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RESUMEN

Considerando que nuestro país ocupa el segundo lugar en el ámbito mundial, con

población obesa, es que los alimentos funcionales son actualmente una de las áreas de

mayor interés en la ciencia de los alimentos. Con la finalidad de mejorar la salud de la

población, se está realizando una reevaluación de los hábitos alimenticios; por tal

motivo los productos naturales y las dietas balanceadas han recibido mucha atención.

Con este propósito diferentes tipos de frutas y vegetales han sido reconocidos como

excelentes fuentes de fitoquímicos, los cuales son componentes de los alimentos que

tienen un efecto fisiológico definido.

En función de sus propiedades los fitoquímicos presentes en los alimentos se pueden

diferenciar macronutrientes, como el ácido oleico; micronutrientes, como las vitaminas;

o compuestos sin valor nutritivo, como los flavonoides, que entre otros pueden tener

efectos antioxidantes.

El objetivo de este proyecto fue evaluar el contenido de fitoquímicos en frutos de interés

comercial, y como se afectan las concentraciones de dichas moléculas al darles

diferentes tratamientos.

Se pudo comprobar que el tratamiento de microondas aplicado en la pulpa de mamey

maduro conserva prácticamente el total de la vitamina C y A presentes en el fruto y

respecto al contenido de carotenoides estos se hacen más disponibles en 1.8 veces.

Los resultados encontrados muestran que el tratamiento con microondas es una buena

alternativa para conservar el fruto de litchi ya que:prácticamente se conserva el 100 %

del contenido inicial de vitamina C. Sin embargo con el tratamiento convencional se

logar inactivar mejor las enzimas del pericarpio y conservar los flavonoides del mismo.

Se logró encontrar que el tratamiento de liofilización aplicado a la pasta de aguacate

reducida en calorias afecta las cantidades de fitoquímicos obteniendo que tiempos

menores de liofilizado generan la menor pérdida de estas moléculas.

2

INTRODUCCION

La obesidad constituye un problema de salud pública y es uno de los padecimientos

epidémicos de los países desarrollados que en los últimos años, por imitación y

consumo de alimentos con alto valor energético, han incrementado su frecuencia en

México. El factor de la obesidad contribuye entre otras causas a incrementar la

mortalidad por enfermedades cardiovasculares, diabetes mellitus, alteraciones

esqueléticas, hipertensión arterial, hipercolesterolemia e inadaptación psicosocial entre

las más importantes, (NOM-174,1998).

Considerando el grave problema de obesidad mencionado anteriormente es que una de

las áreas de mayor interés en la ciencia de los alimentos es la de los alimentos

funcionales. Especialistas en nutrición humana, ciencia y tecnología entre otros,

investigan aquellas propiedades de los alimentos tradicionales que favorecen la salud,

así como desarrollan nuevos productos, con el objetivo de lograr la nutrición óptima.

La salud en la sociedad del siglo XXI no sólo depende de los medicamentos, sino

también de la alimentación. Los científicos, seguidos de cerca por las industrias

alimentaria y farmacéutica, se han lanzado ya al estudio masivo de los nutracéuticos o

alimentos funcionales Los alimentos funcionales tienen como característica la de poseer

componentes con una función preventiva o curativa vinculada al estado de salud.

Diversos son los componentes que le atribuyen propiedades funcionales a los

alimentos, encontrándose en su mayoría en el reino vegetal. A estos componentes se

los conoce como fitoquímicos o nutraceúticos y en la actualidad, se han identificado una

gran diversidad. Se encuentran en frutas, vegetales, leguminosas, semillas, pescados,

aceites, lácteos y también otros alimentos de consumo menos frecuente, que

seguramente integren cotidianamente la dieta del futuro, (Johnson, 2003).

Los alimentos funcionales contienen uno o más ingredientes que inciden sobre una o

más funciones del organismo. En función de sus propiedades se pueden diferenciar

macronutrientes, como el ácido oleico; micronutrientes, como las vitaminas; o

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compuestos sin valor nutritivo, como los flavonoides, que entre otros pueden tener

efectos antioxidantes (Asamy, 2003)

Por lo anterior, se debe señalar que el público consumidor demanda el desarrollo de un

nuevo campo en la industria alimenticia y la nutrición y se prevé que en los próximos

años se fortalezcan algunas áreas tales como estudios de mercado de los alimentos

funcionales, actualización de las leyes que regulan la venta de estos productos.

Además, se espera el surgimiento de nuevas tecnologías que permitan el desarrollo de

nuevos productos y su preservación. Por último, en el área científica es posible

vislumbrar que se investigue la relación de los componentes alimenticios con el

organismo, además de conocer la interacción entre los componentes funcionales y las

enfermedades para identificar mejor el mecanismo de acción de los componentes

funcionales con los procesos patológicos, (Brewer, 2003).

Las llamadas tecnologías emergentes, también denominadas tecnologías alternativas,

logran conservar los alimentos con un menor deterioro de la calidad nutritiva y

sensorial, además de tener un menor impacto ambiental. Estas tecnologías están

basadas en su acción antimicrobiana o principios físicos y químicos que tienden a

reducir el deterioro de los alimentos. Los resultados recientes de la aplicación de las

tecnologías emergentes, permiten suponer que en un futuro próximo éstas desplacen

total o parcialmente el uso de calor para procesar alimentos, (Sumnu 2005).

En este proyecto se seleccionaron tres frutos de interés comercial con un contenido

significativo de fitoquímicos, a los que se les aplicó una tecnología alternativa para que

puedan ser propuestos como alimentos funcionales.

4

DIAGRAMA EXPERIMENTAL

LITCHI (Pulpa)

Tratamiento con microondas

Congelación

MAMEY (Pulpa)

Tratamiento con microondas

HPLC

Determinación de fitoquímicos

Espectrofotómetro

Vitamina C Carotenoides

Vitamina A

HPLC

Determinación de fitoquímicos

Vitamina C

Determinación de fitoquímicos

Espectrofotómetro

Vitamina C

AGUACATE

Liofilizado 4 tiempos diferentes

Obtención de pulpa Patente

HPLC

Determinación de fitoquímicos

Cromatografía de gases

β-sitoesterol Vitamina E

Luteína Glutatión

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METODOLOGÍA β-sitoesterol (967.18AOCS)

Se empleó una columna empacada con una mezcla de digitonina-celite la cual se

preparó disolviendo 300 mg de digitonina en 5 mL de agua a ebullición. La mezcla se

adicionó a un mortero que contenía 10 g de celite y se mezcló perfectamente.

