Virulencia del Virus Dengue Virulencia del Virus Dengue en la evolución del Dengue 2 en la evolución del Dengue 2 en Nicaragua de 2005-2007.en Nicaragua de 2005-2007.

Andrea Núñez, MSc.Andrea Núñez, MSc.

Den

gu

eD

en

gu

eGeneralidadesGeneralidades

Es una enfermedad causada por un virusEs una enfermedad causada por un virus familia familia FlaviviridaeFlaviviridae género género FlavivirusFlavivirus Especie DengueEspecie Dengue

Cuatro serotipos antigénicamente distintos 1, 2, 3 y 4.Cuatro serotipos antigénicamente distintos 1, 2, 3 y 4.

Emerge en regiones tropicales y subtropicales, donde la Emerge en regiones tropicales y subtropicales, donde la humedad, calor y los reservorios naturales representan humedad, calor y los reservorios naturales representan los elementos vitales para el desarrollo del vector y en los elementos vitales para el desarrollo del vector y en consecuencia, la transmisión del virus.consecuencia, la transmisión del virus.

Virus DengueVirus Dengue

Genoma del ARNGenoma del ARN

Poliproteína precursoraPoliproteína precursora

ANCH C - PrM- E- NS1-NS2a-NS2b-NS3- NS4a-NS4b- NS5ANCH C - PrM- E- NS1-NS2a-NS2b-NS3- NS4a-NS4b- NS5

CC MM EE NS1NS1 NS2aNS2a NS2bNS2b NS3NS3 NS4aNS4a NS5NS5

EstructuralesEstructuralesNo estructuralesNo estructurales

NS4bNS4b

Genotipos DengueGenotipos Dengue

– DEN-1: Tres genotipos I, II, y III,  algunos DEN-1: Tres genotipos I, II, y III,  algunos autores incluyen dos genotipos más autores incluyen dos genotipos más denominados IV y V denominados IV y V

– DENV-2 : Americano, Asiático/Americano, DENV-2 : Americano, Asiático/Americano, Asiático I, Asiatico II y selvático.Asiático I, Asiatico II y selvático.

– DENV-3: I, II, III, IV, algunas clasificaciones DENV-3: I, II, III, IV, algunas clasificaciones incluyen el genotipo V. incluyen el genotipo V.

– DENV-4: I, II, III y Selvático, también exclusivo DENV-4: I, II, III y Selvático, también exclusivo de primates no humanos. de primates no humanos.

FDH/SCD PatogeniaFDH/SCD Patogenia ImmunopatologíaImmunopatología

– Infección secundariaInfección secundaria– Incremento dependiente de anticuerposIncremento dependiente de anticuerpos– Células T con reacción cruzadaCélulas T con reacción cruzada

Acción viral directaAcción viral directa– ApoptosisApoptosis– Infección directa de células Infección directa de células

endoteliales?endoteliales?

Factores viralesFactores virales– Variación genotípica (virulencia)Variación genotípica (virulencia)

Factores del HuéspedFactores del Huésped– Genéticos o adquiridosGenéticos o adquiridos

Nicaragua

Managua

Dos estudios prospectivos de Dengue en Nicaragua

1) Estudio Hospitalario

2) Estudio de cohorte

3900 niños 2 – 12 años

Niños de 6 meses - 14 años

Extensa informacion de los pacientes (150 variables) :Edad, sexo, dia de presentación, historia de enfermedad, uso de

antibiótico, estado nutricional, etc.

FIS

Muestras Longitudinales

3 meses 6 meses 12 meses 18 meses

Estudio Hospitalario

Muestra aguda Muestraconvaleciente

2 semanas

Enrolados al presentarse HIMJR

Año 1

Estudio Cohorte

Año 2 Año 3 Año 4

Muestra anual

Muestraconvaleciente

FIS

MuestraAguda

2005 2006 2007

EstudioCohorte

0% 0%

8%

15%

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

2004 2005 2006 2007

% D

HF/

DSS

p<0.001

01020304050607080

90

% Tota

l C

ase

sFDFDH/SCD

Incremento en la severidad del Dengue en 2006/2007 en ambos estudios

EstudioHospitalario

4:1 0.7:1 1:1

sintomática:inaparente 1:4.3 1:2.6

Incremento en la severidad no se explica por la introducción de un nuevo serotipo

2005

DENV1DENV2DENV3DENV4

2006 2007

Estudio Hospitalario

Análisis multivariadoAnálisis multivariado

EdadEdad sexosexo Respuesta inmune (primaria vs secundaria)Respuesta inmune (primaria vs secundaria) SerotipoSerotipo Día de presentación al HospitalDía de presentación al Hospital Año de estudio (2005 vs 2006-2007)Año de estudio (2005 vs 2006-2007) alergiaalergia asmaasma Uso de antibióticoUso de antibiótico Estado nutricionalEstado nutricional Ruta de admisión Ruta de admisión

Infección secundaria y año de estudio resultaron estadísticamente asociados a enfermedad severa

Infección secundaria OR 15.7 (95%CI 2.93-84.0)

Año de estudio, OR 2006-7 fue de 6.58 (2.32-18.6)

Que habrá ocurrido?Que habrá ocurrido?

