INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

TÍTULO DEL TRABAJO:

SELECCIÓN DE DIFERENTES CEPAS DE LEVADURA PARA LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE BAGAZO DE CAÑA

PRETRATADO

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO BIOTECNÓLOGO

PRESENTA: FLAVIO ENRIQUE BANDERAS VIDRIO

México, D. F. Junio 2009

ASESOR BIOL. LEONOR PATRICIA RODRÍGUEZ PASCUAL

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INDICE DE TABLAS INDICE DE FIGURAS INTRODUCCIÓN 5 Etanol 5 1.1 Propiedades químicas 5 1.2 Aplicaciones 6 1.3 Producción 7 2. Situación en México 8 3. Levaduras 9 3.1 Fermentación alcohólica 10 4. Hidrólisis de celulosa 10 4.1 Celulasa y β-glucosidasa 11 4.2 Celobiosa 12 4.3 Xilanasa 13 JUSTIFICACIÓN 14 OBJETIVOS 14 METODOLOGÍA 15 RESULTADOS 16 DISCUSIÓN 20 CONCLUSIONES 20 REFERENCIAS 21 ANEXOS

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla CONTENIDO PÁGINA

1 Detalles de la molécula de etanol 6

2 Producción azucarera en México 9

3 Principales componentes de los árboles y otras plantas (%) 10

4 Medio RM 18

5 Medio semisintético 18

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INDICE DE FIGURAS

Figura CONTENIDO PÁGINA

1 Estructura del etanol 5

2 Producción azucarera en México 9

3 Fermentación alcohólica 10

4 Enlace β-glucosídico 11

5 Estructura de la celulosa 11

6 Estructura de la celobiosa 12

7 Cryptococcus humicola slant en PDAM 17

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INTRODUCCIÓN En este proyecto, se pretende producir etanol a partir de caldos de fermentación de celulosa que contienen glucosa y celobiosa principalmente y que se obtendrán como producto de tratamiento enzimático con celulasas y/o tratamiento con el microorganismo Cellulomonas sp. Por trabajos anteriores se sabe que la celobiosa es de muy difícil simplificación a una hexosa o pentosa sencilla, y no hay datos de fermentación alcohólica con ella como sustrato. Para esto, se emplearán levaduras de varios géneros y especies, que serán probadas en estos caldos de fermentación de celulosa. 1. Etanol 1.1 Propiedades Químicas

El compuesto químico etanol, o alcohol etílico, es un alcohol que se presenta como un líquido incoloro e inflamable con un punto de ebullición de 78 °C. Al mezclarse con agua en cualquier proporción, da una mezcla azeotrópica. Su fórmula química es (de acuerdo a la IUPAC):

Fig. 1 Estructura del Etanol

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Tabla 1. Detalles de la molécula de Etanol Nombre (IUPAC) sistemático

Etanol General

Fórmula semidesarrollada CH3-CH2-OH

Fórmula molecular C2H5OH Propiedades físicas

Estado de agregación Líquido Apariencia Incoloro Densidad 789 kg/m3; 0,789 g/cm3

Masa 46,07 u Punto de fusión 158.9 K (-114.3 °C)

Punto de ebullición 351.6 K (78.4 °C) Punto de

descomposición 0 K (-273,15 °C)

Temperatura crítica 514 K (240 °C) Propiedades químicas

Acidez (pKa) 15,9 Solubilidad en agua Miscible

Termoquímica ΔfH0

gas -235,3 kJ/mol ΔfH0

líquido -277,6 kJ/mol S0

líquido, 1 bar 161,21 J·mol-1·K-1 Valores en el SI y en condiciones normales

(0 °C y 1 atm) 1.2 Aplicaciones

1.2.1 Generales Además de usarse con fines culinarios, el etanol se utiliza ampliamente en muchos sectores industriales y en el sector farmacéutico, como principio activo o excipiente de algunos medicamentos y cosméticos (es el caso del alcohol antiséptico 70º GL y en la elaboración de ambientadores y perfumes). Es un buen disolvente, y puede utilizarse como anticongelante. También es un desinfectante. Su mayor potencial bactericida se obtiene a una concentración de aproximadamente el 70 %. 1.2.2 Industria química La industria química lo utiliza como compuesto de partida en la síntesis de diversos productos, como el acetato de etilo (un disolvente para pegamentos, pinturas, etc.), el éter dietílico, etc.

