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INFORME TECNICO FINAL

EFECTO DEL ESTRÉS SOBRE LA PRODUCCIÓN Y SECRECIÓN DE IgA

EN LA MUCOSA NASAL DEL RATÓN

Registro SIP: 20071131

Responsable: Dr Rafael Campos Rodriguez

RESUMEN

El sistema inmunitario de las mucosas (MALT) comprende tejidos

asociados con la superficie de las mucosas respiratoria, digestiva y

genitourinaria, los cuales defienden el organismo de antígenos externos.

El tejido linfoide asociado a nariz (NALT) representa un compartimiento

inductor de la respuesta inmunitaria y se localiza en piso de la nariz de algunos

roedores; mientras que la lámina propia de la mucosa nasal representa al

compartimiento efector. El estrés, provoca un incremento de la secreción de

hormonas glucocorticoides y catecolaminas por activación del eje hipotálamo-

hipófisis-adrenal. Estas hormonas interactúan con receptores de las células

inmunitarias ocasionando cambios en su respuesta. El objetivo de este trabajo

fue determinar los efectos del estrés sobre el número y distribución de las

células plasmáticas IgA+ así como de la secreción de IgA. Se utilizaron

ratones Balb/c machos de 9 semanas de edad, divididos en un grupo control y

dos grupos problema, a los que se aplicó 3 horas de estrés por inmovilización,

durante 4 y 8 días.

La cuantificación de corticosterona en suero mostró un incremento

significativo en los animales estresados durante 4 días.

De cada animal, se obtuvo el NALT y se realizaron tinciones

inmunohistoquímicas para cuantificar células plasmáticas productoras de IgA

La secreción de IgA en el lavado nasal se determinó por ELISA.

Los resultados mostraron que las células plasmáticas IgA+,

disminuyeron significativamente con el estrés de 4 días y se incrementaron a

los 8 días, lo que se correlacionó con los niveles de IgA en el lavado nasal,

mostrando diferencias significativas.

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Se concluye que el NALT es sensible al esquema de estrés utilizado y

que este afecta la respuesta humoral (células IgA+), posiblemente por la

influencia de las hormonas secretadas durante el estrés.

ANTECEDENTES

SISTEMA INMUNITARIO

Los órganos linfoides se dividen desde un punto de vista funcional en

dos categorías: linfoides primarios o centrales y secundarios o periféricos; y

desde un punto de vista anatómico-estructural en órganos capsulados y no

capsulados.

En los órganos primarios, médula ósea y timo se originan y maduran los

linfocitos B y T hasta convertirse en células competentes, capaces de

reconocer y responder en forma específica a los estímulos antigénicos. Los

órganos linfoides secundarios como los ganglios linfáticos, bazo y tejidos

linfoides asociados a las mucosas (MALT), disponen de linfocitos ya maduros e

inmunológicamente competentes y es en ellos donde se producen las

respuestas inmunitarias frente a estímulos antigénicos.

En las mucosas se encuentra la primera línea de defensa contra antígenos

externos, ya que un gran número de agentes patógenos las utilizan como vía

de entrada. El conjunto de tejidos linfoides organizados y difusos en las

mucosas del organismo, se denominan �tejidos linfoides asociados a las

mucosas� (MALT) los cuales a través de la inmunidad innata y adquirida

mantienen una homeostasis inmunitaria, a lo largo de la gran superficie interior

de las víseras, la cual comprende las mucosas oral, nasal, respiratoria, urinaria

y gastrointestinal. (Tristram GP 2001)

TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A NARIZ

En la mucosa respiratoria, también se encuentra una gran cantidad de

células inmunitarias, las cuales se distribuyen en la lámina propia en forma

difusa, así como en estructuras foliculares no encapsuladas, o constituyendo

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el tejido linfoide asociado a la nariz (NALT), el cual forma parte de los tejidos

linfoides asociados a las mucosas (MALT). Entre las células del epitelio

respiratorio que recubre el NALT, también se encuentra gran cantidad de

células M (membranosas o con micropliegues), cuya principal función es la

captura y la transitosis de los antígenos desde la porción apical de la célula,

hasta la porción basal, en donde muestran el antígeno a las células

presentadoras de antígenos. (Giannasca PJ y cols 1997). Debido a su

localización anatómica, se considera un análogo del anillo de Waldeyer

humano (Boyaka NP y cols 2000) y funcionalmente se compara con la placa

de Peyer por presentar características inductoras similares. (Kiyono H y

Fukuyama S 2004)

El NALT es un compartimiento inductor y corresponde a la porción de

células linfoides organizadas. En este sitio se inicia la respuesta inmunitaria,

además de ser el sitio de cambio de isotípo de inmunoglobulina IgM+ por IgA+

(Shikina T y cols 2004); una vez terminado este proceso, las células

plasmáticas productoras de IgA, migran hacia la lámina propia sobre la que

descansa el tejido organizado, en este sitio que es la porción efectora, se lleva

acabo la producción de IgA secretora la cual se encuentra presente en el moco

nasal. Esta inmunoglobulina evita que agentes patógenos invadan las mucosas

entre ellas la nasal.

