LABORATORIO DE INMUNOLOGIA CLNICA

Reacciones de Precipitacin.

Profesores: QFB Mara de las Mercedes Zamudio DuranQFB Francisco Javier Parada GarcaMtra. Yolanda Flores CabreraDr. Osvaldo Daniel Casteln Martnez

Integrantes del equipo:Grupo: 1802 Equipo: 3

Integrantes.Nombre: Firma

Herrera Lpez Ema Elvira. _____________________

Villa Reyes Odra Berenisse. _____________________

Valle Medina Antonio. _____________________

Universidad Nacional Autnoma de MxicoFacultad de Estudios Superiores Zaragoza

Practica 7. Reacciones de Precipitacin.Introduccin.La inmunoqumica cobra un gran impulso en las primeras dcadas del siglo XX con los trabajos de Karl Landsteiner (1868-1943). Su primera contribucin de importancia haba sido la descripcin, mediante reacciones de aglutinacin, del sistema de antgenos naturales (ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902), completada (en colaboracin con Von Dungern y Hirzfeld), con las subdivisiones del grupo A y el estudio de su transmisin hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estmulo para avanzar en el desentraamiento de la especificidad qumica de los antgenos que determinan la formacin de anticuerpos. Landsteiner estudi sistemticamente las caractersticas de inmunogenicidad y especificidad de reaccin de antgenos con anticuerpos, valindose de la modificacin qumica de antgenos, denominando haptenos a aquellos grupos qumicos que por s mismos no desencadenan formacin de anticuerpos, pero s lo hacen tras ser conjugados a protenas portadoras. La cuestin de las reacciones antgeno-anticuerpo se convirti en otra polmica entre escuelas hasta finales de los aos 20. Mientras Ehrlich y sus seguidores mantenan que estas reacciones tienen una base puramente qumica, Bordet y sus discpulos las explicaban como fenmenos fsicos de reacciones entre coloides. La resolucin del debate debi aguardar hasta finales de los aos 30, al incorporarse avances tcnicos como la electroforesis, la cromatografa en papel, la ultracentrifugacin y el microscopio electrnico. Heidelberg y Kendall (1936) purificaron anticuerpos a partir de sueros por disociacin de precipitados. Tiselius (1939) demostr que los anticuerpos constituyen la fraccin gamma-globulnica del suero. En 1959, Rodney R. Porter y Gerald M. Edelman presentan el modelo fundamental de las inmunoglobulinas (dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) y su estructura qumica., acontecimiento que separ los 200 aos de la historia de la inmunologa en dos perodos, en los cuales ms de 70 investigadores han hecho su contribucin en los campos de: la inmunidad, la serologa, la inmunoqumica y la inmunobiologa. Durante este lapso de tiempo se descubre que la sntesis de anticuerpos ocurre en las clulas plasmticas, aunque stas no son puestas en relacin an con los linfocitos; durante muchos aos se sigui creyendo que los linfocitos eran clulas pasivas, sin funcin inmune. Por aquella poca se describe, tambin, la diversidad de inmunoglobulinas, llegndose al establecimiento de una nomenclatura. Enseguida comienza la era de los mltiples experimentos sobre timectoma en ratones neonatos y sobre bursectoma en aves, as como los de reconstitucin de animales irradiados, con timocitos y clulas de la medula sea, y que permiten afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales T y B, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente. Una importante faceta de la inmunologa de la primera mitad del siglo XX fue la obtencin de vacunas. Se lograron toxoides inmunognicos a partir de toxinas bacterianas, en muchos casos por tratamiento con formol: toxoide tetnico (Eisler y Lowenstein, 1915) y toxoide diftrico (Glenny, 1921). En 1922 se desarrolla la vacuna BCG contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de CalmetteGurin. La utilizacin de coadyuvantes se inicia en 1916, por LeMoignic y Piroy.

