resume n

CURSO DE MICROBIOLOGÍA

GENERAL

Cátedra de Microbiología

Facultad de Química

2009 v3

Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 1 de 110

CURSO DE MICROBIOLOGÍA – 2009. GUÍA DE PRÁCTICO PRIMER CICLO Durante el primer ciclo (4 clases) se realizará la identificación primaria de bacterias y hongos a partir de cultivos puros y de muestras de ambiente. OBJETIVOS: Al finalizar el ciclo el estudiante debe ser capaz de: 1) Manejarse de acuerdo a las normas de bioseguridad. 2) Manejar y mantener el microscopio correctamente. 3) Trabajar asépticamente. 4) Preparar frotis y teñirlos por Gram. 5) Reconocer morfologías microscópicas y coloración Gram de bacterias. 6) Reconocer morfologías microscópicas características de hongos uni y pluricelulares. 7) Identificar bacterias (género/familia). 8) Preparar medios de cultivo. 9) Manejar el autoclave. 10) Preparar material para esterilización por calor seco. 11) Uso de Tablas de identificación de bacterias. Al final del ciclo cada subgrupo (4 estudiantes) deberá entregar un informe indicando: Grupo (n° y horario), nombre de los estudiantes Resultados obtenidos: a) Muestra de ambiente: origen de la muestra, medio y condiciones de cultivo, descripción macro y microscópica de las colonias obtenidas. b) Cultivos bacterianos problema: código de la muestra, descripción macro y microscópica de las colonias en el medio selectivo aportado, pruebas bioquímicas realizadas y datos obtenidos de cada una, género y/o Familia a la que pertenece el m.o. identificado.


Clase Trabajo experimental Material a estudiar

1

- Observación macro y microscópica de cultivos puros de bacterias (medios sólidos y líquidos). - Técnica aséptica. Frotis y tinción de Gram. - Siembra de una muestra: superficie, piel, tierra, aire en TSA

- Normas de bioseguridad. - Utilización de microscopio. - Citología y morfología de bacterias - Siembra y aislamiento.

2

a) Muestra sembrada en 1ª clase: - Observación macroscópica de colonias. - Observación microscópica: frotis, tinción de Gram. b) Identificación de bacterias. Cada subgrupo recibirá un m.o. (microorganismo) sembrado en un medio selectivo: - Observación macroscópica de colonias. - Observación microscópica: frotis, tinción de Gram. - Reaislamiento en medio no selectivo (ALRF y TSA). - Elección de pruebas bioquímicas. Con los datos obtenidos de las observaciones macro y microscópicas y usando la tabla, cada subgrupo deberá elegir las pruebas necesarias para la identificación primaria del m.o.

- Siembra y aislamiento: aislamiento por estrías, cultivo puro. - Medios generalidades; Tabla "Características de algunos medios"; - Composición de medios (manuales comerciales): ALRF, Mac Conkey, MSA, TSA, TSB. - Identificación de bacterias: pruebas bioquímicas primarias: oxidasa catalasa, OF, relación con el oxígeno (crecimiento en anaerobiosis), fermentación de glucosa.

3

a) Continuación de la muestra sembrada en 1ª clase. - Observación macro y microscópica. b) Identificación de bacterias: - Verificación del reaislamiento por observación macro y microscópica. - Siembra de pruebas de identificación primaria. c) Observación macro y microscópica de hongos en cultivos puros. d) Preparación de medios (mitad del grupo).

- Identificación de bacterias. - Siembra y aislamiento: preparación de medios de cultivo y esterilización de material de vidrio. - Citología y morfología de hongos.

4

a) Muestra de ambiente: observación macro y microscópica. b) Cultivo bacteriano puro: lectura de pruebas bioquímicas. c) Observación de hongos, continuación. d) Preparación de medios de cultivo, continuación. e) Entrega de informe y discusión de los resultados.


SEGUNDO CICLO Durante el segundo ciclo (7 clases) se hará el análisis microbiológico de una muestra para determinar si cumple con los requisitos exigidos según una norma determinada. OBJETIVOS: Al finalizar el ciclo el estudiante deberá ser capaz de: 1) Realizar el análisis microbiológico de una muestra de acuerdo a una técnica dada. 2) Informar adecuadamente los resultados del análisis microbiológico de una muestra. 3) Calcular las diluciones adecuadas a sembrar para realizar un recuento (en placa, NMP). 4) Manejar tablas de identificación de bacterias. 5) Comprender las bases bioquímicas de las pruebas utilizadas en la identificación. 6) Comprender la función de cada uno de los componentes de un medio de cultivo. 7) Realizar un esquema simplificado de una técnica microbiológica. En la clase 6 del ciclo cada subgrupo deberá entregar el informe final (solo los resultados obtenidos) de la muestra analizada. En la clase 7 se deberá entregar 2 fotocopias del informe del trabajo asignado en clase 5.


Clase Trabajo experimental Observaciones y material a estudiar

1 Análisis microbiológico de una muestra según técnica aportada. Búsqueda de los 4 m.o. correspondientes y recuentos de mesófilos, enterobacterias y hongos

Técnica microbiológica para el análisis de una muestra Muestreo para análisis microbiológico. Recuentos: Introducción gral. y recuento en placa

2 Continuación con el análisis microbiológico. Aislamiento selectivo. Subcultivo a caldos selectivos. Resultado preliminar del recuento de mesófilos y enterobacterias.

Discusión de medios de cultivo empleados: composición y uso (manuales comerciales). Test de esterilidad.

3 Recuento definitivo de mesófilos. Observación de colonias típicas en medios selectivos. Aislamiento de los caldos selectivos de Salmonella. Reaislamiento en medio no selectivo

Informes de los resultados de recuento de mesófilos y enterobacterias Cálculo de diluciones a sembrar para recuentos según diferentes límites.

4 Gram de colonias típicas. Pruebas primarias (catalasa, oxidasa). E. coli: IMViC. Salmonella spp: Reaislamiento de colonias sospechosas en medio no selectivo. Pseudomonas aeruginosa: crecimiento a 42 ºC, pigmentos. S.aureus: catalasa, coagulasa o DNAsa Recuentos: Siembra de agua potable o de playa por NMP. Recuento de heterótrofos en agua potable por filtración.

Recuentos: recuento por NMP. Uso de Tabla NMP. Límites microbiológicos para agua potable y agua de playa. Identificación de bacterias: pruebas bioquímicas. Presentación y discusión de pruebas bioquímicas.

5 Leer recuento preliminar por NMP. Confirmación de coliformes totales y fecales. Siembra pruebas de tamizaje para Salmonella : TSI, LIA Fenilalanina

Discutir Farmacopeas. Ordenanza, normas UNIT, etc. Se entregarán diferentes trabajos de análisis microbiológico para presentar diseño de metodología por escrito en forma de esuema (diluciones, medios, etc).

6 Leer NMP. Leer bioquímicas de Salmonella. Leer resultado de recuento de heterótrofos por filtración y recuento de hongos. Entregar resultados.

Discutir resultados de NMP. Discusión gral sobre el tema de identificación de una cepa bacteriana.

7 Presentación del trabajo de análisis asignado en clase 5 por cada subgrupo.


TÉCNICA GENERAL DE ANÁLSIS MICROBIOLOGICO DE UNA MUESTRA Especificaciones microbiológicas para la muestra Recuento de mesófilos aerobios viables: menos de 1000 UFC/g Recuento de hongos y levaduras: menos de 100 UFC/g Recuento de Enterobacterias: menos de 100 UFC/g Ausencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Salmonella sp en 10 g. Preparar la muestra que se va a analizar mediante un tratamiento apropiado a sus características físicas y que no altere el número y tipo de microorganismos originalmente presentes, a fin de obtener una solución o suspensión adecuada para los procedimientos analíticos que se van a efectuar. Es recomendable partir de una muestra no menor de 10 g (o mL) representativa del lote a analizar y preparar las diluciones en un solvente adecuado (suero fisiológico, tampón fosfato o agua peptonada al 0,1%). 1 RECUENTOS 1 Preparación previa de la muestra 1.1 Pesar asépticamente 10 g de la muestra y disolver o suspender en 90 mL de suero fisiológico. Esta es la dilución 1/10 o 10-1. 1.2 Pipetear 1mL de esta dilución en cada una de tres placas de Petri estériles. Continuar el procedimiento en 2, 3 y 4. 2 Recuentos de mesófilos aerobios viables 2.1 Agregar inmediatamente a una placa 15 a 20 mL TSA (agar tripticasa soja), previamente fundido y termostatizado a 45 ºC. 2.2 Mezclar por rotación y dejar solidificar a temperatura ambiente. 2.3 Incubar a 35 ± 2 ºC durante 48 a 72 h. Examinar para verificar la presencia de colonias. 3 Recuento de Enterobacterias 3.1 Agregar inmediatamente a otra placa aproximadamente 15 mL de VRBGA (violet red bile glucose agar), previamente fundido y termostatizado a 45 ºC. 3.2 Mezclar por rotación y dejar solidificar a temperatura ambiente. Luego cubrir con una sobrecapa del mismo agar de aproximadamente 5 mL. Dejar solidificar. 3.3 Incubar a 35 ± 2 ºC durante no más de 24 h. Examinar para verificar la presencia de colonias típicas (colonias rojas, con diámetro mayor a 1 mm, habitualmente con halo de bilis precipitada). Reaislar un número representativo de colonias típicas (no menos de cinco) a TSA. Confirmar mediante tinción de Gram y el ensayo de oxidasa. 4 Recuento de hongos y levaduras 4.1 Agregar inmediatamente a la placa restante 15 a 20 mL de SDA (agar glucosado de Sabouraud) con cloranfenicol, previamente fundido y termostatizado a 45 ºC. 4.2 Mezclar por rotación cada placa y dejar solidificar a temperatura ambiente. 4.3 Incubar a 25 ± 2 ºC durante 5 a 7 días. Examinar para verificar la presencia de colonias típicas de hongos filamentosos y/o levaduriformes (realizar una coloración simple).


5 - BÚSQUEDAS. 5.1 - Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli 5.1.1 Pesar asépticamente 10 g de la muestra y agregar a 90 mL de medio TSB. Si fuera necesario homogeneizar mediante suave agitación. 5.1.2 Incubar 18 a 24 h a 35 ± 2 ºC. 5.1.3 Realizar el aislamiento a los siguientes medios sólidos en placa: MSA (agar manitol sal) o agar Baird Parker para Staphylococcus aureus, agar cetrimida para Pseudomonas aeruginosa y agar Mac Conkey o EMB-Levine (agar eosina azul de metileno-Levine) para Escherichia coli. (Para la búsqueda de Salmonella continuar el procedimiento en 5.2). 5.1.4 Incubar las placas a 35 ± 2 ºC durante 24 a 48 h y examinar el desarrollo de colonias típicas. 5.1.5 Si no existen colonias típicas en los respectivos medios, la muestra cumple la exigencia de ausencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli en 10 g de muestra. 5.1.6 Si aparecen colonias típicas de Staphylococcus aureus en MSA o agar Baird Parker, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Luego tomar colonias de este medio y hacer la coloración de Gram, el ensayo de catalasa y el ensayo de coagulasa. 5.1.7 Si aparecen colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimida, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar la coloración de Gram, el ensayo de oxidasa y el crecimiento a 42 ± 0,5 ºC en TSB. Si fuese necesario confirmar la producción de pigmento piocianina en agar King A (incubar no menos de 3 días a 35 ± 2 °C o a temperatura ambiente). 5.1.8 Si aparecen colonias típicas de Escherichia coli en agar Mac Conkey o EMB-Levine, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar una coloración de Gram, el test de catalasa, oxidasa y realizar el ensayo de IMViC (indol, rojo de metilo-Voges Proskauer, citrato) Descripción de colonias típicas de Staphylococcus aureus Medio Descripción de colonias típicas

Agar manitol sal Colonias amarillas rodeadas de un halo amarillo

Agar Baird-Parker Colonias negras, brillantes rodeadas de un halo claro Descripción de colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa Medio Descripción de colonias típicas

Agar cetrimida Colonias castaño claro con pigmento verde-azulado que fluoresce al UV y difunde al medio.


Descripción de colonias típicas de Escherichia coli Medio Descripción de colonias típicas

agar Mac Conkey Colonias rojas habitualmente con halo de bilis precipitada

agar EMB (Levine) Colonias negras habitualmente con brillo metálico verdoso bajo luz reflejada

Pruebas para Staphylococcus aureus Coloración de Gram: cocos positivos en racimos Fermentación de manitol: positiva Catalasa: positiva Coagulasa o DNAsa: positiva Pruebas para Pseudomonas aeruginosa Coloración de Gram: bacilos negativos Oxidasa: positiva Catalasa: positiva Crecimiento a 42 ºC: positivo King A: pigmento azulado Pruebas para Escherichia coli Coloración de Gram: bacilos negativos cortos o cocobacilos Oxidasa: negativa Catalasa: positiva OF glucosa: fermentativo Indol: Positivo o negativo Rojo metilo: positivo Voges Proskauer: negativo Citrato: negativo 5.2 - Salmonella spp. 5.2.1 Pipetear 0,1 mL del TSB previamente incubado durante 18 a 24 h a un tubo con 10 mL de caldo Rappaport-Vassiliadis y 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo tetrationato. 5.2.2 Incubar ambos tubos a 35 ± 1 ºC (el caldo Rappaport-Vassiliadis puede incubarse a 41,5 ± 1 ºC) por no más de 24 h. 5.2.3 De ambos tubos realizar aislamiento a XLD (agar xilosa lisina desoxicolato) y a por lo menos uno de los siguientes medios sólidos en placa: VB (agar verde brillante) y SS (agar Salmonella Shigella). 5.2.4 Incubar las placas a 35 ± 2 ºC durante 24 a 48 h y examinar el desarrollo de colonias típicas. 5.2.5 Si no existen colonias típicas, la muestra cumple la exigencia de ausencia de Salmonella spp. Si aparecen colonias típicas en alguno de los medios, realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar luego la coloración de Gram, el ensayo


de oxidasa, catalasa, TSI, lisina de Möeller (o LIA) y ureasa (o fenilalanina). Realizar una identificación mas completa con sistemas de identificación apropiados y confirmar con el uso de antisueros polivalentes de Salmonella. Descripción de colonias típicas de Salmonella spp* Medio Descripción de colonias

Agar xilosa lisina desoxicolato Colonias rojas con o sin centro negro

Agar verde brillante Colonias blancas o rosadas, pequeñas, transparentes, con halo rojizo

Agar Salmonella Shigella Colonias incoloras o castañas con o sin centro negro *algunas cepas de Salmonella fermentadoras de lactosa pueden dar colonias con características diferentes a las descritas Pruebas para Salmonella spp Coloración de Gram: bacilos negativos cortos o cocobacilos Oxidasa: negativa Catalasa: positiva TSI: alcalino/ácido con o sin producción H2S, con o sin gas Ureasa y fenilalanina: negativa Lisina Möeller: positiva. LIA: pico alcalino/fondo alcalino con o sin producción de H2S


35 ºC 24 h

1 mL 0,1 mL

Caldotetrationato

Caldo Rappaport

10 g muestra

+ TSB

Agar XLDAgar VB

35 ºC 24 h

35 ºC 24 h

35 ºC 24 h

41,5 ºC 24 h

PRE-ENRIQUECIMIENTO

ENRIQUECIMIENTOSELECTIVO

AISLAMIENTOSELECTIVO

IDENTIFICACION

Colonias no típicas

AUSENCIA de Salmonella sp en

10 g

Colonias típicas

Confirmación con pruebas bioquímicas y

serológicas

Reaislamiento de varias colonias

ESQUEMA DE BUSQUEDA DE SALMONELLA


RECUENTO DE HETEROTRÓFICOS POR EL MÉTODO DE MEMBRANA FILTRANTE 1 - Definiciones 1.1 Bacterias heterotróficas. Se considera a las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, mesófilas y psicrotróficas, capaces de crecer en un medio de agar nutritivo. 1.2 Filtro de membrana. Es un elemento de filtración, delgado, no fibroso, para líquidos y gases, de acetato o nitrato de celulosa que tiene un tamaño de poro medio de 0,45 micras de diámetro, en donde las partículas de mayor tamaño que el del poro son retenidas sobre la superficie cuando se aplica succión o presión. No debe contener sustancias inhibitorios del crecimiento bacteriano. 2 - Procedimiento 2.1 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar. 2.2 Pipetear 1 mL de la muestra y diluir en 9,0 mL de suero fisiológico (SF) u otro diluyente apropiado (dilución 1/10 o 10-1). 2.3 Pipetear 1 mL de la dilución resultante en un frasco con 10 a 50 mL de suero fisiológico, de manera de mojar toda la superficie de la membrana. 2.4 Filtrar el total del volumen resultante (correspondiente a 0,1 mL de la muestra original) por embudo de filtración equipado con filtro de membrana estéril bajo vacío parcial. 2.5 Enjuagar el embudo con tres porciones de 50 mL de suero fisiológico. 2.6 Colocar la membrana cuidadosamente sobre el medio sólido en placa de Petri (PCA o TSA), evitando la formación de burbujas. 2.7 Incubar a 35 ± 2 ºC por 48 h. 2.8 Contar las colonias en los filtros de membrana. La densidad óptima de colonias por filtro es entre 20 y 200.


