Racionalización de las pruebas microbiológicas ante la sospecha de enfermedades infecciosas importadas El Prof. Raúl Ortiz de Lejarazu del Servicio de

Microbiología e Inmunología del Hospital Clínico

Universitario de Valladolid, expuso el tema de la

racionalización de las pruebas microbiológicas ante la

sospecha de enfermedades infecciosas importadas.

Planteó una serie de preguntas sobre donde hacer las pruebas, ¿laboratorios de

referencia? ¿nacionales? ¿autonómicos? ¿regionales? ¿localización?; así como ¿qué

hacer? y ¿cómo hacerlas?, y afirmando que hay cosas que racionalizar/reflexionar y

acordar entre microbiólogos.

Para centrar el tema, previamente hizo una serie de consideraciones históricas y

epidemiológicas:

Ante el brote de gripe por el virus A/ Mayo Clinic/103/74 (Hsw1N1) en 1976 (episodio

de Fort Dix, EEUU). La situación de anticuerpos frente a la gripe porcina y humana en

la población de Valladolid (Med Clin –Barc-) 1977, 68:16-18) era la siguiente: un

89,6% de personas >50 años tenían con anticuerpos con título ≥1/20, y no llegó a

haber difusión mundial del virus.

Algo similar, en cuanto a protección, se observó en Valladolid cuando reapareció en

1977 el subtipo H1N1 A/ USSR /90/77 (Laboratorio 1978; 66:339-350): un 13,3% de la

población tenía ya Ac. IH ≥1/40.

Tanto por ciento de seropositivos frente a diversos virus gripales en la población sana de Valladolid (157 sueros, enero 1978)

% Ac. 1/20 % Ac. 1/40 A/Victoria/3/75 H3N2 A/Texas/1/77 H3N2 A/FM/1/47 H1N1 A/RURSS/90/77 H1N1

70,7 56,0 47,1 28,6

50,3 32,4 31,8 13,3

Ante la alerta de la gripe porcina A/H1N1 de 2009, la OMS, en 2009, recomendaba

fuertemente a sus Centros Nacionales de gripe (NIC’s) enviar urgentemente todas las

cepas de gripe A no-subtipables a alguno de los cinco Centros Colaboradores de la

OMS para su diagnóstico y posterior caracterización.

Algunas enfermedades infecciosas importadas se quedan en

los países de acogida y pasan a las carteras de servicios de

Microbiología, así, sucedió con el brote de Francisella tularensis

(tularemia) que sucedió en 1997-98 y 2007-08 en Tierra de

Campos de Castilla y León como una zoonosis del Hemisferio

Norte.

Algo parecido acaeció en Alemania con la infección por Escherichia coli O104:H4

productor de toxina de Shiga que causó un brote de gastroenteritis y síndrome urémico

hemolítico en mayo, junio y julio de 2011. El consumo de brotes verdes de algunos

vegetales fue identificado como el vehículo más probable de la infección.

Estos hechos ilustran situaciones que luego permanecen en la memoria colectiva

sanitaria y que determinan actitudes de diagnóstico, terapia y epidemiológicas.

Enfermedades importadas son todas,

exóticas o cosmopolitas, que pueden llegar al

hombre a través de distintas fuentes y vías.

Las enfermedades emergentes pueden ser

enfermedades importadas pero las

importadas no tienen por qué ser emergentes.

Existe una Guía publicada por el MSSSI que

trata de forma exaustiva y sistematica estas enfermedades infecciosas. Un ejemplo es

la infección por el virus O`nyong-nyong (dolor grave articular), aislado por primera vez

por en Entebe, Uganda en 1959, cuyos vectores primarios son los mosquitos del

género Anopheles funestus y Anopheles gambiae, Las principales manifestaciones

clínicas, entre otras, son fiebre, eritema y poliartritis. De las epidemias conocidas, una

entre 1959 y 1962, en Uganda y Mozambique, afectó a unos dos millones de personas.

