revista científica issn 1665-8493

revista científica ISSN 1665-8493

Universidad de

Guadalajara

Centro Universitario de

Ciencias Biológicas y

Agropecuarias

COORDINACIÓN DE

INVESTIGACIÓN

Evaluación del extracto de piel de Rana catesbeiana como tratamiento alternativo en bovinos con mastitis clínicaEduardo González Covarrubias, Waldina Patricia Reyes Velázquez, Alfonso Enrique Islas Rodríguez y Esther Albarrán Rodríguez 1Digestibilidad aparente “in vitro” en pepsina de la proteína de parota (Enterolobium cyclocarpum) y capomo (Brosimum alicastrum)Alicia de Luna Vega, Agustín Rueda Sánchez, Rafael Escalante Martínez y Javier Vázquez Navarro 7Efecto de la exposición prenatal a testosterona sobre peso del baso y concentración de esplenocitos en ratas hembras y machosOswaldo Palacios, Galina Zaitseva y Jorge Juárez 13Efectos de la adición de vermicomposta en un suelo contaminado con pesticidas y su comportamiento en el proceso de nitrificación y mineralización de carbonoDioselina Álvarez Bernal, Rebeca Flores Magallón y Marcos Alfonso Lastiri Hernández 21LATEVOLT: programa para medir fácilmente amplitudes y latencias en potenciales cerebrales relacionados con eventosMiguel Ángel Guevara Pérez, Araceli Sanz Martin, Marisela Hernández González y Claudia del Carmen Amezcua Gutiérrez 27Pruebas de germinación de dos leguminosas herbáceas con potencial para restaurar bancos de minería a cielo abiertoRosa de Lourdes Romo Campos, Alejandro Muñoz Urias, Sergio Honorio Contreras Rodríguez y José Sánchez Martínez 35Propiedades antinómicas de las poliaminas en los dominios Archaea y Eubacteria y su microambienteRamón Reynoso Orozco, Gerogina Ivette López Cortés y Alfonso Enrique Islas Rodríguez 41Niveles de fertilización orgánica mediante humus de lombriz en el cultivo de la jamaica Hibiscus sabdariffa L Aurelio Pérez-González, Benito Monroy-Reyes, Enrique Pimienta-Barrios, Pedro Posos-Ponce, Vicente Antonio Aceves-Núñez, Jorge Raúl Toral-Flores y Javier Carreón-Amaya 47Epibiontes de hembras anidadoras de tortuga golfina Lepidochelys olivacea en el Playón de Mismaloya, JaliscoIldefonso Enciso-Padilla, Julia Cisneros-Calderón, Freddy C. Gastélum-Gastélum y Francisco J. Jacobo-Pérez 55

Contenido

FECHA EFECTIVA DE PUBLICACIÓN 15 DE DICIEMBRE DE 2012

continúa en la contraportada

VOLUMEN

14NÚMERO 1

–2ENERO-DICIEMBRE DE 2012

scientia-CUCBA es el órgano oficial de difusión científica del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (CUCBA) de la Universidad de Guadalajara. Es una publicación interdisciplinaria de ciencias biológicas, agropecuarias y ambientales.

Editor en Jefe: Dr. Alfredo Ignacio Feria y Velasco.Directora Administrativa: M. en C. Yolanda Feria Cuevas.

Araceli Espinosa Jeffrey

UCLA, Los Ángeles CA, Estados Unidos de América.

Miguel Pérez de la Mora

UNAM, México Distrito Federal.

Eulogio Pimienta Barrios

CUCBA, Universidad de Guadalajara.

Universidad Autónoma del Estado de Morelos

COMITÉ EDITORIAL

Jacinto Bañuelos Pineda

Carlos Beas Zárate

Oscar Carbajal Mariscal

Servando Carvajal Hernández

Jorge Galindo García

Javier García Velasco

Delia González Aguilar

Salvador González Luna

Graciela Gudiño Cabrera

Sergio Guerrero Vázquez

Juan José Hicks Gómez

Salvador Hurtado de la Peña

Alfonso Islas Rodríguez

Eduardo Juárez Carrillo

Faustino Moreno Ceja

Juan Manuel Moreno Martínez

Gustavo Moya Raygoza

Daniel Ortuño Sahagún

Agustín Ramírez Álvarez

Florencio Recendiz Hurtado

Eduardo Ríos Jara

Juan Jesús Roa Vidal

Ramón Rodríguez Macías

Ana María Rosales Torres

Elías Sandoval Islas

Anne Santerre Lucas

Juan de Jesús Taylor Preciado

Mónica Ureña Guerrero

Raúl Fernando Vallarta Mendoza

Javier Vázquez Navarro

Daniel Villagómez Zavala

CONSEJO EDITORIAL

Luis Cañedo Dorantes

scientia-CUCBA 14(1—2):1—6.2012

Evaluación del extracto de piel de Rana catesbeiana como tratamiento alternativo en bovinos con mastitis clínica

Eduardo González Covarrubias1, Waldina Patricia Reyes Velázquez2, Alfonso Enrique Islas Rodríguez3 y Esther Albarrán Rodríguez2

1Departamento de Producción Animal, 2Departamento de Salud Pública, 3Departamento Biología Celular y Molecular, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara.Correo electrónico: [email protected]

Resumen

El presente estudio permitió evaluar el efecto antimicro-biano del extracto de piel de Rana catesbeiana (EPRC), analizar el efecto histopatológico en la glándula mamaria expuesta a Escherichia coli con/sin tratar con EPRC y efectuar una prueba in vivo del tratamiento en vacas con mastitis clínica. Los resultados de la prueba antimicro-biana in vitro mostraron ser contrastantes ya que la con-centración menor (1.56%) y la mayor (100%) del EPRC fueron similares estadísticamente. Se observó reducción de UFC en todas las concentraciones de EPRC. El estudio histopatológico en los cuartos de la ubre inoculados con E. coli mostraron alteraciones caracterizadas por fibrosis, infiltración linfocitaria y ligera necrosis, sin que el trata-miento con EPRC mostrara efecto regenerador en tejido glandular. La prueba in vivo permitió observar reducción de mastitis clínica, destacando la presencia de bacterias ambientales (86.67%) y solo se reportó el 13.33% de S. aureus. Se concluye que el EPRC presentó eficiencia limi-tada como tratamiento antimicrobiano en la mastitis, por lo que debe caracterizarse los péptidos de defensa para su posterior evaluación terapéutica.

Palabras clave: Mastitis, Rana catesbeiana, péptidos de defensa.

Abstract

The objectives of the present study were to evaluate the antimicrobial effect of EPRC, to analyze the histopatho-logical effect on mammary glands exposed to Escherichia coli with or without treatment with EPCR, and to carry out tests in vivo of treatment in cows with clinical mastitis. The results of the in vitro antimicrobial test were shown to be contrasting, in that the lowest concentration (1.56%) and the highest (100%) were statistically similar. A reduc-tion of CFUs (colony forming units) was also observed in all of the concentrations of EPRC. The histopathological study in the quarters of the udders inoculated with E. coli showed the characteristic alterations characterized by fi-brosis, lymphatic filtration, and light necrosis. That with-out the treatment with EPRC showed the effect of regen-eration of glandular tissue. The in vivo test conducted in cows with clinical mastitis permitted the observation of a reduction in the clinical quarter. Of the bacteria isolated 86.67% were ambient and only 13.33% were S. aureus. In conclusion it can be established that EPRC presented lim-ited efficacy as an antimicrobial treatment in mastitis and the isolation and characterization of the defensive peptides will be necessary to know the therapeutic effect.

Keywords: Mastitis, Rana catesbeiana, defensive pep-tides.

Introducción

En la producción de leche uno de los problemas de salud de mayor impacto económico es la masti-

tis, trastorno que comúnmente es de tipo infeccioso (Saran y Chaffer 2000). Dentro de las medidas te-rapéuticas, los antibióticos siguen siendo la herra-mienta de primera elección con el riesgo de ocasionar resistencia bacteriana, además de la eliminación de residuos de antimicrobianos en los productos de ori-gen animal (Allison 1985), lo que implica riesgos a la salud humana (Frazier y Westhoff 1978). En el uso de alternativas terapéuticas para el control de la masti-

tis se han valorado productos homeopáticos, aceites esenciales, ácidos nucleicos y péptidos de la defensa del hospedero (PDH), estos últimos han cobrado gran interés científico, principalmente por sus propieda-des que permiten la eliminación de microorganismos patógenos, reparación del tejido y respuesta inmune (Jenssen et al. 2006). Los PDH son compuestos de la Respuesta Inmune Innata (RII), producidos por todos los organismos vivos como plantas y animales, demostrando beneficios en la industria farmacéutica, la agricultura, acuacultura y producción de alimentos

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http://organicaeditores.mx/refservice.jsp?pubId=Scientia_14_01


EDUARDO GONZÁLEZ COVARRUBIAS ET ÁL.2

en general, lo que representa un futuro prometedor en la lucha contra microorganismos patógenos (Bo-man 1996; Shai 1998).

Existen numerosas investigaciones sobre la efi-ciencia de los PDH extraídos a partir de diversos organismos incluyendo humanos, plantas, inverte-brados marinos y anfibios (Broekaert et al. 1995; Bu-llet et al. 1999). Estos últimos se eligieron para este estudio ya que son seres vivos evolutivamente muy antiguos que desarrollaron mecanismos de defensa efectivos a base de PDH codificados genéticamente que limitan las infecciones que los abundantes mi-crobios presentes en sus lodosos nichos ecológicos les pudieran causar (Mangoni 2009) sin embargo, los es-tudios en México son escasos, por lo que actualmente en el Laboratorio de Péptidos Naturales del Departa-mento de Biología Celular y Molecular del CUCBA, se han caracterizado los PDH extraídos de la piel de la rana americana, endémica de nuestra zona geográfi-ca, Rana catesbeiana con la finalidad de analizar su efectividad como alternativa antimicrobiana. El pre-sente estudio plantea como objetivos particulares: a) Determinar la acción antimicrobiana del extracto de piel de Rana catesbeiana (EPRC) contra Escherichia coli (prueba in vitro), b) Valorar el efecto histopato-lógico en la glándula mamaria del EPRC, y c) Evaluar la aplicación terapéutica en vacas con mastitis clínica (prueba in vivo) (Ryu et. al. 2011)

Materiales y métodos

Obtención del extracto de la piel de la Rana catesbeiana

Se obtuvo un extracto a partir de dos pieles de rana que pesaron aproximadamente 40 g, que se obtuvie-ron del ranario de Pacaná en Tala, Jalisco, México. Posteriormente se fracciona en fragmentos de 1 cm2, se introducen en un mortero al que se agregarón 100 ml de nitrogeno líquido, hasta endurecer la piel de rana, se introdujo a una licuadora de aspas de acero y triturada la piel se obtuvo un polvo fino. Después se introdujeron diez volumenes de solución ácida (ace-tonitrilo 60%, ácido trifluroacetico 1% y 39% agua bi-destilada) a la licuadora para mezclarla con el polvo de piel de rana. Se colocó posteriormente en un ma-traz, donde se mantuvo toda la noche (12 horas) a 4 grados centígrados en un agitador magnético. Poste-riormente se centrifugó a 13,000 rpm a 4 ºC duran-te 30 minutos, y el sobrenadante se mandó liofilizar (Liofilizadora Stokes). El liofilizado se resuspendió en solución salina de fosfatos (PSB) a pH 7.2 estéril (Zassloff).

Determinación de proteínas (por el método de Bradford)

El rango de sensibilidad: 0.25 mg/ml – 200 mg/ml. Se preparó una curva estándar por medio de una so-lución de proteínas de referencia a base de albúmina a una concentración de 1 mg/ml. Se pipetearon canti-dades crecientes de la solución de proteínas en tubos, por duplicado, desde cero microlitros, 2.5, 5, 10, 12.5, 15, 17.5 y 20 microlitros, completando el volumen a 1 ml con solución amortiguadora de fosfatos pH 7.2 y se mezcló en vortex. Se leyó posteriormente a 595 nm después de 2 minutos, pero antes de 1 hora. Ya cons-truida la curva de referencia se introduce la solución de concentración desconocida de la misma manera y se compara con la referencia para saber la concentra-ción (Bollang).

Bioensayo microbiológico

Con el objeto de probar si el aislado descrito como extracto es activo in vitro frente a bacterias Gram po-sitivas, y Gram negativas, se desarrollo el método de detección de Ong y Dalgaard, basado en el ensayo de unidades formadoras de colonia (UFC). Utilizando como control a la Esculentina 1-21 péptido aislando de la piel de la rana europea.

En medio de cultivo de agar soya triptica (DIFCO 211825) liquido, se incuba a la bacteria de interés 12 h, en una estufa a 37 °C.

En la primera Dilución: se toman 0.5 ml, de bac-terias cultivadas y 4.5 ml de agar puro estéril de soya trípticasa y se mezcla en un tubo de ensayo, de ahí se toma 1 ml en un tubo ependorf de la mezcla y otro tubo de puro agar soya tripticasa.

Se mide en el espectrofotometro a 620 nM, se toma lectura de las muestras, se calcúla tener 50 UFC, previa construcción de curva de crecimiento logarít-mica de cada cepa a probar.

Haciendo los cálculos necesarios para 50 UFC de cada bacteria a probar. De la primera dilución hace-mos otra dilución 1:10, ponemos 900 µl de caldo de soya tripticasa y 100 µl de la primera dilución.

Se vuelve hacer otra dilución con los cálculos obte-nidos anteriormente en 10,000 µl de PBS pH 7.2, con el volumen de bacteria calculado 10µl, se mezcla y se toma una placa de 96 pozos para incubar a la bacteria diluida y nuestro péptido antimicrobiana o fármaco de interés.

Para garantizar efectividad es necesario hacer una réplica de cada pozo que se vaya a utilizar para nues-tro bioensayo.

Se prepara la placa primero ponemos la proteína de interés (péptido antimicrobiano) al 100%-100 µl de proteína antimicrobiana y los siguientes pozos se hace una dilución, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, se pone 100 µl


EVALUACIÓN DEL EXTRACTO DE PIEL DE RANA CATESBEIANA COMO TRATAMIENTO ALTERNATIVO EN BOVINOS CON MASTITIS... 3

de proteína antimicrobiana y 100 µl de PBS pH 7.2 se mezcla y se extraen 100 µl y al siguiente pozo se hace lo mismo hasta la dilución 1:16 y se desechan los últimos 100 µl restantes. Se prepara un control, se in-troducen 100 µl de bacteria de la ultima dilución en base a nuestros cálculos a un pozo.

Ya preparada la placa con el péptido antimicro-biano de interes y sus diluciones aclaradas anterior-mente, se introducen 10 µl de bacterias previamente diluidas en base a nuestros cálculos y se introducen a todos los pozos preparados previamente. Se dejan dos horas y media en la estufa a 37 °C.

Se toman 10 µl de cada pozo, y en cajas de petri con agar Mueller Hinton se dividen a las necesidades del investigador y se introduce la gota de la mezcla (10 µl) a las cajas de petri, terminando de platear se introduce nuevamente y se deja 4 horas en la estufa a 37 °C.

Terminado el tiempo requerido se observa si la proteína tiene propiedades antimicrobianas, a qué grado, se mide su sensibilidad y en caso contrario se cuentan las colonias de las bacterias crecidas y se hace una grafica en Microsoft Excel, con los datos adquiri-dos del bioensayo, para darnos cuenta de la eficiencia de nuestra proteína de interés.

Desafío in situ de Escherichia coli al extracto de la piel de rana (PDH) en glándula mamaria

Se seleccionó una vaca Holstein de 6 años de edad, sin que mostrara alteraciones patológicas en glándula mamaria, lo cual fue confirmado por medio de palpa-ción en las cuatro glándulas de la ubre, así como ob-servación de la leche, además de realizar la prueba de mastitis California (PMC). Dos cuartos, los traseros de la glándula mamaria fueron expuestos a un inócu-lo bacteriano (vía intramamaria) de Escherichia coli (400 UFC), dejando un cuarto como control (delan-tero izquierdo) y otro cuarto para aplicar el extracto de la piel de rana, considerado testigo del tratamiento (cuarto delantero derecho).

Doce horas pos-inoculación de la bacteria se ins-peccionaron los cuartos y sé apreció el cuadro de mastitis clínica, confirmándose mediante la prueba de palpación de los dos cuartos afectados mostrando inflamación y presencia de grumos en lugar de leche, además de la prueba de PMC, prueba para la detec-ción de mastitis subclínica y herramienta para identi-ficar los inicios de mastitis clínica. Posteriormente se hicieron las aplicaciones del EPRC a la concentración de 0.8 mg en PBS (10 ml) en uno de los cuartos ino-culados con E. coli (cuarto trasero derecho), repitien-do las aplicaciones cada 12 horas por 5 días. Se dejó el segundo cuarto afectado sin tratar (cuarto trasero

izquierdo). De la misma manera en que se aplicó el EPRC en el cuarto con mastitis clínica se procedió con el cuarto testigo (cuarto delantero derecho). Al término de la prueba se sacrificó la vaca y se diseccio-nó toda la ubre (las cuatro glándulas mamarias) para trasladarla en formol al 10% para el estudio histopa-tológico.

Los cortes y la evaluación histológica se realizaron en el Laboratorio de Morfofisiología del Departamen-to de Medicina Veterinaria del CUCBA.

Prueba in vivo del EPRC en vacas con mastitis clínica

Se seleccionaron vacas de la raza Holstein de segun-do parto y de mediana producción de leche (16-24 l) procedentes de los establos “Dos pivotes” de Ciudad Guzmán (establo 1) y “Los Eucaliptos” de Acatlán de Juárez (establo 2), municipios del estado de Jalisco. Las vacas fueron evaluadas mediante la prueba de palpación de ubre y observación de grumos, así como también la prueba de PMC para ser categorizadas de acuerdo al grado de mastitis que presentaron. Las va-cas clasificadas dentro del grado de mastitis clínica leve, moderada y severa fueron separadas para apli-car vía intramamaria el EPRC a diferentes concen-traciones (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 mg/10 ml) durante cin-co días consecutivos con la finalidad de seleccionar la dosis efectiva. Por cada concentración se tuvieron tres repeticiones. Previo a la aplicación se procedió a realizar un cultivo bacteriológico del o de los cuar-tos dañados, así como posterior al tratamiento. Para la aplicación de la dosis efectiva se seleccionaron 15 vacas con mastitis clínica (2: leve, 10: moderada y 3: severa). Una vez identificados los cuartos de la ubre afectados se procedió a obtener muestra de leche para realizar el análisis bacteriológico de género y especie bajo la técnica BBL cristal (El sistema BBL Crystal para la identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas. Es un método de identificación en miniatura que utiliza substratos convencionales, fluo-rogénicos y cromogénicos modificados. Se ha diseña-do para la identificación de bacterias aerobias Gram positivas y Gram negativas aisladas frecuentemente de muestras clínicas). Se aplicó vía intramamaria el EPRC en la dosis efectiva previamente seleccionada (0.8 mg/10 ml). Para este propósito se utilizó como vehículo 10 ml de solución PBS a pH 7.2 y se realiza-ron 10 aplicaciones cada 12 horas (5 días consecuti-vos). Para determinar la efectividad del tratamiento a las 24 h posteriores a la última aplicación se realizó nuevamente la prueba de palpación de ubre y obser-vación de leche, así como la prueba de PMC y el análi-sis bacteriológico de la leche.



Resultados y discusión

Para analizar los resultados de la prueba antimicro-biana fue necesario aplicar la prueba de t Student para comparar de manera independiente cada tratamiento con el grupo control y entre los diferentes tratamien-tos 1.56%, 3.12%, 6.25%, 12.50%, 25%, 50%, 100%), ya que se observó un comportamiento irregular. Los resultados observados durante la prueba antimicro-biana mostraron una reducción de unidades forma-doras de colonias (UFC) en todos los tratamientos respecto al control, lo cual indicó un efecto inhibito-rio de los diferentes tratamientos sobre el crecimiento de la bacteria E. coli, sin embargo el comportamiento de los tratamientos mostró inconsistencia difícil de explicar, ya que la cuenta de UFC fue similar esta-dísticamente entre la menor y mayor concentración del extracto de la piel de rana, mientras que entre los tratamientos que presentaron las concentraciones de 3.12% y 6.25% fueron similares a los tratamientos con mayor nivel del extracto 25% y 50%. Por lo tanto se recomienda realizar la purificación y caracterización del extracto de la piel de rana y que dichas fracciones sean evaluadas de manera independiente, ya que la presencia de otros compuestos como el colágeno pu-dieron influir en la respuesta antimicrobiana.

Durante la prueba del desafío de la glándula ma-maria con E. coli, se observaron diversos grados de lesiones en las zonas evaluadas, para los tejidos pro-

cedentes del cuarto delantero izquierdo, los princi-pales daños fueron necrosis e infiltración discreta y fibrosis incipiente (Figura 2). Al analizar el tejido del cuarto trasero derecho, se encontraron necrosis y fi-brosis discreto (Figura 3), la laminilla que se obtuvo del cuarto trasero izquierdo (inoculado con E.coli sin tratar) mostró alteraciones importantes. Los alvéolos se encontraron contraídos, rodeados de tejido fibróti-co y con necrosis moderada e infiltración linfocitaria severa (Figura 4).

Las alteraciones observadas en los cuartos trase-ros (inoculados con E. coli), permiten suponer que el tratamiento aplicado no pudo revertir los cambios ocasionados por la bacteria E. coli, si bien la prueba de PMC permitió observar la reducción de los niveles de mastitis en el cuarto tratado con el extracto de piel de Rana catesbeiana, todos los cuartos mostraron necrosis en grado leve, lo cual puede ser atribuido a la edad del animal (6 años) y por el número de lactancia.

Se ha reportado que durante el periodo producti-vo de vacas lecheras pueden presentarse variaciones en la lactación que modifican la citoarquitectura de los tejidos de la glándula mamaria (Holmes y Wil-son 1989). Dichas variaciones pueden ser atribuidas al ciclo de producción de leche, ya que la vaca puede llevar a cabo de 6 a 7 años ciclos considerados redi-tuables. El período de reposo (secado) de la ubre debe ser realizado apropiadamente para reducir los efec-tos que pudieran afectar el siguiente ciclo productivo

Figura 1. Prueba antimicrobiana in vitro de extracto de piel de Rana catesbeiana.

Figura 2. Fotomi-crografia de tejido glandular del cuarto delantero izquierdo. Se identifican alvéolos amorfos y distendidos (a), necrosis (n) y presencia de cuerpos amilaceos (ca). Objetivo 10X. Tinción HE.

Figura 3. Tejido de cuarto trasero de-recho. Alvéolos (a) menos distendidos, fibrosis moderada (f) e infiltración lin-focitaria y necrosis (n). Objetivo 10X. Tinción HE.

Figura 4. Fotomi-crografía de una zona del cuarto trasero izquierdo, se identifican fibrosis severa (f), alvéolos comprimidos (a) y presencia de corpora amilacea (ca). Objetivo 10X. Tinción HE.


EVALUACIÓN DEL EXTRACTO DE PIEL DE RANA CATESBEIANA COMO TRATAMIENTO ALTERNATIVO EN BOVINOS CON MASTITIS... 5

(Robinson 1987). Por otra parte, existen patologías que transcurren durante la vida productiva de la vaca, como la mastitis, padecimiento que se presenta con alta incidencia en los establos lecheros (Nelson y Nic-kerson 2000). La inflamación aguda en los conductos galactóferos y en los alvéolos de la glándula mamaria por efecto de la infección bacteriana puede ocasionar el desarrollo de fibrosis, tejido que puede progresar según las presentaciones consecutivas de las mastitis clínica o subclínica a lo largo de su vida productiva dejando tejido cicatrizal, o bien por el manejo inapro-piado durante la ordeña (Blowey y Edmondson 1995). Se debe destacar las lesiones en la ubre ocasionadas en el manejo, entre estas, fricciones en los corrales así como por fallas del equipo de ordeño (Nelson y Nic-kerson 1992).

El cuadro 1 permite observar la evaluación de la dosis efectiva realizada en vacas seleccionadas con mastitis clínica (leve, moderada y severa), encon-trándose eficiencia estadísticamente significativa por efecto del tratamiento con EPRC (p < 0.05). Es im-portante mencionar que el número reducido de ob-servaciones por tipo de mastitis pudiera influir en las interpretaciones, por lo tanto en futuras investigacio-nes se recomienda tener un mayor número de vacas con los diferentes tipos de mastitis y ser clasificadas previamente por el tipo de microorganismo aislado. Como puede apreciarse los resultados de la prueba in vivo permiten detectar eficiencia en el tratamiento de vacas con mastitis clínica reduciendo en la mayoría de los casos al nivel subclínico. Destaca el crecimien-

to de bacterias ambientales en el 86.67% de las vacas previo al tratamiento con el EPRC, encontrándose S. aureus en 13.33%, y si bien se aislaron bacterias des-pués del tratamiento el 60% correspondió a bacterias oportunistas con efectos limitados sobre la glándula mamaria. Es importante resaltar que hasta la fecha los tratamientos de la mastitis clínica pueden en mu-chos casos ser engañosos, ya que la mayoría parecen responder al tratamiento, pero la realidad es que solo desaparecen los síntomas clínicos y el caso regresa al nivel subclínico a partir del cual volverá a irrumpir en un momento futuro si las condiciones lo favorecen.

Si bien, reducir el problema de mastitis es una meta difícil de alcanzar, es necesario establecer es-trategias de prevención en todos los establos lecheros que reduzcan las infecciones del periodo de secas, que permitan que el tejido dañado se regenere, reducir la mastitis clínica al inicio de lactancia y evitar el uso indiscriminado de antimicrobianos que contaminan la leche destinada al consumo humano. Aplicar las estrategias de manejo en los establos, mejorar las ins-talaciones de las salas de ordeño y utilizar tratamien-tos alternativos, permitirá reducir en gran medida las pérdidas económicas ocasionadas por las mastitis en las explotaciones pecuarias, además de incrementar la calidad de la leche.

Conclusiones

El EPRC permitió reducir el número de UFC de Es-cherichia coli respecto al grupo control, sin embargo,

Cuadro 1. Grado de mastitis y principales bacterias aisladas antes y después del tratamiento con extracto de piel de Rana catesbeiana.

No. de vaca Establo Código (mastitis) Bacteria aislada Código (mastitis) Bacteria aislada

589 2 6 Streptococcus uberis 3 Sin crecimiento

563 2 6 Streptococcus uberis 5 Brevibacillus brevis

611 2 6 Serratia marcescens 3 Sin crecimiento

561 2 6 Escherichia coli 2 Sin crecimiento

572 2 6 Staphylococcus aureus 2 Gemella morbillorum

175 2 6 Staphylococcus aureus 4 Sin crecimiento

1274 1 7 Citrobacter koseri 1 Staphylococcus saprophyticus

1358 1 5 Streptococcus anginosus 5 Lactococcus lactis

41 1 7 Brevibacillus brevis 2 Kytococcus sedentarius

1370 1 7 Lactococcus lactis 4 Streptococcus milleri group

962 1 5 Streptococcus milleri group 3 Lactococcus lactis

789 1 6 Staphylococcus haemoliticus 3 Sin crecimiento

1296 1 6 Escherichia coli 3 Gemella morbillorum

985 1 6 Enterococcus faecium 5 Kocuria kristinae

1049 1 6 Escherichia coli 5 Sin Crecimiento

Códigos de mastitis: 1= Ausencia de mastitis; 2= Mastitis subclínica tipo 1; 3= Mastitis subclínica tipo 2; 4= Mastitis subclínica tipo 3; 5= Masti-tis clínica leve; 6= Mastitis clínica moderada; 7= Mastitis clínica severa.



la respuesta antimicrobiana fue inconsistente, de ma-nera similar a los hallazgos histopatológicos. Sin bien se observó reducción significativa en algunos casos de mastitis clínica tipo moderada, se recomienda reali-zar nuevos estudios con la aplicación de los péptidos de defensa caracterizados que se obtengan de la piel de Rana catesbeiana.d

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Digestibilidad aparente “in vitro” en pepsina de la proteína de parota (Enterolobium cyclocarpum) y capomo

(Brosimum alicastrum)

Alicia de Luna Vega1, Agustín Rueda Sánchez2, Rafael Escalante Martínez1 y Javier Vázquez Navarro1

1Universidad de Guadalajara Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, División de Ciencias Agronómicas.2Instituto de Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias.