RECUENTO DE COLIFORMES FECALES EN AGUA DE PLAYA POR NMP. 1 - Ensayo presuntivo de coliformes totales 1.1 Colocar en una gradilla nueve tubos con medio caldo lauril triptosa (CLT) simple concentración con campana de Durham, para hacer la serie (3-3-3). 1.2 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar. 1.3 Pipetear 1 mL de la muestra y diluir en 9,0 mL de suero fisiológico (SF) u otro diluyente apropiado (dilución 1/10 o 10-1). 1.4 Con una pipeta de 1 ó 2 mL sembrar 1 mL de la muestra en cada uno de tres tubos con medio de simple concentración (primera serie), 0,1 mL de la muestra (o 1 mL de la dilución 1/10) en otros tres tubos (segunda serie) y 0,1 mL de la dilución 1/10 (equivalente a 0,01 mL de la muestra) en otros tres tubos (tercer serie). Rotular adecuadamente los tubos con la dilución sembrada 1.5 Mezclar la muestra con el medio mediante agitación suave. 1.6 Incubar los tubos a 35 ± 0,5 ºC. Luego de 24 ± 2 h agitar los tubos suavemente y observar. 1.7 Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida debido al crecimiento bacteriano y gas en la campana. 1.8 Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24 h. 2 - Ensayo de coliformes fecales 2.1 Subcultivar con un ansa de cada tubo positivo presuntivo de coliformes totales a un tubo con caldo EC con campana de Durham. Rotular adecuadamente los tubos de caldo EC. 2.2 Incubar en baño de agua a 44,5 ± 0,2 ºC por 24 ± 2 h. 2.3 Considerar tubos positivos a los que presentan crecimiento y producción de gas a las 24 h. 2.4 Calcular el valor de NMP de coliformes fecales a partir del número de tubos positivos del medio EC. RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGUA POTABLE POR NMP. 1 - Ensayo presuntivo de coliformes totales 1.1 Colocar en una gradilla tres tubos con medio CLT doble concentración, y seis tubos con medio CLT simple concentración, para hacer la serie (3-3-3). Todos los tubos deben tener campana de Durham. 1.2 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar. 1.3 Con una pipeta de 10 mL estéril sembrar 10 mL de la muestra en cada uno de los tres tubos con medio de doble concentración. 1.4 Con una pipeta de 1 ó 2 mL sembrar 1 mL de la muestra en tres tubos con medio de simple concentración y 0,1 mL de la muestra en los otros tres tubos. Rotular adecuadamente los tubos. 1.5 Mezclar la muestra con el medio mediante agitación suave. 1.6 Incubar los tubos a 35 ± 0,5 ºC. Luego de 24 ± 2 h agitar los tubos suavemente y observar.


1.7 Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida debido al crecimiento bacteriano y gas en la campana. 1.8 Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24 h. 2 - Ensayo confirmativo de coliformes totales 2.1 Someter a la prueba confirmativa todos los tubos que a las 24 ó 48 h presenten reacción positiva presuntiva. Si esta reacción positiva aparece a las 24 h, es conveniente pasar a la confirmación sin dejar transcurrir las 48 h. 2.2 Agitar suavemente los tubos. 2.3 Subcultivar por medio de un ansa de cada tubo con resultado positivo presuntivo a un tubo con medio caldo lactosa bilis verde brillante (CLBVB) con campana de Durham. Rotular todos los tubos adecuadamente. 2.4 Incubar los tubos de CLBVB por 48 ± 3 h a 35 ± 0,5 ºC. 2.5 La producción de gas constituye un resultado positivo confirmado. 2.6 Calcular el valor de NMP de coliformes totales confirmados a partir del número de tubos positivos del medio CLBVB. 3 - Ensayo de coliformes fecales 3.1 Subcultivar con un ansa de cada tubo positivo presuntivo de coliformes totales a un tubo con caldo EC con campana de Durham. Rotular adecuadamente los tubos de caldo EC. 3.2 Incubar en baño de agua a 44,5 ± 0,2 ºC por 24 ± 2 h. 3.3 Considerar tubos positivos a los que presentan producción de gas a las 24 h. 3.4 Calcular el valor de NMP de coliformes fecales a partir del número de tubos positivos del medio EC.


COMPOSICIÓN DE MEDIOS A EMPLEAR SUERO FISIOLÓGICO Cloruro de sodio 8,5 g Agua 1L TSA (agar tripticasa soja) Digerido Pancreático de Caseína 15,0 g Digerido Papaínico de Harina de Soja 5,0 g Cloruro de Sodio 5,0 g Agar 15,0 g Agua 1 L TSB (caldo tripticasa soja) Digerido Pancreático de Caseína 17,0 g Digerido Papaínico de Harina de Soja 3,0 g Cloruro de Sodio 5,0 g Fosfato Dibásico de Potasio 2,5 g Glucosa 2,5 g Agua 1 L SDA (agar Sabouraud glucosado) Glucosa 40 g Digerido péptico de tejido animal 5 g Digerido pancreático de caseína 5 g Agar 15 g Agua 1 L Agregar antes de esterilizar 50 mg de cloranfenicol por litro de medio pH después de la esterilización: 5,6 ± 0,2. ALRF (Agar Rojo Fenol Base + lactosa) Digerido pancreático de caseína 10 g Cloruro de Sodio 5,0 g Agar 15 g Rojo Fenol 0,018 g Lactosa 10 g Agua 1 L pH final: 7,4 ± 0,2 VRBGA (violet red bile glucose agar) Peptona 7,0 g Extracto levadura 3,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Sales biliares 1,5 g Glucosa 10,0 g Rojo neutro 0,03 g Cristal violeta 2 mg Agar 15,0 g Agua 1 L


AGAR BAIRD PARKER Digerido Pancreático de Caseína 10,0 g Extracto de Carne Vacuna 5,0 g Extracto de Levadura 1,0 g Cloruro de Litio 5,0 g Agar 20,0 g Glicina 12,0 g Piruvato de Sodio 10,0 g Agua 1 L Esterilizar y dejar enfriar a una temperatura entre 45° y 50 °C. Agregar 10 mL de solución estéril de telurito de potasio (1 en 100) y 50 mL de emulsión de yema de huevo. Mezclar MSA (agar manitol sal) Digerido Pancreático de Caseína 5,0 g Digerido Péptico de Tejido Animal 5,0 g Extracto de Carne Vacuna 1,0 g D-Manitol 10,0 g Rojo de Fenol 25 mg Cloruro de Sodio 75,0 g Agar 15,0 g Agua 1 L AGAR CETRIMIDA Digerido Pancreático de Gelatina 20,0 g Cloruro de Magnesio 1,4 g Sulfato de Potasio 10,0 g Bromuro de Cetiltrimetilamonio (Cetrimida) 0,3 g Glicerina 10 mL Agar 13,6 g Agua 1L EMB LEVINE (agar eosina azul de metileno Levine) Digerido Pancreático de Gelatina 10,0 g Fosfato Dibásico de Potasio 2,0 g Lactosa 10,0 g Eosina Y 400 mg Azul de Metileno 65 mg Agar 15,0 g Agua 1 L AGAR MAC CONKEY Digerido Pancreático de Gelatina 17,0 g Digerido Pancreático de Caseína 1,5 g Digerido Péptico de Tejido Animal 1,5 g Lactosa 10,0 g Rojo Neutro 30 mg Mezcla de Sales Biliares 1,5 g Cloruro de Sodio 5,0 g Cristal Violeta 1,0 mg Agar 13,5 g Agua 1 L


CALDO RAPPAPORT-VASSILIADIS Peptona de soja 4,5 g Cloruro de magnesio hexahidratado 29,0 g Cloruro de sodio 8,0 g Fosfato dibásico de potasio 0,4 g Fosfato monobásico de potasio 0,6 g Verde de malaquita 0,036 g Agua 1 L CALDO TETRATIONATO Digerido Pancreático de Caseína 2,5 g Digerido Péptico de Tejido Animal 2,5 g Sales Biliares 1,0 g Carbonato de Calcio 10,0 g Tiosulfato de Sodio 30,0 g Agua 1 L Calentar la solución de los sólidos a ebullición. En el día de su utilización, agregar una solución de 5 g de yoduro de potasio y 6 g de yodo en 20 mL de agua. A continuación, agregar 10 mL de una solución de verde brillante (1 en 1000) y mezclar. No se debe calentar el medio después de agregar la solución de verde brillante. AGAR XLD (agar xilosa lisina desoxicolato) L-Lisina 5,0 g Xilosa 3,5 g Lactosa 7,5 g Sacarosa 7,5 g Rojo de Fenol 80 mg Cloruro de Sodio 5,0 g Extracto de Levadura 3,0 g Desoxicolato de Sodio 2,5 g Tiosulfato de Sodio 6,8 g Citrato Férrico Amónico 800 mg Agar 13,5 g Agua 1 L pH final: 7,6 ± 0,2 AGAR SALMONELLA SHIGELLA Extracto de carne 5,0 g Peptona 5,0 g Lactosa 10,0 g Sales biliares 8,5 g Citrato de sodio 8,5 g Tiosulfato de sodio 8,5 g Citrato férrico 1,0 g Verde brillante 0,33 mg Rojo neutro 25 mg Agar 13,5 g Agua 1 L


AGAR VERDE BRILLANTE Extracto de Levadura 3,0 g Digerido Péptico de Tejido Animal 5,0 g Digerido Pancre tico de Caseína 5,0 g Lactosa 10,0 g Cloruro de Sodio 5,0 g Sacarosa 10,0 g Rojo de Fenol 80 mg Agar 20 g Verde Brillante 12,5 mg Agua 1 L CLT (caldo lauril sulfato triptosa) Triptosa 20,0 g Lactosa 5,0 g Fosfato dipotásico 2,75 g Fosfato monopotásico 2,75 g Cloruro de sodio 5,0 g Lauril sulfato de sodio 0,1 g Agua 1 L CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante) Peptona 10,0 g Bilis vacuna 20,0 g Lactosa 10,0 g Verde brillante 13,3 mg Agua 1 L Caldo EC Triptosa 20,0 g Lactosa 5,0 g Fosfato dipotásico 4,0 g Fosfato monopotásico 1,5 g Cloruro de sodio 5,0 g Sales biliares 1,5 g Agua 1 L PCA (agar para recuento en placa) Triptona 5,0 g Extracto de levadura 2,5 g Glucosa 1,0 g Agar 15,0 g


TERCER CICLO Durante el tercer ciclo (2 clases) se hará el estudio de agentes físicos, químicos y biológicos sobre los m.o. OBJETIVOS: Al finalizar el ciclo el estudiante debe ser capaz de: 1) Diseñar un ensayo para evaluar la acción de un agente antimicrobiano 2) Comprender el uso de la escala de Mac Farland 3) Calcular el tiempo de reducción decimal de un agente antimicrobiano 4) Calcular la CIM de un antibiótico para una cepa dada Clase Trabajo experimental Material a estudiar

1 Curva de muerte de E. coli a 63 °C. Cálculo de D. Evaluación de desinfectantes. Ensayo de difusión de antibióticos y extractos. Calcular la CIM para un antibiótico y una cepa dadas

Recuentos: determinación de la masa celular, turbidimetría, escala de Mac Farland. Control del crecimiento microbiano. Agentes físicos, químicos y biológicos

2 Lectura y discusión de resultados

ESTUDIO DE AGENTES Se evaluará el calor como agente físico frente a una cepa de E. coli. Se realizará el cálculo del tiempo de reducción decimal en suero fisiológico a 63 °C. Se evaluará la acción del hipoclorito (250 ppm u otras) con y sin sustancias interferentes y del etanol 70% sobre una cepa de Staphylococcus aureus, según la norma europea (modificada) EN 1276:1997: “Antisépticos y desinfectantes químicos. Ensayo cuantitativo de suspensión para la evaluación de la actividad bactericida de los antisépticos y desinfectantes químicos utilizados en productos alimenticios, en la industria, en el hogar y en colectividad. Método de ensayo y requisitos (fase 2, etapa 1)”. Según esta norma, un desinfectante debe ser capaz de reducir por lo menos en 5 órdenes la carga microbiana inicial, luego de 5 minutos de contacto a 20 ºC. Para realizar el recuento después del contacto con el agente, es necesario eliminar todo efecto inhibidor del agente, ya que su presencia puede falsear el resultado. Para ello se pueden usar diferentes métodos: dilución, neutralización o filtración. Para el caso del hipoclorito se usará tiosulfato de sodio al 10% como neutralizante, para el caso del etanol se utilizará filtración por membrana para eliminar el agente.


