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Herrera Luisana
Resistencia a la meticilina y producción de betalactamasa en staphylococcus aureus aislados a
partir de productos lácteos de fabricación artesanal
Universidad de Los Andes-Facultad de Farmacia y Bioanálisis-Postgrado en Microbiología. 2009.
p. 68
Venezuela
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&view=pdf&docu=26462&col=5
¿Cómo citar?
(i UNI\'ERSIDAD m: LOS ANDES
Universidad de los Andes
Facultad de Farmacia y Bioanálisis
Postgrado de Microbiología
Resistencia a la meticilina y producción de betalactamasa en
Staphylococcus aureus aislados a partir de productos lácteos
de fabricación artesanal
Autor: Leda. Luisana Herrera
Tutor: MSc. Kiralba Sánchez
DIG1TALIZAD.f.\ http:/ltesis.ula.ve
Mérida, Mayo 2~
INDICE DE CONTENIDO
Pág.
Resumen
Dedicatoria ii
Agradecimientos iii
Índice de Figuras iv
Índice de Tablas v
Introducción 1
l. Marco Teórico 3
1.1. Generalidades 3
1.2. Resistencia de Staphylococcus aureus a betaláctamicos 7
1.2.1. Hiperproducción de betalactamasa 8
1.2.2. Resistencia por modificación de proteínas fijadoras de 9 penicilina
1.2.3. Resistencia intrínseca a la meticilina 10
1.3. Métodos de laboratorio para detección de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina 12
1.3.1. Prueba de difusión del disco 13
1.3.2. Siembra en agar Mueller-Hinton suplementado con 4% de NaCI y 6 Jtg/ mL de oxacilina 14
1.3.3. Concentración Inhibitoria Mínima 14
1.3.4. Prueba de "Screening" de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina por aglutinación de partículas de 15 látex
1.3.5. Métodos Moleculares 15
1.4. Epidemiología de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina 16
1.5. Antecedentes de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina en 18 alimentos
11. Objetivos 22
2.1. Objetivos Generales 22
2.2. Objetivos Específicos 22
III. Materiales y Métodos 23
3.1. Tipo de Estudio 23
3.2. Muestra 23
3.3. Procesamiento del producto lácteo 23
3.4. Aislamiento e identificación 25
3.5. Prueba del disco de 30 pg de cefoxitin 25
3.6. Prueba de betalactamasa 27
3. 7. Concentración Inhibitoria Mínima a la oxacilina 27
3.8. Determinación de PBP2a 27
3.9. Análisis estadístico de los datos 27
IV. Resultados 30
V. Discusión 36
VI. Conclusiones 40
VII. Recomendaciones 41
VIII. Bibliografía 42
IX. Anexos 56
Resumen del Trabajo de Grado para optar al Titulo de Especialista en
Microbiología Clínica
Resistencia a la meticilina y producción de betalactamasa en
Staphylococcus aureus aislados a partir de productos lácteos
de fabricación artesanal
Autor: Leda. Luisana Herrera Tutora: MSc. Kiralba Sánchez
El papel de los alimentos como posible fuente de bacterias resistentes a los antibióticos,
no ha sido suficientemente estudiado. Existen pocos datos nacionales e internacionales
sobre la circulación de SARM en derivados lácteos. No se encontró antecedentes de S.
aureus productores de betalactamasa en alimentos. Con el propósito de conocer la
prevalencia de SARM y la frecuencia de S. aureus productores de betalactamasa en
productos lácteos de fabricación artesanal, se analizaron 92 cepas de S. aureus aisladas
a partir de quesos y cuajadas, provenientes de distintos expendios del Municipio
Libertador en Mérida-Venezuela. La susceptibilidad a la meticilina se determinó a
través de las siguientes pruebas: difusión del disco de cefoxitin (30J.tg), concentración
inhibitoria mínima a la oxacilina y detección de PBP 2a. La presencia de betalactamasa
se detectó por medio del kit beta-lactamase (OXOID). En este estudio la prevalencia
de SARM fue de 1,09% (1192), con una CIM de 32 J.tg/mL. La cepa aislada fue
productora de PBP2a. La frecuencia de betalactamasa fue de 11,95%. Estos resultados
demuestran la existencia de SARM en alimentos de consumo masivo; aún cuando se
encuentre en bajo porcentaje, los alimentos podrían representar un factor de riesgo en
la transmisión y diseminación de microorganismos resistentes.
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AGRADECIMIENTOS
A la ilustre Universidad de los Andes.
Al Consejo Científico, Humanístico y Tecnológico (CDCHT-ULA).
A mi tutora la MSc. Kiralba Sánchez, por la confianza depositada en mi para la
realización de este estudio y por toda su paciencia y dedicación.
A la MSc. Beatriz Millán, por toda la colaboración prestada en la realización de esta
investigación.
Al personal de la Sección de Preparación de Medios de Cultivo del Departamento de
Microbiología y Parasitología.
A Ingry Daboín y Rolando Barroeta, por brindarme su amistad, abrirme las puertas de
su casa, y por todos los momentos compartidos durante mi estadía en Mérida.
A mis compañeros de postgrado: María Alejandra, Poema, María Beatriz, Pablo y
Erick, por todos los momentos vividos y aprendizaje a nivel personal y profesional.
Fig.l
Fig. 2
Fig. 3
Fig. 4
Fig. 5
ÍNDICE DE FIGURAS
Aislamiento de Staphylococcus aureus a partir de
queso o cuajada.
Prueba de difusión del disco de cefoxitin de 30J.Lg en
Staphylococcus aureus
Concentración inhibitoria mínima a la oxacilina
en Staphylococcus aureus
Determinación de PBP2a
Discriminación de las 92 cepas de Staphylococcus
aureus aisladas a partir de quesos y cuajadas según la
producción de betalactamasa y resistencia a la
meticilina
Pág.
24
26
28
29
31
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Sensibilidad al disco de cefoxitin 30Jtg de las 92 cepas
de Staphylococcus aureus aisladas a partir de
quesos y cuajadas. Mérida, Noviembre 2008-Abril
2009
Tabla 2 Producción de Betalactamasa en 92 cepas de
Staphylococcus aureus aisladas a partir de quesos y
cuajadas. Mérida, Noviembre 2008-Abril
Pág.
32
2009 33
Tabla 3 Presencia de betalactamasa y resistencia a la metieilina 35
(oxacilina) en 92 cepas aisladas de quesos y cuajadas de
fabricación artesanal. Mérida, noviembre 2008-abril
2009
Introducción
Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) surgió en los ambientes
hospitalarios a principios de la década del sesenta. En los años siguientes, estas cepas
fueron aumentando su prevalencia en diferentes áreas geográficas, a tal punto, que en la
actualidad se consolida como uno de los principales patógenos intrahospitalarios a nivel
mundial, con una prevalencia que puede alcanzar hasta el 70% en unidades hospitalarias
de alto riesgo (NNSI, 2004; Hori, 2005; Salomao y col., 2008).
Los primeros casos de infección extra hospitalaria por SARM se presentaron en la
década del ochenta entre adictos a drogas intravenosas, individuos recluidos en
instituciones de cuidado prolongados y en personas en contacto frecuente con servicios
sanitarios. Algunos años más tarde, SARM comenzó a aparecer en individuos de la
comunidad sin factores de riesgo, convirtiéndose en un patógeno emergente en países
industrializados con prevalencias que oscilan entre 9%-59% (Kaplan y col., 2005; Prego
y col., 2006; Gil y Velazco, 2009).