Con la mezcla anteriormente mencionada se empacaron pipetas Pasteur de 150 mm,

las cuales se emplearon como columnas, colocando un tapón de algodón como sostén,

y posteriormente se añadió la mezcla de digitonina-celite y procurando que el material

de empaque no quedará muy apretado ya que de lo contrario los disolventes no fluirían

adecuadamente.

La columna se saturó con 5 mL de hexano, justo antes de ser empleada, ya que de lo

contrario esta se reseca y ya no es útil.

Se pesaron 900 mg de aceite de aguacate a los cuales se les adicionaron 3 mL de

hexano, se mezcló perfectamente y se transfirió la disolución a la columna previamente

acondicionada. Se realizaron dos lavados al recipiente que contenía la muestra con 2

mL de hexano, estos lavados también se añadieron a la columna.

Una vez que la muestra pasó por la columna se realizaron cinco lavados con 2 mL de

hexano cada uno.

Posteriormente se realizaron cinco lavados con 2 mL de benceno cada uno. Se esperó

a que el último lavado con benceno eluiera por la columna y se realizó un lavado interior

y exterior de la misma con el fin de disolver los lípidos que pudieran haber quedado, ya

que de lo contrario, estos pueden interferir en la determinación del fitoesterol de interés.

Se inició la elusión adicionando 10 mL de DMSO. Posteriormente se adicionaron 3 mL

de hexano al eluido y se agitó perfectamente la muestra hasta observar la formación de

dos capas, se extrajo la capa superior (esteroles), y se colectó en otro tubo para

centrífuga. Al tubo inicial se le adicionaron 4 mL de una mezcla 1:1 de hexano:

benceno y se agitó para recuperar la capa superior nuevamente, lo anterior se realiza

dos veces. Después de la extracción se le adicionó 3 mL de agua y se agitó

vigorosamente, otra vez se observó la formación de dos capas y de igual manera se

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recolectó la capa superior. Esta se colocó en un vial y se evaporó a sequedad. El

residuo se recuperó con 2 mL de cloroformo.

Para realizar el análisis se empleó un cromatógrafo de gases Perkin Elmer AutoSystem

XL con detector de ionización de flama.

La columna utilizada fue una EconoCap EC-1 30 m x 0.32 mm x 0.25 µm a una

temperatura de columna de 245 °C, temperatura del detector de 285 °C y temperatura

del inyector de 285 °C

Se empleó como gas acarreador nitrógeno a 10p6 con un flujo de 60 mL/min. Para la

inyección de las muestras y curva estándar se empleó un automuestreador. La señal de

β- sitoesterol se registró a los 55 minutos de la corrida.

Carotenoides (941.15 AOAC)

Los carotenoides poseen un sistema de dobles enlaces conjugados que constituyen un

cromóforo lo que permite que el compuesto presente color y espectro de absorción

característico. Por ello, la cuantificación de carotenoides está basada en la medición de

su color amarillo naranja (absorción espectral) a la longitud de onda apropiada.

Se pesó 5 g de muestra de mamey, se adicionó 0.1 g de tierra de diatomea y 0.1 g de

sulfato de sodio anhidro, se maceró y posteriormente se adicionó 40 mL de acetona, 60

mL de hexano y se homogenizó por 5 min hasta obtener un color amarillo naranja

intenso. Se recuperó cuantitativamente el extracto en un embudo de separación

cubierto con papel aluminio para protegerlo de la luz. Luego se lavó el residuo con dos

porciones de 25 mL de acetona y una de 25 mL de hexano y se combaniron los

extractos en el embudo de separación. Los extractos de acetona se lavaron con cinco

porciones de 100 mL de agua destilada, sin agitar vigorosamente para evitar la

formación de emulsión. Se desechó la fase acuosa y se recuperó la fase orgánica lo

más rápido posible en un matraz aforado de 100 mL conteniendo 9 mL de acetona y se

ajustó el volumen con hexano.

Se leyó la absorbencia del extracto a 436 nm, calibrando el espectrofotómetro con un

blanco de 9% de acetona y se ajustó el volumen con hexano. Se realizó la

cuantificación de la muestra por triplicado. Todas las operaciones se realizaron en

oscuro para evitar la degradación de los carotenos (AOAC Official Method 941.15).

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g carotenos/g muestra = Volumen (mL) x Abs x 106__

A100% x peso muestra (g) x 100

Donde:

A100% = 2592 que es la constante de la tabla de identificación de carotenos

Abs = absorbencia obtenida del espectro

Volumen = volumen final del aforo que contiene la muestra.

Flavonoides ( Mouming, 2007)

Para llevar a cabo la extracción del fruto, se pesan 5 g, se incorporan con 400 mL de

etanol al 85% en un rotavapor, durante dos horas a 30°C. Posteriormente se filtra el

extracto con papel Whatman no. 1. El residuo se vuelve a extraer y se filtra por

segunda vez. Los filtrados se recombinan y se secan usando un rotavapor a 40°C.

El extracto seco se redisuelve en 100 mL de agua con 300 ml de hexano y etil

acetato secuencialmente. La fracción del etil acetato se seca usando un rotavapor a

40°C, antes de la siguiente purificación.

La fracción con etil acetato se carga a la fase reversa para cromatografía líquida de

alta resolución (RPHPLC), en una columna (100*6.4mm) de poliestireno/divinal, para

el aislamiento de la epitecatequina y la proantocianidina B2 y B4. Las condiciones a

manejar deben ser las siguientes: para la elusión isocrática: solvente A: agua/ácido

fórmico (98:2, v/v); solvente B: acetonitrilo/agua/ácido fórmico (80:19:1 v/v/v).

Tiempo: 4 minutos con 3% del solvente B, después del 3 al 50% de solvente B

durante 14 minutos a un flujo de 1 ml/min. Los perfiles de la RPHPLC se registran a

280 nm. La pureza de estos tres componentes debe ser mayor a 99% por los

estándares de HPLC.

