eje X (movimiento fino): 10 mm - graduación mínima: 10µm ;

Precio de catálogo : U$S 640 Cabe aclarar que este micromanipulador es constructivamente similar al descripto anteriormente, por lo que no se consideró necesario incluir una fotografía del mismo.

5.3 Elementos de fijación

50mm Y X Z

soporte para el microelectrodo

control grueso del eje X

tornillo de ajuste para sujeción

control del eje Z

control fino del eje X

control del eje Y

68

5.3.1 Bases magnéticas Las bases magnéticas están destinadas a proveer un medio de anclaje firme entre el micromanipulador y la estructura antivibratoria. Son dispositivos que poseen un poderoso imán permanente, con un circuito magnético que se completa con la masa de la mesa metálica. Si se cuenta con una superficie ferromagnética, resultan muy prácticas a la hora de fijar los diferentes elementos. Es una ventaja importante por sobre otros sistemas de anclaje que emplean roscas para su fijación. Estos sistemas poseen el inconveniente de estar limitados para desplazarse sólo a posiciones fijas.

Estas bases poseen una varilla vertical de acero cromado y vienen provistas de un brazo, también de acero cromado, que puede ajustarse a una variedad de posiciones, de acuerdo a las necesidades particulares, como puede verse en la siguiente figura.

Figura 5-3 : Base magnética empleada para sostener las estructuras de registro. Las dimensiones de la base son 48 x 48 x 60 mm, y su peso es de 1,8 kg. La varilla vertical es de 12 mm de diámetro y mide 168 mm de largo. El brazo auxiliar es de igual longitud, pero posee un diámetro de 10 mm. La fuerza vertical de agarre

es de 80 kgf. El circuito magnético se activa-desactiva girando la perilla que se observa en el frente. (extraída de [29]).

En el presente trabajo fueron empleadas cuatro de las bases recién descriptas para formar la estructura rectangular de soporte. En el siguiente párrafo se describe su construcción.

5.3.2 Estructura metálica Esta estructura fue fabricada en forma especial, utilizando barras metálicas de acero y planchuelas varias de diferente calibre. Como se mencionó anteriormente, fue construida para solidarizar la cámara (con el preparado) y el micromanipulador (con el microelectrodo) a la superficie de trabajo de la mesa antivibratoria. De esta forma se busca que las vibraciones que pudieran llegar a la superficie de trabajo no provoquen un movimiento relativo entre la punta del microelectrodo y el tejido.

Se emplearon dos barras de acero de 12 mm de diámetro, a las cuales se les soldaron dos planchuelas de 25 mm de ancho. Sobre las planchuelas se coloca la cámara con el preparado. Para poder hacer foco con la lupa binocular sobre el fondo de la misma, las planchuelas fueron dobladas, tal como se muestra en la

Figura 5-4.

69

Figura 5-4 : Corte transversal de la estructura metálica para soporte de la cámara, mostrando sus dimensiones laterales y la relación de altura con la lupa binocular

La siguiente figura muestra una vista en perspectiva de la estructura metálica junto con las bases magnéticas.

Figura 5-5: Esquema representando la disposición de la estructura metálica para el sostén de la cámara del

preparado y el micromanipulador. Medidas en mm.

La siguiente fotografía muestra la superficie de trabajo de la mesa antivibratoria, donde se pueden observar algunos de los distintos componentes descriptos a lo largo de este capítulo.

barra de acero

planchuela

3 cm

8,5 cm

cámara

lupa binocular 9 a 13 cm

(variable de acuerdo al enfoque)

barra de acero

70

Figura 5-6 : Fotografía de la superficie de trabajo de la mesa antivibratoria. Se puede observar la ubicación de los componentes descriptos a lo largo de este capítulo : P, soporte para el preparado; B, bases magnéticas;

M, micromanipulador; S, soporte del microelectrodo ; L, lámpara dicroica.

S

B

P

M

B

B

L

71

6. CAPÍTULO SEIS : SISTEMA PARA EL REGISTRO ANALÓGICO DE LA SEÑAL

El sistema de registro completo de la señal puede dividirse en dos partes. Una parte destinada al registro analógico de la señal, y otra al registro digital, que comprende la digitalización y el almacenamiento de la misma. En este capítulo se describirá con mayor detalle el conjunto de elementos necesarios para llevar a cabo el registro analógico de la señal. Como se indicó previamente, este sistema de registro está constituido por un microelectrodo, un amplificador de señal, un osciloscopio y un sistema de adquisición. También se mencionarán en este capítulo, por encontrarse relacionados con el sistema de registro, los medios destinados a eliminar las interferencias eléctricas y electromagnéticas.

El siguiente diagrama de bloques representa el sistema completo para el registro de la señal.

Figura 6-1 : Diagrama en bloques del sistema de registro completo.

6.1 Microelectrodos Para caracterizar los microelectrodos que se utilizaron en la implementación de este trabajo, se puede decir que los mismos tenían resistencias que oscilaron en el rango de 5 a 10 MΩ, y que poseyeron una punta apropiada a los fines del registro. A continuación se describen las características más importantes asociadas con la fabricación de los microelectrodos utilizados, así como también la fabricación del electrodo indiferente.

6.1.1 El electrodo indiferente El electrodo indiferente se implementó a través de un alambre de plata al cual se le dio una forma particular (ver figura 6.2). Se trató de que el mismo no ocupe mucho espacio dentro de la cámara y a la vez pueda tener un área considerable. Antes de colocarlo fue sometido al proceso de clorurado mediante inmersión en una solución diluida (0,01M) de hipoclorito de sodio.

estimulador

electrodo de referencia

PC amplificador microelectrodo

electrodos de superficie

cámara con el preparado

filtro pre (x 1) ganancia

osciloscopio

SISTEMA DIGITAL SISTEMA ANALÓGICO

voltímetro digital

placa

A/D

monitor

72

Figura 6-2 : Disposición física del electrodo de referencia dentro de la cámara de acrílico usada para alojar

al preparado.

6.1.2 Vidrio Para la fabricación de los microelectrodos utilizados en el presente trabajo se usó el vidrio tipo borosilicato con filamento (diámetro externo 1mm, diámetro interno 0,78 mm).

6.1.3 Estirador de micropipetas El equipo empleado para fabricar los microelectrodos usados en este trabajo es el existente en el Laboratorio de Bioelectricidad de la FI-UNER (marca Sutter, modelo P-97). El mismo es un estirador horizontal de dos etapas : en una primera etapa, se aplica una fuerza de tracción suave al tubo de vidrio mientras el mismo es calentado por un filamento especial. En las segunda etapa, cuando se alcanza una elongación del tubo predeterminada, se aplica una fuerza más fuerte que lo separa por la mitad, formando así dos micropipetas. El tubo se coloca entre dos carros con mordazas que son traccionados simultáneamente por cables de acero conectados al extremo de un solenoide, que es el que realiza la fuerza de tracción cuando es activado eléctricamente. Este modelo particular de estirador, denominado de Flaming y Brown por ser estos quienes lo desarrollaron[27], inyecta un jet de aire durante el estiramiento para acelerar el proceso de enfriamiento del vidrio, y de esta forma se pueden obtener puntas más cortas con diámetros pequeños. Otra característica importante es el control de temperatura del filamento a través de la corriente controlada en forma muy precisa. En la figura 6.3 puede verse un diagrama de los aspectos mecánicos fundamentales del diseño de este estirador.

tornillo de fijación en la pared de acrílico

terminal para conexión eléctrica

alambre de plata clorurada

cámara de acrílico

73

Figura 6-3 : Diagrama esquematizando los aspectos fundamentales del proceso de estiramiento de las

micropipetas en un estirador horizontal. (extraída de [27])

El modelo de estirador descripto posee un control por microprocesador de cada una de las operaciones que realiza. Permite al usuario crear programas con los parámetros de estiramiento particulares para cada caso[28]. Tales parámetros son :

Cantidad de calor que se suministra al filamento (heat) : este parámetro controla el nivel de corriente eléctrica entregada al filamento. La cantidad de calor requerida para derretir el vidrio se basa en las características del filamento que posee el equipo y de cada vidrio en particular. Para establecer el valor de este parámetro se debe ejecutar el denominado “test de rampa” (ramp test). El test de rampa se debe ejecutar cada vez que se cambie el filamento del equipo o se cambie el tipo de vidrio. Para ello se coloca el tubo de vidrio en el equipo y se le solicita que inicie el test. El equipo suministra corriente al filamento a una tasa constante de 650 mA/seg. A medida que el vidrio se ablanda, las mordazas comienzan a separarse. Cuando las mismas alcanzan una velocidad prefijada por el equipo, se interrumpe la tracción y se muestra en el visor el valor del parámetro heat para esa combinación vidrio/filamento.

Velocidad (velocity) : con este parámetro se controla el punto en que finaliza la primera etapa de estiramiento. La velocidad del carro se incrementa cuando el vidrio se comienza a ablandar y la etapa se detiene cuando se alcanza el valor de velocidad prefijado. El valor de velocidad a especificar dependerá de la viscosidad y la temperatura de ablandamiento del vidrio.

Fuerza de estiramiento (pull) : este parámetro controla la fuerza de tracción que se ejerce en la segunda etapa del estiramiento. Cuanto menor sea esta fuerza, menor será el diámetro de la pipeta y más larga resultará la espina.

Tiempo (time) : este parámetro controla el tiempo transcurrido entre las etapas de estiramiento, durante la que se activa el enfriamiento por jet de aire.

Presión de aire (pressure) : controla la presión del aire en la fase de enfriamiento activa por jet.

En el caso particular de este trabajo, los parámetros para los vidrios que se utilizaron en la fabricación de las micropipetas se detallan en la siguiente tabla . Cabe aclarar que ninguno de los parámetros posee unidades, y que los valores se refieren a una escala relativa

74

establecida por el fabricante. Estos parámetros se ajustaron empíricamente de acuerdo con las propiedades finales del microelectrodo, partiendo de valores iniciales sugeridos por el fabricante del equipo. Tabla 6-I: Parámetros que fueron determinados para el uso del estirador Sutter P-97 en la fabricación de micropipetas para microelectrodos intracelulares.

Parámetro

tipo de vidrio

Ramp test Heat Velocity Pull Time Pressure

borosilicato con

filamento

ID=0,58mm ; OD=1mm

600 625 80 80 150 300

borosilicato con

filamento ID=0,78mm ;

OD=1 mm

451 460 80 80 100 300

Con el primero de los vidrios de la tabla, las resistencias oscilaron en un rango de 10 a 20 M, mientras que con el segundo se lograron resistencias menores (5 a 10 M).

6.1.4 Llenado En el laboratorio se emplea el método de llenado que utiliza la fibra interna en el vidrio de fabricación. Las pipetas se fabrican entonces con tubos de vidrio borosilicato con fibra de vidrio interna y luego se las llena por el vástago con una jeringa que posee una aguja especial ultrafina no metálica. Esta aguja (MicroFil de WPI[29]) posee una punta larga y fina que permite comenzar el llenado muy cerca de la punta de pipeta, eliminando las burbujas de aire y el atascamiento debido a partículas de polvo. La aguja esta construida con una combinación de plástico y sílice. Poseen elasticidad y flexibilidad, aunque no son irrompibles. El modelo con el que se cuenta en el laboratorio es la MicroFil MF34G, que posee una longitud de 70 mm, 0.164 mm de diámetro externo, 0.1 mm de diámetro interno.

Figura 6-4 :Agujas para el llenado de las micropipetas (extraída de [29])

75

6.2 Circuito electrónico de registro

6.2.1 Preamplificador

6.2.1.1 Conexión física del microelectrodo Para disminuir al máximo el valor de la capacitancia distribuida, se encapsuló al circuito del preamplificador dentro de una pequeña caja de aluminio que se conoce comunmente con el nombre de “cabezal”. El cabezal se coloca inmediatamente después del microelectrodo, evitando así la presencia de un cable de conexión largo. Además, como se describirá más adelante, la plaqueta donde se monta el circuito hace uso del principio de guarda electrostática. La caja metálica del cabezal se encuentra conectada a tierra para evitar la interferencia de campos eléctricos y magnéticos.

El microelectrodo se coloca en un adaptador especial (ver figura) denominado “holder”, que se conecta directamente al cabezal[29]. Este adaptador esta construido de policarbonato. Posee un orificio cilíndrico que primero se llena con solución electrolítica (KCl 3M) y donde luego se inserta la micropipeta. La conexión eléctrica se establece a través de un alambre de plata que se coloca en el interior de la micropipeta (como el que se muestra en la figura) o bien a través de una bolilla o “pellet” de Ag/AgCl que se encuentra al final del conducto cilíndrico. Tanto el alambre de plata como el pellet de Ag/AgCl se encuentran conectados con un pin de 2 mm que se inserta en el cabezal. En la práctica se prefieren aquellos que poseen pellet, ya brindan mayor estabilidad de voltaje.

Figura 6-5 : Esquema del holder empleado para acoplar el microelectrodo al cabezal. La junta de goma sirve

para sujetar la pipeta, de modo que no se deslice cuando el holder se coloca en posición vertical o semi-vertical. (extraída de [29])

6.2.1.2 Descripción del circuito Para la implementación del preamplificador se escogió el circuito integrado OPA129 de Burr Brown[30]. Es un circuito integrado de corriente de bias ultra baja, que emplea la tecnología Difet (Dielectrically Isolated FET), patentada por su fabricante. La disposición particular de los pines de este circuito integrado (ver figura), permiten la implementación de la guarda electrostática en la plaqueta de montaje, para evitar que las pérdidas a través de las conexiones superen el valor de la corriente de bias.

alambre de plata clorurada

pin de 2mm

junta de goma

76

Figura 6-6: Disposición del las patas de conexión del integrado OPA129.

El circuito del preamplificador se esquematiza en la figura 6.7 y a continuación se describe su funcionamiento.

3

26

1 587

4

OPA129

1000Mreed switch

20Kmultivueltas

entradasalida

-15V

+15V

+15V

Figura 6-7: Circuito del preamplificador

El circuito esquematizado representa sencillamente un seguidor de voltaje: la tensión a la salida “sigue” a la tensión de entrada. Las características fundamentales están dadas por el circuito integrado, el que otorga :

corriente de bias : 100 fA

impedancia de entrada : 1015 Ω

rango dinámico : ±15V

tensión de offset : ±0,5 mV (típico); ±2 mV (máximo)

deriva de la tensión de offset : ±3 µV/oC (típico); ±10 µV/oC (máximo)

El preamplificador no posee corrección de offset ya que, como se verá más adelante, esta operación se realiza en otra etapa del circuito electrónico.