En los últimos 1 O años, se ha observado cambios importantes en la epidemiología de
SARM, evidenciándose por el incremento en el número de reportes de casos
provenientes de fuentes no humanas, como son, los animales y los alimentos. Al
respecto, existen evidencias de la presencia de SARM en alimentos de origen animal,
como la carne, leche y sus derivados. Los hallazgos sugieren una baja circulación de
estas cepas resistentes en productos alimenticios, que oscilan entre menos del 1% hasta
3,7% (Lee, 2003; Kitai y col., 2005; Normanno y col., 2007). No obstante, el papel de
los alimentos en la transferencia de bacterias resistentes o genes de resistencia no ha
sido suficientemente estudiado.
También se han registrado algunos brotes epidémicos causados por SARM transmitidos
por alimentos en pacientes con compromiso del sistema inmunológico. Mediante
estudios epidemiológicos y moleculares, se logró demostrar que la cepa implicada en el
brote procedía del manipulador del alimento (Kluytmans y col., 1995, Jones y col.,
2002).
La evaluación sanitaria de los alimentos, en el caso particular de S. aureus, se
circunscribe a determinar la carga bacteriana en el producto y en los casos de brotes por
S. aureus toxigénicos, se investiga la presencia de la toxina. No se realizan pruebas de
susceptibilidad a los antimicrobianos de las cepas aisladas de alimentos o manos de
manipuladores.
En virtud de la importancia epidemiológica que representa la circulación de SARM
resistentes a los antimicrobianos en los alimentos, y en vista de la poca información que
existe en Venezuela y en particular en el estado Mérida, se plantea con fines de
vigilancia epidemiológica, investigar la prevalencia de SARM en derivados lácteos de
fabricación artesanal, como el queso y la cuajada, por su alto consumo en la población
merideña.
2
l. Marco Teórico
1.1. Generalidades
Staphylococcus aureus es una especie de gran importancia clínica y epidemiológica, ya
que ocasiona una amplia gama de enfermedades; desde infecciones cutáneas
superficiales hasta infecciones de partes blandas y ósteo-articulares. Así mismo, sepsis,
neumonías, endocarditis, infecciones del sistema nervioso central e inclusive
toxiinfecciones, como síndrome del shock tóxico, y enfermedades transmitidas por
alimentos (Galiana, 2003).
El género Staphylococcus pertenece al Phylum 2 del Dominio Bacteria; Clase Bacilli;
Orden Bacillales y Familia Staphylococcaceae. El género incluye mas de 40 especies,
siendo S. aureus la especie representativa del mismo (Bergey' s, 2008). Son bacterias
grampositivas, en forma de cocos, que miden de 0,8 - 1 Jlm de diámetro, inmóvil; con
una disposición típica en agrupaciones irregulares semejantes a racimos de uvas
(Koneman y coL, 2005).
Entre otras características resaltantes, tenemos que S. aureus, es un microorganismo no
exigente, crece en un amplio rango de temperaturas (15°C- 45 °C) y de pH (4,0- 9,8).
Así mismo, tolera altas concentraciones de sal, hasta de 20% de NaCl, siendo esta una
propiedad utilizada para el aislamiento en medios selectivos. También, es resistente a la
desecación, congelación y el calor. En agar sangre, S. aureus forma colonias entre 1 y 3
mm, algunas cepas producen un pigmento amarillo típico, debido a la presencia de
carotenoides; muchas cepas producen beta-hemólisis (Bustos y col., 2006).
Dentro del género, Staphylococcus aureus es la especie más virulenta para el hombre, se
caracteriza por poseer numerosos factores de patogenicidad tanto estructurales como no
estructurales, entre los primeros se citan el genoma y la pared celular.
El genoma de S. aureus está representado por un cromosoma circular (de
aproximadamente 2.800 pares de bases), además de elementos extracromosomales
como profagos, plásmidos y transposones. Los genes responsables de la virulencia y de
la resistencia a los antimicrobianos se encuentran tanto en el cromosoma como en los
elementos extracromosomales; tal es el caso de la resistencia a la meticilina que es
conferida por el gen mecA, el cual esta localizado dentro de un locus inestable en el
cromosoma denominado cassette cromosoma] estafilocócico mee (SCCmec, según
siglas en inglés) (Hurtado y col., 2002).
La pared celular de S. aureus esta constituida por una capa extensa de peptidoglicanos,
que comprende polímeros de N-acetilglucosamina y de ácido N-acetilmurámico
entrelazados. La capa de peptidoglicano proporciona forma y estabilidad al
microorganismo. Entre sus propiedades biológicas destacan, su capacidad para inducir
la producción de interleucina 1 (IL-1 ), activación del complemento y estimulación de la
producción de anticuerpos opsonizantes (Koneman y col., 2005).
Existen otros componentes incluidos en la pared celular, como los ácidos teicoicos,
encargados de mediar la adherencia de los estafilococos a las superficies mucosas
4
mediante uniones específicas a la fibronectina. La capa externa de peptidoglicano
incorpora distintas proteínas facilitadoras de la adhesión, el factor de agregación y la
proteína A; esta última es específica de S. aureus, encontrándose en cantidades
variables en distintas cepas. Su mecanismo de acción consiste en la unión con la región
FC de las inmunoglobulinas, interfiriendo así, en el proceso de opsonización e ingestión
de microorganismos por parte de los leucocitos polimorfonucleares. Además, activa el
complemento y estimula reacciones de hipersensibilidad de tipo inmediata y retardada
(Koneman y col., 2005; Murray y col., 2004).
Las múltiples interacciones de los compuestos de superficie bacteriana favorecen la
formación de biopelículas (biofilms ), lo cual contribuye con la adherencia de S. aureus
a las superficies celulares y materiales inertes. Este mecanismo permite la sobrevivencia
del microorganismo por largos períodos de tiempo y lo hace resistente a las condiciones
adversas del medio ambiente (Chaves y col., 2000).
Entre los factores de virulencia de tipo no estructural, se cita la producción de diversas
enzimas entre las cuales se encuentran:
• Coagulasa: Las cepas de S. aureus poseen dos formas de coagulasa, la ligada o
factor de agregación y la libre o extracelular. Ambas tiene un efecto similar; es
decir, convertir el fibrinógeno en fibrina. Este carácter esta asociado a la especie
y vinculado a la patogenicidad, ya que recubren las células bacterianas con
fibrina haciéndolas resistentes a procesos de opsonización y a la fagocitosis.
• Catalasa: actúa inactivando el peróxido de hidrógeno y los radicales libres
tóxicos, formados por el sistema mieloperoxidasa dentro de las células
fagocíticas, después de la ingestión de estos microorganismos.
5
• Hialuronidasa: Hidroliza el ácido hialurónico presente en la matriz celular del
tejido conectivo y facilita la diseminación de la bacteria a los tejidos.
• Penicilinasa: Esta enzima inactiva a la penicilina mediante la hidrólisis de su
anillo ~-láctamico, bloqueando así la acción de este antibiótico.
• Lipasas: Todas las cepas de S. aureus producen distintas lipasas las cuales
hidrolizan los lípidos, lo que resulta esencial para la supervivencia del
estafilococo en las áreas sebáceas del cuerpo (Koneman y col., 2004; Murray y
col., 2004; Domínguez y Rodríguez, 2006).