1.2.3 Combustible

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Se emplea como combustible industrial y doméstico. En el uso doméstico, se emplea el alcohol de quemar. Éste además contiene compuestos como la piridina o el metanol u otras sustancias denominadas desnaturalizantes, que impiden su uso como alimento, ya que el alcohol para consumo suele llevar impuestos especiales. En algunos países, en vez de etanol se utiliza metanol como alcohol de quemar. En Brasil se añade etanol a la gasolina para bajar la importación de petróleo, dando lugar a la alconafta. Este país es uno de los principales productores (con 18 mil millones de litros anuales), con esto reducen un 40 % de sus importaciones de crudo. Esta última aplicación se extiende también cada vez más en otros países para cumplir con el protocolo de Kyoto.

1.2.4 Toxicología El etanol puede afectar al sistema nervioso central, provocando estados de euforia, desinhibición, mareos, somnolencia, confusión, alucinaciones (como lo sean ver doble o que todo se mueve de forma espontánea). Al mismo tiempo, baja los reflejos. Con concentraciones más altas ralentiza los movimientos, impide la coordinación correcta de los miembros, pérdida temporal de la visión, etc. En ciertos casos se produce un incremento en la irritabilidad del sujeto intoxicado como también en la agresividad; en otra cierta cantidad de individuos se ve afectada la zona que controla los impulsos, volviéndose impulsivamente descontrolados y frenéticos. Finalmente, conduce al coma y puede provocar la muerte. La resistencia al alcohol parece aumentar en las personas adultas, de mayor peso y de menor altura, mientras que los niños son especialmente vulnerables. Se han comunicado casos de bebés que murieron por intoxicación debida a la inhalación de vapores de etanol tras haberles aplicado trapos impregnados de alcohol. La ingesta en niños puede conducir a un retardo mental agravado o a un subdesarrollo físico y mental. También se han realizado estudios que demuestran que si las madres ingerían alcohol durante el embarazo, sus hijos podían ser más propensos a tener el síndrome de alcohólico fetal.

1.2.5 Analítica Un método de determinación de la concentración aproximada de etanol en la sangre aprovecha el hecho de que en los pulmones se forma un equilibrio que relaciona esta concentración con la concentración de vapor de etanol en el aire expirado. Este aire se hace pasar por un tubo donde se halla gel de silicio impregnado con una mezcla de dicromato y de ácido sulfúrico. El dicromato, de color rojo anaranjado, oxida el etanol a acetaldehído y es reducido, a su vez, a cromo (III), de color verde. La longitud de la zona que ha cambiado de color indica la cantidad de etanol presente en el aire si se hace pasar un determinado volumen por el tubo.

1.3 Producción

Hoy en día se utilizan tres tipos de materias primas para la producción a gran escala de etanol de origen biológico (bioetanol):

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Sustancias con alto contenido de sacarosa: caña de azúcar remolacha melazas

Sustancias con alto contenido de almidón: maíz papa

Sustancias con alto contenido de celulosa: madera residuos agrícolas

En la actualidad tres países han desarrollado programas significativos para la manufactura de bioetanol como combustible:

Estados Unidos (a partir de maíz) Brasil y Colombia (ambos a partir de caña de azúcar)

El etanol se puede producir a partir de otros cultivos. También puede extraerse de múltiples tipos de celulosa "no útil". La producción a gran escala de alcohol agrícola para utilizarlo como combustible requiere importantes cantidades de tierra fértil con agua y suelos prolíficos. Brasil es considerado como la primera economía que logró un uso sostenible del etanol y el modelo a seguir por otros países. Comparado con el etanol producido en Estados Unidos con base en el maíz, la productividad del insumo energético en Brasil es ocho veces mayor que la estadounidense, y la productividad por hectárea es más del doble, mientras en Estados Unidos se producen 3000 litros de etanol por hectárea plantada de maíz, en Brasil se producen 7500 litros por hectárea plantada de caña de azúcar. Brasil destina solo 1% de su área cultivable para producir el etanol, mientras que Estados Unidos destina un 3,7% del total de tierras cultivables.

