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Resumen
Este trabajo se basó en una investigación teórica y experimental, donde nuestro
objetivo fue la clonación del gen de la insulina usando un simulador gratuito en línea
tomando como base, los datos de la forma de obtención de la insulina anteriormente,
su estudio e importancia, así como su obtención del gen de la insulina actualmente.
Los avances tecnológicos, han permitido a la biotecnología poder mostrar con mayor
facilidad la manera en que funcionan ciertos procesos biológicos, aquí se explica el
uso del software llamado “Serial Cloner” simulador de utilidad que nos ayudó a poder
explicar el proceso de la clonación del gen de la insulina, donde también, se explica
la base de datos NCBI, en donde se pueden buscar los posibles plásmidos y
secuencias con que se puede realizar esta clonación del gen de la insulina in silico en
el Serial Cloner.
Sabemos que no son procesos capaces de ser observables al ojo humano, por lo que
se puede tomar como una gran oportunidad de poder apreciar su forma, función e
importancia al alcance de nuestra comodidad.
INTRODUCCIÓN
La insulina fue descubierta por científicos canadienses alrededor de los años 1921 y
1922 (Cannela, 2016). La insulina es la hormona hipoglucemiante. Como tal, su
función primaria es reducir la concentración de glucosa en sangre (glucemia)
promoviendo su transporte al interior de las células, pero sólo actúa en este sentido
sobre el tejido adiposo (adipocitos), el músculo (fibras musculares o miocitos) y el
corazón (fibras cardiacas o miocardiocitos). La insulina realiza esta función activando
el transportador de glucosa GLUT4, que sólo se encuentra en la membrana
plasmática de esas células. La glucosa es una sustancia poco polar, y como tal puede
difundir libremente por las membranas de las células.
La insulina es una hormona polipeptídica formada por 51 aminoácidos, producida y
secretada por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas. Su síntesis
pasa por una serie de etapas. Primero la preproinsulina es creada por un ribosoma
en el retículo endoplasmático rugoso (RER), que pasa a ser (cuando pierde su
secuencia señal) proinsulina. Esta es importada al aparato de Golgi, donde se
modifica, eliminando una parte y uniendo los dos fragmentos restantes mediante
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puentes disulfuro (Unión covalente entre dos átomos de azufre. Este tipo de enlaces
se forman por la oxidación de dos grupos sulfhidrilo (SH), cada uno perteneciente a
una molécula de cisteína. Son frecuentes entre cadenas polipeptídicas diferentes de
una misma proteína.) (Clínica Universidad de Navarra, 2015)
La diabetes es una condición que afecta la capacidad del cuerpo para transformar el
alimento en energía. La insulina lo ayuda a obtener energía de los alimentos. Una
parte de lo que se come, se transforma en azúcar llamada glucosa. La glucosa viaja
a través del cuerpo en la sangre. El cuerpo almacena la glucosa en las células para
usarla como energía. La insulina es la llave que abre la puerta a las células, por lo
que, cuando no se tiene suficiente insulina o ésta no funciona adecuadamente, la
glucosa permanece en la sangre. Con el tiempo, la glucosa se acumula en los vasos
sanguíneos y sale por orina. Esto puede dañar ojos, riñones, nervios, corazón y vasos
sanguíneos. Afortunadamente la insulina y otras medicinas para la diabetes suelen
formar parte del tratamiento de la enfermedad. Junto con la alimentación saludable y
la actividad física, las medicinas pueden ayudarle a controlar la enfermedad.
A partir de ese importante hallazgo, la diabetes humana se ha tratado con insulina
proveniente de otros mamíferos, como los cerdos y las vacas, debido a su gran
parecido con la insulina humana. Todo esto fue antes de las herramientas
biotecnológicas más recientes. Así pues, si se querían obtener 240 mL de insulina
purificada, era necesario que se utilizaran varias toneladas del páncreas cuerpo de
cerdos o vacas. La insulina animal se obtenía directamente del páncreas del animal.