La medición de la resistencia del microelectrodo, cuando el mismo se halla colocado en el cabezal y sumergido en el baño, es un procedimiento útil para comprobar su estado. Por lo general los equipos comerciales vienen con una llave en el panel frontal que permite inyectar una corriente conocida a través del microelectrodo para medir su impedancia. Esta corriente es comunmente de 1 nA, de forma de poder leer en el visor numérico 1mV por cada MΩ de impedancia. Para lograr este objetivo se requiere de un conductor adicional en el cable de conexión desde el aparato hasta el cabezal. Los cables disponibles en el mercado local que poseen varios conductores internos resultan poco flexibles, lo que implica que se puedan transmitir vibraciones hacia la punta del microelectrodo, lo que resulta indeseable. Por lo tanto se optó por colocar el circuito de medición dentro del cabezal para poder utilizar un cable más flexible. Tal circuito se esquematiza en la figura

preset de calibración

(1 nA)

77

6.7, y está compuesto por la resistencia de 1000 MΩ, el interruptor magnético (reed switch) y el preset de calibración. Cuando se aproxima un imán al cabezal se cierra el contacto del reed switch, lo que produce la inyección de una corriente de 1 nA a través del microelectrodo y provoca un cambio en la salida de 1mV/MΩ. Esto puede lograrse incluso teniendo el electrodo introducido dentro de la célula.

El conexionado en la plaqueta se realizó de acuerdo al siguiente esquema, para proveer una guarda electrostática alrededor del terminal de entrada.

Figura 6-8: Diagrama de la disposición de las pistas en la plaqueta donde se montó el circuito integrado OPA 129 para el preamplificador.

6.2.2 Compensación de capacitancia El circuito desarrollado en el presente trabajo no cuenta con compensación de capacidad porque en principio está destinado al registro de potenciales de acción cardíacos, cuyo curso temporal no posee componentes de alta frecuencia que puedan resultar afectados por el tiempo de establecimiento de esta configuración. Si bien se podría haber implementado, para realizar un diseño más versátil de aplicación al registro de potenciales de acción más rápidos, esto no pudo ser posible. La causa fundamental es la misma que se discutió para el medidor de resistencia del microelectrodo: la falta de cables en el mercado local que tengan múltiples conductores y sean suficientemente flexibles.

6.2.3 Circuito amplificador Esta parte del circuito está destinada a las siguientes funciones :

Acondiciona la señal del preamplificador a los niveles requeridos por la siguiente etapa (placa conversora A/D)

Provee una corrección del voltaje de offset.

Debido a que la señal de entrada se encuentra, a lo sumo, dentro de los ±100 mV y se desea aprovechar al máximo la resolución de la placa conversora, la ganancia fue fijada en un valor de 20. De esta forma, las señales a la entrada de la placa conversora estarán en un rango de ±2V, que, como se verá más adelante, se configuró para ±2,5 V.

La corrección de offset se implementó a través de un potenciómetro de 2K, con 10 vueltas de recorrido mecánico. Esto es para proveer la suficiente resolución en el rango de voltaje de offset que se pretende corregir, que es de ±200 mV.

En la siguiente figura se brinda el circuito empleado para implementar la etapa del amplificador.

terminal de entrada terminal de salida

guarda electrostática

78

3

26

1 5

7

4

T L081

3

26

1 5

7

4

T L081

10K (1% )

10 K (1% )

1 K

12 K 10 K

2 K (10 vueltas)

68 K 68 K

-15V

+ 15V

-15V

+ 15V

-15V+ 15V

aalida X 1

entrada del cabezal) aalida X 20

preset para ajustede ganancia

co rrecció n de o ffset (±200 m V ) Figura 6-9 : Circuito amplificador y corrector de offset.

6.2.4 Filtro pasabajo Esta parte del circuito fue diseñada teniendo en cuenta que se pueda registrar cualquier tipo de potencial de acción cardíaco. Como las frecuencias de interés de la señal difieren según la misma se trate de un potencial de acción auricular, sinusal o ventricular, debe poder cambiarse la frecuencia de corte del filtro según se necesite. El sistema fue provisto entonces de una llave selectora de tres puntos, cada uno de los cuales corresponde a frecuencias de corte de 100, 500 y 1000 [Hz]. Las frecuencias de 100 y 500 pueden ser usadas para las señales más lentas, como ser los potenciales de acción sinusales, mientras que la frecuencia de 1000 puede ser usada para los potenciales auriculares y ventriculares. Esta característica otorga cierta versatilidad al diseño, permitiéndole adaptarse fácilmente a cada una de las situaciones de registro.

Dado que las características de la señal que se pretende estudiar están todas en el dominio del tiempo, el tipo de filtro más adecuado para la implementación es un filtro Bessel. Los mismos tienen una excelente respuesta al escalón (mínimo sobreimpulso) debido a que son de fase lineal, y por lo tanto preservan todas las características temporales. Por otro lado, con el fin de obtener una atenuación aceptable en la banda de rechazo, se determinó que el filtro debía ser de orden cuatro.

Para su implementación se utilizó el circuito integrado UAF41 de Burr Brown[30], un filtro activo universal que puede ser configurado como pasa bajo, pasa alto, pasa banda o rechaza banda. Utiliza una arquitectura de variable de estado con un amplificador inversor y dos integradores. Éstos últimos incluyen capacitores de 1000 pF integrados en la pastilla con tolerancias del ±0.5%, lo que resuelve el problema de diseñar un filtro activo con un margen ajustado de tolerancia y bajo costo. Existe un cuarto amplificador operacional que puede ser utilizado para formar etapas adicionales o para filtros especiales tales como los rechaza banda o Chebyshev inverso.

A continuación se muestra un esquema con la configuración interna del UAF41.

lineal

79

Figura 6-10: Diagrama interno del filtro activo universal UAF41. (extraída de [30])

El diseño de los filtros se realizó utilizando el programa FilterPro, suministrado por Burr-Brown. Este es un programa especialmente diseñado para el cálculo de los valores de los componentes necesarios para la realización de un filtro a partir de las especificaciones del mismo. En general los filtros diseñados por este programa son implementados con integrados en cascada. El programa automáticamente selecciona los integrados requeridos y la configuración en que éstos deben ser dispuestos. Luego de ingresar los datos requeridos por el programa, se calculan automáticamente los valores de las resistencias. Además, si se necesitaran capacitores externos, el programa selecciona valores estándares de los mismos y calcula los valores exactos de las resistencias para el filtro seleccionado. También existe una opción para calcular el valor más cercano del componente al estándar con un margen de no más del 1% de tolerancia. El programa muestra además un diagrama en bloques con los integrados necesarios para implementar el filtro diseñado, con una etiqueta que muestra la configuración y, en caso de que el orden del mismo sea mayor a dos, el orden en que deben ser conectados los subcircuitos.

En las siguiente figura se muestra el circuito completo del filtro :

80

FREQ ADJ 18

FREQ ADJ 214

VIN 112

VIN 23

VIN 32

Q ADJ4

BND PASS OUT 7

HI PASS OUT 13

LO PASS OUT 1

AUX (-IN) 5

AUX (+IN) 4

AUX OUT 6

UAF41

RQ

88,7 K

RG

50 KEntrada

FREQ ADJ 18

FREQ ADJ 214

VIN 112

VIN 23

VIN 32

Q ADJ4

BND PASS OUT 7

HI PASS OUT 13

LO PASS OUT 1

AUX (-IN) 5

AUX (+IN) 4

AUX OUT 6

UAF41

RQ

88,7 K

RG

50 K

Llave selectora: 3posiciones - 4 salidas

100K200K

1M100K

1M200K

221K

110K

110K

1,1M221K

1,1M

Salida

Delamplificador

A la placaconversora

Figura 6-11: Diagrama del circuito empleado para implementar el filtro pasa bajo con frecuencia de corte

seleccionable. De acuerdo al dibujo, la posición inferior de la llave selectora configura el circuito para fc=100 Hz, la intermedia para fc=500 Hz y la superior para fc=1000 Hz.

81

6.2.5 Estimulador Para llevar cabo la estimulación de los preparados se utilizó un estimulador facilitado por la Cátedra de Fisiología y Biofísica de la FI-UNER, marca GALIX, modelo MA-7[31]. Se trata de un estimulador transesofágico portátil para uso en electrofisiología clínica. La mayoría de las prestaciones que presenta el aparato exceden las necesidades de este sistema, pero debido a que el aparato estaba disponible, se decidió utilizarlo en el sistema, evitando así incurrir en la compra o en la construcción de uno nuevo. Las características que posee el instrumento y son destacables para este sistema son :

• Frecuencia programable de 30 a 180 ppm (pulsos por minuto), en pasos de 5 ppm.

• Amplitud de pulso de 0,5mA a 25mA, en pasos de 0,5mA.

• Ancho de pulso de 2ms a 25ms, en pasos de 0,5ms.

La estimulación es extracelular: se provee a través de un par de electrodos de superficie de Ag/AgCl (ver Figura 6-12). Los electrodos son dos alambres de Ag aislados entre sí por tubitos de vidrio. En el extremo están doblados para no lastimar los preparados y poseen una capa de AgCl, depositada por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio 0,01 M. Ambos electrodos se conectan mediante conductores trenzados al estimulador, en una bornera de conexión provista por el aparato. Uno de los electrodos se conecta al terminal positivo del estimulador y el otro al terminal negativo. Los dos extremos de los electrodos están separados por una distancia de 1 a 2mm, para crear un campo de estimulación localizado durante la inyección de corriente.

Figura 6-12 : Esquema del sistema de estimulación.

6.2.6 Eliminación de interferencias Para la eliminación de interferencias provenientes de campos eléctricos se construyó una jaula de Faraday, con caños estructurales de 2x2 cm y una malla metálica de alambre (Figura 6-13). Fue provista de cuatro patas de 87 cm de altura, las que se fijaron al piso mediante tornillos. La misma fue conectada a una bornera de tierra común conectada a una jabalina. En la bornera de tierra común fueron conectados además todos los instrumentos electrónicos del sistema de registro, la superficie metálica de la mesa antivibratoria, la lupa, las bases magnéticas y el baño termostatizado.

electrodos desuperficie

bornera paraconexión

cable bipolarblindado

alambres de Agcon la puntaclorurada

cable trenzado

estimulador

82

Figura 6-13 : Fotografía mostrando las dimensiones y la ubicación física de la jaula de Faraday construida

6.2.7 Voltímetro digital El voltímetro está destinado a la salida del valor medio del potencial registrado por el microelectrodo. En este diseño sirve además para visualizar el valor de la resistencia del microelectrodo (a razón de 1mV/MΩ) cuando se cierra el interruptor magnético del cabezal. Para su construcción se utilizaron módulos de fuera de uso existentes en el laboratorio. El mismo está compuesto por un circuito conversor A/D ICL7016, que maneja un visor numérico de cristal cuarzo líquido (LCD) de 3 ½ dígitos. Permite así la visualización de potenciales de membrana de ±199.9 mV y resistencias de microelectrodo de hasta 199.9 MΩ.

6.2.8 Osciloscopio El osciloscopio usado es un instrumento que estaba disponible en el Laboratorio antes de comenzar el proyecto y que satisface los requerimientos del sistema. Por esta razón no fue necesario adquirirlo. Se trata de un osciloscopio digital Hitachi, modelo VC-6041(Z). La característica más importante para esta aplicación es que tiene capacidad de almacenamiento de hasta 4K por canal, lo que permite en el modo ROLL la observación de eventos de baja frecuencia como son las señales de los potenciales de acción. Las restantes características pueden hallarse en la referencia [32].

6.2.9 Comparación de las características del amplificador con modelos comerciales A fin de poder comparar las características del amplificador desarrollado con las de los modelos comerciales, a continuación se brinda una tabla donde se detalla el valor de los parámetros más representativos de cada uno.

120 cm

92 cm 60 cm

83

Tabla 6-II : Características de algunos modelos comerciales de amplificadores para registro intracelular. En la última columna se detalla el diseño del presente trabajo para poder realizar la comparación.

WPI

Electro 705[29]

WPI

Duo-773 (715P) [29]

Warner Instruments

IE-251[33]

FHC

Xcell-3[34]

Intracel

VF -180[14]

Diseño de este trabajo

resistencia de entrada

1012 Ω 1015 Ω >1011 Ω 1012 Ω 1011 Ω 1015 Ω

corriente de bias

10 pA 10 fA ajustable a cero

4 pA - 100 fA

ganancia de voltaje

x 1 x 1 x 1 ó x 10 seleccionable

x 10 x 1 ó x 10 seleccionable

x 1 ó x 20 seleccionable

rango de voltaje máx.

±5 V ±15 V - ±1 V - ±15V

nivel de ruido

500 µV p-p[a] <50 µV p-p[b]

500 µV p-p[a] - - 500µV p-p[b]

ancho de banda del circuito limitador

sin filtro incorporado

filtro LP: 1 a 30 kHz

variable en forma

continua

sin filtro incorporado

filtros: LP (.1, 1, 10, 50,

100, 1000 Hz) ; HP (50, 100,

500, 1K, 2K, 10K, 15K)

filtro LP (1, 10 kHz)

filtro LP (100, 500, 1000 Hz)

tiempo de estableci-miento (10-90%)

15 µs 25 µs[c] 10 µs[c] - 20 µs[d] 500 µs[e]

compensa-ción de capacidad

0 a 50 pF 0 a -10 pF 0 a 50 pF 10 a 100 pF 0 a 33 pF no posee

corriente de prueba del µE

1 nA 1 pA ó 1 nA seleccionable

1 nA onda cuadrdada. 1

kHz/1mV

1 nA 1 nA

ajuste del voltaje de offset

±300 mV ±300 mV ±200 mV ±2 V - ±200mV

visor numérico

no posee LED 3 ½ dígitos

no posee no posee LCD 3 ½ dígitos

LCD 3 ½ dígitos

precio U$S 1073.- (catálogo)

U$S 4563.- (catálogo)

- - - ver cap. 9

a Con la entrada conectada a masa a través de un resistencia de 20 M. b Con entrada conectada a masa c A través de una resistencia de entrada de 20 M y con compensación de capacidad. d A través de una resistencia de entrada de 10 M y con compensación de capacidad. e A través de un resistencia de 10 M.

84

Como puede verse, muchas de las características del amplificador diseñado y desarrollado en este trabajo son similares y hasta superan las de los modelos comerciales. La excepción es el tiempo de establecimiento, parámetro que tiene un valor elevado, por la falta de compensación de capacidad en el amplificador.