EJE HIPOTALAMO-HIPOFISIS-ADRENAL

El hipotálamo es un centro de integración que recibe y monitorea

información acerca del ambiente, y además coordina las respuestas a través

del sistema nervioso central, autónomo y endocrino. Las principal información

que recibe es la visual, olfativa, auditiva y sensitiva.

Dentro de las funciones del hipotálamo está la de controlar la secreción

de hormonas hipofisiarias, controlar las acciones involuntarias por medio del

SNA (sistema nervioso autónomo) y regular la motivación y los instintos por

medio del sistema límbico. El núcleo paraventricular del hipotálamo secreta la

hormona corticotropina (CRH) dentro del sistema portahipofisiario, la cual

regula subsecuentemente la producción de hormona adrenocorticotrofica

(ACTH) en la glándula hipófisis anterior. La hormona ACTH a su vez actúa en

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la corteza de la glándula suprarrenal provocando la secreción de cortisol.

Durante los periodos de estrés se produce una sobreestimulacion hipotalámica,

lo cual provoca una hipersecreción hormonal.

El sistema de estrés está constituido por el eje hipotálamo-hipófisis-

adrenal (HPA) y el sistema simpático sistémico, los cuales se encuentran

controlados por señales limbicas, circadianas, neurosensoriales y hormonales.

Las situaciones de estrés, tales como la hipoglicemia, procesos inflamatorios,

fiebre, trauma, ejercicio intenso, cirugía y problemas emocionales pueden

activar este sistema. (Paca´k K y Palkovits M 2001)

MODELOS DE ESTRÉS EN ANIMALES

Hans Selye (Paca´k K y Palkovits M 2001) en 1936, fue el primer

investigador que utilizó el modelo de estrés por inmovilización en ratas, las

cuales manifestaron varios signos que caracterizaron un síndrome ocasionado

por el estrés. La manifestación mas evidente fue la presencia de hipertrofia de

la glándula adrenal, la cual se atribuyó a una sobreestimulacion por las

hormonas ACTH secretadas por la hipófisis anterior. Otra manifestación fue la

presencia de ulceración gástrica, la cual se atribuyó al incremento en la

secreción de ácido clorhídrico por las células parientales en el estómago;

también se encontró involución del sistema timo linfático, la cual se atribuyó a

la implicación del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal así como del sistema

nervioso autónomo.

ESTRÉS Y SECRECIÓN DE IgA.

Por otro lado sujetos sometidos a estrés intenso o de larga duración así

como atletas de alto rendimiento sujetos a estrés por ejercicio intenso padecen

de enfermedades respiratorias con mayor frecuencia que los sujetos no

estresados. La razón de esta mayor susceptibilidad se desconoce, pero se

supone esta relaciona con una inhibición de la respuesta inmunitaria. A nivel de

las mucosas, los efectos del estrés se han estudiado solo sobre las

modificaciones de los niveles de IgA en saliva y no existen estudios acerca de

sus efectos a nivel de la mucosa nasal, en particular sobre la producción y

secreción de IgA.

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OBJETIVO GENERAL

Analizar los efectos del estrés, sobre la cantidad y distribución de las

células productoras de IgA, así como los cambios en la secreción de IgA al

líquido nasal. Así como su efecto sobre síntesis de las citocinas involucradas

en la producción de IgA.

OBJETIVOS ESPECIFICOS 1. Determinas las concentraciones de corticosterona séricas en los ratones

normales y sometidos a estrés.

2. En el NALT de ratones normales y sometidos a estrés, identificar y

cuantificar por inmunohistoquímica las células plasmáticas IgA+

3. En el tejido no NALT (la lámina propia) de ratones normales y estresados,

identificar linfocitos B IgA+.

4. En muestras de lavado nasal de ratones normales y estresados, cuantificar

anticuerpos IgA mediante inmunoensayo enzimático (ELISA).

5. Determinar por RT-PCR la expresión de RNAms para IL-6 e IL-10.

MATERIAL Y METODOS Animales

Se utilizaron ratones Balb/c machos con un peso entre 21-24 g

proporcionados por Harlan México, el manejo de los animales se realizo de

acuerdo a las normas de la Comisión de Bioética de la ESM. Los ratones se

dividieron en tres grupos de 7 animales cada uno; un grupo control, uno con

tratamiento de estrés de 4 días y otro con tratamiento de 8 días.

Tratamiento de estrés. Los animales fueron sometidos a un esquema de estrés por

inmovilización en contenedores cilíndricos apropiados al tamaño del animal (5

6

cm. de largo, 3 cm de alto y 3.5 cm de diámetro) con ventilación adecuada.

Antes y después del periodo de estrés, los animales se mantuvieron en jaulas

durante los días de tratamiento, ingiriendo agua y comida a libre demanda. Los

animales control se mantuvieron en las mismas condiciones.

Los animales problema se sometieron diariamente a 3 horas de estrés,

bajo un horario establecido (8:00-11:00 AM). Para evitar el estado de

adaptación al estrés durante la inmovilización, los ratones se estimularon cada

30 minutos de la manera siguiente: 1.-Agitación de los contenedores durante

10 segundos, iniciando el ciclo a los 10 minutos. 2.-Rotación de los

contenedores durante 10 segundos, iniciando el ciclo a los 20 minutos. 3.-Por

ultimo, se sumergió la cola de los animales en agua fría durante 10 segundos,

iniciando el ciclo a los 30 minutos.