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Glutatión (Demirkol, 2004)

Se pesaron 0.5 g de cada uno de los aceites de aguacate, a estos se les adicionó 1 mL

del amortiguador de serina-borato (100 mM Tris-HCl, 10mM borato de sodio, 5 mM

serina, y 1 mM de ácido dietilentriamonopentacético). Este amortiguador se empleó

para prevenir la oxidación del glutatión.

Las muestras se sonicaron durante 2 minutos en agua fría y después se centrifugaron a

3600 rpm por 15 minutos. Se tomaron 20 µL del sobrenadante y se le adicionaron 230

µL de agua destilada y después se derivatizaron adicionando 250 µL de N-(1-pirenil)

maleimida (1 mM NPM en acetonitrilo). Esta solución se mezcló perfectamente y se

incubó a temperatura ambiente por 5 minutos, transcurrido este tiempo se le

adicionaron 10 µL de HCl 2N para detener la reacción y por último se filtró a través de

un acrodisc.

La cuantificación del glutatión se realizó empleando un equipo de HPLC acoplado a un

fluorómetro, el cual operó con una longitud de onda de excitación de 330 nm y longitud

de onda de emisión de 375 nm. Se utilizó un sistema en fase reversa empleando como

fase móvil una mezcla 70:30 acetonitrilo-agua a la cual se le adicionaron 1 mL de ácido

acético y 1 mL de ácido o-fosfórico por cada litro de fase empleada. La columna que se

utilizó fue una C18 de 150 mm x 4.6 mm y se inyectaron 20 μL de muestra.

Luteína (Aston, 20006)

Se pesó 1 g de cada uno de los aceites y se le adicionaron 5 mL de una solución 0.1 %

de BHT en acetona. A esta disolución se le adicionaron 100 mg de Na2CO3 y se

homogenizó perfectamente empleando un vórtex, a continuación se le adicionaron 500

mg de Na2SO4. El tubo se aereó con nitrógeno y se conservó en refrigeración (4 °C)

durante toda la noche. Transcurrido este tiempo se tomaron 2 mL del extracto y se

atemperaron, a este se le adicionaron 2 mL de dietil éter y 8 mL de una solución de

NaCl al 10 %, empleando un vórtex se agitó perfectamente la mezcla. La solución se

centrifugó durante 10 minutos a 3600 rpm. La capa superior se recuperó en otro tubo

para centrífuga. Al primer tubo se le adicionaron 2 mL de dietil éter y se centrifugó

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nuevamente. La capa superior se colectó en el tubo que contenía a la primer capa

superior extraída y se evaporó a sequedad empleando nitrógeno.

El concentrado se disolvió en 1 mL de la solución de BHT al 0.1 % en acetona, se

mezcló perfectamente empleando vórtex y se centrifugó por 20 minutos a 3600 rpm. Se

colectó el sobrenadante y se evaporó el disolvente empleando nitrógeno, el residuo se

disolvió en 500 µL de acetato de etilo y se filtró empleando un acrodisc de 0.2 µm.

Para el análisis se empleó un HPLC Perkin Elmer Series 200 UV-Vis Detector con un

sistema de fase en gradiente donde la fase A fue acetato de etilo y la fase B

Acetonitrilo: Metanol en una proporción 9:1. Se trabajó con un flujo de 1ml/min, la

proporción de las fases durante los primeros 16 minutos fue en 20 % de A y 80 % de B ;

después se cambió la proporción a 60 % de la fase A y 40 % de la fase B durante 5

minutos. La columna que se utilizó fue una Supelcosil LC-18DD 25 cm x 4.6 mm x 5

µm. Se inyectaron 20 µL y se leyó a una longitud de onda de 450nm.

Vitamina A (NOM-091-SSA1-1994)

Se utiliza un cromatógrafo modelo 4200 marca Varion de gradiente de elusión básico es

utilizado. Este dispositivo es adaptado con 2 bombas de 500 psi cada una, el dispositivo

es acoplado a un programa de gradiente de flujo y a un detector de longitud de onda

variable. Un registrador Fisher Recordall serie 500 con integrador fue conectado al

detector.

Hexano seco y desgasificado se empleo en la bomba A y cloruro de

metileno:isopropanol 9:1 en la bomba B. La velocidad de flujo fue a 39mL/h para ambas

bombas. El detector se ajusta a una longitud de onda de 325 nm en una escala de 0 –

0.1 unidades de absorbencia. Se utiliza una columna Micropack 50 cm x 2mm de

diámetro empacada con LiChrosorb Si60-10.

Un gradiente de elusión es usado y la fase móvil es programada como sigue: una

solución inicial de 81% para la bomba A y 19% de para la bomba B; disminuyendo

9%/min de la bomba B por 2 min; controlada a 1% por 1 min; disminuyendo 0.2%/min

por 1min; disminuyendo 0.8%/min por 1 min. La bomba B es entonces reiniciada a 19%.

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El ajuste a cero fue hecho con un solvente inicial, 50L de muestra estandar de

vitamina A es inyectada y el programa de gradiente de elusión es iniciado. La

integraciones son contadas cuando la vitamina a es eluida.50L de muestra,

conteniendo 0.5 – 4 L/mL es inyectada y el programa de gradiente de elusión es

empleado.

El intervalo de precisión es establecido de la curva estandar. La concentración de

vitamina en la muestra es determinada por proporción con integraciones y

concentración del estandar.

Vitamina B1 (Tiamina, Fernández 2001)

La cantidad de material tomada para la determinación será tal, que la proporción del

volumen de solución 0.1 N de ácido sulfúrico, usado para la extracción, sea por lo

menos 15 a 1 con respecto a la cantidad de muestra y al contenido de tiamina

equivalente de 3 a 100 microgramos de clorhidrato de tiamina.

1. Póngase la cantidad de material por determinar, pesado con precisión de 0.1 mg, en

65 ml de solución 0.1N de ácido sulfúrico contenidos en un tubo de centrífuga de 100 ml

y digiérase a baño de vapor, mezclándose con frecuencia durante 30 minutos o

caliéntase en autoclave de 121°C a 123°C durante 15 minutos. El líquido tiene que

quedar ácido durante la digestión, si no es francamente ácido al indicador azul de timol,

agréguese suficiente ácido sulfúrico diluido para hacerlo ácido.

2. Enfríese y ajústese el pH entre 4 y 4.5 por la adición de la solución 2N de acetato de

sodio usando verde de bromocresol como indicador externo en placa adecuada.