85

7. CAPÍTULO SIETE : SISTEMA DE ADQUISICIÓN DIGITAL DE LA SEÑAL

7.1.1 Características del hardware Como se mencionó previamente, el hardware esta compuesto por la PC y por la placa conversora A/D. En primer lugar se describirán cuáles son las características que se evaluaron para la elección de la PC y posteriormente para la elección de la placa conversora.

7.1.1.1 Computadora personal (PC) Las PC más difundidas actualmente en nuestro país son las IBM compatibles, operando bajo el sistema operativo Windows 95 de Microsoft. La gran mayoría de los programas utilitarios que se utilizan en el laboratorio trabajan bajo Windows 95. La elección de este sistema operativo, establece de cierta forma los requisitos mínimos indispensables para la PC. Windows 95 requiere para su correcto funcionamiento el siguiente hardware : Tabla 7-I: Requisitos mínimos e ideales de la PC para el sistema operativo Windows 95.

Sistema mínimo Sistema óptimo

Placa madre (motherboard) AT- 486 Pentium

Procesador 486 - 40MHz Pentium 133 MHz (o mayor)

Memoria 16 MB 32 MB (o más)

Disco rígido 200 MB 1 GB (o más)

Placa de video / monitor VGA SVGA

Entonces, en principio, mediante la configuración óptima quedaron determinados los requisitos para la PC. Esto es debido a que la diferencia de precio hoy en día no es significativa, no justificándose comprar un equipo de menor performance. Los puntos adicionales que se consideraron fueron:

◊ Capacidad de almacenamiento en forma permanente : Por cada día de experimentación se almacenan en promedio entre 30 y 40 archivos de datos con los registros de los potenciales de acción. Como se verá más adelante, en el apartado dedicado al software, los datos se guardan en archivos en formato de texto. Si se considera que los registros duran en promedio un minuto y se establece un frecuencia de muestreo de 1 kHz (1000 muestras por segundo), cada archivo contiene 60000 datos. Como cada dato (en formato real) ocupa 10 bytes de memoria, un archivo tipo ocupará 60000 datos x 10 bytes/dato = 600000 bytes ≈ 585 KB. Por lo tanto se necesitan 30 archivos x 585 KB/archivo = 17,5 MB por día de experimento. Afortunadamente este tipo de archivos puede comprimirse hasta un 80% de su tamaño, con lo que quedan finalmente unos 3,5 MB por día. Igualmente esto representa mucho espacio y los discos rígidos tienen una capacidad limitada. Se hace necesario entonces implementar un sistema de almacenamiento en forma permanente con gran capacidad y que sea más versátil que un disco rígido. Como mínimo, para cumplir con este requisito, se podrían

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utilizar diskettes de 3 ½” (1.44 MB). El problema es que con el tiempo se incrementa progresivamente la cantidad de diskettes acumulados, los que a su vez pueden llegar a dañarse, con la consecuente pérdida de los datos. La solución más conveniente hoy en día sería agregar una lectora/grabadora de CD-ROM. Además de encontrarse muy difundido el uso de los CD, por lo que resulta conveniente poseer una unidad lectora, estos discos pueden almacenar hasta 650 MB cada uno y son prácticamente inalterables con el tiempo.

◊ Salida en papel: El sistema debe contar con una impresora para permitir la salida en forma gráfica de los registros. Además, se pretende que la PC pueda servir para utilizar otros programas que utilizan la impresora, por lo que la presencia de la misma es indispensable. Mínimamente la PC debe contar con una impresora a chorro de tinta o a inyección de burbujas, blanco y negro. Idealmente, podría ser a color.

Dado que en el Laboratorio se disponía de una PC antes de comenzar con este proyecto, no fue necesario llevar a cabo la adquisición de la misma. Esta PC cuenta con las siguientes características :

- Placa madre 486 - DX2

- Procesador Intel 486 - 66 MHz

- 16 MB de memoria RAM

- Disco rígido : 1 GB

- Placa de vídeo VGA

- Monitor VGA color

- Unidad de diskettes de 3 ½”

- Impresora Cannon BJ-100, a inyección de burbujas, blanco y negro.

- Mouse

- Teclado español, 101 teclas

El sistema operativo que originalmente tenía la PC era DOS 6.0, y utilizaba también Windows 3.11. Se decidió entonces comprar el software Windows 95, ya que fue instalado en esta PC y en otra que se utiliza en el Laboratorio de Bioelectricidad, para el sistema de registro mediante “patch-clamp”.

Para el almacenamiento de los datos provenientes de los experimentos utiliza actualmente (en forma provisoria) el disco rígido, pero se prevé para el futuro la adquisición de una unidad lectora/grabadora de CD, por los criterios anteriormente expuestos.

7.1.1.2 Placa conversora A/D Evaluando las características de la señal con la que se está trabajando, se pueden definir los requisitos de la placa conversora para el sistema de adquisición :

◊ Número de entradas analógicas : este no es un requisito limitante, dado el sistema actualmente sólo necesita de una entrada analógica, para digitalizar la señal del potencial de acción proveniente del amplificador. Se puede prever para el futuro el agregado de otro canal, que podría tomar por ejemplo la señal proveniente de otro microelectrodo y la derivada analógica de cada uno de los canales. Igualmente la mayoría de las placas no tienen inconvenientes en proveer 16 canales de entrada de

87

terminación simple (u 8 diferenciales), lo cual resulta bastante holgado para esta aplicación.

◊ Frecuencia de muestreo : el ancho de banda máximo que puede tener la señal, de acuerdo a la frecuencia de corte del filtro implementado en el amplificador, es de 1 KHz. Considerando el uso simultáneo de hasta cuatro canales y aplicando el criterio práctico de muestrear a 4 veces la máxima frecuencia contenida en la señal, se tiene que la placa debe tener como mínimo una frecuencia de muestreo de 16 KHz.

◊ Resolución y rango: Una resolución de 12 bits resulta suficiente, ya que en este caso se tiene (400 mV de rango de señal/ 212 niveles posibles) = 97,6 µV ≈ 0,1 mV de resolución en la señal del potencial de acción. Esto permite discriminar variaciones muy pequeñas, en el orden del 0.025% del rango completo. La señal que se tiene a la salida del amplificador está en el rango de ±2 V, por lo que una placa que posea ±2,5 V de rango es suficiente.

◊ Ganancia : No es necesario proveer amplificación desde la placa de adquisición, por lo que una placa con ganancia x1 es suficiente para esta aplicación.

◊ Linealidad, precisión relativa y offset : valores aceptables para estos parámetros, para la aplicación que se está desarrollando son : no linealidad ±0,5 LSB ; precisión relativa ±0,5 LSB ; offset ±1 LSB. De esta forma se está asegurando no superar el error que siempre se comete al realizar la conversión, que es de ±1 LSB.

◊ Salidas analógicas : por el momento no se necesitan, por lo que no se considerará esta especificación.

◊ Entrada y salida digital (D-I/O): por el momento no se necesitan, por lo que no se consideraron sus especificaciones.

◊ Temporización : Los circuitos de temporización por el momento no se necesitan, por lo que no se consideraron sus especificaciones.

◊ Control de Acceso Directo a Memoria (DMA): En el caso de este trabajo, dado que se pretende que la PC realice la adquisición de las señales sólo en determinados intervalos de tiempo, durante los cuales no se realiza ninguna otra tarea que requiera la atención exclusiva del microprocesador, el uso de DMA no es un factor importante a tener en cuenta.

◊ Software: Como se mencionó previamente, la elección del software es un factor determinante en la decisión sobre la compra de una determinada placa. Evaluando entre comprar un paquete de software listo para usar y desarrollarlo mediante un lenguaje de programación a la medida de las necesidades del proyecto, se decidió esta última opción. Entre los posibles lenguajes que podían ser usados para la programación del sistema de adquisición, se decidió elegir el LabVIEW, de National Instruments. Las razones fundamentales fueron que es un software de programación específico para el desarrollo de herramientas de adquisición y procesamiento, viene con bibliotecas de subprogramas que aceleran y facilitan el desarrollo de los programas y, finalmente, se encuentra disponible en la Facultad. Más adelante, en la sección dedicada al software se brindarán más detalles acerca del LabVIEW.

Debido a la elección del software, la elección de las placas conversoras quedó restringida a aquellas que puedan ser controladas mediante los manejadores (drivers) del LabVIEW. Las placas que se evaluaron antes de decidir la compra fueron :

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- Digidata 1200, de Axon Instruments : Se pensó en esta placa dado que en el sistema para registro mediante “patch-clamp” ya se cuenta con una y ha otorgado excelentes resultados. Brinda la posibilidad de ser usada tanto con programas específicos de adquisición y procesamiento de señales electrofisiológicas y como con programas de desarrollo propio[35]. Como principales desventajas se tiene que posee un costo elevado (U$S 3100), hay que realizar los trámites de importación para comprarla y que los drivers de LabVIEW para manejarla son de una versión más actual (v3.1) del programa que la versión existente en la facultad (v3.0).

- Placas de National Instruments36: estas placas pueden ser manejadas sin inconvenientes por los programas generados en el LabVIEW, por ser ambos del mismo fabricante. De todas las placas evaluadas se decidió la compra de la PC-LPM 16 PnP ya que satisface los requisitos planteados en el principio de este apartado. Se la adquirió al representante de National Instruments en Argentina. A continuación se dan las características de la misma :

• 16 canales de entrada monopolares (8 en modo diferencial)

• Resolución de 12 bits

• Frecuencia de muestreo de 50 KHz

• Rangos de ±10V, ±5V y ±2,5V.

• Calibración por software (no hay que configurar ningún interruptor en la placa)

• Entrada/salida digital a través de dos líneas TTL de 8 bits.

• Dos contadores-temporizadores de 16 bits de resolución y frecuencia máxima de trabajo de 8MHz.

• Linealidad : ±1 LSB como máximo

• Precision relativa : ±1 LSB típico, ±1,5 LSB como máximo

• Error de offset : ±1 LSB típico, ±2 LSB como máximo

• Costo : $400.

7.1.2 Características del software : En este apartado se discutirán las características del software de adquisición, ya que como se dijo anteriormente, el sistema operativo escogido es el Windows 95. Como también se mencionó previamente, para el desarrollo de el programa de adquisición se utilizó el software LabVIEW de National Instruments.

7.1.2.1 Descripción del LabVIEW La mayoría de los lenguajes de programación utilizados en el desarrollo de un programa de aplicación necesitan que las sentencias sean introducidas en forma de texto (el denominado “código fuente”). Por esta razón se los denomina lenguajes de programación basados en texto. En cambio, en el LabVIEW los programas se desarrollan construyendo diagramas de bloque. Debido a esto se lo denomina lenguaje de programación gráfico[37].

El LabVIEW posee bibliotecas de funciones y subrutinas para la mayoría de las tareas de programación, adquisición de datos, control de instrumentación, análisis y almacenamiento de datos.

89

Los programas realizados con el LabVIEW se denominan Instrumentos Virtuales (VI’s) debido a la similitud que poseen con los instrumentos del mundo real. Los VI’s poseen tres características fundamentales :

1. Tienen una interfaz interactiva para el usuario llamada “panel frontal”. El panel frontal contiene botones, perillas, visores digitales y otros controles e indicadores. Se pueden ingresar o modificar parámetros a través del mouse o del teclado, y observar los resultados en la pantalla de la PC.

2. Reciben las instrucciones del código fuente equivalente o “diagrama de bloques”.

3. Son jerárquicos y modulares, esto es, pueden usarse como programas principales o como subprogramas de otros VI’s (sub-VI’s). LabVIEW emplea así el concepto de programación modular, ya que se puede dividir una aplicación compleja en una serie de tareas simples, que pueden ser ejecutadas en forma separada. Los subprogramas generados pueden servir además para la construcción de distintos programas.

7.1.2.2 Estrategias y técnicas de adquisición con LabVIEW En LabVIEW existen tres niveles de VI’s para realizar adquisición de datos: los de nivel básico (easy I/O), intermedio (intermediate) y avanzado (advanced). Los últimos son más flexibles y poderosos, y constituyen los bloques fundamentales para todos los otros sub-VI’s de adquisición. Los VI’s más básicos permiten programar muy rápidamente, pero cuentan con muchos parámetros establecidos por defecto que los vuelven poco flexibles[38].

Para la adquisición de datos, se definen tres formas de hacerlo mediante LabVIEW :

Adquisición Inmediata, sin uso de memoria intermedia (inmediate non-buffered): en esta forma de adquisición se realiza la lectura de la(s) entrada(s) de la placa a intervalos de tiempo preestablecidos por el programa. Es útil para la adquisición de cantidades prefijadas de datos, lo que se conoce como un “scan” de un canal o grupo de canales.

Adquisición Temporizada, sin uso de memoria intermedia (hardware timed non-buffered): en esta otra forma, el contador presente en la placa establece los intervalos de tiempo entre lecturas, por lo que la temporización es más precisa que en el modo anterior ya que el contador es independiente del microprocesador de la PC. Esta forma de adquisición es útil sólo para frecuencias de muestreo bajas (<1KHz).

Adquisición Temporizada, usando memoria intermedia (timed buffered): Si se necesita temporización precisa y a la vez una frecuencia de conversión alta, se utiliza este modo de adquisición, donde el LabVIEW transfiere los datos a intervalos temporizados desde la placa a un bloque de memoria intermedia (buffer). Este buffer puede ser simple (para adquirir una cantidad de datos prefijados) o circular (para el caso de una adquisición continua). En el primer caso se pueden leer los datos una vez que el programa haya terminado la adquisición, o bien leer porciones menores mientras la adquisición está en progreso. En el segundo caso habrá que cuidar de que no se llene el buffer más rápido de lo que el programa puede retirar los datos del mismo.

7.1.2.3 Descripción del programa de adquisición De las tres estrategias enunciadas en el apartado anterior se decidió utilizar la última : adquisición temporizada usando memoria intermedia. Para su implementación se utilizó un VI de nivel intermedio, obtenido de la biblioteca de subrutinas del LabVIEW. El VI es el denominado AI-Continuous Scan (AI-CS). Este VI realiza adquisición en forma continua de un canal o grupo de canales, almacena los datos en un buffer circular y entrega una

90

cantidad predeterminada de datos desde este buffer cada vez que se lo requiere. Es particularmente apropiado para esta aplicación ya que se necesita la adquisición en forma continua de la señal, para ser almacenada sólo en intervalos en que las condiciones del experimento lo requieran.