Día Agitación de los

contenedores

Rotación

de los contenedores

Inmersión de la cola en agua

fría

1 x x

2 x x x

3 x x

4 x x x Sacrificar el grupo de ratones controles y estresados durante 4 días 5 x x

6 x x x

7 x x

8 x x x Sacrificar el grupo de ratones estresados durante 8 días

Obtención y procesamiento del material biológico.

Posterior al tratamiento, los animales se anestesiaron profundamente

con vapores de éter, se sangraron por punción cardiaca directa y se

sacrificaron por decapitación. Se procedió a realizar lavado nasal con 2 ml de

solución salina estéril, colocando un catéter en la tráquea, para realizar

infusión retrógrada y colectar el liquido de lavado nasal en tubos Eppendorff,

después se almacenó en congelación para cuantificar posteriormente la sIgA

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(IgA secretora) mediante ELISA tipo emparedado. Por último se realizaron

curvas de concentración y cuantificación de proteínas por el método de

Bradford.

Para la obtención del NALT, después del lavado nasal se removió la piel

de la cabeza, se retiró el maxilar inferior y los tejidos blandos, como lo

describen (Asanuma y cols, 1997; Heritage y cols, 1998)

El paladar extraído se colocó en contenedores de aluminio de 1 cm³,

sobre una base de medio de inclusión hidrosoluble (Tissue-tek), con el NALT

en posición ventral, éste fue cubierto con una segunda capa de tissue-tek y se

congeló en isopentano. Las muestras fueron almacenadas a �70° C, hasta su

corte en criostato.

Después de extraído el NALT los cráneos fueron fijados por inmersión

en paraformaldehido al 4% por 24 horas. Después de lavado, se

descalcificaron con EDTA al 8% p.H 7.6, realizando un cambio diario durante 8

días. Al término se procesaron para su inclusión en parafina y se obtuvieron

cortes de 7 µm de espesor.

Procesamiento

De las muestras del NALT congeladas se obtuvieron cortes de 7 µm de

espesor, se colocaron en series de portaobjetos previamente tratados con

gelatina la 1% y se fijaron en acetona durante 20 minutos.

Tinción

En los cortes fijados en acetona se realizo la tinción inmunohistoquímica

para identificar por inmunohistoquímica directa, células plasmáticas

productoras de IgA utilizando anticuerpo policlonal de cabra anti-IgA de ratón

conjugado con HRP (Serotec).

Cuantificación de las células.

Las AFC-IgA+ en el NALT se contaron en una área de 30013µm2, en

los cortes de la porción media del tejido, mientras que se utilizó un área

constante de 25050 µm2, para contabilizar las AFC-IgA+ en la lámina propia.

Cuantificación de IgA en líquido nasal por ELISA

Se colocó en cada pozo 100 µg/ml de inmunoglobulinas de conejo anti-

IgA de mieloma de ratón y se incubo durante 18 h a 4° C; después de tres

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lavados con amortiguador de fosfatos-tween 20 p.H 7.2 (PBS-T) se aplicaron

las muestras de líquido nasal sin diluir incubándose durante 2h a 37° C; al

término, las placas se lavaron 5 veces con PBS-T y 5 veces con PBS,

posteriormente se incubaron durante 2h a 37° C con el conjugado de cabra

anti-IgA de ratón (Serotec) diluido 1:1000 en PBS-T. Finalmente, las placas se

lavaron 3 veces con PBS-T y 3 veces con PBS. Posteriormente se adicionó el

sustrato (Ortofenilendiamina). Después de 15 minutos a temperatura ambiente,

la reacción se detuvo con ácido sulfúrico al 2.5 M se determinó la absorbancia

a una longitud de onda de 490 nm. La curva estándar se hizo utilizando una IgA

de mieloma de ratón (Sigma), el rango de concentración fue de 5 µg a 150 ng.

Aislamiento de RNA total. Cada muestra con un peso entre 50 y 70 mg, fue disuelta en un mL de Trizol reagent (invitrogen) por medio de homogenización de acuerdo a las instrucciones del proveedor. El Trizol fue removido con la adicción de 0.2 mL de cloroformo seguido de la precipitación de RNA total con isopropanol. Los precipitados fueron lavados con etanol al 75 %. La cantidad y la pureza de el RNA fue cuantificado espectrofotometricamente por las lecturas de densidad óptica a 260 y 280 nm de cada muestra; la integridad fue comprobada mediante electroforesis en gel de agarosa. El aislamiento del RNA total de las mucosas almacenadas de los diferentes grupos se basó en el método de guanidina de tiocinato (Chomczynski y Sacchi, 1987) con Tri reagent (Sigma). Como primer paso de este aislamiento fue la homogenización (50-70 mg de tejido/mL) de las muestras de intestino con un homogenizador marca Polytron. Se mantuvo el homogenizado por 5 min a temperatura ambiente para permitir la disociación de complejos de nucleoproteínas, posteriormente se agregó cloroformo 0.2 mL por 1 mL de Tri reagent, tras mezclarse vigorosamente por 15 seg se dejó 15 min a temperatura ambiente, centrifugándose a 12 000 g por 15 minutos a 4ºC. Se obtuvieron tres fases; superficial o fase acuosa (contiene RNA Total), una fase intermedia y una fase inferior orgánica (contiene proteínas); el paso siguiente fue transferir la fase acuosa a un tubo nuevo libre de DNAsas y RNAsas. La precipitación del RNA de la fase acuosa se hizo con isopropanol 0.5 mL /1 mL de Tri reagent usado en la homogenización inicial; ya añadido y mezclado cuidadosamente, el isopropanol se dejó interactuar 10 min y se centrifugó a 12 000 g por 10 min a 4ºC obteniéndose un sedimento blanco, que se lavó con 1 mL de etanol al 75% por cada 1 mL de Tri reagent con la subsiguiente centrifugación a 7500 g por 5 min a 4ºC. Se removió el etanol y se secó brevemente el sedimento (no totalmente para evitar insolubilidad), se disolvió el RNA con agua-DEPC (di-etil pirocarbonato), auxiliado con incubación a 55ºC por 5 min. Todas las muestras de RNA se incubaron con DNasa I (Roche) a una relación 10 U/1mg de RNA total a 37ºC por 30 min. Al término de la incubación se inactivó la enzima mediante 150 µL de fenol:cloroformo: alcohol isoamílico que se agregó a cada una de las muestras y se mezclo vigorosamente por 30 seg, al término de los cuáles se centrifugo la muestra por 2 min a 12000 g a 4ºC. El