2. Situación en México

Las reservas de petróleo disminuyen considerablemente, por tanto deben ser aprovechadas para la fabricación de productos de la industria petroquímica como aceites, plásticos y otros productos que de otra fuente no es posible elaborar, y no para producción de combustibles. El etanol mana como una buena opción para uso como combustible, ya sea puro o combinado en distintas proporciones con combustibles procedentes del petróleo, lo que reduciría o nulificaría el uso de gasolinas, diesel, y otros combustibles derivados del hidrocarburo. En México, al menos 3 estados de la república tienen dependencia económica de la producción de caña de azúcar: Oaxaca, Morelos y Veracruz. La producción de azúcar de 2001 a 2006 en México está dominada por varios estados del país, como se muestra a continuación.

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Fig. 2. Producción azucarera en México

Tabla 2. Producción azucarera en México

En 2008, la producción total de caña molida supera las 4 millones de toneladas. El bagazo de caña está siendo “producido” como producto secundario en cantidades grandes, que puede ser utilizado para la producción de etanol.

3. Levaduras

Son microorganismos del Reino Fungi, Ascomycota o Basidiomycota que pueden presentar reproducción sexual y asexual. Aunque en algunos textos de botánica se considera que las levaduras "verdaderas" pertenecen sólo a la clase Ascomycota, desde una perspectiva microbiológica se ha denominado levadura a todos los hongos con predominio de una fase unicelular en su ciclo de vida, incluyendo a los hongos basidiomicetos.

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3.1 Fermentación alcohólica La fermentación alcohólica es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de oxígeno, originado por la actividad de microorganismos como las levaduras que procesan los hidratos de carbono para obtener como productos finales: etanol, CO2 y ATP. El etanol resultante se emplea en la elaboración de algunas bebidas alcohólicas, tales como el vino y la cerveza. En la actualidad se sintetiza también etanol mediante la fermentación a nivel industrial para ser empleado como biocombustible. La fermentación alcohólica tiene como finalidad biológica proporcionar energía a los microorganismos en ausencia de oxígeno para ello disocian las moléculas de glucosa y obtienen la energía necesaria para sobrevivir, produciendo el etanol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentación. Una de las principales características de estos microorganismos es que sobreviven en ambientes completamente carentes de oxígeno (O2), máxime durante la reacción química, por esta razón se dice que la fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico.

Fig. 3. Fermentación alcohólica

4. Hidrólisis de celulosa

La Celulosa es la principal componente de las paredes celulares de los árboles y otras plantas. El contenido de celulosa varía según el tipo de árbol o planta que se considere. A continuación se muestra la composición de distintos árboles y plantas:

Tabla 3. Principales componentes de los árboles y otras plantas (%)

Celulosa Hemicelulosa Lignina Ceniza Sílice • Pinos 40-50 15-34 26-34 1 trazas • Otros Árboles 38-51 21-27 16-30 1 trazas • Bagazo de caña de azúcar 32-44 19-24 2-5 1.5-2 • Bambú 26-43 21-31 2-5 1.5-2.5 • Pelusa de algodón 80-85 3-4 1-2 • Paja de trigo 28-36 25 12-16 15-20 12-18 • Paja de arroz 29-40 26 7-21 4-11 4-7

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Estructura Molecular de la Celulosa Desde el punto de vista bioquímico, la celulosa (C6H10O5)n con un valor mínimo de n = 200, es un polímero natural, constituido por una larga cadena de carbohidratos polisacáridos. La estructura de la celulosa se forma por la unión de moléculas de β-glucosa a través de enlaces β-1,4-glucosídicos. La celulosa tiene una estructura lineal o fibrosa, en la que se establecen múltiples puentes de hidrógeno entre los grupos hidroxilo de distintas cadenas yuxtapuestas de glucosa, haciéndolas muy resistentes. De esta manera, se originan fibras compactas que constituyen la pared celular de las células vegetales, dándoles así la necesaria rigidez.

Fig. 4. Enlace β-glucosídico

La unión de 2 moléculas de β-glucosa forman un disacárido llamado celobiosa (unidad secundaria de la celulosa).

Fig. 5. Estructura de la celulosa

A pesar de que está formada por glucosas, sólo algunos organismos pueden utilizar a la celulosa como fuente de energía que cuenten con la enzima ß-glucosidasa necesaria para hidrolizar los enlaces β-1,4-glucosídicos lo que forma dos moléculas de ß-glucosa a partir de una de celobiosa.