Resumen

Se determinó la composición química y la digestibilidad in vitro (DIV, pepsina/pancreatina) en muestras represen-tativas de harina de los frutos de parota (Enterolobium cyclocarpum) y capomo (Brosimum alicastrum) como re-cursos proteicos. Los valores encontrados para el conteni-do de proteína, nitrógeno (N) y Digestibilidad in vitro del N (DIVN) de los recursos proteicos, fueron: proteína 23% en parota y 11% en capomo. El N fluctuó entre 3.66% (ha-rina del fruto de parota) y 1.74% (harina del fruto de capo-mo) y la DIVN fue de 73.82% y 69.25%, respectivamente. La harina de los frutos de capomo fue la de menor conte-nido de N y DIV, lo que podría estar influenciado por el mayor contenido de fibra presente en esta fuente alimen-ticia. En cuanto a la digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS), los valores fueron 56.6% y 39.3% (parota y capomo). La digestibilidad de la materia orgánica (DI-VMO) en parota fue de 52.4% y de 39.2% para capomo. Con estos resultados se reafirman las ventajas de la harina de los frutos de parota. Ambos recursos arbóreos parecen prometedores para la alimentación animal, tanto por su contenido de N como por sus valores de DIV.

Palabras clave: recursos arbóreos, digestibilidad in vitro, harina de los frutos de parota y capomo.

Abstract

Chemical composition and in vitro digestibility (DIV pepsin/pancreatin) was determinated on representative samples of earpod-tree (Enterolobium cyclocarpum) and ramon fruit meals (Brosimum alicastrum) as proteic re-sources. Found values for protein content, nitrogen (N) and DIV of N (DIVN) from both samples was as follow (respectively): 22.9 and 10.88 % (earpod-tree and ramon meals); N fluctuate between 3.66 and 1.74 %; DIVN was 73.82 and 69.25 %. Ramon fruit meal has lowest N and DIV values, maybe influenced by its highly fibrous content. About in vitro digestibility of dry matter (DIVMS), values were 56.6 and 39.3 (earpod-tree and ramon). Organic matter digestibility (DIVMO) on earpod-tree was 52.4, and 39.2 on ramon. These results confirm earpod-tree fruits meal advantages. Both arboreal resources seem promising on animal nutrition, by its N content and their DIV values.The lowest digestibility values founded on ramon are caused for its highly relative fiber content, influencing negatively on nutrients digestibility, specially the N one. Nitrogen proportion structurally associated to insoluble fraction of dietetic fiber makes a marked influence on N in vitro digestibility. An increased dietetic insoluble fiber lev-els consume, increases too fecal bolus and consequently, N excretion, related with protein linked to vegetal cellular wall, besides, lower digestibility could be due to antinutri-tional compounds (tanins and saponins) associated with fibrous parts of plant, making a negative effect over pro-tein digestibility and its use by the body.

Keywords: arboreal resources, in vitro digestibility, ear-pod-tree meal, ramon meal.

Introducción

Debido a la necesidad de producir alimentos en sistemas que mantengan estables su producción

y rentabilidad a largo plazo, sin generar inequidad so-cial y preservando todos los recursos naturales bajo el

paradigma de la sostenibilidad, ha cobrado especial importancia el uso de árboles forrajeros como fuente viable de nutrientes para la alimentación animal. Más recientemente, se suma el manejo de sistemas silvo-

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ALICIA DE LUNA VEGA, AGUSTÍN RUEDA SÁNCHEZ, RAFAEL ESCALANTE MARTÍNEZ Y JAVIER VÁZQUEZ NAVARRO8

pastoriles que integran el uso de pasturas, árboles y animales con diferentes objetivos y estrategias de producción (Giraldo 1996).

El gran reto de la ganadería moderna consiste en incrementar la producción de carne y leche en forma acelerada y sostenible, de tal manera que permita sa-tisfacer la demanda de la población y que, además, garantice la conservación de los recursos naturales y del medio ambiente.

En los sistemas silvopastoriles tradicionales exis-ten muchas especies leñosas de uso múltiple, entre ellas la parota (Enterolobium cyclocarpum) y el capo-mo (Brosimum alicastrum), que producen semillas, frutos o vainas ricas en energía digerible, proteínas y minerales, principalmente en la época de sequía, du-rante la cual los pastos son escasos y de bajo valor nu-tritivo, siendo reconocida la importancia que tienen para la alimentación de los rumiantes en las zonas ganaderas del país (Fernández 1990). Estas especies crecen en forma natural en los potreros de la Costa de Jalisco de enero a mayo. Sus frutos poseen altas con-centraciones de proteínas y carbohidratos solubles, además, son muy apetitosos para el ganado y pueden servir como suplemento de las gramíneas.

La digestibilidad de los forrajes arbóreos medi-da tanto en laboratorio (in vitro) como en rumen (in vivo), solo permite conocer parcialmente su valor nu-tritivo para rumiantes, puesto que es de esperar que la digestión enzimática, que ocurre en abomaso e in-testino delgado, debe incrementar la utilización de los nutrimentos contenidos en estos forrajes.


El objetivo del presente trabajo fue el estudio de la composición química y la digestibilidad in vitro (DIV) de parota y capomo para determinar su posible utili-dad en la alimentación de rumiantes. En la comuni-dad Indígena de Chacala, municipio de Cabo Corrien-tes en el estado de Jalisco, México (2006), se tomaron muestras en forma aleatoria y representativa de los materiales en estudio colectados y se secaron, previa determinación de su contenido de humedad en estufa con circulación de aire a una temperatura de 60 °C. Posteriormente se molieron hasta obtener un tamaño de partícula de 0.33 mm. De las muestras así prepa-radas se tomaron alícuotas para la determinación por duplicado de MS, ceniza, N, extracto etéreo y mine-rales según las recomendaciones de la AOAC (1995). La fibra detergente neutra (FND) se midió según Van Soest y Wine (1967). El contenido de materia orgánica (MO) se definió como 100 % menos el porcentaje de ceniza. En los cuadros 1 y 2 se muestra el contenido de nutrientes y minerales de los recursos estudiados.

Cuadro 1. Contenido de nutrientes de la parota y el capomo colec-tada en la comunidad Indígena de Chacala, municipio de Cabo Co-rrientes en el estado de Jalisco (2006), reportados en % base seca.

Determinación Parota % Capomo %

Humedad 3.87 2.03

Cenizas 4.25 5.52

Proteína 22.9 10.88

Grasa 1.29 1.07

Fibra 7.24 13.18

ELN 60.45 67.02

Materia seca 96.13 97.97

Materia orgánica 95.75 94.48

Fuente; Laboratorio de Nutrición Animal, CUCBA, UdeG.

Cuadro 2. Contenido de minerales de la parota y el capomo reporta-dos en %.

Determinación Parota % Capomo %

Calcio 0.27 0.20

Fósforo 0.30 0.20

Potasio 0.86 1.00

Nitrógeno 3.66 1.74

Magnesio 0.78 0.76

Azufre 0.22 0.24

Cobre 5.56 ppm 5.52 ppm

Fuente; Laboratorio de Nutrición Animal, CUCBA, UdeG.

Se colocó un gramo de muestra previamente mo-lida y desgrasada (con éter en aparato Goldfisch du-rante cuatro horas) en un frasco de polietileno con tapa de rosca; se le agregaron 150 ml de solución de pepsina precalentada a 45 °C, se taparon los frascos y se colocaron en posición vertical en una incubadora con agitador, manteniendo la temperatura constante a 45 °C y agitando durante 16 horas. Al cabo del tiem-po de agitación, se hizo pasar por papel filtro del N° 1 que fue colocado en un embudo Bushner conectado a una bomba de vacío y el mismo se lavó tres veces con agua a 80 °C, posteriormente se trasfirió el papel conteniendo el residuo húmedo a un matraz Kjeldahl y se determinó el nitrógeno por el método Kjeldahl. La proteína digerible en pepsina se calculó restando la proteína indigerible en pepsina a la proteína cruda total.

Se utilizaron 200 ml de éter, 2 gramos de muestra de los frutos en tratamiento, 150 ml de pepsina, caseí-na usada como estándar en la valoración del método, equipos Goldfisch, Kjeldahl y baño maría con agita-dor.

Los resultados de las mediciones de la digestibi-lidad in vitro se analizaron mediante análisis de va-rianza de acuerdo con una clasificación simple. La


DIGESTIBILIDAD APARENTE “IN VITRO” EN PEPSINA DE LA PROTEÍNA DE PAROTA (ENTEROLOBIUM CYCLOCARPUM) Y CAPOMO... 9

prueba de rangos múltiples de Duncan (Steel y Torrie 1980) fue utilizada para identificar las diferencias en-tre medias de los tratamientos.

Resultados

En el cuadro 3 se presentan los resultados de los en-sayos de digestibilidad in vitro. Los valores hallados para la DIVN de la caseína usada como estándar en cada ensayo estuvieron en 98.35 ± 0.3%. Este valor es cercano al obtenido por Dierick et al. (1985) del 99.8%, lo que indica que el sistema de incubación empleado fue efectivo.

La digestibilidad en pepsina del nitrógeno para Enterolobium cyclocarpum fue de 73.82 y de 69.25% para Brosimun alicastrum.

Ramírez en el 2000 afirmó que una digestibilidad adecuada de la proteína en pepsina debe estar entre el 66 y 80%, y que valores inferiores a 65% son insufi-cientes para que el animal la aproveche.

La digestibilidad de la MS y la MO fue superior para la harina del fruto de parota con valores de 56.6, 52.4 con respecto a 39.3 y 39.2% de la harina del fruto de capomo.

Cuadro 3. Digestibilidad in vitro (DIV, pepsina) de la harina de los frutos de parota y capomo.

Harina de frutos

DIVMS DS DIVMO DS DIVN DS

Parota 56.6 0.72 52.4 0.55 73.82 1.80

Capomo 39.3 0.91 39.2 0.46 69.25 1.46

En el cuadro 4 aparecen algunos estudios de inter-dependencia entre los valores de DIV y el contenido de fibra de las harinas de los frutos evaluados. Usan-do la matriz de correlación de Pearson se halló que los índices de DIV medidos estuvieron positivamente correlacionados entre sí (P<0.05). Tanto la fibra cru-da como la FDN estuvieron negativamente asociadas con la DIV de la MS y de la MO (P<0.05). Esta inter-dependencia fue más débil con respecto al N digeri-do in vitro. Por otra parte, la pared celular definida como FDN estuvo menos estrechamente asociada a la DIV de las distintas fracciones estudiadas, que la fibra cruda. Sin embargo, ambas formas de expresión de la fibra de la harina de los frutos estudiados estuvieron significativamente (P<0.05) relacionadas entre sí.

Discusión

Análisis químico proximal de los frutos en estudio dentro de estas fracciones los mejores resultados fueron para la parota con respecto al capomo en PC (22.9, 10.88%), grasa (1.29, 1.07%) y MO (95.75,

Cuadro 4. Resultados obtenidos de diferentes autores mediante el método in vitro para determinar la digestibilidad de la fibra de la harina de parota y capomo.

Parota Capomo

FDN FDA FDN FDA

De Luna 34.58 31.28 19.37 17.25

Febles et al. (1999) 41.50 29.80

Cecconello et al. (2003) 27.53 19.90

Sosa et al. (2004) 41.20 24.83 54.00 43.48

Ku Vera et al. (1997) 37.50 28.50

Denia et al. (2000) 55.80 35.80

Lizarraga et al. (2001) 67.50 47.10

94.48%, respectivamente). Para capomo los mejores resultados correspondieron a cenizas (5.52, 4.25%), fibra (13.18, 7.24%) y materia seca (97.97, 96.13%). Existen pocos estudios de frutos de especies arbóreas utilizadas como fuente de alimentación para el gana-do, la mayoría de estas investigaciones se refieren a la utilización del follaje, es importante señalar que los frutos son consumidos por los animales sobre todo en época seca y es un aporte adicional a la dieta tanto a ganado domestico como a la fauna silvestre, respecto al valor nutritivo de la harina de los frutos de la parota y al capomo varios autores coinciden con los valores encontrados en esta investigación. Ortega (1998) y Castro (1999) indicaron que el contenido de PC para la parota y el capomo es de 22.5 y 10.90, y la MS 96 y 97.15%. Sin embargo en 1997 Velasco et al. reporta valores para PC el 22.8%, teniendo una variación con los valores reportados por parte de Álvarez (2003) en PC con 17.2%. Morales (1997) obtuvo PC 20 y 10.86% y MS 94.60 y 97% respectivamente, valores muy simi-lares a los reportados en este trabajo.

Otra fracción interesante es la correspondiente a la fibra, pues es conocido que esta puede influir ne-gativamente sobre la digestibilidad de los nutrientes que componen un alimento. Los porcentajes de FDN fueron en general mayores para la harina de los frutos de parota respecto a la harina de los frutos del capo-mo, con 34.58 y 19.37% respectivamente.

Respecto al ELN, es importante resaltar que los frutos completos de todas estas leguminosas tienen valores bastante elevados, por lo demás inusuales en materiales vegetales consumibles por los rumiantes en el trópico. Este ELN está representado principal-mente por los azúcares solubles, de muy fácil diges-tión. La especie con éste valor más alto fue el capomo (67.02%) y el más bajo para parota (60.45%). Dispo-ner de este ELN en estos frutos es de suma importan-cia para el balance de energía y proteína en el rumen, ya que representa una fuente de energía fácilmente fermentable, la cual aprovecha rápidamente la masa microbiana para todos los procesos de síntesis (Bondi


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1988). Combellas (1986) también encontró para este tipo de leguminosas valores elevados de ELN, obte-niendo valores de 61 y 72% para el Caro y Samán, res-pectivamente. Por su parte Velasco et al. (1997) re-porta valores de 57.3% para ELN en parota.

Los valores menores de digestibilidad hallados en la harina de los frutos del capomo pueden ser pro-ducto de su mayor contenido relativo de fibra, lo que influye negativamente en la digestibilidad de los nu-trientes, en especial la del N (Fernández y Jorgensen 1986). Aunque a este respecto, Rodríguez y Figueroa (1995) al estudiar diferentes fuentes fibrosas de ali-mento, encontraron valores elevados de N asociado a la FDN. Por otra parte Kass (1992) ha sugerido que entre 32 y 56% del nitrógeno está asociado a la FDN. La proporción de nitrógeno asociado estructuralmen-te a la fracción insoluble de la fibra dietética ejerce una marcada influencia sobre la digestibilidad in vitro del N (Mastrapa et al. 1996). Así es que Eggum (1992) ha señalado que un incremento en los niveles de fi-bra dietética insoluble consumidos, aumentan el bolo fecal o la excreción del N en ratas y cerdos, debido a una excreción aumentada de la proteína enlazada a la pared celular vegetal.

El mejor perfil de minerales encontrado fue para la harina de los frutos de parota, por lo que puede constituir una fuente de minerales con potencialidad para incluir en la dieta de los ovinos en el trópico. Dichos valores son: calcio 0.27, fósforo 0.30, potasio 0.86 nitrógeno, 3.66, magnesio 0.78, azufre 0.22% y cobre 5.56 ppm. En cuanto a minerales, Vázquez y De Luna (2003) encontraron los siguientes valores para parota: P 0.29 y Ca 0.36%. En un trabajo publicado por Benezra (2003) reporta valores de 0.29, 0.36, 0.77, 0.23% para fósforo, calcio, magnesio y azufre. El contenido de calcio, magnesio y cobre presentes en la harina de los frutos evaluados permitiría cubrir am-pliamente los requerimientos de estos minerales para ganado bovino, según lo establecido por McDowell (1997), ya que son superiores al nivel crítico estable-cido de 0.30 % de calcio, 0.05 a 0.25% de magnesio y de 4 a 10 ppm de cobre. De igual manera ocurre para el azufre, el cual cubre los requerimientos (0.08 %) establecidos para bovinos de carne (McDowell 1997).

Como se puede observar, los valores obtenidos en esta investigación son muy similares a los reportados por otros autores.

Conclusiones

Debido al contenido de proteína cruda, fibra, mate-ria seca, materia orgánica y a la digestibilidad de los frutos de la parota (Enterolobium cyclocarpum) y el capomo (Brosimun alicastrum), pueden ser conside-rados como una fuente importante de nutrientes para

la dieta de los rumiantes que pastorean en el bosque deciduo tropical mexicano durante los períodos de verano.

Por el contenido de calcio, fósforo, magnesio, azu-fre y cobre en los frutos de estas leguminosas, puede afirmarse que representan una fuente importante de elementos minerales para aminorar las deficiencias de estos elementos, mismos que no son aportados por los pastos durante el período seco.

Por medio del uso del método de digestibilidad de la proteína en pepsina se determinó que la parota tiene mayor digestibilidad que el capomo. En este es-tudio se mostró que la parota tiene un potencial nutri-cional claramente superior al del capomo.d

Literatura citada

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Efecto de la exposición prenatal a testosterona sobre el peso del bazo y la concentración de esplenocitos en ratas

hembras y machos

Oswaldo Palacios1, Galina Zaitseva1 y Jorge Juárez2

1Laboratorio de Inmunobiologia del Departamento de Biología Celular y Molecular; 2Instituto de Neurociencias del Departamento de Ciencias Ambientales. Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara, Jalisco, México. Correo electrónico: [email protected]

Resumen

Diversos trabajos científicos en el área de inmunoneuroen-docrinología, así como algunas evidencias empíricas, apo-yan el concepto de un dimorfismo sexual en la respuesta inmune (RI). El dimorfismo sexual (DS) de la respuesta inmune se manifiesta o se hace más evidente cerca de la pubertad como consecuencia de la acción activadora de las hormonas sexuales. Sin embargo, se desconoce si este DS de la RI se establece (como ocurre con otras estructuras del cerebro) durante el desarrollo prenatal como resulta-do de la acción organizadora de las hormonas, principal-mente testosterona. Con el propósito de investigar en qué medida afecta la testosterona durante el periodo crítico prenatal la RI: Peso relativo del bazo (PRB) y concentra-ción de esplenocitos por volumen de suspensión celular de hembras y machos, utilizamos un modelo experimental. Para ello, se aparearon ratas Wistar hembras de 90 días de edad y tratadas diariamente (del día 14 al día 20 de gesta-ción) con 2 mg de propionato de testosterona (PT) disuelto en 0.1 ml de aceite de maíz por vía intramuscular (grupo experimental) o sólo con el vehículo-aceite de maíz (grupo control). Después del parto espontáneo las crías fueron se-paradas por sexo y tratamiento, destetadas a los 22 días de edad. A los 85 días, los animales fueron sacrificados, sus bazos fueron extraídos y pesados para valorar los paráme-tros cuantitativos y número de esplenocitos por volumen de suspensión celular. De 36 sujetos estudiados 10 per-tenecieron al grupo de machos controles, 8 tratados con PT, 10 hembras controles y 8 hembras tratadas con PT. Se encontró que algunas de las ratas, tratadas durante la ges-tación con testosterona, presentaron abortos espontáneos, notable inquietud y canibalismo hacia sus crías. En cuanto a la descendencia, se observó una clara masculinización de las hembras, nacidas de las madres tratadas. El peso corporal mostró dimorfismo sexual en favor de los machos en los grupos controles, no así en los grupos tratados. En el peso del bazo, así como en el número de linfocitos es-plénicos, observamos una disminución significativa en los sujetos tratados con PT en comparación con los controles, independientemente del sexo. Por tanto, el tratamiento

con testosterona durante la gestación afectó el comporta-miento de las madres y de las crías; se observó un evidente efecto inmunosupresor de la testosterona, aplicada en la etapa prenatal.

Palabras claves: testosterona, respuesta inmune, dimor-fismo sexual.

Abstract

The sexual dimorphism (SD) of the immune response manifests itself and is more evident near puberty as a con-sequence of the activating action of the sexual hormones. However, it is not known if this SD of the immune response (IR) is established during the pre-natal development as a result of the organizing action of sexual hormones. With the purpose of investigating the effects of the hormonal ac-tion during the critical pre-natal period of sexual differen-tiation on the IR of males and females, we used Wistar rats of 90 days of age which, after fertilization, were injected daily (from the 14th to the 19th days of gestation) with ei-ther, 2 mg of testosterone propionate (TP) or with corn oil (control group). At 22 days of age all pups were weaned and were separated by sex and treatment, a total of 36. Af-ter 85 days the pre-natal treated rats were sacrificed in or-der to extract the spleen with the purpose of assessing the number of spleen's Lymphocytes per volume. The stud-ied subjects were:, 10 males control, 8 TP treated males, 10 control females and 8 TP treated females. The spleen weight was higher in males in contrast with the females in the control group. The spleen weight in the treated group was lower than in the control group, regardless of sex. The concentration of the spleen lymphocytes was significantly greater in the control groups than in the treated groups regardless of sex. This data support that testosterone in the critical period of sexual differentiation can play an important role in the modulation of the immune response through its organizing action.

Keywords: testosterone, immunity, sexual difference.

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OSWALDO PALACIOS, GALINA ZAITSEVA Y JORGE JUÁREZ14

Introducción

En la mayoría de las especies cada sexo presenta características bien diferenciadas, lo que se de-

nomina dimorfismo sexual (DS), el cual se refiere a las diferencias que pueden existir ya sea en forma cualitativa o cuantitativa, en estructuras o funciones entre los distintos sexos dentro de los miembros de una misma especie. Una de las estructuras corpora-les, que más se ha estudiado y donde se encuentra DS, es el cerebro. En la rata existen diferencias sexuales en el hipotálamo, en la amígdala, en la corteza visual, en el giro dentado, en el sistema vomero-nasal y en el núcleo de la cama de la estría terminal (Hines et al. 1992). La región del área preóptica-hipotalámica anterior (APo-HA), que posee un claro DS, es la que ha despertado mayor interés, por las múltiples evi-dencias que demuestran su importancia en el control de la conducta sexual en diferentes especies. Aquí se encuentra el núcleo sexualmente dimórfico del área preóptica medial que alcanza un volumen mayor en el macho que en la hembra. La especialización de los hemisferios también es sexualmente dimórfica, el hi-potálamo derecho controla la conducta sexual mas-culina, el hipotálamo izquierdo la conducta sexual femenina (Corsi et al. 2003). La actividad electroen-cefalográfica (EEG) también es sexualmente dimórfi-ca, resultando que la coherencia y correlación inter-hemisférica es mayor en las hembras, mientras que la correlación intrahemisférica es mayor en los machos (Juárez et al. 1995).

El DS en el cerebro es dependiente de la exposi-ción a la hormona gonadal testosterona durante el pe-riodo perinatal. En ausencia de testosterona circulan-te, el cerebro de mamíferos se desarrolla de acuerdo al fenotipo femenino. De lo contrario, la exposición temprana a testosterona permanentemente masculi-niza numerosas funciones fisiológicas y conductuales, incluyendo, pero no limitando, reproducción, nutri-ción, aprendizaje, memoria, agresión, ciclos de sue-ño y secreción de hormona de crecimiento (Michael et al. 1998). La placenta en los animales placentarios juega un papel importante en el tráfico de hormonas sexuales de la madre hacia el feto (Van de Beek et al. 2004). El incremento de testosterona en el suero san-guíneo materno (por el alimento, en los casos patoló-gicos o experimentales) puede modificar el desarrollo gonadal condicionado por genes, más si esto ocurre en el periodo crítico (entre día 14 al 20 de gestación en ratas). Según la determinación de Jost (1974), la diferenciación sexual es el primer proceso importante controlado endocrinológicamente en el periodo pre-natal temprano y tiene lugar en un estadio determi-nado “período crítico” del desarrollo gonadal de cada especie y no puede variarse.

Varios estudios (Mosley et al. 1997; Chambers et al. 2000) sustentan que sistemas neuroendocrino e inmune están íntimamente integrados en un sistema único de regulación de homeostasis en una comple-ja organización del metabolismo corporal (ver figura 1). La presencia de las hormonas sexuales en el mi-croambiente tímico y del bazo en ambos sexos duran-te la diferenciación de linfocitos puede jugar un papel importante para el establecimiento del dimorfismo sexual de la respuesta inmune. Según Gallard et al. (1998), el dimorfismo sexual en el eje hipotalámico-hiopofisiario-adrenal-gonadal-tímico (HHAGT) se presenta después de la pubertad, sin embargo, sus ca-racterísticas género-dependientes se inician en el pe-riodo embrionario. En la actualidad, la comunicación bidireccional entre los sistemas inmune y neuroendo-crino es considerablemente aceptada como esencial para la sobrevivencia del organismo.

Los andrógenos ejercen una influencia consi-derable sobre el tamaño y la composición del timo, principal órgano linfoide. La ausencia de hormonas sexuales después de la castración en los machos, se manifiesta en hipertrofia del timo, incluyendo a los animales viejos. El mecanismo de esta involución tímica, inducida por los andrógenos, no está com-pletamente comprendida, pero se podría postular la implicación de la disminución de la proliferación y el tráfico celular, así como el incremento de la muerte celular a través de la inducción de apoptosis por me-dio de la activación de nucleásas endógenas (Olsen et al. 1998). Los linfocitos T después de madurar en el timo salen a poblar los órganos linfoides secundarios, de los cuales el bazo es de mayor importancia en la respuesta inmune. El bazo es la masa de tejido linfá-

Sistema nervioso Sistema endocrino

Sistema inmune

Figura 1. Relación del sistema neuroendocrino-inmune (Blalock 1994).

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EFECTO DE LA EXPOSICIÓN PRENATAL A TESTOSTERONA SOBRE EL PESO DEL BAZO Y LA CONCENTRACIÓN DE ESPLENOCITOS... 15

tico más grande del cuerpo. En los embriones de ma-míferos placentarios, el esbozo del bazo aparece como un engrosamiento del mesénquima en el mesenterio dorsal del estómago durante la quinta semana del desarrollo embrionario. Más tarde el tejido parenqui-matoso del bazo se hace del tipo mieloide, que contie-ne todas las etapas del desarrollo de los granulocitos y eritrocitos. El desarrollo de los linfocitos y los mo-nocitos en el bazo se presenta durante toda la vida. El bazo es un importante órgano linfopoyético, donde proliferan los linfocitos T y B (esplenocitos), que se forman en los nódulos de la pulpa blanca (Abbas y Andrew 2002).

En los linfocitos del timo y del bazo, así como en los linfocitos de sangre periférica, se encuentran re-ceptores para los andrógenos (Cohen et al. 1983), a través de los cuales la testosterona realiza su acción sobre la respuesta inmune. Forneris et al. (2008) evi-denciaron en los esplenocitos de rata la expresión de ARNm de receptores para testosterona. Los linfocitos maduros tratados in vitro con andrógenos, reducen la producción de IL-2 e IL-4, además, la testosterona disminuye el desarrollo de células CD4+ y la síntesis de anticuerpos, provoca una maduración insuficiente de los linfocitos B e impide la regeneración de tejido linfoide, así explican el efecto inmunosupresor de la testosterona Cutolo et al. (1995).

El conocimiento sobre la interacción hormonal es muy amplio, sin embargo los datos sobre la influencia de las hormonas sexuales en la determinación del DS de la respuesta inmune son escasos (Grossman et al. 1989; Mc Gormick et al. 1998; Spinedi et al. 2002) y se desconoce el papel organizador de la testosterona durante la etapa prenatal sobre la respuesta inmune en la edad adulta. El estudio de la androgenización prenatal en relación con la inmunidad, adquiere ma-yor relevancia si consideramos que el adecuado desa-rrollo de este sistema proporciona la habilidad de res-ponder a los agentes patógenos y la tolerancia hacia el feto durante la gestación.

Con esta base, el presente trabajo investigó el papel que juega la testosterona durante la etapa crítica de diferenciación sexual sobre el comportamiento y los parámetros inmunológicos estructurales como peso del bazo y concentración de esplenocitos de machos y hembras. Los resultados aquí presentados, además de aportar a la comprensión de los mecanismos involu-crados en la interacción neuroendocrinoinmune, po-drán ser útiles para el diseño de terapias hormonales e intento de advertencia en el caso del uso descontro-lado de andrógenos en la dieta de animales domésti-cos y, como consecuencia, del hombre.

Objetivos del estudio

• Analizar el comportamiento de ratas tratadas con testosterona durante la gestación.

• Determinar los parámetros cuantitativos de la res-puesta inmune: el peso del bazo y la cantidad de esplenocitos por volumen de suspensión celular en ratas adultas de ambos sexos expuestas al propiona-to de testosterona en los días 14 a 20 del desarrollo prenatal (período crítico prenatal de diferenciación sexual) y en ratas expuestas durante el mismo tiempo al aceite de maíz.

Material y métodos

Animales

Se utilizaron 12 ratas hembras de la cepa Wistar de 90 días de edad del bioterio del Instituto de Neurocien-cias del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Guadalajara. Los animales fueron mantenidos en condiciones estándar de laboratorio con alimento comercial “ Nutricubos Purina” y agua ad libitum. Las hembras fueron apa-readas con machos mantenidos en las mismas con-diciones de laboratorio. Al momento del estro se les permitió copular libremente hasta que el macho lo-graba 3 eyaculaciones.