1 Agentes Físicos: calor 1.1 Preparar una suspensión de Escherichia coli (ATCC 25922) en suero fisiológico, equivalente al tubo Mac Farland N°4, a partir de un cultivo en tubo inclinado en TSA. 1.2 Homogeneizar bien la suspensión en vortex. 1.3 Sacar una alícuota y realizar las diluciones necesarias en suero fisiológico. 1.4 Realizar el recuento en superficie en placas de TSA secas sembrando tres diluciones sucesivas. Extender con rastrillo estéril y dejar adsorber unos 15 min. 1.5 Incubar durante 24 h a 35 ± 2 ºC. 1.6 Colocar el resto de la suspensión en baño de agua a 63 °C. y comenzar a registrar el tiempo transcurrido. 1.7 Extraer a distintos tiempos alícuotas de 1,5 mL a un tubo vacío estéril y enfriar inmediatamente en baño de hielo. 1.8 Realizar el recuento de viables de las alícuotas extraídas a los distintos tiempos sembrando las diluciones necesarias en superficie en placas de TSA. Extender con rastrillo estéril y dejar adsorber unos 15 min. 1.9 Incubar durante 24 h a 35 ± 2 ºC. 2.0 Construir tabla de Nº de m.o. sobrevivientes en función del tiempo y la correspondiente gráfica de log Nº de sobrevivientes en función del tiempo. 2.1 Calcular el valor D. Nota: sabiendo que el tiempo D a 63 ºC en TSB para E. coli ATCC 25922 es de 0,7 minutos, determinar los tiempos y las diluciones necesarias para construir la curva de muerte para el mismo m.o. en suero fisiológico. 2 Evaluación de Desinfectantes 2.1 Hipoclorito de sodio 2.1.1 Preparar una suspensión de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en suero fisiológico, equivalente al tubo Mac Farland N°4, a partir de un cultivo en tubo inclinado de TSA. 2.1.2 Homogeneizar bien en vortex. 2.1.3 Tomar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico y agregar a 9,0 mL de agua destilada estéril. Esta suspensión es Ni. Realizar luego las diluciones necesarias en SF para obtener el recuento en placa en TSA (incorporado). El recuento de esta suspensión Ni representa el valor a tiempo cero. 2.1.4 Agregar 1,0 mL de agua destilada a un tubo con 8,0 mL de solución de hipoclorito de sodio 250 ppm. Luego agregar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico. 2.1.5 Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 °C (ambiente) durante 5 minutos. Esta suspensión es Nf. 2.1.6 Tomar luego 1 mL de esta suspensión y agregar a un tubo conteniendo 9 mL de solución de neutralizante. 2.1.7 Dejar durante 10 minutos, homogeneizar y sembrar 1 mL de esta suspensión en una placa de Petri estéril. 2.1.8 Agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 ºC. 2.1.8 Comparar el resultado del recuento obtenido para Ni y Nf (luego del contacto durante 5 minutos con el agente).


2.2 Hipoclorito de sodio con sustancias interferentes 2.2.1 Agregar 1,0 mL de sustancia interferente (p. ej. leche descremada diluida) a un tubo con 8,0 mL de solución de hipoclorito de sodio 250 ppm (u otra concentración elegida). Homogeneizar bien. 2.2.2 Agregar 1 mL de la suspensión de S. aureus preparada en 2.1.2 en suero fisiológico. Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 °C (ambiente) durante 5 minutos. 2.2.3 Tomar luego 1 mL de esta suspensión y agregar a un tubo conteniendo 9 mL de solución de neutralizante. 2.2.4 Dejar durante 10 minutos, homogeneizar y sembrar 1 mL de esta suspensión en una placa de Petri estéril. 2.2.5 Agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 ºC. 2.2.6 Comparar el resultado del recuento obtenido para el Ni tiempo cero (2.1.3) y Nf, luego de 5 minutos con el agente y la sustancia interferente.

Calcular el efecto de reducción decimal o efecto germicida EG: Log Ni – Log Nf donde Ni es el resultado del recuento obtenido para el Ni a tiempo cero (1/10 del valor de la suspensión McFarland Nº4) y Nf es el resultado del recuento obtenido en la suspensión luego del contacto con el agente (calcular el recuento en contacto con el agente corrigiendo según las diluciones sembradas).

ESQUEMA PARA HIPOCLORITO DE

SODIO

9 mL neutralizante

Susp Mac Farland N°4

8 mL desinf + 1 mL agua (o sust.

interf.) 9 mL de agua

destilada

Ni t=0Ensayo

5 min.

1 mL 1 mL

1 mL

1 mL

Recuento en placa TSA Recuento en

placa TSA

1 mL5 min.

1 mL

1

Diluciones en SF

Recuento en placa TSA

1 mL

Nf t=5 min


2.3 Etanol 2.3.1 Preparar una suspensión de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en suero fisiológico, equivalente al tubo Mac Farland N°4, a partir de un cultivo en tubo inclinado de TSA. 2.3.2 Homogeneizar bien en vortex. 2.3.3 Tomar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico y agregar a 9,0 mL de agua destilada estéril. Esta suspensión es Ni. Realizar luego las diluciones necesarias en SF para obtener el recuento en placa en TSA (incorporado). El recuento de esta suspensión Ni representa el valor a tiempo cero. 2.3.4 Agregar 1,0 mL de agua destilada a un tubo con 8,0 mL de solución de etanol al 70% (u otra concentración). Luego agregar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico. 2.3.5 Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 °C (ambiente) durante 5 minutos. Esta suspensión es Nf. 2.3.6 Tomar inmediatamente 1 mL de esta suspensión y agregar a 50 mL de suero fisiológico 2.3.7 Homogeneizar y filtrar 5 mL mediante embudo con membrana aplicando vacío. 2.3.8 Enjuagar la membrana con dos porciones de 50 mL de suero fisiológico 2.3.9 Colocar la membrana sobre placa de TSA. 2.3.10 Incubar a 35 ± 2 ºC por 48 h. 2.3.11 Comparar el resultado del recuento obtenido para el Ni tiempo cero (2.3.3) y Nf, luego de 5 minutos en contacto con el agente.

Calcular el efecto de reducción decimal o efecto germicida EG: Log Ni – Log Nf

ESQUEMA PARA ETANOL

50 mL SF

Susp Mac Farland N°4

9 mL etanol 9 mL de agua destilada

Ni t=0Ensayo

5 min.

1 mL

1 mL

Recuento en placa TSA Recuento en

placa TSA

1 mL5 min. 1 mL

FILTRAR Y ENJUAGAR

Diluciones en SF

Recuento en placa TSA

1 mL

1 mL

Nf t=5 min

5 mL


Controles A) Efecto bactericida del neutralizante Tomar 1 mL de la suspensión Ni (preparada en 2.1.3) de S. aureus y agregar a 9,0 mL de solución neutralizante. Dejar 10 minutos a temperatura ambiente. Realizar el recuento de esta suspensión en TSA incorporado (realizar las diluciones adecuadas en SF). Verificar que la solución neutralizante no ejerce efecto bactericida sobre la cepa ensayada. B) Validación de la neutralización Tomar 1 mL de agente desinfectante y agregar a 9 mL de solución neutralizante, mezclar bien. Tomar luego 0,1 mL de una dilución de la suspensión S. aureus (preparada en 2.1.1) de concentración conocida (que contenga alrededor de 1000 células en el volumen a agregar) a esta solución. Dejar 10 minutos a temperatura ambiente. Sembrar 1 mL de esta suspensión en una placa de Petri estéril y agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 ºC. Comparar el resultado obtenido con el recuento de la suspensión conocida de S. aureus de alrededor de 1000 células. Verificar que el neutralizante es efectivo para neutralizar el antiséptico a la concentración ensayada. 3 Evaluación de agentes biológicos 3.1 Ensayos de difusión. 3.1.1 Prepara una suspensión del m.o. ajustada al 0.5 de la escala de Mc Farland. 3.1.2 Hisopar la superficie de dos placas de agar Mueller Hinton. 3.1.3 Colocar cuidadosamente sobre la superficie de una placa -a una distancia de 1,5 mm entre sí y del borde de la placa- discos de antibióticos de concentración conocida. 3.1.4 Colocar sobre la superficie de la otra placa 4 cilindros de metal. Cargar los cilindros con 100 μL de las soluciones de antibióticos y extractos. 3.1.4 Incubar a 35 °C durante 18 a 20 h. 3.1.5 Leer los halos de inhibición. 3.2 Ensayo de dilución en medio líquido. Determinación de la concentración inhibitoria mínima. 3.2.1 Preparar una suspensión del m.o. en un tubo conteniendo 4.5 mL de caldo Mueller Hinton, a partir de un cultivo de 18 h y ajustar la turbidez a 0,5 de Mac Farland. 3.2.2 Realizar dos diluciones seriadas de 1: 10 en caldo Mueller Hinton (para alcanzar una concentración de 1 x 106 ufc/mL) (Inóculo). 3.2.3 Transferir 1 mL de la suspensión bacteriana de 1x106 ufc/mL a cada uno de los tubos conteniendo 1mL de dilución del antibiótico y al tubo control. Rotular los tubos con la concentración final de antibiótico. 3.2.4 Incubar los tubos inoculados conteniendo las diferentes concentraciones de antibiótico y el tubo control de crecimiento a 35 ºC, durante 16-20 h. 3.2.5 Determinar la C.I.M.


NORMAS BÁSICAS DE SEGURIDAD EN UN LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA

1. Esta prohibido, comer, beber, fumar, tomar mate, almacenar alimentos, aplicarse cosméticos y

cambiarse lentes de contacto en el área de trabajo. Los lentes de contacto solo se deben utilizar

cuando no se puedan usar otro tipo de lentes.

2. Está prohibido pipetear con la boca.

3. Se debe lavar las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y cada vez que se sospeche

contacto con material contaminado.

4. Se debe trabajar de manera tal de minimizar la creación de aerosoles.

5. Se debe usar túnica y esta debe estar abrochada.

6. El pelo largo se debe usar atado.

7. Cuando sea necesario se debe usar lentes de seguridad para proteger la cara de salpicaduras,

sustancias corrosivas, luz UV y otras radiaciones.

8. El laboratorio se debe mantener ordenado y limpio. Se debe minimizar el material que no sea

pertinente al trabajo en las mesadas.

9. Todo material contaminado se debe descontaminar antes de desechar.

10. Las superficies de trabajo se deben limpiar y descontaminar con desinfectantes adecuados al

final del trabajo y en caso de haberse volcado material contaminado.

11. Todos los accidentes o vuelcos de material deben ser comunicados al docente encargado de

grupo.


UTILIZACIÓN DEL MICROSCOPIO

1. Colocar una preparación.

2. Abrir el diafragma de la fuente de luz al máximo.

3. Abrir el diafragma del condensador al máximo y llevar el condensador al máximo de su

trayectoria.

4. Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x.

5. Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad confortable.

6. Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar y ajustar el foco de cada ocular si el

microscopio lo permite.

7. Enfocar la preparación.

8. Gradualmente cerrar el diafragma de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal.

9. Bajar el condensador hasta que los bordes del polígono se vean nítidos.

10. Ajustar el enfoque.

11. Si la imagen poligonal no está en el centro, centrarla utilizando los tornillos del condensador.

12. Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la poligonal apenas salga del campo, no tocarlo

más. No tocar más la altura del condensador.

13. Elegir el contraste óptimo ajustando el diafragma del condensador.

14. Verificar la iluminación quitando los oculares y mirando por el tubo hacia los objetivos ajustar el

diafragma a 2/3 abierto (2/3 del campo iluminado).

15. Para cambiar el contraste regular el diafragma del condensador y para ajustar el brillo modificar

la intensidad de la fuente luminosa o colocar filtros. No cambiar la distancia del condensador.

Al cambiar de objetivo solo modificar el diafragma de la fuente de luz y el diafragma del

condensador a la apertura del objetivo.

MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO DIARIO (cada vez que se usa) Limpiar el aceite de inmersión de lentes y otras superficies del microscopio con papel tissue. El aceite de inmersión debe conservarse cerrado. Apagar la fuente de luz del microscopio Cubrir el microscopio con su funda.


CITOLOGÍA Y MORFOLOGÍA DE BACTERIAS

Las bacterias, junto con los protozoarios, algas microscópicas, hongos microscópicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos (m.o.). El término microorganismo no tiene un significado taxonómico preciso sino que agrupa a todos los organismos de dimensiones microscópicas (< 0,1 mm) aunque presenten grandes diferencias entre sí. Por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariotas (hongos, protozoarios, algas) y virus. También difieren notablemente en el tamaño aunque sean todos microscópicos. En una escala comparativa tenemos: Protozoarios > levaduras > bacterias > virus Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales presentan una de las tres formas generales siguientes:

• elipsoidal o esférica • cilíndrica o en forma de bastón • espiral o helicoidal

Las bacterias esféricas o elipsoidales se denominan COCOS. Muchas bacterias con esta forma presentan modelos de agrupación que derivan de los diversos planos de división celular. Así tenemos: cocos en pares (diplococos), ej. Neisseria cocos en cadena, ej. Streptococcus cocos en racimo, ej. Staphylococcus cocos en tétradas, ej. Pediococcus cocos en cubos, ej. Sarcina cocos sin distribución especial Las células bacterianas cilíndricas se denominan BACILOS o BASTONES (rod en inglés) y presentan otros modelos de agrupación. Así tenemos:

• bastones en cadena, ej. Bacillus • bastones en letras chinas o empalizadas, ej. Corynebacterium • bastones sin distribución especial

Las bacterias helicoidales se presentan en general como células individuales independientes; pero las células de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, número y amplitud de las espiras y rigidez de la pared. OBSERVACIÓN Y EXAMEN MICROSCÓPICO La observación y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras fundamentales:

• observando los microorganismos vivos sin teñir • observando las células fijadas, teñidas con colorantes

Las bacterias vivas en suspensión acuosa tienen propiedades ópticas similares a las del agua y, por lo tanto, son difíciles de observar con el microscopio de campo claro debido a la falta de contraste con el medio que las rodea. Este contraste aumenta cuando se las tiñen con un colorante adecuado. Sin embargo, para muchos fines es preferible evitar la coloración debido a que puede alterar la forma y además mata a las células. Si se quiere observar los m.o. vivos es conveniente usar un microscopio de campo de contraste de fases o en su defecto un microscopio de campo claro con iluminación mínima. Ésta se logra bajando el condensador, minimizando la iluminación.


El movimiento de traslación de algunas bacterias puede observarse en preparaciones húmedas del material, es decir con los m.o. vivos. Debe distinguirse claramente el movimiento independiente de las bacterias móviles del movimiento por arrastre por corrientes de convección y el movimiento browniano. Cuando el movimiento se realice por propulsión flagelar, el tipo de movimiento variará con la disposición de los flagelos en el cuerpo celular. La coloración de las bacterias tiene como fines:

• poder visualizarlas para determinar morfología y tamaño. • diferenciar grupos bacterianos por su reacción frente a determinados colorantes. • revelar la presencia de distintas estructuras internas.

Los colorantes utilizados son sales en las que el anión o el catión es el responsable del color; en el primer caso se trata de un colorante ácido o aniónico y en el segundo, básico o catiónico. Cuando el medio externo tiene un pH cercano a la neutralidad la célula bacteriana tiene una débil carga negativa. Como la diferencia de carga eléctrica es lo que determina la afinidad entre el colorante y la célula, las bacterias tendrán afinidad por los colorantes básicos (ej.: cristal violeta y azul de metileno). Cuando se utiliza un solo colorante básico, el método se denomina coloración simple, mientras que cuando se usan dos o más se llama coloración compuesta. La coloración diferencial es un caso particular de coloración compuesta. Cuando a una preparación bacteriana se le aplica un colorante ácido tal como eosina, éste no se une a las células cargadas negativamente, pero si se deposita alrededor de ellas, quedando así un fondo coloreado donde contrastan las células incoloras. No es, por lo tanto, una verdadera tinción y se denomina tinción negativa o indirecta. En algunas ocasiones es necesario utilizar un mordiente, es decir, alguna sustancia que contribuya a la fijación del colorante a la célula, por ejemplo: ácido tánico, sales de Al, Fe, etc. PREPARACIÓN DE UN FROTIS Comprende las siguientes etapas:

1) extendido del material en un portaobjetos 2) secado 3) fijación

El propósito de la fijación es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula y adherir la preparación al portaobjetos. Sin el proceso previo de fijación se lavaría la capa de células durante el proceso de tinción. El agente fijador ideal preserva las estructuras de la célula con su forma y posición sin que aparezcan estructuras que no existían en la célula original. El calor es en general el método de fijación mas utilizado para la observación de la morfología de células bacterianas. Cuando además de los microorganismos interesa la observación de células animales, se utiliza un método químico como la fijación por metanol y por formol, que altera menos que el calor la morfología de las células. Coloración simple Consiste en la aplicación de un colorante luego de fijada la preparación. Pueden emplearse los siguientes colorantes básicos: azul de metileno, cristal violeta o fucsina fenicada. Estos presentan diferente afinidad por las bacterias y por ello los tiempos de aplicación serán distintos. Coloración de Gram Los m.o. difieren física y químicamente entre sí y por eso reaccionan de una manera diferente frente a un determinado proceso de tinción. Esto constituye el fundamento de las tinciones diferenciales. La tinción de Gram, la más empleada en bacteriología, es una coloración diferencial. Por este método se clasifican las bacterias en dos grupos: Gram positivos (Gram +) y Gram negativos (Gram –), en función de su reacción frente a la coloración.