Entre las toxinas o proteínas extracelulares que produce S. aureus se señalan:
• Toxinas a ~ 8 y: Son sintetizadas por la mayoría de las cepas de S. aureus,
poseen capacidad hemolítica y pueden afectar eritrocitos, leucocitos,
macrófagos, plaquetas y fibroblastos.
• Leucocidina de Panton- Valentine: Esta toxina es sintetizada por el 3% de las
cepas de S. aureus, induce la desgranulación de los leucocitos
polimorfonucleares y la liberación de mediadores de la inflamación. Este factor
de virulencia se encuentra entre el 77% y 96% de aislamientos de
Staphylococcus aureus resistente a la meticilina adquiridos en la comunidad
•
(SARM-AC).
Toxinas exfoliativas: Son producidas aproximadamente entre el 5 y 1 O% de las
cepas de S. aureus, se han identificado dos formas: A (termoestable) y la B
(termolábil), las cuales, actúan destruyendo los desmosomas del estrato
granuloso de la epidermis.
6
• Toxina del síndrome del shock tóxico: El 30% de los S. aureus produce esta
toxina. Es una proteína termoestable, codificada en genes cromosómicos, actúan
como superantígenos. Se unen al complejo mayor de histocompatibilidad,
proteínas clase II, causando proliferación de células T y liberación de citoquinas.
• Enterotoxinas: Se han identificado ocho tipos A, B, C, D, E, G, H, 1; son
termoestables y resistentes a las enzimas digestivas. Poseen propiedades
eméticas y causan gastroenteritis. Aproximadamente entre el 30% y 50% de las
cepas de S. aureus las producen. Son inmunomoduladoras, característica propia
de los superantígenos (Prescott, 1999; Hurtado y col., 2002; Domínguez y
Rodríguez, 2006).
La producción de algunas enzimas y toxinas son características variables en diferentes
cepas de S. aureus, la detección de estas proteínas, se ha utilizado como marcador
diferencial para la identificación de este microorganismo. Es importante señalar, que la
mayoría de las enfermedades ocasionadas por S. aureus, resultan de la acción
combinada de varios determinantes de patogenicidad con diversas funciones:
adherencia, invasión de tejidos, evasión de la respuesta inmune y toxicidad (Mandell,
2002).
1.2. Resistencia de Staphylococcus aureus a los antibióticos betaláctamicos
La resistencia a los antimicrobianos plantea una amenaza grave y cada vez mayor para
la salud pública a nivel mundial, involucrando cada día nuevas especies bacterianas y
nuevos mecanismos de resistencia, tal como, es el caso de S. aureus, el cual ha
7
desarrollado numerosos mecanismos de resistencia a diferentes grupos de antibióticos,
producto del uso extensivo de estos con fines terapéuticos (Martínez, 2003).
Desde la introducción de la penicilina en 1940, mas del 90% de las cepas de S. aureus
han adquirido resistencia a este tipo de antibióticos (penicilina G, ampicilina), debido a
la producción de una enzima tipo betalactamasa, conocida con el nombre de
penicilinasa, por su afinidad por esta clase de moléculas; siendo el primer mecanismo
de resistencia desarrollado por este microorganismo (Olsen y col., 2006).
Posteriormente, en 1959, fue incorporada la meticilina al mercado, una penicilina
semisintética resistente a la acción de la penicilinasa; no obstante, a solo dos añosde su
introducción Jevons (1961), en Londres, realizó el primer reporte de S. aureus resistente
a la meticilina (SARM). Desde entonces, se ha extendido por todo el mundo,
reconocido como una de las principales causas de infección nosocomial (Watson y col.,
2003).
Se han descrito diversos mecanismos que explican la resistencia de S. aureus a la
meticilina, como: la hiperproducción de betalactamasa (por fenómenos de tolerancia),
resistencia por modificación de proteínas fijadoras de penicilina (PBP, según sus siglas
en inglés) o sobreproducción de PBP 4, y la resistencia intrínseca a la meticilina
(Cáceres y col., 1998; Gil, 2000).
1.2.1. Hiperproducción de betalactamasa
La mayoría de las cepas de S. aureus producen una enzima betalactamasa de tipo
inducible (penicilinasa), cuya liberación dependerá de las características propias de la
cepa en estudio y de las condiciones de crecimiento a las cuales sea sometida; dicha
8
enzima tiene la capacidad de hidrolizar lentamente o parcialmente a las penicilinas
resistentes a penicilinasas y cefalosporinas, siempre y cuando se produzca "in vitro" en
cantidades suficientes (Me Dougal y Thomsberry, 1986).
La hiperproducción de betalactamasa, ocasiona un incremento en la concentración
inhibitoria mínima (CIM) a la oxacilina (4-8 ¡.tg/mL), lo que se traduce en una
resistencia límite a dicho antibiótico; este tipo de cepas no producen PBP2a, presentan
baja frecuencia entre los aislados de SARM, y no exhiben resistencia cruzada con otros
betaláctamicos, ni multiresistencia hacia otras familias de antibióticos (Montanari y col.,
1990; Torres, 2002; Castellanos y col., 2008).
1.2.2. Resistencia por modificación de las proteínas fijadoras de penicilina
En las cepas de S. aureus susceptibles a la meticilina, se han descrito 4 proteínas
fijadoras de penicilina, PBPI, PBP2, PBP3, y PBP4 con pesos moleculares de 85, 81,
75 y 45 kDa respectivamente. Las PBP son proteínas unidas a la membrana celular que
intervienen en la síntesis de la pared a través de la actividad carboxipeptidasa y
transpeptidasa, por lo tanto, son los blancos de los antibióticos betalactámicos. Las PBP
disminuyen la capacidad de unión al antibiótico, debido a ligeras modificaciones que se
producen específicamente en PBP1 y PBP2; en consecuencia, se produce la pérdida del
acceso del fármaco a la cadena de peptidoglicano en elongación (Murray y col., 2004).
Estas cepas son denotadas con el acrónimo MODSA, por sus siglas en inglés (modified
S. aureus) (Tomasz y col., 1989).
9
La hiperproducción de betalactamasas, la alteración de las PBP e hiperproducción de
PBP 4, son considerados mecanismos de "falsa resistencia", ya que no existen
evidencias clínicas que sugieran su relación con fracasos terapéuticos; demostrándose a
través de ensayos en modelos animales que el tratamiento basado en penicilinas
resistentes a penicilinasa es efectivo contra las cepas de S. aureus que posean alguno de
los mecanismos mencionados (Unal y col., 1994; Higashi y col., 1999; Castellanos y
col., 2008).
Las cepas de S. aureus que presentan alguno de los mecanismos de "falsa resistencia",
exhiben una CIM a la oxacilina cerca del límite de interpretación de resistencia,
conocidas como cepas BORSA (por su siglas en inglés, Borderline S. aureus) (PAHO,
2008).
1.2.3. Resistencia intrínseca a la meticilina
El término de resistencia "intrínseca" a la meticilina en S. aureus, hace referencia a la
adquisición horizontal del gen mecA, el cual forma parte de un elemento genético móvil,
SCCmec; este casette no es un elemento de tipo constitutivo; el mismo actúa
integrándose al cromosoma bacteriano, recombinándose con cepas de S. aureus
susceptibles a la meticilina. Esta característica, le permite diseminarse rápidamente
tanto en el ambiente hospitalario como en la comunidad (Groom y col.; 2001; Mallorqui
y col., 2004; Bustos y col., 2006).