Androgenización en el periodo crítico

El día del apareamiento se consideró el día 0 de ges-tación. Del día 14 al 20 de gestación 6 hembras fue-ron tratadas diariamente con 2 mg de propionato de testosterona diluido en 0.1 ml de aceite de maíz (vehículo) vía subcutánea (grupo experimental). Las 6 hembras restantes fueron tratadas diariamente con 0.1 ml de aceite de maíz (grupo control) en el mismo periodo de gestación.

Formación de grupos experimentales

Después del parto, las crías fueron destetadas a los 21 días de edad, inmediatamente fueron separadas por sexo y tratamiento en los grupos control y experimen-tal. A partir del destete y hasta los 85 días de edad, los sujetos fueron alojados en jaulas colectivas en gru-pos de 5 sujetos y mantenidos en condiciones están-dar de bioterio. Debido a que las hembras expuestas prenatalmente a la testosterona presentan diestro persistente, las hembras del grupo control fueron sa-crificadas durante la fase de diestro, para asegurar lo anterior, se les tomaron frotis vaginales diariamente. El día del sacrificio (día 85 de edad post-natal) se les

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extirpó el bazo para la determinación posterior de su peso y concentración celular.

Análisis del comportamiento

El comportamiento de las ratas progenitoras y sus descendientes fue monitoreado diariamente a través de observación directa y anotación en bitácora corres-pondiente.

Determinación del peso del bazo

Las ratas fueron sacrificadas por dislocación cervical, se pesaron en una balanza granataria (Felisa) y, pos-teriormente, en condiciones estériles se realizo la ex-tracción del bazo, el cual fue colocado en una caja de Petri con 7 ml de solución salina balanceada de Hank (SSBH) a 4 °C. La caja de Petri fue pesada en la balan-za analítica Sartorius antes y después de la colocación del bazo, por la diferencia fue calculado el peso del bazo.

Obtención de suspensión celular del bazo

El bazo que se encontraba dentro de caja de Petri en la SSBH, fue posteriormente disgregado en una bolsa de Nitex (malla de microfilamentos de nylon con poros de diametro de 210 µ, Teteco. Inc., Elmsford, N.Y.) en las condiciones estériles en la campana de flujo lami-nar (Alder). Posteriormente, con una pipeta Pasteur la suspensión de células obtenidas fue recogida de la caja de Petri y colocada en el tubo de ensayo de 12 × 75 mm, donde se dejo reposar por 5 minutos a tem-peratura de 4 a 6 °C para que sedimentaran los restos tisulares. Las células se centrifugaron a 1200-1500 rpm durante 10-15 min. El sobrenadante se eliminó y las células se lavaron dos veces en SSBH. Este proce-dimiento se realizó dos veces. El sobrenadante se des-echó y al botón de células se le adicionó un mililitro de RPMI 1640, se homogeneizó, los tubos se colocaron en hielo; después se tomaron 100 µl, los cuales fueron adicionados a un tubo de ensayo que contenía 900 µl de PBS, para contar la cantidad de esplenocitos en-contradas en un mililitro de la suspensión celular del bazo. El conteo celular se llevó a cabo mediante la uti-lización de la cámara de Neubauer, donde se contaron los cuatro cuadrantes externos y se calculó la canti-dad de células obtenidas por la siguiente fórmula: la cantidad de células contadas se divide entre cuatro, se multiplica por el factor de la cámara (10000) y por el factor de dilución. Después se realizó la prueba de viabilidad de los esplenocitos en la suspensión celular usando el colorante azul de tripano al 0.4% (Sigma Chem.Co.T8154). Para esto se tomaron 10 µl de la suspensión celular del mismo tubo, donde se hizo el

conteo celular, se colocaron en un portaobjetos, se les adicionó 10 µl de azul de tripano, se homogeneizó y después de un minuto se les colocó el cubreobjetos. Posteriormente en el microscopio se contaron 100 cé-lulas, de las cuales las teñidas son las que están muer-tas y sirven para calcular el porcentaje de viabilidad

Las ratas fueron tratadas durante los experimen-tos con ética de acuerdo a la normatividad interna-cional en el manejo y uso de animales de laboratorio.

Análisis estadístico

Para el análisis de los resultados se aplicó una prue-ba de análisis de varianza (ANDEVA) de dos facto-res (SEXO × TRATAMIENTO) para cada uno de los parámetros determinados. Cuando la interacción entre factores fue significativo se aplicó la prueba T de Tukey que permitió conocer la diferencia entre los grupos de estudio. El nivel de significación estadística se consideró con un valor de p< 0.05.

Resultados

Algunas de las ratas androgenizadas durante la ges-tación con testosterona presentaron cambios en su comportamiento como notable inquietud y canibalis-mo, lo que no se observó en las madres controles. En cuanto a la descendencia, se observó una clara masculinización de las hembras, nacidas de las ma-dres tratadas con testosterona, ya que presentaron un incremento importante de la distancia ano-genital y en la edad adulta no presentaron apertura del orificio vaginal, a diferencia de las hembras no tratadas, las cuales no presentaron ninguna alteración anatómica. La conducta sexual también se vio alterada, ya que algunas de las ratas hembras, androgenizadas pre-natalmente, en su etapa juvenil (más de 60 días de edad) mostraron conducta de monta, muy similar a los machos de su misma edad; no se observó dicha modificación de la conducta sexual en las hembras no androgenizadas.

De las 6 ratas hembras expuestas durante la gesta-ción a la testosterona, únicamente 16 crías (8 machos y 8 hembras) se consideraron para el estudio debido a la presencia de abortos espontáneos y canibalismo. De las 6 ratas hembras expuestas durante la gestación al aceite de maíz (vehículo) se derivaron para el es-tudio 10 machos y 10 hembras. Nuestros resultados representan el análisis de 36 sujetos, los cuales dis-tribuimos en cuatro grupos de la siguiente manera: grupo control de machos expuestos prenatalmente al vehículo n=10; grupo control de hembras expuestas prenatalmente al vehículo n=10; grupo experimental de machos expuestos prenatalmente a testosterona

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n=8; grupo experimental de hembras expuestas pre-natalmente a testosterona n=8.

El peso corporal de los animales controles y ex-puestos a testosterona al momento del sacrificio fue similar, 396 ± 11g y 391 ± 13g respectivamente para los machos; 278 ± 7g y 281 ± 6g para las hembras. En los grupos tratados prenatalmente con testoste-rona se observó una ligera disminución del peso en los machos y un incremento del peso corporal en las hembras en comparación con los grupos tratados con aceite de maiz.

En lo que se refiere al peso del bazo, se observó di-morfismo sexual en favor de los machos: El promedio y el error estándar del peso del bazo de los machos fue de 1.35 ± 0.21 g (grupo control) y de 0.69 ± 010 g (grupo expuesto a testosterona), el peso del bazo de las hembras fue de 0.75 ± 0.05 g (grupo control) y de 0.45 ± 0.04 g en el grupo experimental. Se observó diferencia significativa [F (1,32) = 12.60, P=0.00155] entre grupos control (machos y hembras) y grupos expuestos (machos y hembras), indicando que la tes-tosterona decrementó el peso del bazo independiente del sexo de los sujetos (ver la figura 2).

Respecto al número de esplenocitos por volumen de suspensión celular del bazo dentro de los grupos no se encontró dimorfismo sexual significativo: En ratas machos del grupo control el parámetro fue de 436,980 ± 64.276 células por mililitro y en las hem-bras, expuestas al aceite de maíz en la etapa prenatal, fue de 450,960 ± 53.477 células por ml. En el grupo experimental los machos mostraron 132,610 ± 15.974 esplenocitos por ml y las hembras 133,712 ± 36.376 esplenocitos por ml. En este parámetro inmunológico

cuantitativo el factor tratamiento también fue signifi-cativo [F(1,32)=38.32, p=0.00001]. En la figura 3 se representa el número de linfocitos esplénicos por vo-lumen de suspensión celular del bazo en grupos con-troles y grupos tratados.

Discusión

En los últimos años se ha demostrado que existe una relación bidireccional entre el sistema inmune y el sistema neuroendocrino. Estudios experimentales in vivo e in vitro han confirmado la influencia de las hormonas sexuales en la inmunidad. Sin embargo, el conocimiento de los mecanismos involucrados está lejos de ser comprendido plenamente.

Nosotros observamos clara masculinización de las hembras, nacidas de las madres tratadas con testos-terona, ya que en la edad adulta no presentaron aper-tura del orificio vaginal y la distancia ano-genital fue mayor, a diferencia de las hembras no tratadas, las cuales no presentaron ninguna alteración anatómica. La conducta sexual también se vio alterada, ya que algunas de las ratas hembras androgenizadas prena-talmente, mostraron conducta de monta, muy similar a la de los machos. Esta alteración no se observó en la conducta sexual de las hembras no androgenizadas. Estos cambios en la anatomía y en la conducta de los animales nacidos de las ratas tratadas con testoste-rona en la etapa crítica del desarrollo embrionario, también han sido descritos por Juárez y cols. (1998).

Hasta donde sabemos, este es el primer reporte de alteración de parámetros inmunológicos bajo apli-cación de la testosterona en la etapa prenatal durante

Grupos de control Grupos Testosterona

Peso

baz

o (g

r)

*

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

Figura 2. Peso del bazo de ratas de grupos de control (M y H) y de grupos tratados con testosterona en el periodo prenatal (M y H). Las barras indican la media. * Controles >Tratados. En este análisis el factor tratamiento fue significativo.

Grupos de control Grupos Testosterona

Esp

leno

cito

s 10

3 /ml

*

0

100

200

300

400

500

600

Figura 3. Concentración de esplenocitos/volumen de suspensión celular del bazo, en los grupos de control (M y H) y tratados con tes-tosterona en el periodo prenatal (M y H). Las barras indican la media con desviación estándar. * Controles > Expuestos. La interacción entre sexo y tratamiento no fue significativa para este parámetro, sin embargo se observa que la testosterona produjo una disminución drástica en el número de linfocitos esplénicos por volumen tanto en machos como en hembras.

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el periodo crítico del desarrollo gonadal: El peso del bazo, principal órgano linfoide secundario, muestra disminución significativa en los animales de ambos sexos tratados con testosterona en comparación con los grupos controles (como se observa en la figura 2). Este decremento del peso del bazo en grupos tratados estuvo acompañado de una disminución de la pobla-ción linfocitaria de este órgano, como se pudo obser-var en la concentración de esplenocitos en la figura 3, lo cual es congruente con los datos de Angele et al. (1998), quienes observaron disminución de la canti-dad de esplenocitos bajo el efecto de la testosterona durante el estrés hemorrágico, así como con el hallaz-go de Utsuyama et al. (1989), quienes observaron el aumento de células esplénicas después de la gona-doectomía en machos. Naghdi et al. (2005) reportan que las hormonas sexuales actúan sobre la respuesta inmune vía glándula tímica, involucrando en la inmu-noregulación al eje hipotalámico-hiopofisiario-adre-nal-gonadal-tímico, observando que el tratamiento con testosterona en etapa adulta provoca la activación de este eje debido a la alta concentración de recepto-res a los andrógenos en las estructuras cerebrales y en los linfocitos del timo. Con base en los datos de Ol-sen et al. (1998) consideramos, que la disminución de linfocitos esplénicos después del tratamiento prenatal con testosterona se debe principalmente al aumento de apoptosis en los linfocitos del timo fetal inducido por ésta hormona esteroide, ya que los linfocitos T del bazo tienen origen tímico. Este comentario, además, se apoya en nuestra observación de la disminución del peso del timo en los grupos tratados con testoste-rona en comparación con los animales controles (da-tos no publicados). El primer trabajo que demostró la interacción entre las gónadas y el timo fue escrito en 1878 por Calzonari, investigador italiano, al observar que la castración de los conejos produce un aumento del tamaño del timo. Reciente estudio de Chen et al. (2009) en pollos castrados y tratados con testostero-na evidencia una vez más, que las hormonas sexuales afectan el tipo y el grado de la respuesta inmune.

La disminución del peso del bazo en los machos tratados en la etapa prenatal con testosterona fue mayor que en las hembras expuestas. Esta aparente diferencia dependiente del sexo parece coincidir con los datos de Belliure et al. (2004), quienes observa-ron disminución de la proliferación de linfocitos T bajo estímulo mitogénico de fitohemaglutinina sólo en los machos de dos especies de lagarto mediterrá-neo, aunque tratados con testosterona en etapa adul-ta. Probablemente, a pesar de que los machos están expuestos de manera natural a la acción androgénica de la testosterona durante el desarrollo embrionario o después de la pubertad, su aplicación en dosis mayo-res que las fisiológicas, parece conducir a la inmuno-

supresión más drástica, debido a mayor densidad de receptores androgénicos en sus células en compara-ción con las de hembras, como lo reportan Cutolo et al. (1995) y, en recientes estudios moleculares sobre dimorfismo sexual de ARNm del receptor androgéni-co en esplenocitos (De León-Nava et al. 2009).

Andersson et al. (2004) y Seale et al. (2005) en-focan la testosterona como principal determinante del dimorfismo sexual de la respuesta inmune y en su rol en el periodo neonatal, así como en la suscep-tibilidad del eje HHAGT a las hormonas sexuales en el estado adulto debido a que el efecto organizador esta sumado al efecto activador sobre la función del eje hormonal mencionado. La mayoría de los estudios mencionados relacionados con DS se dedican a exa-minar los aspectos anatómicos y conductuales y muy pocos trabajos se orientan a estudiar la actividad del eje HHAGT durante el periodo crítico del desarrollo gonadal y por ende los efectos de su manipulación so-bre la respuesta inmune.

En la interpretación de nuestros datos, no se puede soslayar la acción activadora de las hormonas sexuales durante el desarrollo, ya que los parámetros inmunológicos de los sujetos fue analizada en la edad adulta; y es posible que el efecto inmunosupresor tan marcado en los machos y menos en las hembras por la exposición prenatal con testosterona, se debe a la participación de estos efectos activadores durante el desarrollo actuando sobre el sistema neuroendocrino inmune ya organizado con características dependien-tes de los niveles hormonales fisiológicos o farmaco-lógicos.

Conclusiones

• La testosterona afectó el comportamiento de las ra-tas progenitoras y a sus descendientes hembras con marcada masculinización.• Evidente efecto inmunosupresor de la testosterona aplicada en la etapa prenatal se mostró en la disminu-ción de los parámetros inmunológicos cuantitativos (peso del bazo y cantidad de esplenocitos) en ambos sexos.• Este trabajo soporta la postulación del efecto organi-zador de la testosterona en la etapa prenatal sobre los mecanismos neuroendocrino inmunes de regulación que se manifiestan en la edad adulta.d

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Efectos de la adición de vermicomposta en un suelo contaminado con pesticidas y su comportamiento en el

proceso de nitrificación y mineralización de carbono

Dioselina Álvarez Bernal, Rebeca Flores Magallón y Marcos Alfonso Lastiri Hernández

Instituto Politécnico Nacional. Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Michoacán. Justo Sierra Nº28, Col. Centro. C.P. 59510. Tel/Fax: 3535330083 Correo electrónico:[email protected]

Resumen

Los suelos agrícolas de San Gregorio municipio de Paja-cuarán, Michoacán los cuales pertenecen al Distrito de Riego 024 (Ciénega de Chapala), tienen un historial en el uso de agroquímicos, entre ellos pesticidas; el uso indiscri-minado e incesante de éstos, tiende a cambiar las pobla-ciones microbianas o la actividad de algunas especies de microorganismos. Los herbicidas y los fungicidas han sido diseñados para afectar específicamente ciertas actividades enzimáticas para restringir el impacto de malezas, plantas y diversos microorganismos patógenos, sin embargo tam-bién afectan a los microorganismos benéficos del suelo. Se ha observado que la aplicación de materia orgánica tiene un efecto complejo en la degradación de pesticidas; en este trabajo se analizó la adición de vermicomposta en sitios donde se han utilizado pesticidas, dando como resultado el mejoramiento del proceso de nitrificación y mineraliza-ción de carbono, también se observó que dichos suelos es-tán erosionados, sin embargo cabe destacar que el proceso de bioestimulación del suelo con enmiendas orgánicas es lento.

Palabras claves: Bioestimulación, pesticidas, suelo, ver-micomposta, nitrificación, enmiendas orgánicas.

Abstract

Agricultural soils in the municipality of San Gregorio, Pa-jacuaran, Michoacán, which belong to irrigation district 024, have a history of long term use of agrochemicals, including pesticides, indiscriminate and incessant use of these tends to change microbial population or activity of some species of microorganisms. Herbicides and fungi-cides are designed to specifically affect certain enzymatic activities to restrict the impact of weeds, plants and fungal pathogens, but also affect beneficial soil microorganisms. It has been observed that the application of organic mat-ter has a complex effect on degradation of pesticides, in this study we analyzed the addition of vermicompost in soils where pesticides have been used, resulting in the im-provement of nitrification and mineralization of carbon, also found that these soils are eroded, it should be noted however that process of biostimulation of soil with organic amendments is slow.

Keywords: Biostimulation, pesticides, soil, vermicom-post, nitrification, organic amendments.

Introducción

Los pesticidas son utilizados en todo el mundo para proteger los cultivos controlando o destruyendo

malezas, insectos, hongos y otras plagas. El suelo ac-túa como un filtro activo, donde los compuestos quí-micos son degradados por procesos físicos, químicos y biológicos. También se dice que el suelo es un filtro selectivo por la capacidad de retener químicos y evitar su infiltración a acuíferos. (Cox et al. 2000).

La acumulación de pesticidas en el suelo y su dis-persión en el ambiente depende principalmente de las características y el funcionamiento general del ecosis-

tema. Entre los factores más importantes a conside-rar son las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo (textura, estructura, pH, contenido materia orgánica y actividad microbiológica), condiciones ambientales (principalmente temperatura y hume-dad) y las características del pesticida por sí mismo (Kôhne et al. 2009).

La velocidad de descomposición de los compues-tos químicos en el suelo es una función de la disponi-bilidad que tienen hacia los microorganismos o a los

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DIOSELINA ÁLVAREZ BERNAL, REBECA FLORES MAGALLÓN Y MARCOS ALFONSO LASTIRI HERNÁNDEZ22

sistemas enzimáticos capaces de degradarlos y de la cantidad y actividad de éstos (Sánchez et al 2004).

Los compuestos que no están disponibles en el suelo varían mucho de un suelo a otro y también de-pende del tipo de suelo (Nam, Chung y Alexander 1998). La naturaleza y la extensión depende prime-ramente de las propiedades intrínsecas de los pesti-cidas, los parámetros fundamentales incluyendo la solubilidad en agua, la presión de vapor y el coefi-ciente de partición octanol/agua (Semple et al. 2001). En segundo término, las propiedades del suelo, entre ellas, la cantidad y naturaleza de la materia orgánica (Semple et al. 2003) y sus constituyentes inorgánicos (Maeder et al. 2002), especialmente en lo que se re-fiere al tamaño de poro y su estructura (Nam, Chung y Alexander 1998).

La aplicación de lodos tiene un efecto complejo en la degradación de pesticidas (Perrin-Ganier et al. 2001).Varios autores han estudiado la limitación por la agregación de materia orgánica para la biodispo-nibilidad de los pesticidas en el suelo (Worrall et al. 2001), el mecanismo propuesto para la baja de bio-disponibilidad de los pesticidas es debido a la fuerza de adsorción y el incremento relativo de la población microbiana (Sánchez et al. 2004).

La adición de sustratos orgánicos al suelo como lucerna o polvo de cuerno aumenta el metabolismo del nitrógeno y carbono, por lo que se procede a la medición de nitrato, nitrito y amonio, junto con el consumo de oxígeno o la liberación de dióxido de car-bono (Lynch 1995), esto con el fin de cuantificar la ni-trificación y mineralización de carbono, debido a que la adición de sustratos orgánicos tiende a elevar las concentraciones de nitrógeno mineral y CO2.

El objetivo de este trabajo fue evaluar la adición de una enmienda orgánica (vermicomposta) para medir las concentraciones de nitrógeno mineral provenien-tes de la nitrificación, amonio (NH4+), nitritos (NO2-) y nitratos (NO3-) y la cuantificación de dióxido de car-bono (CO2) para conocer el grado de alteración de la nitrificación y mineralización de carbono, en suelos donde se ha tenido un periodo largo del uso de agro-químicos entre ellos pesticidas; por lo tanto, y con este conocimiento, saber si el uso de enmiendas or-gánicas como vermicomposta es recomendable para suelos con estas características.


Sitios y muestreo de suelos

El sitio experimental está localizado en el Distrito de Riego 024, en el municipio de Pajacuarán, en el estado de Michoacán de Ocampo, México (latitud Norte 20° 07', longitud Oeste 102° 34'). Su altitud aproximada

es de 1520 metros sobre el nivel del mar y caracteri-zado por una clima templado, con lluvias en verano y una temperatura promedio anual de 24.5 °C y una precipitación promedio anual de 700 mm (http://www.inegi.gob.mx).

El suelo es principalmente cultivado con maíz (Zea mays) y sorgo (Sorghum vulgare) por más de 20 años (http://www.inegi.gob.mx), recibiendo una gran cantidad de fertilizante inorgánico y pesticidas (http://www.siap.gob.mx).

El muestreo del suelo fue realizado el 15 y 17 de junio de 2010, de la capa superficial de 0-20 cm de-bido a que esta capa normalmente muestra la mayor actividad microbiana y contenido de materia orgáni-ca (Alexander 1980); este muestreo se realizó en tres campos. Por lo tanto, nueve suelos fueron muestrea-dos; a los suelos de cada campo se les quitaron las piedras y raíces; también se obtuvieron muestras de un suelo en donde no se han utilizado agroquímicos, para utilizarlo como suelo control.

Caracterización física y química del suelo

El pH se determinó en una suspensión de agua: suelo (1:2.5, p/p; Thomas 1996). El carbono (C) orgánico se determinó por la técnica descrita por Sánchez-Monedero et al. (1996). El C inorgánico se determinó adicionando 20 ml de una solución de HCl 1 N a 1 g de suelo seco (Nelson y Sommers 1996). El C total se calculó como la suma del C total más el C inorgánico. El Nitrógeno (N) total se cuantificó por el método de Kjeldahl (Bremner 1996). La distribución del tamaño de partícula se realizó de acuerdo al método de Gee y Bauder (1996), la capacidad de intercambio catiónico (CIC) se midió por el método PZNC (Print of Zero Net Charge) (Uehara y Gillman 1982), La conductividad eléctrica se midió directamente con un conductíme-tro en el extracto saturado del suelo (Rhoades y Col. 1989).

Pre-Acondicionamiento del suelo para la incubación aerobia

Después de realizar el muestreo de suelos se tamizó de forma separada (cada sitio y cada campo), utilizan-do una malla de 2 mm de apertura de trama. Poste-riormente, los suelos se acondicionaron al 50% de su capacidad de retención de agua y se incubaron duran-te siete días antes de iniciar los experimentos. El sue-lo se colocó en bolsas de plástico, que permanecieron abiertas dentro de contenedores. En los contenedores se colocaron dos frascos, uno con agua para evitar que el suelo perdiera humedad y el otro con NaOH 1M para evitar la acumulación de dióxido de carbono (Jâggi 1976; Anderson 1982).

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EFECTOS DE LA ADICIÓN DE VERMICOMPOSTA EN UN SUELO CONTAMINADO CON PESTICIDAS Y SU COMPORTAMIENTO EN EL... 23

Las pruebas se llevaron a cabo periódicamente (0, 3, 7, 14 y 28 días) para determinar NH4+, NO2-, NO3- y CO2. Se seleccionaron al azar frascos con suelo y se hicieron las determinaciones por triplicado. Las bo-tellas se incubaron a temperatura controlada (25 °C).

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza a las característi-cas del suelo, y a las concentraciones de N inorgánico (NH4+, NO2- y NO3- ), CO2 para determinar diferen-cias significativas entre los sitios, utilizando el paque-te estadístico SAS®.


El pH de los suelos los sitúa en la categoría de neutro. Los suelos se clasificaron según el triángulo de cla-ses texturales como arenoso el suelo Con (control), franco-arenoso el suelo Sg (Suelo 1) y arenoso-franco para los suelos Mg (Suelo 2) y Mt (Suelo 3), el carbo-no orgánico, nitrógeno total fueron similares entre los suelos contaminados con pesticidas, a diferencia del suelo control que fue significativamente diferente a los antes mencionados; la conductividad eléctrica de todos los suelos resultó baja, lo que indica suelos con bajo contenido de sales, el resto de la caracterización se puede observar en el cuadro 1.

Los suelos poseen un gran porcentaje de arena, lo cual los hace muy susceptibles a la lixiviación de pes-ticidas, sin embargo, la relación C/N es baja, lo que indica que son suelos que tienen posibilidad de adsor-ber pesticidas (Fernández-Bayo et al. 2009).

La vermicomposta de gallinaza tuvo las siguientes propiedades: pH 6.7; el contenido de carbono orgáni-

Figura 1. Unidad experimental.

Incubación aerobia

Se colocaron 20 g de suelo en una botella de vidrio, la cual se coloca dentro de una botella más grande y se colocó un frasco con NaOH 1N, para atrapar el CO2 liberado, y otro con agua para mantener la humedad (figura 1); los frascos se airearon cada semana para evitar condiciones de anaerobiosis, el experimento se realizó durante 28 días, las determinaciones se hicie-ron por triplicado para cada sitio.

Se colocaron 20 g de suelo y se le adicionaron 308 mg (2 g C kg-1) de vermicomposta en una botella de vidrio; se mezcló para tener una muestra homogénea, la cual se colocó dentro de un frasco más grande y se introdujo un frasco con NaOH 1N para atrapar el CO2 liberado, y otro con agua para mantener la humedad. Se airearon cada semana para evitar condiciones de anaerobiosis, las determinaciones se hicieron por tri-plicado para cada sitio.

Cuadro 1. Características físico-químicas de los suelos.

Parámetro Con Sg Mg Mt DMS 5%

pH 6.9 6.8 7.4 7.3 0.3

% Humedad 37.3 18.0 7.0 22 3.5

%CRA 232 179 131 110 21.5

CE (mS/cm) 2.2 0.4 0.2 0.4 0.8

CIC(meq/l) 14.58 14.7 12.08 19.17 0.6

Pdis (mg/kg) 1.7 3.2 3.4 5.1 7.8

Ptot (mg/kg) 35.2 43.5 38.5 40.1 13.2

C (mg/kg) 46.4 25.4 27.1 25.02 30.62

N (mg/kg) 6.02 12.06 11.9 12.4 0.75

Textura Limo 5.02 1.7 8.31 19.4

Arena 89.5 Arenoso 79.4 Franco- 80.7 Arenoso- 72.31 Arenoso-

Arcilla 5.4 18.8 Arenoso 10.9 Franco 8.3 Franco

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co 170 g kg−1; una conductividad eléctrica de 2.1 mS cm−1; una relación ácido humico-fulvico 0.9 (HA/FA); contenido total de N 2.1 g kg−1; carbono total 17.7 g kg−1; y una relación NH4+ / NO3− 8.5. La vermi-composta tuvo un índice de germinación para berro (Lepidium sativum) del 90% después de 2 meses. Por otro lado, la vermicomposta contiene menos de 3 CFU g−1 Salmonella spp.; no hubo presencia de coliformes fecales, ni Shigella spp., ni huevos de helmintos, lo que la hace una vermicomposta inocua y apta para utilizar como enmienda orgánica.

Nitrificación y mineralización de carbono

La producción de CO2 en los diferentes suelos, fue incrementándose conforme al tiempo de incubación. Cabe mencionar que los suelos en donde se adicionó vermicomposta, la producción de CO2 se incremen-tó 1.5 veces, en comparación con los suelos sin tra-tamiento (figura 2); la aplicación de materia orgáni-ca, proporciona una carga considerable de bacterias, hongos y actinomicetos los cuales son capaces de rea-lizar algunos ataques a moléculas organofosforadas, incluso podrían utilizar esta clase de moléculas como fuente de energía (Nivia 1992).

Se observó una disminución en la concentración de amonio (NH4+) a medida que aumentaba el tiem-po de incubación en los suelos, esto es debido a que el primer paso de la nitrificación es la conversión de

Figura 2. Producción de CO2; a) suelos sin tratamiento y b) suelos adicionados con vermicomposta.

Figura 3. Producción de N-inorgánico (mg N/kg Suelo), suelos sin tratamiento.