Las células previamente fijadas se tiñen con solución de cristal violeta, se lavan y se tratan con lugol. El yodo del lugol forma un complejo con el cristal violeta que sirve para fijar éste a la célula. Luego se agrega un agente decolorante (alcohol, acetona o mezclas de ambos) en el cual el complejo yodo-cristal violeta es soluble. Algunos microorganismos son decolorados (los Gram –) mientras que otros no (los Gram +). Luego de la decoloración se aplica un colorante de contraste, generalmente safranina, que hace visibles las bacterias Gram – que habían sido decoloradas. Las bacterias Gram + se ven de color azul-violeta y las Gram – se ven rosadas. Las bacterias Gram + poseen paredes gruesas de peptidoglicano, que cuando se deshidratan por el alcohol provoca que se cierren los poros de la pared, impidiendo que el complejo yodo-cristal violeta se escape. En las bacterias Gram –, la fina capa de peptidoglicano no evita el pasaje del solvente y el escape del complejo yodo-cristal violeta de la célula. Las levaduras, que poseen una pared celular gruesa pero de una composición química totalmente diferente, generalmente se tiñen como Gram +. En este caso no son los constituyentes químicos, sino la estructura física de la pared lo que le confiere su coloración como Gram +. Coloración de ácido resistentes La tinción de ácido-resistentes es una tinción diferencial que demuestra la resistencia de la célula a ser decolorada por los álcalis, ácidos y alcohol. En algunos microorganismos de los géneros Mycobacterium y Actinomyces la propiedad ácido resistente está relacionada con su alto contenido en lípidos. Coloración de estructuras Esporas Ciertas especies bacterianas, en particular de los géneros Bacillus y Clostridium, producen elementos de resistencia denominados esporas o endoesporas debido a que se forman dentro de la célula, a razón de una por célula. A diferencia de la célula vegetativa que la produce, la espora es muy resistente a condiciones adversas tales como alta temperatura, baja humedad, radiaciones y agentes químicos. Es una forma de vida latente que puede permanecer largos períodos como tal y cuando desaparecen las condiciones adversas puede germinar. También puede inducirse esa germinación mediante, por ejemplo, un shock térmico, es decir un calentamiento a 80ºC. Las esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las técnicas de coloración comunes aparecerán como regiones sin teñir dentro de las células coloreadas. Por lo tanto, para teñir las esporas específicamente, deben usarse métodos de coloración especiales. Los datos importantes que se obtienen como resultado de esta coloración son:

• presencia o ausencia de esporas • deformación o no del cuerpo celular • posición dentro del cuerpo celular

En base a la posición de la espora dentro de la célula se las clasifica en: terminales, centrales y subterminales (posición intermedia). Flagelos Muchas bacterias son móviles y su capacidad para moverse en forma independiente se debe generalmente a la presencia de estructuras especiales, los flagelos. Son apéndices largos, delgados, de forma helicoidal, libres en un extremo y unidos a la célula por otro. Son tan delgados que solo se pueden ver al microscopio común luego de una coloración especial que hace uso de un mordiente. Este promueve la fijación de las moléculas de colorante al flagelo dando lugar a la formación de un precipitado a lo largo del flagelo, haciéndolo visible. La célula bacteriana puede tener uno o más flagelos dispuestos en distinta manera y en base a eso se clasifican en: polar (flagelo en un extremo del cuerpo celular), anfitrica (flagelos en ambos


extremos), lofotrica (penacho de flagelos en un extremo) y peritrica (flagelos alrededor de toda la célula sin distribución). Cápsula Ciertas bacterias segregan en su superficie materiales gomosos compuestos por polisacáridos, polipéptidos o complejos glucoproteicos. Cuando este material se dispone de una manera compacta alrededor de la superficie celular se denomina cápsula. La mejor forma de observarla es con tinción negativa, aunque existen técnicas especiales, para la coloración específica de la cápsula.


TÉCNICAS

MANIPULACIÓN ASÉPTICA DE CULTIVOS

• Tomar el tubo de cultivo con la mano izquierda, de modo que el fondo del tubo toque la palma de la mano y probar (con la mano derecha) que el tapón esté libre, girándolo sin destapar.

• Tomar el ansa con la mano derecha, con los dedos pulgar, índice y mayor, dejando libres el anular y el meñique. Quemar el ansa introduciendo la punta en el cono frío de la llama del mechero, en posición vertical y luego ir levantándola hasta que quede toda al rojo.

• Pasar el ansa por la llama en un ángulo de 60º con la vertical, manteniéndola siempre en posición paralela al cuerpo.

• Flamear el metal adyacente al ansa. • Trabajando cerca del mechero, tomar el tapón de algodón del tubo con los dedos anular y

meñique de la mano derecha y quitarlo girando el tubo; flamear la boca del tubo. • Introducir el ansa tocando la pared fría dentro del tubo (sin soltar el tapón de algodón) para

que se enfríe el ansa y luego introducirla en el cultivo líquido o deslizarla sobre la superficie del cultivo sólido de abajo hacia arriba, para tomar las células a transferir (inóculo).

• Sacar el ansa así cargada del tubo, flamear la boca del tubo y taparlo. Transferir el inóculo, ya sea a un portaobjetos para hacer un frotis o a otro medio de cultivo. Quemar nuevamente el ansa.

Siempre que se vaya a tomar una muestra de un cultivo con cualquier finalidad debe procederse según técnica aséptica descrita, con el fin de no introducir contaminación en el cultivo o en la muestra. OBSERVACIÓN DE UN PREPARADO FRESCO (para observar movilidad, forma, etc) Método de la gota pendiente Colocar una gota de muestra usando técnica aséptica en el centro de un cubreobjetos limpio. Invertirlo cuidadosamente y colocarlo sobre la depresión de una lámina excavada, de manera que no deslice la gota por el cubreobjeto. La gota no debe tocar el fondo de la depresión. Aplicar unas gotas de agua a los bordes del cubre para sellarlo y mantenerlo en su lugar. Observar con el lente seco de mayor aumento. Método de lámina-laminilla Colocar una gota de la muestra usando técnica aséptica sobre un portaobjetos limpio y cubrir con un cubreobjetos. Para prevenir las corrientes de convección y el secado de la preparación, se puede sellar poniendo en los bordes del cubreobjetos vaselina sólida o esmalte de uñas. Observar igual que el anterior. En caso de disponer de microscopio de contraste de fases la visión es mucho mejor. PREPARACIÓN DE UN FROTIS 1) Colocar con un ansa una gota de muestra -si es líquida- sobre un portaobjetos limpio. Si la muestra proviene de un cultivo en medio sólido, colocar primero una gota de agua sobre el porta, tomar la muestra con el ansa, tocar la gota, quemar el ansa y luego de enfriada, mezclar bien con el agua para lograr una suspensión homogénea.


2) Secar al aire. Puede acelerarse el secado, manteniendo la lámina encima de la llama del mechero a 15 cm o más de distancia. 3) Fijar. Con el frotis seco, pasar el porta tres veces por la llama del mechero para fijar. Coloración simple Preparar un frotis según la técnica habitual antes descrita. Colocar el porta sobre un soporte para tinciones. Cubrir la preparación con 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno o de cristal violeta y dejar 1 minuto. Lavar con agua. Secar encima de la llama del mechero. Observar al microscopio con lente de inmersión (100x) y determinar forma, disposición y relación de tamaños de las distintas bacterias. Coloración de Gram (Técnica de Hucker) Preparar un frotis según la técnica antes descrita. Colocar el porta sobre un soporte para tinciones. Cubrir con solución de cristal violeta y dejar actuar 1 min. Lavar suavemente con agua de la canilla. Cubrir con lugol y dejar actuar 1 min. Lavar de la misma manera. Cubrir con etanol 95% y dejar 30 seg. moviendo suavemente la lámina. Seguir lavando con etanol hasta que este no arrastre más colorante. Lavar con agua. Cubrir con solución de safranina y dejar 15 seg. Lavar y secar. Observar por inmersión. Las bacterias Gram + se verán de color azul-violeta y las Gram - rosadas. Coloración de esporas Preparar un frotis pasando 10 veces por la llama para fijar. Colocar la lámina sobre una plancha para tinciones. Cubrir con pequeños trozos de papel de filtro, impregnar éstos con solución de verde de malaquita y calentar durante 5 min. con el mechero. Mantener el papel siempre saturado con verde de malaquita mediante agregado de solución. Lavar suave pero abundantemente con agua. Dar contraste con solución de safranina durante 30 s. Lavar con agua y secar. Observar por inmersión. Se verán las esporas verdes y los cuerpos celulares rosados. Si se dispone de un microscopio con contraste de fases, se puede observar la endospora sin teñir como una estructura densa, blanca dentro de la célula. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA La microscopía de fluorescencia se basa en los mismos principios de óptica que la microscopía común, con diferencias en el manejo y el diseño relacionadas con la generación y transmisión de longitudes de onda adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar, ya sean propios de la muestra o de la coloración utilizada. Los procesos de excitación generalmente requieren longitudes de onda cortas, en el UV cercano (lámpara de halógeno-cuarzo, arcos de mercurio, etc.). Las lentes deben ser de algún material (generalmente fluorita) que transmita esas longitudes de onda y el aceite de inmersión de ser no fluorescente. Se encuentran diversos ejemplos de fluorocromos naturales tales como algunas vitaminas, esteroides, porfirinas, etc. Un ejemplo de estudio de bacterias por visualización directa de fluorocromos naturales es la observación de bacterias metanogénicas con luz UV. Estas fluorescen con luz UV en preparaciones sin coloración debido al la presencia de coenzimas fluorescentes F 420 y F 350, relacionadas con el metabolismo del C y la metanogénesis. Otros compuestos que fluorescen (rodamina, auramina, fluoresceína, colorantes de acridina) se utilizan en distintas técnicas de tinción; por ejemplo la tinción de microorganismos ácido-resistentes con auramina-rodamina en muestras de tejido y esputo. También se utilizan las técnicas de inmunofluorescencia que consiste en la aplicación a la muestra, de una solución de un anticuerpo marcado con una sustancia fluorescente; si la muestra tiene el antígeno que se busca, este reaccionará y así se localizará. Tal es el caso, por ejemplo, de la detección de Salmonella con anticuerpos marcados con fluoresceína.


CITOLOGIA Y MORFOLOGIA DE HONGOS

INTRODUCCIÓN Los hongos constituyen un grupo muy heterogéneo de organismos eucariotas, heterótrofos no fotosintéticos y con pared celular. Basándose en la apariencia macroscópica de la colonia se pueden diferenciar dos tipos de hongos: si producen colonias opacas, cremosas o pastosas se denominan levaduras; si producen crecimientos aéreos, velludos, algodonosos o pulverulentos se llaman hongos filamentosos o mohos. Existe un tercer grupo que se desarrolla como levaduras cuando crece a 37ºC y como hongo filamentoso a 25ºC. Este fenómeno se denomina dimorfismo. El conjunto de elementos que constituyen un hongo se denomina talo. El talo puede ser unicelular (en levaduras). En hongos filamentosos el talo incluye una parte vegetativa, el micelio, compuesto por hifas y una parte reproductora. Las hifas son tubos que contienen núcleos y citoplasma. Pueden presentar septos (micelio tabicado) (fig.1) o no (micelio no tabicado) (fig.2). Los septos presentan poros que conectan los distintos segmentos de la hifa. A veces las levaduras constituyen cadenas de células denominadas pseudomicelio (fig.3). Pueden existir elementos de resistencia como los esclerotes que son masas endurecidas de micelio presentes en algunos géneros de Ascomycetes y Basidiomycetes. Los hongos se pueden reproducir asexuada y sexualmente. En algunas especies coexisten las dos formas de reproducción en el mismo organismo que se denomina entonces holomorfo. El holomorfo tiene a la vez una forma de multiplicación asexuada, el anamorfo o estado imperfecto y una sexuada, el teleomorfo o estado perfecto. La reproducción asexuada puede ocurrir por propagación vegetativa a partir de fragmentos de micelio, o por formación de esporas de distinto tipo (conidios, esporangiosporas, etc.). La reproducción sexuada se caracteriza por la unión de dos núcleos que dan lugar a esporas sexuadas (zigosporas, ascosporas, etc.). Los hongos pueden ser homotálicos si poseen en el mismo micelio núcleos complementarios que pueden conjugarse o heterotálicos cuando requieren núcleos provenientes de micelios diferentes. En general la reproducción asexuada es más importante para la propagación de la especie. En muchos hongos la reproducción sexuada se da solo una vez al año. Hay un grupo de hongos a los que no se les conoce reproducción sexuada. Existe otro grupo que no forma esporas de ningún tipo y solo se reproduce por fragmentación del micelio. ZYGOMYCETES Estructura Hongos filamentosos con micelio no tabicado, cenocítico. Pueden presentar órganos de fijación: rizoides, típicos de Rhizopus. Reproducción ASEXUADA: Clamidosporas: células vegetativas que se rodean de una pared gruesa constituyendo a la vez elementos de resistencia (fig.4) y que luego dan origen al micelio. Esporangiosporas: esporas producidas endógenamente dentro de un esporangio. A veces, como en Mucor sp., el esporangio puede presentar una columela (fig. 5). La columela es una vesícula o parte central del esporangio que es continua con el esporangióforo (hifa que genera el esporangio). SEXUADA: Zigotes o zygosporas: cuerpos marrones o negros, con paredes gruesas que frecuentemente está cubierto por espinas, que son formados por la fusión de dos gametangios (fig. 6).


Ej.: zigote heterotálico: Absidia coerula, zigote homotálico: Mucor baciliformis ASCOMYCETES Estructura Hongos filamentosos con micelio tabicado y levaduras. Reproducción ASEXUADA: Gemación (o fisión ) en levaduras (fig.7). Conidios formados en conidióforo SEXUADA: Ascosporas contenidas en un asco que se forma frecuentemente por kariogamia de 2 núcleos distintos. Generalmente se forman 8 aunque pueden formarse 2 o 4. Los ascos pueden estar incluídos o no dentro de un ascocarpo.