9

paso siguiente fue transferir la fase acuosa a un tubo nuevo libre de DNAsas y RNAsas. A la fase acuosa se le agregó 1 mL de etanol al 100% a -20ºC se mezcló cuidadosamente y se incubó por 15 min a -20ºC. Después se centrifugaron las muestras por 2 min a 12000 g a 4ºC obteniéndose un sedimento que se lavó con 1 mL de etanol al 80%, se removió el etanol y se seco brevemente el sedimento y fue disuelto el RNA con agua tratada con DEPC y con ayuda de incubación en un baño a 55ºC, por 5 min. Se determinó la concentración y pureza del RNA por su densidad óptica a 260 nm y 280 nm en un espectrofotómetro Genesys y se guardó a -70 ºC hasta su uso. El RNA se cuantificó con la siguiente fórmula: µgRNA/mL= dilución X As260 X 40 La integridad del RNA se verificó por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 0.5%- formaldehído-bromuro de etidio (1 µg/mL). Previo al corrimiento, las muestras (5 mL de RNA total de cada una de ellas) se incuban a 65ºC durante 10 min y posteriormente se colocaron en hielo a 4ºC y se les agregó 1 µL de colorante de corrimiento (formamida al 98%, EDTA 10mM, xilen-cianol al 0.1% y azul de bromofenol al 0.1%), las mezclas se colocaron en el gel de agarosa y formaldehído antes mencionado. El regulador del corrimiento consistió de MOPS 1X. Preparación de cDNA. La reverso transcripción se realizo con el kit �First-strand cDNA Synthesis� (Epicentre) utilizando 0.5 µg de la muestra de RNA total. El cDNA fue cuantificado espectrofotometricamente a una densidad óptica de 260 nm. PCR en tiempo real. El PCR en tiempo real fue usado para medir los niveles de mRNA animales. Nosotros emplemos el equipo Lightcycler y el kit �Lightcycler Taqman entre los grupos de Master� realizado siguiendo las instrucciones del proveedor Roche. mediante el uso de sondas predesarrolladas por el mismo proveedor (pIgR e IgA), tipo Taqman para expresión genética. La transcripción reversa y la reacción en cadena de la polimerasa se hizo en un solo paso con el �Kit Taqman One Step RT - PCR Master Mix Reagents� (Formado por: �Master Mix� sin UNG y �MultiScribe� mas �RNase Inhibitor Mix�), la reacción se llevó a cabo en un volumen final de 10 µL/pozo: 5 µL �Master Mix� sin UNG y 0.25 µL �MultiScribe� mas �RNase Inhibitor Mix�, 1 µL (50 ng de RNA total) RNA total (ajustado según rango dinámico, previamente obtenido), 3.25 µL de agua libre de RNasa y 0.5 µL de sonda de nuestros genes blanco (pIgR e IgA marcados con 6- carboxifluoresceína: FAN) o nuestro control endógeno 18 S (marcado con VIC) control interno (normalizador). Las placas se corrieron utilizando el termociclador en tiempo real ABI 7900, con el siguiente programa: 35 min a 48ºC para la reverso trascripción y 10 min a 95ºC para activar DNA polimerasa, la amplificación se realizó con 45 repeticiones de los dos pasos siguentes: 15 seg de desnaturalización a 95ºC y un paso de 1 min de alineación y extensión a 60ºC.

Análisis estadístico

Utilizando la prueba de ANOVA de una vía, se compararon los grupos

experimentales de cada protocolo con su respectivo testigo. Los datos se

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analizaron mediante el software Sigma Stat y se graficaron mediante el

software Sigma Plot.

RESULTADOS

Cuantificacion de corticosterona sérica.

Linfocitos B IgA+ en el NALT

En los tres grupos de estudio, las células IgA+ mostraron un patrón de

distribución difuso en todo el NALT, no observándose zonas de concentración

para esta población (Figura 1-A y B).