A continuación se realiza un diagrama de flujo donde se puede seguir la lógica de las operaciones realizadas por el programa de adquisición. Una descripción mas detallada del programa de adquisición se brinda en el apéndice II.

91

Figura 7-1 : Diagrama de flujo del programa de adquisición implementado en LabVIEW.

Durante la ejecución del programa, el procedimiento que debe seguir el usuario para grabar los datos es el siguiente (ver Figura 7-2):

1) Introducir el nombre para el archivo donde serán almacenados los datos, en la casilla rotulada en el panel frontal GUARDAR COMO.

se configura la placa deadquisición

inicio

se llama al sub-VI AI-CS, quellena un bloque de memoria

(buffer) con los datossolicitados que envía la placa

ocurrió algúnerror ?

no

si se muestra unmensaje de error

en pantalla

se vacía el bufferintermedio

se vacía el bufferintermedio

FIN

se transfieren los datosdel buffer a un vector

se dividen todos losvalores por 20 paracorregir el factor de

escala

se pulsó DETENER ?

no

si

se pulsó GRABAR ?

no

si

los datos se grafican enpantalla

se enciende el led VERen pantalla

se pulsó EVENTO ?

si

no

se introduce uncomentario al archivo

se envían los datos alarchivo

se enciende el ledEVENTO en pantalla

se enciende el ledGRABAR en pantalla

se enciende el ledDETENER en

pantallaFIN

92

2) Pulsar el botón GRABAR. El botón funciona como interruptor si/no : cuando se quiere detener la grabación simplemente hay que volver a pulsarlo para llevarlo a su estado inicial.

Los datos se almacenan en archivos con formato de texto. En este tipo de archivos los datos se ordenan en forma de tabla de resultados (en inglés spreadsheet). En esta tabla las columnas están separadas por tabuladores y las filas separados por saltos de línea[39]. Para llevar a cabo esta función, el programa desarrollado utiliza un VI obtenido de la biblioteca de subrutinas del LabVIEW, el denominado Write to Spreadsheet File-VI. Cada vez que se lo llama dentro del programa, este VI realiza los siguientes pasos :

1) Crea o abre el archivo indicado por el usuario. Si el archivo no existe, se crea uno con el nombre indicado por el usuario. Si en cambio el archivo ya existe, los nuevos datos se agregan a continuación de los que ya están guardados.

2) Ingresa los datos en el archivo en formato de texto.

3) Cierra el archivo.

Como ya se ha mencionado, para el almacenamiento de los datos se eligió el formato de texto. Este formato permite la lectura de los archivos desde la mayoría de las aplicaciones utilizadas para procesamiento y análisis estadístico, en particular por el STATISTICA (StatSoft®) y el Microcal Origin (Microcal Software Inc.®), utilizados en el Laboratorio donde se desarrolló este proyecto.

93

1. led indicador de que el programa está en modo visualización 2. botón y led indicador de grabación 3. botón y led indicador de detención del programa 4. ventana para ingresar el nombre del archivo donde almacenar los datos 5. marcador de eventos, led indicador y ventana para ingresar comentario 6. indicador de la frecuencia cardíaca promedio 7. indicador de la frecuencia de muestreo real 8. indicador gráfico de los potenciales de acción en pantalla.

Figura 7-2 : Panel frontal del VI, donde pueden observarse los distintos controles e indicadores disponibles

para el usuario

1

3

2

5

4

6

7

8

94

8. CAPÍTULO OCHO : DISEÑO DEL ESPACIO DE TRABAJO

Tal como se mencionó en el apartado 2.3.2, en este tipo de sistemas para registro lo ideal es que el operario trabaje sentado. En base a esta premisa se establecieron los lineamientos generales para el diseño de superficies de trabajo para personal sentado. Además se mencionaron criterios para la distribución general y específica de los diversos componentes dentro del sistema. En este capítulo se describe cómo fueron tenidas en cuenta las consideraciones de la superficie de trabajo y del espacio físico en la construcción del sistema.

8.1 Ubicación física El sistema fue instalado en un ambiente de aproximadamente 9 x 3 mts, destinado en forma compartida al Laboratorio de Bioinstrumentación y a la Cátedra de Bioingeniería II. Ocupa un área aproximada de 2 x 2 metros, dentro de dicho ambiente. La es una fotografía en la que se puede observar la ubicación física de los componentes del sistema.

Figura 8-1 : Fotografía que muestra la disposición física de los distintos componentes del sistema. 1) sector

donde se ubica el preparado y se realizan las maniobras de inserción del microelectrodo bajo la lupa; 2) sector destinado a los elementos de los sistemas de perfusión y gaseado; 3) sector destinada a la

instrumentación electrónica.

Si se toma como referencia al operario sentado de frente a su puesto de trabajo, los distintos elementos del sistema se pueden agrupar en tres sectores diferentes :

1. De frente: la cámara para el preparado en su sistema de soporte, el sistema de visualización (la lupa con su sistema de iluminación), el estimulador y los micromanipuladores.

2. A la izquierda : los elementos y controles que forman parte del sistema de perfusión de solución fisiológica y de perfusión de oxígeno (el reservorio para la solución, la bomba peristáltica, un tablero con las llaves de tres vías y el baño termostatizado) El tubo de oxígeno fue instalado fuera de este sector, en un lugar tal que no interrumpiera el paso,

2 1

3

95

no corra riesgo de voltearse accidentalmente y pueda ser retirado con facilidad para su recambio.

3. A la derecha: todos los controles e instrumentos electrónicos, los que fueron colocados en una repisa o “rack” sobre un escritorio: el osciloscopio, el amplificador, el control de temperatura, el control de iluminación, la fuente de alimentación de ±15V, el termómetro de la cámara. Encima del mismo escritorio se instaló la PC.

8.2 Superficie de trabajo Existen dos lugares dentro del área de trabajo del sistema que por sus características pueden considerarse como superficies de trabajo para el operario. Estas son la superficie de trabajo de la mesa antivibratoria y la superficie de trabajo del escritorio donde se coloca la PC y demás equipos. A continuación se considerarán cada una de ellas.

8.2.1 Mesa antivibratoria

8.2.1.1 Área Se consideró el área normal propuesta por Barnes, (Figura 2-23) en la que se tiene una superficie rectangular de 119,4 x 39,4 cm. La elección se debe a que las tareas que se realizan arriba de la mesa antivibratoria están restringidas a un espacio limitado, donde el operario sólo trabaja sobre la cámara con el preparado o con el micromanipulador. Por esta razón, la superficie de trabajo de la mesa antivibratoria fue diseñada con 110 cm de ancho y 50 cm de profundidad.

8.2.1.2 Altura De acuerdo a lo establecido en el apartado 2.3.3.3, se considera que la superficie de trabajo para personal sentado trabajando en un área de laboratorio, debe estar entre 86,4 y 96,5 cm. Como las tareas que se realizan sobre la mesa requieren de precisión manual, se trató de fijar un valor para la altura que estuviera próximo al máximo del rango. Además, esto mejora las características de las patas de la mesa antivibratoria, ya que al ser más altas pueden llenarse con más arena y ser más pesadas. De esta forma se tiene una mesa con una altura final de 94,5 cm. En la Figura 8-2 pueden observarse las dimensiones que establecen la altura de la mesa. Para que operarios con distintas características antropométricas puedan adecuarse a la superficie de trabajo fue menester colocar una silla con altura regulable.

96

Figura 8-2 : Vista frontal de la mesa antivibratoria. La zona sombreada indica el contenido de arena en las patas. Medidas en mm. (escala 1:100)

8.2.2 Escritorio

8.2.2.1 Área El área considerada para la superficie del escritorio fue tal que pudieran entrar el rack para los instrumentos y la PC. El rack fue construido con un ancho estándar de 19 pulgadas (48,26 cm) y un largo de 50 cm. La longitud fue establecida considerando el equipo de mayor dimensión en esa dirección, que es el osciloscopio. Como el ancho aproximado del monitor de la PC es de 40 cm, y se previó dejar lugar para el mouse, el ancho de la superficie del escritorio se fijó en 1,10 m. Para calcular la longitud de dicha superficie se consideró el espacio ocupado por el monitor (40 cm), el teclado delante de él (17 cm) y un espacio para apoyar las muñecas cuando se utiliza el teclado (5 a 10 cm). Por lo tanto se estableció una profundidad igual a 70 cm. En la Figura 8-3 se observa un diagrama del escritorio construido, donde están delineadas las áreas para el rack y los distintos componentes de la PC.

8.2.2.2 Altura La altura de al superficie del escritorio es de 78 cm, acorde al valor máximo establecido en el apartado 2.3.3.3. En el rack para los instrumentos las alturas pueden ser ajustables, pudiéndose ubicar cada uno de ellos al nivel deseado, como se verá más adelante. En la Figura 8-3 se observa un diagrama del escritorio construido, donde se indica la altura de la superficie de trabajo.

2010

25

700

80

50

60

945

97

Figura 8-3 : Esquema del escritorio mostrando tanto las áreas como las alturas de la superficie de trabajo.

Las áreas corresponden al rack (1), y los componentes de la PC: el monitor (2), el mouse (3), el teclado (4) y el gabinete que contiene la unidad central de procesamiento o CPU (5). Medidas en milímetros...

8.2.3 Espacio físico y distribución Para la distribución de los distintos componentes del sistema dentro del espacio físico se hizo uso de dos de los principios guías enunciados anteriormente : para la distribución general de los componentes se utilizaron los principios de importancia y funcional; para la distribución específica se utilizó sólo el principio funcional.

8.2.3.1 Situación general de los componentes Los elementos del sistema fueron agrupados en principio de acuerdo a su función. Nuevamente, si se considera al operario sentado de frente a la mesa antivibratoria, se tienen agrupadas a su alrededor las siguientes funciones :

Sistema de perfusión de solución fisiológica y burbujeo de oxigeno : ubicado a su izquierda. Los reservorios para la perfusión por gravedad fueron colocados en un estante de 30 x 43 cm ubicado a 1,80 m de altura. Más abajo, contra la pared, está el tablero de distribución de solución y de oxígeno. Un estante con las mismas dimensiones que el anterior, ubicado a 1,20 m de altura, sirve para apoyar la bomba peristáltica utilizada en el sistema de recirculación. El baño termostatizado por donde pasan las tuberías para ser calentadas se encuentra sobre la superficie de la mesa antivibratoria.

Sistema electrónico : ubicado a la derecha (ver Figura 8-4). Como se mencionó anteriormente, todo el instrumental electrónico, ya sea de visualización, de registro o de control, fue colocado sobre el escritorio, en el rack.

1100

700

r=55

170 450

400

400

780

130

140

400

200

435

500

500

480

12

3

4

5

98

Figura 8-4 : Fotografía mostrando la ubicación de los instrumentos, a la derecha del operario. Se han dibujado flechas para indicar las líneas de visión. La flecha del centro representa la línea horizontal de

visión, tomada como referencia (0o). Hacia abajo la línea de visión normal (-15o) y hacia arriba la línea de visión secundaria (+15-20o).

Dentro del rack los elementos fueron distribuidos de acuerdo al principio de frecuencia de uso :

• En la línea de visión normal, preferida para los displays visuales críticos, se ubico el osciloscopio. Este instrumento se observa casi de manera continua para controlar el estado del registro. Esto implica, por ejemplo, cuidar que no se ha salido el microelectrodo, observar que el preparado está siendo estimulado, etc.

• En la línea horizontal de visión, área preferida para controles primarios, se ubicó al amplificador. El control de offset y el indicador digital del voltaje de membrana que posee este instrumento se utilizan en forma frecuente durante el experimento.

• Más arriba, unos 15o por encima de la línea horizontal de visión, en el área destinada a controles secundarios, se ubicaron la fuente de alimentación regulable para el sistema de iluminación y el control de temperatura. El control de temperatura se fija al comienzo del experimento en una temperatura deseada y por lo general no se vuelve a tocar. La fuente de alimentación se utiliza muy poco, en ocasiones que es necesario disminuir el nivel de iluminación. Por ejemplo, para evitar el deslumbramiento cuando se quiere hacer una penetración muy precisa.

• En el último de los estantes del rack, en el área máxima de superficie para los controles secundarios, fueron ubicados un termómetro digital que indica la temperatura de la cámara con el preparado, y una fuente de alimentación de ±15 V utilizada para el amplificador y dicho termómetro.

En la Figura 8-5 se ha representado una vista frontal del escritorio y el rack, donde se puede observar la ubicación de los elementos recién descriptos.

99

Figura 8-5 : Vista anterior del escritorio y el rack con los instrumentos, ubicados cada uno en su sitio.

8.2.3.2 Situación específica de los componentes En este apartado se describen las consideraciones utilizadas en la disposición específica de los componentes de cada elemento desarrollado. A continuación se describirán sólo aquellos elementos en los cuales se prestó especial cuidado en la ubicación de los componentes, en los que fue aplicado el principio de agrupamiento funcional.

Tablero de distribución de solución y gas :

En este tablero, se manejan los flujos de solución de perfusión y de gas (carbógeno u oxígeno), a partir del accionamiento apropiado de llaves de tres vías. En la Figura 8-6 se esquematiza la vista anterior del tablero y el estante de apoyo de la bomba de recirculación. Se puede observar cómo están agrupadas las llaves de acuerdo al sistema al que pertenecen (de gas o de solución).

CPU (PC) impresora (PC)

mouse (PC)

teclado (PC)

monitor (PC)

osciloscopio

control de temperatura

fuente de alimentación del sist. de

iluminación

amplificador

fuente de alimentación

±15 V

termómetro digital

100

Figura 8-6 : Vista anterior del tablero de distribución de solución y gas, y del estante de apoyo de la bomba recirculadora. En el sector izquierdo se agrupan los controles de gas : 1) llave de control del burbujeo de gas en el reservorio de perfusión de solución por gravedad ; 2) llave de control del burbujeo de gas en la cámara

del preparado. En el sector derecho se agrupan los controles de solución : 3) llave que permite la selección de envío de agua o solución por gravedad hacia la cámara ; 4) llave para abrir/cerrar el desagote ; 5) llave de

selección del modo de perfusión entre circulación por gravedad, recirculación o circulación cerrada.

Amplificador :

En este instrumento, los diversos controles, indicadores y fichas disponibles para el usuario, se distribuyeron de acuerdo a su función.