Agréguense 5 ml de la solución de enzima, mézclese e incúbese de 455 a 50°C durante

3 horas. Enfríese, centrifúguese la mezcla hasta que el líquido sobrenadante sea limpio

o plásticamente límpido, transfiérase cuantitativamente el líquido sobrenadante a un

matraz aforado de 100 ml.

3. Lávese el residuo centrifugado con 10 ml y luego con 5 ml de ácido sulfúrico 0.1N y

agréguense los lavados al líquido sobrenadante y dilúyase con agua hasta aforo de 100

ml.

4. Pásese por el tubo para cambio de bases ya acondicionado, una parte alícuota de la

solución conteniendo de 5 a 10 microgramos de tiamina; lávese el tubo con tres

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porciones de agua destilada hirviente de 5 ml cada una, teniendo cuidado de evitar que

la superficie del líquido baje de la superficie del silicato. Hágase la elución de la tiamina

del silicato para cambio de bases pasando por el tubo sucesivamente pequeñas

porciones de la solución ácida caliente de cloruro de potasio. Recójanse los primeros 15

ml o 20 ml de líquido en un matraz aforado de 25 ml, enfríese y dilúyase a un volumen

de 25 ml, con solución ácida de cloruro de potasio. Esta solución constituye la solución

para la valoración.

Oxidación de la Tiamina a Tiocromo y medición de la Fluorescencia

1. Determínese el contenido de Tiamina en la solución para valoración ya oxidada,

comparando la intensidad de fluorescencia de un extracto de esta solución expuesta a

los rayos ultravioleta de la longitud de onda de 350 mm y a 400 mm con la solución tipo

de clorhidrato de tiamina. La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad

de tiamina presente y puede ser medida con ayuda de un instrumento para tal objeto.

2. Para oxidar la tiamina o tiocromo, agréguense a cantidades que contengan de 0.10 a

2.0 microgramos de tiamina en la solución tipo de clorhidrato de tiamina tratada de

manera similar, suficiente solución ácida de cloruro de potasio para hacer un volumen

de 5 ml.

3. Luego agréguense mezclando, 3 ml de residuo oxidante y dentro del lapso de 2

minutos añádanse 13 ml de alcohol isobutílico y agítese vigorosamente durante 2

minutos.

4. Cetrifúguese la mezcla a baja velocidad hasta que el líquido sobrenadante sea

límpido.

5. Mídase en un fluorímetro la intensidad de la fluorescencia de la solución isobutílica

directamente, si es límpida o si es turbia después de agitar con 2 g de sulfato de sodio

anhidro. Compárese con ésta, la intensidad de fluorescencia, producida después de

oxidar la solución tipo de clorhidrato de tiamina. La solución tipo de sulfato de quinina

es usada para controlar la igualdad de resultados con el del instrumento. Tendrá que

hacerse una corrección para la fluorescencia producida por otras substancias que no

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son la tiamina y de la solución que se valora, tratada como se indico antes, pero

empleado solución de hidróxido de sodio al 15% que reemplazará al reactivo oxidante.

6. Cálculos

mg de tiamina = 1.0 x (A - B) (S - D)

Donde:

A = fluorescencia del alcohol isobutílico.

B = Fluorescencia del extracto de la solución de ensayo tratado con 3 ml de

NaOH al 15%.

S = Medida de fluorescencia del extracto de la solución tipo.

D = Fluorescencia del extracto de la solución tipo tratado con 3 ml de NaOH

al 15%.

Vitamina C (HPLC, Wall 2006)

Mezclar durante 1 minuto, 100 g de muestra y 100 mL de alícuota de solución de ácido

metafosfórico a 2650 rpm usando un homogenizador Polytron, 50g de la mezcla se le

adicionan 35 mL de metanol, 10 mL de un estandar, 0.05% de pentanofenonan en

metanol. La mezcla fue centrifugada por 15 min a 13300 x g a 4 °C. El sobrenadante es

decantado y diluido a 100 mL con 50% de metanol. A 10 mL de alícuota de esta

solución es además diluida a 100 mL con 1,5 mM de pirogalol en 50% de metanol, una

porción fue pasada a través de un filtro de 0.45 m antes de inyectar al HPLC.

Una serie de soluciones estandares conteniendo 0.6% de ácido metafosfórico, 0.0005%

de pentanofenona, 1.3 mM de pirogalol y 2.5 a 12.5 g/mL de ácido ascórbico en 50%

de metano son preparados inmediatamente antes del análisis.

Las proporciones de las áreas de los picos de los estándares de ácido ascórbico es

graficado contra la concentración del ácido ascórbico. La ecuación para esta curva de

calibración es determinada por regresión lineal. Los resultados son expresados como

mg de ácido ascórbico/100 g de peso fresco.

Un análisis con HPLC es llevado a cabo usando una cromatografía líquida Perkin Elmer

Serie 4 con una columna a 35°C y un detector a 247nm. Los datos son detectados en

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una Hewlett – Packard 3390A. La columna es 25 cm x 4.6 mm Vydac 201 HS, tamaño

de partícula de 10 precedida por una columna protegida RP-18. la velocidad de flujo

es de 3.5 mL/min. La fase móvil es 0.5 mM tridecilamonio, elaborado con 60 + 40 + 1

(metanol + agua + acetonitrilo) pH 4.5. El pH es ajustado a 4.25 usando ácido fórmico y

10 mL de acetonitrilo adicionado por litro de solución. Antes de usar la fase móvil es

pasada a través de un filtro de 0.45 m.

La vitamina C es determinada por el método de titulación con dicloroindofenol. Los

resultados son expresados como mm de ácido ascórbico /100 g de peso fresco.

Vitamina C (espectrofotométrico, Ranganna,1986)

El método está basado en la medición de una solución de 2,6-diclorofenol-indofenol en

la medida en que es reducido por el ácido ascórbico.

Se realizó una curva estándar de ácido ascórbico a una concentración de 0.1 mg/mL

disuelto en ácido metafosfórico al 3%. Se adicionó 1 mL de amortiguador de acetatos

pH 4, 1.5 mL de 2,6-diclorofenol-indofenol y 7.5 mL de xileno. Se agitaron los tubos

vigorosamente y se dejaron reposar para permitir la separación de las fases, la fase

orgánica se recupera con una pipeta y se adiciona Na2SO4 anhidro para remover trazas

de humedad. Se leyó en un espectrofotómetro a 520 nm, usando como blanco el xileno.