El SCCmec esta constituido por el gen mecA y sus genes reguladores, además del
complejo genético ccr, el cual codifica el sitio específico de recombinación o inserción
10
del SCCmec al extremo 3' del gen or:fX en el cromosoma de las cepas SARM. Existen
cinco tipos de SCCmec; cuya clasificación esta basada en la combinación de los alotipos
de los genes ccr y mee (Jansen y col., 2009).
Estudios genotípicos han permitido determinar que los SCCmec tipos 1, 11 y III son
comunes en ambientes hospitalarios, con pesos moleculares de 95, 80 y 55 kDa
respectivamente, además contienen genes que les confiere multiresistencia
antimicrobiana. En contraste, los tipos SCCmec IV y V, son característicos de los
aislamientos de la comunidad, carecen de genes de resistencia y poseen menor peso
molecular (23 kDa), lo cual está relacionado con su mayor capacidad de diseminación
(Chongtrakool y col., 2009; Palombarini y col., 2007; Reinert y col., 2008).
El gen mecA, es el responsable de la síntesis de una proteína de fijación a la penicilina
modificada, conocida como, PBP2a. Esta proteína tiene actividad de transpeptidasa, la
cual es capaz de continuar con la síntesis de la pared celular bacteriana en presencia del
antibiótico, a diferencia de las otras PBP habituales (1, 3 y 4). Según lo señalado, las
cepas mecA positivas son resistentes a todas las penicilinas anti-estafilocócicas y
cefalosporinas (Castellanos y col., 2008).
En este sentido, la expresión fenotípica de la resistencia intrínseca a la meticilina, puede
ser heterogénea u homogénea. Las cepas heterogéneas se caracterizan porque menos del
O, 1% de las cepas de SARM sobrevive a concentraciones de meticilina superiores a
1 Üflg/mL, mientras que la mayor parte de la población muere con bajas concentraciones
del antibiótico. Estas cepas presentan gran heterogeneidad en el tamaño de las colonias
y exhiben una CIM a la meticilina entre 1-16 flg/mL (Finan y col., 2002).
11
En contraste, las cepas con expresión homogénea en su mayoría expresan la resistencia
a la meticilina; así mismo, el tamaño de las colonias es homogéneo. La CIM en estas
cepas es superior a 16 Jlg/mL (Finan y col., 2002).
1.3. Métodos de laboratorio para la detección de Staphylococcus aureus resistente
a la meticilina
La detección de SARM por métodos fenotípicos puede ser en algunos casos
problemática, debido a la expresión irregular del gen mecA, y por otra parte, a la
influencia de factores externos relacionados a condiciones de cultivo como:
temperatura, pH del medio y tiempo de incubación; factores críticos para la detección
óptima de cepas heterorresistentes (Camarena y Sánchez, 2008).
En la actualidad, existe diversidad de métodos diagnósticos para determinar la
resistencia de S. aureus a la meticilina o a penicilinas resistentes a penicilinasa. Estos
engloban desde los convencionales, que emplean la técnica de difusión del disco, hasta
aquellos de detección a nivel molecular; que aunque no son aplicables en la rutina,
tienen la ventaja de no estar sujetos a las condiciones de crecimiento de la cepa en
estudio. En su conjunto, con estos métodos se busca detectar la resistencia a meticilina
de cualquier aislado de S. aureus, incluyendo aquellos que muestran un fenotipo
heterogéneo de resistencia, los que tienen una resistencia a oxacilina de bajo nivel; así
como, diferenciar los verdaderos SARM de los "borderline" (Murakami y col., 1991;
Batista y col., 2008).
12
1.3.1. Prueba de difusión del disco
La prueba de difusión del disco de oxacilina de 1 J..Lg ha sido recomendada por el
Instituto para los estándares de Laboratorios Clínicos (CLSI por sus siglas en inglés,
anteriormente NCCLS) para predecir resistencia a los betaláctamicos en S. aureus. No
obstante, este ensayo presenta dificultad al momento de realizar las lecturas de los halos
de inhibición, sobre todo en poblaciones de SARM fenotípicamente heterogéneas; por
consiguiente, se deben controlar las condiciones de laboratorio, en procura de
discriminar correctamente las cepas sensibles de las resistentes a este grupo de
antibióticos (Swenson y col., 2005).
Alternativamente, algunos investigadores propusieron el uso del disco de cefoxitin de
30 Jlg, para determinar la resistencia "intrínseca" a meticilina. Este antibiótico tiene la
capacidad de actuar como un inductor más fuerte que la oxacilina, sobre la producción
de PBP2a en aislados de S. aureus; confiriendo una mayor eficacia en la detección de
este tipo de resistencia, sobre todo en aquellas poblaciones de S. aureus
heterorresistentes (Mougeot y col., 2001; Cauwelier y col., 2004).
Según el CLSI, el ensayo con el disco de 30 J..Lg de cefoxitin es comparable con la
prueba del disco de 1 Jlg oxacilina, en la predicción de resistencia mediada por el gen
mecA; siendo el disco de cefoxitin más estable a las condiciones de almacenamiento e
incubación; aunado a ello, proporciona una lectura nítida de los halos de inhibición,
facilitando la interpretación de los resultados. Con base a esta prueba, los aislados de
13
S. aureus se reportarán sensibles o resistentes a la oxacilina y demás antibióticos
betaláctamicos (CLSI, 2009).
1.3.2. Siembra en Agar Mueller-Hinton suplementado con 4% NaCI y
6 p.1g/mL de oxacilina
Otro de los métodos recomendados por el CLSI para determinar la resistencia a la
meticilina en S. aureus, es la siembra de las colonias en estudio en agar Mueller-Hinton
con 6 fJ.g/mL de oxacilina. El crecimiento mayor a 1 colonia posterior a un lapso de 24
horas en condiciones específicas de incubación (33°C-35°C), es considerado como una
cepa resistente a la oxacilina y demás antibióticos betaláctamicos; esta prueba puede ser
utilizada para confirmar tanto la prueba de dilución como la de difusión del disco
(Swenson y col., 2001; CLSI, 2009).
Alternativamente a este método, Jayaretne y Rutherford (1999), proponen el uso del
agar manito} salado suplementado con 6 fJ.g/mL de oxacilina, para el rastreo de SARM,
este medio tiene la ventaja de favorecer el aislamiento de cepas en un período de tiempo
menor en relación a otras técnicas descritas previamente.
1.3.3. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)
Esta prueba permite encontrar la concentración más baja de los antibióticos que inhibirá
"in vitro" el crecimiento de bacterias aisladas. En caso de determinar resistencia de
S. aureus a las penicilinas resistentes a la penicilinasas, se ensayan tanto la oxacilina
14
como el cefoxitin. Los puntos corte para cada antibiótico están establecidos en el CLSI
(CLSI, 2009).
1.3.4. Prueba de "Screening" de Staphylococcus aureus resistente a
meticilina por aglutinación de partículas de látex
En 1998, científicos japoneses desarrollaron una técnica basada en la aglutinación de
partículas de látex para la detección rápida de la PBP2a, producto del gen mecA. Las
partículas de látex están sensibilizadas con un anticuerpo monoclonal dirigido
específicamente contra PBP2a. Esta técnica exhibe una excelente sensibilidad,
especificidad y se correlaciona con la presencia o ausencia del gen mecA; en virtud de
esto, se constituye como una alternativa a los métodos moleculares, con la ventaja de
ser más económico (Ulloa y col., 2001; Felten y col., 2002; Salvador y col., 2005).