Anticuerpos Un anticuerpo se define como una inmunoglobulina (Ig) capaz de una combinacin especifica con el antgeno que ha causado su produccin en un animal susceptible. Ellos son producidos en respuesta a la invasin de molculas forneas en el cuerpo. Los anticuerpos existen como una o mas unidades en forma de Y, compuesta por cuatro cadenas polipeptdicas. Cada Y contiene dos copias idnticas de una cadena pesada (HC, heavy chain), y dos copias idnticas entre s de una cadena ligera (LC, light chain), llamadas as por sus pesos moleculares relativos que son de aproximadamente 50kDa la cadena pesada y de cerca de 25kDa la cadena ligera. Estas cadenas se mantienen unidas mediante enlaces disulfuros intercatenarios. Estas cadenas pueden separarse por reduccin de los enlaces S-S y acidificacin.Los anticuerpos pueden ser divididos en cinco clases: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, basado en el nmero de unidades Y y en el tipo de cadena pesada. Las cadenas pesadas de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, son conocidas como gamma, mu, alpha, delta y epsilon (, , , y ), respectivamente. Las cadenas ligeras de cualquier anticuerpo pueden ser clasificadas como tipo kappa () o lambda (), basadas en pequeas diferencias estructurales polipeptdicas; sin embargo, las cadenas pesadas determinan la subclase de cada anticuerpo.Antgenos El principio bsico de cualquier tcnica inmunoqumica es el de que un anticuerpo especfico se unir con un antgeno especfico para dar un complejo anticuerpo-antgeno exclusivo. La definicin clsica de antgeno es cualquier sustancia fornea que elicita una respuesta inmune cuando es introducida dentro de tejidos de animales susceptibles y que son capaces de combinar con los anticuerpos especficos formados. Los antgenos son generalmente de alto peso molecular y comnmente son protenas o polisacridos. Polipptidos, lpidos, cidos nucleicos y otras molculas pueden tambin funcionar como antgenos. La respuesta inmune puede tambin ser generada contra sustancias pequeas, llamadas haptenos, si estos esta acoplados a una protena acarreadora, como la albmina de suero bovino (BSA) u otras matrices sintticas. Una variedad de molculas como drogas, azucares simples, aminocidos, pequeos pptidos, fosfolpidos o triglicridos pueden funcionar como haptenos. As, dndole suficiente tiempo, cualquier sustancia fornea ser identificada por el sistema inmune y evocara la produccin de un anticuerpo especfico. Sin embargo, esta respuesta inmune especfica es altamente variable y depende mucho en parte del tamao, estructura y composicin de los antgenos. Los antgenos que elicitan una fuerte respuesta inmune se dice que son altamente inmunognicos. Las partes de las regiones hipervariables del anticuerpo que contactan con el antgeno se denominan partopos y la regin de un antgeno que puede especficamente unirse a un anticuerpo es llamado eptope. Un eptope no tiene una propiedad intrnseca de alguna estructura particular. Estos son usualmente uno a seis monosacridos o 5-8 residuos de aminocidos sobre la superficie del antgeno. Debido a que la molcula de antgeno existe en el espacio, el eptope reconocido por un anticuerpo puede depender de la presencia de una especfica conformacin tridimensional del antgeno (por ejemplo, un sitio nico formado por la interaccin de dos loops o subunidades de una protena nativa) o el eptope puede corresponder a una regin de una secuencia primaria simple, as, los eptopes son descritos como conformacionales y lineares, respectivamente. El rango de posibles sitios de unin es enorme, ya que cada sitio de unin tiene sus propias propiedades estructurales derivadas de enlaces covalentes, inicos e interacciones hidroflicas e hidrofbicas. Para que exista una eficiente interaccin entre el antgeno y el anticuerpo, el eptope debe estar fcilmente disponible para la unin. Si la molcula blanco es desnaturalizada, por ejemplo, por la fijacin, cambios de pH o durante la preparacin para el gel de electrofresis, el eptope puede ser alterado y esto puede afectar su habilidad para interactuar con un anticuerpo. Por ejemplo, algunos anticuerpos son inefectivos en un Western-blot pero muy bueno en inmunohistoqumica debido a que en el proceso, un complejo sitio antignico puede ser mantenido en el tejido, mientras que en el otro procedimiento la preparacin de la muestra altera la conformacin de la protena lo suficiente para destruir el sitio antignico y as elimina el sitio de unin con el anticuerpo. 14 Si el producto de un gene de inters est presente en concentraciones extremadamente bajas, una opcin puede ser el uso de la informacin de la secuencia conocida de nucletidos para derivar el correspondiente pptido para generar anticuerpos especficos para esa secuencia. Caractersticas de un buen antgeno incluyen: reas de estabilidad estructural dentro de la molcula. Un peso molecular mnimo de 8000 a 10000 Daltons, aunque los haptenos con pesos moleculares tan bajos como 200 Da han sido usados en presencia de protenas acarreadoras. La habilidad de ser procesado por el sistema inmune. Regiones inmunognicas accesibles al mecanismo formado por el anticuerpo. Elementos estructurales que sean suficientemente diferentes al husped. Para pptidos antgenos, regiones que contengan por lo menos 30% de aminocidos inmunognicos: K, R, E, D, Q, N. Para pptidos antgenos, significante hidrofobicidad o residuos cargados.