Figura 4. Producción de N-inorgánico (mg N/kg Suelo), suelos adicionados con vermicomposta.

amonio a nitritos (De Boer y Kuwalchuck 2001). Las concentraciones de nitritos fueron muy bajas, las cua-les disminuyeron durante el transcurso de la incuba-ción, debido a que es una fase de transición en la nitri-ficación (Bartholomen 1965). Estas concentraciones fueron muy similares para los tres suelos y también para el suelo control con o sin vermicomposta.

Las concentraciones de nitratos fueron más gran-des en el suelo control, sin embargo, también hubo un incremento de dicha concentración en los suelos

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EFECTOS DE LA ADICIÓN DE VERMICOMPOSTA EN UN SUELO CONTAMINADO CON PESTICIDAS Y SU COMPORTAMIENTO EN EL... 25

adicionados con vermicomposta (figuras 3 y 4), por lo tanto el nitrógeno fue mineralizado en los 28 días de incubación. Las concentraciones de amonio y nitritos regularmente son bajas, debido a que son pasos de transición para la formación de nitratos (Alexander 1985).

Por otro lado, suelos con un historial de varios años de uso de pesticidas tienden a tener baja acti-vidad con respecto a nitrificación, existe evidencia que los pesticidas organofosforados como el Paratión, Malatión inhiben parcialmente la nitrificación y los hidrocarboroclorinados y carbamatos sí la inhiben marcadamente (Itoh 1991). La adición de materia orgánica estimula a los microorganismos autóctonos para un mejor desempeño en la nitrificación y a su vez en la disipación de pesticidas (Torres et al. 2009), además, se sabe que la materia orgánica puede adsor-ber pesticidas y esto beneficia la flora autóctona del suelo (Moreno y Moral 2010).

Conclusiones

Los suelos en donde se han utilizado agroquímicos, como pesticidas, por un periodo largo de tiempo se ven afectados en la mineralización de nitrógeno, es decir que dichos suelos tienen un rendimiento pobre en cuanto a fertilidad del suelo, cabe mencionar que la adición de vermicomposta es útil para incrementar la fertilidad, ya que al adicionarse el suelo con esta enmienda orgánica incrementa su concentración de nitratos el cual será aprovechado por las plantas, por lo que el uso de vermicomposta sería una alternativa para suelos con un largo historial en el uso de pesti-cidas.

Agradecimientos

A la Secretaría de Investigación y Posgrado (SIP) del Instituto Politécnico Nacional por el financiamien-to de este proyecto (201000264) y a Norma Bereni-ce Barocio Ceja (Becaria del Programa Institucional de Formación de Investigadores) por la asistencia técnica.d

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LATEVOLT: programa para medir fácilmenteamplitudes y latencias en potenciales cerebrales

relacionados con eventos

Miguel Ángel Guevara Pérez1, Araceli Sanz Martin1, Marisela Hernández González1

y Claudia del Carmen Amezcua Gutiérrez1

1Instituto de Neurociencias, CUCBA, Universidad de Guadalajara. Francisco de Quevedo 180, Arcos Vallarta, C.P. 44130, Guadalajara, Jalisco, México. Correo electrónico: [email protected]

Resumen

Los Potenciales Relacionados con Eventos (PREs) son cambios de voltaje en la actividad eléctrica cerebral que ocurren como respuesta a eventos discretos, ya sean in-ternos o externos. Esta técnica, ha permitido ampliar el conocimiento sobre el curso temporal de algunos proce-sos cognoscitivos a partir del comportamiento de ciertos potenciales eléctricos cerebrales. El procedimiento más común para su obtención es la promediación de segmen-tos de actividad electroencefalográfica (EEG) registrados en forma sincronizada con la repetición de un evento par-ticular. Después de que los PREs son extraídos es nece-sario analizar las características de las ondas resultantes, también denominadas componentes o picos; los cuales se definen por la combinación de su polaridad, latencia ca-racterística, distribución sobre el cuero cabelludo y sensi-bilidad a manipulaciones experimentales. Para analizar las mencionadas características se han desarrollado progra-mas computacionales especializados. En este artículo se describe el programa LATEVOLT, el cual permite inspec-cionar de manera visual los PREs y obtener tanto la polari-dad como los valores de amplitud (voltaje) y latencia de los picos que componen a los potenciales. Este programa es flexible y fácilmente adaptable a necesidades experimenta-les y clínicas, por lo que puede ser utilizado eficientemente en proyectos de investigación básica y aplicada.

Palabras clave: Amplitud, latencia, potenciales relaciona-dos con eventos, PREs.

Abstract

The event-related brain potentials (ERPs) are changes of voltage in the brain electrical activity generated as a re-sponse to specific internal or external events. This tech-nique has allowed extending the knowledge about the temporary course of some cognitive processes from the behavior of certain cerebral electrical potentials. The most common procedure for its obtainment is averaging many samples of electroencephalographic activity (EEG) anchored temporarily to repetitions of a particular event. After EPRs are extracted, it is necessary to analyze the characteristics of the resulting waves, also denominated components, which are defined by the combination of their polarity, characteristic latency, distribution on the scalp and sensitivity to certain experimental manipulation. In order to analyze the characteristics before mentioned, it is necessary the use of specialized computational programs. In this article, we describe the program LATEVOLT, which allows to inspect visually the EPRs and to obtain polar-ity as well values of voltage amplitude and latency of nine picks. This program is flexible and easily adaptable to ex-perimental and clinical needs, so it can be used efficiently in basic and applied investigations.

Keywords: Amplitude, EPRs, event-related brain poten-tials, latency.

Introducción

Los Potenciales Cerebrales Relacionados con Even-tos (PREs) son cambios de voltaje en la activi-

dad eléctrica cerebral que ocurren como respuesta a eventos discretos ya sean internos o externos y son el promedio de un número determinado de muestras de señales electroencefalográficas (EEG) (Andreassi 2000; Rugg y Coles 1995). En los últimos 40 años, ha crecido exponencialmente el interés por estudiar la

relación entre los PREs y diversas actividades psicoló-gicas, a tal punto que en la actualidad es una de las va-riables psicofisiológicas más populares. Se considera que los PREs son indicadores de procesos o subpro-cesos cognoscitivos o perceptivos entre los que desta-can la atención, el procesamiento de la información, la memoria, la comprensión del lenguaje, los procesos emocionales, entre otros (Nuñez-Peña et al. 2004).

CitarCitar


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MIGUEL ÁNGEL GUEVARA PÉREZ ET ÁL.28

En opinión de Nuñez-Peña et al. (2004) los PREs tienen cuatro ventajas fundamentales. La primera ra-dica en el hecho de que el registro de los PREs es una técnica no invasiva, totalmente inocua para el sujeto, que consiste en la colocación de electrodos en la su-perficie de la cabeza. En segundo lugar permite obte-ner una medida de la actividad cerebral en contextos en los que una respuesta conductual puede ser pro-blemática o imposible. Con esto, se pretende destacar el hecho de que los PREs pueden registrarse indepen-dientemente de que el sujeto deba realizar una tarea específica o emitir una respuesta motora, por lo que pueden emplearse en pacientes en coma, niños pe-queños o recién nacidos. La tercera ventaja consiste en que el registro de los PREs aporta múltiples datos como son la latencia, amplitud, polaridad y topografía del componente de interés. La cuarta hace referencia a la alta resolución temporal del registro de los PREs –en el orden de los milisegundos− lo que permite es-tudiar la evolución o secuencia de la actividad neuro-nal subyacente a funciones cerebrales superiores.

Al igual que el EEG, los PREs representan la acti-vidad sincrónica de grupos numerosos de neuronas con organizaciones espaciales específicas denomina-das como campos abiertos (Lorente de No 1947). Los campos abiertos son frecuentes en aquellas estructu-ras organizadas por capas, tales como la corteza cere-bral y el cerebelo, en donde las neuronas se ordenan de manera tal que todas sus dendritas están orienta-das hacia un lado de la estructura, en tanto que todos los axones se encuentran orientados al otro lado de la estructura, con lo cual, los campos eléctricos genera-dos por cada neurona estarán orientados en la misma dirección y se sumarán. Se cree además que la mayo-ría de los PREs registrados sobre el cuero cabelludo son producto de la suma de potenciales postsinápti-cos de un gran número de neuronas que son activadas (o inhibidas) sincrónicamente (Allison et al. 1986; Rugg y Coles 1995).

De acuerdo con su origen, es posible clasificar a los PREs como exógenos y endógenos. Los primeros son afectados por las propiedades físicas de un even-to externo (i.e. modalidad del estímulo, intensidad) y poseen una latencia más corta (menor a los 100 ms). Los segundos dependen más de la naturaleza de la interacción entre el sujeto y el evento, es decir por factores tales como la atención, la relevancia de la tarea o el estado del sujeto durante el procesamien-to del estímulo. Respecto a esta clasificación, Rugg y Coles. (1995), consideran que no se trata de una di-cotomía, sino más bien de un continuo. En opinión de los autores basta con advertir que casi todos los componentes tempranos pueden verse afectados por las características físicas del estímulo y muchos de los

componentes tardíos son modificados por manipula-ciones cognoscitivas (i.e. la atención).

Otra clasificación de los PREs se basa en la ocu-rrencia del evento, por lo que éstos pueden ser previos a la ocurrencia del suceso o posteriores a éste (Rugg y Coles, 1995).

Para obtener los PREs se colocan electrodos en va-rias posiciones en la cabeza, siguiendo generalmen-te, las propuestas en el Sistema Internacional 10-20 (Jasper 1958). En dicho sistema, cada localización se define por dos coordenadas: la primera, su proxi-midad a una región concreta del cerebro (prefrontal, frontal, central, temporal, parietal y occipital); y la segunda su ubicación en el plano lateral de la cabe-za (números nones para el lado izquierdo, números pares para el derecho y la letra z para las ubicaciones sobre la línea central).

Para obtener los PREs es necesario registrar la diferencia de voltaje entre dos electrodos. Lo más habitual es calcular esa diferencia entre el electro-do colocado en cada zona de interés y un electrodo común (llamado “referencia común”) que tenga una baja actividad eléctrica (registro monopolar). Dicha referencia habitualmente se obtiene a partir de dos electrodos cortocircuitados (unidos) colocados en los lóbulos de las orejas o en los mastoides (hueso detrás de la oreja).

En virtud de que los PREs son pequeños (sólo algunos microvolts) en comparación con el EEG de fondo (alrededor de 50 μV o más), es imprescindible, para extraer los potenciales del EEG, realizar proce-dimientos para incrementar la discriminación entre la señal (los PREs en sí) del ruido (en este caso, el EEG de fondo). El procedimiento más común para su obtención es la promediación de segmentos (mues-tras) de actividad electroencefalográfica registrados en forma sincronizada con la repetición de un even-to particular (a partir de un momento “cero”) (Gumá 2001; Rugg y Coles 1995). La suposición que motiva esta técnica radica en que la actividad eléctrica que no está relacionada con el evento varía aleatoriamente a lo largo de las distintas épocas registradas, mientras que la actividad relacionada con el evento se manten-drá constante. De esta forma, en el promedio, las fluc-tuaciones aleatorias del voltaje tenderán a igualarse a cero y destacarán una o varias ondas residuales (Nuñez-Peña et al. 2004), constituyendo el potencial de interés.

Para obtener una señal EEG de entrada más lim-pia, la promediación suele acompañarse de otras téc-nicas como las de filtraje (analógico o digital) de las de reconocimiento de patrones (i.e. correlación cruzada) en las que se busca en el EEG regiones de correspon-dencia máxima a partir de ciertos patrones predefi-

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LATEVOLT: PROGRAMA PARA MEDIR FÁCILMENTE AMPLITUDES Y LATENCIAS EN POTENCIALES CEREBRALES RELACIONADOS CON... 29

nidos (épocas con características específicas) (Rugg y Coles 1995).

Después de que el potencial se ha extraído con las técnicas anteriormente expuestas, es necesario anali-zar las características de las ondas que lo constituyen, también denominadas componentes o picos. Para Donchin et al. (1978) un componente debe ser defini-do por la combinación de su polaridad, su latencia ca-racterística, su distribución sobre el cuero cabelludo y su sensibilidad a cierta manipulación experimental. En lo que respecta a la polaridad, los componentes pueden ser positivos o negativos, denominados “P” o “N” respectivamente. La latencia suele medirse to-mando el tiempo en milisegundos desde la presenta-ción del estímulo (tiempo “cero”) hasta la aparición del pico o valle. Por ejemplo, el N400 es una onda negativa que presenta un pico aproximadamente a los 400 milisegundos. Sin embargo, esta denominación basada en la latencia tiene el problema de que en mu-chas ocasiones se emplea para identificar un compo-nente que puede presentar variaciones importantes en su latencia. Tal es el caso del componente P300 que, dependiendo del estímulo, los sujetos y las ma-nipulaciones experimentales, puede llegar a mostrar una latencia en el rango de 300 a 700 ms. Por esta razón, algunos investigadores han propuesto mante-ner la polaridad pero añadir, en vez de la latencia, un número, que indique el orden de aparición del pico (i.e. N2 y P3) (Nuñez-Peña et al. 2004).

La tercera característica definitoria de los compo-nentes, según la propuesta de Donchin et al. (1978), es su topografía o distribución sobre el cuero cabe-lludo, lo que permite determinar si un componente aparece en un lugar concreto o presenta asimetrías hemisféricas. Sin embargo, no es posible atribuir las fluctuaciones en el voltaje recogidas con un electro-do colocado sobre el cuero cabelludo a la actividad de la población neuronal que subyace a dicho electrodo, pues ésta refleja la actividad de múltiples generado-res en el cerebro. De hecho, la actividad registrada en un área concreta del cuero cabelludo puede haberse generado en una localización cerebral distante al elec-trodo donde fue registrada.

Desde una perspectiva psicológica, el principal problema al analizar los componentes de los PREs es el relacionar alguna característica de dichos com-ponentes con un proceso cognoscitivo específico, es-pecialmente porque en la práctica diferentes opera-ciones cognoscitivas son realizadas en paralelo y, por lo tanto, las características de una onda (un pico, por ejemplo) pueden reflejar más de un proceso. Para re-solver este problema se suelen sustraer ondas obte-nidas en distintas condiciones experimentales con la finalidad de separar el componente que represente las diferencias entre condiciones.

Un método común para obtener los picos o com-ponentes asociados con ciertas funciones cognosciti-vas, es el denominado de Componentes Principales, cuyo propósito es identificar fuentes de varianza en un grupo de datos. Particularmente en los PREs, se analizan con este método las variaciones de voltaje en el tiempo durante el registro de una condición, variaciones de voltaje entre distintos electrodos o entre diferentes manipulaciones experimentales. Por lo tanto, el propósito de la utilización del método de Componentes Principales en este contexto es identifi-car aspectos de las ondas que covaríen tanto entre las condiciones experimentales como entre las derivacio-nes (Rugg y Coles 1995).

Ya sea restando potenciales o mediante el método de Componentes Principales, se han logrado identi-ficar componentes como el de Variación Contingen-te Negativa (Contingent Negative Variation, CNV) (para más información ver Gumá 2001); Negatividad Mismatch, N2; P300 (también conocido como P3a y P3b) y N400. Sea cual fuere el método empleado por el investigador para obtener los potenciales, siempre es necesario medir la amplitud y la latencia de los distintos picos que los integran. Para alcanzar este fin, se emplean distintos programas comerciales, los cuales son generalmente muy costosos pues forman parte de sofisticados sistemas de registro y análisis de PREs. Por tal motivo, en el Instituto de Neurocien-cias de la Universidad de Guadalajara se desarrolló el programa LATEVOLT, el cual permite, una vez que se han obtenido los PREs con otros programas (i.e. SCAN 4.4 de la compañía Neuroscan, Mind Tracer de la compañía Neuronic, CAPTUSEN [Guevara et al. 2000], entre otros) inspeccionar de manera visual PREs y calcular de forma automática y simultánea la polaridad, amplitud y latencia de los picos o compo-nentes que lo forman. A continuación se describen las características de LATEVOLT.

Funciones principales

Características del hardware y software requeridos

LATEVOLT ha sido elaborado bajo el ambiente de programación Delphi, para el sistema operativo Win-dows y funciona en cualquier computadora compati-ble con PC que tenga un procesador Pentium o supe-rior con al menos un Mb de memoria RAM. El espacio que requiere en disco duro es el necesario para guar-dar las señales por revisar (señales de entrada), más el espacio ocupado por un pequeño archivo de resul-tados (archivo de salida). Todos los archivos son de texto (tanto los de entrada como el de salida).

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Ejecución del programa

Para poder ejecutar LATEVOLT, se requieren seña-les digitales (discretas en la amplitud y en el tiempo) que contengan potenciales relacionados con eventos (PREs). Cada potencial deberá estar incluido en un archivo de texto, con un dato por renglón. Por ejem-plo, si el potencial consta de 256 puntos, entonces el archivo de texto poseerá 256 renglones.

En la figura 1 se muestra la pantalla inicial de LA-TEVOLT. El primer paso para ejecutar este programa consiste en asignar el “archivo de nombres”, lo cual se consigue presionando en la pantalla el botón con di-cha leyenda. La figura 2 muestra un ejemplo de un ar-chivo de nombres llamado FZ.DIR, el cual contiene 3 archivos de datos (potenciales) a revisar. El archivo de nombres siempre debe ser de texto, con un nombre de archivo (conteniendo un potencial) por renglón (el cursor debe quedar exactamente debajo del último nombre, pues no se aceptan renglones en blanco).

Además del archivo de nombres, se deben pro-porcionar, en la pantalla de inicio, ciertos parámetros (ver figura 1): a) el número de puntos por segmento (incluyendo, si lo hubiera, al preestímulo), estos son los puntos (muestras) que forman al potencial, donde el máximo es 512; b) el número de puntos de preestí-mulo, que son los puntos capturados como línea base justo antes del estímulo que provoca el potencial; c) la frecuencia de muestreo.

Al oprimir el botón “Iniciar el programa” en la pan-talla de inicio, comienza la revisión de cada uno de los archivos (que contienen un potencial) enlistados en el

archivo de nombres (FZ.DIR para el ejemplo) (figura 3). Al aparecer graficado el primer segmento de señal, LATEVOLT ya ha calculado el intervalo entre puntos (se requiere para saber la latencia de los picos que se seleccionen) y los valores máximo y mínimo de todos los potenciales por revisar. Lo anterior permite calcu-lar un factor de escalamiento que hace que todos los potenciales se ajusten en el área de graficación y que sean comparables entre sí.

Al aparecer graficado en pantalla cada uno de los potenciales, aparece un cursor (en color rojo) po-sicionado en el primer punto que conforma al po-tencial (inmediatamente después de los puntos de preestímulo). Este cursor puede ser desplazado ha-cia la izquierda o hacia la derecha, Las teclas “←” ó “0” (flecha o número cero) mueven el cursos hacia la izquierda, y hacia la derecha con “→” ó “.” (flecha o punto decimal).

Fórmulas

LATEVOLT puede graficar un máximo de 512 puntos en la pantalla (incluyendo los puntos de preestímulo). En el algoritmo del programa, el límite vertical del área de graficado se denomina ymax; este valor es uti-lizado como límite para graficar el potencial en el área de graficación. Los valores que contienen los archivos de datos de entrada deberán ser escalados para ajus-tar a ymax como valor máximo. Además, dicho factor de escalamiento deberá permitir que las gráficas de los diferentes potenciales, en pantalla, sean compara-bles entre sí. Para ello, al iniciar el programa, lo pri-

Figura 1. Pantalla de inicio de LATEVOLT. El programa puede ser ejecutado en cualquier com-putadora compatible con PC que funcione con ambiente Windows.

Figura 2. Archivo de nombres (FZ.DIR) que incluye 3 nombres de archivos, cada uno conteniendo un potencial. Los potenciales fueron registrados en la misma derivación (FZ) pero bajo diferentes condiciones (ALVI, MIVI y NEVI).

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mero que se calcula es dicho factor de escalamiento. Primero se calculan los valores máximo (valmayor) y mínimo (valmenor) en las señales a graficar. Las fór-mulas 1 a la 5 ilustran la manera en que se calcula el valor de escalamiento:

(1) Mitad del rangoMedioran = (valmayor-valmenor) / 2.0

(2) El centro del rangoMeddelran = valmenor + medioran

(3) reasignación del valor mayorValmayor = meddelran + medioran

(4) Reasignación del valor menorValmenor = meddelran - medioran

(5) Factor de escalamientoReescala = increy / (valmayor-valmenor)

Cada dato (que forma parte del potencial) antes de ser graficado debe escalarse para que ajuste den-tro de los límites del área de graficación. En datgra (fórmula 6) queda el nuevo valor del dato (listo para ser graficado).

(6) Dato escaladodatgra = (dato-valmenor)*reescala

Revisión de señales con LATEVOLT

Ante cada segmento que aparece graficado en la pan-talla se pueden oprimir diferentes teclas. Las teclas

“←” ó “0” (flecha o número cero) mueven el cursos hacia la izquierda, y hacia la derecha con “→” ó “.” (flecha o punto decimal). Para marcar los picos de in-terés, en el potencial, se pueden presionar las teclas correspondientes a los números del “1” al “9” (figura 3). Con la tecla “-” se procede a graficar el siguiente potencial, con la tecla “+” se grafica el siguiente po-tencial pero sin borrar el anterior (el anterior pasa a ser de color gris): el último potencial graficado siem-pre es de color negro (ver figura 4). Con la tecla “T” se da por terminada la revisión.

Conforme se van revisando los potenciales, el pro-grama crea un archivo de salida, en formato de texto, el nombre de éste diferirá del archivo de nombres so-lamente en la extensión, siendo ahora de tipo LYA; en el ejemplo se llamará FZ.LYA. Como se ilustra en la figura 5, en la parte superior del archivo de salida, aparece la ubicación y el nombre del “archivo de nom-bres”. Posteriormente se presentan, para cada uno de los potenciales revisados, la latencia y la amplitud en cada uno de los picos que fueron marcados (máximo 9 por cada potencial).

Consideraciones

Para que LATEVOLT pueda graficar los PREs, es me-nester que estos se hallen contenidos en señales di-gitalizadas en formato de texto (con un potencial en cada archivo). También es importante tener en cuen-ta que tanto el registro de la actividad EEG como la extracción de los potenciales a través del método de promediación deben realizarse con otros programas (i.e. Scan IV, Track Waker, CAPTUSEN [Guevara et al. 2000]).

Figura 3. Pantalla de LATEVOLT durante la revisión del potencial contenido en el archivo FZALVI.TXT (nombre indicado en la esquina inferior izquierda de la imagen). En este po-tencial el usuario ha marcado 9 picos.

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Discusión y conclusiones

LATEVOLT es un programa computacional para el sistema operativo Windows que permite inspeccionar de manera visual PREs en formato de texto y obtener la polaridad, amplitud (voltaje) y latencia de poten-ciales constituidos hasta para nueve picos.

A diferencia de otros programas costosos que nor-malmente están sujetos a ciertos formatos de captura y/o equipos particulares, LATEVOLT puede graficar y analizar señales provenientes de sistemas de captura de EEG de distintas marcas, basta convertir los archi-vos en formato ASCII (opción presente en la mayoría de los sistema comerciales). Además, no requiere de equipos computacionales sofisticados, funciona en cualquier computadora compatible con PC y sus ar-chivos de salida son almacenados también en formato ASCII, facilitando su posterior manejo, representa-ción gráfica y análisis estadístico. Ya que es flexible y fácilmente adaptable a necesidades experimentales y clínicas, puede ser utilizado eficientemente en pro-yectos de investigación básica y aplicada.

Para fines de investigación científica, LATEVOLT puede ser solicitado a los autores para ser libremente instalado. Lo único que se solicita es que, si se publican resultados en los que se haya utilizado el programa, se cite el crédito correspondiente (esta publicación).d

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Figura 4. Pantalla de LATEVOLT durante la revisión del potencial contenido en el archivo FZNEVI.TXT (nombre indicado en la esquina inferior izquierda de la imagen). En este ejemplo, el usuario ha oprimido la tecla “+” en dos ocasiones, por lo que han permanecido en la pantalla los dos potenciales revisados anteriormente. El último potencial es el que aparece en color negro.

Figura 5. Archivo de salida tipo LYA de LATEVOLT. Nótese como en este ejemplo se revisaron tres potenciales: FZALVI.TXT; FZMIVI.TXT y FZNEVI.TXT. El archivo FZ.LYA muestra la latencia y la amplitud de cada uno de los picos seleccionados por el usuario, que en este caso fueron 9. Los valores de voltaje negativos en la columna de amplitud indican que la polaridad del pico es negativa.

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Pruebas de germinación de dos leguminosasherbáceas con potencial para restaurar bancos de

minería a cielo abierto

Rosa de Lourdes Romo Campos1, Alejandro Muñoz Urias2,Sergio Honorio Contreras Rodríguez1 y José Sánchez Martínez3

1Departamento de Ciencias Ambientales, 2Departamento de Ecología. División de Ciencias Biológicas y Ambientales. 3Departamento de Producción Agrícola. División de Ciencias Agronómicas. Universidad de Guadalajara, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Km 15.5 Carretera Guadalajara-Nogales, Zapopan, Jalisco. Correo electrónico: [email protected]

Resumen

Durante los últimos años se ha registrado la degradación de los suelos del área con-urbana de Guadalajara por cau-sa de la explotación excesiva de la minería a cielo abierto, algunos de estos sitios han quedado abandonados, implan-tándose en forma espontánea especies herbáceas. Debido a las condiciones ambientales limitantes que existen en és-tos suelos, la mayoría de las especies desarrollan mecanis-mos de protección como la latencia en semillas. Este tra-bajo tiene como objetivo establecer el mejor método para romper la latencia en semillas de las especies leguminosas Crotalaria pumila y Aeschynomene villosa var. longifolia, que poseen altos valores de importancia en bancos de mi-nería a cielo abierto abandonados. Se colectaron los frutos maduros y se escarificaron con inmersión en ácido sulfú-rico (H2SO4) al 37.55 N, 15.30 N y 10.20 N; a diferentes periodos de tiempo, 60, 30, 15, 7:35 y 3:40 minutos, las pruebas de germinación se realizaron en una cámara de germinación utilizando 50 semillas y cinco repeticiones. Se encontraron porcentajes cercanos al 100% de germina-ción de C. pumila en ácido sulfúrico al 37.55 N a intervalos de 30 y 60 minutos y de A. villosa se alcanzaron porcen-tajes de 70% con la concentración al 37.55 N a intervalos de 60 minutos. Los porcentajes más altos de germinación se lograron con la inmersión con ácido sulfúrico al 37.55 N durante una 30 minutos en C. pumila y en A. villosa durante 60 minutos.

Palabras clave: Restauración, bancos de material, legu-minosas, escarificación.

Abstract

In recent years there has been the degradation of the met-ropolitan area of Guadalajara, due to overexploitation of open pit mining. Some of these sites have been abandoned, and spontaneously colonized by herbaceous species. Due to the limiting environmental conditions that exist in these soils, most species develop protection mechanisms such as seed dormancy. This paper aims to establish the best method for breaking dormancy in legume species Crotalaria pumila and Aeschynomene villosa var. lon-gifolia, which are highly important in abandoned open strip mining. Mature fruits were collected and scarified by immersion in sulfuric acid (H2SO4) at 37.55 N, 15.30 N and 10.20 N, at different periods of time, 60, 30, 15, 7:35 and 3:40 minutes. Germination tests were performed in a germination chamber using 50 seeds and five repetitions. Percentages close to 100% germination for C. pumila were attained at 37.55 N sulfuric acid at periods of 30 and 60 minutes; for A. villosa rates of 70% were achieved at 37.55 N concentrations at intervals of 60 minutes. The highest percentages of germination were obtained with sulfuric acid immersion at 37.55 N during a 30-minute period for C. pumila and during 60 minutes for A. villosa.

Keywords: Restoration, open pit mining, legumes, scari-fication.

Introducción

En varias regiones del mundo se están utilizando especies nativas para la estabilización de suelos y

rehabilitación de minas (Brooks 1994). Sin embargo la mayoría de dichas especies poseen latencia inhe-rente cuyo significado ecológico es un mecanismo de escape a condiciones ambientales desfavorables, lo

que afecta la rehabilitación de ciertos sitios (Bell et al. 1993).

El uso de las especies nativas con objetivos de res-tauración utilizando poblaciones naturales trae mu-chos beneficios (Coates y Leeuwen 1997) porque ge-neralmente estas comunidades poseen adaptaciones

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a las condiciones ambientales del sitio en términos de sobrevivencia y crecimiento, además presentan una diversidad genética amplia con lo que se promueve la sustentabilidad (Warren 2000). Estas también se uti-lizan con objetivos diversos como la rehabilitación de minas, carreteras y proyectos en desarrollo. El futuro de la biodiversidad en los paisajes dependerá de la ha-bilidad y la eficiencia con que se colecten y se realice la germinación efectiva en dichas especies (Mortlock 2000).