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Figura 1. Distribución de los linfocitos IgA+ en el NALT. A) La figura muestra los

linfocitos con reacción positiva al anticuerpo anti-IgA. 20x. B) los puntos representan el patrón

de distribución de las células IgA+ en el NALT.

En la cuantificación del numero de células en un área de 30013µm2, las

cifras encontradas fueron: en el grupo testigo 94±8.6 células, en los ratones

estresados durante 4 días 70±9.7 y en los estresados durante 8 días 107±22.3

linfocitos (Figura 2). En el análisis estadístico, se encontraron diferencias

significativas entre el grupo control y el grupo de estrés de 4 días (F2,15=9.667;

P 0.013) y entre este último grupo y el grupo de 8 días, también hubo

diferencia significativa (F2,15=3.238; P 0.002). Entre el grupo testigo y de estrés

por 8 días no hubo diferencia (P 0.151)

Por lo tanto, esta población celular fue susceptible al estrés, mostrando

una disminución, seguida de una recuperación del número de estas células.

A

B

12

4DIAS

Num

ero

de li

nfoc

itos

B Ig

A+

en e

l NA

LT

0

20

40

60

80

100

120

140

160

CONTROL 8 DIAS

P 0.002P 0.013

Figura 2. Cantidad de linfocitos B IgA+ en el NALT. La gráfica compara la cantidad

de células entre los tres grupos de estudio. Con respecto al grupo control, el número de células

disminuyó significativamente con el estrés de 4 días (DF2,15=9.667; P 0.013) y se incremento

con el estrés de 8 días (DF2,15=3.238; P 0.002).

Células plasmáticas IgA+ en el tejido no NALT (lámina propia)

Las células plasmáticas IgA+ se observaron en la lámina propia

entre los acinos mucoserosos de la mucosa revestida por epitelio respiratorio,

predominantemente a nivel de los cornetes (Figura 3). En la mucosa del

tabique y de la región anterior de la nariz las células fueron escasas.

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Figura 3. Células plasmáticas IgA+ en la lámina propia. Las células plasmáticas se

observan entre los acinos de las glándulas nasal (Flechas). 20X

El conteo de las células se realizó en el área de 25050 µm2 de los

cornetes, encontrando un promedio de 5.3±1.5 células en el grupo testigo, el

grupo de estrés de 4 días mostró 4.6±0.8 células, y el de 8 días 5±0.9 células

(Figura 4). El análisis estadístico no mostró diferencias significativas entre los

tres grupos de estudio (F2,15=0.536; P 0.596), pero aparentemente los animales

estresados durante 4 días mostraron tendencia hacia la disminución del

número de células plasmáticas IgA+.

4 DIAS

Cél

ulas

pla

smat

icas

IgA

+ en

lám

ina

prop

ia

0

2

4

6

8

10

8 DIASCONTROL

Figura 4. Cantidad de células plasmáticas en la lámina propia. La gráfica compara

los dos grupos problema con el testigo. El análisis estadístico, no mostró diferencias

significativas entre los tres grupos de estudio (DF2,15=0.536; P 0.596),

Efecto del estrés en los niveles de IgA+ secretora

En el análisis del inmunoensayo enzimatico (ELISA), los niveles

de sIgA en las muestras nasales del grupo testigo fue de 1.43.±0.10 µg/ml. Los

resultados mostraron una disminucion significativa en los niveles de sIgA con

14

el estrés de 4 días, con cifras de 1.27±0.11 µg /ml. (F2, 24=9.480; P <0.003), en

cambio el grupo tratado durante 8 días presentó cifras de 1.46±0.07 µg /ml, sin

mostrar diferencias significativas con el grupo control (P 0.451). (Figura 5)

Figura 5. Niveles de IgA secretora. La gráfica compara los dos grupos problema con

el testigo, cuantificando los niveles de sIgA en el lavado nasal por ELISA. En el análisis

estadístico, se observó una diferencia significativa entre el grupo control y el de estrés de 4

días (DF2, 24=9.480; P <0.003), así como los grupos problema (P 0.001).

Efecto del estrés por 8 dìas expresión relativa de mRNA para cadenas alfa de IgA y citocinas.

Los resultados de la determinación de a expresión relativa de los diferentes

mRNA en ratones estresados durante 8 días fueron los siguientes: IgA 6.67 +/-

0.57, IL-6 0.81 +/- 0.29, IL-2 2.56 +/- 0.28 e INFγ 4.19 +/- 1.27, IL-12 0.25 +/-

0.04. Por lo que podemos observar que la expresión de la IL-6 no se modifico,

mientras que la expresion de IL-12 se encuentran disminuidas en relación al

control (1.0). Por el contrario, la expresion de IFN-g, IL-2, (Figura 6), asi como

de lisozima, TNF-alfa, TLR-2 , TLR-3, IL-1 e IL-10 se encontro aumentada

(Figura 6 y Figura 7).

4 DIAS

% Ig

A ( µ

g/m

L)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

CONTROL 8 DIAS

P 0.003 P 0.001

15

0

2

4

6

8

10

Control IgA IL-6 IL-12 INF-g IL-2

Niv

eles

Rel

ativ

os d

e m

RN

A

Figura 6. Expresión relativa de mRNA para cadena alfa (IgA) y citocinas en ratones

estresados durante 7 días.