Qué diferencia existe entre los años?

Qué diferencia existe entre los años?

Genome Resources in Dengue Consortium Genome Resources in Dengue Consortium (GRID)(GRID)

Broad NIAID Microbial Sequencing Center

Nicaragua Eva Harris

Angel Balmaseda

VenezuelaIrene Bosch

Diane Schmidt David Kulp (Amherst)

Puerto Rico & Caribbean Jorge MunozKate McElroy

Gilberto Santiago

Vietnam, Cambodia& Singapore

Cameron SimmonsJeremy Farrar

Phillip Buchy

•Selección coordinada, prep muestras y análisis de >4500aislamientos•Datos clínicos estandarizados Reportados

•Creación de capacidades a Lab colaboradores

Secuencia del genoma completo del virus(Broad NIAID Microbial Sequencing Center) 163 cepas del

serotipo 2 del dengue

Nicaragua

Broad

STRUCTURAL NON-STRUCTURAL

Hubo cambios en la secuencia viral entre estos años?

Analisis Filogenetico de Genomas Analisis Filogenetico de Genomas CompletosCompletos

DatosDatos 163 cepas Nicaraguenses DENV-2 163 cepas Nicaraguenses DENV-2

15 cepas Leitmeyer et al. (1999) J. of Virology15 cepas Leitmeyer et al. (1999) J. of Virology

13 cepas America Central & SurAmerica (NCBI)13 cepas America Central & SurAmerica (NCBI)

NCBI secuencias de Referencias DENV-1, DENV-3, y DENV-4NCBI secuencias de Referencias DENV-1, DENV-3, y DENV-4

Modelo de sustitucion NucleotidosModelo de sustitucion Nucleotidos

General Time-Reversible (GTR +I +General Time-Reversible (GTR +I +4))

Análisis de máxima similitud (bootstrap = 1000)Análisis de máxima similitud (bootstrap = 1000)

Neighbor Joining Tree AnalysisNeighbor Joining Tree Analysis (bootstrap = 1000)(bootstrap = 1000)

All Tree Topologies All Tree Topologies

Nicaragua

“Asia Americano”

“Asiático”

“Americano”

Cepas Nicaraguense más relacionados al

genotipo asiático americano DENV2

DENV-2 Nicaragua: Rápido reemplazo de los clades

Asiático

Americano/Asiático

NI-1a

NI-2a

NI-2b

Año de aislamiento y Clade significantemente

relacionados

(Pearson’s Chi-Square p<0.0001)

% G

enom

es

YearN

icara

guense

Correlación con enfermedad severa

Asiático

Americano/Asiático

NI-1

NI-2a

NI-2b

Correlación con enfermedad severa

(DF/DHF/DSS) Pearson’s Chi-Square p=0.046

Nic

ara

gua 2

1

DHF/DSSDF

Cohorte

Hospital

9 Amino Acidos propuestos para el reemplazamiento de Clade

NI-2a

NI-2b/c

NI-1a

Cap:K97RNS1:R869KNS3:T1720PNS4:N2488S

CAP ENV NS1 NS1 NS3 NS4B NS5 NS5 NS597 772 869 1054 1720 2488 2691 2781 2892

E:M772VNS1:L1054FNS5:K2691QNS5:T2781I

NS5:R2892K

Env E

Mukhopadhyay/Rossman Nature Reviews 2005M772V

La mutación E es localizada en C-terminal

Tres mutaciones en NS5 están expuesta a la superficie

NS5

Clade 1

Clade 2

1° human1° humanMDDCsMDDCs

Son los Clade 2 virales mas virulentos?? (MDDC)?

Nicaragua

X 2p

41 2b,c

Clade

1

10

100

1000

10000

DV33 DV34 DV37 DV128 DV172 DV174

pfu

/ml

1 2 3 5 6 7 8 91

10

100

1000

10000

0

pfu

/ml

Clade 1 Clade 2

p = 0.0298 (Wilcoxon)

Clade 1

Clade 2U937

/DC-SIGN

Son los virus Clade 2 “inherently” more fit (U937 #1)?