La restauración de zonas naturales exige el uso de especies nativas que aceleren la sucesión, utilizán-dose plantas de procedencia regional, las cuales se propagan para fines de restauración de comunidades vegetales (Piotto 1995). Sin embargo, la revegetación a gran escala requiere de grandes cantidades de se-millas, en las cuales se buscan características que les permitan crecer en condiciones muy desfavorables como son los suelos degradados (Bernhardt 1995). El uso de semillas nativas conlleva a resolver otros pro-blemas como son los requerimientos específicos de la especie para su germinación y consiguiente propaga-ción (Mortlock 2000). Generalmente durante la colo-nización inicial de suelos estériles, la germinación y el establecimiento son erráticos (Greipsson 1999). Una de las limitaciones para la germinación de semillas nativas es la dureza del pericarpio, lo que le confie-re resistencia al paso del agua, esta estructura causa que la germinación sea casi nula, la imbibición la es-carificación química permite romper dicha cubierta (Piotto 1995). Entre los mecanismos más utilizados para romper dicho latencia están la escarificación con ácido sulfúrico (Naidu et al. 1999).

El objetivo de este trabajo fue establecer el mejor método para romper la latencia en semillas de las es-pecies leguminosas Crotalaria pumila y Aeschyno-mene villosa var. longifolia, que poseen altos valores de importancia en bancos de material abandonados.


El trabajo de campo se realizó en un banco de ma-terial geológico a cielo abierto en el predio conocido como “Goterita”, el cual se localiza en el municipio de Zapopan. Sus coordenadas geográficas son 103° 32’ longitud oeste y 20° 44’ latitud norte. El predio tiene una extensión de 9 hectáreas; del cual se ha extraido arena amarilla y jal desde 1978 hasta 1997. Este sitio se ubica en la zona de amortiguamiento del Bosque la Primavera, geológicamente es muy frágil por su origen volcánico-tectónico, por su morfología y por el tipo de roca fácilmente erosionable, como es el caso de la toba y el pómez. A nivel edáfico, los suelos son poco desarrollados (regosoles) por lo que se erosio-

nan fácilmente, al tener poca capacidad de formar agregados (Romo 1998; Suárez et al. 1996).

El 51% de los suelos es de tipo regosol y se presen-ta en 51% dentro de la zona, se consideran con desa-rrollo incipiente y con una fertilidad de baja a mode-rada, estas presentan una alta proporción en arenas pomáceas aportadas por La Primavera que permite la retención de humedad (característica bastante desea-da en la siembra del maíz). Su contenido de materia orgánica es pobre y susceptible a la erosión.

El sitio de colecta de las semillas fue explotado como banco de material geológico a cielo abierto has-ta hace aproximadamente 8 años en que fue aban-donado, estableciéndose una sucesión de vegetación secundaria (Suárez et al. 1996).

Se colectaron los frutos maduros de las especies Crotalaria pumila Ort., y Aeschynomene villosa (Mi-cheli) Rudd., durante los meses de septiembre y oc-tubre, los cuales se deshidrataron exponiéndolos al sol, una vez secos los frutos, se extrajeron las semillas de las vainas ejerciendo presión y fricción sobre ellas utilizando un extractor de semillas de leguminosas, el cual consiste en dos superficies corrugadas con las cuales se ejerció presión sobre las semillas triturando el pericarpio y liberando las semillas intactas; pos-teriormente se tamizaron las semillas por medio de diferente luz de malla de 2, 3 y 4 mm. El tratamiento para escarificar las semillas consistió en la inmersión en ácido sulfúrico (H2SO4) (Cantliffe et al. 1980) al 37.55 N, 15.30 N y 10.20 N, con diferentes intervalos de tiempo, 60, 30, 15, 7:35 y 3:40 minutos, se utili-zó como testigo agua destilada. Se sembraron 50 se-millas en cajas de Petri (9 × 1.5 × 8.5 cm); se utilizó como sustrato arena de suelos de bancos de material, el diseño experimental fue bloques al azar, con cinco repeticiones. Durante el periodo de germinación se adicionó agua destilada cada vez que fuera necesario, las semillas con 5 mm de radícula (Caloggero y Pa-rera 2000) se consideraron germinadas; los datos de la germinación se registraron durante un periodo de ocho días debido a que durante este lapso de tiempo se estabiliza la curva de germinación.

Los porcentajes de germinación fueron transfor-mados con la función raíz cuadrada del arcoseno para obtener distribución normal y cuando no se obtuvo distribución normal se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis y al presentarse diferencias estadísticamente significativas se utilizó la prueba de Student Newman-Keus por medio del programa SigmaPlot versión 5.0.


Crotalaria pumila mostró porcentaje de germinación cercanos al 100%, cuando fueron tratados con H2SO4 37.5 N durante 60 minutos, bajo esta normalidad se

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observó diferencia estadísticamente significativas se-gún la prueba de Kruskal Wallis (H= 26.6, p<0.0001, α=0.05) con respecto al tiempo de inmersión siendo los porcentajes de germinación más altos los obteni-dos con 60 y 30 minutos de inmersión (cuadro 1).

Cuando se utilizó el H2SO4 15.3 N el porcentaje de germinación más alto fue de 47%, en inmersión por 60 minutos. En esta normalidad se observaron dife-rencias estadísticamente significativas según la prue-ba de Kruskal Wallis (H:23.5, p< 0.0001, α= 0.05) y el tratamiento estadísticamente superior fue con 60 minutos de inmersión, seguido por el tratamiento de 30 minutos, el resto de los tratamientos no fue afecta-do por la inmersión de semillas en H2SO4 y cuando se utilizo el H2SO4 a 10.2 N no se observó efecto de esca-rificación en ningún tiempo, según la prueba de Krus-kal Wallis (H= 5.73, p= 0.3324, α= 0.05). Dentro de los intervalos de 7.15 a 0 minutos no se observó efecto de la escarificación por el ácido (cuadro 1, figura 1).

Sin la escarificación, la germinación sería nula (figura 1), lo anterior se corroboró debido a que los porcentajes de germinación se incrementaron sig-nificativamente cuando se aumentó el tiempo de escarificación y la normalidad de ácido sulfúrico, el cual es utilizado en muchas especies para vencer la dureza y la latencia de las semillas, debido a que la cubierta está relacionada con la latencia y dureza de

Cuadro 1. Porcentaje de germinación de semillas de Crotalaria pumila a diferentes tiempos de inmersión en H2SO4 37.5 N, 15.3 N, y 10.2 N.

Tiempo (minutos)

Ácido sulfúrico (Normalidad)

Promedio de Germinación

60 37.5 93 ± 2.5 a

30 37.5 91 ± 2.9 a

15 37.5 30 ± 5.0 b

7.35 37.5 8 ±4.6 c

3.40 37.5 0.0 c

<1 H2O 0.0 c

60 15.3 47 ± 8.1 a

30 15.3 25 ± 4.5 b

15 15.3 3 ± 0.53 c

7.35 15.3 7 ± 1.25 c

3.40 15.3 3 ± 0.53 c

<1 H2O 0.0 c

60 10.2 0.75 ± 0.37 a

30 10.2 0.5 ± 0.22 a

15 10.2 0.25 ± 0.18 a

7.35 10.2 0.0 a

3.40 10.2 1 ± 0.54 a

<1 H2O 0.0 a

las semillas que es una condición frecuente que se presenta en numerosas especies, pero es más común en las siguientes familias: Leguminosae, Malvaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Cannaceae, Con-vallariaceae, Geraniaceae, Gramineae, Lileaceae y Solanaceae (Bewley y Black 1982). La latencia está controlada por las características físicas de la cubierta que las hace impermeable al agua y por lo tanto no permite la germinación de la semilla (Tran y Cavana-gh 1984). El calor y las fluctuaciones de temperatura juegan un papel importante en el rompimiento de la dureza de las semillas de las especies adaptadas a eco-sistemas tropicales, subtropicales y mediterráneos, en los cuales típicamente se experimentan veranos con sequía (Fenner 1992).

Los porcentajes de germinación más altos en A. vi-llosa se observaron cuando se utilizó el H2SO4 a 37.5 N. Obteniéndose porcentajes hasta del 70% cuando las semillas estuvieron inmersas en el ácido por 60 minutos. En esta normalidad se observaron diferen-cias estadísticamente significativas según la prueba de Kruskal Wallis (H=23, p= 0.003, α= 0.05). Con la prueba de comparación de medias se obtienen re-sultados similares con tiempos de 15 y 60 minutos de inmersión en H2SO4, 37.5 N. En las normalidades de 15.3 y 10.2 no se observan diferencias estadísticamen-te significativas según la prueba de Kruskal Wallis

Figura 1. Porcentajes de germinación en A) Crotalaria pumila y B) Aeschynomene villosa var. longifolia a diferentes tiempos de inmer-sión en H2SO4 a 37.5 N, 15.3 N y 10.2 N.

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(H= 10.7, p= 0.118, α=0.05) y (H= 2.25, p= 0.6899, α= 0.05) respectivamente, por lo cual el H2SO4 sólo es efectivo cuando se utiliza al 37.5 N (cuadro 2, figura 1).

Estos resultados son similares a los realizados en leguminosas como los reportados para Lupinus texensis sólo que para esta especie se realizó con 120 minutos (Davis et al. 1991). En las semillas sumergi-das en agua (testigos) falló la prueba para promover la germinación, estos resultados son semejantes a los estudios realizados con otras leguminosas como Lupinus conseti, en donde se realizaron pruebas de germinación utilizando agua sin obtener resultados de germinación (Horn y Hill 1974).

Conclusiones

● Se requiere la escarificación con ácido sulfúrico para lograr la germinación de Crotalaria pumi-la y Aeschynomene. villosa var. longifolia .

● Los mayores porcentajes de germinación encon-trados en C. pumila fueron los tratamientos con ácido sulfúrico 37.5 N y con tiempo de inmer-sión de 30 y 60 minutos.

● Para la escarificación con ácido sulfúrico de las semillas de A. villosa var. longifolia la máxima germinación se presentó con 37.5 N en tiempo

Cuadro 2. Porcentaje de germinación de semillas de Aeschynomene villosa var. longifolia a diferentes tiempos de inmersión en H2SO4 a 37.5 N, 15.3 N y 10.2 N.

Tiempo (minutos)

Acido Sulfúrico (Normalidad)

Promedio de Germinación

60 37.5 70 ± 5.7 a

30 37.5 50 ± 7.25 a

15 37.5 54 ± 1.8 a

7.35 37.5 11.8 ± 1.5 b

3.40 37.5 13.6 ± 1.25 b

<1 H2O 0.0 c

60 15.3 0.0 a

30 15.3 2.5 ± 0.74 a

15 15.3 0.0 a

7.35 15.3 0.0 a

3.40 15.3 0.5 ± 0.22 a

<1 H2O 0.0 a

60 10.2 0. 0 a

30 10.2 0.25 ± 0.17 a

15 10.2 0.0 a

7.35 10.2 0.25 ± 0.18 a

3.40 10.2 0.5 ± 0.35 a

<1 H2O 0.0 a

de inmersión a 60 minutos, por lo tanto ya no es necesaria la inmersión a normalidades más bajas y a diferentes intervalos de tiempo.

Agradecimientos:

A Javier García Velasco y Edgar López Borja por sus sugerencias para mejorar el manuscrito.d

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Propiedades antinómicas de las poliaminas en los dominios Archaea y Eubacteria y su microambiente

Ramón Reynoso Orozco, Gerogina Ivette López Cortés y Alfonso Enrique Islas Rodríguez

Departamento de Biología Celular y Molecular-CUCBA, Universidad de Guadalajara. Km 15.5 carretera a Nogales, predio Las Agujas, Nextipac, Zapopan, Jalisco, México. Tel. 01(33) 37771150. Correo electrónico: [email protected]

Resumen

En este trabajo se revisan los aspectos antinómicos de la Poliaminas Biogénicas (PB). Por un lado se hace énfasis en su función como moléculas esenciales para el crecimiento celular normal y por otro su propiedad antimicrobiana. Se correlacionan aspectos evolutivos de Archea y Eubacteria con las PB y su microambiente. Se analiza la susceptibi-lidad bacteriana a las PB: Putrescina (Pu), Espermidina (Spd), y Espermina (Spm), y se dan ejemplos experimenta-les de la acción de la Pu, la Spd, y la Spm contra la bacteria G- E. coli, en los cuales se puede apreciar el efecto antimi-crobiano directo, en un bioensayo in vitro dosis respuesta de las tres PB; Pu, Spd y Spm por separado. Por último se revisa el caso de la distribución bacteriana en el tracto digestivo humano y su aporte o consumo de PB, desde el punto de vista biomédico, con el objeto de describir la in-fluencia de la microbiota en el hospedero y viceversa.

Abstract

The present work was aimed to review of the antinomy effects of Biogenic Polyamines (BP). It is clear that some BP (BP; Putrescine (Pu), Spermidine (Spd) and Spermine (Spm) affects the growing properties of normal cells, but have antimicrobial properties. It has been correlated the evolutionary aspects of Archea and Eubacteria with BP and its microenvironment. Furthermore it is shown here, sev-eral examples of experimental data from our laboratory, where we can see a direct antimicrobial effect of each of the three BP on G- E. coli bacteria trough a dose response bio-assay. At last it is discussed, with the purpose of describing their mutual influence, the case of the distribution of the microbiota in the gastrointestinal tract, and the income and outcome of BP, from the biomedical point of view.

Introducción

Las poliaminas biogénicas (PB), en especial pu-trescina, espermidina y espermina son moléculas

esenciales para el crecimiento celular normal, y su contenido en la célula es regulado por la biosíntesis, la degradación, la incorporación exógena y su excre-ción (Higashi 2008). Sin embargo, también se les ha reportado un efecto contrario. Tienen la propiedad antimicrobiana, la cual no ha sido suficientemente discutida y menos aplicada. Dichas PB son compues-tos catiónicos esenciales en todos los organismos vi-vos (Agostinelli 2004; Gugliucci 2004). Dentro de las células, estas moléculas cargadas positivamente están asociadas principalmente a macromoléculas acídicas, tales como el DNA genómico y el RNA ribosomal, op-timizando su funcionamiento. Sin embargo ante un exceso en su concentración y cambios en el pH, su efecto puede ser el contrario. La participación de las

PB en múltiples funciones celulares, como la expre-sión génica, ha sido estudiada intensamente en Euca-riontes y en Procariontes (Kwon 2007). En Procarion-tes se conoce mejor el modelo de E. coli (Barry 2011), no así en otras especies de bacterias. Por ejemplo en Helicobacter pylori no se conocen completamente las vías de síntesis de las PB, aunque pueden poseer vías únicas, como en otras bacterias que no se les ha en-contrado un número de enzimas biosintéticas (Tomb 1997; Alm 1999; Baltrus 2009; Oh 2006). Además, de acuerdo a Barry (2011), las secuencia del genoma de H. pylori no contiene las correspondientes secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas trans-portadores de PB. Sin embargo, el análisis de secuen-cias genómicas microbianas indica que probablemen-te están presentes en muchos patógenos del humano, tanto Gram+ como Gram-, así como en Archeas, leva-duras y protozoarios (Shah 2008).

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RAMÓN REYNOSO OROZCO, GEROGINA IVETTE LÓPEZ CORTÉS Y ALFONSO ENRIQUE ISLAS RODRÍGUEZ42

Susceptibilidad Bacteriana a Antibióticos en Combinación con PB

Es importante destacar que las PB pueden rescatar la susceptibilidad a antibióticos convencionales, de bacterias resistentes como E. coli, P. aeruginosa, y S. enterica serovar Typhimurium, así como Gram+, como S. aureus, incluyendo las cepas resistentes a Meticilina, en cuyo caso, en presencia de las PB, dis-minuye la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) para β-lactámicos y cloranfenicol.

Sin embargo, de manera controversial, en el caso de Pseudomonas aeuroginosa PÁO1, se incrementa la MIC para péptidos catiónicos, aminoglicosidos y quinolonas (Kwon 2007).

Los mecanismos moleculares que subyacen en di-chas respuestas antagónicas no se conocen aún, por lo que será necesario más investigación (Kwuon 2006).

La propuesta aplicativa es desarrollar modelos in vivo (Matsumoto 2011) en donde se aproveche el po-sible sinergismo entre los antibióticos usados en la te-rapia de enfermedades infecciosas por bacterias que se verían favorecidos con la incorporación terapéutica de las PB.

La intención de esta revisión es poner de relieve el efecto antinómico de las PB. Por un lado son factores de crecimiento o activadores del ciclo celular debido a que en su presencia los procesos de replicación, trans-cripción y traducción de la célula son más eficientes y por otro lado las PB también muestran un efecto antimicrobiano en determinadas condiciones de pH, temperatura, y concentración, cuyo mecanismo está por elucidarse (Carlson 2009).

La principal poliamina en las Eubacterias, la pu-trescina (Pu), es sintetizada por descarboxilación biosintética de la arginina y/o del aminoácido secun-dario ornitina (Moore 1990; Tabor 1987). A su vez la Pu es fuente de la espermidina (Spd), debido a que se metaboliza por adición de un grupo propilaminado, como sucede en los Eucariontes.

En la figura 1 se muestra un ejemplo del efecto an-timicrobiano de la Pu, sobre la bacteria G- E. coli por medio del bioensayo que mide actividad antimicro-biana (Peck 2002; Dalgaard 1994)

Spd y Spm no sufren catabolismo en E. coli aun-que las concentraciones en exceso son neutraliza-das por acetilación, de la enzima especie-específica, acetiltransferasa de PB (Fukuchi 1995; Limsuwun 2000). La espermina (Spm), la poliamina más larga comúnmente producida en Eucariontes, no es sin-tetizada por E. coli (Carlson 2009). Sin embargo su incorporación exógena satisface sus requerimientos, (Kakegawa 1991; Xaplanteri 2005). El metabolismo de las PB en Eubacterias se estimula por una variedad de condiciones de estrés como el choque térmico, pH extremo (Harper 1991), entre otras.

La figura 2 muestra un ejemplo del efecto antimi-crobiano de la Spd y la Spm, sobre la bacteria G- E. coli por medio del bioensayo que mide actividad anti-microbiana (Peck 2002; Dalgaard 1994)

Archaea y Eubacteria, y su microambiente

Como se sabe, en los procariontes se distinguen dos grupos importantes de organismos tanto genética como bioquímicamente. Por un lado, las Eubacterias como E. coli de la cual se conoce muy bien que PB sintetiza, y por otro las Archaea, que se subdividen en Thermofilas que sintetizan las primeras PB naturales encontradas que son; Termina y Caldina en el caso del género Caldariella (o Sulfolobus). Las bacterias Ha-lófilas extremas carecen de dichas PB, pero contienen Agmatina y las bacterias Metanógenas anaerobias presentan algunas especies que sintetizan Spm. La relación de los procariontes con las PB que producen, puede estar asociada con su nivel evolutivo, aunque probablemente no es así en sus sistemas de transpor-te transmembranal (Shah 2008).

En el caso de las bacterias se sabe que sus lípidos están formados de enlaces éster, mientras que las

Figura 1. En la gráfica se puede observar el número de unidades formadoras de colonias (CFU) de E. coli,±la desviación estándar, en presencia de concentraciones crecientes de la Pu, comparadas con un control de PBS pH 7.2. Se puede observar que en todas las concentraciones probadas existe un efecto antimicrobiano.

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PROPIEDADES ANTINÓMICAS DE LAS POLIAMINAS EN LOS DOMINIOS ARCHAEA Y EUBACTERIA Y SU MICROAMBIENTE 43

Archeas tienen enlaces éter; además, en las mismas biomoléculas el esqueleto de fosfato en bacterias es como en los eucariontes, el fosfato está unido en la posición 3 del glicerol, sin embargo en Archea el fos-fato está unido por la posición uno del glicerol. En general se considera el metabolismo de Archea como “tipo-bacterial”. La parte central del aparato de trans-cripción y sus factores de elongación de la traducción de Archea corresponden a los de “tipo-eucariota”. De forma similar Archea puede generar gas metano, mientras que las bacterias no. Sin duda, el hecho de que las bacterias sean patógenas y las Archae no, pa-rece tener una relación directa con su dependencia de Spm que proviene del huésped, mientras que las Archea no dependen del hospedero para disponer de Spm, debido a que producen su propia Spm (Cavic-chioli 2011). Ésta última evidencia parece hacer a la Spm una molécula indispensable para la homeostasis celular, sin embargo es necesario demostrarlo experi-mentalmente.

Como se mencionó, la Eubacteria E. coli, adaptada a ambientes más restringidos, es incapaz de sintetizar Spm, sin embargo Archaea que sí producen Spm se han adaptado a una gran diversidad de hábitats extre-mos (Martinac 2008). Las PB son requeridas para el crecimiento normal de E. coli, aunque su mecanismo preciso de acción, empieza ha ser entendido (Chatto-

padhyay 2003; Minton 1990; Yoshida 2004). Se co-noce, que las PB se unen a ribosomas y a los ácidos nucléicos, y son necesarias para su funcionamiento óptimo (Kakegawa 1991; Xaplanteri 2005). Las PB se asocian con la síntesis del DNA, la transcripción, la traducción y la actividad enzimática (Tabor 1976; Young 1972).

Las PB: Pu, Spd, y Spm, consideradas clásicas, son inductoras de la regulación global de genes, que con-ducen, como se ha dicho, al crecimiento óptimo en E. coli (Yoshida 2004). Sin embargo, el exceso en su concentración intracelular, retarda la síntesis de pro-teínas y por lo tanto el crecimiento celular (He 1993).

En los procariontes, existe una relación directa entre el contenido de PB, y la etapa de crecimiento de dichos microrganismos, cuando su concentración intracelular alcanza valores milimolares (Igaras-hi 2000; Igarashi 2006). Después que un cultivo se desarrolló toda la noche, con un medio definido de glucosa, E. coli puede contener menos del 1% de Spd, comparado con el crecimiento exponencial. En el caso de Lactobacillus casei, no se rebasa las 200 moléculas de la misma Spd, por célula después del crecimien-to nocturno, pero su valor puede incrementarse a 1.4 ×105 durante el crecimiento exponencial. Dicho valor regresa a sus niveles más bajos cuando el cultivo lle-ga a su fase estacionaria. Sin embargo, no se sabe si

A

B

Figura 2. En las gráficas se puede observar el número de unidades formadoras de colo-nias (CFU) de E. coli,±la desviación estándar, en presencia de concentraciones crecientes de la Spd (A) y de Spm (B), comparadas con un control de PBS pH 7.2. A diferencia de la Pu, los resultados muestran un efecto dosis respuesta típico de las concentracio-nes probadas en donde existe un efecto antimicrobiano mayor, conforme es mayor la concentración de la PB.

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el incremento de la Spd, o las otras PB, se relaciona con la inducción de la construcción de algún elemento particular de la estructura bacteriana y/o función(es) celulares, o bien el papel esencial de las mismas en la vida del organismo, además de la naturaleza molecu-lar de su interacción con otros componentes celulares (Cohen 1998).

La Spd y Spm se consideran factores de crecimien-to para algunas bacterias, sin embargo muestran an-tinómicamente, una actividad antibacteriana, que es usada como antibiosis mutua, con fines adaptativos de predominio, lo cual se explica por los efectos a nivel de la replicación, transcripción y traducción de mane-ra especie-específica de las PB (Kwon 2007), depen-diendo de las condiciones del medio (Cohen 1998). Por otro lado, Spm y Spd contribuyen a la virulencia de Streptococcus pneumonia a través de mecanismos aún no descritos (Ware 2006). Aunque la biosíntesis y mecanismos de transporte de las PB mismas, se re-conocen como factores de virulencia involucrados en múltiples aspectos de patogénesis bacteriana (Shah 2008). Por último, el efecto antimicrobiano de Spd y Spm se divide en efecto directo y efecto sinérgico, adi-cionadas al suero, a fluidos corporales o a antibióticos (Kwon 2007).

Distribución bacteriana en el tracto digestivo humano

Hasta ahora se ha hecho énfasis en aspectos evolu-tivos de las PB en los Procariontes, sin embargo, la interacción de PB de las bacterias de la microbiota normal en el tracto digestivo, desde el punto de vis-ta biomédico, sugiere que en el ambiente extracelular altamente ácido del estómago de los mamíferos, todas las PB de origen bacteriano se encuentran completa-mente ionizadas pero son incapaces de unirse a las moléculas de la célula huesped que poseen la misma carga (Michael 1999). Las condiciones de pH en el tracto digestivo son determinantes en la interacción entre las PB producidas por bacterias en el tejido lo-cal (Stearns 2011). En esta misma región del tracto digestivo, las PB permiten la sobrevida y crecimiento de E. coli y de otras bacterias como Bifidobacterium animalis en ambientes ácido extremo (Samartzidou 2003; Matsumoto 2011), a dicho fenómeno se le co-noce como resistencia acídica o sobrevida ácida (Fos-ter 2004; Slonczewski 1996). En el caso de las PB en-dógenas, producidas por E. coli, éstas bloquean a las porinas de su propia membrana bacteriana (OmpF y OmpC), disminuyendo la permeabilidad (Samartzi-dou 2003; Samatzidou 1999), lo que podría explicar su resistencia. De tal manera que las PB exógenas no penetrarían a través de las porinas OmpF y OmpC, evitando su probable efecto antibacteriano (Yohan-

nes 2005), demostrado in vitro. En el caso del estrés oxidativo in vivo, se induce una respuesta adaptativa que involucra la producción de proteínas con funcio-nes protectoras como la superoxidodismutasa (Shah 2008).

Ya en el intestino, específicamente en el colon del humano, las bacterias de la microbiota normal, excre-tan Pu y Cadaverina (Cad), durante la digestión de ali-mentos ricos en proteína (Milovic 2003), lo cual tiene un efecto protector en el tejido local, previniendo la diseminación bacteriana dentro del epitelio intesti-nal. Lo anterior ha sido confirmado en experimentos de pérdida de expresión génica (Shah 2008; Matsu-moto 2011).

Además, de manera importante e interesante las PB inducen la proliferación celular del epitelio coló-nico, lo cual aumenta la longevidad en ratones (Mat-sumoto 2011), pero, pueden contribuir al desarrollo de tumores de colon. Dichos tumores pueden ser tra-tados con drogas que disminuyen el contenido de PB (Turchanowa 2001). Por lo anterior, la modulación del metabolismo de las PB, en las condiciones del am-biente intestinal es un blanco terapéutico importante (Yohannes 2005).

La incorporación de las PB al interior de la célula bacteriana es dependiente del ambiente de pH básico, y podría aumentar a través de transportadores de tipo “cassette” de unión a ATP (Tabor 1966; Shah 2008). Las PB se desprotonizan, neutralizándose, lo que les permite cruzar la membrana celular como una base débil. Ya en el interior, la inhibición del crecimien-to bacteriano por exceso de PB se amplifica también (Dubin 1960; Iyer 2000). El exceso mencionado pro-duce un estrés en las bacterias, que implica el decre-mento en la traducción de la subunidad sigma RpoS, perteneciente a la RNA polimerasa, que está impli-cada en la fase de crecimiento de E. coli o de alguna bacteria patógena (Yoshida 2002; Farrel 2003). El pH intestinal, favorece la incorporación de PB al inte-rior de las bacterias vía porinas y en el tejido local vía caveolas (Yohanes 2005; Roy 2008; Kimberly 1981; Ignatenko 2011).

Agradecimientos

Al Dr. Mario Noa Pérez por sus amables comentarios al texto del presente artículo. d

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Niveles de fertilización orgánica mediante humus de lombriz en el cultivo de la jamaica Hibiscus sabdariffa L

Aurelio Pérez-González, Benito Monroy-Reyes, Enrique Pimienta-Barrios, Pedro Posos-Ponce, Vicente Antonio Aceves-Núñez, Jorge Raúl Toral-Flores y Javier Carreón-Amaya

Km 15.5 Guadalajara - Nogales, Predio las Agujas, Nextipac, Jalisco. c.p. 45110. Correo electrónico: [email protected]

Resumen

El presente trabajo se realizó en los municipios de Tlajo-mulco de Zúñiga y Villa Corona en el estado de Jalisco y tuvo como objetivo conocer el nivel óptimo de nutrición orgánica en el cultivo de la jamaica Hibiscus sabdariffa L., con el humus de lombriz, y el lixiviado de humus de lombriz aplicado al suelo y al follaje. Para ello se realiza-ron cuatro experimentos en dos municipios del estado, se utilizó como material genético la semilla de jamaica de la variedad “Americana” con un hábito de crecimiento de 135 días a cosecha. En los resultados obtenidos para el caso humus de lombriz lixiviado de aplicación al follaje se pro-baron tres dosis, y la que mejor comportamiento tuvo fue la de tres aplicaciones con intervalos de siete días entre cada una, iniciando en la tercera etapa fenológica (desa-rrollo foliar), el T3 fue de 10 litros de lixiviado diluidos en 200 litros de agua ha-1 en tres aplicaciones, y en el caso de humus de lombriz, el mejor tratamiento fue el T3 con 7.96 ton ha-1, aplicado 15 días antes de la siembra.