Interaccin antgeno-anticuerpo Los antgenos y anticuerpos interactan por complementariedad espacial y no por uniones covalentes. La asociacin especfica del antgeno y el anticuerpo es dependiente del los puentes de hidrogeno, las interacciones hidrofbicas, fuerzas electrostticas y las fuerzas de van der Waals; por lo general solo son efectivas en distancias cortas. Todos estos son uniones dbiles no covalentes, aunque algunas de las asociaciones entre antgeno y anticuerpo pueden ser bastante fuertes. Al igual que los anticuerpos, los antgenos pueden ser multivalentes, ambos a travs de mltiples copias del mismo eptope, o a travs de la presencia de mltiples eptopes que son reconocidos por mltiples anticuerpos. Las interacciones que involucran multivalencias pueden producir mayor estabilidad a los complejos, sin embargo la multivalencia puede tambin resultar en dificultades estricas, por lo tanto reduciendo la posibilidad de unin.

La respuesta inmune es la actuacin integrada de un gran nmero de mecanismos heterogneos de defensa contra sustancias y agentes extraos. En general, a las sustancias extraas se las denomina como antgenos, y son ellos los que desencadenan en el organismo una serie de eventos celulares que provocan la produccin de los mecanismos de defensa.Objetivos.Determinar la concentracin de complemento hemoltico en suero, para lisar el 50% de una suspensin de glbulos rojos de carnero; en una muestra de suero problema. Mtodo

ResultadosImagen 1: Precipitacin en capilar Se observa que en todos los capilares hay precipitacin aproximadamente en la misma altura, contrastndose entre s, teniendo adems que en el control positivo no hay precipitado y tampoco en el control negativo, todas las diluciones han mostrado precipitado en menor proporcin en cuanto han ido diluyndose ms.

Imagen 2, precipitacin en sistema de 3 pozos de OuchterlonySe logra observar en el sistema de la derecha una reaccin de identidad dada entre albumina y anticuerpo antialbumina, el sistema izquierdo no ha mostrado la mnima reaccin.

Anlisis de Resultados

Conclusiones

Bibliografa:Siachoque MO. Inmunologia: diagnostico e interpretacin de pruebas de laboratorio. 1 ed. Bogot: Centro editorial Universidad del Rosario; 2006.Pesntez HX. Diagnstico de Inmunoglobulinas por el Mtodo de Inmunodifusin Radial [Tesis]. Ecuador: Universidad Catlica De Cuenca; 2011.Freifelder D. Tecnicas de bioqumica y biologa molecular. 1 ed. Barcelona: Reverte; 2003.