0

2

4

6

8

10

Control Lisoz TNF-a TLR-2 TLR-3 IL-1 IL-10

Niv

eles

Rel

ativ

os m

RN

A

Figura 6. Expresión relativa de mRNA para lisozima (Lisoz), TNF-alfa, TLR-2 , TLR-3,

IL-1 e IL-10 en ratones estresados durante 7 días.

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DISCUSION

El estrés provocó cambios en el número linfocitos IgA+ en el NALT

El conteo de linfocitos IgA+ por área de tejido en el NALT, mostró una

disminución significativa con el estrés de 4 días, mientras que a los 8 días su

número fue mayor que en el grupo testigo. En la literatura no se encontraron

reportes previos de la cantidad de linfocitos B IgA+ en el NALT ni su relación

con el estrés; Sin embargo los resultados sugieren influencia de las hormonas

del estrés sobre la producción de las citocinas o en la expresión de moléculas

coestimuladoras relacionadas con el cambio de isotipo de IgM a IgA, pues se

sabe que dentro del MALT, en las estructuras que corresponden al

compartimiento inductor, placas de Peyer o en este caso el NALT, ocurre ese

cambio de isotipo, de células IgM+ a IgA+ debido a una transformación de la

cadena µ al isotipo α, regulada por citocinas como el TGF-β. Posteriormente las

células IgA+, migran hacia la lámina propia (porción efectora), en donde se

convierten en blastos IgA+ y células plasmáticas bajo la influencia de IL-5, IL6,

IL10 (Shikina T y cols 2004).

Aunque no se encontraron reportes de la es posible que la disminución en el

número de AFCs IgA en el NALT, se deba a modificaciones en la expresión de

estas moléculas lo cual a su vez modifique el cambio de isotipo de IgM a IgA.

Otra posible explicación es que las células IgA+ se redistribuyan en

otros sitios, como la lámina propia de la mucosa respiratoria, en sangre

periférica u otros órganos linfoides, aunque también se encontró que el

número de AFCs IgA no se modificó significativamente en la lámina propia a

nivel de los cornetes.

Otra explicación de la disminución de las células B IgA+, son los

cambios en la redistribución de las células B (IgM+). Dhabhar FS y cols

mencionan que el estrés agudo provocado durante la mañana ocasionó una

reducción de linfocitos B en sangre periférica (Dhabhar FS y cols 1994). En el

presente trabajo, los ciclos de estrés fueron aplicados en las primeras horas del

día, es posible que estos hayan originado una redistribución de las células IgA+

y con ello su disminución en el NALT, aunque en análisis morfológico no

mostró cambios en la cantidad de linfocitos IgM+.

17

La redistribución de las células linfoides en el MALT está regulada por la

expresión de moléculas de adhesión y quimiocinas. En la mucosa intestinal,

moléculas como TECK/CCL25, MEC/CCL28, MIP-3α/CCL20; y sus receptores

CCR9 y CCR6, pueden regular la migración de las células plasmáticas

productoras de IgA desde los tejidos u órganos linfoides, hacia los sitios de

inflamación y sitios efectores de la mucosa. Aunque no se encontraron

reportes, de cuales son los agentes quimiotacticos que posiblemente participan

en la localización de las AFCs IgA en el NALT, pero es probable que al igual

que en la placa de Peyer existan cambios en la expresión de estos agentes

quimiotacticos que pueden condicionar cambios en la redistribución de estas

células durante el estrés debido al efecto de las hormonas relacionadas con el

mismo. (Lazarus NH, y cols 2003, Kunkel EJ y Butcher EC 2002, Kunkel EJ y

cols 2003, Kunkel EJ y Butcher EC 2003).

Es posible que la alteración de las quimiocinas, así como de moléculas

de adhesión y sus receptores: MAdCAM-1/α4β7, PNAd/L-selectina y VCAM-

1/α4β1, las cuales se han vinculado con la localización de los linfocitos en el

NALT (Csencsits KL y cols 1999), se encuentren disminuidas debido al efecto

del estrés y sus hormonas, al igual de lo que sucede con VCAM-1, selectina-E,

e ICAM-1 las cuales disminuyen en las células endoteliales, después de la

aplicación de glucocorticoides sintéticos, en enfermedades inflamatorias

intestinales (Aziz KE y Wakefield D 1996, Mori N y cols 1999).

El estrés, no modificó la cantidad de células plasmáticas IgA+ en la lámina propia.

El número de células plasmáticas IgA+ en lámina propia se cuantificó a

nivel del tabique nasal, siendo ligeramente menor en los animales estresados,

aunque la diferencia no fue significativa y sugiriendo estar en relación con el

menor número de células IgA+ encontradas en el NALT, con lo cual la cantidad

de células que migran hacia la lámina propia es inferior a lo normal.

Sugiriendo que el mecanismo, seria otra vez la alteración en la expresión de

diversas moléculas, citocinas, quimiocinas y de sus receptores

correspondientes por el estrés y sus hormonas (glucocorticoides). Aunque se

menciona que la lámina propia, no es un sitio preferente de secuestro de

18

linfocitos durante el periodo de estrés, como lo muestran algunos trabajos

(Krynicki M y Olszewski WL 1989, Stefanski V y cols 2003), en donde se

encontró que los linfocitos marcados migran preferentemente hacia la medula

ósea y la piel durante el estrés. Sin embargo, el trafico de estas células hacia

órganos linfoides como el bazo, los nódulos linfoides mesentéricos y

periféricos, fue menor que en el grupo control.