Aunque la insulina, sobre todo de cerdo, era muy similar a la humana no era idéntica
y contenía algunas impurezas. Esto provocaba rechazo y en algunos casos alergias.
Estas impurezas se lograron disminuir con la mejora de la técnica. En los años 70, la
cromatografía líquida de alta resolución llegó a depurar la técnica obteniendo un 99%
de pureza. No obstante, las reacciones alérgicas menores no se han podido eliminar
totalmente. Además puede haber contaminación por toxinas y bacterias. La
Federación Internacional de Diabetes ha notificado que:
“Las insulinas animales [modernas y altamente purificadas] siguen siendo una
alternativa perfectamente aceptable”.
Actualmente, con la ingeniería genética se ha conseguido que la bacteria Escherichia
Coli (E. Coli) pueda producir insulina. Esta insulina se le llama insulina con ADN
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recombinante. La ventaja de esta insulina “humana” es que es fácil mantener la
bacteria, se pueden producir grandes cantidades en menor tiempo que la de origen
animal y con costos menores. La compatibilidad de la insulina es del 100%. Aunque
puede haber reacciones debido a otros componentes.
En el caso concreto de México, la diabetes (derivada de la insuficiencia de insulina en
el cuerpo) es una de las enfermedades más mortales hoy en día, tanto en niños como
en adultos y personas mayores; de hecho afecta a un gran porcentaje de nuestra
población ya que 4 millones de personas refirieron haber sido diagnosticadas con
diabetes. La proporción de adultos con diagnóstico previo de diabetes es de 9.2% (.
Esto se debe en gran parte a la cantidad de alimentos y bebidas azucaradas que
proliferan actualmente en nuestro mercado, afectando sobretodo a personas de bajos
recursos, ya que según la Federación Mexicana de Diabetes A.C “Más del 80% de
las muertes por diabetes se registran en países de ingresos bajos y medios”. -al no
poder hacerse con un tratamiento adecuado-, sumado a la herencia genética de ser
propenso a la diabetes, a la falta de ejercicio, obesidad infantil y en adultos.
Los avances en la biotecnología llevaron a que en la década de los 80s, se lograra
producir insulina más eficiente por medio de la inserción del gen humano de esta
hormona en la bacteria E. coli. Actualmente, se sigue utilizando la bacteria E. coli, ya
que es la bacteria más estandarizada, estudiada, secuenciada y su rendimiento es
bastante alto (Cannela, 2016).
Más recientemente, se ha conseguido que el cuerpo humano reaccione diferente a la
insulina suministrada con la ingeniería genética.
Los plásmidos portan el gen del péptido, estos plásmidos son introducidos a las
bacterias donde se habrá de sintetizar la hormona, a través de poros producidos en
las membranas de las bacterias por medio de descargas eléctricas (electroporación)
o bien por medio de un choque térmico. Una vez insertado el plásmido en la bacteria
se induce la síntesis del péptido por medio de especies químicas que activan la
maquinaria de transcripción y traducción del gen.
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Hoy en día se cuenta con herramientas más sofisticadas que antes, como laboratorios
mejor equipados y, sobre todo, con ordenadores potentes que nos brindan la
capacidad de hacer clonación in silico, es decir, hacer todo virtualmente para después
poder aplicar la clonación en el laboratorio experimental. Tal instrumento es el caso
del software llamado “Serial Cloner”.
ADN recombinante y clonación:
La tecnología del ADN recombinante tuvo sus orígenes en la década de los 70´s con
el descubrimiento y caracterización de las endonucleasas de restricción y el desarrollo
de métodos rápidos de secuenciación e hibridación de ADN, que aunado a la técnica
de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la clonación de genes en los 80´s,
sentaron las bases para el desarrollo de esta nueva biotecnología.
El ADN recombinante es una combinación de dos fragmentos de ADN de dos
especies distintas, en donde el material genético del huésped se replica junto con el
del hospedero. Esta técnica es muy usada por los investigadores actualmente.