Cabe aclarar que se utilizó un gabinete metálico de 19” de ancho, donde el lugar disponible en el panel frontal del mismo resultó más grande de lo necesario para la cantidad de controles y fichas colocadas. Sin embargo se dejó un espacio suficiente como para implementar en el futuro un segundo canal de registro completo.

En la Figura 8-7 se tienen, de izquierda a derecha e identificados por recuadros de color más claro, los siguientes grupos :

1. Sección de encendido y borne de puesta a tierra del chassis del equipo.

2. Sector de entrada/salida del amplificador, donde se tiene la entrada a través de un conector DIN de 3 pines, la salida sin amplificar (x1) a través de un conector BNC y la perilla de corrección de offset.

3. Sector destinado al filtro, donde se tiene la llave selectora de frecuencia de corte y la salida filtrada y amplificada x20 a través de un conector BNC.

4. Sector del indicador (voltímetro)

101

Figura 8-7 : Aspecto del panel frontal del amplificador desarrollado. 1) Sección de encendido y borne de puesta a tierra ; 2) Sector de entrada/salida del amplificador ; 3) Sector destinado al filtro ; 4) Sector del

voltímetro digital.

4321

102

Sección 3 : Pruebas del sistema

103

9. CAPÍTULO NUEVE : PRUEBAS DE BANCO

En este capítulo se desarrollarán los resultados obtenidos en las pruebas de banco del sistema desarrollado en el presente proyecto. A continuación se describen las pruebas realizadas a los subsistemas para el control de la temperatura, el control de las vibraciones y la electrónica de registro.

9.1 Control de temperatura Para evaluar el desempeño del sistema de control de temperatura se analizará la variación en la temperatura de la cámara en las condiciones de funcionamiento habituales, esto es, en circulación por gravedad y en recirculación.

9.1.1 Prueba en circulación por gravedad En esta prueba, en condiciones iniciales, el agua del baño termostatizado se hallaba a una temperatura de 25,3oC. El reservorio para la circulación por gravedad contenía agua destilada, la cual estaba una temperatura de 25,2oC. Se analizará la repuesta del baño y de la cámara ante un escalón de 4,7oC en el valor preestablecido de la temperatura en el controlador, lo cual se logró prefijando en el mismo una temperatura de 30oC para el baño. La siguiente figura muestra la repuesta del baño y de la cámara ante la mencionada maniobra.

0 5 10 15 20 25 30 3524

25

26

27

28

29

30

31

temp

erat

ura

( o C)

tiempo (min) Figura 9-1 : Respuesta ante un escalón de temperatura del sistema a) temperatura del baño (gráfica superior,

trazo negro) ; b) temperatura de la cámara (gráfica inferior, trazo azul).

En la gráfica se puede observar cómo difieren las dinámicas de cada subsistema. El baño responde al escalón como un sistema de segundo orden subamortiguado, con un máximo sobreimpulso producido aproximadamente a los ocho minutos y un error en estado

104

estacionario de ±0,1oC. Esto es razonable, ya que este tipo de controles tienen siempre un error en estado estacionario distinto de cero que oscila alrededor el valor de consigna. Este error se trató de minimizar en el diseño del sistema.

Lo más notable es la respuesta de la cámara ante el estímulo producido por la respuesta del baño (en este caso no se puede hablar de un respuesta al escalón). Esta respuesta es característica de un sistema de segundo orden sobreamortiguado. Puede observarse que en este caso el error en estado estacionario respecto de la temperatura prestablecida es prácticamente constante (o no es posible de detectar una variación del mismo con la resolución del termómetro utilizado). Se ha verificado en forma empírica que este error es siempre del orden de -2oC, dependiendo de la temperatura ambiente y de la velocidad de perfusión, y se produce debido a que la transferencia de calor entre el agua del baño y el agua que está circulando por las tuberías sumergidas en el mismo no tiene un 100% de eficiencia. La pequeña variación de temperatura observada a los 18 minutos se debe probablemente a la respuesta al sobreimpulso del baño, retardada por un tiempo muerto.

9.1.2 Prueba en recirculación Se parte de las condiciones del punto anterior, donde la temperatura del baño termostatizado es de 30 ± 0,1oC y la de la cámara 27,9oC. Se accionan las llaves correspondientes en el tablero de control y se enciende la bomba. La velocidad de la misma se fija en aproximadamente 120 r.p.m. y se observa el comportamiento de la temperatura de la cámara, el que se muestra en la siguiente figura. Al igual que la Figura 9-1, se representó en la gráfica de arriba el valor de temperatura del baño y en la de abajo la temperatura de la cámara.

0 5 10 15 20 25 30 3527,0

27,5

28,0

28,5

29,0

29,5

30,0

30,5

31,0

21

temp

erat

ura

( o C)

tiempo (min) Figura 9-2 : Comportamiento de la temperatura de la cámara en condiciones de recirculación. La flecha 1

indica el accionamiento de la bomba en 120 rpm. La flecha 2 indica el reajuste de velocidad a 140 rpm.

En principio, cuando se establecen las condiciones de recirculación (flecha 1 en la Figura 9-2), existe un pequeño descenso de la temperatura en la cámara debido a que las

105

mangueras de la bomba estaban vacías y debían purgarse. Luego, la temperatura alcanzada en la cámara es 0,2oC superior a la que tenía antes de la recirculación. Esto es debido a que la velocidad con la que se está recirculando es inferior a la velocidad con la que se estaba circulando por gravedad, con lo que el agua permanece en el baño termostatizado por más tiempo durante el cual puede elevar su temperatura. La flecha 2 en la Figura 9-2 indica el punto en el que la velocidad se aumenta hasta 140 rpm, con la cual se alcanza la temperatura que tenía la cámara inicialmente.

En las condiciones normales de trabajo hay que cuidar de tener la bomba ya purgada y de tener la velocidad establecida en el valor adecuado (aprox. 140 rpm). De esta manera se trata de minimizar la variación de las condiciones que tiene la cámara en el estado previo a la recirculación.

9.2 Sistema mecánico El sistema mecánico, constituido por la mesa antivibratoria y los sistemas de soporte del preparado y el micromanipulador, fueron ensayados mediante pruebas relativamente sencillas. El ensayo de estructuras mecánicas antivibratorias requiere de complejos equipamientos, capaces de producir una entrada adecuada y medir la respuesta producida en la estructura. Por ejemplo, para obtener la curva de transmisibilidad habría que mover el piso con una fuerza de variación sinusoidal, con la que se realiza un barrido de frecuencias y se mide el desplazamiento de la superficie de trabajo.

Para medir en forma práctica el desempeño de la estructura construida, se recurre al siguiente ensayo : Se coloca un preparado biológico en la cámara y se registra el potencial de reposo. En estas condiciones normales de medición el sistema mecánico se excita con un “impulso”. Este impulso se provoca arrojando un peso de 70kg desde una altura de 10 cm. en el suelo, 15 cm por delante y en el centro de las patas de la mesa antivibratoria. Las mediciones se realizan con la estructura en condiciones normales (superficie desacoplada del suelo a través de las cámaras de aire) y con la estructura acoplada al suelo (colocando tacos de madera en reemplazo de las cámaras). A continuación se muestran los resultados obtenidos en cada caso, registrados de la pantalla del programa de adquisición.

106

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

pote

ncial

(V)

tiempo (seg)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

Figura 9-3 : Respuesta de la estructura en estado normal (desacoplado) ante la excitación descripta en el párrafo. El microelectrodo (R=22MΩ) está insertado en el interior de una célula, la que no presenta

potenciales de acción por estar el estimulador apagado. La flecha indica el instante en el que se arroja el peso. No existe ningún efecto perceptible sobre el registro.

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

tiempo (seg)

pote

ncial

(V)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

Figura 9-4 : Respuesta de la estructura, cuando se encuentra acoplada la superficie al suelo, ante la

excitación descripta en el párrafo. Las demás condiciones son idénticas a las de la figura anterior. La flecha indica el instante en el que se arroja el peso. Puede verse el efecto sobre el potencial de reposo.

107

A continuación se muestran los efectos indeseables de la vibración mecánica, producidos sobre el registro de los potenciales de acción por el movimiento de la superficie de trabajo. En el primer caso (Figura 9-5) se muestra la rotura del microelectrodo durante la realización de un registro de potenciales de acción sinusales. Esta situación resulta sumamente indeseable, ya que hay que recambiar el microelectrodo y buscar otro sitio de inserción, lo que representa una pérdida de tiempo considerable. El segundo caso () representa el “desempalamiento” de una célula durante un registro de potenciales de acción auriculares. No se llega a la rotura del microelectrodo pero el registro debe interrumpirse hasta reacomodar el mismo.

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

pote

ncial

(V)

tiempo (seg)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

Figura 9-5 : Rotura del microelectrodo producida por la vibración mecánica del la superficie. Puede

observarse que en el momento de producirse la interferencia (indicado por la flecha) se interrumpe el registro y el potencial tiende bruscamente a cero por la rotura de la punta del electrodo.

108

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

pote

ncial

(V)

tiempo (seg)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

pote

ncial

(V)

tiempo (seg)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

Figura 9-6 : Pantallas sucesivas mostrando una secuencia de “desempalamiento”, producida por la vibración mecánica del la superficie. En el momento de producirse la interferencia (indicado por la flecha) el registro

cambia : el potencial se hace más positivo y los potenciales de acción disminuyen de amplitud. Este registro debe descartarse.

9.3 Sistema electrónico de registro

109

En este apartado se describen las pruebas realizadas al circuito amplificador. En primer lugar se analizan las características de microelectrodos fabricados con diferentes parámetros, para determinar las condiciones óptimas de registro. Luego se analizan las características relativas al ruido presente en los registros.

9.3.1 Microelectrodos Como se mencionó en el apartado 6.1.3, el estirador de micropipetas posee una variedad de parámetros ajustables, los que se usan para determinar las propiedades de los microelectrodos fabricados (en especial su resistencia eléctrica y la forma de la punta). Hasta encontrar el valor aceptable para estos parámetros se realizaron varias pruebas, las que a su vez produjeron microelectrodos con valores diferentes de resistencia mecánica y eléctrica. Las propiedades mecánicas pueden deducirse a partir del valor de resistencia, teniendo en cuenta que electrodos con puntas más finas y flexibles tienen resistencias mayores que los que poseen puntas mas cortas y rígidas. En las siguientes figuras se muestran tres registros llevados a cabo con microelectrodos de diferente forma y resistencia. En las gráficas, el valor de resistencia puede determinarse midiendo la altura del pulso producido por la inyección de la corriente de prueba, a razón de 1 mV/MΩ.

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

tiempo (seg)

pote

ncial

(V)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

Figura 9-7 : Medición de la resistencia de un microelectrodo de aproximadamente 47 MΩ.

110

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

tiempo (seg)

pote

ncial

(V)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

Figura 9-8 : Medición de la resistencia de un microelectrodo de aproximadamente 22 MΩ.

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

pote

ncial

(V)

tiempo (seg)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

Figura 9-9 : Medición de la resistencia de un microelectrodo de aproximadamente 5 MΩ.

Como puede observarse, el ruido presente en el registro es proporcional a la resistencia del microelectrodo empleado. A partir de las propiedades observadas en estos microelectrodos (y en otros que produjeron resultados no mostrados aquí), tales como el nivel de ruido presente en el registro y sus propiedades mecánicas, se determinaron los parámetros de fabricación que se muestran en la tabla Tabla 6-I.

111

9.3.2 Amplificador y sistema de eliminación de interferencias En este punto se evalúan las características de ruido presente en el sistema de registro para diferentes condiciones experimentales. Los registros fueron obtenidos con microelectrodos de 5 MΩ sumergidos en la cámara sin la presencia del preparado. En la Figura 9-10 se observa la pantalla normal de registro con tres condiciones diferentes de ruido presente en el sistema .

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

pote

ncial

(V)

tiempo (seg)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

Figura 9-10 : Observación cualitativa del nivel de ruido presente en el sistema. De arriba hacia abajo: 1)

iluminación y baño termostatizado apagados, 2) iluminación encendida y baño apagado y 3) ambos encendidos. El trazo superior y el inferior presentan un offset para poder comparar los registros entre sí

La siguiente figura es un detalle ampliado de la misma situación representada en la Figura 9-10.

112

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,02

-0,01

0,00

0,01

0,02

tiempo (seg) Figura 9-11 : Vista ampliada de los niveles de ruido presentes en el sistema en las mismas condiciones que

la figura anterior : trazo negro - iluminación y baño termostatizado apagados, trazo rojo - iluminación encendida y baño apagado y trazo azul - ambos encendidos. Obsérvese que en el peor de los casos el ruido

llega a tener un valor de 1mV pico a pico.

Se puede concluir que el ruido introducido en el peor de los casos no representa una interferencia significativa sobre los registros, aunque idealmente el ruido a la salida debería ser menor a la resolución de la placa de adquisición que en este caso es de 0,1 mV.

113

10. CAPÍTULO DIEZ : VERIFICACIÓN DEL SISTEMA MEDIANTE UN EXPERIMENTO “IN VITRO”

10.1 Uso del sistema completo Finalmente se detalla el desarrollo de un día de experimentación, donde se muestran los registros obtenidos en el transcurso del mismo

Para realizar una evaluación del sistema completo se describirá su utilización a lo largo de un día de experimentación y luego se mostrarán los registros obtenidos.

10.1.1 Preparación del experimento Para comenzar se realiza el accionamiento de la llave principal de alimentación de energía eléctrica. Luego se procede al encendido de todos los equipos: PC, osciloscopio, control de temperatura, amplificador, termómetro digital y bomba de vacío, accionando las llaves correspondientes. También se fija el valor de temperatura deseado para el baño termostatizado en el panel del control de temperatura..

Se comienza a circular agua destilada para lavado por el sistema de tuberías y a través de la cámara. Para tal fin, se acciona una llave de tres vías del tablero destinado al control de la perfusión de líquido y gas, llevándola a la posición “lavado”.

El sistema permanece en este estado por aproximadamente una hora, mientras alcanza su estado de régimen. Mientras tanto se preparan 4 litros de solución de Tyrode para la perfusión, para lo cual se pesan las sales correspondientes (ver apartado 3.1) y se realiza la dilución en agua destilada. También se aprovecha para estirar el vidrio para fabricar varios microelectrodos (unos 10 ó 16).

Una vez preparada la solución, se controla el pH para ajustarlo, si es necesario, a un valor entre 7,3 y 7,4. Se coloca el frasco de solución en el estante superior del sitio destinado a la perfusión de líquido y gas. Se cambia la llave de tres vías del tablero a la posición “por gravedad” y con esto se da comienzo a la circulación de solución a través de la cámara. Se acciona además las llaves del tablero que dan comienzo al burbujeo del oxígeno en el reservorio y en la cámara.