1.3.5. Métodos Moleculares
El método de referencia para la determinación del gen mecA emplea técnicas
moleculares, éstos incluyen la hibridación de ADN o la reacción en cadena de la
polimerasa (RCP). Tienen la ventaja de ser pruebas rápidas y que permiten el análisis de
un número considerable de cepas, no obstante, la realización rutinaria en los
laboratorios clínicos es poco práctica y de alto costo; limitando su uso a los laboratorios
de referencia o con fmes investigativos (Camarena y Sánchez, 2008).
15
1.4. Epidemiología de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina
Desde la década de 1960, comenzaron aislarse las primeras cepas de SARM en
ambientes hospitalarios (SARM-AH), desde entonces, el aumento de la prevalencia ha
sido persistente, como se evidencia en los estudios de vigilancia epidemiológica
realizados a nivel mundial (Cercenado, 2006).
A principios de 1990, algunos hospitales del Reino Unido empezaron a registrar
frecuencias de SARM del 2%, rápidamente esa cifra fue superada, alcanzando el 43%
de prevalencia a finales de la década (Cookson, 2005).
Para el año 2002, el Sistema Nacional de Vigilancia de Infecciones Nosocomiales en
Estados Unidos, reportó una prevalencia del 60% de SARM, aislados en Unidades de
Cuidados Intensivos (NNIS, 2004). Para la misma época, Japón registró la frecuencia
más alta (70%) de SARM a nivel intrahospitalario (Hori, 2005).
Otros países como Colombia, reportó cifras menores a las publicadas por los países
industrializados, como lo refiere Londoño y col. (2006) quienes encontraron SARM en
el 25% de los aislados en una unidad de cuidados intensivos.
Por su parte, Salomao y col. (2008) en Brasil, realizaron un estudio epidemiológico, en
una unidad de cuidados intensivos entre los años 2003 y 2006. Estos autores
encontraron una prevalencia de SARM del 95,7% del total de los aislamientos de S.
aureus.
La Red de Vigilancia de Resistencia a los Antimicrobianos en Venezuela, para el año
2007 reportó una frecuencia del 42,86% de SARM en muestras de pacientes
16
hospitalizados en unidades de cuidados intensivos (PROVENRA, 2009). Datos
similares presentaron Guzmán y Lozada (2007) en Cumaná-Venezuela, con un 45,5%
de SARM en pacientes con infecciones nosocomiales. Por su parte, en Valencia
Venezuela, Sánchez y col. (2008), consiguieron un 18% de SARM en pacientes
hospitalizados.
Históricamente, SARM ha sido considerado un residente natural del ámbito
hospitalario, asociado a factores de riesgo bien definidos (Eady y Cove, 2003; Naimi y
col., 2003). No obstante, desde la década de los ochenta ha emergido como un patógeno
significativo en la comunidad (SARM-AC); aislándose tanto en adultos como en niñ.os
sin patologías previas (Cortes y col., 2007). La presencia de SARM-AC se ha asociado
con infecciones de la piel, el uso de antibióticos de amplio espectro y condiciones de
hacinamiento (Nabón y col., 2004; Fridkin y col., 2005; Lu y col., 2005).
Durante la última década, la prevalencia de SARM-AC ha ido en ascenso, en especial
en países industrializados, como en los Estados Unidos, donde se han registrado datos
de prevalencia que oscilan entre el 59% y el 75%, en pacientes que consultaron por
infecciones en piel y tejidos blandos (Kaplan y col., 2005; Nicola y col., 2005; Wenzel
y col., 2007).
La tendencia de SARM-AC en los países en vías de desarrollo al igual que en lo países
industrializados, va en aumento, con diferencias importantes entre países, e incluso
entre regiones. En Uruguay, Prego y col. (2004) consiguieron una prevalencia del 47%
de SARM-AC asociados a infecciones de piel y tejidos blandos. Hallazgos similares
(42%) fueron reportados en Argentina (Paganini y col., 2008).
17
En Venezuela, los datos de SARM-AC son escasos; en este sentido, en la ciudad de
Caracas, Serrano y col. (2000); reportaron un 22% de cepas de SARM aisladas a partir
de lesiones de piel y tejidos blandos. Recientemente, en la ciudad de Mérida, Gil y
Velazco (2009) investigaron la presencia de SARM-AC a partir de 150 muestras de
pacientes con infecciones de piel y tejidos blandos, que acudieron al Instituto Autónomo
Universitario de los Andes (IHULA). Los autores encontraron una prevalencia del 9,3%
de SARM-AC, de estos el 6% era portador nasal de este microorganismo (Dato no
publicado).
La emergencia de SARM a nivel comunitario es motivo de preocupación a nivel
mundial. Sus propiedades de superadaptación a la comunidad han provocado un
aumento significativo en las infecciones causadas por esta bacteria. Además, su
potencial virulencia e invasividad determinan mayor riesgo de desarrollar enfermedades
fatales en los pacientes afectados (Simor y col., 2001; Fang y col., 2004).
1.5. Antecedentes de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina en alimentos
S. aureus es conocido mundialmente como uno de los principales agentes implicados en
enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs) de naturaleza toxigénica (Figueroa
y col., 2002). Su presencia en los alimentos, se relaciona significativamente con una
inadecuada manipulación o al empleo de materia prima contaminada (Rosas, 2007).
Los manipuladores de alimentos juegan un rol fundamental en la transmisión de S.
aureus en la cadena alimenticia. Las altas tasas de colonización de piel y mucosas
observadas en este grupo poblacional, aumentan su transmisibilidad. Según la literatura,
18
la prevalencia de portadores nasales de S. aureus en la población general es en
promedio cercana a 37 %, con un rango que oscila entre 19% y 55 %, registrándose
tasas de colonización del 35,6 % en manipuladores de alimentos (Soto y col., 1996;
Kluytmans y col., 1997).
Datos similares han sido reportados por Valdivieso y col. (2006) en Cumaná-Venezuela,
detectándose una prevalencia de S. aureus del 40%, en manos de manipuladores de
alimentos; estos hallazgos refuerzan el papel del hombre como reservorio, en la cadena
de transmisión de este microorganismo.
Las fosas nasales anteriores son el principal reservorio de S. aureus, alrededor del 20%
de los humanos son colonizados de manera persistente y asintomática. No obstante, los
portadores nasales de SARM en la comunidad se presentan en porcentajes mas bajos
que oscilan entre 2,8% y 6% (González y col., 2005; Gil y Velazco, 2009).
El primer reporte de SARM de transmisión alimentaria fue documentado por
Kluytmans y col. (1995), en Rotterdam, Reino de los Países Bajos, a través de la
investigación epidemiológica de un brote de SARM ocurrido en una Unidad de
Hematología del Hospital Universitario de Rotterdam. La cepa implicada se detectó
tanto en el alimento como en el personal que preparó el mismo. Producto de este brote
fallecieron cinco personas por septicemia.
Después de estas primeras evidencias de SARM transmitido por alimentos, se
empezaron a divulgar más casos en diferentes partes del mundo. Para el año 2002,
Jones y col., en Estados Unidos, reportaron el primer brote de gastroenteritis aguda
19
adquirida en la comunidad, ocasionada por una cepa SARM productora de enterotoxina
C, la cual, fue aislada tanto en las heces de los pacientes afectados como en los
alimentos involucrados en dicho brote.
Por su parte, Lee (2003), en un estudio realizado en Corea, evaluó 1913 muestras de
alimentos de origen animal; este investigador detectó 15 (3,6%) cepas de SARM,
positivas para el gen mecA. Doce de estas se aislaron de leche de vaca, de las cuales
nueve fueron obtenidas de procesos de mastitis.