Esta enfermedad es un ejemplo de cómo se describen este tipo de enfermedades en

la “Guía de enfermedades infecciosas importadas” publicada por el Ministerio de

Sanidad y Consumo en el 2007, con especial referencia a las importadas por

inmigrantes residentes en España que se desplazan temporalmente a sus países de

origen (VFRs-Visiting friends and relatives). En los distintos informes se abordan la

distribución geográfica, los aspectos clínico-epidemiológicos más relevantes y las

medidas generales de prevención y control de las EI importadas más importantes.

La población susceptible de EI en España se explica mejor conociendo los datos

siguientes:

España es el 2ºpaís receptor del mundo con >50 millones de llegadas de turistas

anuales.

Entre 12 y 13 millones de españoles viajan al extranjero cada año, de los que un

millón lo hacen hacia zonas tropicales. Turismo, trabajadores temporales, ONGs,

FFAA

En 2011 la población española tenía 5,7 millones extranjeros (2,4 mill ciudadanos

UE) 12,2%:

América del Sur (1.418.751)

África (1.078.899)

Asia (341.886)

Europa no comunitarios (234.760)

América Central y Caribe (206.329)

América del Norte (54.547).

En 2009, los ciudadanos extranjeros más numerosos por nacionalidades fueron los

marroquíes (644.688), ecuatorianos (420.110), colombianos (280.705), bolivianos

(239.942) y argentinos (145.315).

Este conocimiento debe permitir planificar el diagnostico en función de la

nacionalidad y la patología infecciosa más prevalente.

Las Enfermedades importadas pueden llegar a nuestro entorno por la vía de los

animales. En un artículo de 2005 publicado en Medicina Clínica decía textualmente,

“Cuando los primeros humanos se pusieron de pie, los microorganismos llevaban años

infectándolos y dicho proceso continúa hoy día. El crecimiento demográfico, con más

de 6.300 millones de habitantes en el mundo, el esfuerzo requerido para alimentarlos y

la gran movilidad en un mundo global hacen que las interrelaciones animales-hombre

persistan con distintos niveles de intensidad, alterando esa sutil relación establecida

durante millones de años. Quizá hoy estemos más desarrollados técnicamente,

pero tal vez seamos más vulnerables como especie” .

Los microorganismos también pueden importarse a través de alimentos ilegalmente

introducidos en un país.

Entre las EI importadas, hay que tener en cuenta los cambios del clima, los

movimientos de la población, los transportes y todos lo aspectos relacionados con la

GLOBALIZACION, adaptándose a cada situación nueva.

Entre los eventos que hacen posible las enfermedades infecciosas importadas están

los siguientes:

Turismo

Inmigración

Cooperación internacional

Motivos religiosos

Conflictos armados

Refugiados

Importaciones de animales

Alimentos exóticos

Por otro lado, hay que considerar que los

� Los microorganismos no reconocen fronteras y la importancia de la

� Agricultura/ganadería/veterinaria � Animales como vectores de enfermedades.

Entre las EI hay que tener en cuenta también las asociadas a bioterrorismo:

Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Clostridium botulinum,

Virus de la viruela y Virus Fiebres de hemorrágicas

REDIVI

El conocimiento y control de las EI, es de interés global. La Red de Unidades

Hospitalarias de atención a inmigrantes y viajeros (REDIVI) surgió de la hipótesis de

que la información aportada por una red que esté formada por centros de atención

primaria y hospitalarios y cuya distribución abarque todo el territorio nacional y ofrezca

información sobre las enfermedades importadas por inmigrantes y viajeros más global

y representativa de la realidad que las series de casos recopiladas por centros

concretos o realizadas en localizaciones geográficas españolas particulares,

aumentando, por tanto, su validez externa. La Red de Unidades Hospitalarias de

atención a inmigrantes y viajeros (REDIVI).

De esta manera, surgió la red siguiendo un patrón similar a la red Geosentinel de la

Sociedad Internacional de Medicina del Viajero. Es una red de datos colaborativos con

historias clínicas/bases asistenciales, registro anónimo, base de datos accesible vía

internet, codificación común y uso asistencial para los centros adscritos.