Palabras clave: humus de lombriz, cáliz seco, rendimien-to, lixiviado.

Abstract

The present work was carried out in the municipalities of Tlajomulco de Zúñiga and Villa Corona in the state of Jalisco, with the objective to know the optimal level or or-ganic nutrition in the cultivation of jamaica Hibiscus sab-dariffa L, with the vermicompost and leachate applied to the soil and foliate. Four experiments were carried out in different municipalities of the state; it was used as genet-ic material to the American variety with an intermediate habit of 135 days. In the results obtained for the case of the liquid vermicompost three doses were proven, and the one that better behavior had was that of three applications with intervals of seven days among each other, the treat-ment was of 10 liters of vermicompost diluted in 200 liters of water ha-1, beginning the first application in the third stage phenology that is that of development to foliate (60 days after the sowing). For the case of the solid vermicom-post solid the better treatment was T3 with 7.96 ton ha-1, applied 15 days before seeding.

Key words: vermicompost, dry chalise, yield, leachate.

Introducción

La República Mexicana se caracteriza por tener las diferentes condiciones agroecológicas que per-

miten el establecimiento y desarrollo de una amplia gama de cultivos agrícolas. Sin embargo, existen algu-nas especies que no ha sido posible su expansión de-bido a que se desconoce su tecnología y perspectivas de mercado. Tal es el caso del cultivo de la jamaica, que a pesar de su escaso conocimiento técnico pro-ductivo, es una opción rentable para los productores agrícolas.

En México, el cultivo de la jamaica es de parti-cular importancia por los diversos usos potenciales que tiene. En la actualidad se cultiva en los estados

de Guerrero, Oaxaca, Nayarit, Michoacán, Campeche, Colima y Jalisco. En Guerrero se siembran aproxima-damente 15 mil hectáreas bajo condiciones de tempo-ral asociadas con maíz, ubicadas en la región cono-cida como Costa Chica, las cuales por su volumen de producción constituyen la zona “jamaiquera” de ma-yor importancia, de ahí que se le conozca en esta zona como “Oro rojo”.

El presente trabajo se justifica al proponer el uso de una fertilización orgánica aplicada al cultivo de la jamaica, lo que daría como resultado la protección al agroecosistema, y a la vez, ofrecer al productor agrí-

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AURELIO PÉREZ-GONZÁLEZ ET AL.48

cola la oportunidad de generar mayor captación de recursos económicos.

La creciente demanda de alimentos ha propiciado la sobreexplotación de los suelos cultivables, con tec-nologías de la agricultura desarrollada, en busca de altos rendimientos con un consumo alto de productos químicos (López et al. 2004).

La agricultura moderna (revolución verde) aplica-da en países desarrollados se ha caracterizado por un gran consumo de fertilizantes, pesticidas, herbicidas, riego, antibióticos, maquinaria, etcétera, generando una mecanización destructiva, el monocultivo y la concentración de tierras en busca de la exportación y provocar el deterioro del medio ambiente. Otros efectos son la deforestación y la desertificación, esti-mándose una pérdida de 24 millones de toneladas de suelos orgánicos y de 5 a7 millones de hectáreas de tierra arable (García Trujillo 1993).

La incorporación de mejoradores orgánicos al suelo, generalmente ha permitido incrementar la pro-ducción de los cultivos debido a los cambios físicos, químicos y biológicos que ocurren en el suelo y que benefician al desarrollo de la planta (Compagnoni y Potzolu 2001).

La tendencia mundial para el consumo de alimen-tos se está encaminando a los productos agrícolas libres de agroquímicos, con un enfoque claro hacia la agricultura sustentable y orgánica. Desde el año de 1970 en Japón surge el concepto de la “Agricul-tura Orgánica”, pero es hasta el año de 1991 cuando se aplicó el reglamento de la Comunidad Económica Europea (CEE) en la producción y comercialización, lo que obliga a que los productos no tengan indicios de herbicidas, fungicidas, fertilizantes inorgánicos, e insecticidas (Fujii et al. 1991).

El concepto de desarrollo sustentable en agricul-tura, expresado como “Agricultura sustentable” de acuerdo con Neugebauer (1993), considera al agricul-tor como el objeto del desarrollo, y no según lo in-terpreta el concepto economista como un insumo al proceso de producción que conduce al desarrollo.

La problemática ecológica que aqueja al mundo y desde luego a México, revela que cada vez se hace me-nos operante seguir practicando las formas tradicio-nales de la producción de alimentos que provienen de la agricultura, cuyas prácticas promueven la sobreex-plotación, degradación y contaminación de recursos tales como el agua y el suelo, reduciendo la sostenibi-lidad de la agricultura (Uribe 2005).

En la producción orgánica de cálices de jamaica se queda prácticamente toda la materia orgánica en el área de influencia de la planta y ésta enriquece así el suelo con la aportación de la biomasa (Ndegwa 2001). También en la producción de jamaica debería prio-rizarse el mejoramiento y la productividad del suelo,

en el sentido de rescatar materia orgánica, microor-ganismos y mejorar la estructura del suelo dentro del sistema de la sustentabilidad, utilizando biorremedia-dores del suelo, como podrían ser la incorporación de la lombriz roja de California Eisenia foetida, la cual ha dado resultados sorprendentes al remediar suelos contaminados con hidrocarburos (González 2001).

El interés que suscita el uso de la lombriz para aprovechar los recursos orgánicos en descomposición (Atiyeh et al. 2001) permite mejorar la estructura de los suelos, gracias a la porosidad, aireación, drenaje y retención de agua que tiene la composta producida mediante el estiércol de algunos animales procesa-dos en el tracto digestivo por la ingesta de la lombriz roja de California (Edwards 1998). Los minerales que contiene presentan bajas cantidades de sales con una gran capacidad de intercambio iónico (Albanell et al. 1998), aportan sustancias activas reguladoras para el crecimiento de la planta.

Estas sustancias activas son el nitrato, fósforo y agregados solubles (potasio, calcio y magnesio) fáci-les de asimilar por las plantas, y que han sido pro-cesados por el tracto digestivo de las lombrices, lo que permite a cualquier planta nutrirse mediante la incorporación de este tipo de compostas (Orozco et al. 1996). Se ha confirmado que los desechos orgáni-cos tratados con la lombriz roja de California Eisenia foetida tienen efectos benéficos en el crecimiento y desarrollo de las plantas con ciclos más cortos y con mayor producción.

Por su parte López et al. (2004) señalan que el abono orgánico de cualquier origen aunado a la la-branza de conservación, así como la labranza cero permiten mejorar las condiciones físicas y químicas del suelo, y afectan de manera positiva en el rendi-miento de los cultivos.

El objetivo de este trabajo fue evaluar el compor-tamiento productivo del cultivo de la jamaica en di-ferentes condiciones de fertilización orgánica, por lo que se planteó la siguiente hipótesis: La evaluación del comportamiento productivo del cultivo de la ja-maica en diferentes condiciones de manejo de humus de lombriz y lixiviado, permitirá ofrecer una opción rentable a los productores.


El presente trabajo se realizó en los municipios de Tlajomulco de Zúñiga en las coordenadas 20° 28’ de latitud norte y 103° 27’ de longitud oeste, a una ele-vación de 1575 metros sobre el nivel del mar, y Villa Corona en las coordenadas 20° 14’ 30’’ y 20° 33’ 00’’ de latitud norte y 103° 37’ 00’’ a los 103° 49’ 00’’ de longitud oeste, a una elevación de 1330 metros sobre el nivel del mar. El clima es templado con tempera-

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NIVELES DE FERTILIZACIÓN ORGÁNICA MEDIANTE HUMUS DE LOMBRIZ EN EL CULTIVO DE LA JAMAICA HIBISCUS SABDARIFFA L 49

tura promedio de 21 °C, mínima de 4 °C y máxima de 32 °C, con tres días por año de riesgo a heladas; precipitación pluvial de 840 mm anuales.

Se seleccionaron suelos agrícolas en los dos mu-nicipios con un pH de 6.7; esas parcelas en los últi-mos cinco años se sembraron con maíz de temporal utilizando semilla híbrida, herbicidas y fertilización química a base de urea y súper fosfato triple.

En los experimentos las variables que se midieron fueron las responsables de las características fenoló-gicas del cultivo: diámetro basal del tallo en cm, altu-ra de planta en cm, número de ramas, número de cáliz por rama y por planta, y peso de cáliz seco. Se utilizó como humus la transformación de la materia orgáni-ca por el proceso digestivo de la lombriz de California, y el lixiviado de ese producto para la forma líquida.

La siembra se realiza en forma manual depositan-do tres semillas, con la variedad de jamaica “Ameri-

Cuadro 1. Tratamientos evaluados a base de humus de lombriz y lixiviado.

Tratamiento Dosis Equivalente

Humus de lombriz

T1 133 g/planta 5.32 ton ha-1



Lixiviado

T1 10 l ha-1 una aplicación 10 L en 200 de agua ha-1

T2 10 l ha-1 dos aplicaciones 20 L en 400 de agua ha-1

T3 10 l ha-1 tres aplicaciones 30 L en 600 de agua ha-1

cana”, y una densidad aproximada de 40,000 plantas ha-1.

Se realizó ensayos de germinación para determi-nar vigor de la semilla en laboratorio en condicio-nes óptimas y controladas de acuerdo al protocolo internacional de AOSA (Association of Official Seed Analysts 2003) quien cita “el vigor de las semillas re-presenta aquellas propiedades que determinan su po-tencialidad para una emergencia rápida, uniforme y para el desarrollo de plántulas normales, bajo un am-plio rango de condiciones de campo”. Y se encontró que el 87% de la semilla fue viable y con vigor, 5% se-milla dañada y 8% inviable que aunque no mostraba daño aparente o visual no germinó. Por esta situación se tomó la decisión de sembrar tres semillas por vez.

De las plantas muestreadas, se cosechó el cáliz el cual se desprendió de la cápsula en donde quedó la se-milla y se pesó en la balanza granataria digital marca Ohaus, se deshidrataron los cálices de la jamaica en horno con circulación de aire a 70 °C hasta peso cons-tante y se pesaron nuevamente en balanza granataria digital para determinar el peso seco.

Experimento con humus de lombriz en Villa Corona, y Tlajomulco de Zúñiga Jalisco, 2005

El diseño experimental empleado fue de bloques al azar con cuatro tratamientos y cuatro repeticiones con una parcela experimental de cuatro surcos de

Cuadro 2. Caracterización química de humus de lombriz utilizado en el experimento en las localidades de Villa Corona, Jalisco y Tlajomul-co de Zúñiga, Jalisco.

Determinaciones Método Humus de lombriz

Materia orgánica % Gravimetría 29.1

Cenizas % Gravimetría 70.9

C orgánico % Calculado 16.9

Nitrógeno total % Kjeldahl 1.37

R C/N % Calculado 12.3

Fósforo total % Espectrofotómetro 1.44

Potasio total % Absorción atómica 1.34

Sodio total % Absorción atómica 0.40

Calcio total % Absorción atómica 3.66

Magnesio total % Absorción atómica 0.72

pH Potenciómetro 7.3

Conductividad eléctri-ca (mmhos/cm )

Conductímetro 2.25

Humedad % Gravimetría 41

Densidad Gravimetría 0.84

Cuadro 3. Caracterización química de lixiviado de humus de lombriz utilizado en el experimento en las localidades de Villa Corona, Jalisco y Tlajomulco de Zúñiga, Jalisco.

Determinaciones MétodoBase Húmeda

Lixiviado de humus

Materia orgánica % Gravimetría 0.31

Cenizas % Gravimetría 0.28

C orgánico % Calculado 0.18

Nitrógeno total % Kjeldahl 0.01

R C/N Calculado 18

Fosforo total ppm Espectrofotómetro 51

Potasio total % Absorción atómica 0.09

Sodio total % Absorción atómica 0.02

Calcio total % Absorción atómica 0.03

Magnesio % Absorción atómica 0.01

pH Potenciómetro 7.5

Conductividad eléctri-ca (mhos/cm )

Conductimetro 0.98

Humedad % Gravimetría 0.59

Ácidos húmicos Kononova 0.19

Ácidos fúlvicos Kononova 0.10

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10.0 m y una parcela útil de 20 plantas de los dos surcos centrales. Se utilizó para el T1 5.32 ton ha-1 de humus equivalente a 133 g por planta; para el T2 6.64 ton ha-1 de humus equivalente a 166 g por planta; para el T3 7.96 ton ha-1 de humus equivalente a 199 g por planta, y un T4 testigo absoluto sin abono.

Manejo agronómico: la siembra se realizó el 20 de junio para Villa Corona y el 29 de junio de 2005 para Tlajomulco, a tierra seca, con siembra directa 3 semillas por golpe, a una distancia entre plantas de 33 cm y una separación entre surcos de 80 cm, lo que arroja una densidad de población de 37,878 plantas ha-1. Para el control de maleza se realizó una rastra de presiembra y se aprovechó para la incorporación del humus de lombriz, y posteriormente durante el culti-vo se realizaron dos deshierbes manuales con azadón.

Experimento con humus de lombriz lixiviado en Villa Corona, y Tlajomulco de Zúñiga Jalisco, 2005

El diseño experimental empleado fue de bloques al azar con cuatro tratamientos y cuatro repeticiones con una parcela experimental de cuatro surcos de 10.0 m y una parcela útil de 20 plantas de los dos surcos centrales, se utilizó para el T1 una aplicación de lixiviado de humus de lombriz al 10% (un litro en diez de agua); para el T2 dos aplicaciones de lixivia-do al 10%; para el T3 tres aplicaciones de lixiviado al 10% de humus de lombriz, y un T4 testigo absoluto sin abono.

Manejo agronómico: la siembra se realizó el 20 de junio de 2005 para Villa Corona y el 29 de junio de 2005 para Tlajomulco, a tierra seca, con siembra di-recta 3 semillas por golpe, a una distancia entre plan-tas de 33 cm y una separación entre surcos de 80 cm, lo que arroja una densidad de población de 37,878 plantas ha-1. Para el control de maleza se utiliza una rastra de presiembra y dos deshierbes manuales. La primera aplicación de lixiviado de humus de lombriz se realizó en la tercera etapa fenológica, es decir en el desarrollo foliar, y las otras dos aplicaciones después de siete días de aplicada la primera.

Análisis estadísticos

Los resultados se analizaron mediante el paquete es-tadístico Rohm and Haas Company “Master”, versión 2000, con un nivel de confianza P=0.05n Tukey’s en la forma siguiente:

Los datos se capturaron en la bitácora de campo, y después en una hoja de cálculo electrónico en el pro-grama Microsoft Excel, se realizaron seis columnas, para cada una de las variables y se obtuvieron los pro-medios de cada variable de estudio. Una vez realizada

esta operación, los datos así obtenidos se trasladaron al programa Master y se capturaron electrónicamente para su análisis estadístico.


La incorporación de mejoradores orgánicos al sue-lo, generalmente ha permitido incrementar la pro-ducción de los cultivos debido a los cambios físicos, químicos y biológicos que ocurren en el suelo y que benefician al desarrollo de la planta. Dentro de ellos, el humus de lombriz es considerado como el mejor abono orgánico que existe. En Cuba se han utilizado lombricompuestos con la calidad requerida para ser usados como complemento o sustituto de la fertili-zación química, lo que coincide con los resultados de este estudio (Compagnoni y Potzolu 2001), lo ante-rior coincide con lo encontrado en las variables res-puesta de este estudio.

Los resultados coinciden con Grandy et al. (2002), quienes señalan que el incorporar compostas orgáni-cas al suelo, produce incrementos en los rendimien-tos de las cosechas, así como mejoras en la estructura del suelo, y a menudo ésta incorporación mejora sue-los erosionados. Además los fertilizantes líquidos ela-borados con extracto de humus de lombriz de tierra aportan ácidos húmicos y fúlvicos, microorganismos vivos propios para la nitrificación y solubilización de minerales enlatados en el suelo, lo que coincide con los resultados de laboratorio.

Los rendimientos encontrados coinciden con los trabajos de Villa-Briones et al. (2003) quienes seña-lan que los mejores resultados en sus investigaciones se obtuvieron con la incorporación de humus de lom-briz de 7.5 ton ha-1 hasta 12.5 ton ha-1, situación que se asemeja al T3 con una aplicación de 7.96 ton ha-1.

Efecto de humus de lombriz en el desarrollo de la planta

En la localidad de Villa Corona y Tlajomulco de Zúñi-ga, ambos del estado de Jalisco, en donde se llevó a cabo el experimento con los diferentes tratamientos aplicados de humus de lombriz a diferentes dosis en el cultivo de la jamaica Hibiscus sabdariffa L., de la variedad Americana, en la primera localidad, el efecto de humus de lombriz en la altura de la planta, se de-tectó una diferencia significativa (P=0.05) en los tra-tamientos aplicados de humus de lombriz; en el trata-miento de 199 g de humus de lombriz se observó una altura de 1.808 m, al tratamiento de 166 g de humus de lombriz presentó una altura de planta de 1.790 m, y en el tratamiento de 133 g de humus de lombriz presentó una altura de 1.780 m, comparándolo con el testigo libre de humus de lombriz que presenta una

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altura de la planta de 1.63 m, presentó una reducción del 10% en el testigo, no siendo así en la región de Tlajomulco de Zúñiga al no presentarse diferencia significativa en todos los tratamientos (cuadros 4 y 5).

Efecto de humus de lombriz en el diámetro basal del tallo de la planta

En la primera localidad, el efecto de la aplicación de humus de lombriz sobre el diámetro basal tuvo una diferencia significativa (P=0.05), en los tratamientos aplicados, en el tratamiento de 199 g de humus de lombriz se observó una diámetro basal de 22.13 mm, al tratamiento de 166 g presentó un diámetro basal de la planta de 21.45 mm y en el tratamiento de 133 g presentó un diámetro basal de 17.25 mm, compa-rándolo con el testigo que presenta un diámetro basal de la planta de 15.20 mm, resultó en una reducción del 31% en el testigo; en la segunda localidad a lo que corresponde a diámetro basal no se detectó diferencia significativa, (cuadros 4 y 5); en relación al número de ramas no se detectó diferencias significativa en ambas localidades.

Efecto de humus de lombriz en la formación de cáliz de la planta

En la primera localidad, el efecto de la aplicación de humus de lombriz sobre la formación del número de cáliz por planta mostró una diferencia significativa

(P=0.05), en los tratamientos aplicados de humus de lombriz, en el tratamiento de 199 g/planta de humus de lombriz se observó un número de cáliz de 59.5, al tratamiento de 166 g/planta presentó un número de cáliz de 51.3, en el tratamiento de 133 g/planta pre-sentó un número de cáliz de 57.3 y en el testigo se presentó un número de cáliz de 46.0, resultó en una reducción del 23% en el testigo, en la segunda locali-dad la reducción fue de 35% (cuadros 4 y 5).

Efecto de humus de lombriz en la producción de cáliz seco de la planta

En la primera localidad, el efecto de la aplicación de humus de lombriz sobre la producción de cáliz seco presentó una diferencia significativa (P=0.05), en los tratamientos aplicados de humus de lombriz, en el tratamiento de 199 g/planta de humus de lombriz se observó una producción de cáliz seco de 1668.5 kg por ha, al tratamiento de 166 g/planta presentó una producción de cáliz seco de 1440.5 kg por ha, y en el tratamiento de 133 g/planta presentó una producción de cáliz seco de 1545.5 kg por ha, y en el testigo se pre-sentó una producción de cáliz seco de 1242.5 kg por ha, resultó en una reducción del 26% en el testigo; en la segunda localidad a lo que corresponde a produc-ción de cáliz seco no se detectó diferencia significativa en los tratamientos aplicados con humus de lombriz (cuadros 4 y 5).

Cuadro 4. Medias de las variables de estudio en jamaica con aplicación de humus de lombriz, Villa Corona, Jalisco, 2005.

Tratamientos Altura de planta (m) Diámetro basal de tallo (mm)

Número de ramas Número de cáliz por planta

Producción cáliz seco kg ha-1

Humus de lombriz 133 g/planta 1.780 a 17.25 b 13.5 a 57.3 a 1545.5 b

Humus de lombriz 166 g/planta 1.790 a 21.45 a 12.3 a 51.3 b 1440.5 c

Humus de lombriz 199 g/planta 1.808 a 22.13 a 13.5 a 59.5 a 1668.5 a

Testigo s/a 1.63 b 15.20 b 11.0 a 46.0 c 1242.5 d

HSD Tukey .05 0.0819 2.373 3.33 2.55 59.68

Medias dentro de cada columna con diferente letra difieren estadísticamente según Tukey 0.05.

Cuadro 5. Medias de producción en jamaica con humus de lombriz, en Tlajomulco de Zúñiga, Jalisco, 2005.




Humus de lombriz 133 g/planta 1.575 a 16.02 a 8.8 a 35.8 b c 974.0 a

Humus de lombriz a 166 g/planta

1.520 a 16.45 a 10.5 a 44.5 a b 1115.0 a

Humus de lombriz 199 g/planta 1.567 a 18.38 a 10.5 a 47.5 a 1055.0 a

Testigo s/a 14.90 a 14.90 a 8.3 a 30.8 c 787.5 b

HSD Tukey .05 0.1423 3.604 2.44 9.87 149.80


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Efecto de lixiviado de humus de lombriz en el desarrollo de la planta

La aplicación de lixiviado de humus de lombriz a diferentes dosis en el cultivo de la jamaica Hibiscus sabdariffa L, de la variedad Americana, en la locali-dad de Villa Corona, Jalisco; en el efecto de lixiviado de humus de lombriz sobre la altura de la planta se detectó una diferencia significativa (P=0.05), en los tratamientos aplicados de lixiviado de humus de lom-briz; en el T3 de 30 litros de lixiviado de humus de lombriz se observó una altura de 1.830 m, al T2 de 20 litros de lixiviado de humus de lombriz presentó una altura de planta de 1.825 m, y en el T1 de 10 litros de lixiviado de humus de lombriz presentó una altura de 1.805 m, comparándolo con el testigo libre de lixivia-do de humus de lombriz que presenta una altura de la planta de 1.630 m, presentó una reducción del 11% en el testigo, no así en la región de Tlajomulco de Zúñi-ga al no presentarse diferencia significativa en todos los tratamientos en lo relacionado a altura de planta (cuadros 6 y 7).

Efecto de lixiviado de humus de lombriz en el diámetro basal del tallo de la planta

En Villa Corona, Jalisco, en el efecto de la aplicación de lixiviado de humus de lombriz sobre el diámetro basal del tallo de la planta se detectó una diferencia significativa (P=0.05), en los tratamientos aplicados

de lixiviado de humus de lombriz; en el T3 de 30 li-tros de lixiviado de humus de lombriz se observó un diámetro basal de 20.25 mm, en el T2 de 20 litros pre-sentó un diámetro basal de planta de 19.42 mm y en el T1 de 10 litros presentó un diámetro de 15.77 mm, comparándolo con el testigo que presenta un diáme-tro basal de la planta de 15.95 mm, en la región de Tlajomulco de Zúñiga en el T3 de lixiviado de humus de lombriz se observó una diámetro basal de 18.38 mm, en T2 presentó un diámetro basal de planta de 16.27 mm, y en el T1 presentó un diámetro basal de 15.70 mm, comparándolo con el testigo que presenta un diámetro basal de la planta de 13.90 mm, resultó en una reducción del 21% para la localidad de Villa Corona y de un 24 % para la localidad de Tlajomulco de Zúñiga (cuadros 6 y 7).

Efecto de lixiviado de humus de lombriz en la formación de ramas de la planta

En Villa Corona, Jalisco, el efecto de la aplicación de lixiviado de humus de lombriz sobre la formación de ramas en la planta mostró una diferencia significativa (P=0.05), en los tratamientos aplicados de lixiviado de humus de lombriz; en el T3 de 30 litros de lixivia-do de humus de lombriz se observó una formación de ramas de 10.8, en el T2 de 20 litros presentó una for-mación de ramas en la planta de 10.8, y en el T1 de 10 litros presentó una formación de ramas de 11.5, com-parándolo con el testigo que presenta una formación

Cuadro 6. Medias de las variables de estudio en jamaica con aplicación de lixiviado de humus de lombriz, en Villa Corona, Jalisco, 2005.




Lixiviado 10 l/ha 1.805 a 15.77 b 11.5 a 49.5 a 1,381 a

Lixiviado 20 l/ha 1.825 a 19.42 a 10.8 a 50.8 a 1,371 a

Lixiviado 30 l/ha 1.830 a 20.25 a 10.8 a 50.5 a 1340 a

Testigo s/a 1.630 b 15.95 b 8.0 b 44.8 b 1102 b

HSD Tukey .05 0.09851 2.541 2.70 5.41 178.46


Cuadro 7. Medias de las variables de estudio en jamaica con aplicación de lixiviado de humus de lombriz en Tlajomulco de Zúñiga, Jalisco, 2005.




Lixiviado 10 l/ha 1.683 a 15.70 b 10.8 a 38.5 a 1222.3 a

Lixiviado 20 l/ha 1.743 a 16.27 a b 9.8 a 40.3 a 1251.0 a

Lixiviado 30 l/ha 1.755 a 18.38 a 9.5 a 36.5 a 1161.3 a

Testigo s/a 1.683 a 13.90 b 11.5 a 34.8 a 1005.0 a

HSD Tukey .05 0.1686 2.467 4.46 7.78 263.72


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de ramas de 8.0, resultó en una reducción del 26% en el testigo; en la región de Tlajomulco de Zúñiga, no se detectó diferencia significativa (P=0.05), en la forma-ción de ramas en el cultivo (cuadros 6 y 7).

Efecto de lixiviado de humus de lombriz en la formación de cáliz de la planta

En Villa Corona, Jalisco, el efecto de la aplicación de lixiviado de humus de lombriz en la formación de Cáliz de la planta tuvo una diferencia significativa (P=0.05), en los tratamientos aplicados de lixiviado de humus de lombriz; en el T3 de 30 litros de lixivia-do de humus de lombriz se observó una formación de cáliz de 50.5, en el T2 de 20 litros presentó una for-mación de cáliz en la planta de 50.8, y en el T1 de 10 litros presentó una formación de cáliz de 49.5, com-parándolo con el testigo que presenta una formación de cáliz de 44.8, resultó en una reducción del 11% en el testigo, en la región de Tlajomulco de Zúñiga, no se detectó diferencia significativa (P=0.05), en la forma-ción de cáliz en el cultivo (cuadro 6 y 7)

Efecto de lixiviado de humus de lombriz en la producción de cáliz seco de la planta

En Villa Corona, Jalisco, el efecto de la aplicación de lixiviado de humus de lombriz en la Producción de cáliz seco se detectó una diferencia significativa (P=0.05), en los tratamientos aplicados de lixiviado de humus de lombriz; en el T3 de 30 litros de lixivia-do de humus de lombriz se observó una producción de 1,340 kg por ha, al T2 de 20 litros presentó una producción de cáliz seco de 1,371 kg por ha, y en el T1 de 10 litros presentó una producción de 1,381 kg por ha, y en el testigo se presentó una producción de cáliz seco de 1,102 kg por ha, resultó en una reducción del 18% en el testigo; en la región de Tlajomulco de Zúñi-ga a lo que corresponde a producción de cáliz seco no se detectó diferencia significativa en todos los trata-mientos aplicados (cuadros 6 y 7).

Conclusiones

En las condiciones de manejo agronómico aplicados el cultivo de jamaica y utilizando las distintas concen-traciones de humus de lombriz y lixiviado se llega a las siguientes conclusiones:

El lixiviado de humus de lombriz obtuvo un mejor comportamiento en relación al desarrollo de la planta en la región de Villa Corona y Tlajomulco de Zúñiga, utilizando una dosis de 30 litros.

El humus de lombriz tuvo un mejor efecto sobre la producción de cáliz por planta en la localidad de Villa

Corona, y Tlajomulco de Zúñiga, utilizando una dosis de 199 g/planta.

Con la aplicación de un abono orgánico como el humus de lombriz en el cultivo de jamaica se obtuvo un buen rendimiento en la producción de cáliz seco.