Las etapas para la obtención de ADN recombinante son las siguientes:
a) El rompimiento del ADN tanto del huésped como del hospedero con
endonucleasas (enzimas de restricción).
b) El empalme (“pegar”) de estos dos fragmentos de ADN, mediante la enzima
ADN ligasa.
c) La clonación, en donde se inserta el ADN recombinante en un agente para su
posterior replicación (como por ejemplo en un plásmido , y éste a su vez es
absorbido por una bacteria).
d) El aislamiento de las bacterias deseadas (que portan el ADN con el gen
deseado).
Cabe destacar que además de usar las enzimas de restricción para insertar el gen
deseado en un plásmido, también se usan para introducir un gen de resistencia
antibiótica. Este gen será de utilidad en los siguientes pasos de la clonación, después
de que se haya suministrado calor (por ejemplo) a una solución de bacterias y
plásmidos, y algunas bacterias absorbieran estos plásmidos. Pero habrá bacterias en
la solución que no pudieran absorber los plásmidos, y por lo tanto, no tendrán el gen
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resistente al antibiótico y por lo tanto moriran. Aquí es cuando entra en acción el gen
de resistencia antibiótica, pues teniendo colonias de bacterias dispersas en nuestro
cultivo, se procederá a meter nutrientes junto con antibióticos para conservar aquellas
bacterias que tengan el plásmido con nuestro gen, y matar a las que no son útiles.
Reacción PCR:
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común
utilizada para hacer muchas copias de una región particular de ADN. Esta región de
ADN puede ser cualquier cosa que le interese al experimentador.
La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer muchas
copias de una determinada región de ADN in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de
un organismo). La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq
polimerasa, y requiere de cebadores de ADN diseñados específicamente para la
región de ADN de interés. (Omayra, 2007)
En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura
que permiten la producción de muchas copias de la región blanco.
La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza de
forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el análisis forense de
ADN.
Enzimas de restricción:
Las enzimas de restricción son las enzimas encargadas de cortar un fragmento de
ADN en sitios específicos, ello acorde con las bases nitrogenadas (A, T, C, G) del
mismo. Además, estas enzimas cortan el ADN del individuo extraño y del hospedero
en lugares que permiten crear extremos “pegajosos”, con lo que ambos pedazos de
material genético se puedan acoplar, y formar el ADN recombinante.
Son extraídas de organismos procariontes (bacterias), donde actúan como un
mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la
célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para
distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. Las enzimas de restricción no pueden
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cortar ADN metilado, de este modo solo afectan el ADN extranjero y no el ADN
bacterial.
Las enzimas de restricción participan en la primera fase descrita anteriormente del
rompimiento del ADN, y luego la segunda etapa de empalme, se desarrolla con otra
enzima que se llama ADN ligasa.
Serial Cloner:
El software de Serial Cloner es una herramienta en línea y gratuita que permite
desarrollar la clonación in silico, es decir, virtualmente. Ahí el usuario puede descargar
archivos de genes de algún banco de datos para usarlos; le permite encontrar sitios
de restricción y las correctas enzimas de restricción para ello, encontrar nucleótidos
específicos y secuencias peptídicas, le permite visualizar el gen mediante gráficos y
mapas, además de que permite desarrollar el PCR de manera virtual, entre otras
funciones.(http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html)
Base de datos NCBI
NCBI (National Center for Biotechnology, por sus siglas en inglés) es un banco de
datos donde se puede encontrar información respecto a temas de biotecnología,
secuencias genómicas, medicina, así como enfermedades genéticas humanas. Esta
importante fuente de datos ha permitido a los investigadores de muchos países
realizar investigación de nivel, pues cualquiera puede ingresar a buscar información,
y descargar secuencias genéticas específicas, por ejemplo. Es lo que nosotros
hicimos para obtener el gen de la insulina.(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO
Este proyecto acerca de la clonación del gen de la insulina con métodos
computacionales (in silico), usando el Serial Cloner, se realizó mediante una
exhaustiva investigación teórica acerca del tema, consideramos que para poder llevar
a cabo un buen proyecto es muy importante contar con la información que se ha
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publicado con respecto a un tema, y nuestro caso poder explicar cómo se lleva a cabo
la clonación genética. Dado que en la ENP no contamos con la infraestructura
necesaria para poder llevar a cabo de manera experimentar la clonación de genes,
hicimos uso de las ventajas tecnológicas que nos brindan las TIC hoy en día, por lo
que era importante para nuestro trabajo familiarizarnos con el software Serial Cloner,
así como con la base de datos NCBI, que fueron fundamentales para la siguiente
etapa de nuestro proyecto.