GRUPO FORMAS DE REPRODUCCION

Asexuada Sexuada Fig Ejemplo

Hemiascomycetes gemación Ascos sin ascocarpo 8 Saccharomyces

Euascomycetes conidios Ascos cleistotecio en peritecio ascocarpo apotecio

9 10 11

Emericella Sordaria Pyronema

BASIDIOMYCETES Estructura Hongos filamentosos con micelio tabicado y algunas levaduras. Reproducción ASEXUADA: crecimiento vegetativo, rara vez forman esporas. SEXUADA: basidiosporas formadas sobre basidios. DEUTEROMYCETES O FUNGI IMPERFECTI Estructura Hongos filamentosos con micelio tabicado y levaduras. Se agrupan aquí los hongos a los que no se les conoce forma de reproducción sexuada. Se presume que éstos son estados no sexuados o anamorfos de Ascomycetes (o más raramente Basidiomycetes) cuyos estados sexuados o teleomorfos no han sido descubiertos. Si se observa el estado sexuado de una especie de Deuteromycetes, ambos estados se transfieren al grupo al que pertenece el teleomorfo. Reproducción Conidios formados en células especializadas, las células conidiógenas que pueden encontrarse en una hifa especializada: el conidióforo.


La clasificación dentro de este grupo se basa en la observación del aparato conidiógeno. La forma en que se produzca la conidiogénesis dará lugar a la formación de conidios solitarios, en racimos o en cadenas. En algunos géneros las células conidiógenas no se diferencian del resto de la hifa, ej.: Aureobasidium (fig.12). En otros, las células conidiógenas se alargan denominándose fiálides, ej.: Penicillium (fig.13), se ramifican, ej. Botrytis (fig.14), o el extremo se dilata, ej.: Aspergillus (fig.15). Algunos géneros forman artrosporas por fragmentación de la hifa, ej.: Geotrichum (fig.16) y otros clamidosporas. Pueden ser unicelulares o contener dos o más células: macroconidias, ej. Alternaria (fig.17) o Fusarium (fig. 18). Las células conidiógenas pueden estar contenidas dentro de pycnidios, ej.: Phoma, (fig.19). Los pycnidios son cuerpos de fructificación globosos, con forma de matraz y poseen una apertura apical llamada ostiolo PARTE PRÁCTICA En la identificación de hongos filamentosos juega un rol muy importante las características morfológicas macro y microscópicas. Observación microscópica El micelio se debe describir según:

• su situación: aéreo (razante a la superficie o elevado) o profundo • su morfología: velludo, glabro, rugoso, etc. • su coloración • produzca o no pigmentos que difundan al medio

Se debe tratar de observar las estructuras lo más intacta posible. Puede observarse directamente la placa de Petri con bajo aumento. Las preparaciones se hacen entre lámina y laminilla. Se coloca en un portaobjeto una gota de solución aclarante de KOH al 10 % o de una solución colorante de azul de metileno. Se corta, con el ansa, una pequeña porción del material a estudiar. Para disminuir el daño, se puede utilizar un trocito de cinta adhesiva que se presiona suavemente sobre el cultivo. Se coloca el material o el trozo de cinta en la gota, se cubre con un cubreobjeto y se presiona suavemente. Se observa con bajo aumento. BIBLIOGRAFIA Samson, R.A and col.; "Introduction to Food-Borne Fungi",, 1995. Stanier and col.; The Microbial World, 5ta ed., Prentice-Hall, 1986, p.536-544. Lennette and col.; Manual of Clinical Microbiology, 4ta Ed., American Society for Microbiology, 1985, cap.46. Pelczar and Reid; Microbiology, McGraw-Hill Book Cy., 1972, caps.14 y 15. Guiraud, J. and Galzy, P.; L'analyze microbiologique dans les industries alimentaires, Editions de L'usine, 1981, cap.2. Alexopoulos,C.J. and Mims, W.; Introducción a la Micología, Ed. Universitaria de Buenos Aires, 1977. Moore-Landecker, E.; Fundamentals of The Fungi, 2nd ed., Prentice-Hall, 1982. Pitt, J. & Hocking, A., Fungi and food spoilage, Academic Press, London, 1985 FIGURAS DE HONGOS


Fig. 1 Micelio no tabicado Fig. 2

Micelio tabicado Fig. 3

Pseudomicelio

Fig. 4 Clamidosporas

Fig. 5

Fig. 6 Zygote

Fig. 7 Gemación

Fig. 9 Cleistotecio

Fig. 10 Peritecio

Fig. 11 Apotecio

Fig. 8 Ascos desnudos


Fig. 12 Aureobasidium

Fig. 14 Botrytis

Fig. 15 Aspergillus

Fig. 16 Geotrichum

Fig. 17 Alternaria

Fig. 18 Fusarium

Fig. 19 Phoma

Fig. 13 Penicillium


SIEMBRA Y AISLAMIENTO - BÚSQUEDA

SIEMBRA Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado el medio de cultivo debe incubarse a una temperatura adecuada para el crecimiento de los m.o. La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estéril. Cultivo en medio líquido Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar por aparición de turbidez, formación de velo o película o sedimento. Cultivo en medio sólido Puede ser en tubos con medio sólido o placas. Tubos con agar inclinado. Para sembrarlos, se mueve el ansa o la punta suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar. Tubos sin inclinar. Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar. También se llama siembra por picadura. Siembra en placas. Puede ser en superficie o incorporada. En superficie

• Se colocan 0,1 mL de la dilución de la muestra con pipeta estéril en el centro de la placa, y se distribuye con un rastrillo estéril.

• Se siembra con un ansa para aislar, como se explica más adelante. • Se siembra con un hisopo.

Incorporada

• Se coloca 1 mL de la muestra en una placa estéril vacía, en el centro de la misma. Sobre ella se agregan 20 mL de medio de cultivo sólido fundido y termostatizado a 45ºC; luego se mueve suavemente la placa para que la muestra se mezcle con el agar y se deja solidificar.

En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para contar y aislar. Cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, puede ser necesario diluir la muestra con un diluyente estéril como suero fisiológico. AISLAMIENTO Aislar es separar un microorganismo a partir de una población que los contiene de varios tipos. En ecosistemas naturales raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro o axénico (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar los distintos tipos de microorganismos presentes para luego así poder identificarlos. El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los microorganismos están en una proporción adecuada. Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos: a) aislamiento por estrías. b) aislamiento por dilución


Aislamiento en placa por estrías Existen distintas técnicas, el objeto es obtener colonias aisladas. Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa; se quema el ansa, se enfría, se gira la placa 90º y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por último, sin quemar el ansa, se estría el resto de la superficie sin sembrar. Aislamiento por dilución en medio sólido Se emplean tanto el método de siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele ser necesario diluir la muestra usando suero fisiológico o algún otro diluyente. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS Para aislar microorganismos anaerobios que son rápidamente destruidos por exposición al oxígeno, las placas pueden ser preparadas en la forma usual, y luego de sembradas, incubadas en recipientes cerrados en atmósfera sin oxígeno. También se puede sembrar diluciones en tubos con agar fundido y termostatizado que luego se tapan con una capa de vaselina-parafina para evitar el acceso de aire. Con anaerobios más sensibles al oxígeno, se trabaja en cámaras anaeróbicas, o también usando la técnica del "roll-tube", que es un tubo en el que el agar se deposita en las paredes al hacerlo girar mientras se enfría; se trabaja gaseando el tubo continuamente con gas libre de oxígeno mientras el tubo está destapado. BÚSQUEDA Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en una muestra, se lleva a cabo un procedimiento llamado búsqueda, que involucra una primera etapa de aumento del número del tipo de microorganismo que se desea aislar. Luego se aísla por el método de estrías o por dilución y se identifica. Una búsqueda generalmente implica los siguientes pasos:

1) enriquecimiento 2) aislamiento selectivo (medios selectivos y/o diferenciales) 3) reaislamiento (medio no selectivo) 4) identificación

El objetivo de la etapa de enriquecimiento es aumentar el número del microorganismo que se desea determinar y en algunas ocasiones puede subdividirse en dos: preenriquecimiento y enriquecimiento selectivo. El preenriquecimiento o enriquecimiento no selectivo suele hacerse solamente cuando los microorganismos buscados están debilitados o dañados y se usan siempre medios nutrientes líquidos no selectivos. El enriquecimiento selectivo se realiza incubando la muestra en medios líquidos selectivos, ya sea en presencia de agentes químicos o biológicos que suprimen el crecimiento de otros m.o. no deseados y permiten el desarrollo en particular del o de los microorganismos buscados. Luego de cumplida la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo la etapa de aislamiento, empleando la técnica de estrías en superficie en medios sólidos generalmente selectivos y diferenciales. En estos medios deben examinarse las colonias típicas para el tipo de m.o. que estamos buscando. Las colonias deben describirse por examen macroscópico en función del tamaño, la forma, el borde, la elevación, la transparencia y el color. Esto resulta a veces muy útil en la identificación. En el caso de medios selectivos las colonias aisladas deben aislarse nuevamente en un medio no selectivo por el método de estrías. Esto se conoce como reaislamiento y es necesario para asegurar la obtención de un CULTIVO PURO del microorganismo de interés, ya que en los medios


de aislamiento selectivos puede ocurrir que una colonia característica del m.o. que estamos buscando pueda contener como contaminantes –en muy bajo número- otros microorganismos que no hayan crecido en este medio por estar inhibidos, pero al subcultivarlos en condiciones favorables puedan crecer. El examen microscópico de una colonia de un cultivo puro de un microorganismo debe mostrar células razonablemente semejantes respecto al Gram y a la morfología. El informe de una búsqueda se hace siempre expresando PRESENCIA o AUSENCIA en los gramos o mL de muestra sembrados en la primera etapa del procedimiento (enriquecimiento). DESCRIPCIÓN DE COLONIAS DE BACTERIAS Y LEVADURAS Las colonias de muchos m.o. se pueden describir teniendo en cuenta el tamaño, color, superficie, etc. Esta descripción no incluye hongos filamentosos. Tamaño: Grande: diámetro mayor a 1 mm Mediana: diámetro aproximadamente igual a 1 mm Pequeña: diámetro menor a 1 mm Color Blanco, Crema, Amarillo limón, Negro, etc Superficie Brillante, Lisa, Granular, Rugosa Consistencia Viscosa, Mantecosa, Friable (se disgrega al tocarla) Densidad (con luz a través de la colonia) Opaca, Transparente, Traslúcida FORMA

ELEVACIÓN

MARGEN

Chata Elevada Convexa Cúpula Umbonada Umbilicada

Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Lanceolada

Entero Ondulado Lobado Ondeado Filamentoso


MEDIOS DE CULTIVO

GENERALIDADES Si se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos, etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento de ellos frente a otros m.o. que los acompañen en ese ecosistema. Se puede emplear un medio de cultivo y condiciones de incubación (atmósfera, temperatura, pH) considerando las características fisiológicas del m.o. buscado, para otorgarle ventajas frente al resto de m.o. de ese ecosistema. Pretendemos inhibir la mayor cantidad posible de m.o. no deseados, de manera que estos no interfieran durante el aislamiento de los que sí interesan. Un esquema general para el enriquecimiento, aislamiento e identificación de m.o. es el siguiente: Debemos realizar las siguientes consideraciones si deseamos detectar y aislar un determinado tipo de m.o. y simultáneamente minimizar la interferencia de otros: Muestra Elegir la muestra adecuadamente. El m.o. que se está buscando debe ser factible de estar presente, ya sea si lo estamos buscando per se, o como contaminante. Debemos considerar si es útil someter la muestra a un tratamiento previo. Cuanto mayor selección se realice en este paso inicial, menos selectivos deberán ser los medios de cultivo a utilizar. ¿Debemos comenzar con un enriquecimiento o aislar la muestra directamente? Si el m.o. que deseamos aislar está en un bajo número, se siembra la muestra en un caldo de cultivo que favorezca su multiplicación (enriquecimiento). Cuando un enriquecimiento se realiza en un medio formulado para frenar el desarrollo de m.o. acompañantes no deseados, se denomina enriquecimiento selectivo. Cuando el m.o. deseado está en alto número, no se necesita realizar un enriquecimiento, y se puede sembrar la muestra en un medio sólido adecuado directamente. Medio de cultivo Todo medio de cultivo debe contener los nutrientes esenciales para el crecimiento de una o varias especies microbianas y dar condiciones tales como pH, presión osmótica, oxígeno disuelto, etc. adecuados para el crecimiento. Debemos utilizar una formulación de los medios de cultivo adecuados al tipo de m.o. a cultivar. En general en las primeras etapas se utilizan medios de cultivo selectivos (agregando un inhibidor de la flora acompañante), o utilizando un medio de cultivo restrictivo al incluir un nutriente que sólo el m.o. deseado sea capaz de utilizar o utilizando condiciones de incubación particulares. Debemos utilizar las condiciones de incubación adecuadas: temperatura, luz, atmósfera (aerobia o anaerobia, atmósfera con concentración de CO2, etc.). Los componentes del medio de cultivo que se pueden manejar son:

• Fuente de carbono. A modo de ejemplo, se podrían quitar todos los compuestos orgánicos para permitir el crecimiento de m.o. autótrofos que son capaces de obtener su fuente de carbono del CO2 (que difunde de la atmósfera al medio o por agregado de bicarbonato). O incluir exclusivamente una fuente de carbono particular, por ej, fenol si queremos aislar degradadores de ese compuesto.

Fuente de inóculo Caldo de enriquecimiento Aislamiento Identificación


• Fuente de nitrógeno. Generalmente se agrega como sales de amonio o peptonas. Se puede omitir el agregado de fuente nitrogenada (orgánica u inorgánica) para permitir el crecimiento de fijadores libres de nitrógeno, que son capaces de obtener su fuente de nitrógeno del N2 atmosférico.

• Fuente de energía. Si no se agrega ningún compuesto capaz de ser utilizado como fuente

de energía y se incuba a la luz, sólo crecerán los m.o. fotosintéticos que usan la luz como fuente de energía.