Eisenia foetida es la especie que mejor se adapta a estas actividades, obteniéndose buenos resultados en el sentido de aumentar el rendimiento en cultivos agrícolas. En este estudio se comprueba que la pro-ducción de humus de lombriz tiene capacidad supe-rior para fabricar una composta de buena calidad.

El costo de cultivo fue de $ 19,500.00, que incluye la preparación de suelo hasta cosecha y retiro a alma-cén, el valor promedio de jamaica es de $ 40,000.00 ton, lo que representa en relación al rendimiento un costo beneficio de 1:3.

El productor agrícola manifiesta gran interés por fomentar la lombricultura, debido a la transformación de los residuos orgánicos contaminantes en humus de lombriz, lo que genera un fertilizante irreemplazable para el mejoramiento y remediación de los suelos y la nutrición de las plantas.d

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Epibiontes de hembras anidadoras de tortuga golfina Lepidochelys olivacea en el Playón de Mismaloya, Jalisco

Ildefonso Enciso-Padilla1, Julia Cisneros-Calderón1, Freddy C. Gastélum-Gastélum2 y Francisco J. Jacobo-Pérez2

1Laboratorio de Ecosistemas Marinos y Acuicultura, Departamento de Ecología. 2Laboratorio Bosque La Primavera, Departamento de Ciencias Ambientales. Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara. Carretera a Nogales Km 15.5, Las Agujas, Zapopan, Jalisco, México.Correo electrónico: [email protected]

Resumen

La presencia de epibiontes sobre tortugas marinas ha sido utilizada con diferentes propósitos, tales como indicado-res biogeográficos, rutas migratorias y movimientos en sus etapas de vida pelágica. Con el objetivo de conocer la riqueza y distribución de especies de epibiontes, se hicie-ron recolectas de todos los organismos que se encontraron sobre 163 hembras de Lepidochelys olivacea que anidaron en el Playón de Mismaloya, Jalisco. El total de epibiontes colectados fue de 2,567, correspondientes a 10 especies, siendo el más abundante el anfípodo Podocerus chelono-philus. Además, fueron encontrados sanguijuelas, cangre-jos, balanos y percebes distribuidos tanto en partes duras como blandas de las tortugas.

Palabras clave: epibiontes, Lepidochelys olivacea, Pla-yón de Mismaloya.

Abstract

The presence of epibionts on marine turtles has been used for various purposes, such as biogeographic indicators, migration routes and movements of pelagic life stages. With the goal of know the richness and species distribu-tion of epibionts, were collections of all the organisms found on 163 females of Lepidochelys olivacea nesting in the Playón de Mismaloya, Jalisco. The total collected epi-bionts was 2.567, corresponding to 10 species, being the most abundant amphipod Podocerus chelonophilus. They were also found leeches, crabs and barnacles distributed both in hard and soft parts of the turtles.

Keywords: epibionts, Lepidochelys olivacea, Playón de Mismaloya.

Introducción

Los grandes vertebrados marinos, como los cetá-ceos y las tortugas marinas hospedan una gran

variedad de organismos, llamados epibiontes (Dood 1988), que incluyen percebes, crustáceos, moluscos, algas e incluso algunos vertebrados como las rémo-ras, generando así verdaderos ecosistemas que se desplazan por el océano. En el caso de las tortugas, habitantes del mar desde hace más de 100 millones de años, estos organismos se adhieren y colonizan tanto las superficies duras (cabeza y caparazón), como en las superficies blandas, principalmente en el cuello, adaptándose a vivir sobre otro ser vivo, de-sarrollando un proceso llamado Epibiosis. Este tipo de asociación se presenta en casi todas las especies de tortugas marinas en sus etapas juvenil y adultas. Miranda y Moreno (2002) establecen que el conoci-

miento en cuanto a la determinación, composición y abundancia de los epibiontes representa un elemento importante para determinar la relación entre ambos, tortugas y epibiontes, y desde el punto de vista ecoló-gico, la principal relación que se establece entre am-bos, es la utilización de la superficie corporal de la tor-tuga, tanto en piel como en caparazón, como sustrato de asentamiento larvario y como medio de dispersión y obtención de alimento (Barnes 1986). El caparazón de las tortugas puede no representar un sustrato uni-forme para el asentamiento y/o reclutamiento de epi-biontes, a causa de la influencia de factores tales como el flujo del agua sobre el caparazón, lo cual implica una distribución diferencial de los epibiontes sobre el mismo, debido a la desecación, accesibilidad de ali-mento y abrasión de las aletas por contacto con el ca-

CitarCitar


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parazón. El ensamblaje de organismos epibiontes en tortugas no solo está compuesto por invertebrados, algunos de los cuales son comensales obligados, por ejemplo el balano Chelonibia testudinaria (Zardus and Hadfield 2004), sino que también existen grupos de algas epizoicas que son parte de esta comunidad, tal como lo documentan en sus estudios Sentíes et al. (1999) y Báez et al. (2002).

Diversos estudios han utilizado a los epibiontes como una herramienta para conocer la ecología de sus hospederos, como el de Frazier et al. (1992), sus rutas migratorias, o bien como indicadores biogeográficos (Liria 2011). Asimismo, los epibiontes pueden indicar las condiciones específicas del entorno en el cual se desarrollan las tortugas durante alguna de sus fases de vida (Hernández y Valadez 1997).

Si bien en México se desarrolla una gran cantidad de investigaciones sobre la biología de las tortugas marinas, lo relacionado con epibiontes es aún esca-samente documentado. Los primeros trabajos acerca de epibiontes sobre tortugas marinas que anidan en Jalisco fueron los realizados por Hernández y Valadez (1997), en la playa de La Gloria, Jalisco, quienes ha-cen un estudio de los epizoarios, su abundancia y dis-tribución, en tortuga golfina. Suárez y Lazo (2009), realizaron un trabajo acerca de la variación intraespe-cífica de un ectoparásito que recolectaron en la costa sur de Jalisco sobre el caparazón de una hembra de L. olivacea. El presente trabajo tiene como objetivo conocer los epibiontes de hembras anidadoras de la tortuga golfina L. olivacea, así como su distribución y abundancia en las diferentes partes del cuerpo de las tortugas que anidan en la costa central de Jalisco.


El presente trabajo se realizó en la costa central de Jalisco, México, en el Santuario Marino y playa de anidación Playón de Mismaloya, durante los meses de julio a diciembre en las temporadas 2004, 2006 y 2007. Las localidades donde se tomaron las muestras fueron las siguientes:

1. Villa del mar, con una extensión de 16 kilóme-tros.

2. Playón de Mismaloya con una extensión de 28 kilómetros.

3. Chalacatepec con una extensión de 20 kilóme-tros.

Para la recolecta de muestras, se hicieron recorri-

dos nocturnos para localizar hembras de tortugas que estuvieran anidando. Una vez localizadas, se esperaba el momento adecuado para acercarse a ellas y no in-terrumpir el proceso de oviposición; posteriormente se procedió a desprender, con ayuda de una espátula,

todos los organismos que se encontraran en la tor-tuga, anotando si éstos se encontraban sobre partes duras (caparazón) o partes blandas (cuello y aletas). Los epibiontes fueron debidamente etiquetados y preservados en alcohol al 70% y transportados al La-boratorio de Ecosistemas Marinos del Departamento de Ecología del Centro Universitario de Ciencias Bio-lógicas y Agropecuarias de la Universidad de Guada-lajara, para su determinación taxonómica.

Resultados

Durante el periodo de estudio del presente trabajo se obtuvieron muestras de epibiontes de 163 hembras adultas de Lepidochelys olivacea, de 178 tortugas ob-servadas en las tres localidades del Santuario marino Playón de Mismaloya, Jalisco, lo cual representa el 91.5% del total de la muestra. La n de tortugas para cada una de las localidades se muestra en el cuadro 1.

Cuadro 1. Número de tortugas muestreadas por localidad durante las temporadas 2004, 2006 y 2007, en tres localidades del Playón de Mismaloya, Jal.

Localidad Tortugas muestreadas

Playón de Mismaloya 97

Chalacatepec 43

Villa del Mar 38

n=178

Se determinaron en total diez taxa, correspon-dientes a cuatro phyllum, cinco clases, siete familias y diez géneros. La lista taxonómica se presenta en el cuadro 2.

De las 163 hembras de L. olivacea examinadas, en 76 de ellas se presentó el cirrípedo L. hilli, mien-tras que C. virgatum se observó en 42 hembras. Los porcentajes relativos de tortugas con la presencia de las diferentes especies de epibiontes se muestran en la gráfica 1.

% r

elat

ivo

de to

rtug

as

0

5

10

15

20

25

30

35

L. hilli

C. virg

atum

O. bra

nchia

tus

P. he

xasty

los

S. pra

egus

tator

Ch. tes

tudina

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P. ch

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P. cy

aneu

s

R. rem

ora

T. pan

amen

sis

Gráfica 1. Porcentaje de epibiontes encontrados sobre hembras de L. olivacea.

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El total de especímenes de epibiontes recolecta-dos fue de 2567, correspondiendo el mayor número de ellos, 1269, al anfípodo P. chelonophilus, seguido por el cirrípedo L. hilli, con 547 organismos. Los que registraron el menor número fueron la anémona T. panamensis y el perciforme R. remora, con tan solo un organismo de cada uno. En el cuadro 3 se presen-tan los números y porcentajes totales de los epibion-tes recolectados.

El número de especies (riqueza específica) de epi-biontes que se encontraron sobre tortugas se tiene que en 112 de ellas se localizó una sola especie de epi-zoos, mientras que la mayor riqueza de especies (6) se encontró en tan solo una hembra de tortuga (gráfica 2).

Con respecto a la distribución de los epibiontes so-bre el cuerpo de las hembras de tortugas, éstos fueron colectados tanto de partes duras como partes blandas. Sólo una especie, el percebe L. hilli, se localizó en am-bas partes; 5 especies se encontraron exclusivamente

en las partes duras, principalmente en el caparazón y cabeza; y 4 especies se presentaron únicamente en las partes blandas (cuello, aletas y cloaca. Cuadro 4).

Discusión

El estudio de epibiontes es, por si mismo, muy com-plejo, ya que integra muchas variables que dependen no solo de las características biológicas de los epi-biontes (y la competencia entre ellos), sino también de los hospederos. Además de lo anterior, se deben de considerar los factores y las condiciones ambientales en las que se encuentran los hospederos, en este caso las tortugas marinas; estos factores incluyen el des-plazamiento migratorio, sus actividades y sus com-portamientos (reproductivos, alimenticios). Es decir, cuando se hacen las recolectas de los epibiontes, no sabemos a ciencia cierta en donde estuvieron ni las condiciones en las que estuvo esa tortuga. También desconocemos si los epibiontes que se encuentran en

Cuadro 2. Lista taxonómica de epibiontes colectados en hembras anidadoras de L. olivacea en el Playón de Mismaloya, Jal.

Phylum Superclase o Subphyllum

Clase Orden Familia Género/Especie

Cnidaria Anthozoa Actiniaria Isophelliidae Telmatactis panamensis

Annelida Clitellata Hirudinea Hirudinida Ozobranchidae Ozobranchus branchiatus

Arthropoda Crustacea Maxilopoda Sessilia Coronulidae Chelonibia testudinaria

Platylepas hexastylos

Stomatolepas praegustator

Pedunculata Lepadidae Conchoderma virgatum

Lepas hilli

Malacostraca Amphipoda Podoceridae Podocerus chelonophilus

Decápoda Grapsidae Planes cyaneus

Chordata Vertebrata Osteoichthyes Perciformes Echeniidae Remora remora

Cuadro 3. Número total y proporción de epibiontes recolectados.

Epibionte Número de organismos

% de organismos

P. cheloniphilus 1269 49.5

L. hilli 547 21.0

C. virgatum 266 10.5

S. praegustator 228 8.5

O. branchiatus 186 7.0

P. hexastylos 40 1.5

Ch. testudinaria 27 1.05

P. cyaneus 3 0.15

R. remora 1 0.4

T. panamensis 1 0.4

Total 2567 100%

0

20

40

60

80

100

120

Núm

ero

de

tort

ugas

Riqueza de especies de epibiontes

1 2 3 4 6

Gráfica 2. Riqueza específica de epibiontes encontrados en L. olivacea.

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ella desplazaron a otros y están pleno proceso de co-lonización, o bien, si van en declive.

Si bien la riqueza de especies de epibiontes en-contrados durante el presente estudio (10) puede ser

Cuadro 4. Distribución de epibiontes sobre las partes duras (PD) y partes blandas (PB) de hembras anidadoras de L. olivacea en el Playón de Mismaloya, Jalisco.

Epibionte Región corporal

Telmatacti panamensis PD

Ozobranchus branchiatus PB; Cloaca

Chelonibia testudinaria PD

Platylepas hexastylos PD; Boca

Stomatolepas praegustator PD

Conchoderma virgatum PD

Lepas hilli PB; PD

Podocerus cheloniphilus PB

Planes cyaneus Cloaca

Remora remora Cloaca

baja, es casi igual con la encontrada por Hernández y Valadez en tortugas que anidaron en La Gloria, Jalis-co (9 especies), y similar a la encontrada por Salgado en el 2002 en la playa de Careyes, Jalisco. El cuadro 5 muestra un comparativo entre las especies de epi-biontes encontrados sobre la tortuga golfina L. oliva-cea, durante el presente estudio y los realizados por Angulo et al. (2002) en playa Ceuta, Sinaloa; Hernán-dez y Valadez (1998) en La Gloria, Jalisco; Salgado, M. (inédito) en Careyes, Jalisco; y por Gámez et al. (2006) en algunas localidades de Michoacán y Jalis-co.

Frick et al. 1998 y Zardus & Haldfield 2004, men-cionan dos tipos de epizoos; los especialistas y los ge-neralistas. Los que integran el grupo de especialistas son aquellos que viven exclusivamente sobre tortugas marinas, mientras que las especies generalistas pue-den colonizar tanto sustratos vivos como no vivos, pero que se encuentran con frecuencia sobre tortugas marinas. En el caso del grupo de epibiontes especia-listas, y con base a los trabajos anteriores, se encontró a los balanos Chelonibia testudinaria y Platylepas

Cuadro 5. Epibiontes de tortuga golfina L. olivacea reportados para algunas playas del Pacífico central mexicano.

Ceuta, Sin. (n=12) P. Mismaloya, Jal. (n=163)

La Gloria, Jal. (n=46)

Careyes, Jal (n=49) Mich./Oax (n=28)

CNIDARIA

Obelia sp.

Telmatacti panamensis

ANNELIDA

Ozobranchus branchiatus

ARTHROPODA

Balanos

Chelonibia testudinaria

Platylepas hexastylos

Stomatolepas praegustator

Percebes

Conchoderma virgatum

Lepas hilli

Lepas anatifera

Lepas anserifera

Anfípodos

Anfipodo Gamaridae

Balaenophillus sp.

Caprella sp.

Podocerus cheloniphilus

Decápodos

Planes cyaneus

CHORDATA

Remora remora

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hexastilos, al anfípodo Podocerus chelonophilus y a la sanguijuela Ozobranchus branchiatus. Dentro del grupo de epibiontes generalistas, se encontró a los cirrípedos lepadomorfos Conchoderma virgatum y Lepas hilli.

Badillo (2007) menciona, además de epibiontes especialistas y generalistas, a otros dos grupos: los intermedios, que son especies con un alto grado de asociación con las tortugas marinas, como son los isópodos Caprella andreae y Hyale grimaldii, y el decápodo Planes minutus; el otro grupo es el de los epibiontes accidentales, que son especies que rara-mente se encuentran sobre tortugas marinas, como el gasterópodo Bittium sp. En el presente estudio se en-contraron tres especies, que de manera conjunta sólo representaron el 0.95% del total de epibiontes encon-trados. que pueden considerarse dentro de estos dos grupos. En el caso de especies intermedias se tiene al perciforme Remora remora, que se encuentra con alguna frecuencia adherida a la cloaca o al plastron de las tortugas. También en este grupo se encuentra el decápodo Planes cyaneus, que es un cangrejo ex-clusivamente pelágico, y que de acuerdo a Miranda y Moreno (2002), existe una relación de comensalismo, ya que éste se alimenta de los deshechos fecales de la tortuga. Asimismo, este decápodo se haya asociado a las algas del género Sargassum, igual que P. minu-tus, pero ambos con diferente distribución, ya que P. cyaneus se encuentra en el Pacífico, mientras que P. minutus se distribuye en el océano Atlántico, Índico y Mediterráneo (Liria 2011).

La presencia de algunas especies de epibiontes puede ayudar a conocer las rutas migratorias, movi-mientos, preferencias de hábitat, y muchos otros as-pectos de la historia de vida de las tortugas cuando están lejos de su zona de anidación (Caine 1986).d

Referencias

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Burrito y Palomo, nuevas variedades de frijol para Jalisco

Rogelio Lépiz Ildefonso1, Santiago Sánchez Preciado1, Alfredo González Ávila2, Eduardo López Alcocer1 y Eduardo Rodríguez Guzmán1

1Universidad de Guadalajara, km 15.5 Carr. Guadalajara-Nogales, Las Agujas, Zapopan, Jal. 2Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Parque Los Colomos, Guadalajara, Jal.Correo electrónico: [email protected]

La reducción considerable de la producción de fri-jol en el estado de Jalisco de 69 mil 827 toneladas

en 1980 a 13 mil 158 toneladas en 2008, transformó al estado de un productor importante a un importador neto para cubrir las necesidades del consumo interno de esta leguminosa (SIAP 2012). La causa principal del drástico descenso de la producción estatal de fri-jol, ha sido la eliminación de la leguminosa del siste-ma maíz-frijol asociado, por la producción de maíz en unicultivo. Actualmente las altas densidades de po-blación, el uso de herbicidas y la utilización de maqui-naria en las actividades de siembra, laboreo y cosecha del maíz, no permiten la siembra de frijol trepador en asociación con maíz, sistema de producción utilizado en el 76% de la superficie cosechada de frijol en 1980.

Una opción para rescatar la producción estatal de frijol, reducir el nivel de importación de estados ve-cinos y contribuir a la producción nacional, es pro-mover el cultivo de variedades de frijol arbustivo en zonas con condiciones favorables, como las regiones Centro y Sur de Jalisco. De acuerdo con estudios rea-lizados por INIFAP, en esta parte del estado existen 40 mil hectáreas donde los factores de clima y suelo son favorables para la producción de hasta 2.5 tonela-das de frijol por hectárea, bajo condiciones de tempo-ral (Lépiz et al. 2000).

En este contexto y con el propósito de rescatar en parte la producción de frijol en Jalisco, contribuir a reducir el desabasto estatal de este grano básico y de

incentivar el consumo a través de una mayor dispo-nibilidad de producto, el Proyecto de Frijol de la Uni-versidad de Guadalajara con participación del Insti-tuto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias, inició sus actividades en el año 2000 con el objetivo de desarrollar variedades de frijol de grano preferente y alto rendimiento para las regiones Cen-tro, Sur y Altos de Jalisco (Lépiz et al. 2001).

El trabajo se inició con la introducción de germo-plasma nacional e internacional, para identificar fuen-tes de genes de adaptación, resistencia a bacteriosis de halo (Pseudomonas syringae pv. phaseolicola) y antracnosis (Colletotrichum lindemuthianum), para mejorar por hibridación y selección las variedades de frijol tipo peruano de Sinaloa, cultivares de alta de-manda en Jalisco, pero con problemas de adaptación y susceptibilidad a las enfermedades ya mencionadas (Lépiz et al. 2001).

Como resultado del trabajo de evaluación de ger-moplasma introducido en los viveros nacionales e internacionales de fuentes de resistencia, se identi-ficaron genotipos de excelente adaptación, resisten-cia a las enfermedades prevalentes, alto rendimiento y grano comercial. Estos materiales introducidos de alto valor agronómico, fueron evaluados entre 2003 y 2006 a través de ensayos de rendimiento locales y re-gionales (cuadros 1 y 2) (Aranda 2006) y en parcelas de validación técnica en diferentes localidades de las regiones productoras de frijol del Centro, Sur y Altos

Cuadro 1. Rendimiento de grano (kg/ha) de variedades y líneas de frijol en el ensayo de rendimiento regional en cinco sitios del estado de Jalisco.

Variedad TEPA 2002

ZAPO 2003

SAYU 2003

ZAPO 2004

SAYU 2004

MEDIA

Burrito 1390 1922 1087 2156 3937 2098

Palomo 2577 1918 571 1655 3036 1951

AzufradoTapatío (t)

1965 1880 893 1924 3314 1995

Localidades: TEPA, Tepatitlán; ZAPO, Zapopan; SAYU, Sayula.

Cuadro 2. Rendimiento de grano (kg/ha) de variedades y líneas de frijol en dos fechas de siembra en Zapopan. P-V, 2004.

VARIEDAD VAG 2003

ANT 22/07

ANT 04/08

Zapopan 22/07/04

Zapopan 04/08/04

Zapopanpromedio

Burrito 3 1 2 2356 2160 2258

Palomo 2 1 1 1830 1656 1743

AzufradoTapatío (t)

4 3 2 1447 1928 1688

VAG, valor agronómico; ANT, antracnosis. Valores de evaluación: 1, 2, 3, bueno o resistente; 4, 5, 6, intermedio; 7, 8, 9, deficiente o susceptible.

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ROGELIO LÉPIZ ILDEFONSO ET AL.62

de Jalisco (cuadro 3) (Sánchez et al. 2007). Las líneas promisorias también se sometieron a pruebas de cali-dad culinaria y trabajos de caracterización varietal en 2007 y 2008, con fines de registro.

El trabajo permitió identificar genotipos de alto valor agronómico y grano comercial para las regiones Centro, Sur y Altos de Jalisco. La línea PT-98016 de frijol pinto (figuras 1 y 2) procedente del Programa de Frijol del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) de hábi-to de crecimiento indeterminado postrado tipo III, es similar en rendimiento de grano a la variedad testigo

Azufrado Tapatío (cuadros 1, 2 y 3) y superior a otras variedades comerciales de su tipo como Pinto Villa y Pinto Saltillo. En marzo de 2009 se inscribió en el Ca-tálogo Nacional de Variedades Vegetales (CNVV) del Servicio Nacional de Inspección y Certificación de Se-millas (SNICS) con el nombre de Burrito y número de registro FRI-057-240209.

Por su parte la línea identificada como Vista de tipo blanco pequeño (figuras 3 y 4), es un frijol in-troducido de Estados Unidos de Norteamérica. El material es de hábito indeterminado erecto tipo II, resistente a bacteriosis de halo, roya (Uromyces ap-

Cuadro 3. Rendimiento de grano (kg/ha) del ensayo de validación técnica en siete localidades del Centro, Sur y Altos de Jalisco. PV 2005.

VARIEDAD SAYULA ZACOALCO ZAPOPAN 05 ACATIC PONCITÁN TAPIAS ZAPOPAN 06 PROMEDIO

Burrito 3053 1354 2578 2512 2187 2023 1822 2218

Palomo 2704 1216 1979 2075 1478 1556 2090 1872

A. Tapatío (t) 2883 1651 1974 1333 1718 2002 2064 1942A. Tapatío, Azufrado Tapatío.

Figura 1. Burrito, vainas y semilla. Figura 2. Color y forma de las semillas de Burrito.

Figura 3. Palomo, vainas y semilla. Figura 4. Color y forma de las semillas de Palomo.

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BURRITO Y PALOMO, NUEVAS VARIEDADES DE FRIJOL PARA JALISCO 63

pendiculatus) y antracnosis, de alto rendimiento y viene a cubrir las necesidades de variedades de este tipo de grano con demanda regional y nacional. En marzo de 2009 se inscribió oficialmente en el CNVV del SNICS, con el nombre de Palomo y número de re-gistro FRI-056-240209.

Las variedades Burrito y Palomo son aptas para siembras de temporal en las regiones Centro, Sur y Altos de Jalisco, entre el 20 de julio y 10 de agosto. Las siembras deben hacerse en suelos francos, fran-co-arenosos o ligeramente arcillosos, de buen drena-je, con una fertilización a la siembra de 50 kg de N y 50 kg de P2O5, ambos por hectárea. En siembras co-merciales mayores a una hectárea, es indispensable el uso de herbicidas y la utilización de maquinaria para las diferentes labores, incluyendo la cosecha (Alemán et al. 1996; Lépiz et al. 2007).d

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Niveles de aflatoxina M1 en quesos y yogurt de tipo artesanal, elaborados en dos regiones del estado de Jalisco

Waldina Patricia Reyes Velázquez1, Severiano Patricio Martínez1, Armando Toral Flores2,Mayra Serrano Meckler1 y Federico Rojo1

1Departamento de Salud Pública. 2Departamento de Desarrollo Rural Sustentable. Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara. Km15.5 Camino Ing. Ramón Padilla Sánchez No.2100, La Venta del Astillero, Zapopan, Jalisco

Resumen

Durante 2008 y 2009 fueron recolectadas al azar 150 muestras de tres tipos de quesos y 40 muestras de yogurt natural y frutas, todas procedentes de fábricas de tipo arte-sanal ubicadas en dos localidades del estado de Jalisco. El método analítico utilizado para la determinación de AFM1 fue la técnica de Inmunoensayo enzimático ELISA. Se de-tectó AFM1 en 86.7% de los quesos (rango: 50–1512 ng/kg) y en 25% de las muestras de yogurt (rango: 57.15–240 ng/kg). En los meses de invierno se observó la mayor contami-nación de AFM1 en quesos, correspondiendo al tipo adobe-ra (promedio: 378 ng/kg); los niveles menores se presen-taron en los meses de verano y se observaron en los quesos fresco y Oaxaca (promedio: 94 ng/kg). No se encontró diferencia estadística (P> 0.05) entre tipos de quesos o yogurt. Del total de muestras analizadas 16.7% excedieron los límites permitidos por la Normatividad Mexicana (500 ng/kg). Este estudio es el primer reporte en México de la presencia de AFM1 en yogurt.

Palabras clave: Aflatoxina M1, queso, yogurt, ELISA.

Abstract

During 2008 and 2009 were randomly collected 150 sam-ples from 3 type cheeses and 40 samples of yogurt nature and fruit flavors, all of them from artisan factories in two locations in the state of Jalisco. The analytical method used for determining AFM1 was the technique of enzyme immunoassay ELISA. AFM1 was detected in 86.7% of cheese samples (range: 50–1512 ng/kg) and 25% in yogurt samples (range: 57.15–240 ng/kg). In winter months was observed the highest contamination of AFM1 in cheese, corresponding to the type adobera (average: 378 ng/kg), showed lower levels in the summer months and were seen in the fresh cheese and Oaxaca (average: 94 ng/kg). There was no statistical difference (P> 0.05) between types of cheese or yogurt. 16.7% cheese samples exceed the legal limits (500 ng/kg) established by the Mexican Regulation. This paper reports the data of the first survey on the pres-ence of AFM1 in yogurt in Mexico.

Keywords: Aflatoxin M1, cheese, yogurt, ELISA.

Introducción

Las aflatoxinas (AFs) son micotoxinas producidas principalmente por los hongos Aspergillus fla-

vus, A. parasiticus y A. nomius (Creppy 2002). La contaminación con AFs en alimentos de humanos y animales depende de diversos factores biológicos, destacando las condiciones de temperatura y hume-dad que prevalecen durante el cultivo y la cosecha, así como las condiciones del almacenamiento y el tipo de procesamiento al que se someten los productos. El mayor impacto de AFs a la salud son los efectos carcinogénicos, mutagénicos y teratogénicos descri-tos en animales y humanos (Battacone et al. 2003; Peraica et al. 1999). Es posible encontrar en diversos

alimentos aflatoxina B1 (AFB1), AFB2, AFG1, AFG2 y sus metabolitos AFM1 y AFM2, sin embargo se obser-van con mayor frecuencia AFB1 y AFG1. Se ha descrito a AFB1 como el agente hepatocarcinógeno más poten-te en mamíferos y el nivel de riesgo es ampliamente conocido (Virdis et al. 2008). Aunque la toxicidad de AFM1 es menor que AFB1, ambas se han clasificado como agentes carcinógenos Clase 1 en humanos por la Agencia Internacional de Investigaciones contra el Cáncer (IARC 2002). La AFM1 se encuentra en la le-che y productos lácteos de animales que consumieron alimentos contaminados con AFB1. Además, AFM1 es relativamente estable en la leche cruda y en los pro-

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WALDINA PATRICIA REYES VELÁZQUEZ ET AL.66

ductos de leche procesados, reportándose no afectar-se durante la pasteurización o elaboración de quesos u otros derivados (Munksgaard et al. 1987).