4.1 Celulasa y β-glucosidasa

Las moléculas de celulosa se unen mediante puentes de hidrógeno de dos tipos diferentes, dando lugar a una estructura polimórfica. Se han reconocido, al menos, cuatro formas cristalinas, además de la celulosa amorfa. De la hidrólisis se obtienen celodextrinas, celobiosa y, finalmente, glucosa. Los puentes de hidrógeno en las formas cristalinas de la celulosa configuran cristales con una disposición tan comprimida que ni el agua ni las enzimas pueden penetrar en ellos (formas insolubles). La estructura cristalina sólo puede ser atacada por un tipo de celulasas, las exo β 1,4-glucanasas, que remueven unidades de glucosa o celobiosa a partir del extremo libre no reductor de la cadena de celulosa, dando como resultado un incremento rápido en los azúcares o grupos reductores y poco cambio en el tamaño del polímero. En esas condiciones puede

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intervenir otro grupo de enzimas del complejo enzimático, las endo β 1,4-glucanasas, rompen por hidrólisis al azar los enlaces internos de la molécula en las regiones amorfas, producen un rápido decremento en la longitud de la cadena y un lento incremento de los grupos reductores libres. Enzimas que forman parte del pretratamiento que se dará a la celulosa. Puede decirse que la hidrólisis completa de la celulosa transcurre en distintos episodios, en los que intervienen diferentes enzimas del sistema enzimático celulolítico (sensu lato). Se distinguen tres fases en la degradación de la celulosa:

1. Transformación de la celulosa insoluble (cristalina) en celulosa soluble (amorfa). 2. Transformación de celulosa soluble en oligosacáridos y celobiosa (dímero de la glucosa). 3. Transformación de la celobiosa en glucosa.

En las dos primeras fases intervienen diversas enzimas que podemos incluir dentro del grupo de las celulasas (sensu stricto), mientras que en la tercera está presente una enzima que cataliza la ruptura del enlace β del disacárido, denominada β-glucosidasa. El proceso se puede resumir según el siguiente esquema: exo β 1,4-glucanasa endo β 1,4-glucanasa β-glucosidasa Celulosa(Cristalina) Celulosa(Amorfa) Celobiosa Glucosa La intervención de la β-glucosidasa resulta decisiva para que se produzca la degradación completa de la celulosa a glucosa y la posterior fermentación de ésta a alcohol etílico.

4.2 Celobiosa

La celobiosa es un azúcar doble (disacárido) formado por dos glucosas unidas por los grupos hidroxilo del carbono 1 en posición beta de una glucosa y del carbono 4 de la otra glucosa. Por ello este compuesto también se llama beta glucopiranosil(1-4) beta glucopiranosa. Al producirse dicha unión se desprende una molécula de agua y ambas glucosas quedan unidas mediante un oxígeno monocarbonílico que actúa como puente. La celobiosa aparece en la hidrólisis de la celulosa. Su fórmula es:

Fig. 6. Estructura de la celobiosa

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4.2 Xilanasa

Las xilanas son heteropolisacáridos y su degradación total para producir xilosa y/o arabinosa es llevada a cabo, como en la celulosa, por un grupo de enzimas que participan sinergísticamente. Las más conocidas son las endo-ß-D-xilanasas, las cuales rompen al azar los enlaces glicosídicos de la cadena principal de la molécula. La arabinofuranosidasa que hidroliza las cadenas laterales de arabinosa, mientras que las acetil xilan esterasas liberan grupos acetatos. La glucoronidasa remueve las cadenas laterales de ácido glucorónico a partir de unidades de xilosa. Las ß-xilosidasas son enzimas activas sobre oligosacáridos cortos, llevando a cabo la hidrólisis de los enlaces ß-1,4-aril-xilopiranósido produciendo xilosa. Se considera a la xilanasa como una enzima necesaria para el proyecto dado que no se puede asegurar la no presencia de xilanas en el caldo pretratado de celulosa.

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JUSTIFICACIÓN El Etanol ha probado ser una fuente de combustible renovable y al menos igual de eficiente que la gasolina. Es un producto requerido para México, que reduciría la dependencia del petróleo y la importación de productos de éste. Se seleccionó al bagazo de caña como sustrato dado que éste es un residuo producido por la industria azucarera lo que representa su bajo costo. La degradación de celulosa produce un caldo de fermentación conteniendo glucosa y celobiosa, las levaduras son la opción elegida para obtener etanol, debido a su relativa facilidad de manejo pero principalmente por el amplio espectro de degradación de productos derivados de celulosa.