El estrés modificó la cantidad de IgA secretora (sIgA) en el líquido nasal

Los resultados mostraron una disminución significativa de los niveles de

sIgA con el estrés de 4 días y un incremento no significativo en el grupo de

ratones estresados por 8 días. Estos resultados pueden relacionarse con los

cambios tempranos que ocurren durante el estrés agudo, cuya respuesta

revierte tales efectos (periodo de adaptación), ya que agotamiento ocurrido

durante el estrés crónico, provocaría un decremento en el número de células.

(Paca´k K y Palkovits M 2001). En la literatura no se encontraron reportes del

efecto del estrés o de sus hormonas sobre la secreción de sIgA en el moco

nasal, aunque algunos estudios sugieren una relación estrecha entre el estrés,

la inmunidad y la susceptibilidad a infecciones del tracto respiratorio alto

(Cohen S y cols 2001, 2002).

La disminución a los 4 días en la secreción de IgA, se correlaciono con

el menor número de células IgA+ localizadas en el NALT, en donde un factor

determinante, puede ser la sobreactivación del eje HPA durante el estrés. En

saliva por ejemplo, está reportado que durante los periodos de estrés agudo, se

incrementan los niveles de glucocorticoides (Bosch JA y cols 2002, Van Eck M

y cols 1996, Ng V y cols 2003), situación que de repetirse, ejercería efectos

inmunomoduladores sobre las células inmunitarias locales. Como

consecuencia, en el fluido nasal, estas hormonas afectarían el cambio de

isotipo hacia IgA y con ello la cantidad de células plasmáticas en la lámina

propia y la secreción de la inmunoglobulina.

También ha sido propuesta la alteración en el transporte de la sIgA

desde el intersticio glandular hacia la saliva en estrés crónico, lo cual ocasiona

incremento de la susceptibilidad a infecciones en el tracto respiratorio alto

(Graham NM y cols 1998, Jemmott y cols 1983, Phillips AC y cols 2006). Este

19

proceso explicaría la diferencia de células IgA+ en lámina propia y los niveles

de IgA en el fluido nasal. Así, probablemente la deficiencia en el transporte de

sIgA también ocurra a nivel de la mucosa nasal.

Por otro lado el leve incremento de la sIgA en los animales estresados

por 8 días, concuerda con otros reportes, donde el estrés agudo produce

elevación en los niveles de sIgA, además de otros cambios inmediatos en la

composición y la función de la saliva (Bosch JA y cols 1996, Ohira H 2004). En

el presente estudio, la producción de sIgA mostró diferencias en cuanto al

tiempo de aplicación del estrés, lo que se correlacionó con el numero de

linfocitos B IgA+ en el NALT. Por tanto, es posible que el tráfico de estas

células hacia el compartimiento efector, se haya modificado con el estrés.

El estres incremento la expresion del gene para cadenas alpha de la

IgA,, asi como de los genes para las citocinas producidas por celulas del

fneoetipo Th1; interferon gamma e IL-2. Por el contrario, redujo la expresion de

los genes de las citocinas IL12 e IL6.

CONCLUSIONES

1. Se comprueba la hipótesis de influencia del estrés sobre el tejido linfoide

del NALT.

2. Las células IgA+ disminuyeron con estrés por inmovilización de 4 días

así como la secreción de IgA en el fluido nasal, mismas que mostraron

un incremento con el estrés de 8 días, probablemente debido a una

adaptación.

3. El estres incremento la expresion del gene para la cadena alpha por lo

tanto la menor concentracion de IgA en el liquido nasal puede deberse a

menor sintesis de pIgR y por lo tanto del transporte de IgA dimerica..

4. Se sugiere que los efectos del estrés sobre las células productoras de

IgA así como en la secreción de la inmunoglobulina se ejercen a través

de la influencia de las hormonas, catecolaminas y glucocorticoides

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BIBLIOGRAFIA

Asanuma H, Hodson AT, Iwasaki T, Sato Y, Inaba Y, Aizawa C, Kurata T,

Tamura S. Isolation and characterization of mouse nasal-associated

lymphoid tissue. J Immunol methods. 1997; 202: 123-131.

Aziz KE, Wakefield D. Modulation of endothelial cell expression of ICAM-1,

E-selectin, and VCAM-1 by beta-estradiol, progesterone, and

dexametasone. Cell Immunol 1996; 167: 79-85

Bosch JA, Brand HS, Ligtenberg TJ, Bermond B, Hoogstraten J, Nieuw

Amerongen AV. Psychological stress as a determinant of protein levels and

21

salivary-induced aggregation of Streptococcus gordonii in human whole

saliva. Psychosom Med. 1996; 58: 374-382.

Bosch JA, Ring C, de Geus EJ, Veerman EC, Amerongen AV. Stress and

secretory immunity. Int Rev Neurobiol. 2002; 52: 213-253.