OBJETIVOS
● Realizar una investigación teórica sobre la insulina y el proceso de ADN
recombinante para obtener la insulina en grandes cantidades.
● Buscar en el banco genómico NCBI información sobre plásmidos (para vector
de clonado) y sobre la insulina humana.
● Sintetizar insulina mediante el uso del simulador Serial Cloner, proceso “in
Silico”
DESARROLLO
Lo primero se hizo para empezar con la clonación in silico del gen de la insulina, fue
descargar el software de Serial Cloner, que sería nuestra herramienta principal a lo
largo del proceso. (http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner-Download.html)
En la interfaz se encuentra un menú con herramientas para buscar secuencias de
nucleótidos y sus posibles enzimas de restricción; para construir, escanear,
recombinar, alinear, hacer el PCR, entre otros. Además, permite al usuario visualizar
gráficos, simulaciones y mapas de los “features” o características del material
genético con la herramienta que esté utilizando.
Después de descargado el Serial Cloner, se buscó la secuencia genética de la
preinsulina en un artículo científico de la revista Nature (Bell, 1979), la cual tuvimos
que reescribirla en un documento de notas para poder ingresarlo al software e iniciar
con su clonación. Este texto científico fue de suma utilidad, pues al principio
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buscábamos en NCBI un gen de la insulina humana, pero después de leer el artículo
comprendimos más acerca del gen de la insulina humana, y cómo se manipula.
Después de obtenido el gen, procederíamos a buscar el vector de clonado, en nuestro
caso el plásmido pUC18 en NCBI. Una vez descargado éste, con la opción FIND se
buscaron los sitios de restricción que usaríamos para cortarlo. No obstante, estos
sitios de restricción no deben estar en el gen de la preinsulina, pues de ser así las
enzimas que actúen en estos sitios cortaran el gen en lugares indeseados. De modo
que al elegir las enzimas de restricción en el plásmido, se debe cerciorar que no estén
en el gen. Nosotros elejimos las enzimas Ndel y HindIII.
Una vez seleccionadas las dos enzimas de restricción, una irá al 5’ “forward” (Ndel) y
la otra irá al 5’ “reverse” (HindIII). Para que estas enzimas puedan actuar en base a
un fragmento complementario del ADN de nuestro gen, se adicionan los cebadores o
“primers”, que son secuencias cortas de nucleótidos. En nuestro caso, con la enzima
Ndel se usó un primer de 20 nucleótidos, iniciando con “cat” (parte no idéntica a
nuestro gen) y luego 17 nucleótidos idénticos a nuestro gen. Luego para la enzima
HindIII fue “aagctt” (no idéntica) y los siguientes 16 nucleótidos idénticos a la parte
complementaria de nuestro gen. Todo ello se realizó con un PCR en el Serial Cloner.
Y una vez que se hizo el PCR, y se obtuvo el gen deseado, se procede a insertar éste
al vector de clonado, que es el plásmido pUC18, con la opción CONSTRUCT del
Serial Cloner. Para ello se seleccionan las enzimas de restricción del gen de la
insulina y el plásmido, dándole siempre la orientación correcta, es decir, de Ndel a
HindIII y no al revés. Al hacer esto, obtenemos el plásmido con el gen de la insulina
virtualmente, pero en el laboratorio, ya se podría meter en una bacteria para su
clonación, con las técnicas de electroporación o choque térmico.