OBJETIVO GENERAL

Seleccionar las cepas de levadura, de acuerdo a su comportamiento y datos cinéticos en medios ricos en glucosa y celobiosa, que brinden una producción eficaz de etanol a partir de caldos de degradación de celulosa.

OBJETIVOS PARTICULARES

A partir de celulosa (bagazo de caña) obtener un caldo de fermentación rico en

glucosa y celobiosa, y determinar sus respectivas concentraciones en éste. Analizar el comportamiento de cada cepa en medios formulados con glucosa y en

medios formulados con celobiosa, para determinación de datos cinéticos. Experimentar con diferentes cepas de levadura y determinar el crecimiento y las

concentraciones de etanol producido.

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METODOLOGÍA Se hizo una búsqueda por diferentes medios (aislamiento, compra y/o préstamo) de cepas de levadura que cumpliesen con los requerimientos (como: producción de b-glucosidasa y alcohol deshidrogenasa) para ser consideradas como candidatas a participar en el experimento. Se mantuvieron en dos medios de cultivo previo al de ensayo, en slant y placa en PDA y ASD modificados (+5g/L de celobiosa, pH 5.6), se hicieron resiembras cada 2 semanas para su conservación. Previo a la aplicación, se probaron las capacidades degradativas de celobiosa de cada cepa de manera cualitativa en medio con rojo de metilo como indicador (0.01% w/v). Enseguida se trasladaron a medio liquido sintético (c. 20g/L de celobiosa) del que se obtuvieron resultados concluyentes respecto a agitación. De estas pruebas se seleccionaron los candidatos con mayor vire en su medio y crecimiento respectivamente, se trasladaron al medio de producción obtenido del tratamiento de celulosa, se realizó la fermentación en condiciones controladas con cada cepa. Al finalizar, se cuantificó la cantidad de azúcares en el medio a varios tiempos, con el objetivo de visualizar consumo y generación de glucosa con el método de DNS. Para determinar azúcares iniciales en el medio se realizó igualmente el método de DNS con 5 muestras del mismo recipiente, obtenido del tratamiento previo. En resumen:

Adquirir las cepas de levadura con las que se llevará a cabo la experimentación. Hacer las resiembras necesarias para mantener a los microorganismos en estado

viable (Medios elegidos: ASD modificado y PDA modificado) Análisis de degradación de celobiosa en medio sintético por método cualitativo. Análisis de degradación de celobiosa en medio semi-sintético por método

cualitativo. Corrimiento de cinéticas de crecimiento de las cepas seleccionadas en el medio

experimental (caldos de degradación de celulosa). Análisis de resultados.

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RESULTADOS Y ANÁLISIS 1era Etapa: De recolección y resiembra para activación o mantenimiento de cepas de levadura. Análisis de concentraciones de azucares en el caldo de fermentación de celulosa. Una cantidad de cepas de levadura que son capaces de utilizar celobiosa y glucosa según lo reportado en las referencias y/o son reportadas como productoras de etanol fueron analizadas y se comprobó si tienen capacidades de utilización de celobiosa y glucosa como sustrato para producir alcohol etílico en fermentación. PDAM y ASDM (+5g/L de celobiosa, pH 5.6) Algunas de las levaduras a utilizar son:

Saccharomyces cereviseae Candida albicans

Cryptococcus humicola Xanthophyllomyces dendrorhous Saccharomyces cereviseae esta reportada como productora de etanol por excelencia, mas no hay datos acerca de si utiliza o no celobiosa. Candida albicans es una levadura muy conocida que también posee la capacidad de producir etanol, sin embargo, no es muy clara la información respecto a la utilización de celobiosa, glucosa y otras hexosas o pentosas. Cryptococcus humicola es una levadura capaz de hidrolizar a la celulosa a través de la enzima carboximetil-celulasa 1, y que posee también la enzima β-glucosidasa, capaz de liberar glucosa de celobiosa, por lo que será probada su utilización de celobiosa y la posibilidad de que produzca etanol.

