Sntesis de oligonucletidosSntesis automatizada de oligonucletidos Los avances de la sntesis qumica y la moderna sntesis paralela permiten hoy en da una rpida y eficiente produccin de oligonucletidos de casi cualquier secuencia. En la sntesis en fase slida, la secuencia deseada de un oligonucletido es ligada a un material portador inerte, y separado del mismo al final de la sntesis. A diferencia de la sntesis en solucin, la snstesis de fase slida tiene la gran ventaja que los pasos intermedios pueden ser aislados fcilmente, y los excedentes de reactivos y ciertos subproductos pueden ser eliminados a travs de un simple lavado y mtodos de filtracin. Materiales bsicos Los materiales bsicos ms importantes para la sntesis de oligonucletidos son los llamados nuclesido-fosforamidita.

2'- desoxiadenosina - fosforoamidita

2'-desoxiguanosina - fosforoamidita

2'-desoxicitidina - fosforoamidita

2'-desoxitimidina - fosforoamidita

En la 3'OH se encuentran grupos reactivos de fosforamidita (magenta), la 5'OH est bloqueada por grupos de cidos inestables dimetoxitritil (DMT rojo), para evitar que las funciones amino exocclicas de adenosina, guanina y citidina causen reacciones secundarias durante la sntesis. stas son bloqueadas con grupos protectores de acilo (violetas). Para comenzar con la sntesis es necesario el material portador derivado con el respectivo

3'-nuclesido. Normalmente es acoplado el nuclesido inicial sobre un enlace inestable al controlled pore glass (CPG) o poliestirol beads (CPG):

Ciclo de la sntesis La sntesis qumica de oligonucletidos es llevada a cabo desde la direccin 3' hacia la 5'. En el paso decisivo del acoplamiento reacciona un 3-fosforamidita con un grupo libre 5' hidrxilo:

a) Separacin de tritilo (deblocking): Se separa de la fase fija, el componente anclado (nuclesido inicial o luego la cadena creciente de oligos) del cido lbil del grupo protector 5-dimetoxitritil; se obtiene de este

modo una hidroxifuncin libre reactiva. Como reactivo separador se ulitiza cido di - o tricloractico en diclorometano. b) Acoplamiento (coupling): El grupo libre de 5'-OH puede ahora reaccionar con un fosforamidito proporcionado, se origina un enlace de ambos componentes nuclesidos sobre un puente de fosfito. El fosforamidito tiene que ser activado con un cido dbil (p. ej. 1H-tetrazolio). c)Bloqueo (capping): Como el proceso de acoplamiento (como toda reaccin qumica) no transcurre completamente al 100%, debe evitarse que los grupos libres de OH que van quedando (aprox. 1%) reaccionen tambin en el siguiente ciclo de la sntesis y as conducir a secuencias no especficas. Con el procedimiento capping son bloqueados todos los reactivos libres del grupo por medio de una acetilacin, y luego no cumplen ningn rol en la sntesis siguiente. d) Oxidacin: Las agrupaciones fosfito internucleotdicas originadas en el proceso de acoplamiento son oxidadas a fosfato por medio de una solucin de yodo. Se comienza de nuevo con el paso a) un nuevo ciclo de sntesis. Estas reacciones son repetidas hasta que se produce la secuencia deseada del oligo. El oligonuclotido portador vinculado puede ser liberado del ciclo con un grupo libre de 5'OH o bien con un grupo protegido de 5'OH (DMT). Luego de ocurrida la sntesis son necesarios los siguientes pasos de elaboracin: a) Separacin del oligonucletido del material de soporte: A travs de un tratamiento del oligonuclotido unido al material de soporte, se separa con una solucin concentrada de amonaco, la primera unin entre el 3'-OH del oligo y el portador. El oligo "nada" en solucin amoniacal. b) Separacin de los grupos protectores de las bases: Para la eliminacin de los grupos protectores de las bases de adenina, guanina y citidina y la liberacin de las funciones amino exocclicas, se calienta a alta temperatura la solucin del oligonuclotido en amonaco (habitualmente entre 50C y 80C, 1-8 horas segn el protocolo y grupo protector utilizado). Rendimiento del acoplamiento gradual El rendimiento del acoplamiento gradual se entiende como la eficiencia de la sntesis de ADN, con la cual se acopla un nuevo fosforoamidito a la cadena creciente de oligonucletidos. Es el rendimiento que se obtiene a travs de los pasos de una reaccin cclica. Al comienzo de cada ciclo de acoplamiento se separa el grupo protegido de dimetoxitritilo

con cido para la liberacin del grupo reactivo 5'-OH. En este sentido se origina un catin dimetoxitritilo, cuya cantidad puede ser determinada fotomtricamente o a travs de una medicin de conductibilidad. Asumiendo una separacin total de los grupos de DMT del oligonucletido, se puede calcular en base a la cantidad de catin de DMT la eficacia del paso anterior de acoplamiento. Estos valores del tritilo as cuantificados y los rendimientos del acoplamiento gradual son por lo tanto, una medida para la calidad del proceso de la sntesis. El rendimiento promedio en cada paso del acoplamiento durante la sntesis de un oligonucletido tiene un impacto drstico en la cantidad porcentual de secuencia que puede ser tericamente obtenida: % secuencia deseada = nmero de bases (rendimiento del acomplamiento gradual promedio)

El diagrama demuestra p. ej. que para la produccin de un 80mer con un excelente promedio en el rendimiento del acoplamiento de 99% netamente calculado debe obtenerse claramente debajo del 50% de la secuencia deseada; el resto consiste en cortos productos nx. Dependiendo del experimento, se debe preveer y considerar cuidadosamente, con cual mtodo ser purificado el oligonucletido en bruto.