Para la determinación en la muestra del mamey se pesó 10 g y se adicionó 10 mL de

ácido metafosfórico al 3%, se filtró y se tomó 1 mL del filtrado y posteriormente se le

adicionó 1 mL de amortiguador de acetatos pH 4, 1.5 mL de 2,6-diclorofenol-indofenol y

7.5 mL de xileno (Ranganna, 1986).

La Vitamina C se presenta como L-ácido ascórbico y ácido dihidroascórbico en frutas y

vegetales, así como también en alimentos procesados en donde es adicionada como

antioxidante. La función de la vitamina C es para prevenir el escorbuto. El ácido

ascórbico es probablemente el más efectivo antioxidante soluble en agua (Johnson, I.,

2003). En el fruto del mamey en estado maduro se realizó un estudio del contenido de

vitamina C sometiendo la pulpa a un tratamiento térmico con microondas a 60 W / 3

min., en donde se observó que la pulpa tratada presentó menor cantidad de vitamina C

24.45 mg ácido ascórbico / 100 g de pulpa y en la pulpa sin tratar presentó 29.73 mg

14

ácido ascórbico / 100 g de pulpa, lo que nos indica que en el tratamiento térmico con

microondas a esta potencia y tiempo disminuyó el contenido de vitamina C. La

retención de vitamina C depende del tipo de energía usada, tiempo de exposición, la

presencia de agua del fruto o vegetal, ya que el escalde por microondas es un proceso

rápido y permite retener más los nutrientes termolábiles como la vitamina C, aunque

también el calentamiento con microondas puede causar significante pérdida de vitamina

C (Drake y col., 1981). Se ha reportado que conforme incrementa el tiempo de escalde

con microondas en el brócoli, el contenido de vitamina C disminuye

independientemente del nivel de potencia (Brewer and Begum, 2003).

Vitamina E (NOM-091-SSA1-1994)

Saponificación: A 1g de la muestra añadir 7g de hidróxido de potasio grado analítico en

un matraz, y mezclar para disolver. A continuación añadir 60 ml de alcohol absoluto y

0,5 g de ácido ascórbico o hidroquinona.

Montar sobre un sistema de reflujo, introducir una ligera corriente de gas nitrógeno y

calentar durante 30 minutos en un baño maría ebulliendo provisto de agitadores

magnéticos.

Una vez terminada la saponificación, enfriar el matraz a temperatura ambiente y

trasvasar la suspensión a un embudo de separación de 500 ml.

Enjuagar con máximo 30 ml de agua fría en 3 porciones de 10 ml que se añaden al

contenido del embudo de separación. Evitar un exceso de agua, ya que favorece la

formación de emulsiones.

Enseguida enjuagar el matraz con 50 ml de éter de petróleo (rango de 40 - 60 ºC) en

varias porciones que se añaden al embudo de separación. Extraer la vitamina E

agitando ligeramente. Dejar separar las fases. Vaciar la fase acuosa a otro embudo de

separación de 500 ml. Recoger la fase orgánica en un tercer embudo de separación de

500 ml. Efectuar esta extracción 5 veces en total. Haciendo las agitaciones con mucho

cuidado para evitar emulsiones.

Lavar la solución orgánica con porciones de 100 ml de agua adicionándola por las

paredes del embudo, sin agitar, hasta que el agua de lavado ya no dé reacción

15

coloreada con fenolftaleína. Después del último lavado, esperar al menos 15 minutos

antes de vaciar la fase acuosa.

Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene

aproximadamente 5 g de sulfato de sodio anhidro, y recoger el filtrado en un matraz en

forma de pera de 500 ml, sin dejar secar el filtro. Al final enjuagar el filtro con 50 ml de

éter de petróleo. Evaporar el disolvente bajo presión reducida en un rotavapor a 40ºC, y

eliminar los últimos mililitros mediante una corriente de nitrógeno. Disolver el residuo en

3 ml de la fase móvil (2-propanol al 1% en hexano) y filtrar la solución inmediatamente a

través de un filtro de 0,45 µ de tamaño de poro y adecuado para solventes orgánicos,

recoger el filtrado en un matraz. Para el análisis se utilizó un HPLC empelando una

columna Spherisorb Sílice, 5 µm, 4,6 X 250 mm. La fase móvil fue 2-propanol 1% en n-

hexano con un flujo de 2ml por minuto. Se inyectaron 20 µl de la muestra y se leyó a

una longitud de onda de 292nm.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

META 1 ( 30 %).

Determinación de fitoquímicos de mamey.

Se determinó carotenoides totales, vitaminas A y C en mamey maduro sin

tratamiento y después del tratamiento con microondas.

Para poder llevar a cabo el tratamiento con microondas en el mamey, fue necesario

primero determinar el estado de madurez óptimo del fruto para lo cual se realizaron las

siguientes actividades:

1.1 Recolección del mamey

El fruto de mamey fue recolectado en una huerta de Coatlán del Río, Estado de

Morelos. En la huerta fue posible hacer el seguimiento del desarrollo del fruto a partir de

16

la floración (antesis) de los árboles seleccionados. La recolección se llevo a cabo

después de la antesis: para el mamey inmaduro a 398 días, para el maduro 419 días y

para el sobremaduro 483 días.

Se analizaron algunos de los parámetros fisicoquímicos en los tres estados de

maduración del mamey considerando los grados brix, pH, % de acido málico y color

(cuadro 1). En relación al primer parámetro, los grados Brix cambian conforme aumenta

la maduración del fruto, esto es porque al pasar de un estado de madurez a otro las

enzimas hidroliticas del fruto van generando azúcares de diferentes pesos moleculares.

CUADRO 1. EVALUACIÓN DE ALGUNOS PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS DEL MAMEY EN SUS

3 ESTADOS DE MADUREZ

MAMEY INMADURO MAMEY MADURO MAMEY SOBREMADURO

°Bx 8.5 16.5 28

Ph 5.76 5.83 5.98

% Acido málico 0.25 0.18 0.12

Color L* A* b* L* a* b* L* a* b*

80.40 3.48 25.91 68.67 32.15 36.95 56.88 29.62 29.63

Los cambios de pH no fueron tan significativos, la variación de este parámetro

depende de la cantidad y el tipo de ácidos orgánicos generados durante todo el

proceso de maduración. El % de ácido málico, conforme aumentó la madurez del

mamey hubo una disminución de este ácido. El mamey presenta un ligero incremento

en la acidez durante el preclimaterio y disminuye en la fase de ascenso al climaterio,

después del inicio de la maduración de consumo y durante el climaterio (Arenas, y col.,

2003). El mamey ha sido descrito como una fruta baja en acidez (0.22 – 0.11%)

expresado como ácido málico (Villanueva y col., 2000).