En Japón, Kitai y col. (2005), analizaron 444 muestras de pollo crudo, en las cuales se
aislaron 292 (65,8%) cepas de S. aureus. De éstas dos cepas resultaron resistentes a la
meticilina y una de ellas causó una intoxicación alimentaria, identificándose la
enterotoxina tipo C. Las cepas SARM aisladas pertenecían al biovar humano y
albergaban el marcador genético SCCmec tipo IV, el cual es prevalente en aislados de
SARM-AC. Las cepas involucradas también se aislaron de las fosas nasales de los
manipuladores del alimento analizado.
En Holanda, Van Loo y col. (2007), realizaron un estudio a partir de 79 muestras de
carne, los autores aislaron un total de 36 cepas de S. aureus, de las cuales 2 (2,5%)
mostraron resistencia a la meticilina. Estos resultados son significativos considerando
el hecho de que S. aureus es encontrado regularmente en poca cantidad en carne
destinada al consumo humano.
Otros investigadores en Italia, reportaron la presencia de SARM en productos
alimenticios de origen animal. De las 160 cepas identificadas como S. aureus, seis
20
(3,75%) resultaron positivas para el gen mecA; de éstas, 4 provenían de leche bovina y
dos de productos elaborados (queso pecorino y rnozarella). Todas las cepas de SARM
aisladas eran productoras de enterotoxinas (Norrnanno y col., 2007).
Recientemente, en Venezuela, Lernus y col. (2008), evaluaron la presencia de
Staphylococcus spp. resistente a la rneticilina, a partir de queso blanco fabricado en el
estado Anzoátegui. Del total de cepas de aisladas, 15,2% mostraron resistencia a la
oxacilina, correspondiendo dos de ellas a SARM. Según los autores este hallazgo es
importante, puesto que, el queso blanco constituye uno de los principales alimentos en
la dieta del venezolano. Este es el primer reporte de SARM en alimentos que se realiza
en este país.
En los últimos años, se ha observado que las bacterias de transmisión alimentaria,
incluyendo los patógenos conocidos, corno las bacterias comensales, muestran un
espectro de resistencia creciente y variado a los antirnicrobianos de uso humano y
veterinario. En virtud de esto, las autoridades en seguridad alimentaria de la Unión
Europea, recomiendan la evaluación del papel de los alimentos en la diseminación de
bacterias y/o de genes de resistencia, para llevar a cabo una estimación de riesgo en la
asociación alimento-bacteria (EFSA, 2009).
21
11. Objetivos
2.1 Objetivos Generales
• Determinar la prevalencia de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina en
quesos y cuajadas de fabricación artesanal, provenientes de diferentes expendios
del Municipio Libertador en la ciudad de Mérida.
• Determinar la frecuencia de betalactamasa en Staphylococus aureus aislados a
partir de quesos y cuajadas de fabricación artesanal, provenientes de diferentes
expendios del Municipio Libertador en la ciudad de Mérida.
2.2 Objetivos Específicos
• Evaluar la sensibilidad antimicrobiana a la meticilina (oxacilina) en los aislados
de S. aureus a través del método de difusión del disco de cefoxitin de 30 ¡.tg y la
prueba de dilución en agar a la oxacilina.
• Determinar la producción de betalactamasa en los aislados de S. aureus.
• Relacionar la presencia de betalactamasa en los aislados de S. aureus con el tipo
de producto lácteo analizado.
• Determinar la presencia de la proteína de unión a la penicilina PBP2a en las
cepas de SARM aisladas.
111. Materiales y Métodos
3.1. Tipo de Estudio
Se planteó un estudio descriptivo de tipo transversal y de campo; durante el período
comprendido entre noviembre de 2008 y abril de 2009.
3.2. Muestra
Se recolectaron 60 productos lácteos de fabricación artesanal, discriminados en 30
cuajadas criollas y 30 quesos blancos frescos; provenientes de distintos expendios
ubicados en el Municipio Libertador del Estado Mérida, durante el período
comprendido entre noviembre 2008 y abril 2009. Al momento de adquirir el producto,
se registró la ubicación geográfica del punto de venta y el tipo de expendio (vendedor
ambulante o supermercado). El producto fue refrigerado hasta el momento de su
procesamiento.
La muestra estuvo constituida por 92 cepas de S. aureus aislados a partir de los
productos seleccionados.
3.3. Procesamiento del producto lácteo
Se pesaron 10 gramos de cada producto (quesos o cuajadas), los cuales se disolvieron
en 90ml de caldo citratado estéril por separado; posteriormente, se realizó la
homogeneización de la dilución en una licuadora y se procedió a inocular cada
suspensión del producto en placas contentivas de Agar Baird Parker (OXOID); luego se
incubaron por 24-48 horas a 37°C en atmosfera aeróbica (COVENIN, 1989) (Fig. 1 ).
Procesamiento de la muestra
Se disolvieron 10 g de queso o cuajada en 90 mi de caldo citratado al2%
lncub~~ a 3.;~or 24 - 4S . , ¡
D
~Si~bra en Agar eaird Parker
Aislamiento de colonias características de Staphylococcus aureus y conserv~íón wra su identificación @finitiva
- , · "' " "' . . ~ .',<
Fig. l. Aislamiento de Staphylococcus aureus a partir de queso o cuajada.
3.4. Aislamiento e Identificación
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, a partir de cada placa, se seleccionaron
aquellas colonias compatibles con S. aureus. La identificación definitiva se realizó a
través de las siguientes pruebas: Gram, catalasa, fermentación del manitol, coagulasa y
proteína A (OXOID) (Koneman y col., 2005).
La determinación de la proteína A o "factor cumpling" para identificación de S. aureus,
se realizó con el Kit comercial
especificaciones de los fabricantes.
Staphytest Plus (OXOID); siguiendo las
Las cepas identificadas como S. aureus fueron conservadas a - 70°C, para estudios
posteriores.
3.5. Prueba del disco de Cefoxitin de 30¡.rg
Antes de la realización de las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, se reactivaron
las cepas de S. aureus en placas de agar BHI (OXOID) para obtener colonias aisladas y
frescas (CLSI, 2009).
A cada uno de los aislamientos de S. aureus, se les determinó la susceptibilidad al disco
de cefoxitin (30¡.rg, OXOID), mediante la técnica de Kirby-Bauer (Fig. 2). La
interpretación de los halos de inhibición, se realizó comparando los resultados con la
tabla correspondiente en el manual de la CLSI (2009). Para esta prueba, se empleó
como cepa control S. aureus ATCC 25923.
25
Reactivación de las cepas de S. aureus en caldo J BHI
Preparación del inóculo en solución salina fisiológica 0.85% ajustado con Me Farland 0.5
[ l
Inoculación en Mueller-Hinton con hisopo
Colocación del disco de Cefoxitin (3Q¡Jg)
Incubar a 37 ° C. 18 horas en aerobiosis
Lectura de los halos de inhibición
l Registro de resultados
J
Fig. 2 Prueba de difusión del disco de cefoxitin de 30p.tg en Staphylococcus aureus
3.6. Prueba de betalactamasa: La determinación de beta1actamasa se rea1izó a través
del kit de Beta-Lactamase (OXOID); el cual consta de una serie de palillos impregnados
con solución de Nitrocefin. Esta cefalosporina cromogénica es lábil a la acción de la
betalactamasa, evidenciándose a través de un cambio de color de amarillo a rojo, por el
cambio de pH producto de la hidrólisis del anillo betaláctamico. El ensayo se realizó de
acuerdo a las especificaciones de la casa comercial utilizando como cepa control:
S. aureus ATCC 29213 (suministrada por el Centro Venezolano de Colección de
Microorganismos).