Investigaciones en otros países han demostrado la presencia de AFM1 en diferentes tipos de quesos, des-tacando la contaminación observada en Turquía, con porcentajes del 91.49% en quesos frescos y de 53% en quesos tipo Kashar (Aycicek et al. 2005); al noreste de Turquía se encontró en 71.42% de los quesos fres-cos y madurados tipo Kashar, civil y Gravier (Yapar et al. 2008); además de observarse en 82.4% de quesos blancos tipo salmuera procesados en pequeñas fábri-cas de tipo artesanal (Ardic et al. 2009). En Irán la contaminación con AFM1 fue de 82.5% en quesos tipo Feta (Kamkar 2006), mientras que en Slovenia solo se reportó en el 10% de quesos tipo artesanal frescos y semiduros (Torkar y Vengust 2008). En yogurt la frecuencia de presentación es contrastante, pudiendo encontrarse desde 2.8% en el yogurt comercial re-colectado en Cataluña, España (Cano-Sancho 2010) hasta 66.1% en el yogurt analizado en Irán (Fallah 2010). Existen numerosos reportes a nivel interna-cional sobre la contaminación con AFM1 en quesos y yogurt (cuadro 1). La variabilidad en la presentación de AFM1 en los productos lácteos depende de dife-rentes factores como el proceso de manufactura, los niveles de contaminación en la leche, el tipo de queso, grado de maduración y el método analítico emplea-do. Debido al impacto de AFM1 en la salud pública, los niveles en productos lácteos deben ser regulados estrictamente por las agencias gubernamentales. La Comunidad Europea (Commission Regulation, EC. 2006) y el Codex Alimentarius han descrito como lí-mite permitido 50 ng/kg de AFM1 en leche líquida, en polvo y en productos lácteos procesados (Codex Alimentarius Commission 2001), mientras que las regulaciones de Norte América determina como ni-vel máximo permitido 500 ng/kg (Stoloff et al. 1991). Aunque la Comunidad Europea no tiene establecido el límite máximo para AFM1 en quesos se adoptaron rangos entre 200 ng/kg (Holanda), 250 ng/kg (Sui-za y Austria) y 450 ng/kg (Italia) según las necesida-des de cada país. El Codex Alimentarius en Turquía define como límite permitido de AFM1 en la leche y quesos 50 ng/L y 250 ng/kg respectivamente (Anon 2002). La regulación en México para los niveles de AFM1 en leche y productos lácteos es publicada en la Norma Oficial NOM-243-SSA1-2010, estableciendo como nivel máximo 0.5 µg/L (500 ng/kg).

El estado de Jalisco, es el principal productor de leche a nivel nacional con más de 3.5 millones de li-tros por día, correspondiendo al 17.1% del total gene-rado por el país (SIAP 2008). En Jalisco se encuentra la región denominada “Los Altos”, ubicada en la zona centro del estado, y está representada por el 58.4%

de productores de tipo familiar, lo cual favorece a la fabricación a nivel artesanal de diversos productos lácteos, principalmente los quesos frescos, tipo ado-bera y Oaxaca y el yogurt natural y de frutas. A pesar que en México la calidad microbiológica de la leche y quesos se ha estudiado ampliamente, son pocos los reportes sobre el contenido de AFM1 (Carvajal et al. 2003; Pérez et al. 2008; Urbán et al. 2009; Reyes et al. 2009; Landeros et al. 2012) y no existen en el yo-gurt consumido por la población.

El objetivo de esta investigación fue determinar la presentación natural de AFM1 en muestras de quesos y yogurt elaborados en fábricas de tipo artesanal ubi-cadas en dos localidades del estado de Jalisco, ade-más de determinar posibles variaciones de acuerdo al tipo de queso o yogurt o por período de muestreo.


Un total de 150 muestras de quesos (47 frescos, 53 tipo adobera y 50 tipo Oaxaca) y 40 muestras de yogurt (18 natural y 22 de frutas) fueron recolectadas al azar de fábricas familiares de tipo artesanal en Guadalajara y en la región de los Altos, Jalisco. La mitad de las mues-tras de quesos se obtuvieron durante los meses de ve-rano (julio, agosto y septiembre) de 2008 y el resto durante los meses de invierno (enero, febrero y mar-zo) de 2009. Las muestras de yogurt se recolectaron durante julio y agosto de 2009. Todas las muestras fueron transportadas y almacenadas bajo condicio-nes apropiadas hasta el análisis. El método analítico utilizado para la determinación de AFM1 en las mues-tras de queso y yogurt fue la técnica de inmunoensayo enzimático (ELISA), de la marca R-Biopharm, (Ri-dascreen, Cat. No. R1111). El límite de detección para queso y yogurt fue de 50 y 5 ng/kg, respectivamente.

Determinación de AFM1 en quesos

El protocolo para la extracción y cuantificación de AFM1 fue descrito por Amer e Ibrahim (2010). Dos gramos representativos de la muestra de queso fue-ron mezclados con 40 ml de diclorometano y man-tuvieron en agitación durante 15 min. La suspensión fue filtrada y 10 ml del extracto se evaporaron con flujo de N2 a 60 °C. El residuo fue redisuelto en 0.5 ml de metanol, 0.5 ml de buffer fosfato salino y 1 ml de heptano. La mezcla fue centrifugada a 2700 g/15 °C durante 15 min. El sobrenadante de heptano fue removido y 100 µl de la alícuota fueron disueltos con 400 µl del buffer contenido en el kit. El procedimien-to para el inmunoensayo se aplicó de acuerdo a las indicaciones descritas por el fabricante, y finalmente los resultados se calcularon por medición de la absor-bancia a 450 nm en un lector de ELISA (ELx800, Bio-

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NIVELES DE AFLATOXINA M1 EN QUESOS Y YOGURT DE TIPO ARTESANAL, ELABORADOS EN DOS REGIONES DEL ESTADO DE... 67

Cuadro 1. Ocurrencia de AFM1 en quesos y yogurt reportados en otros países.

País Producto lácteo % (muestraspositivas/analizadas)

Promedio ng/kg Rango ng/kg Referencia

Egipto Queso blando 40 (20/50) 70.63 52-87.6 Amer y Ibrahim, 2010

Queso duro 38 (19/50) 132.24 51.6-182

Quesos procesados 22 (11/50) 52.52 51.8-54

Italia Yogurt 61 (73/120) 9.06 <1-32.1 Galvano et al., 2001

Queso 9.8 (4/41) 257 79.5-389 Virdis et al., 2008

Queso 16.6 (44/265) * 50-250 Montagna et al., 2008

Queso tipo Grana Padano (25) 246 111-413 Manetta et al, 2009

Yogurt * * 1-496 Galvano et al., 1998

Kuwait Queso 80 (32/40) 87.6 23.8-452 Dashti et al., 2009

Portugal Yogurt natural 4.2 (2/48) 44 43-45 Martins y Martins, 2004

Yogurt con fresas 33.3 (16/48) 51.12 19-98

Eslovenia Queso fresco 7.7 (1/13) 223 * Torkar y Vengust, 2008

Queso semiduro 7.7 (1/13) 68 *

España Yogurt 2.8 (2/72) 38.34 Max. 51.58 Cano-Sancho et al., 2010

Iran Queso Feta 82.5 (66/80) 410 * 150-2410 Kamkar, 2006

Turquía Queso blanco 5 (10/200) 253 100-200 Yaroglu et al., 2005

Queso Kashar 6 (12/200) 272 120-800

Yogurt natural 65.38 (68/104) * * Akkaya et al, 2006

Yogurt con frutas 66.66 (7/21) * *

Yogurt strained 44.23 (29/52) * *

Queso Kashar 82.6 (109/132) 194 50-690 Tekinsen y Eken, 2008

Queso blanco 82.4 (159/193) 284.6 52-860 Ardic et al., 2009

Queso 28 (14/50) * 20-2000 Filazi et al., 2010

Queso blanco 81.9 (59/72) 297 30-1200 Fallah, 2010

Yogurt 66.1 (45/68) 32 15-119

Queso 63 (38/60) * 12-378 Nurhan et al., 2011

Yogurt 56 (28/50) * 2.5-78* No reportado.

Tex, Instruments, Inc.). Los datos fueron procesados mediante el programa RIDA®SOFT desarrollado por R-Biopharm.

Determinación de AFM1 en yogurt

El protocolo para la extracción y cuantificación de AFM1 fue descrito por Akkaya et al. (2006). Las muestras de yogurt (25 ml) se sometieron a 80 °C por 3 min para inactivar las bacterias. Posteriormente las muestras se enfriaron a temperatura ambiente, se di-luyeron 1:10 en buffer PBS (pH 7.2) y se homogeniza-ron por agitación. Las muestras diluidas fueron uti-lizadas directamente para el inmunoensayo descrito por el fabricante.

Se realizó el análisis estadístico de los resultados utilizando el programa Sigma STAT V3.1 para Win-

dows, aplicando un nivel de significancia <0.05. Se aplicó la prueba de t Student para la comparación de medias entre los periodos de muestreo.


Quesos

El cuadro 2 muestra la distribución y niveles de AFM1 observada en las muestras de quesos y yogurt. Se de-tectaron niveles de AFM1 en el 86.7% (96/150) de las muestras de queso, 10.7% superaron el límite permiti-do por la legislación Mexicana (500 ng/kg), mientras que 26.7% de las muestras excedieron lo establecido en otros países. No se encontró diferencia estadística (p> 0.05) entre tipos de quesos (promedio: fresco 246 ng/kg; adobera 324 ng/kg; Oaxaca 253 ng/kg), sin

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embargo, los niveles promedio detectados de AFM1 en los tres tipos de queso durante los meses de invierno (promedio: 331.7 ng/kg) fueron mayores estadística-mente (p< 0.05) a los observados en los meses de ve-rano (196.8 ng/kg). Los efectos estacionales sobre los niveles de AFM1 en la leche pueden estar relacionados con el tipo de alimentación, debido a que durante in-vierno las vacas consumen un mayor número de in-gredientes en la ración por la menor disponibilidad de forrajes, mientras que en verano son más disponibles. Aún cuando las condiciones climáticas, el sistema de producción agrícola y las condiciones de alimentación se encuentran estrechamente relacionadas, no es fácil distinguir su influencia sobre la incidencia de AFM1 y los niveles de contaminación en productos lácteos (Galvano et al. 1998). La presencia de AFM1 en quesos es frecuente, ya que la toxina se concentra en la frac-ción caseína de la leche (Galvano et al. 1996). Además, diversas investigaciones han reportado incremento de la concentración de AFM1 en quesos en función del tipo de maduración, proceso tecnológico y cantidad de agua eliminada durante el procesamiento. En este estudio los tipos de quesos analizados son procesados con similar tecnología, excepto el tipo Oaxaca que in-cluye una etapa térmica posterior al cuajado para for-mar la pasta hilada. Los niveles detectados de AFM1 en las dos regiones evaluadas fueron mayores a los reportados por Yaroglu et al. (2005), Tekinsen y Eken (2008), Virdis et al. (2008), Torkar y Vengust (2008), Dashti et al. (2009), Manetta et al. (2009), Amer e Ibrahim (2010); y fueron similares a los observados en el queso tipo Feta Iraní (Kamkar 2006; Fallah 2010). Las variaciones en los niveles de contamina-ción con AFM1 en productos lácteos como el queso en los diferentes países puede ser debida a distintas razones, como el tipo de queso, el procedimiento de manufactura (Oruc et al. 2006), la región geográfica del país y el tipo de método analítico utilizado.

Es importante destacar que diversos estudios in-ternacionales sobre la contaminación con AFM1 en

productos lácteos se han desarrollado utilizando la metodología analítica de inmunoensayo enzimático ELISA (Van Egmond 1989; Sarimehmetoglu et al. 2004; Pei et al. 2009), técnica considerada por diver-sos investigadores de gran confiabilidad. Si bien, la cromatografía de líquidos de alta precisión (HPLC) es una técnica con mayor sensibilidad y precisión para la determinación de AFM1, el costo es limitante para análisis de rutina requerido en la mayoría de estable-cimientos o industrias lácteas. Kim et al. (2000) re-portan que las técnicas de HPLC y ELISA mostraron buena correlación en los resultados analíticos, aun-que tiene menor límite de detección ELISA.

Yogurt

Los niveles de AFM1 detectados en las muestras de yogurt se presentan en el cuadro 2. Del total de mues-tras analizadas 25% fueron positivas a AFM1, mos-trando niveles de 57.15 a 240 ng/kg, considerados dentro límite permitido por la NOM (500 ng/kg), sin embargo, todas superaron el nivel máximo estable-cido por la Comunidad Europea y el Codex Alimen-tarius (50 ng/kg). Algunos estudios han evaluado el efecto del procesamiento del yogurt sobre los niveles de AFM1, encontrándose ligero incremento en la con-centración de la micotoxina cuando el yogurt fue ela-borado a partir de leche contaminada y almacenada a 7 °C (Yousef y Marth 1989). En otro estudio Wise-man y Marth (1983) observaron que los tratamientos térmicos o la fermentación utilizada en el proceso de yogurt y kéfir no afectan la concentración de AFM1 en el producto. Los niveles de AFM1 observados en el yogurt artesanal elaborado en las dos regiones eva-luadas fueron similares a los reportados en Italia por Galvano et al. (1998), quienes encontraron AFM1 en 80% de las muestras (91/114) con niveles en un rango de 1–496.47 ng/kg. Posteriormente en otro estudio, Galvano et al. (2001) observaron menor contamina-ción en muestras de yogurt recolectadas en Italia, Bél-

Cuadro 2. Distribución y niveles de AFM1 detectados en las muestras de quesos y yogurt recolectadas en dos regiones de Jalisco.

Tipo de muestra Muestrasanalizadas

Positivas Niveles de AFM1 (ng/L o ng/kg)

Número de muestras que

superan la NOM (500 ng/kg)

Número de muestras que superan los

límites permitidos de otros países* (200-250 ng/kg)

N % Rango Media ± SD n (%) n (%)

Queso fresco 47 31 66.0 60-965 246±208 5 (16) 12 (38.7)

Queso adobera 53 33 62.3 55-1512 324±321 7 (21.2) 17 (51.5)

Queso Oaxaca 50 32 64.0 50-935 253±237 4 (12.5) 11 (34.4)

Yogurt natural 18 5 27.7 69.43-226.33 116.25±64 - 5 (100)

Yogurt de frutas 22 5 22.7 57.15-240.09 127.63±75 - 5 (100)SD: desviación estándar. *Holanda, Austria y Suiza.

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gica y Francia (1.0–32.1 ng/kg). Mientras que la con-taminación observada al sur de Corea fue de 17–124 ng/kg en el 50% de las muestras (Kim et al. 2000). En Turquía, Aydemir et al. (2011) reportan alto por-centaje de muestras positivas (87.5%), con niveles de AFM1 de 10 a 475 ng/kg; 11.53% de las muestras de yogurt natural y 9.52% de yogurt de frutas superaron el límite permitido. Es importante mencionar que en el presente estudio, los niveles promedio observados en los tipos de yogurt evaluados fueron similares es-tadísticamente (natural: 116.25 ng/kg y frutas: 127.63 ng/kg). Algunas investigaciones muestran efectos contradictorios respecto a la influencia del proceso durante la elaboración del yogurt sobre los niveles de AFM1. Yousef y Marth (1989) y Govaris et al. (2002) consideran importante las variaciones en el pH del yogurt; Rasic et al. (1991) se refieren como determi-nante la concentración presente de AFM1 en la leche; mientras que Pieride et al. (2000) mencionan a las di-ferentes condiciones de fermentación; en tanto You-sef y Marth (1989) y Blanco et al. (1993) consideran importante posibles cambios en las propiedades fisi-coquímicas de la caseína presente en la leche.

Debido a que AFM1 es un metabolito de AFB1 ex-cretado en la leche, la incidencia de niveles de AFM1 en quesos y yogurt implica la presencia de nive-les elevados de AFB1 en el alimento, por lo tanto es prioridad reducir la contaminación de aflatoxinas en las materias primas y forrajes que se incluyen en las raciones de bovinos productores de leche, así como implementar medidas preventivas que eviten los fac-tores que favorecen la producción de dichos metabo-litos en el almacenamiento del alimento o durante el procesamiento de productos lácteos.

Conclusiones

La presencia de AFM1 en la leche y productos lácteos es considerada de riesgo para la salud humana, par-ticularmente para la población infantil, por lo que no debe minimizarse ya que son impredecibles las condiciones climáticas y ambientales, además de las deficiencias en los sistemas de producción agrícola, caracterizados por limitaciones económicas o esca-sos conocimientos, para el manejo de la prevención y control de micotoxinas. Los resultados del presente estudio deben ser considerados con cautela al proce-der de un número limitado de muestras, sin embargo indican la presencia de AFM1 en productos lácteos que se consumen en México. Por lo tanto, deben rea-lizarse nuevas investigaciones que permitan obtener un esquema general de la contaminación en el país. Además, las agencias gubernamentales deben pro-porcionar información a los productores de leche y empresas relacionadas con la elaboración de produc-

tos lácteos, sobre la importancia de AFB1 y AFM1 en la alimentación y las consecuencias a la salud pública.d

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Instrucciones para los autores

scientia-CUCBA es una publicación del Centro Uni-versitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Guadalajara. Publica trabajos sobre temas relacionados con las ciencias biológicas y agro-pecuarias, originales, inéditos o en versiones autori-zadas. Se constituyó con el objeto de ofrecer a los pro-fesionales de estas ciencias y áreas afines, una opción para publicar los resultados de sus investigaciones y así fomentar la difusión del conocimiento generado, principalmente en este Centro.

En scientia-CUCBA se publican contribuciones resultado de investigaciones teóricas o experimenta-les, de trascendencia local, estatal, regional, nacional o internacional de diferentes tipos:

EditorialEs: aportaciones del editor o de un invita-do, puede tratarse, o no, de temas del ámbito de las ciencias biológicas y agropecuarias.

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notas brEvEs: hallazgos y aportaciones breves basa-dos en resultados de investigación reciente; resulta-dos de modificaciones o perfeccionamiento de algún método, técnica experimental, análisis estadístico, aparato, instrumento de campo, criadero, invernade-ro o laboratorio. Entre 750 y 1500 palabras.

Se publicarán artículos escritos en español, acep-tándose algunos redactados en inglés, francés o por-tugués, siendo necesario agregar un resumen muy amplio en español. La revista no se compromete a realizar traducciones.

Las contribuciones se deben enviar a:

M. en C. Yolanda Feria CuevasJefa de la Unidad EditorialCorreo electrónico: [email protected] [email protected]

Proceso de evaluación

El Editor-en-Jefe hará una primera revisión, corro-borando que el manuscrito corresponde a la línea editorial, así como de la presentación y estilo general del mismo. Posteriormente se enviará, omitiendo los datos de los autores, a dos revisores especialistas en el tema. En caso de divergencia entre los revisores, el artículo será enviado a un tercer revisor.

El dictamen y las observaciones de los revisores se harán del conocimiento de los autores. Si estas úl-timas son atendidas y realizadas, el manuscrito será aceptado para su publicación.

Estructura y formato de las contribuciones

Los trabajos enviados deberán estar escritos con fuen-te tipo Georgia de 12 puntos a doble espacio, con un máximo de 30 cuartillas incluyendo cuadros y figuras.

Estarán conformados por Título; Información de los autores; Resumen, en español e inglés; Palabras clave, en español e inglés; Texto; Cuadros, figuras y pies de figuras; Agradecimientos; y Referencias.

título: Redactado de manera clara. Incluir los nom-bres completos de los autores en el orden en el que aparecerán en la publicación; institución(es) de afi-liación; nombre del departamento, dirección, teléfo-no y correo electrónico del primer autor o autor de correspondencia.

rEsumEn Estructurado: Incluirá objetivos, métodos, resultados y conclusiones de manera sucinta, con un máximo de 300 palabras. Se incluirá, en un Abstract, la misma información en inglés.

Palabras clavE: Cinco palabras que identifiquen el tema del artículo listadas en orden alfabético. Se de-berán incluir también en inglés Keywords.

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INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES74

tExto: Cuando la contribución sea el informe de una investigación, la estructura será: Introducción, con el propósito del trabajo y los antecedentes que lo sus-tenten. Materiales y métodos, explicando, con dete-nimiento el procedimiento, el equipo y las técnicas utilizadas, con el suficiente detalle para que pueda ser replicado. Si el material experimental es humano, no se identificará a los participantes en el proyecto y los procedimientos deberán ceñirse a las normas éticas sobre experimentación humana de la Declaración de Helsinki. Se incluirán los nombres genéricos, dosis y vías de administración de los fármacos y productos químicos utilizados. Si la experimentación se realizó en animales, se deberán seguir y mencionar explíci-tamente, los lineamientos de la Ley General de Sa-lud de la República Mexicana y los establecidos en el documento Guide for the care and use of laboratory animals, publicado por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos de América*. Resultados.

Tanto el texto como los cuadros y figuras, deben seguir una secuencia lógica; el número de cuadros y figuras no debe exceder la mitad menos una del nú-mero de páginas del texto (p.e. si el trabajo tiene 16 páginas, se sugiere que el número total de cuadros y figuras no debe ser mayor a 7). Discusión. Se destaca lo más importante y novedoso del trabajo, se comen-tan los resultados y se comparan con otros de estudios parecidos, y se presentan las conclusiones. Agrade-cimientos. A personas o instituciones que aportaron al contenido científico, técnico o económico. Referen-cias. De uno a dos autores se escribirán en el texto, los apellidos y el año de la publicación; de tres en adelan-te se escribirá el apellido del primer autor seguido de et al. y el año de publicación.

agradEcimiEntos.

rEfErEncias: Todas las referencias bibliográficas se presentarán en orden alfabético, cronológico y con alineado de forma francesa, al final del documento. Si se cita más de una publicación con el mismo año por los mismos autores, utilice el sufijo, a, b, o c en segui-da del año de la publicación. Por ejemplo: Smith et al. 1997; Imamura and Debata 1996; Honan et al. 1995a ; Honan et al. 1995b.

Las referencias deben listar el apellido del autor seguido por la(s) inicial(es), año, título del artículo, nombre completo de la revista (en cursiva), volumen, primera y última páginas. A continuación se mues-tran la manera de presentar las referencias según la fuente:

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notas al PiE: Mantener el uso de notas al pie a un mínimo. Una nota al pie puede incluir la designa-ción de un autor correspondiente del documento, información de la dirección vigente para un autor (si es diferente de la que se muestra en la afiliación), y aparecerá al final de la página del título. Los apoyos económicos para la investigación deben aparecer en una sección separada de Agradecimientos al final del documento, no en una nota al pie. Reconocimientos de la asistencia de colegas o notas similares de apre-ciación pertenecen a una sección de Agradecimientos y no en notas al pie.

Las notas al pie deben de estar indicadas en el tex-to con los siguientes símbolos: * (asterisco o estrella), † (daga), ‡ (doble daga), ¶ (marca de párrafo), § (mar-ca de sección), ǁ (paralelas), # (signo de número). No usar números para llamar notas al pie, ya que pueden ser confundidos como llamados a referencias biblio-gráficas o exponentes.

scientia-CUCBA 14(1—2):73—75.2012

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES 75

Las notas al pie dentro de una tabla deben ser in-dicadas por los mismos símbolos mencionados ante-riormente. Anotar las notas al pie de una tabla direc-tamente debajo de ella.

Recomendaciones para las figuras, gráficas y fotografías

1. Preferiblemente no incluir las figuras/fotografías/ gráficos en el documento de texto del artículo, sólo las llamadas a estos, p. ej. “En la figura 2 se puede observar…”.

2. En un documento de Word independiente colocar las imágenes correspondientes a las figuras/fotogra-fías/gráficos con su respectivo texto descriptivo (pie de figura/fotografía), a manera de listado de figuras/fotografías/gráficos.

3. Incluir por separado los documentos (archivos) originales de las imágenes con nombres que se refie-ran al número de figura/fotografía/gráfico de que se trate, p. ej. “figura1.tif”, “foto3.tif”.

4. Para las imágenes preferir el formato TIF sin com-presión o con esta mediante el algoritmo LZW (sin pérdida de calidad). En caso de utilizar formato JPG (con pérdida de calidad) fijar el nivel de compresión que mantenga la mayor calidad posible de la imagen.

5. Las imágenes deberán entregarse con la mayor resolución y calidad posible. Una imagen a tamaño carta deberá contener 2550 × 3300 pixeles. Una de media carta 2550 × 1650 pixeles. Se recomienda que ninguna imagen tenga menos de 950 × 600 pixeles.

6. Se recomienda que los gráficos generados en Excel, CorelDraw, Illustrator o similares (gráficos vectoria-les), sean entregados en formato PDF.

7. Habitualmente la revista se imprime en blanco y negro (escala de grises), por lo que se deberá tomar en cuenta esta limitación al momento de incluir gráficos o mapas en los que se requiera representar múltiples datos.


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Fe de erratas

A solicitud de los autores Roberto Maciel Flores, José Guadalupe Rosas Elguera, Laura Elizabeth Peña García y Jorge Alberto Pérez de la Rosa, en el artículo “Evolución bio-geologica durante el pleistoceno, en la Sierra La Primavera, Jalisco, México”, publicado en Scientia-CUCBA vol. 13 (1–2), pp. 53–71, 2011, el cuadro 7 se susti-tuye por el siguiente:

Cuadro 7. Datos climatológicos de la SP y SB.

DATOS AGROCLIMATOLÓGICOS

Localidad Primavera Sierra de Bolaños

Latitud y Longitud 20° 39' /104° 34' 24° 51'/ 103° 50'

Altura 2000 msnm 2640 msnm

Clave del mpio. 120 61

Estación meteorológica 123

T° media 18-22 °C 14-18 °C

T° máxima 26-30 °C 22-26 °C

T° mínima 14-18 °C 14-18 °C

Amplitud térmica 14-16 °C 12-14 °C

T° diurna 22-26 °C 22-26 °C

T° nocturna 14-18 °C 14-18 °C

T° media anual 18-20 °C menor 18 °C

T° máxima anual 26-30 °C 22-26 °C

T° mínima anual 10-12 °C menor 10 °C

Pp Jun-Oct 600-800 800-1200

Pp Julio 150-200 150-200

Pp anual 600-800 500-600

Evaporación Jun-Oct 800-900 700-800

Evaporación anual mayor 2200 2000-2200

Indice de humedad Jun-Oct 0.8-1.2 0.8-1.2

Indice de humedad Agst-Spt 0.8-1.2 menor 0.8

Indice de humedad anual 0.4-0.8 menor 0.4

Fecha de inicio P. humedo Jul 16-31 Agosto 1-15

Fecha de término Sept 16-30 Sept 1- 15

Duración del periodo húmedo 60-90 días 60-90 días

Fuente: Villalpando F., García E. 1993. Agroclimatología del Estado de Jalisco. Universidad de Guadalajara, CUCBA, Lab. Bosque La Primavera. México.

DIRECTORIO DE LA UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

Marco Antonio Cortés GuardadoRECTOR GENERAL

Miguel Ángel Navarro NavarroVICERRECTOR EJECUTIVO

José Alfredo Peña RamosSECRETARIO GENERAL

Salvador Mena MunguíaRECTOR DEL CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y

AGROPECUARIAS (CUCBA)

Enrique Pimienta BarriosSECRETARIO ACADÉMICO DEL CUCBA

José Rizo AyalaSECRETARIO ADMINISTRATIVO DEL CUCBA

Alfredo Ignacio Feria VelascoCOORDINADOR DE INVESTIGACIÓN DEL CUCBA

CERTIFICADO DE RESERVA DE DERECHOS AL USO EXCLUSIVO NÚMERO: 04-2003-101714124100-102

La opinión que se expresa en los artículos es responsabilidad de los autores. Se autoriza la reproducción total o parcial de los trabajos, siempre y cuando se cite la fuente y no sea con fines de lucro.

Auxiliar en la ediciónM. EN C. YOLANDA FERIA CUEVAS. Jefa de la Unidad EditorialCoordinación de Investigación CUCBA, Universidad de Guadalajara.

Diseño e impresión

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Universidad de Guadalajara

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ISSN 1665-8493

9 771665 849006 20410

Burrito y Palomo, nuevas variedades de frijol para JaliscoRogelio Lépiz Ildefonso, Santiago Sánchez Preciado, Alfredo González Ávila, Eduardo López Alcocer y Eduardo Rodríguez Guzmán 61Niveles de aflatoxina M1 en quesos y yogurt de tipo artesanal, elaborados en dos regiones del estado de JaliscoWaldina Patricia Reyes Velázquez, Severiano Patricio Martínez, Armando Toral Flores, Mayra Serrano Meckler y Federico Rojo 65Instrucciones para los autores 73Fe de erratas 77

Contenido (continuación)

VOLUMEN

14NÚMERO 1

–2ENERO-DICIEMBRE DE 2012

revista científica issn 1665-8493

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