17

Otro parámetro que se determinó como índice de madurez fue el color mediante los

parámetros CIELAB (L*, a* y b*) en donde el brillo L* disminuyó conforme aumenta la

madurez del fruto, el color rojo a* tuvo un aumento conforme aumenta la madurez pero

en el estado sobremaduro disminuyó al igual que el color amarillo b*. Lo que puede

indicar es que en la fase del climaterio hay un incremento de color amarillo en el mamey

inmaduro y maduro; en el postclimaterio (mamey sobremaduro) el color amarillo rojo

tiende a presentarse lo cual indica la disminución la disminución de b*. De igual

manera ocurrió para a*, donde en la fase del climaterio existe también un aumento del

color rojo, y en el postclimaterio el mamey tiende a tornar de rojo a café lo cual indica la

disminución a*.

1.2. Optimización del proceso mediante un diseño de superficie de respuesta

Una vez seleccionado el estado de madurez del mamey en el cual era más conveniente

llevar a cabo el tratamiento con microondas, se procedió a determinar el diseño

experimental para el tratamiento. Para lo cual se utilizó un diseño de superficie de

respuesta de tendencia central mediante el programa Desing Expert Versión 7.0.

Considerando dos variables de respuesta (actividad de PFO y color de la pulpa) y dos

factores independientes (potencia y tiempo). El tratamiento térmico con microondas

seleccionado después de llevar a cabo el diseño experimental fue una potencia de 60

Watts durante 3 min.

1.3. Evaluación de carotenoides

Los carotenoides son pigmentos naturales ampliamente distribuidos, responsables del

color amarillo, naranja y rojo de las frutas, raíces, flores, etc., son sustancias

hidrofóbicas, lipofílicas y son insolubles en agua. Los carotenoides se presentan

invariablemente en los cloroplastos de las plantas superiores, aunque en este tejido

fotosintético su color está enmascarado por el de la clorofila (Rodríguez, A., 1999). Los

carotenoides poseen un sistema de dobles enlaces conjugados que constituyen un

cromóforo lo que permite que el compuesto presente color y espectro de absorción

18

característico. Por ello, la cuantificación de carotenoides está basada en la medición de

su color amarillo naranja (absorción espectral) a la longitud de onda apropiada.

En el fruto del mamey en estado maduro se realizó un estudio del contenido de

carotenoides sometiendo la pulpa a un tratamiento térmico con microondas a 60 Watts

durante 3 min, en donde se observó que la pulpa tratada presentó mayor cantidad de

carotenoides 5.83 mg / 100 g de pulpa y en la pulpa sin tratar presentó 3.27 mg / 100 g

de pulpa, lo que nos indica que en el tratamiento térmico con microondas se hacen los

carotenoides más biodisponibles. En las hojas de camote, en el crisantemo garland y en

la zanahoria sometidas a tratamiento térmico con microondas retuvo mejor el contenido

de carotenoides que el calentamiento convencional (Rodríguez, A., 1999). La pérdida

de los pigmentos aumenta en el siguiente orden: tratamiento térmico con microondas <

al vapor < convencional < salteado (Meléndez, y col., 2004).

1.3. Evaluación de vitamina A

El retinol, es la forma de la vitamina A que se encuentra en las fuentes alimenticias, es

de color amarillo y es importante para la visión y el crecimiento óseo., es una vitamina

liposoluble. Se determinó el contenido de vitamina A expresada como retinol en la pulpa

de mamey en estado maduro y también con tratamiento térmico con microondas a 60

Watts durante 3 min. El contenido de retinol en la pulpa de mamey antes del tratamiento

fue 60.5 g/100g y después del tratamiento térmico fue de 33.8 g/100g, lo que muestra

que el tratamiento conserva aproximadamente el 50 % del contenido de vitamina A.

1.4. Evaluación de vitamina C

La Vitamina C se encuentra como L-ácido ascórbico y ácido dihidroascórbico en frutas

y vegetales, así como también en alimentos procesados en donde ha sido adicionada

como antioxidante. La función de la vitamina C es para prevenir el escorbuto. El ácido

ascórbico es probablemente el más efectivo antioxidante soluble en agua (Johnson, I.,

2003). En el fruto del mamey en estado maduro se realizó un estudio del contenido de

vitamina C sometiendo la pulpa a un tratamiento térmico con microondas a 60 Watts

durante 3 min, en donde se observó que la pulpa tratada presentó mayor cantidad de

19

vitamina C 24.44 mg ácido ascórbico / 100 g de pulpa y en la pulpa sin tratar presentó

21.66 mg ácido ascórbico / 100 g de pulpa, lo que nos indica que en el tratamiento

térmico con microondas a esta potencia y tiempo se hizo más extraíble el contenido de

vitamina C.

Conclusión. Se pudo comprobar que el tratamiento de microondas aplicado en la pulpa

de mamey maduro hace más disponibles en 1.8 veces el contenido de carotenoides.

Conserva prácticamente el total de la vitamina C y en un 50 % la vitamina A presentes

en el fruto.

META 2 ( 30 %).

Determinación de fitoquímicos de Litchi chinensis

Se determinará Vitamina C, Tiamina, flavonoides en pulpa de Litchi chinensi madura

antes y después de tratamiento con microondas y congelación.

2.1. Sanitización del fruto

El fruto del litchi chinensis Sonn, cultivar de San Luis Potosí, fue el seleccionado para

llevar a cabo el desarrollo experimental.

Para el tratamiento con microondas, primero se sanitizaron los frutos de litchi

empleando una solución al 0.3 % de plata coloidal estable al 0.32 % de marca

comercial BacDyn y se sumergieron durante 10 minutos, después se eliminó el exceso

de agua utilizando una malla.