• Se pueden agregar o no compuestos que sean utilizados como factores de crecimiento

(vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, ácidos grasos, etc.) según se necesiten o no. Peptonas Las peptonas son uno de los constituyentes principales de los medios de cultivo en microbiología. Se preparan por hidrólisis de proteínas y por lo tanto están constituidas por mezcla de polipéptidos, péptidos de diverso peso molecular y aminoácidos. Las peptonas de uso microbiológico son mezcla de varios productos resultantes de la hidrólisis proteica: bases nitrogenadas, sales inorgánicas y trazas de minerales y compuestos varios. Algunas fuentes comunes de peptonas son: carne (fresca, deshidratada o congelada), pescado (fresco o deshidratado), caseína, gelatina, proteína de soja, microorganismos (levaduras, algas), sangre, albúmina de huevo, etc. La hidrólisis puede ser en medio ácido o alcalino o a presión superior a la atmosférica para lograr más altas temperaturas. Las peptonas resultantes en este proceso tienen en general bajo contenido de vitaminas y aminoácidos porque son destruidos en el proceso. Sin embargo la hidrólisis también puede ser enzimática (con papaína, pancreatina, pepsina) y es realizada a mas bajas temperaturas, y por lo tanto las peptonas del proceso tienen más elevado contenido de aminoácidos y vitaminas que las de la hidrólisis ácida o alcalina. Infusiones y extractos Las fracciones solubles en agua de materiales como hígado, células de levadura, extracto de malta y músculo tienen bajo contenido en péptidos pero contienen sustancias valiosas para un medio de cultivo como vitaminas, metales traza y carbohidratos complejos. Ejemplos de ellos son los extractos de carne (ricos en compuestos nitrogenados, vitaminas, aminoácidos), levadura (ricos en vitaminas del complejo B, aminoácidos y compuestos carbonados y nitrogenados), malta (rica en carbohidratos, especialmente maltosa y otros nutrientes) y corazón de buey. Según la finalidad del medio de cultivo podemos encontrar distintos tipos: 1) Medios nutrientes (no selectivos) Son medios de propagación que permiten el desarrollo de varios tipos de microorganismos. No contienen inhibidores. Como ejemplos de medios nutrientes comunes tenemos agar nutriente, agar tripticasa soja, caldo nutriente, etc. A veces estos medios se enriquecen con ciertos productos tales como sangre, yema de huevo, etc. para permitir el crecimiento de microorganismos exigentes: tendríamos entonces un medio de cultivo rico o enriquecido; ej. agar sangre, agar chocolate (el medio contiene sangre hemolizada). También pueden contener indicadores de pH u otros para diferenciar la reaccion de los m.o.; tales medios se llamarían medios diferenciales, por el. agar lactosa rojo fenol (indicador de pH rojo fenol), caldo tioglicolato (indicador de potencial redox resazurina). 2) Medios selectivos o inhibitorios Son medios que contienen además de los nutrientes, ciertas sustancias que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos permitiendo el crecimiento de otros, por ej. agar cetrimide. Estos medios también pueden contener indicadores para diferenciar los distintos tipos de microorganismos que puedan crecer en él; tal medio sería selectivo y diferencial, por ej. Mac Conkey, Baird Parker, EMB, etc. Los medios de enriquecimiento selectivo son medios selectivos


líquidos que contienen inhibidores, ej., sales biliares, altas concentraciones de cloruro de sodio, etc. 3) Medios diferenciales Contienen sustancias que permiten diferenciar las distintos tipos de m.o. por ej por sus propiedades bioquímicas (producción de ácido de un carbohidrato, producción de pigmentos, hidrólisis de un compuesto, etc) , ej: agar lactosa rojo fenol, agar Mac Conkey, agar Baird Parker (contiene yema de huevo que permite ver la producción de lipasas). Pueden ser selectivos o no. Para referirse a otras generalidades de los medios de cultivo, sus constituyentes, preparación en el laboratorio, control de calidad y almacenamiento se pueden consultar los manuales de medios de cultivo comerciales Preparación de medios de cultivo Cuando el medio va a repartirse en placas, se esterilizan por separado el medio de cultivo (generalmente por autoclavado) y las placas de Petri (en horno); luego el medio termostatizado a 45 ºC se reparte en placas, usando técnica aséptica. Cuando el medio va a repartirse en tubos, se reparte antes de su esterilización, colocando en cada tubo un determinado volumen según el tamaño del tubo y si queremos o no que quede fondo. Cada tubo se tapa con algodón (o también con capuchón de metal, plástico o tapón de rosca). Cuando alguno de los constituyentes del medio de cultivo es termolábil se esteriliza por filtración y se agrega al medio base luego de autoclavado. Esterilización de material de vidrio: Placas de Petri: se preparan en paquetes de 8 a 10 placas según el tamaño, envolviéndolas con papel. Tubos: se tapa cada uno con un tapón de algodón y se envuelven con papel en paquetes Pipetas: se coloca un algodón en la parte superior de la pipeta y se envuelve con papel. Se esterilizan en horno a 160 (2 h) o a 180 ºC (1 h).


CARACTERÍSTICAS DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO

Medio de cultivo Tipo de medio Agente bacteriostático

Azúcar fermentable

Sistema Indicador

ALRF (agar lactosa rojo fenol)

diferencial (no selectivo) ----- lactosa rojo fenol

Agar Cetrimide selectivo bromuro de cetiltrimetil amonio ----- -----

Agar Mac Conkey selectivo y diferencial

cristal violeta, sales biliares lactosa rojo neutro

VRBA (violeta rojo bilis agar)

selectivo y diferencial

cristal violeta, sales biliares lactosa rojo neutro

Manitol Salt Agar (Chapman)

selectivo y diferencial cloruro de sodio manitol rojo fenol

XLD agar (xilosa lisina desoxicolato)

selectivo y diferencial

desoxicolato de sodio

lactosa, xilosa, sacarosa

rojo fenol, citrato férrico amónico y tiosulfato de sodio

Baird Parker agar selectivo y diferencial

Cloruro de litio y telurito de potasio ------ yema de huevo,

telurito de potasio

TSB + 10% NaCl enriquecimiento selectivo cloruro de sodio ------ ------

Caldo Tetrationato enriquecimiento selectivo

Tetrationato, sales biliares (verde brillante)

------ ------

CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante)

enriquecimiento selectivo

verde brillante, sales biliares lactosa producción de

gas


TEST DE ESTERILIDAD

INTRODUCCION El test de esterilidad se aplica a productos que deben ser estériles y se realiza para verificar que efectivamente están libres de contaminación microbiana. Deben ser estériles la gran mayoría de los productos suministrados por vía parenteral (inyectables, sueros), los materiales que estén en contacto con el medio interno (apósitos, suturas, fluidos para irrigaciones, material quirúrgico) y los productos oftálmicos. A medida que los avances tecnológicos permiten obtener productos de mejor calidad, esta exigencia se va extendiendo a otros materiales tales como los de aplicación ótica o sobre algún tipo de mucosas. El test de esterilidad se encuentra descrito en las Farmacopeas donde debe ser estudiado como complemento de este trabajo. Por esterilidad se entiende ausencia de cualquier forma de vida. El término esterilidad es absoluto. El proceso mediante el cual se logra este estado se denomina "esterilización" y se define como "el proceso de eliminar toda forma de vida". Este proceso está diseñado para minimizar la probabilidad de que haya microorganismos sobrevivientes. Por lo tanto, siempre existe una probabilidad finita de que quede algún microorganismo vivo. LIMITACIONES DEL TEST DE ESTERILIDAD 1) El test de esterilidad es un procedimiento destructivo, por lo tanto sólo se puede aplicar a una parte del lote del material a analizar. Por esta razón no puede asegurarse la esterilidad de todo el lote. Empleando conceptos estadísticos se recurre a un plan de muestreo que establece para un nivel de confianza dado, que el porcentaje de contaminación del lote está por debajo de cierto límite. Por ejemplo: para un resultado negativo (ausencia de crecimiento) en 20 muestras de un lote dado, se asegura con un nivel de confianza del 95%, que el nivel de contaminación del lote está por debajo del 5%. Para asegurar que ese lote tiene un nivel de contaminación menor que el 1%, con un nivel de confianza del 99%, sería necesario analizar 500 muestras, lo que resultaría impracticable. Como se observa, tal como está diseñado el método sólo permite detectar una contaminación grosera. 2) El ensayo no garantiza la detección de todos los microorganismos conocidos. Es imposible diseñar un método que permita recuperar todos los posibles m.o. contaminantes. Los medios de cultivo empleados y las condiciones de incubación limitan el número de m.o. a recuperar, a un cierto grupo. Quedan excluidos por ejemplo los m.o. exigentes, los anaerobios muy estrictos y los virus. A ello se agrega el hecho de que si el material fue sometido a un proceso de esterilización, los m.o. sobrevivientes se encuentran "estresados" y aunque no se recuperen en las condiciones de realización del test, podrían proliferar en medios más ricos como el medio interno. 3) Para darle confiabilidad a un resultado positivo del test (desarrollo de m.o.) habría que asegurarse de que la contaminación no fue introducida durante la realización del ensayo (falso positivo). Aunque se han mejorado las condiciones de realización del mismo, todavía siguen siendo un factor importante de fuente de error. Esto se contrapone a la idea de que se debe aumentar el número de muestras para aumentar la confiabilidad del test, porque también aumenta la posibilidad de tener falsos positivos.


MÉTODOS DE ENSAYO a) Inoculación directa Consiste en la transferencia directa del producto a ensayar desde su recipiente de origen al medio de cultivo apropiado. b) Filtración por membrana Consiste en la filtración del producto a ensayar si es líquido o una solución del mismo a través de una membrana de porosidad adecuada (no mayor de 0,45 μm). Los microorganismos quedan retenidos en la membrana. Ésta se coloca asépticamente en los medios de cultivo y se incuba. Se aplica a formas líquidas y a productos que puedan solubilizarse en disolventes apropiados (esterilizables e inocuos para los microorganismos). Permite ensayar un volumen mayor de muestra. Es particularmente apropiado para productos con propiedades bacteriostáticas o fungistáticas. Es el método de elección siempre que sea posible. DISEÑO EXPERIMENTAL 1) Muestreo Las Farmacopeas establecen el número de unidades a ensayar y la toma de cada unidad según el contenido y tipo de producto. Para la selección de las muestras es conveniente conocer el proceso de esterilización, de manera de ensayar las unidades que tienen mayor riesgo de no haber quedado esterilizadas; por ejemplo, en una esterilización por calor húmedo se ensayan las unidades que están en los "puntos fríos" del autoclave. Obviamente, el producto esterilizado debe estar contenido en un envase que conserve su esterilidad, por lo tanto si esto no se cumple carece de sentido realizar el test de esterilidad. CANTIDAD MINIMA DE MUESTRA A USAR PARA CADA MEDIO – USP 30

Cantidad por envase Cantidad mínima a tomar de cada unidad

Líquidos (no antibióticos)

Menos de 1 mL El contenido total de cada envase

1 – 40 mL La mitad del contenido de cada envase pero no menos de 1 mL

Más de 40 y no más de 100 mL 20 mL

Más de 100 mL 10% del contenido del envase pero no menos de 20 mL

Líquidos antibióticos 1 mL

Otras preparaciones solubles en agua o en miristato de isopropilo

El contenido total de cada envase para suministrar no menos de 200 mg

Sólidos

Menos de 50 mg El contenido total de cada envase

50 mg o más pero menos de 300 mg La mitad del contenido de cada envase pero no menos de 50 mg

300 mg – 5 g 150 mg

Más de 5 g 500 mg


NUMERO MINIMO DE ARTICULOS A ENSAYAR EN RELACION CON EL NÚMERO DE ARTÍCULOS EN LA PARTIDA – USP 30

Número de artículos en la partida Número mínimo de artículos a ensayar para cada medio*

Preparaciones parenterales

No mas de 100 envases 10% o 4 envases lo que resulte mayor

Más de 100 pero no más de 500 10 envases

Más de 500 envases 2% o 20 envases lo que resulte menor

Parenterales de gran volumen 2% o 10 envases lo que resulte menor

Antibióticos sólidos

Menos de 5 g 20 envases

Mayor o igual a 5 g 10 envases

Preparaciones oftálmicas y otras no inyectables

No más de 200 envases 5% o 2 envases lo que resulte mayor

Más de 200 10 envases

* Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios esta columna da el númeo de envases necesarios para los dos medios juntos. 2) Medios de cultivo Los medios de cultivo fueron seleccionados para favorecer el desarrollo del más amplio espectro de microorganismos posible. Los recomendados actualmente son: Caldo Tripticasa Soja (TSB o Tryptic Soy Broth) y Caldo tioglicolato. El TSB se propone para recuperar bacterias aerobias, hongos y levaduras, y se incuba a 22,5 ± 2,5ºC. El Tioglicolato favorece el crecimiento de microorganismos anaerobios por ser un medio de bajo potencial redox, aunque permite también el desarrollo de microorganismos aerobios. Se incuba a 32,5 ± 2,5ºC. El bajo potencial redox se logra con el agregado de reductores (cisteína y ácido tioglicólico) y un bajo porcentaje de agar que disminuye la difusión del oxígeno. El medio incluye resazurina como indicador del potencial redox. Se considera que el medio está apto para el uso cuando no más del tercio superior del volumen total está oxidado (rosado). Los medios deben ser sometidos a dos tipos de controles: a) confirmar su esterilidad, para ello se incuba un número representativo de cada partida (control negativo) en las mismas condiciones del ensayo durante 14 días. b) Test de promoción de crecimiento: se debe demostrar que el medio es capaz de promover el desarrollo de microorganismos aunque estén en bajo número. Para ello se inoculan en forma independie unidades de cada lote de medio con no más de 100 ufc del tipo de m.o. establecido y se verifica el crecimiento de los mismos dentro de 3 días para bacterias y no más de 5 días para hongos. Los medios son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de los m.o.


3) Determinación de la presencia o ausencia de inhibidor en el producto a analizar Antes de realizar el test de esterilidad se debe verificar que el producto a ensayar no ejerce propiedades bacteriostáticas o fungistáticas en las condiciones del ensayo. Para ello se compara el crecimiento desarrollado en el medio de cultivo, luego de inoculado con una cantidad conocida de microorganismos (no mas de 100 ufc), en ausencia y presencia del producto (método de inoculación directa) o de la membrana usada para filtrar el producto (método por filtración). El crecimiento debe ser similar en ambos ensayos. Si se comprueba presencia de inhibidor se debe agregar un agente neutralizante o ajustar la relación toma de muestra/medio de cultivo hasta que se verifique que no existe inhibición. Cepas de microorganismos empleados para el test de promoción de crecimiento y validación

Bacterias aerobias

Staphylococcus aureus ATCC 6538 Bacillus subtilis ATCC 6633 Micrococcus luteus (Kocuria rhizophila) ATCC 9341 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Bacterias anaerobias

Clostridium sporogenes ATCC 11437 Bacteroides vulgatus ATCC 8482

Hongos

Candida albicans ATCC 10231 Aspergillus niger ATCC 16404

4) Procedimiento a) Condiciones de realización. Cabe recordar que en este ensayo una contaminación accidental sería crítica. Se debe extremar las precauciones en el manejo de la técnica aséptica y trabajar en una cabina de flujo laminar en un ambiente adecuado. La cabina de flujo laminar consiste en una cabina en la cual hay una corriente constante y de velocidad uniforme (en forma laminar) de aire filtrado a través de filtros de alta eficiencia (HEPA = High Efficiency Particulate Air). Estos filtros tienen una eficiencia del 99,97% en remover todas las partículas mayores o iguales a 0.3 μm. El flujo puede ser vertical (brinda mayor protección al operador) u horizontal. El personal que realiza el ensayo también puede ser fuente de contaminación por sí mismos, por su vestimenta o por las manipulaciones. Se recomienda utilizar vestimenta adecuada (túnica, tapabocas, cofia y guantes esterilizados) y realizar el menor número de movimientos posibles. Generalmente se controla la contaminación durante la realización del test por exposición de placas con medio nutriente que luego se incuban. b) Apertura de los envases y toma de muestra. Se limpia la superficie exterior de los envases con una solución de un desinfectante adecuado y se extrae el contenido en forma aséptica. Si se trata de viales o ampollas conteniendo un líquido se hace la toma con jeringa o pipeta estéril y se transfiere a los medios de cultivo o directamente al vaso de filtración de la unidad filtrante (si el volumen es muy pequeño o la solución es viscosa, diluir la muestra con un disolvente adecuado antes de filtrar).