3. 7. Concentración inbibitoria mínima a la Oxacilina
Se determinó la CIM mediante el método de dilución en agar; siguiendo el
procedimiento descrito por el CLSI (2009). Se empleó como controles las cepas S.
aureus ATCC 29213 y 43300 (Fig. 3).
3.8. Determinación de PBP2a
Para la realización de esta prueba se utilizó el kit comercial MRSA-Screen (DENKA
SEÍKEN), de acuerdo a las especificaciones descritas por la casa comercial. En este
ensayo se empleó la cepa control S. aureus ATCC 43300 (Fig.4).
27
Reactivación de las cepas de S. aureus en caldo de BHI
Preparación de Soluciones Madres: SM1: 1280 flQ/ml,
SM2: 160 flg/ml
~ Vol. Vol. Concentración Final (J.Lg/ml)
Concentración Sotución Agua Volumen Total= 18 mL de MH con 2% de Inicial f.19 /ml Madre (mL) NaCI + 2 ml de dilución
(mL) {1:10! 1280 2 128 640 1 1 64 320 0,5 1,5 32 160 2 (SM2) 16 80 1 1 8 40 0,5 1,5 4 20 2 2 10 1 1 1 5 0,5 1,5 0,5
2,5 2 (SM3) 0,25 1,25 1 1 0,125
l Preparación del inóculo al 0,5 de Mac Farland y dilución del mismo ( 1: 10)
Inoculación de AMH con 2% NaCI
l Incubación de la& placas en aerobiosis, 350C oor 24 h
Lectura de la CIM
Fig. 3. Concentración lnhibitoria Mínima a la oxacilina en Staphylococcus aureus
1
DETERMINACIÓN DE PBP2a
1. Procedimiento de Extracción de
4 gotas de R1 + 1 asada de cultivo (1.5 lll)
Calentar en bloque térmico a 95-1 00°C por 3 minutos
Dejar enfriar a temperatura ambiente
+ Agregar 1 gota de R2 (mezclar bien). Centrifugar a 3000 rpm
l 2. Procedimiento de Aglutinación en Látex
1
Mezclar en la tarjeta: 50 "' de sobrenadante + 25111 de R3, por 3 min.
PRESENCIA DE PBP2a
Fig. 4. Determinación de PBP2a en aislados de Staphylococcus aureus
IV. Resultados
Se procesaron 92 cepas de S. aureus provenientes de 60 productos lácteos (quesos
frescos y cuajadas), adquiridos en puntos de venta ambulantes y supermercados,
ubicados en el Municipio Libertador de la ciudad de Mérida, durante el período
comprendido entre los meses de Noviembre 2008 y abril del2009.
• De acuerdo a los resultados obtenidos, el 87% (80/92) de las cepas evaluadas fue
sensible a la meticilina (SASM) y el 13% presentó algún mecanismo de resistencia a
los antimicrobianos de la familia de los betalactámicos (Fig.5).
• De las 92 cepas de S. aureus analizadas, una cepa resultó resistente a la meticilina,
según los resultados obtenidos con la prueba de difusión del disco de cefoxitin de
30Jlg y la prueba de dilución en agar, representando el1,09% (Tabla 1).
• Once cepas de las 92 estudiadas, fueron productoras de betalactamasa,
correspondiéndose con una frecuencia de 11,95%. Ocho provenían de queso y tres
de cuajada. No se observaron <,ijferencias significativas entre la presencia de
betalactamasa y el tipo de producto lácteo procesado (Tabla 2).
1% 12%
87%
Fig. 5
r!'l SARM
r:.J 8-LACTAMASA
13 Sensible
Discriminación de las 92 cepas de Staphylococcus aureus aisladas a
partir de quesos y cuajadas según la producción de betalactamasa y
resistencia a la meticilina. Mérida, Noviembre 2008-Abril2009.
Tabla 1
Sensibilidad al disco de cefoxitin 30 Jtg de 92 cepas de Staphylococcus
aureus aisladas a partir de quesos y cuajadas. Mérida, Noviembre
2008-Abril 2009.
TIPO DE RESULTADO DE FOX TOTAL
PRODUCTO RESISTENTES SENSIBLES
n o¡o n % n %
CUAJADA 1.09 45 48,91 46 50
QUESOS o o 46 50 46 50
TOTAL 1,09 91 98,91 92 100
n= número de cepas; FOX= disco de cefoxitin de 30 flg
Tabla 2
Producción de Betalactamasa en 92 cepas de Staphylococcus aureus
aislados a partir de quesos y cuajadas. Mérida, Noviembre 2008-Abril
2009.
TIPO DE BETALACTAMASA Total
PRODUCTO POSITIVA NEGATIVA
n % n % n %
QUESOS 8 8,69 38 41,30 46 49.99
CUAJADAS 3 3,26 43 46, 75 46
50,01
TOTAL 11 11,95 81 88,05 92 100,00
n= número de cepas
p= 0,1081
p < 0,05
• Las ocho cepas betalactamasa positiva aisladas de queso, procedían de puntos de
venta ambulantes. Al relacionar la presencia de betalactamasa con el tipo de
expendio no se observó asociación estadística (Tabla 3).
• La cepa de SARM fue aislada de una muestra de cuajada adquirida en un expendio
ambulante.
• Los aislamientos de S. aureus que resultaron sensibles al disco de cefoxitin de 30Jlg,
presentaron una CIMa la oxacilina entre el rango 0,250Jlg/mL- lJlg/mL.
• La cepa de SARM aislada mostró bajo nivel de resistencia a la oxacilina, con una
CIM de 32Jlg/mL.
• La cepa de SARM aislada fue portadora de PBP2a.
34
Tabla 3
Presencia de betalactamasa y resistencia a la meticilina (oxaciUna) en
92 cepas aisladas de quesos y cuajadas de fabricación artesanal.
Mérida, Noviembre 2008-Abri12009.
TIPO DE PRODUCTORES DE RESISTENCIA A TOTAL
PRODUCTO BETALACTAMASA LA METICILINA n Ofo
LÁCTEO D % N %
CUAJADA 3 3,2~ 1 1,09 4 4,35
QUESO 8 8,69 o o 8 8,69
TOTAL 11 11~ 1 1z!!9 12 13,04
n= nmp~ro de cepas
p= 0,1J96
p < 0,05
V. Discusión
Desde la aparición de las primeras cepas de SARM, estos han experimentado cambios
constantes en su epidemiología, en este sentido, desde hace algunos años las autoridades
sanitarias vienen advirtiendo sobre el potencial riesgo de transmisión de SARM, a
través de los alimentos de origen animal, sobre todo por el uso indiscriminado de
antibióticos en medicina veterinaria, por lo cual, tanto los alimentos como los animales
representan un punto clave en la transmisión y diseminación de bacterias resistentes
hacia los humanos, en los próximos años.
Al respecto, en el presente estudio se encontró una frecuencia de SARM relativamente
baja del 1,09%. Este resultado es consistente con las cifras reportadas a nivel
internacional, por Lee (2003), con un 2,5% de SARM en distintos tipos de alimentos y
con el 3,75% de prevalencia de SARM reportado por Van Loo y col. (2007), y
Normanno y col. (2007), en estudios similares.
