Trabajo Practico N°3Trabajo Practico N 3

Cultivo de microorganismos en elCultivo de microorganismos en el

laboratoriolaboratorio

¿Para qué cultivar microorganismos?Para estudiarlos

P é?¿Por qué?Porque es un microorganismo nuevo no caracterizado. Porque tienen

i t i ló i i d t i l ( li t lá t t )importancia ecológica, industrial (alimentos: lácteos, cerveza, etc.),

biotecnológica (producción de compuestos, obtención de genes de interés) y

porque causan enfermedades.p q

¿Cómo?¿Imitando en el laboratorio las condiciones del ambiente natural del

microorganismo, utilizando medios de cultivos y condiciones que sustenten el

crecimiento.

¿Qué factores influencian el crecimiento bacteriano en la naturaleza?

Factores nutricionales

Factores ambientales (físicos)

Factores nutricionales:

Carbono: CO2, compuestos orgánicos.

Nitrógeno: NH3, NO3-, N2, compuestos orgánicos nitrogenados (aminoacidos,

bases nitrogenadas)

Fósforo: PO3-

Azufre: H2S, SO4-, compuestos orgánicos azufrados.

Potasio, magnesio, sodio, calcio, hierro.

El t t C M M Ni Z tElementos traza: Cu, Mo, Mn, Ni, Zn, etc

Factores de crecimiento: vitaminas, aminoacidos, purinas y pirimidinas

¿Qué factores influencian el crecimiento bacteriano en la naturaleza?

Factores ambientales

Temperatura

T ófil 50 60 °C

Disponibilidad de agua (osmolaridad)Termófilos: 50-60 °C

Mesófilos: 20-40 °C

Psicrófilos: 10-20 °C

Halófilos discretos 1-6 % NaCl

Halófilos moderados 6-15 % NaCl

Halófilos extremos 15 30 % NaClHalófilos extremos 15-30 % NaCl

Halotolerantes

pH

Oxígeno

Aerobios estrictos

A bi f lt ti Acidófilos 1.0 - 5.0

Neutrófilos 5.5 - 8.5

Alcalófilos 9 0 10 0

Anaerobios facultativos

Microaerófilos

Anaerobios aerotolrenates Alcalófilos 9.0 - 10.0Anaerobios estrictos

Varias preguntas al cultivar un microorganismo:Varias preguntas al cultivar un microorganismo:

¿Es aerobio, anaerobio facultativo, microaerófilo, anaerobio?

¿Qué sustratos puede utilizar como fuente de carbono y energía?¿ y g

¿Qué formas de nitrógeno puede utilizar?

¿Requiere suplementos nutricionales?¿Requiere suplementos nutricionales?

¿Requiere luz como fuente de energía?

¿Puede crecer sobre un sustrato inorgánico?

¿Cuál es su temperatura óptima de crecimiento?

¿Tolera concentraciones altas de sal?

M di d lti

¿Cómo sustentamos el crecimiento en el laboratorio?

Medios de cultivos

Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada denutrientes que en concentraciones adecuadas y concondiciones físicas óptimas permiten un buen crecimiento delos microorganismos.

Fuente de carbono y energía (glucosa o cualquier otro compuesto carbonado)

Fuente de nitrógeno azufre fósforoFuente de nitrógeno, azufre, fósforo

NaCl

Buffer

Agua

Líquidos (caldos)q ( )Sólidos (agar 1,5 %)Semisólidos (agar 0,6 %)

Según la consistencia

Obtención de cultivos puros – Breve historia

1876 Koch Cultivo de MO en medio solido (gelatina y rodajas

de papa) para asegurar cultivos puros.

Postulados de Koch:

1. El microorganismo debe estar presente en todos los individuos con la mismaenfermedadenfermedad.

2. El microorganismo debe ser recuperado del individuo enfermo y poder seraislado en medio de cultivo.

3. El microorganismo proveniente de ese cultivo debe causar la mismaenfermedad cuando se lo inocula a otro huésped

Robert Koch

enfermedad cuando se lo inocula a otro huésped.4. El individuo experimentalmente infectado debe contener el micoorganismo.