Si se trata de productos oleosos solubles en miristato de isopropilo se puede aplicar el método de filtración. Para los sólidos se busca un disolvente adecuado o se aplica el método de inoculación directa. En el caso de paquetes conteniendo artículos esterilizados (algodón, gasa, equipo quirúrgico, etc) se debe abrir y extraer asépticamente parte de su contenido. En los dispositivos terapéuticos que requieren la condición de esterilidad sólo para el interior del mismo (por ejemplo cánulas), se hace fluir los medios de cultivo a través del lumen. c) Técnica de filtración por membrana. La unidad filtrante consta básicamente de un vaso de filtración un soporte para la membrana, un embudo y un kitasato. La filtración se realiza por aspiración con bomba de vacío. La membrana de filtración está constituida generalmente por polímeros de ésteres de celulosa. Actúa como filtro de superficie con un tamaño de poro definido y limitado. En el test de esterilidad se emplean membranas de 0,45 μm de diámetro de poro, lo que permite retener las bacterias en su superficie. Pueden adquirirse esterilizadas o pueden esterilizarse junto a la unidad de filtración. Después de filtrar el producto, especialmente si éste tiene propiedades bacteriostáticas o fungistáticas, se lava la membrana con líquido de enjuague. En este caso pueden emplearse también membranas con bordes hidrofóbicos, que impiden que la parte de más difícil acceso a las soluciones de enjuague (bordes de la membrana) quede embebida de agente inhibidor. Se desarma la unidad y asépticamente se retira la membrana, se corta a la mitad y se introduce cada una en los medios TSB y Tioglicolato. Se incuban durante 14 días. d) Técnica de inoculación directa. Se transfiere directamente y en forma aséptica la toma desde cada unidad a un tubo conteniendo TSB y a un tubo conteniendo caldo Tioglicolato. Se incuba y se observa si hay evidencia de crecimiento microbiano a intervalos frecuentes. Si el producto por sí mismo deja el medio turbio, subcultivar el día 14 no menos de 1 mL de cada uno de los medios a nuevos medios respectivos. Incubar los subcultivos no menos de 4 días para detectar crecimiento. e) Interpretación e informe de resultados. Luego de concluido el período de incubación se examina los medios de cultivo en búsqueda de evidencia macroscópica de crecimiento microbiano.

• Si no hay evidencias de crecimiento como desarrollo de turbidez y/o crecimiento superficial, se informa que el producto "cumple el test de esterilidad según farmacopea ....."

• Si hay crecimiento en cualquiera de los caldos empleados se informa "no cumple el test de esterilidad según farmacopea ....." a menos que pueda demostrarse claramente que la prueba resultó inválida por causas no relacionadas con el producto examinado La prueba puede considerarse inválida solo si se cumplen una o mas de las siguientes condiciones:

a) Los datos del monitoreo microbiológico de las instalaciones demuestran una falla. b) Una revisión del procedimiento analítico usado durante el test revela una falla. c) Se detecta crecimiento microbiano en los controles de esterilidad de los medios. d) Luego de determinar la identidad de los m.o. aislados del test puede atribuirse de manera inequívoca a falla con respecto al material o a la técnica usados.

Si el test se considera inválido se repetirá con el mismo número de unidades del test original. Si no se detecta crecimiento microbiano el producto examinado cumple con el test de esterilidad. Si se detecta crecimiento microbiano en el test repetido el producto examinado no cumple el test de esterilidad. No se prescribe en forma oficial, pero se recomienda aislar y caracterizar él o los m.o. que crecieron en los medios de cultivo. El hecho de que los microorganismos aislados en cada ensayo sean iguales puede ser una evidencia de que provienen de la muestra y por lo tanto de que el producto no cumple con el test de esterilidad.


EL TEST DE ESTERILIDAD Y OTROS CONTROLES DE ESTERILIZACION El control de un proceso de esterilización puede realizarse sobre el producto esterilizado (test de esterilidad) y sobre el proceso mismo. Los controles del proceso pueden ser físicos (temperatura, presión, humedad), químicos (viraje de algún indicador, concentración del agente esterilizante) o biológicos (bioindicadores). Actualmente, el criterio general es emplear una combinación de éstos ya que los ensayos en el producto final no aseguran, por sí solos, la esterilidad del mismo. Se considera que la esterilidad, como parte de la calidad de un producto, debe ser proyectada y construida y no solo inspeccionada sobre el producto final.


IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA

Existen diferentes sistemas de clasificación de bacterias, pero el más comúnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón o grupo según una clasificación dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada. Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que prosigue la identificación. A continuación se propone un esquema de trabajo para la identificación de una cepa bacteriana desde el punto de vista bioquímico (biotipo): 1) Obtener un cultivo puro 2) Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así la forma y la tinción Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas u otras características morfológicas de interés. 3) Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos. 4) Realización de pruebas primarias: en la tabla modificada del Cowan & Steel's Manual of Identification of Medical Bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, que podríamos denominar pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, fermentación de glucosa, presencia de esporas, crecimiento en aerobiosis/anaerobiosis y movilidad. 5) Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, etc.) Serotipo A los efectos de realizar identificaciones más rápidas, o cuando las pruebas bioquímicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros específicos. Los antígenos bacterianos pueden ser capsulares, somáticos (O) que corresponden al lipopolisacárido de la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras y el número o letra del antígeno correspondiente. En una primera identificación se usan sueros polivalentes y para la caracterización serológica se usan sueros monovalentes dentro de cada tipo de antígeno. Existen en el comercio antisueros para caracterización de: Salmonella, Shigella, E.coli, Haemophilus, etc. También se pueden utilizar métodos de cromatografía gaseosa para identificar productos metabólicos, en particular para la identificación de bacterias anaerobias no esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc. Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera: Yersinia enterocolítica 4 03 género especie biotipo serotipo


ENSAYOS BIOQUIMICOS

La identificación de una cepa bacteriana proveniente de un aislamiento puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes. Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer lo metaboliza o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque proveen los reactivos prontos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de identificación, comerciales, etc.). a) Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios prontos para sembrar. En todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados. Los sistemas comerciales más comúnmente usados son: BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema pronto para usar para la identificación de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos no esporulados, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plástico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultáneamente en una etapa y permiten la detección de 15 características bioquímicas. OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la identificación de bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plástico de 12 medios de cultivo que permite la realización simultánea de 14 pruebas bioquímicas. API 20 E (BioMerieux) Es un sistema estandarizado para la identificación de Bacterias Gram negativas. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión bacteriana. Permite la realización de 23 pruebas bioquímicas a partir de una única colonia bacteriana. Existen también sistemas de identificación comerciales para levaduras. b) En la Cátedra se desarrolló un sistema para la identificación de Enterobacterias que consta de nueve pruebas bioquímicas convencionales (SYS 9E). Este sistema identifica las 23 especies más frecuentemente aisladas de muestras clínicas. Está integrado por las siguientes pruebas: producción de H2S (TSI), fenilalanina desaminasa, producción de indol, descarboxilación de lisina y ornitina, crecimiento en citrato, fermentación de arabinosa, fermentación de sorbitol y producción de acetoína.


En esquema, la realización de una prueba bioquímica implica:

• Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación. La prueba bioquímica también puede consistir en demostrar el crecimiento en presencia de determinado inhibidor.

• Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato de

una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimática.

En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 h. de incubación) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica, atmósfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para esa prueba. Si bien existen una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de identificación, se enumerarán a continuación solo las que se utilizan más frecuentemente, agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su nombre corriente. 1) Enzimas vinculadas con la respiración oxidasa catalasa 2) Requerimientos de oxígeno OF Caldo tioglicolato 3) Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros

Producción de ácido, o ácido y gas Detección de enzimas y vías metabólicas (RM-VP, esculina, ONPG –orto-

nitrofenilgalactopiranosido. 4) Fuente única de carbono

citrato malonato

5) Utilización de compuestos nitrogenados

asimilación de nitrato (reducción a amonio) desnitrificación (utilización de nitrato como aceptor de electrones) descomposición de carbohidratos, aminoácidos y otros (indol, fenilalanina, urea,

descarboxilación de lisina, etc) 6) Ensayos combinados

TSI (Triple azúcar hierro) LIA (Agar hierro lisina)

7) Detección de exoenzimas (lecitinasa, proteasas, coagulasa, celulasas, etc) 8) Test de crecimiento o inhibición (temperatura, cloruro de sodio en alta concentración, antibióticos) 9) Otros (solubilidad en bilis, producción de pigmentos).


PRUEBAS BIOQUÍMICAS

CATALASA Introducción La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. La catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 átomos de hierro de la molécula están en estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. Principio El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los carbohidratos. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas. La catalasa transforma el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción: H2O2 → H2O + O2 (burbujas de gas) La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es comúnmente utilizada para diferenciar Streptococcus (catalasa negativa) de Staphylococcus (catalasa positiva). Medios y reactivos 1. Cultivo de 24 horas del microorganismo en un medio no selectivo y que no contenga sangre. 2. Peróxido de hidrógeno al 3% (diluir la solución de 30% con agua destilada). Procedimiento Transferir una ansada de células del centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjetos en el que se coloco una pequeña gota de peróxido de hidrógeno al 3%. Emulsionar bien. Se recomienda probar previamente las ansas que contengan hierro, ya que se pueden producir falsos positivos. Interpretación La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una prueba positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno, unas pocas burbujas diminutas, formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba positiva. Controles Staplylococcus aureus: positivo Streptococcus spp.: negativo PRUEBA DE ÓXIDO-FERMENTACIÓN (OF) Introducción La prueba de óxido-fermentación es importante en las primeras etapas de identificación de un cultivo. Permite diferenciar las bacterias según el rol del oxígeno atmosférico en la utilización de carbohidratos. Principio El medio más comúnmente utilizado es el de Hugh-Leifson que -a diferencia de otros medios de cultivo- contiene una baja concentración de peptonas (0,2 %). A las concentraciones de peptona habitualmente usadas en otros medios (1 al 2%), no es posible detectar la baja concentración de


ácidos que se produce por metabolismo oxidativo de azúcares, ya que las aminas generadas por el uso aerobio de las peptonas alcalinizan el medio. La baja concentración de peptona del medio Hugh-Leifson permite diferenciar los microorganismos oxidativos de los inactivos frente a la glucosa. En ausencia de otros aceptores externos de electrones (ej. NO3

-), la oxidación de carbohidratos es un proceso estrictamente aerobio, en tanto que la fermentación es un proceso que no requiere oxígeno. El medio de cultivo es semisólido. Medios y reactivos Medio de Hugh-Leifson de glucosa Peptona 2 g Glucosa 10 g Azul de bromotimol 0,03 g NaCl 5 g K2HPO4 0,30 g Agar 3 g Agua destilada c.s.p. 1 L Se dispensa en tubos profundos (7 - 8cm). pH (luego de la esterilización): 7,1 ± 0,2. Procedimiento Se inocula por picadura (con punta en vez de ansa) un solo tubo que tiene por lo menos 7 cm de altura de medio de cultivo y se incuba a 35ºC durante 48 horas o más. Interpretación La producción de ácido se detecta en el medio por la aparición de color amarillo. En el caso de microorganismos oxidativos, este aparece en la superficie. Cuando el microorganismo es fermentador se observa el viraje en todo el tubo. Si el medio no cambia de color o vira al color azul (pH básico) con respecto a un tubo del mismo lote sin sembrar, se considera que el microorganismo es inactivo frente a la glucosa. Controles Fermentador de glucosa: Escherichia coli Oxidativo de glucosa: Pseudomonas aeruginosa No reacciona: Micrococcus spp. FERMENTACIÓN DE GLUCOSA Introducción La determinación de la capacidad de fermentación de la glucosa es importante en las primeras etapas de identificación de bacterias quimiótrofas. Principio Se utiliza un caldo que contiene glucosa (azúcar del cual la mayoría de las bacterias quimiotrofas pueden obtener energía, ya sea por fermentación o respiración), peptona y un indicador de pH que permite detectar la producción de ácidos (característica de la fermentación de la glucosa). Además en la fermentación se produce gas, ya sea CO2 solo o una mezcla de H2 y CO2. El H2 es insoluble y se detecta por la formación de una burbuja en una campana de Durham presente en el medio. Medios y reactivos Medio caldo de fermentación de glucosa Proteasa peptona 10 g Glucosa 10 g Púrpura de bromocresol 0,015 g Cloruro de sodio 5 g Agua destilada c.s.p. 1 L


Se dispensa por 9 mL en tubos y se agrega una campanita de Durham invertida. pH (luego de la esterilización): 6,8 ± 0,2. Procedimiento Se inocula con ansa y se incuba a 35 ºC durante 48 horas. Interpretación Las bacterias fermentadoras de glucosa producen un viraje del indicador al ácido (color amarillo). Si se produce gas puede observarse en la campanita invertida. Las bacterias no fermentadoras no producen viraje o producen un viraje hacia el pH alcalino (púrpura a violeta). Pueden ensayarse otros carbohidratos además de glucosa. OXIDASA Introducción El sistema citocromo oxidasa está constituido por hemoproteínas capaces de catalizar la oxidación de un citocromo reducido por el oxígeno molecular. Las bacterias que obtienen su energía por respiración y utilización del oxígeno molecular como aceptor final de electrones contienen diferentes sistemas citocromo oxidasa, en tanto que las bacterias anaerobias obligadas no contienen tales sistemas. Principio El ensayo de citocromo c oxidasa permite detectar la presencia en el microorganismo de ciertas enzimas del sistema citocromo oxidasa, capaces de oxidar rápidamente al colorante redox . Este ensayo es útil para sospechar la presencia de los géneros de bacterias que dan el ensayo positivo como Neisseria, Aeromonas, Vibrio, Camplylobacter y Pseudomonas y para excluir las Enterobacterias que dan reacciones negativas. Medios y reactivos 1. Cultivo fresco del m.o. en un medio no selectivo y libre de colorantes que puedan interferir en el ensayo. 2. Solución al 1% de diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina (producto de color rosado), o clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (producto de color azul), recién preparada. Procedimiento Añadir unas gotas de reactivo a una tira o disco de papel de filtro (colocada en una placa de Petri limpia) y extender luego una ansada (bien cargada) de la colonia a estudiar. Se debe realizar un control negativo del ansa ya que ésta puede producir falsos positivos. Interpretación Cuando se utiliza el reactivo tetrametil-p-fenilendiamina: Se considera el ensayo como positivo cuando aparece un color azul profundo en un tiempo menor a 10 seg. Se considera positivo lento a confirmar cuando el color aparece entre 10 y 60 seg. y se considera negativo cuando no hay desarrollo de color o cuando se produce en un tiempo mayor a 60 seg. Cuando se utiliza el reactivo dimetil-p-fenilendiamina: Se considera el ensayo como positivo cuando aparece un rosado a fucsia en un tiempo de aproximadamente 2 minutos. Controles Positivo: Pseudomonas aeruginosa Negativo: Escherichia coli


CALDO TIOGLICOLATO – CRECIMIENTO AEROBIO-ANAEROBIO Introducción Los microorganismos pueden ser clasificados de acuerdo a su crecimiento en presencia de oxígeno de la siguiente manera: 1) aerobios estrictos: son los que necesitan O2, 2) anaerobios estrictos: aquellos que solo pueden crecer en ausencia de O2, y 3) anaerobios facultativos: aquellos que pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno. El Manual Bergey’s aplica las relaciones con el oxígeno a las bacterias heterótrofas y define: aerobio: organismo capaz de utilizar el oxígeno como aceptor final de electrones, pueden tolerar un nivel de oxígeno equivalente o mayor al presente en el aire (21%) y tiene un metabolismo respirador. Algunos aerobios pueden ser capaces de crecer con otros aceptores de electrones distintos al oxígeno (ej. respiración anaerobia con nitrato). anaerobio facultativo: organismo capaz de crecer bien tanto en ausencia como en presencia de una concentración de oxígeno similar a la del aire. Algunos crecen en aerobiosis respirando con oxígeno y en anaerobiosis por fermentación. Otros tienen un metabolismo estrictamente fermentativo y no respiran el oxígeno. microaerofílico: organismo capaz de crecer dependiente de oxígeno pero no tolera las concentraciones de oxígeno del aire. La respiración aerobia se da en concentraciones bajas de oxígeno (5%). Algunos microaerofílicos pueden respirar anaeróbicamente utilizando otros aceptores de electrones distintos al oxígeno. anaerobio: organismo incapaz de crecer en presencia de oxígeno a niveles atmosféricos o bajos. Algunos tienen metabolismo fermentativo y otros respiran anaeróbicamente. Principio Para determinar las relaciones con el oxígeno se utiliza el caldo tioglicolato. Este medio permite el crecimiento de muchas de las bacterias heterótrofas no exigentes, pero no de todas, y de acuerdo al tipo de crecimiento se determinará si el microorganismo puede respirar y/o fermentar. No se puede determinar si el microorganismo puede crecer anaeróbicamente con aceptores electrónicos alternativos (NO3

-) o con luz. El tioglicolato de sodio, baja el potencial redox del medio y la resazurina es un indicador de oxidación (aerobiosis) del tubo. Medios y reactivos Medio Caldo tioglicolato Extracto de levadura 5 g Casitona 15 g Glucosa 5,5 g NaCl 2,5 g L-Cistina 0,5 g Tioglicolato de Na 0,5 g Agar 0,75 g Resazurina 0,001 g Agua destilada 1 L pH luego de la esterilización: 7,1 ± 0,2 Procedimiento Inocular los tubos por picadura (con punta). Incubar a 35°C durante 48 horas. Interpretación Aquellos microorganismos que son indiferentes al oxígeno y tienen un metabolismo estrictamente fermentativo, crecerán a lo largo de todo el tubo. Los anaerobios facultativos crecerán a lo largo de todo el tubo pero habrá mayor crecimiento en la superficie del tubo. Los aerobios estrictos crecerán sólo en la superficie del tubo (no fermentan). Los microaerofílicos no crecerán en la superficie pero sí en la zona aerobia (rosada) donde haya una concentración de oxígeno inferior a la atmosférica. Los anaerobios estrictos -que puedan crecer en este medio- solo se desarrollarán en el fondo del tubo.