Luego se lleva a cabo la disección del tejido del animal de experimentación. Para la realización del experimento se utilizan conejos neocelandeses de aproximadamente 30 días de edad. Se suministra un anestésico (pentobarbital sódico) en una dosis de 70 mg/kg de peso del animal, en forma intraperitoneal. Se inyecta además heparina, como anticoagulante, a razón de una unidad por gramo de peso. Luego de 10 a 15 minutos, cuando se produce la anestesia profunda, se toracotomiza el animal y se le extrae el corazón. Bajo lupa, se realiza la disección de los tejidos de interés. Esta operación la realiza sentado y trabajando sobre una mesada cercana al set-up. Una vez finalizada la disección, se lleva el tejido hasta la cámara que ya tiene la solución circulando a temperatura controlada. Se coloca el tejido en la cámara y se lo fija mediante agujas de entomología para evitar una excesiva contracción mecánica. Si el tejido no presenta automatismo, habrá que encender el estimulador y para comenzar la estimulación. Hay que verificar que el tejido efectivamente se esté estimulando, de lo contrario el preparado se deteriora y puede fracasar el experimento.

114

A continuación se espera aproximadamente una hora para que el tejido se adecue a las condiciones experimentales de la cámara. A partir de ese momento se puede comenzar con los registros, que se describen en el siguiente apartado.

10.1.2 Realización de los registros Se llena un microelectrodo y se coloca en el holder que lo conecta al cabezal del amplificador. Luego, observando a través de la lupa binocular, hay que acercarse con el microelectrodo al tejido que está en la cámara mediante el micromanipulador. Una vez que el electrodo está sumergido en la cámara se observa la presencia de señal en el osciloscopio. Se ajusta el control de offset del amplificador hasta llevar el voltaje a cero. Luego se comprueba la integridad del microelectrodo midiendo su resistencia.. Si se encuentra dentro de los límites aceptables (5 a 10 MΩ), se puede iniciar el proceso de inserción. En caso contrario, se debe cambiar el microelectrodo.

Una vez que se logró ubicar un sitio de interés a través de la lupa, se realiza una aproximación “gruesa” del microelectrodo. Luego, con el movimiento fino del eje X del micromanipulador se realiza una segunda aproximación, denominada “a ciegas” ya que no se mira a través de la lupa sino que se observa la señal en la pantalla del osciloscopio. Cuando el registro en la pantalla es el esperado para un potencial de acción normal, se puede dar comienzo a la adquisición de datos a través de la PC.

Siempre al comienzo de cada experimento se realiza un registro de las condiciones basales. Se debe colocar el nombre del archivo donde se desean guardar los datos y se debe accionar (mediante el mouse) la tecla que indica la operación GRABAR en el programa de adquisición. Una vez que se adquirieron los datos necesarios, se vuelve a oprimir la tecla GRABAR, y el programa continúa mostrando los datos pero sin guardarlos en el disco.

Luego, la secuencia posterior depende del tipo de experimento que se desee realizar. Por lo general los experimentos tienen en común la siguiente operativa:

1. Se accionan las llaves de tres vías del tablero destinado a la perfusión de líquido, llevándolas a la posición indicada como “recirculación”.

2. Se enciende la bomba de recirculación.

3. Se realiza la maniobra correspondiente, por ejemplo echar un volumen de alguna sustancia dentro de la cámara y se espera un tiempo para estabilización.

4. Luego de la estabilización (aprox. 10 a 15 minutos) se procede a realizar los registros

5. Luego de realizar los registros, se apaga la bomba y se vuelve a colocar las llaves en la posición “normal”.

Esta última secuencia de cinco pasos se repite varias veces durante el día de trabajo, siempre con el mismo preparado. Lo que se va cambiando es tipo de sustancia que se echa al preparado, de la cual se quiere estudiar el efecto sobre el potencial de ación del tejido. En el caso del proyecto al que está destinado este sistema, se utilizan diversos agonistas y antagonistas de los receptores beta-adrenérgicos. En particular se está estudiando el efecto de fracciones séricas purificadas obtenidas de pacientes chagásicos.

Al finalizar el día de experimentos se retira el tejido de la cámara y se realiza un lavado de la misma con agua destilada. Posteriormente se apagan todos los equipos.

115

10.1.3 Registros obtenidos A continuación se muestran registros de potenciales de acción de tejidos de diferentes zonas del corazón de conejo, los que fueron obtenidos utilizando el sistema desarrollado en el presente trabajo. Se puede realizar una comparación con los registros indicados en la bibliografía para el corazón de mamíferos en general (Figura 2-4).

Los registros se muestran tal como se observan en la pantalla del programa de adquisición. Todos ellos fueron obtenidos de diferentes corazones en condiciones normales, es decir en circulación de Tyrode por gravedad, sin el agregado de ninguna sustancia cardioactiva.

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

pote

ncial

(V)

tiempo (seg)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

Figura 10-1 : Registro del potencial de acción espontáneo del nódulo sinusal. Temperatura de la cámara

33.1±0,1oC, resistencia del microelectrodo 10 MΩ, frecuencia de muestreo 1kHz.

116

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

pote

ncial

(V)

tiempo (seg)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

Figura 10-2 : Registro del potencial de acción espontáneo en el músculo auricular, generado desde el nódulo

sinusal.. Temperatura de la cámara 31.5±0,1oC, resistencia del microelectrodo 25 MΩ, frecuencia de muestreo 1kHz.

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000-0,10

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

pote

ncial

(V)

tiempo (seg)

-0,09

-0,07

-0,05

-0,01

-0,03

0,01

0,03

0,05

Figura 10-3 : Registro del potencial de acción del músculo ventricular. En este caso se trata de tejido

endocárdico de ventrículo izquierdo. Temperatura de la cámara 32.5±0,1oC, resistencia del microelectrodo

117

10 MΩ, frecuencia de muestreo 1kHz. Estimulado a 70 ppm, con un pulso de 4 mA de amplitud y 4 mS de duración.

Como puede verse, en cada caso se obtuvieron morfologías de los potenciales de acción esperados, coincidentes con lo observado en la bibliografía :

En el nódulo sinusal un potencial espontáneo con una fase cero inexistente y una despolarización sostenida en fase 4. Además, un potencial diastólico máximo de alrededor de -60 mV y un potencial de pico de aproximadamente 0 mV.

En el músculo auricular un potencial también espontáneo, debido a la presencia del nódulo sinusal en el preparado, y las fases características de este tipo de potencial, con una duración del mismo de unos 100 mseg. Un potencial de reposo de aproximadamente -70 mV y un potencial de pico de unos 30 mV.

En el músculo ventricular un potencial estimulado (ver artefactos del estimulador) y las fases características de este tipo de potencial, con una duración del mismo de unos 200 mseg. Un potencial de reposo de aproximadamente -80 mV y un potencial de pico de unos 20 mV.

A partir de los resultados obtenidos se puede decir que se han alcanzado en forma satisfactoria los objetivos planteados al comienzo del trabajo: se ha dejado en funcionamiento, en el Laboratorio de Bioelectricidad de la FI-UNER, el sistema completo de registro de los potenciales de acción con microelectrodos intracelulares.

Adicionalmente cabe destacar que los experimentos realizados con este sistema (o partes del mismo) han dado lugar a dos presentaciones a congresos por parte del grupo de investigación del Laboratorio de Bioelectricidad :

• En el mes de marzo de 1998 se ha presentado el trabajo “Frecuencia del latido sinusal: dependencia con la temperatura” en el 8o Congreso Argentino de Ciencias Morfológicas, realizado en Tandil, provincia de Bs. As. El trabajo fue realizado haciendo uso del control de temperatura en un sistema de registro con electrodos de superficie.

• En el mes de diciembre de 1998 se presentó el trabajo “Efecto de sueros de individuos con serología positiva para Chagas, sobre el potencial de acción cardíaco” en el 18o Congreso de la Sociedad Argentina de Biofísica, realizado en La Plata, provincia de Bs. As. En este trabajo se estudiaron los potenciales de acción de músculo ventricular de conejos mediante el uso del sistema de registro completo.

118

Sección 4 : Aspectos Económicos

119

11. CAPÍTULO ONCE : ANÁLISIS DE COSTOS

En la primera parte de este capítulo se analizan los costos involucrados en la etapa de investigación y desarrollo del sistema de registro implementado. En una segunda parte se analizan los costos de producción relativos al proyecto, a fin de poder estimar el precio de venta del mismo. Debido a que el sistema representa un desarrollo destinado al área de investigación, resulta difícil evaluar el tamaño del mercado potencial que podría utilizarlo, por lo que se consideró el costo unitario de producción.

Antes de comenzar con la descripción de los costos en particular, cabe realizar una definición muy importante, que será mantenida a lo largo de todo el capitulo. Dentro del rubro Equipamiento, se ha considerado conveniente definir dos subgrupos :

A) Un subgrupo A, en el que se incluyen todos aquellos equipos diseñados y desarrollados, (como por ejemplo el amplificador, el sistema de control de temperatura, el software y la mesa antivibratoria).

B) Un subgrupo B, donde se consideran aquellos equipos que fueron comprados (como ser por ejemplo la PC, el osciloscopio, la placa conversora, etc.)

11.1 Costos de Investigación y Desarrollo Los costos de Investigación y Desarrollo (I+D) se valoraron a través de dos enfoques diferentes. En el primero se calcularon los costos de I+D reales, es decir aquellos en los cuales hubo que incurrir en la realización del presente proyecto. En el segundo enfoque se consideraron los costos hipotéticos que hubiera insumido la implementación del proyecto a precio de mercado de los factores. De esta forma es posible realizar un análisis comparativo que muestre en términos económicos la ventaja de haber realizado este proyecto con recursos de la Facultad.

11.1.1 Costo de I+D real Considerando el desarrollo en el marco institucional de la Universidad, los costos de personal se referirán a ella y se incluirán también los gastos involucrados en el funcionamiento de un laboratorio de desarrollo en la institución.

11.1.1.1 Personal El cálculo del costo de la hora de trabajo se realiza en base a la Beca de Iniciación a la Investigación en la Universidad Nacional de Entre Ríos, a un valor de $3,10 la hora.

Item Costo ($) Subtotal ($)Diseño y desarrollo del equipamiento A (280 hs) 868,00Evaluación, selección y compra del equipamiento B (80 hs) 248,00Montaje del equipamiento A y B (250 hs) 775,00Puesta a punto del sistema completo (120 hs) 372,00

2263,00

120

11.1.1.2 Equipamiento En este ítem se consideran todos los bienes y equipos adquiridos o desarrollados para la implementación del sistema completo. Se los clasificó en planillas de acuerdo a cada subsistema en particular.

Sistema ambiental Item Costo ($) Subtotal ($)Perfusión de solución fisiológicaMangueras de PVC transparente, tamaños varios 20,00Acrílico para cámara 15,00Elastómero ("Sylgard") 72,00Llaves de tres vías 12,00Bomba peristáltica 400,00Manguera de tygon 80,00Frasco para perfusión de solución fisiológica 100,00Reservorio de PVC para agua destilada 80,00

779,00Perfusión de gasTubo de carbógeno 350,00Válvula reductora + Manómetro 140,00Mangueras de PVC transparente, tamaños varios 20,00Llaves de tres vías 12,00

522,00Control de temperaturaFuente de alimentación de 110V (CC) 120,00Control de temperatura 125,00Termómetro digital 65,00Bloque de aluminio 6,00Baño termostatizado 140,00

456,00Sistema auxiliar de vacíoBomba neumática 180,00Frasco de vidrio para trampa 50,00Mangueras de PVC transparente, tamaños varios 20,00

250,002007,00

Sistema mecánico

Item Costo ($) Subtotal ($)Mesa antivibratoria 355,00Estructura de soporte 35,00Bases magnéticas 320,00Micromanipulador Narishige 900,00Micromanipulador Taurus 600,00

2210,00

121

Sistema óptico Item Costo ($) Subtotal ($)Fuente de alimentación 60,00Lámpara + portalámpara 25,00Lupa binocular 1200,00Cables, fichas de conexión 5,00

1290,00

Sistema de registro analógico Item Costo ($) Subtotal ($)Agujas para llenado 74,00Sujetador para el microelectrodo ("holder") 48,00Amplificador 150,00Estimulador 1100,00Osciloscopio digital 4300,00Jaula de Faraday 25,00Materiales eléctricos varios 32,00

5729,00

Sistema de adquisición digital

Item Costo ($) Subtotal ($)PC + impresora 1200,00Sistema operativo Windows 95 200,00Software de adquisición (LabVIEW 3.00) 400,00Placa de adquisición PC-LPM 16 1200,00

3000,00

Accesorios varios

Item Costo ($) Subtotal ($)Escritorio para PC 120,00Silla de altura regulable 85,00Material para el rack 30,00Estantes de madera 10,00Herrajes varios (tornillos, ménsulas, etc) 20,00

265,00

11.1.1.3 Materiales En este apartado se detallan los insumos requeridos para la realización de los experimentos de puesta a punto del sistema desarrollado. Cabe aclarar que se ha considerado un total de cinco experimentos de puesta a punto.

Item Costo ($) Subtotal ($)Drogas varias para el preparado de soluciones 100,001/3 de carga del tubo de carbógeno 12,00Vidrio para microelectrodos 13,00Baterías de 9V para estimulador 10,00

135,00

122

11.1.1.4 Gastos preoperativos Item Costo ($) Subtotal ($)Bibliografía 70,00Comunicaciones (teléfono, fax, internet, correo) 40,00Transporte 120,00Fotocopias 25,00Servicios del laboratorio (gas, luz) 25,00

280,00

11.1.1.5 Costo total Item Costo ($) Total ($)Personal 2263,00Equipamiento 14501,00Consumibles 135,00Gastos preoperativos 280,00

17179,00

13%

84%

2%1%

PersonalEquipamientoConsumiblesGastos preoperativos

Figura 11-1 : Distribución relativa de los costos de I+D reales.

11.1.2 Costo de I+D a precio de mercado de los factores En este apartado se considera el costo que hubiera insumido el proyecto a precio de mercado de los factores. Se modifica únicamente el rubro personal, que se calcula a partir del precio de mercado para la hora de trabajo de un ingeniero novel ($8,00) y de un técnico ($4,00).