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Xanthophyllomyces dendrorhous conocida por su capacidad de degradación de derivados de celulosa, pero con pocos datos acerca de fermentación a etanol. Phaffia rhodozima, X. dendrorhous en estado reproductivo y con, ciertamente, mayores capacidades degradativas de diversos sustratos. Otras Levaduras reportadas como degradadoras de celobiosa:

Kluyveromyces marxianus K. cellobiovorans Candida wickerhamii C. shehatae C. tenuis Dekkera intermedia Pichia stiptis

Lo principal es considerar que cada una de estas especies, debe producir las enzimas necesarias: β-glucosidasa Xilanasa Celulasa Alcohol deshidrogenasa

Fig. 7. Cryptococcus humicola slant en PDAM Respecto al hidrolizado de celulosa. La concentración de la hexosa glucosa varía entre 50 y 150uM, en el caso de la celobiosa, esta concentración se triplico, al menos, puesto que el tratamiento previo no da para más, llegando a valores de entre 330 y 480uM.

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2da etapa: Pruebas de utilización de glucosa y celobiosa. Para esta parte, se empleó un método cualitativo, se preparó un medio de cultivo con los siguientes reactivos (las cantidades también se expresan para cada uno): El medio constó de los siguientes componentes:

Tabla 4. Medio RM (NH4)2SO4 2.0g/L Na2HPO4 0.31g/L NaH2PO4 0.45g/L NaCl 0.1g/L Peptona de caseína 0.1g/L Extracto de levadura 0.04g/L Celobiosa 10.0g/L pH 6 - ajustado con acido acético Rojo de metilo al 0.01%.

Como se aprecia (en las imágenes del anexo 1), no hubo pruebas que mostraran un vire muy notable en el medio cualitativo. Sin embargo, las que mostraron una cierta modificación son:

• Cryptococcus humicola • Cryptococcus spp. • Candida albicans • Candida guilliermondii. • Saccharomyces cereviseae.

3ra etapa: Desarrollo de cinéticas de crecimiento en medio con componentes en concentraciones conocidas Se llevaron todas las cepas a medio líquido, se mantuvieron a 190rpm, a 30°C y

pH 5.5, medio líquido a 100rpm, a 30ºC y pH 5.5, y medio líquido sin agitación, a 30ºC y pH 5.5.

La agitación probó ser un factor muy importante para el desarrollo de los microorganismos.

Tabla 5. Medio Semisintético

Componente Concentración (g/L) Celobiosa 20.0 (NH4)2SO4 2.0 Na2HPO4 0.5 NaH2PO4 0.5

NaCl 0.1 MgSO4·7H2O 0.5

Extracto de levadura 2.0

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4ta etapa: Desarrollo de cinéticas de crecimiento en el caldo pretratado de celulosa (bagazo de caña).

Se mantuvieron en el medio líquido (100mL en matraces de 250mL) a 30°C en condiciones semianaeróbicas por 54h.

Los azúcares reductores en el sobrenadante se determinaron empleando el método del ácido dinitrosalicílico 22 utilizando glucosa como estándar.

Grafica 1. Biomasa y sustrato vs. Tiempo

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450

5 10 5

1 10 4

1.5 10 4

2 10 4

X Candida albicansX Cryptococcus humicolaX Cryptococcus spp.S C.albicansS C.humicolaS C.spp.

Biomasa y Sustrato vs Tiempo

tiempo (t, hr)

biom

asa

(x),

sust

rato

(S)

xA

xB

xC

SA

SB

SC

t

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DISCUSIÓN Las tablas en el anexo 2 y la gráfica 1 muestran una tendencia consumo-generación-consumo de glucosa. El caldo por si sólo ya contenía glucosa después del tratamiento, y celobiosa, que no es afectada por el ác. 3,5-DNS, sino hasta que es degradada a glucosa por el microorganismo en cuestión. Los valores de azúcares reductores se presentan como promedios de dos repeticiones por tratamiento a diferentes temperaturas (25 y 32ºC). Se hizo un análisis de varianza de dos colas, aleatorio, cuando se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, se empleó una prueba de comparación de medias con una probabilidad mayor o igual al 95% (a=0,05). El caldo por si sólo ya contenía glucosa después del tratamiento, y celobiosa, que no es afectada por el ác. 3,5-DNS, sino hasta que es degradada a glucosa por el microorganismo en cuestión.