1882 Walter Hesse remplaza la gelatina por Agar-Agar, lo que

permitió el cultivo de microorganismo aislados a mayores

temperaturas.

1887 Julius Richard Petri uno de los ayudantes de Koch ideo

una caja o capsula de vidrio para el cutivo de los microorganismo.

Obtención de cultivos puros

Medio Sólido: permite el crecimiento en superficie de los microorganismos como poblaciones discretas COLONIAS Cultivos puros

Medio líquido: Permite la obtención de gran masa celular. Posibilidad de tili d lú ( t di bi í i f t i )utilizar grandes volúmenes (estudios bioquímicos, fermentaciones).

Medio semisólido: Se utiliza para estudios de movilidad, fermentación.

Tipos de Medios de cultivos

Medio definido o sintético: son los medios que contienen una composición

química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para el estudio dequímica definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para el estudio de

requerimientos nutricionales y para obtener resultados reproducibles.

Medio complejo medios q e contienen n trientes de composición q ímicaMedio complejo: medios que contienen nutrientes de composición química

variable o no establecida. Son mezclas complejas y poco definidas de

nutrientes. Contienen extractos animales, vegetales e hidrolizados deg

proteínas.

Se utilizan cuando se necesita obtener una amplia gama de microorganismos

Medios complejos

Extracto de carne: Se obtiene a partir de la proteólisis de carne magra sin tendones. Es de alto valor nutritivo.

E t t d l d S bti d l t ió dFuente de Extracto de levadura: Se obtiene de la extracción acuosa de levadura de cerveza. Es rico en vitaminas.

Extracto de malta: Se obtiene a partir de la cebada de malta

Fuente de carbono

Extracto de malta: Se obtiene a partir de la cebada de malta. Rica en carbohidratos y maltosa.

Peptona de carne: Digestión de carne bovina con tripsina o p g ppepsina

Peptona de caseína (tripteína): Tratamiento de caseína con tripsina. Altos contenidos en triptofano.

Fuente de nitrógeno caseína con tripsina. Altos contenidos en triptofano.

Peptona de soja: Digestión de soja con papaína.

Gl l i t t b d

NH4Cl, (NH4)2SO4, aa, bases nitrogenadas

Glucosa, sacarosa o cualquier otro compuesto carbonadoMedio definido

Medio mínimo definido para Bacillus megaterium

Medio definido paraMedio definido para Thiobacillus thiooxidans, un quimiolitoautótrofo del azufre

Medio definido para un quimilitoautotrofo que oxida amonio (Nitrosomas)

Medio definido para un quimiorganoheterótrofo

amonio (Nitrosomas)

Medio complejo para p j pquimiorganoheterótrofo (agar nutritivo)

Medio definido para el crecimiento de bacterias quimioorganoheterótrofas fastidiosas como Neisseria gonorreae

Medio complejo paraMedio complejo para bacterias fastidiosas

Medio complejo para halófilos extremos

Efecto del oxígeno sobre el crecimiento

Atmósferas de incubación

Crecimiento en anaerobiosis

E t f jEstufas y jarras de anaerobiosis (generadores de gases)gases)

Creciemiento en bi iaerobiosis

Medios líquidos: Agitación.

Sólidos: en atmósferaSólidos: en atmósfera normal (78 % N2, 21 % O2, 0,03 % CO2)

Temperatura de incubación

Otros medios de cultivo

Medios enriquecidos: medio que tiene un gran exceso de nutrientes y se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales.

Medios diferenciales: medio que permite revelar características fisiológicas de los microorganismos.

Medios selectivos: medio que sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibe el de otros. Permite seleccionar y aislar

Medios de enriquecimiento: Es un medio que permite el desarrollo de

microorganismos a partir de poblaciones mixtas.

Medios de enriquecimiento: Es un medio que permite el desarrollo de un grupo de microorganismos a partir de una muestra que contiene una gran variedad de microorganismos. Se utiliza un medio selectivo líquido y se incuba bajo determinadas condiciones.