RESULTADOS
Se obtuvo el gen de la preinsulina (Figura 1), así como la secuencia del vector de
clonado, pUC18 (Figura 2). Una vez teniendo ambos, se determinaron las enzimas y
sitios de restricción que unirían ambas secuencias posteriormente.
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Figura 1. Secuencia del gen de la preinsulina
Figura 2. Plásmido pUC18, secuencia
y Graphic Map
Las enzimas de restricción empleadas fueron Ndel y HindIII; al gen de preinsulina se
le añadió el sitio de resticción (secuencia) “cat” para la enzima Ndel, y luego a su
reverso complementario, el sitio “aagctt” para HindIII. Estas secuencias de sitios de
restricción ya están presentes en el plásmido pUC18, cabe añadir. Así con esta
información, e ingresando los nucleótidos de la secuencia de la preinsulina a los
cuales se querían añadir los sitios de restricción (primers), se realizó el PCR de ésta
en el Serial Cloner (Figura 3).
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Figura 3. PCR de la preinsulina. A la izquierda se puede ver “cat” y los demás
nucleótidos, que forman el Primer Forward; y “aagctt” con el otro segmento que son
el Primer Reverse. A la derecha se ve como queda la secuencia.
Luego de tener nuestro gen de la preinsulina con los sitios de restricción “cat” y
“aagctt”, se procedió a insertarla en el vector de clonado con la opción en el Serial
Cloner de CONSTRUCT (Figura 4). Para esto se seleccionan ambas secuencias, se
establecen las enzimas de restricción que cortan los genes, y la correcta dirección
(sentido) en el que se acoplan, que es muy importante.
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Figura 4. CONSTRUCT de la preinsulina y el pUC18. El Graphic Map de la derecha
muestra de manera gráfica el gen (gris) inserto en el plásmido (azul). La orientación
se puede ver en la flecha circular que va de derecha a izquierda.
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Como se puede apreciar en la Figura 4, que es el CONSTRUCT de ambas
secuencias, el vector de clonado aparece en color azul, y el gen de la insulina en color
gris (ello en la derecha de la imagen), lo que nos indica que se ha realizado con éxito
la inserción de nuestro gen deseado en el plásmido.
La dirección que se le dio al vector de clonado fue igualmente la correcta, pues si se
hubiera tratado de hacer en la dirección contraria, sólo se obtendría un muy pequeño
fragmento del plásmido, que no serviría para ejecutar la clonación del gen.
Además, el PCR que se hizo antes del CONSTRUCT también fue efectivo, pues a
pesar de que no se indica explícitamente en el programa como con el CONSTRUCT,
si hubiésemos añadido sitios de restricción incorrectos, el insertar el gen en el vector
hubiera sido imposible; o si no se hubiera puesto el reverso del gen de la preinsulina
por ejemplo, donde corresponde, el PCR tampoco se hubiera logrado.
CONCLUSIONES
Todo el proceso de clonar con el Serial Cloner puede resultar complicado, e incluso
difícil de entender, pues se necesita saber qué enzimas de restricción son adecuadas,
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cuáles sitios de restricción vamos a usar, cuál es el reverso de la secuencia (Reverse),
y seleccionar las enzimas del gen y el plásmido para dar bien la orientación, entre
otros.
No obstante, nos queda claro que la clonación in silico de un gen, y todas las
herramientas computacionales que conlleva, son fundamentales para comprender,
estudiar y mejorar este proceso, y permite a los investigadores visualizar eventos que
antes sólo podían con los experimentos mismos, y no con un paso intermedio, como
es el Serial Cloner.
Además, nuestra investigación empleamos herramientas que hemos aprendido de las
asignaturas académicas, como bien lo fueron el idioma inglés y conocimientos de
biología para poder encontrar y utilizar el gen de la preinsulina del artículo (“Nucleotide
sequence of a cDNA clone encoding human preproinsulin”) en inglés; también usamos
la química, las matemáticas, y sobre todo la computación para adentrarnos en el
Serial Cloner e intentar hacer una clonación un tanto compleja, como lo puede ser el
de la insulina.
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