Los frutos sanitizados se colocaron inmediatamente después en una red circular de

polietileno y se trataron 13 muestras de acuerdo a los datos obtenidos mediante un

análisis de respuesta, en un horno de microondas doméstico Samsung Co., de 2450

MHz, empleando 7 niveles de variación del mismo.

Posterior al tratamiento cada muestra de los frutos tratados se enfrió con agua helada a

4 ºC, es importante evitar que el pericarpio se humedezca por ello se colocaron en

bolsas de polietileno antes de sumergirlas en el agua.

20

Una vez enfriadas las muestras se colocaron en bolsas de polietileno perforadas para

evitar la condensación de agua durante el tiempo de almacenamiento (3 semanas) a 4

ºC, y con esto evitar las condiciones de humedad para el crecimiento de hongos.

2.2. Caracterización del Fruto Dado que el calentamiento con microondas depende de las características físicas del

material a tratar se determinaron algunas de las propiedades físicas del fruto de litchi, el

peso, tamaño y porción comestible del mismo, los resultados se presentan en el cuadro

4. Estas características están relacionadas con la cantidad de energía que se transfiere

al fruto, y dependiendo de la capacidad del fruto de absorber o disipar la energía de

microondas, será la eficiencia de la transferencia de energía que se obtenga en el

tratamiento. Puede presentarse en un intervalo de 18 a 100 %, a diferentes volúmenes,

sólo en el caso específico del agua en 1000 mL o más se absorbe el 100 % de energía

(Gunasekaran, y Yang, 2007).

El tratamiento con microondas crea un efecto de calentamiento al friccionarse las

moléculas de agua, esta energía cinética se manifiesta en forma de calor originando la

transferencia de la humedad, lo que origina un gradiente de presión de vapor entre la

superficie y la parte interna del fruto (Ozkan y col., 2007), por lo que es de vital

importancia la clasificación del fruto en tamaños, ya que esto determinará la porción

comestible, y en consecuencia el contenido de humedad en el mismo.

CUADRO 2. PESO, DIMENSIONES Y PORCIÓN COMESTIBLE DEL LITCHI

Dimensiones del litchi

Peso (g) Axial (cm) Ecuatorial

(cm)

Promedio 19.90 +

0.5

3.4 + 0.15 3.1 + 0.2

Porción comestible

Pulpa (%) Semilla (%) Pericarpio (%)

62.52 + 0.6 20.74 + 6.0 16.71 + 7.0

21

En base a los datos de peso y tiempo de proceso, se puede obtener un valor importante

para el escalamiento de los procesos con microondas, la densidad energética (Ortiz y

col., 2003) que nos indica la cantidad de energía que se transmite al alimento a un

cierto tiempo, y una potencia dada.

La distribución de temperatura durante el tratamiento con microondas depende del peso

de la muestra, forma de la muestra, características intrínsecas del fruto como porcentaje

de humedad, conductividad eléctrica y constante dieléctrica (Devece y col., 1999).

2.3. Tratamiento con microondas

El fruto de litchi caracterizado y sanitizado se procedió a tratar con microondas, para lo

cual muestras de diferentes pesos en un intervalo de 80 a 220 gramos fueron tratadas,

variando además los tiempos de tratamiento en un intervalo de 0.5 a 3.4 minutos y una

potencia especifica del horno de microondas de 318 watts, posteriormente se determinó

la disminución de la actividad enzimática por gramo de fruto fresco (UA/g ff). Se observó

la disminución de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa después de que las

muestras fueron tratadas con microondas (Osorio 2007). En la muestra sin tratamiento

la actividad enzimática fue de 4.07 UA/g ff (testigo) y para las muestras tratadas de

menos de 2.0 UA/g ff, la disminución de la actividad de la polifenoloxidasa se refleja en

el aumento del tiempo de oscurecimiento del pericarpio. Aunque se observó que existe

muy buena respuesta en la inactivación enzimática al comparar las muestras tratadas

con el testigo, también se presentan algunos inconvenientes durante el tratamiento

como son el oscurecimiento por quemadura del pericarpio de litchi, fractura del mismo

al someterlo a tiempos largos de calentamiento como 2 y 3 minutos y la deshidratación

lo que ocasiona la disminución en la luminosidad del pericarpio. Se puede concluir que

el tratamiento con microondas favorece la fijación del color en la muestra tratada,

además de que resultó ser un método rápido y efectivo para el control del

oscurecimiento en el fruto.

22

2.4. Congelación

Para proceder a la congelación del litchi ya tratado con microondas, se procedió al

enfriamiento con agua helada a 4 ºC. Una vez enfriadas las muestras se colocaron en

recipientes de plástico para su congelación a - 15 ºC. Los frutos congelados se

almacenaron para continuar la siguiente meta de investigación propuesta. Que

consistirá en la determinación de los fitoquímicos presentes en fruto fresco y

congelado.

2.5. Determinación de vitamina C

Con respecto al contenido de vitamina C se encontró que no existe una diferencia

significativa entre la muestra tratada con microondas y la muestra tratada

convencionalmente con respecto al testigo (muestra sin tratamiento) en el cuadro 3 se

muestra los resultados. En la muestra tratada con microondas prácticamente se

conserva el 100 % del contenido inicial de la misma, esto debido a que el calentamiento

es más rápido, y el fruto no está en contacto con el agua. En el caso de la muestra

tratada convencionalmente se observa una pérdida del 5 % con respecto al testigo

después del tratamiento, la disminución es muy pequeña, el hecho de que el fruto

presenta un pericarpio duro y poco permeable evita el intercambio de líquidos (jugo con

el agua de tratamiento) sin embargo en ocasiones se presentan fracturas y esto puede

originar la oxidación y la solubilizacion de la vitamina C.

23

Cuadro3. Contenido de vitamina C en muestras de litchi.

Con el tratamiento convencional se observaron mejores resultados en cuanto a la

inactivación de las enzimas presentes en la pericarpio de litchi. Respecto al contenido

de vitamina C no se ve afectado significativamente, sin embargo en el tratamiento

convencional la pulpa presenta manchas obscuras al parecer ocasionadas por

compuestos que se liberan de la semilla, además de un sabor ligeramente amargo.

Considerando que el litchi es un fruto de producción anual que sólo está disponible en

México los meses de mayo a julio es que se procedió a conservar por medio de

congelación y a cuantificar el efecto que tiene este método en los fitoquímicos.