Agar columbiaCNA

Medio muy nutritivo

Contiene peptonas, extractos de

Medio selectivo

S. epidermidis en agar Columbia CNA

levadura y corazón, almidón.

colistin y ácido nalidíxico Inhiben G -

Agar MRS (Man, Rogosa y sharpe)

Medio enriquecido para Lactobacillus.

Poca selectividadContiene

Extratos, peptonas, glucosa, factores de crecimiento (tween 80, Mn, Mg), citrato (inhibición G -)

Lactobacillus lacticus en MRS agar

Levine EMB Agar

Medio para enterobacteriasMedio para enterobacterias

Contiene:

Peptona

diferencial y selectivo

Peptona

Lactosa

Eosina

Permite diferenciar entre los microorganismo capacesde fermentar la lactosa de los que no.

Azul de metileno

No fermentador de lactosa

Fermentador de lactosaFermentador de lactosa, con brillo verde brillante (E. coli )

Mac Conkey AgarMedio para diferenciar enterobacterias

Contiene:

P t

Selectivo y diferencial

E coli

Peptonas

Lactosa

Sales Biliares y cristal violeta E. coliy

Purpura de bromocresol

Lactosa (+) colonias Amarillas

Lactosa ( - ) colonias transparentes

o blancas

ProteusE. coli

Agar sangreMedio enriquecido y diferencialMedio enriquecido y diferencial

Se adiciona al medio sangre.

Permite el crecimiento dePermite el crecimiento de bacterias con requerimientos nutricionales exigentes .

Permite distinguir tres patronesPermite distinguir tres patrones de hemólisis: α β γ

Agar chocolateMedio enriquecido

Agar con el agregado de sangre, calentado suave. Suministra factores de crecimiento para bacterias exigentes. p g(Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrheae)

Haemophilus influenzae

Agar manitol saladoMedio para aislar StaphylococcusMedio para aislar Staphylococcus

Contiene:

Selectivo y diferencial

Peptonas

Manitol

Cl d di 7 5 % ( 0 5 %)Cloruro de sodio 7,5 % (vs 0,5 %)

Rojo fenol

Fermentación manitol acidez Colonias amarillas

No fermentación manitol Colonias rosadas

S.aureus S epidermidis

Baird-ParkerMedio para distinguir Staphyloccocus aureus.

Contiene:

Selectivo y diferencial

Peptonas

Extractos

Se suplementa con yema de huevo emulsionada con telurito de potasio

Cloruro de litio

Glicina

Piruvato de sodio

Glicina + piruvato promueven el crecimiento dePiruvato de sodio crecimiento de Staphyloccocus

S. aureus

S. aureus reducción telurito a telurio, lecitinasa (-) Colonias negro-grisáceo

rodeada por zona clara

S. Epidermidis reducción de telurito, lecitinasa (+)

Colonias negro-grisáceas, sin zona clara

Agar cetrimida Medio para PseudomonasSelectivo, parcialmente dif i l

Contiene:

Peptona

diferencial

Cloruro de magnesio

Sulfato de potasio

Cetrimida (detergente catiónico

P. aeruginosa en agar cetrimida

Cetrimida (detergente catiónico, bromuro de cetiltrimetil amonio)Adición de ácido nalidíxico

Producción de pigmentos pioverdina Colonias amarillo verdosas

piocianina, piorrubina

pioverdina

Agar MosselMedio para aislar Bacillus cereus

C ti

selectivo y diferencial

Contiene:

Peptonas

ExtractosAdición de yema de huevo yt actos

Manitol

Rojo fenol

de huevo y polimixina B

Bacillus cereus: no es capaz de utilizar el manitol (M -), produce la exo-enzima lecitinasa (L+)

Colonias rosadas con precipitado blanco

e a ec asa ( )

Saphilococcus aureus: es capas de utilizar manitol (M +), no producel i l i i (L )

Colonias amarillas con precipitado blanco

la exoenzima lecitinasa (L-)p p

Salmonella y Shigella AgarM di l ti dif i l S l ll Shi llMedio selectivo y diferencial para Salmonellas y Shigellas