De esta Red se pueden extraer muchos datos de interés que se muestran a

continuación en formato de tablas:

Regiones de los destinos en los viajeros registrado s en +Redivi (N=1259)

Motivos de consulta en los inmigrantes registrados en Redivi (2012)

Diagnósticos finales más frecuentes en los inmigran tes registrados en Redivi

Calculado sobre 2237 inmigrantes de los que se tiene un diagnóstico final confirmado Motivos de consulta en VFRs

Diagnósticos finales más frecuentes en VFRs

Calculado sobre 574 VFR-inmigrantes y 103 VFR-viajeros en los que se tiene un diagnóstico final confirmado Como se puede comprobar la mayoría de EI son producidas por parásitos para los que existen métodos diagnósticos variados. Diagnósticos en 2993 viajeros atendidos en consulta s. UMT del H. Ramón y Cajal (1989-2006)

Los diagnósticos más comunes de EI importadas, en el 2008, según G. Rojo Marcos,

J. Cuadros González, y A. Arranz Caso, del Hospital Príncipe de Asturias de Alcalá de

Henares, fueron los siguientes

:

• Paludismo • Chagas • Esquistosomiasis • Neurocisticercosis • Geohelmintiasis intestinales • Oncocercosis, loasis • Amebiasis

• Micosis geográficas

• Histoplasmosis • Paracocidiosis brasil

• Bacterias:

– Tuberculosis MR – Tularemia – E. Coli EH O104:H14 – F. Tifoidea – Borreliosis – Bartonelosis

– Ricketsiosis – Leptospirosis

Algunas EI generales importadas víricas y adaptació n biológica

Virus:

Dengue (Croacia, Francia)

Chikunguya (A. albopictus en Europa)

West Nile (córvidos)

Fiebre del Valle del Rift

Hantavirus (pumala, dobrava)

Ebola y F. hemorragicas

Encefalitis

MERS

Paraparesia espástica tropical

Gripe animal (salto de barrera genética)

Un caso interesante de adaptación biológica es el del virus West Nile en USA que al

encontrarse con vectores antropofílicos mutó del genotipo original NY99 al WN

cambiando tres nucleotidos que provocaron mayor eficiencia de transmisión (Hayes

EB et al. Emerg Infect Dis 2005)

En los laboratorios de Microbiología, para trabajar con algunos de los patógenos

causantes de EI, se requieren Zonas de Seguridad clase 3, que pueden usarse como

2+ y convertibles en 3 en caso necesario, ya que es conveniente crear hábitos de

trabajo en Clase 3, adecuando los equipos de protección individual (EPI), y las cabinas

de seguridad biológica (CSB).

La actividad de un laboratorio de Microbiología origina riesgos de distinto tipo,

especialmente biológicos, que pueden afectar a la salud de sus trabajadores, de los

visitantes y a la comunidad. Los exámenes de salud (vigilancia y prevención), la

concienciación individual de autoprotección, la identificación de los peligros y la

evaluación del riesgo, la adopción de medidas de contención apropiadas y el empleo

de técnicas microbiológicas escrupulosas permiten hacer del laboratorio un lugar

seguro, como así demuestran las estadísticas de accidentes o de infecciones

contraídas en el laboratorio. Formación e información son las herramientas clave para

elaborar un plan de seguridad completo.

Existe en el mundo una Red de Laboratorios para la detección rápida y temprana de

epidemias debido a patógenos peligrosos emergentes: WHO Emerging and

Dangerous Pathogens Laboratory Network (EDPLN). Los participantes son la OMS, la

Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la

Oficina Internacional de Epizootias (OIE). Se siguen patógenos e infecciones como el

Ebola, la fiebre del valle del Rift, peste, viruela del simio, fiebre de Lassa fever, SARS,

tularaemia, MERS-CoV, virus Nipah, legionellosis, borreliosis, melioidosis, y otros.