Boyaka PN, Wright PF, Marinaro M, Kiyono H, Johnson JE, Gonzales RA,

Ikizler MR, Werkhaven JA, Jackson RJ, Fujihashi K, Di Fabio S, Staats HF,

and McGhee JR. Human nasopharyngeal-associated limphoreticular

tissues, functional analysis of subepithelial and intraepithelial B and T cells

from adenoids and tonsils. Am J Pathol. 2000; 157: 2023-2035.

Cohen S, Miller GE. Stress, Immunity, and susceptibility to upper respiratory

infection. Psychoneuroimmunology. 2001; 2: 7-18.

Cohen S, Hamrick N, Rodriguez MS, Feldman PJ, Rabin BS, Manuck SB.

Reactivity and vulnerability to stress-associated risk for upper respiratory

illness. Psychosom Med. 2002; 64: 302-310.

Csencsits KL, Jutila MA, Pascual DW. Nasal associated lymphoid tissue:

phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node

addresin in naive lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a

mucosal site. J Immunol. 1999; 163: 1382-1389.

Dhabhar FS, Miller AH, Stein M, Mcewen BS, Spencer RL. Diurnal and

acute stress-induced changes in the distribution of peripheral blood

leukocytes subpoblations. Brain Behav Immun. 1994; 8: 66-79.

Giannasca PJ, Boden JA, Monath TP. Target delivery of antigen to hamster

nasal lymphoid tissue with M-cell-directed lectins. Infec immun. 1997; 65:

4288-4298.

22

Graham NM, Bartholomeusz RC, Taboonpong N, La Brooy JT. Does anxiety

reduce the secretion rate of secretory IgA in saliva?. Med J Aust. 1998; 148:

131-133.

Heritage PL, Brook MA, Underdown BJ, McDermott. Intranasal immunization

with polymer-grafted microparticles activates the nasal-associated lymphoid

tissue and draining lymph nodes. Immunology. 1998; 93: 249-56.

Jemmott JB 3rd, Borysenko JZ, Borysenko M, McClelland DC, Chapman R,

Meyer D, Benson H. Academic stress, power motivation, and decrease in

secretion rate of salivary secretory immunoglobulin J. Lancet. 1983; 1: 1400-

1402.

Kiyono H, Fukuyama S. NALT-versus peyer�s-patch-mediated mucosal

immunity. Nat Rev Immunol. 2004; 4: 699-710.

Krynicki M, Olszewski WL. Influence of thermal stress on lymphocyte

migration pattern in rats. Arch Immunol Ther Exp. 1989; 37: 601-607.

Kunkel EJ, Butcher EC. Chemokines and the tissue-specific migration of

lymphocytes. Immunity. 2002; 16: 1-4.

Kunkel EJ, Campbell DJ, Butcher EC. Chemokines in lymphocyte trafficking

and intestinal immunity. Microcirculation. 2003; 10: 313-323.

Kunkel EJ, Butcher EC. Plasma-Cell homing. Nat Rev Immunol. 2003; 3:

822-829.

Lazarus NH, Kunkel EJ, Johnston B, Wilson E, Youngman KR, Butcher EC.

A common mucosal chemokine (mucosae-associated epithelial

chemokine/CCL28) selectively attracts IgA plasmablasts. J Immunol. 2003;

170: 3799-3805.

23

Mori N, Horie Y, Gerritsen ME, Anderson DC, Granger DN. Anti-

inflammatory drugs and endothelial cell adhesion molecule expression in

murine vascular beds. Gut. 1999; 44: 186-195.

Ng V, Koh D, Chia SE. Examination stress, salivary cortisol, and academic

performance. Psychol Rep. 2003; 93: 1133-1134.

Ohira H. Social support and salivary secretory immunoglobulin A response

in women to stress of making a public speech. Percept Most Skills. 2004;

98: 1241-1250.

Paca´k K. and Palkovits M. Stressor specificity of central neuroendocrine

responses: implications for stress-related disorders. Endocr Rev. 2001: 4;

502�548

Phillips AC, Caroll D, Evans P, Clow A, Hucklebridge F, Der G. Stressful life

events are associated with low secretion rates of immunoglobulin A in saliva

in the middle aged and elderly. Brain Behav Immunol. 2006; 20: 191-197.

Shikina T, Hiroi T, Iwatani K, Ho Jang M, Fukuyama S, Tamura M, Kubo T,

Ishikawa H, Kiyono H. IgA Class Switch ocurrs in the Organized

Nasopharynx, and Gut-Associated Lymphoid Tissue, but not in the diffuse

lámina propia of Airways and Gut. J Immunol. 2004; 172: 6259-6264.

Shikina T, Hiroi T, Iwatani K, Ho Jang M, Fukuyama S, Tamura M, Kubo T,

Ishikawa H, Kiyono H. IgA Class Switch ocurrs in the Organized

Nasopharynx, and Gut-Associated Lymphoid Tissue, but not in the diffuse

lámina propia of Airways and Gut. J Immunol. 2004; 172: 6259-6264.

Tristram GP, Stites DP, Terr AI, Imboden JB. Inmunología Básica y clínica.

10a ed. México: Manual moderno; 2001

24

Van Eck M, Berkof H, Nicholson N, Sulon J. The effects of perceived stress,

traits, mood states, and stressful daily events on salivary cortisol.

Psychosom med. 1996; 58: 447-458