Contiene

Peptonas

Salmonella typhimurium

p

Extractos

Lactosa

Sales biliares y verde brillante

Citrato férrico

Tiolsulfato sódico

Rojo neutroShigella flexneri

Salmonella, producción de ác. sulfìdrico, lactosa (-)

Colonias transparentes con centro negro

Shi ll l t ( ) C l i t tShigella, lactosa (-) Colonias transparentes

E. coli, lactosa (+) Colonias rosadas a rojas

Indicadores de pH

ROJO NEUTRORango de pH: 6.8-8.0 (rojo a amarillo)

AZUL DE BROMOTIMOLAZUL DE BROMOTIMOLRango de pH: 6-7.6 (amarillo a azul).

ROJO DE FENOL

AZUL DE TIMOLR d H 1 2 2 8 ( j ill ) 8 0 9 6 ( ill l)

ROJO DE FENOLRango de pH: 6.8-8.2 (amarillo a rojo)

Rango de pH: 1.2-2.8 (rojo a amarillo) y 8.0-9.6: (amarillo a azul).

PURPURA DE BROMOCRESOLRango de pH: 5.2-6.8 (amarillo a púrpura)Rango de pH: 5.2 6.8 (amarillo a púrpura)

ROJO DE CRESOLRango de pH: 7.2-8.8 (amarillo a rojo).

Técnicas básicas de i bi l ímicrobiología

Siembra en placa:Agotamiento por estríaAgotamiento por estría

Obtención de colonias aisladas

Siembra en agar ginclinado

Inoculaciones en medio solido en tubos

Pasaje de cultivos líquidos

Siembra por extensión y por vertido de placa

Siembra por extensión con espátula de Drigalsky

Medida del crecimiento

Por masa celularPor masa celular

1) Determinación del peso seco /húmedo

2) Determinación del N total : proteico o no proteico

3) Determinación de componentes celulares: ADN, ARN, proteínas

4) Métodos turbidimétricos (densidad óptica)

Medición de la turbidez: métodos espectofotométricos

λ = 600 nm

Curva de calibración

Medida del crecimiento

Por medida del número de individuosPor medida del número de individuos

1) Recuento directoCámara de Petroff-Hauser (para bacterias)Cámara de Petroff Hauser (para bacterias)Cámara de Thomas (para levaduras)

2) Contadores electrónicos de partículas (Contador Coulter)

3) Recuento de viables en placa

4) Recuento de viables sobre filtro en placa

Recuento directo de microorganismos al microscopio

Cámara de Petroff-Hausser

muestra

Área total: 1 mm2

Altura: 0,02 mm

Volumen: 0,02 mm3 = 0,00002 cm3

Nº cél/ml = promedio cél x 25 x 5 104

Recuento de células viables: método de recuento en placa

UFC/ml= N/ (vol x dil)( )

Problemas de Diluciones• DO = 0 35• DO600= 0,35

0,1 DO = 5x108 bact/ml

V final de cada dilución será de 0,1 mlV final de cada dilución será de 0,1 ml

• Un cultivo de E. coli crece en fase logarítmica y tiene una DO de 0,6g y ,

unidades. Se sabe que cuando el cultivo tiene una DO de 0,4 unidades, la

concentración bacteriana es de 1x108 bacterias/ml. ¿Qué dilución haría y

qué volumen sembraría para realizar el recuento de viables cuando la DO

es 0.6 U?.

Conservación de cultivos puros (axénicos)(axénicos)

Preservar la viabilidad y estabilidad genética. Evitar la

En estría sobre agar inclinado en Solo unos meses

contaminación

gheladera (5ºC)

Solo unos meses

Congelados a -20 ºC, –70 ºC ó - De meses a años196 ºC en caldo con 20 % glicerol u otrocrio persevante (por ejemplo leche)

De meses a años

Liofilizados Tiempos largosLiofilizados Tiempos largos

Los repiques sucesivos NO son un método de conservaciónLos repiques sucesivos NO son un método de conservaciónde microorganismos