En Venezuela, solo se ha registrado hasta la fecha, un estudio realizado por Lemus y
col. (2008) en el estado Anzoátegui, acerca de la búsqueda de Staphylococcus spp.
oxacilino resistentes a partir de queso blanco duro y blando elaborados artesanalmente,
reportando una prevalencia de SARM del 1 ,2%; resultados muy similares a los
obtenidos en esta investigación.
En base a los antecedentes y los hallazgos observados se infiriere que la circulación de
cepas de SARM en alimentos esta por debajo del 1 0%; este hecho pudiera asociarse a
las bajas tasas de portadores nasales de SARM y a que la presencia de S. aureus en
alimentos se asocia a una manipulación indebida de los mismos, sugiriendo así, que la
cepa de SARM aislada en el presente trabajo sea de origen humano.
Sin embargo, a pesar de la baja frecuencia de SARM encontrada en el presente estudio,
la circulación de este tipo de cepas a través de los alimentos, implica un riesgo tanto
para la salud del consumidor como para la diseminación a nivel de la comunidad de este
tipo de cepas con mecanismos de resistencia a los antimicrobianos, específicamente a la
familia de los betaláctamicos.
A nivel internacional, no se encontró información disponible en relación a la
prevalencia de SARM en derivados lácteos de manufactura artesanal; sin embargo, en
los trabajos consultados, la mayoría de las cepas SARM, se aislaron a partir de
productos como leche de vaca, queso pecorino, y queso mozarella (Van Loo y col.,
2007; Normanno y col., 2007}, evidenciando el papel de los lácteos como fuente de
diseminación de SARM.
La cepa de SARM recuperada en esta investigación se aisló de una muestra de cuajada,
vale la pena resaltar, que la contaminación de este tipo de producto por S. aureus,
supera generalmente los límites sanitarios permitidos, debido a las características
intrínsecas del mismo que favorecen el desarrollo de la bacteria, y por otro lado el
proceso de elaboración de la cuajada carece de controles sanitarios.
En cuanto a la producción de betalactamasa en las cepas de S. aureus aisladas a partir de
quesos y cuajadas, fue menor del 25% (11,95%). Al respecto, en la literatura
consultada, no se encontró información que permitiera comparar este resultado; sin
37
embargo, este hallazgo se explicaría debido a que las cepas aisladas en su mayoría son
de origen ambienta], por consiguiente, tendrían un comportamiento distinto en cuanto a
la expresión de mecanismos de resistencia a los antibióticos de tipo betaláctamicos con
respecto a lo descrito en aislados clínicos de S. aureus.
De las doce (13,04%) cepas de S. aureus que presentaron alguno de los mecanismos de
resistencia estudiados, cuatro (4,35%) fueron aisladas de cuajadas y ocho (8,69%) de
quesos, al respecto, no se observó asociación estadística entre las variables estudiadas;
por lo cual se puede inferir que la presencia de cepas de S. aureus resistentes a la
meticilina o productores de betalactamasa en productos lácteos de fabricación artesanal
no esta influenciada por el tipo de producto analizado.
La producción de PBP2a en la cepa SARM aislada de este estudio, está relacionada con
un mecanismo de tipo estructura] conferido por dicha proteína, que Je otorga al
S. aureus resistencia a todos los antibióticos betaláctamicos incluyendo a beta]áctamicos
con inhibidores de beta]actamasa y cefa]osporinas, relacionándose así, con los
resultados obtenidos a través de la prueba de difusión del disco de 30Jlg de cefoxitin y
con la CIMa ]a oxacilina (32 Jlg/mL), en dicha cepa.
A través de la determinación de la PBP2a, se puede deducir de una manera indirecta la
presencia del gen mecA, como codificador del mecanismo de resistencia a los
betaláctamicos en la cepa de SARM aislada; un hecho relevante ya que en este tipo de
mecanismos eventualmente pueden estar inmersos genes de resistencia a otras familias
de antimicrobianos, implicando un riesgo para la salud pública la diseminación a nivel
38
de la comunidad de este tipo de cepas resistentes, que ocasionalmente podrían causar
enfermedad en el humano.
La cuajada y los quesos blancos frescos, son productos nutricionalmente recomendados
para las dietas blandas en pacientes hospitalizados con dificultades para deglutir
alimentos y bebidas, sobre todo en adultos mayores. La presencia de SARM en los
alimentos representa un riesgo para los consumidores, e incluso para individuos
inmunocomprometidos; ya que en estas personas, la respuesta inmune no es capaz de
actuar como barrera para prevenir la colonización de SARM a nivel gastrointestinal. El
consumo de alimentos contaminados con SARM, podría incluso causar la muerte en
este grupo de pacientes con factores predisponentes; tal y como lo refiere Kluytmans y
col. (1995).
Debido al surgimiento de cepas bacterianas con mecanismos de resistencia a los
antimicrobianos cada vez mas agresivos, y a la utilización de los antibióticos de manera
masiva a nivel clínico y como promotores de crecimiento en animales destinados al
consumo humano; es de vital importancia realizar estudios que permitan dilucidar la
situación epidemiológica de este tipo de cepas resistentes en los alimentos, ya que estos
constituyen una fuente factible de diseminación, que en el caso especifico deSARMen
quesos y cuajadas, implicaría un incremento del riesgo de adquisición a nivel
comunitario.
39
VI. Conclusiones
l. Durante el período de estudio, se encontró una prevalencia de SARM dell,09%,
del total de cepas aisladas a partir de productos lácteos de fabricación artesanal
2. La cepa de SARM fue detectada en una muestra de cuajada.
3. El 11, 95% de las cepas de S. aureus aisladas a partir de productos lácteos eran
productoras de betalactamasa.
4. La presencia de betalactamasa en S. aureus no se relacionó con el tipo de
producto lácteo procesado.
5. La cepa S. aureus resistente a la meticilina detectada en este estudio se
caracterizó por presentar un bajo nivel de resistencia a la oxacilina (CIM=
32¡.tg/mL). Así mismo, fue portadora de PBP2a.
VII. Recomendaciones
l. Continuar con los estudios de vigilancia epidemiológica que permitan dilucidar
el papel de los alimentos como posibles vehículos de SARM, y así establecer
medidas de control para evitar la diseminación de este tipo de cepas resistentes.
2. Continuar estudios moleculares que permitan determinar el tipo de cassette
SCCmec, involucrado en la cepa de SARM aislada en el presente trabajo, y así
poder determinar el origen de adquisición de dicha cepa (a nivel nosocomial o
comunitario).
3. Realizar estudios orientados a la búsqueda de SARM en los alimentos
suministrados a pacientes hospitalizados, por el riesgo que implicaría el
consumo de alimentos que contengan este tipo de cepas resistentes.
4. Dar a conocer los hallazgos de esta investigación a las instancias sanitarias y
Red de Vigilancia de la Resistencia bacteriana a los antimicrobianos.
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54
IX. ANEXOS
ANEXO!
Desarrollo de S. aureus en Agar Baird Parker
._
••
ANEX02
Kit para determinación de Proteína A en Staphylococcus aureus.
ANEX03
Kit para detección de betalactamasa
ANEX04
Kit para detección de PBP2a
Sensitized Latex 1.3ml Control ~tex 1.3ml Extraction Reagenr 1 10ml Extraction Reagent 2 2.5mL
ANEXOS
Reacción positiva y negativa para la PBP2a