11.1.2.1 Personal Item Costo ($) Subtotal ($)IngenieroDiseño y desarrollo del equipamiento A (280 hs) 2240,00Evaluación, selección y compra del equipamiento B (80 hs) 640,00Supervisión de las tareas del técnico (40 hs) 320,00TécnicoMontaje del equipamiento A y B (250 hs) 1000,00Puesta a punto del sistema completo (120 hs) 480,00

4680,00

11.1.2.2 Equipamiento Se mantiene igual que 11.1.1.2

123

11.1.2.3 Materiales Se mantiene igual que 11.1.1.3

11.1.2.4 Gastos preoperativos Se mantiene igual que 11.1.1.4

11.1.2.5 Costo total

Item Costo ($) Total ($)Personal 4680,00Equipamiento 14501,00Consumibles 135,00Gastos preoperativos 280,00

19596,00

24%

74%

1%1%

PersonalEquipamientoConsumiblesGastos preoperativos

Figura 11-2 : Distribución relativa de los costos de I+D a precio de mercado de los factores.

11.1.3 Comparación de los costos de I+D En la siguiente figura se han representado los costos de I+D reales y los costos de I+D a precio de mercado de los factores, a fin de poder realizar una comparación entre ellos.

Pers

onal

Equi

pam

ient

o

Con

sum

ible

s

Gas

tos

preo

pera

tivos

Tota

l

0

5000

10000

15000

20000

cost

o ($

)

costo I+D real costo I+D a precio de mercado Figura 11-3 : Diagrama de barras representando los componentes de los costos de I+D descriptos

previamente

Tal como puede verse, los costos reales del proyecto fueron menores a los costos a precio de mercado. Esto se debe a una economía en el valor de la mano de obra utilizada para el

124

proyecto. Se puede ver entonces que utilizando recursos humanos propios (becario) se produjo un ahorro importante, de aproximadamente un 15% del costo total.

11.2 Estimación del precio de venta Como se mencionó previamente, dado que el presente proyecto constituye un desarrollo para el área de investigación, resulta difícil estimar su demanda potencial. Por lo tanto se considera el costo de producción unitario del proyecto, para poder estimar el precio de venta del desarrollo a un posible comprador externo.

En primer lugar se calcula cuál sería el precio de venta del sistema desde la Universidad. Luego se realiza un análisis del precio que tendría un sistema similar, constituido en su totalidad por equipamientos comerciales.

11.2.1 Producción en la Universidad Para la determinación del costo total de producción en la Universidad se consideraron todos los recursos económicos e insumos que habría que desembolsar para la reproducción del proyecto, desglosados en costos directos y costos indirectos. Entre los costos directos se incluyeron los costos de personal, equipamiento y materiales. Entre los costos indirectos se consideraron los servicios generales del laboratorio (luz, gas, teléfono, etc.), la amortización y el mantenimiento de los equipos, etc. Para obtener un valor estimado del precio de venta se consideró un porcentaje de utilidades sobre este costo total. Dado que el desarrollo tuvo su origen en la Universidad, para el cálculo de dichas utilidades se utilizó un criterio propuesto por la misma para este mecanismo[f]. Este indica que hay que adicionar entre un 20 y un 25% al costo total de producción para establecer el valor final del producto, en concepto de margen de beneficio universitario. El margen de beneficio universitario corresponde a la utilidad económica en concepto del valor intrínseco que contiene todo trabajo realizado en el seno mismo de la producción del conocimiento, que es la Universidad.

En la planilla que se presenta a continuación se realizaron las siguientes consideraciones :

a) COSTOS DIRECTOS :

• Personal : La mano de obra se consideró de $1960, donde $1480 corresponden a 370 hs de trabajo de montaje y puesta a punto de un técnico y $480 a 60 hs de trabajo de supervisión y tramitación de compras por parte de un ingeniero novel, ambos a precio de mercado de los factores.

Item Costo ($) Subtotal ($)IngenieroTramites de compra (20 hs) 160,00Supervisión de las tareas del técnico (40 hs) 320,00TécnicoArmado del equipamiento A (80 hs) 320,00Montaje del equipamiento A y B (170 hs) 680,00Puesta a punto del sistema completo (120 hs) 480,00

1960,00

f Los datos fueron obtenidos a través de consultas con el Área de Vinculación Tecnológica de la UNER. Los porcentajes establecidos pertenecen a criterios extraídos de un proyecto de normativa al respecto, el que en estos momentos se halla en evaluación.

125

• Equipamiento : El costo del equipamiento se consideró igual al costo de los apartados anteriores, aunque podría ser menor, debido a que habrá equipos (como por ej. osciloscopio, estimulador, etc) que se podrán adquirir a menor precio.

• Materiales : Se consideró el mismo costo que en los casos anteriores en los consumibles necesarios para la puesta a punto del sistema.

• Gastos Preoperativos : en este caso no se producen, por no haber involucradas etapas de investigación y desarrollo.

b) COSTOS INDIRECTOS : Se estimó un total de $200 correspondiente a este ítem.

c) UTILIDADES : Se consideró un 25% del costo total en concepto de margen de beneficio universitario.

Item Valor ($) Precio final ($)Costos directos Personal 1960,00 Equipamiento 14501,00 Materiales 135,00Costos indirectos 200,00Utilidades (25%) 4199,00

20995,00

Se puede estimar entonces un precio de venta de $ 20995 para un posible comprador de este proyecto. Como se mencionó anteriormente este cálculo es aproximado.

11.2.2 Producción fuera de la Universidad En este apartado se considera el precio que debería pagar un interesado externo por un sistema similar al desarrollado en el presente proyecto. Cabe aclarar entonces que en este caso no se desarrollaría ninguno de los equipos (subgrupo A) sino que se comprarían en su totalidad.

La siguiente planilla detalla el costo total de los equipos e insumos requeridos para la implementación de un sistema similar al desarrollado en el presente proyecto, donde se realizaron las siguientes consideraciones :

• Personal : La mano de obra se consideró de $1320, donde $1000 corresponden a 250 hs de trabajo de montaje y puesta a punto de un técnico y $320 a 40 hs de trabajo de supervisión y tramitación de compras por parte de un ingeniero novel, ambos a precio de mercado de los factores. Cabe aclarar que en este caso se utilizan menos horas porque, como se mencionó previamente, no se realiza el armado del equipamiento A, sino que el mismo se compra.

Item Costo ($) Subtotal ($)IngenieroTramites de compra (20 hs) 160,00Supervisión de las tareas del técnico (20 hs) 160,00TécnicoMontaje del equipamiento A y B (170 hs) 680,00Puesta a punto del sistema completo (80 hs) 320,00

1320,00

• Equipamiento : Se han considerado los siguientes elementos comerciales en reemplazo de los desarrollados :

126

- Control de temperatura TLC-MI de ALA Science (U$S 4000)[13]

- Mesa antivibratoria Newport LW-3048- OPT (U$S 8000)[40]

- Amplificador para microelectrodos Electro 705, de WPI (U$S 1073)[29]

- Software y placa de adquisición Digipack de Axon Instruments, compuesto por una placa de adquisición Digidata 1200B y el software Axoscope 7.0 para adquisición de señales electrofisiológicas. (U$S 3100)[35]

• Materiales : Se consideró el mismo costo que en los casos anteriores en los consumibles necesarios para la puesta a punto del sistema.

• Gastos Preoperativos : en este caso no se producen, por no haber involucradas etapas de investigación y desarrollo.

Los precios que se estimaron fueron obtenidos de catálogos, por lo que la valoración está subestimada. Adicionalmente habría que valorar los costos de importación de los equipos antes mencionados, lo que duplicaría el costo de los mismos.

Item Valor ($) Precio final ($)Personal 1320,00Equipamiento 25612,00Materiales 135,00

27067,00

11.2.3 Comparación de precios En la siguiente figura se han representado el precio de venta si el sistema es producido en la Universidad y el precio que resulta al comprar todos los equipos comerciales, a fin de poder realizar una comparación entre ellos.

Per

sona

l

Equ

ipam

ient

o

Con

sum

ible

s

Cos

tos

indi

rect

os

Util

idad

es

Pre

cio

tota

l

05000

1000015000200002500030000

cost

o ($

)

valores en la Universidad valores comerciales

Figura 11-4 : Diagrama de barras representando los componentes de los precios descriptos previamente

Como se puede ver, tanto el precio estimado de venta ($20995) está por debajo del costo que hubiera insumido el comprar todos los elementos para realizar el montaje ($27067). Se puede decir entonces que se ha logrado realizar una disminución sustancial del costo del sistema, con prestaciones de sus componentes que son similares y hasta superan a las de los modelos disponibles en forma comercial.

127

Sección 5 : Apéndices

128

1. APÉNDICE UNO : CONCEPTOS TEÓRICOS ASOCIADOS CON EL CONTROL DE LAS VIBRACIONES.

1.1 Caracterización de un sistema antivibratorio Las fuentes de vibraciones están presentes en prácticamente todos los ambientes de trabajo. Entre las más comunes podemos citar: acondicionadores de aire, heladeras, bombas, caminos o rutas cercanas al laboratorio y hasta el movimiento de las personas alrededor del puesto de trabajo, entre otras. Estas fuentes contribuyen a la aparición de un ruido de fondo, que se halla acoplado a los cimientos y pisos de la construcción donde esté instalado nuestro laboratorio. El ruido de fondo presente en la estructura de una construcción se encuentra generalmente en un rango comprendido entre 0.1 y 500 Hz, dependiendo del tipo de fuentes presentes en el sistema[40] (ver Figura 1-1). Las vibraciones se hallan acopladas además a la superficie de trabajo a través de la atmósfera, en forma acústica. Las vibraciones acústicas contribuyen con un ruido de fondo de frecuencias superiores a los 20 Hz.

Figura 1-1: Algunas de las fuentes comunes de vibraciones en un laboratorio.

Una primera forma de controlar las vibraciones es reducir las vibraciones ambientales y las acústicas. En principio hay que tratar de instalar el puesto de trabajo en un piso firme y sólido, lo más alejado posible de las fuentes de ruido. Si existen equipos que contribuyen con ruido capaz de acoplarse a través del piso, estos deben instalarse sobre soportes especiales que atenúen las vibraciones antes de que sean transmitidas. Las fuentes de vibración acústica deben alojarse dentro de recintos que disminuyan este tipo de contribución. Sin embargo, aunque se tomen todos los recaudos posibles para tratar de atenuar las fuentes de ruido, siempre existe un nivel de ruido de fondo que resulta excesivo para la realización de los experimentos en cuestión.

Una segunda forma de controlar las vibraciones es aislar la superficie de trabajo del ruido presente en el ambiente. Las vibraciones del piso pueden ser atenuadas apoyando la

129

superficie de trabajo sobre una variedad de sistemas de acoplamiento. Tales sistemas pueden estar constituidos por estructuras de montaje de goma, aisladores neumáticos pasivos o activos, etc. La elección del tipo particular de sistema de acoplamiento depende de la aplicación en particular, del peso que debe ser soportado y del ruido ambiental presente. Como se verá más adelante, el diseño de los sistemas de acoplamiento se encuentra relacionado fundamentalmente con el concepto de transmisibilidad.

La tercera forma de atacar el problema de las vibraciones es maximizar la rigidez y las características de amortiguamiento de la superficie de trabajo. Esta última debe estar diseñada de manera tal que presente una respuesta mínima ante cualquier vibración transmitida a través del sistema de acoplamiento. Para ello se utilizan superficies de trabajo construidas con materiales que alcanzan una rigidez elevada sin aumentar de manera excesiva la masa. Más adelante se discutirá este concepto, representado mediante la relación rigidez/masa. Además se verá que el diseño de una superficie de trabajo antivibratoria está íntimamente relacionado con el concepto de compliancia.

1.2 Fundamentos de vibración Para comprender los fundamentos del control de las vibraciones, es necesario realizar una breve descripción de algunos conceptos teóricos. Los conceptos de vibración y de aislación de las vibraciones están ambos íntimamente relacionados con el movimiento armónico simple y el fenómeno de resonancia.

1.2.1 Movimiento armónico simple Un ejemplo sencillo de movimiento armónico simple es el de una masa colocada en una viga flexible empotrada. Una fuerza externa, ya sea un impulso o una vibración periódica aplicada en forma vertical, causará una oscilación del sistema que se mantendrá en forma indefinida. En el caso de un sistema real en cambio, si el estímulo es un impulso, tal oscilación se extinguirá al cabo de cierto tiempo debido al amortiguamiento del sistema, que disipa la energía aplicada. (ver Figura 1-2)

Figura 1-2 : Viga empotrada como ejemplo de movimiento armónico simple. En un sistema real la respuesta

y(t) a un impulso aplicado en el extremo libre es una oscilación que va disminuyendo de amplitud hasta hacerse cero debido al amortiguamiento.

La respuesta y de este oscilador ante una excitación sinusoidal puede ser hallada resolviendo la siguiente ecuación diferencial:

my cy ky F t&& & .sen( )+ + = ω

En esta ecuación ÿ es la aceleración, ý la velocidad, y el desplazamiento, m la masa que está siendo movida, c el amortiguamiento y k la rigidez. F es la fuerza de excitación que varía en forma sinusoidal con frecuencia ω y amplitud máxima Fo.

y

tiempo

desplazamiento y

Fuerza de excitación F

130

1.2.2 Frecuencia natural La frecuencia natural es la frecuencia a la cual el sistema entra en resonancia con el estímulo aplicado. En el ejemplo del oscilador simple (sin amortiguamiento), la frecuencia natural está determinada por la masa colocada en el extremo (se considera que la viga posee masa despreciable frente a esta última) y por la rigidez de la viga. Como puede observarse en la siguiente expresión, la relación es tal que una menor masa y/o una viga más rígida incrementan la frecuencia natural y viceversa.

ωn k m=

El valor de k depende de la forma de la viga y del módulo de Young del material con el que esté construida.

Para el caso de una estructura antivibratoria resulta deseable lograr que las frecuencias naturales de la misma tengan valores elevados. Más adelante se discutirá más en detalle este concepto.

1.2.3 Compliancia Las fuerzas externas pueden ser estáticas o dinámicas y constituyen la entrada o excitación de nuestro sistema. La compliancia representa la función de transferencia que relaciona a la excitación con la respuesta de la estructura. En el caso de una fuerza estática la compliancia es la relación entre el desplazamiento lineal o angular de una determinada parte de la estructura y la magnitud de la fuerza aplicada a dicha estructura. En el caso de un fuerza que varía en forma dinámica o vibración, la compliancia es la relación entre la amplitud de la repuesta vibratoria y la magnitud de la vibración aplicada a la estructura. Un valor de compliancia pequeño implica una estructura rígida, lo cual es altamente deseable para una superficie de trabajo antivibratoria en condiciones estáticas[41].