Nicaragua

X 2p

1 2a 2b 2c

Clade

0

10

20

30

40

50

33 34 37 6740

10 187

174

191

306

694

128

% Infe

ctio

n

p = 0.056 (Mann-Whitney)

1.00E+02

1.00E+03

1.00E+04

1.00E+05

33 34 37 67 4010 187 174 191 306 694 128

GE/µ

L -

HI

Clade 2 virus pueden replicar mejor que los Clade 1 virales.

qRT-PCRqRT-PCR

11 22aa

2b/c2b/c

1.00E+02

1.00E+03

1.00E+04

1.00E+05

33 34 37 67 4010 187 174 191 306 694 128

pfu/

mLPlaque assayPlaque assay

11 22aa

2b/c2b/c

Ensayo Particulas Virales Reporteras

Structural Proteins

GFP Replicon

co-transfect

Single-round RVP (Particulas

de Virus reportero)

infect GFP+

C prM/M E C prM/M E

Clade 2

Clade 1

+ suero DenV2 0

50100150200250300350

1 2

PR

NT5

0

T.C. Pierson, NIH

ConclusionesConclusiones

Incremento en la severidad en la estación de Dengue 2006/2007 en ManaguaIncremento en la severidad en la estación de Dengue 2006/2007 en Managua Estudio HospitalarioEstudio Hospitalario Estudio cohorte basado en la comunidadEstudio cohorte basado en la comunidad

Los cambios no son explicados por factores clínicos y epidemiológicosLos cambios no son explicados por factores clínicos y epidemiológicos Análisis de 163 genomas completos indicanAnálisis de 163 genomas completos indican

Dos clades diferentes en cepas nicaraguenses de DENV 2Dos clades diferentes en cepas nicaraguenses de DENV 2 Significante correlación genética temporal (2005 vs 2006/7)Significante correlación genética temporal (2005 vs 2006/7) Asociación significante con severidad de la enfermedad.Asociación significante con severidad de la enfermedad.

Análisis funcional Análisis funcional in vitroin vitro Mayor replicación de Clade 2 en células humanas y de mosquitosMayor replicación de Clade 2 en células humanas y de mosquitos Anticuerpos neutralizan mejor a Clade 1Anticuerpos neutralizan mejor a Clade 1

Hipótesis para explicar incremento de la severidad

A) “inherente al virus”

B) “Inmunidad pre existente”

Incremento de la infeccion dependiente de Acs (ADE)?Disminucion de la neutralizacion o evasion de los Acs neutralizantes?

AgradecimientosAgradecimientosCentro de Salud Centro de Salud

Socrates Flores VivasSocrates Flores Vivas*Guillermina Kuan*Guillermina Kuan

Oscar OrtegaOscar OrtegaMiguel ReyesMiguel ReyesLeyla SaenzLeyla Saenz

Nery SanchezNery SanchezSergio OjedaSergio Ojeda

Magaly AmadorMagaly AmadorZoila OrozcoZoila Orozco

Carolina FloresCarolina Flores

Hospital La MascotaHospital La Mascota*Crisanta Rocha*Crisanta Rocha

Maria de los Angeles Maria de los Angeles PérezPérez

*Sheyla Silva*Sheyla SilvaJavier SilvaJavier Silva

Federico NarváezFederico NarváezRafael CentenoRafael CentenoCintia SaboríoCintia SaboríoGerardo MejiaGerardo Mejia

Departamento de Departamento de Virología, CNDRVirología, CNDR*Angel Balmaseda*Angel Balmaseda

*Andrea Nuñez*Andrea Nuñez*Douglas Elizondo*Douglas Elizondo

*Yolanda Tellez*Yolanda Tellez*Tangni Gomez*Tangni Gomez*Yara Saboria*Yara Saboria

*Magelda Montoya*Magelda MontoyaLeonel PérezLeonel Pérez

Juan Carlos MercadoJuan Carlos MercadoJuan Carlos MatuteJuan Carlos Matute

Celia MachadoCelia MachadoMaria José VargasMaria José Vargas

Sonia ArguelloSonia Arguello

Sustainable Sciences Sustainable Sciences InstituteInstitute

William AvilésWilliam AvilésKate StandishKate Standish

Mirtha MonterreyMirtha Monterrey

University of CA, University of CA, Berkeley Berkeley Eva HarrisEva Harris

Aubree GordonAubree GordonMolly OhAinleMolly OhAinle

MINSA NicaraguaMINSA NicaraguaGuillermo GonzalezGuillermo Gonzalez

SILAIS ManaguaSILAIS ManaguaMaritza CuanMaritza Cuan

Dir. de EpidemiologíaDir. de EpidemiologíaEdmundo SánchezEdmundo Sánchez

CNDR, MINSACNDR, MINSAAlcides GonzálezAlcides González

Broad InstituteBroad InstituteMatthew HennMatthew HennNiall LennonNiall LennonBruce BirrenBruce Birren

ThanksThanks!!GraciasGracias!!

Funding:Funding:NIAID/NIH NIAID/NIH Pediatric Dengue Vaccine Initiative, Pediatric Dengue Vaccine Initiative, TDRTDR