http://www.who.int/csr/bioriskreduction/laboratorynetwork/en/

Características microbiológicas generales del diagn óstico de EI importadas

• Un 90% de los microorganismos implicados en EI importadas, no son

cultivables o son difíciles de hacerlo (fastidious microorganisms)

• La casuística es escasa en el contexto general del laboratorio

• Hay necesidad de mantenimiento de estándares de calidad mediante

muestras simuladas o controles de calidad

• Algunos síndromes tienen rendimiento diagnóstico bajo

• Encefalitis <50%

• S. respiratorios<65%

• S. gastroenteriticos <70%

Pruebas complementarias Iniciales en EI Obtención de muestras para valoración general a otras destinadas a un diagnóstico etiológico de la focalidad:

Orden de pruebas Microbiológicas en EI importadas

• Detecciones rápidas de Ag (VPP) (paludismo, criptosporidium etc)

• Detección de Acs pruebas rápidas (Chagas, VIH, etc)

• Microscopía, Examen fresco, tinciones especiales

• Detección Molecular (multiplex en gastroenteritis, respiratorios)

• Detección de Acs convencionale (EIA, IF, HA, WB)

• Espectrometría de masas (valor limitado solo cultivables)

• NGS, Ultrasecuenciación, Secuenciación masiva

Principales enfermedades vectoriales con potencial introducción en España

* Referida a leishmaniasis cutánea del medio oriente (L. tropica y L. major) y a las formas cutáneas y viscerales americanas (L. braziliensis) La automatización, en las TBAN, es importante para la detección de patógenos de

las EI. Existen varios aparatos y sistemas para los distintos procesos. Los más

utilizados son:

Sistemas de extracción de RNA/DNA

Nuclisense EasyMag (Biomerieux®) MagnaPure (Roche®) Versant (Siemens®)

QIACube (QiaGen®) BioSprint 96 (QiaGen®) GenoXtract (Hain®) Magpurix (Inydia®)

Sistemas de amplificación/detección (PCR)

Sistemas end-

MasterCycler ProS (Eppendorf®) MyCycler (BioRad®)

PCR 2400 (PerkinElmer®) Veriti Dx 96(Applied BioSystems®) 9700 (Roche®)

Sistemas en tiempo real

Versant kPCR ABI 7500 Fast LightCycler480

LightCycler2.0 CFX 96 Stratagene SmartCycler

Optimización de plataformas de PCR para enfermedade s importadas

Ultra-secuenciación NGS, Secuenciación Plataformas:

• ION TORRENT (70-100.000)

• Illumina (80-90.000 euros)

• Junior (en extinción)

Cuellos de botellas

• Extracción/procesamiento

• Herramientas/Programas de

análisis de datos

• Bases datos/librerías pequeñas

(Caliendo AM. Clin Infect Dis 2013)

Sistemas de

extracción

Número de

muestras

Grande Mediano Pequeño

Versant

QIACube

BioSprint

EasyMag MagnaPur

e

MagPurix

GenoXtract

Sistemas de PCR Versant kPCR

ABI 7500 Fast

LightCycler

ABI 7500 Fast

SmartCycler

Stratagene

CFX96

LightCycler

Los más versátiles Extractores de material genético Equipos de PCR

Por tanto se pueden seguir unas premisas para la optimización del diagnóstico

microbiológico de EI que se resumen en la tabla siguiente

• Identificación clínico/sindrómica

– Volante o petición específica – Personas en las que descartar un diagnóstico de EI importada

• Repercusión epidémica – Caso – Brote

• Evaluación/Consideración del Riesgo biológico/Equipamiento • Niveles de capacidad diagnóstica (organización en redes)

• Diagnósticos preferentes por incidencia de microrganismo y área geográfica • Remisión segura y documentada a otro centro

Con los datos expuestos cada laboratorio en función de su localización geográfica y

la población mayoritaria susceptible de EI deberá priorizar sus recursos diagnósticos

organizándoles en función de su complejidad. Deberá establecer con otros laboratorios

nacionales un drenaje de los casos de diagnóstico para los que no se disponga

recursos o herramientas eficaces.