Respecto a la vitamina C, en el fruto previamente sanitizado, separado de la cáscara y

semilla, triturado y finalmente almacenado en congelación a -18°C, se cuantificó

inmediatamente después de obtener el extracto y se consideraron las precauciones

necesarias para evitar la formación de ácido dehidroascórbico, (DHAA) como forma

oxidada de la molécula.

De acuerdo con los resultados obtenidos, el fruto tuvo una concentración de

0.025mg/100 g de muestra congelada de Vitamina C. Comparado con los 50 mg/100 g

de la muestra fresca, se puede concluir que en el fruto congelado durante 8 meses,

éste nutracéutico ha sido degradado.

Muestra Contenido de vitamina C

mg/100 g

Testigo 50.00

Tratamiento con

microondas

49.99

Tratamiento

convencional

47.38

24

2.5. Determinación de tiamina

Comparando los tiempos de retención de las señales obtenidas en las muestras del

litchi frente a patrones de la vitamina. Como resultado final se obtuvo 0.01 mg de

tiamina/ 100 g de fruta fresca, cifra que representa el 0.1% de la ingesta diaria

recomendada de esta vitamina, que es de 10 mg, y en términos de composición del

nutrimentos del fruto, representa el 1.3%. Respecto al fruto congelado no se detecto ya

ninguna concentración de tiamina.

2.5. Determinación de flavonoides

Se extrajeron varias fracciones de flavonoides en el fruto fresco que fueron

epicatequina, proantocianidina B2 y proantocianidina B4, cuantificandose 231, 254 y

452 µg/mL de extacto respectivamente. La presencia de estas moléculas ha sido

recientemente estudiada por la importante actividad antioxidante, anticancerígeno e

inmunomodulatoria.

Conclusión. Los resultados encontrados muestran que el tratamiento con microondas

es una buena alternativa para conservar el fruto de litchi ya que prácticamente se

conserva el 100 % del contenido inicial de vitamina C.

META 3 (40 %)

Determinación de fitoquímicos de pasta de aguacate variedad Hass tratada con

microondas y liofilizada.

3.1. Liofilización de la pasta

La pulpa de aguacate variedad Hass se trató de acuerdo a lo establecido en la patente

mexicana #258281 y se liofilizó empleando 4 condiciones diferentes variando

temperatura y tiempos de proceso. Se determinó la cantidad de β-sitoesterol por

cromatografía de gases y de luteína, vitamina E y glutatión empleando HPLC.

25

CUADRO 4. CONTENIDO DE LOS DIFERENTES FITOQUÍMICOS EN LAS PASTAS

DE AGUACATE TRATADAS CON MICROONDAS Y LIOFILIZADAS

Muestra β-sitoesterol

(mg/100g)

Luteína

(mg/100g)

Vitamina E

(UI/100g)

Glutatión

(nM/100g)

Pasta Microondas 82.5 19.7 2.1 130603.6

Pasta Liofilizada A

41.5

8.1

NR

NR

Pasta Liofilizada B NS NR 1.2 18843.0

Pasta liofilizada C NS NR 2.7 18422.9

Pasta Liofilizada D NS NR 3.0 130528.7

NS: No se obtuvo señal; NR: No se realizó la determinación

El objetivo de esta meta fue analizar el contenido de sitoesterol, luteína, vitamina E y

glutatión en pastas de aguacate tratadas con microondas y liofilizadas. La importancia

de estos fitoquímicos en el tratamiento de diferentes padecimientos se ha estudiado en

diversas investigaciones, por ejemplo el -sitoesterol puede inhibir la absorción del

colesterol en el intestino, resultando un menor nivel de colesterol en la sangre. Estudios

en animales han demostrado que este compuesto influye en la inhibición de tumores

cancerosos.

La vitamina E funciona como antioxidante disminuyendo la formación de radicales libres

que pueden causar daño en las células durante el envejecimiento y causar daños al

corazón y diversos tipos de cáncer, incluyendo el de boca y faringe.

La luteína es un carotenoide, que ayuda a proteger al ojo del desarrollo de cataratas y

la degeneración macular.

El glutatión o L-glutamil-L-cistein-glicina (GSH) es un tripéptido perteneciente a la

familia de los biotioles y que actúa como un antioxidante que protege a las células del

estrés oxidativo.

Se trató con microondas una pasta de aguacate variedad Hass, esta se dividió en 5

lotes: Pasta microondas, pasta liofilizada A, pasta liofilizada B, pasta liofilizada C y

26

pasta liofilizada D. La diferencia entre las pastas liofilizadas fue el tiempo de proceso,

siendo la de mayor tiempo de liofilización la muestra A y la de menor la muestra D.

Como se puede observar en el cuadro 1, el proceso de liofilización afecta a la

concentración de los fitoquímicos contenidos en la pasta de aguacate ya que al

comparar las concentraciones encontradas en las pastas liofilizadas con los valores de

la pasta trata con microondas se observa una disminución en dichas concentraciones, a

excepción de la vitamina E.

En cuanto a las pastas de aguacate liofilizadas se observó que a mayor tiempo de

proceso se disminuye la concentración de glutatión y de vitamina E.

Para el caso de β-sitoesterol, no se observó señal en la cromatografía de gases debido

a que las pastas liofilizadas empleadas para este análisis fueron rehidratadas y

almacenadas por una semana antes del análisis, con lo que se puede considerar que

dicho fitoquímico se degrada con el tiempo. Lo anterior nos sugiere que el consumo de

las pastas rehidratadas debe realizarse de manera inmediata.

En el caso de la vitamina E se observó que la pasta liofilizada D presentó una

concentración mayor a la registrada en la pasta de aguacate tratada solo con

microondas, esto nos sugiere que el proceso de liofilización puede estar dañando las

estructuras de los plástidos y se está generando la liberación de dicha vitamina.

Conclusión. Se logró encontrar que el tratamiento de liofilización aplicado a la pasta

de aguacate reducida en calorías afecta las cantidades de fitoquímicos obteniendo que

tiempos menores de liofilizado generan la menor pérdida de estas moléculas.

Impacto.

Con los resultados obtenidos podemos considerar que los tratamientos combinados de

microondas – congelación ó microondas – liofilización pueden ser una buena alternativa

para la conservación de frutos cómo el mamey, litchi y aguacate. Estos tres frutos son

de interés comercial y con una vida media postcocecha muy corta.

27

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