La expresión general para la compliancia de un sistema con un grado de libertad, como lo es el oscilador simple, es la siguiente :

compliancia yF k m c rigidez efecto de la masa amortiguamiento

complianciak

n n

= =− +

=− +

=− +

1 1

11 2

2 2 2

2 2 2 2

( ) ( ) ( )

/( / ) ( / )

ω ω

ω ω ζω ω

o expresado en otros té rminos:

donde ω es la frecuencia de la excitación, ωn es la frecuencia de resonancia natural del sistema y ζ es el coeficiente de amortiguamiento, dado por la expresión :

ζ =ck m2 .

La siguiente figura muestra un gráfico de la compliancia en función de la frecuencia, de acuerdo a la fórmula anterior. Como puede verse, la compliancia de un sistema con un grado de libertad puede separarse en tres partes : una debida a los efectos de masa, otra a la rigidez y la otra al amortiguamiento.

Altura del pico determinada por el amortiguamiento

(1/cω)

Pico de resonancia

log compliancia

Región dominada por la masa

(1/mω2)

Región de la rigidez

(1/k)

131

Figura 1-3 : Gráfico de la compliancia en función de la frecuencia para un sistema con un grado de libertad.

Como se dijo anteriormente, en un oscilador simple la frecuencia a la cual se produce el pico de resonancia puede hallarse mediante ωn k m= , donde la cantidad k/m es conocida como relación rigidez/masa. Por lo tanto la frecuencia de resonancia de un sistema puede alterarse si se modifica esta relación.

En una estructura real, donde se presentan muchas frecuencias de resonancia, esto representa un concepto importante para el diseño de la misma. Así, el mayor objetivo en el diseño de una superficie de trabajo antivibratoria es lograr que los picos de resonancia de la misma se encuentren en frecuencias altas, mayores que las frecuencias de excitación presentes en el sistema. Además, tales picos deben ser de baja amplitud, hecho que se logra variando el amortiguamiento del sistema. Para llevar los picos de resonancia a frecuencias mayores, se debe incrementar la rigidez de la superficie de trabajo, al mismo tiempo que se debe tratar de minimizar su masa.

1.2.4 Transmisibilidad En el caso del oscilador simple amortiguado con un grado de libertad se considerará ahora que la excitación proviene del extremo empotrado de la viga. Esto puede interpretarse como una fuerza o una vibración acoplada a través de la pared. La masa colocada en el extremo libre de la viga tendrá entonces un desplazamiento debido a esta excitación.

Figura 1-4 : Esquema del oscilador simple amortiguado donde la excitación proviene del extremo

empotrado de la viga, que provoca un desplazamiento de la masa en el extremo libre.

El flujo de energía de vibración se expresa en términos de la transmisibilidad, que es la función de transferencia que cuantifica con qué eficiencia la excitación es capaz de producir la vibración de la masa. Así, la transmisibilidad es la relación entre la amplitud de la vibración transmitida sobre la amplitud de la vibración ejercida.

La expresión para la transmisibilidad es la siguiente :

Transmisibilidad n

n n=

+− +

1 21 2

2

2 2 2 2

( / )( / ) ( / )

ζω ωω ω ζω ω

desplazamiento y

Fuerza de excitación

132

donde ω es la frecuencia de excitación, ωn es la frecuencia natural del sistema y ζ el coeficiente de amortiguamiento. Como puede observarse, existe una similitud entre las funciones de transferencia de transmisibilidad y compliancia. Si se observa la gráfica que representa la transmisibilidad (Figura 1-5) se puede ver que existen tres regiones.

Figura 1-5 : Curva de transmisibilidad de un oscilador armónico simple.

A bajas frecuencias, la masa en el extremo de la viga se mueve sincrónicamente con el extremo empotrado y con igual amplitud. El sistema se comporta como si la viga fuera perfectamente rígida. Esto significa que la transmisibilidad es igual a uno y no existe aislamiento de las vibraciones. A medida que la frecuencia se incrementa, se aproxima a las condiciones de resonancia, donde la amplitud de la respuesta se hace máxima y cuyo valor depende del coeficiente de amortiguamiento. Finalmente, a frecuencias mucho mayores que la frecuencia de resonancia, se tiene la región dominada por los efectos de la masa. La transmisibilidad tiende a cero y la masa en el extremo de la viga permanece inmóvil ante la excitación. Esta es la región donde se produce el efecto de aislación de las vibraciones.

El concepto de transmisibilidad resulta importante en el diseño de los sistemas de acoplamiento de la superficie de trabajo con el suelo y del microelectrodo con la superficie de trabajo. De lo expuesto anteriormente puede decirse que dichos sistemas deben poseer dos características fundamentales :

• Deben poseer frecuencias de resonancia (horizontal y vertical) que estén por debajo de las frecuencias de vibración del ambiente.

• Debe poseer amortiguamiento para atenuar los picos de resonancia.

A continuación se discuten más en detalle las características deseables para estos dos sistemas de acoplamiento

1.3 Estructura de acoplamiento entre soporte del microelectrodo y la superficie de trabajo[42]

altura del pico determinada por el amortiguamiento

pico de resonancia

log transmisibilidad

Región dominada por la masa.

Región de aislación las vibraciones

log relación de frecuencias ω /ωn 10 100 1

100

10

1

0.1 0.1

Región de la

rigidez

133

A continuación se analizará un ejemplo simplificado de una estructura para registro, consistente en una base, un micromanipulador y un brazo donde se sujeta el microelectrodo. Por conveniencia, sólo se considerarán los movimientos verticales, ya que los movimientos laterales pueden ser tratados de manera similar. La Figura 1-6 muestra el esquema de un micromanipulador montado en una base rígida, con el microelectrodo en el extremo

Figura 1-6 : Esquema representando una base rígida sobre la que se encuentra apoyado el micromanipulador

que soporta al microelectrodo.

Se considera que la masa M se encuentra concentrada en el cabezal y la compliancia C se mide en el extremo del brazo. El objetivo es entonces minimizar las variaciones en la distancia x cuando la base sufre de oscilaciones verticales, a causa, por ejemplo, de las vibraciones transmitidas desde el piso donde se encuentra apoyada la superficie de trabajo.

En cualquier sistema práctico, la frecuencia de resonancia de la estructura micromanipulador + microelectrodo es mucho mayor que las frecuencias de vibración de la base. Bajo estas condiciones cuasi-estáticas, el desplazamiento ∆x en el extremo de la estructura está dado por :

∆x h M C= &&. .

donde &&h representa la aceleración instantánea de la base. De aquí se puede ver que para reducir el valor de ∆x se deberá tratar de hacer pequeños los valores de &&h , M y C.

La reducción de la masa M se logra sencillamente tratando de evitar la colocación de peso excesivo en el extremo del cabezal. La reducción de la compliancia C, en cambio, requiere del conocimiento de la teoría de vigas. La compliancia medida en el extremo libre de una viga empotrada está dada por :

ClE I

=3

3. .

donde l es la longitud del brazo, E es el módulo de Young del material del brazo e I es el momento de inercia del mismo. Para una barra de sección circular, I se incrementa con la cuarta potencia del radio. De acuerdo a esto, para disminuir la compliancia, el brazo debe ser corto, grueso y debe estar construido de un material rígido. Sin embargo, el grosor del brazo no puede aumentarse indefinidamente ya que esto implicaría un aumento de la masa del brazo, que dominaría la masa de la estructura (lo mismo ocurriría si se quisiera eliminar la masa M del cabezal). La deflexión en el extremo de una barra de sección transversal uniforme de masa m por unidad de longitud es :

∆xh m l

E I=&&. .. .8

l

M

x

C

h

base

superficie de trabajo

micromanipulador brazo

microelectrodo

134

Esto sugiere que el brazo debe estar construido con un material con elevada rigidez específica (módulo de Young dividido por la densidad). De los materiales más comunes el aluminio, el vidrio y la madera poseen aproximadamente el mismo valor de rigidez específica. Cabe aclarar que si bien hasta aquí no se han considerado las características del micromanipulador, está claro que una mínima compliancia en la estructura implica una baja compliancia en el mismo. Más adelante se discutirán en detalle sus características.

1.4 Estructura de acoplamiento entre la superficie de trabajo y el suelo[42]

Por último, para reducir el valor de ∆x, hay que minimizar la aceleración &&h de la base, que se halla unida solidariamente a la superficie de trabajo, en respuesta a las vibraciones del piso. La Figura 1-7 muestra una superficie de trabajo de masa M’ apoyada sobre soportes con compliancia C’.

Figura 1-7: Esquema representando una superficie de trabajo de masa M’ apoyada sobre soportes de

compliancia C’.

No se realizará un análisis dinámico completo, pero se obtiene una aproximación bastante buena si se considera que para pequeñas aceleraciones del piso &&h es inversamente proporcional a (M’.C’)½ . El objetivo es por lo tanto hacer que M’ y C’ sean lo más grande posible. Un límite superior para C’ es el inconveniente que presenta un soporte excesivamente flexible. La máxima compliancia tolerable oscila alrededor de los 100 µm/N. Tampoco es posible incrementar excesivamente la masa, ya que hay limitaciones impuestas por el costo, el espacio y la resistencia de los soportes, por ejemplo. Está recomendado el uso de masas del orden de los 50 a 100 Kg.

M’

C’

135

2. APÉNDICE DOS : DESCRIPCIÓN DEL PROGRAMA REALIZADO EN LABVIEW

Este apéndice tiene como finalidad brindar detalles más específicos del programa de aplicación desarrollado con el LabVIEW.

Se explicará el programa haciendo referencia al diagrama de bloques del mismo. Antes de comenzar con la explicación es importante mencionar la convención de colores empleada por el LabVIEW para la representación de cada tipo de dato en el diagrama de bloques. Así, el flujo de datos de números enteros se dibuja con líneas finas azules, el de los números reales con líneas finas naranja, el de los operadores booleanos con líneas finas verdes, el de las cadenas de caracteres por líneas finas rosadas, el de las matrices por líneas dobles con el color de acuerdo al tipo de sus elementos y el de las estructuras que poseen más de un sólo tipo de dato (“clusters”) en líneas gruesas rosadas.

Para comprender la estructura general del programa de adquisición es necesario guiarse por las figuras II-2 y II-3 que representan el panel frontal y el diagrama en bloques del instrumento virtual (VI) respectivamente. A continuación se resume el funcionamiento general del mismo.

El VI Analog-Input Continuous Scan (AI-CS) se colocó dentro de una estructura condicional tipo WHILE-DO, (MIENTRAS (condición) HACER (acción)), representada en el diagrama de bloques por una flecha que describe un bucle rectangular.

Figura II-1 : Diagrama del VI desarrollado, mostrando sus diferentes componentes.

La finalización de la adquisición (condición de terminación del bucle verdadera) puede ocurrir debido a que se accionó el botón del panel frontal que posee la leyenda DETENER o se produjo un error en la ejecución del programa.

En la iteración número cero, el AI-CS llama a otros sub-VI’s para configurar en la placa conversora (dispositivo):

• El canal o grupo de canales seleccionado

• El hardware necesario para la ubicación del buffer intermedio.

• La frecuencia de muestreo

Cuando se da comienzo a la adquisición, en cada iteración sucesiva, el AI-CS toma el número de datos especificado en la variable número de muestras y, de acuerdo al rango

VI que detecta cuando se produjo

un error

parámetros de configuración

de la placa

(acción)

condición de terminación (condición)

Bucle WHILE contador de

iteración

136

en el que está configurada la placa, devuelve un vector con los valores de voltaje correspondientes. En la última iteración (condición de terminación del bucle verdadera), el AI-CS “limpia” el buffer intermedio.

El panel frontal (figura II-2) está compuesto por un gráfico utilizado para mostrar la señal de entrada (la de los potenciales de acción). El gráfico posee su contraparte, rotulada bajo el nombre POTENCIAL DE ACCIÓN en el diagrama de bloques, la que se halla conectada a la salida del AI-CS, luego de realizado un proceso de escalado y conformación del vector de datos. Posee además un “nodo de atributos”, también rotulado bajo el nombre POTENCIAL DE ACCIÓN, que permite establecer las propiedades tales como valores mínimos y máximos de la escala X, incremento en X y cantidad de cifras significativas en la representación.

En el panel frontal se cuenta además con una serie de botones e indicadores luminosos. Los botones permiten acceder a las funciones de grabar, detener el programa y marcar la presencia de un evento. Los indicadores luminosos son el verde para indicar que el programa está corriendo, y que se encuentra a la derecha de la leyenda VER, el rojo que se enciende mientras está activa la función de grabar y que se halla ubicado a la derecha del botón GRABAR, el rojo a la derecha del botón DETENER, que indica la finalización del programa, y el azul que se enciende cuando es pulsado el botón marcador de eventos. La utilidad del marcador de eventos permite introducir un comentario en el archivo durante el proceso de grabación del mismo, para indicar la ocurrencia de algún suceso en particular durante el experimento.

El programa permite guardar en un archivo de texto una secuencia determinada de los datos que se están adquiriendo. Para ello, en el panel frontal del programa, basta con colocar el nombre del archivo en donde se desean almacenar los datos en el recuadro NOMBRE DEL ARCHIVO y posteriormente presionar el botón rotulado GRABAR. A partir de ese instante y hasta que el botón vuelva a ser apretado o se detenga la ejecución del programa, el VI envía cada barrido que realiza de la placa de adquisición al archivo mencionado.

Adicionalmente, el programa posee dos indicadores numéricos. Uno brinda el valor de la frecuencia de muestreo real, calculada por el AI-CS, la que a veces puede diferir de la prestablecida por el programa debido a retardos en la ejecución de las operaciones. El otro indicador muestra un valor aproximado de la frecuencia cardíaca promedio, calculada a partir de multiplicar el número de latidos detectados en un segundo por 60. La detección del número de latidos ocurridos en un segundo se lleva a cabo mediante un VI detector de picos, al que se le pasan los parámetros umbral y ancho de pico válido y devuelve el número de picos detectados en una ventana dada, la que en este caso fue de un segundo. Esta utilidad accesoria sirve para controlar la frecuencia promedio cuando se realizan mediciones de latidos espontáneos, como por ejemplo en el nódulo sinusal. No brinda sin embargo una información precisa, ya que el cálculo es aproximado.

137

138

Sección 6 : Bibliografía

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