Y en seguida de la aparición de glucosa, ésta es degradada hasta el producto final. CONCLUSIONES La concentración de azúcares en el medio inicialmente no es uniforme, puesto que el contenido de derivados de celulosa varios es muy diverso. En base a la cantidad de glucosa obtenida a partir de la celobiosa en el medio, se deduce la capacidad por parte de C. humicola como la mejor entre estas cepas para la degradación de celobiosa, siendo el tiempo 5 aquel en el que se produjo más glucosa, que posteriormente, se degradó en mayor grado que por parte de los otros microorganismos. El estudio no es concluyente respecto a la fermentación a etanol, pero el hecho de que Crypptococcus spp. haya sobrepasado al promedio de los microorganismos utilizados en producción de biomasa, indica la posibilidad de que sea también el mejor productor de etanol.

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REFERENCIAS Programa Nacional de la Agroindustria de la Caña de Azúcar 2007 - 2012,

SAGARPA, Gobierno Federal de los Estados Unidos Mexicanos. Datos oficiales obtenidos de World Wide Web: http://www.sagarpa.gob.mx United States, Department of Energy. Biomass Program. Disponible en World Wide

Web: http://www1.eere.energy.gov/biomass/technologies.html Yeast Identification, Culture and Safe Deposit Services. Norwich, UK. Disponible

en World Wide Web: http://www.ncyc.co.uk/index.php National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine.

Bethesda, MD, United States of America. Disponible en World Wide Web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

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Desphande, M.V. Ethanol production from cellulose by coupled saccharification/fermentation using Saccharomyces cerevisiae and cellulase complex from Sclerotium rolfsii UV-8 mutant. Appl. Biochem. Biotechnol. 36(3):227-234. 1992.

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ANEXO 1

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24

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ANEXO 2

Cuadro 1 Determinación de concentración de glucosa en Cryptococcus sp. Cryptococcus

sp. AS540 [gluc] (µM)

t0 0.266 59.37788

t1 0.177 34.93136 t2 0.191 38.77688

t3 0.194 39.60092

t4 0.168 32.45924 t5 0.34 79.7042

t6 0.068 4.99124

t7 0.05 0.047 t8 0.124 20.37332

Cuadro 2 Determinación de concentración de glucosa en Candida albicans

Candida albicans AS540 [gluc] (µM)

t0 0.313 72.28784 t1 0.289 65.69552 t2 0.333 77.78144 t3 0.485 119.5328 t4 0.566 141.78188 t5 0.257 56.90576 t6 0.204 42.34772 t7 0.132 22.57076 t8 0.098 13.23164

Cuadro 3 Determinación de concentración de glucosa en Cryptococcus humicola

Cryptococcus humicola AS540 [gluc] (µM)

t0 0.41 98.9318 t1 0.385 92.0648 t2 0.293 66.79424 t3 0.152 28.06436 t4 0.721 184.35728 t5 0.501 123.92768 t6 0.31 71.4638 t7 0.114 17.62652 t8 0.09 11.0342

26

Gráfica 2 Variación del contenido de glucosa en el medio

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

5.94E+01 3.49E+01 3.88E+01 3.96E+01 3.25E+01 7.97E+01 4.99E+00 4.70E-02 2.04E+01

[gluc + fruc] (uM)

As 540nm

Cryptococcus sp. Candida albicans Cryptococcus humicola

27

ANEXO 3

Sustrato en el medio: Biomasa producida:

SA

59.3778810 6

34.9313610 6

38.7768810 6

39.6009210 6

32.4592410 6

79.704210 6

4.9912410 6

0.04710 6

2.3733210 6

xA

0.05 10 5

2.99610 5

4.09810 5

5.01110 5

5.24810 5

3.76410 5

5.43110 5

5.12410 5

3.01210 5

SB

72.28810 6

65.69610 6

77.78110 6

119.53310 6

141.78210 6

56.90610 6

42.34810 6

22.57110 6

13.23210 6

xB

1.04510 5

3.98610 5

4.29810 5

6.01110 5

6.42810 5

5.09210 5

5.54110 5

5.10910 5

3.82 10 5

SC

98.93210 6

92.06510 6

66.79410 6

28.06410 6

184.35710 6

123.92810 6

71.46410 6

17.62710 6

11.03410 6

xC

3.93510 5

3.32210 5

4.00110 5

4.77410 5

5.30910 5

6.10310 5

7.40510 5

7.53110 5

5.11510 5

Amax 0.71hr

Bmax 0.341hr

Cmax 0.321hr