PRUEBAS BIOQUÍMICAS SECUNDARIAS

INDOL Introducción El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de m.o. Principio La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito más adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. Medios y reactivos Caldo triptofano Peptona o digerido pancreático de caseína 2 g Cloruro de sodio 0,5 g Agua destilada 100 ml Reactivo de Kovacs Alcohol amílico o isoamílico 150 ml p-dimetilaminobenzaldehído 10 g HCl conc. 50 ml Procedimiento Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo por la pared del tubo. Interpretación El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado positivo de la prueba. Controles Escherichia coli: positivo Klebsiella pneumoniae: negativo (mayoría de las cepas) ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP) Principio Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.


El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia Medios y reactivos Caldo RM/VP Peptona 7 g Glucosa 5 g Fosfato dipotásico 5 g Agua destilada 1 L pH = 6,9 ± 0,1 Indicador de pH rojo de metilo Rojo de metilo 0,1 g en 300 mL de etanol 95° Agua destilada 200 ml Revelador VP alfa-naftol (solución al 5% en etanol 95°) Solución de KOH al 40% en agua destilada Procedimiento Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. En el otro tubo con el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo. Interpretación La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína. La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. Controles RM positivo, VP negativo: Escherichia coli RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes UTILIZACIÓN DE CITRATO Introducción La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. Principio La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.


Medios y reactivos Medio de Simmons Fosfato diácido de amonio 1 g Fosfato dipotásico 1 g Cloruro de sodio 5 g Citrato de sodio 2 g Sulfato de magnesio 0,2 g Agar 15 g Azul de bromotimol 0,08 g Agua destilada c.s.p. 1 L pH = 6,9 Procedimiento Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C de 24 h. a 4 días. Interpretación El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul. Controles Positivo: Klebsiella spp. Negativo: E.coli DESCARBOXILACIÓN DE LISINA Y ORNITINA Introducción La descarboxilación de aminoácidos es llevada a cabo por descarboxilasas y se forman aminas y CO2. Cada descarboxilasa es específica para un aminoácido y la reacción es completa e irreversible. Los aminoácidos ensayados habitualmente para la identificación son lisina, ornitina y arginina. Principio El caldo descarboxilasa de Moëller es el medio base más comúnmente usado para la determinación de las descarboxilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medio conteniendo el aminoácido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminoácido. Se cubren con una capa de aceite mineral (vaselina líquida) para hacer el medio anaerobio de manera que ocurra la fermentación de la glucosa que contiene. Durante las primeras etapas de la incubación en ambos tubos se observará viraje del indicador de pH del medio al ácido por la fermentación de la glucosa. Luego, si el aminoácido es descarboxilado, se forman aminas que provocan un retorno al color original del medio o un viraje al alcalino. Medios y reactivos Base de Moeller Peptona 5 g Extracto de carne 5 g Glucosa 0,5 g Piridoxal 0,005 g Púrpura de Bromocresol 0,01 g Rojo de cresol 0,005 g Agua destilada c.s.p. 1 L


pH final = 6,0 Caldo Lisina o Ornitina de Moeller: Preparar igual al medio base y agregar 10 g del aminoácido (1% de concentración final de la forma levo, utilizar el doble si se usa la forma dl del aminoácido ya que sólo la levo es activa). Agregar aceite mineral para formar una capa de 1 cm de espesor. Procedimiento Inocular con un cultivo puro de 24 horas un tubo de base de Moëller con el aminoácido a estudiar (lisina u ornitina) y un tubo de la base (control sin aminoácido). Incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Interpretación El ensayo puede ser leído si en el tubo control se observa crecimiento y viraje del indicador al amarillo indicando que se dio la fermentación de la glucosa y un descenso de pH que permite la activación de las descarboxilasas. La presencia de crecimiento y el retorno al color azul-violeta en el tubo que contiene el aminoácido indica una reacción positiva debida a la liberación de aminas por descarboxilación. Controles Descarboxilación de lisina positiva: Enterobacter aerogenes Descarboxilación de lisina negativa: Enterobacter cloacae Descarboxilación de ornitina positiva: Serratia spp Descarboxilación de ornitina negativa: Klebsiella spp. FENILALANINA DESAMINASA Introducción La fenilalanina es un aminoácido que por desaminación oxidativa forma un cetoácido, el ácido fenilpirúvico. Para los géneros Proteus y Providencia que poseen la fenilalanina desaminasa, esta prueba permite diferenciarlas del resto de las Enterobacterias. Principio La prueba de la fenilalanina se basa en la detección del ácido fenilpirúvico luego del desarrollo del m.o. en un medio que contiene fenilalanina. Para eso se agrega cloruro férrico que forma un complejo de color verde con el ácido fenilpirúvico. El medio de cultivo no puede contener extractos de carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina. Medios y reactivos Agar fenilalanina DL fenilalanina 2 g Extracto de levadura 3 g Cloruro de sodio 5g Fosfato de sodio 1 g Agar 12 g Agua destilada c.s.p. 1 L pH = 7,3 Cloruro férrico Cloruro férrico 10 g HCl concetrado 2,5 g Agua destilada c.s.p. 100 ml


Procedimiento Inocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de 24 horas e incubar a 35°C durante 18-24 horas. Luego de transcurrido el período de incubación, agregar 4 o 5 gotas de reactivo de cloruro férrico, directamente sobre la superficie del agar. Interpretación La aparición inmediata de un color verde intenso indica la presencia de ácido fenilpirúvico y una prueba positiva. Controles Positivo: Proteus Negativo: Escherichia coli TSI (TRIPLE SUGAR IRON) Introducción El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la detección de la producción de H2S. Es una prueba bioquímica útil en la identificación de enterobacterias. Principio El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cámaras de reacción en el tubo. La porción inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxígeno es aerobia y la porción inferior (fondo) está protegida del aire y es relativamente anaerobia. La glucosa en el TSI está en una proporción 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, como la cantidad de glucosa es baja, la cantidad de ácido producida por la fermentación será baja. En las primeras horas (10 a 16 h) de incubación se producirá viraje del indicador al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubación, el pico del tubo retornará al rojo por la degradación aerobia de las peptonas que produce aminas (que viran el pH al medio básico). Si el m.o. fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azúcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producirá gran cantidad de ácido que no puede ser neutralizado por la producción de aminas que se da en la superficie. En este caso todo el tubo (pico y fondo) virará al color amarillo (ácido). Si se inoculan m.o. no fermentadores, no se formarán ácidos y el m.o. no crecerá en el fondo del tubo, pero por la producción de aminas en el pico, todo el medio quedará rojo. La producción de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitación del sulfuro ferroso (negro). Como esta reacción se da preferencialmente en medio ácido, un ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee como fermentación de algunos de los azúcares del medio. Además puede observarse la producción de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o hasta por su desprendimiento del fondo del tubo.


Medios y reactivos TSI Extracto de carne 3 g Extracto de levadura 3 g Peptona 15 g Proteosa peptona 5 g Lactosa 10 g Sacarosa 10 g Glucosa 1 g Cloruro de sodio 5 g Sulfato ferroso 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,3 g Agar 12 g Rojo fenol 0,024 g Agua destilada 1 L pH = 7,4 ± 0,2 Procedimiento Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 °C durante 18-24 hs, pero no más de 24 hs.. Interpretación y Controles Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, producción de gas y H2S. Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-) No hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no fermentadoras como Ej. Pseudomonas sp Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S-) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas ni de H2S. Ej. Shigella spp. Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas, si de H2S. Ej. Salmmonella typhi. Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de gas y producción de ácido sulfhídrico. Ej. Salmonella spp. (la mayoría de las especies de Salmonella). Pico ácido/fondo ácido (A/A) Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. E.coli (A/A/H2S -) A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.


LIA (LYSINE IRON AGAR) Introducción Este ensayo permite diferenciar los microorganismos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se puede detectar además la producción de H2S. Es muy utilizado en las técnicas de búsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo. Principio Durante las primeras etapas de la incubación el fondo virará el indicador de pH del medio al ácido (amarillo) por la fermentación de glucosa. Luego, si el aminoácido es descarboxilado se formarán aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al básico (color violeta). En la desaminación se produce un ácido carboxílico y NH3 y se visualiza en la superficie la aparición de un color rojo intenso. La producción de H2S a partir de tiosulfato se visualiza por la precipitación de sulfuro ferroso de color negro. Medios y reactivos Peptona 5 g Extracto de levadura 3 g Glucosa 1 g L-lisina HCl 10 g Citrato férrico amónico 0,5 g Tiosulfato de sodio 0,04 g Púrpura de bromocresol 0,02 g Agar 15 g Agua destilida 1 L pH = 6,7 ± 0,2 Procedimiento Inocular los tubos de LIA con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta con el inóculo, hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35°C durante 24 horas. Interpretación y controles Para el LIA siempre se informa el resultado generalmente en el siguiente orden: pico, fondo, producción de H2S.

Pico alcalino/fondo alcalino (lisina descarboxilada) Pico alcalino/fondo ácido (lisina no descarboxilada) Pico rojo/ fondo ácido (lisina desaminada)

Salmonella typhimurium: pico alcalino/ fondo alcalino/H2S + Proteus mirabilis: pico rojo/ fondo ácido/H2S – Salmonella arizonae: pico alcalino/ fondo alcalino/H2S - PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS PARA PSEUDOMONAS sp. Introducción La capacidad para producir pigmentos como pioverdina (fluoresceína) y piocianina es una característica importante para la identificación de especies de Pseudomonas. Algunas de ellas elaboran sólo fluoresceína (ej. Ps. fluorescens) y otras ambos pigmentos (ej. Ps. aeruginosa). La piocianina solamente es producida por Ps. aeruginosa aunque no todas las cepas de esta especie


la producen. Se han diseñado medios de cultivo que potencian la elaboración de uno de los pigmentos e inhiben la formación del otro. Principio El medio King A (o Pseudomonas Agar P) potencia la elaboración de piocianina mientras que el King B (o Pseudomonas Agar F) potencia la elaboración de fluoresceína e inhibe parcialmente la de piocianina. Estos pigmentos son solubles en agua y difunden al medio. La piocianina es un pigmento azul-verde mientras que la fluoresceína es amarillo-verdoso y fluoresce cuando es expuesto a la luz UV (λ=254 nm). Existen pigmentos amarillo-verdosos producidos por algunas especies de Pseudomonas que no fluorescen. Medios y reactivos King A King B Peptona 20 g Proteosa Peptona 20 g Glicerol 10 g Glicerol 10 g K2SO4 10 g K2HPO4 1,5 g MgCl2 1,4 g MgSO4.7H2O 1,5 g Agar 15 g Agar 15 g Agua c.s.p. 1 L Agua c.s.p. 1 L Los medios se reparten en tubos, se esterilizan a 121ºC durante 15 minutos y se dejan solidificar inclinados. Procedimiento Inocular los tubos por estrías. Incubar a 35ºC durante 24 hs. Interpretación Observación de pigmento azul-verdoso en el medio King A: producción de piocianina (King A +) Observación al UV de pigmento fluorescente amarillo-verdoso en el medio King B: producción de fluoresceína (King B +) Controles Pseudomonas aeruginosa: King A + P. fluorescens: King A - P. fluorescens: King B + P. stutzeri: King B - COAGULASA Y FACTOR DE AGLUTINACION Introducción La coagulasa es una enzima extracelular capaz de unirse a la protrombina para formar un complejo capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo visible. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio de infección estafilocóccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus. Principio Para determinar la actividad de esta enzima extracelular se realiza una prueba en tubo comúnmente llamada Coagulasa Libre en la que una suspensión de bacterias productoras de coagulasa al ser mezclada en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, origina un coágulo visible de manera similar a cuando se añade trombina.


Existe un ensayo más sencillo cuyos resultados tienen un alto porcentaje de concordancia (96%) con la determinación de la coagulasa libre. Este ensayo se basa la determinación del factor de aglutinación, un determinante que se encuentra sobre la superficie celular y que es capaz de unirse al fibrinógeno. Por lo tanto si a una suspensión de bacterias que poseen este determinante en su superficie se las mezcla con fibrinógeno se observará un agregado de las bacterias. A este ensayo se le llama Test de Factor de Aglutinación o Test de Coagulasa Fija, a pesar de que no se basa en la detección de esta enzima. Medios y reactivos Liofilizado de Plasma citratado o plasma con EDTA para ensayo de coagulasa (Difco, o BBL) Agua estéril o diluyente apropiado para reconstituir el reactivo de Plasma liofilizado Cultivo de Staphylococcus sp. de 24 h en un agar nutriente. Procedimientos Test de Factor de Aglutinación (Prueba en un portabjetos): Colocar una gota de agua sobre un portaobjetos Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensión cargada y homogénea. En caso de que exista autoaglutinación (se formen grumos que no se disgregan) NO puede usarse esta técnica. Agregar una gota de plasma previamente reconstituido según indicaciones del proveedor junto a la gota de la suspensión del m.o. Mezclar bien con el ansa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado y observar la aparición de grumos antes de los 10 segundos. Test de Coagulasa Libre (Prueba en tubo) Inocular una colonia en un tubo estéril conteniendo 0.5mL de plasma de conejo Los tubos pueden mantenerse refrigerados durante 10 días o congelados por varios meses. Incubar los tubos a 35oC - 37oC hasta completar 24 horas. Examinar luego de 4 horas de incubación, buscando la presencia de un coágulo que no puede suspenderse por agitación. Si es negativo a las cuatro horas, volver a incubar hasta las 24 horas.

Interpretación 1+: pequeños coágulos no organizados. 2+: pequeños coágulos organizados. 3+: gran coágulo organizado. 4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo. Se consideran positivos los grados 3+ y 4+ Controles Positivo: S.aureus Negativo: S.epidermidis:


DNASA - DESOXIRRIBONUCLEASA Introducción La actividad desoxirribonucleasa (DNAsa) se ha demostrado fundamentalmente en los géneros Staphylococcus y Serratia y consiste en la propiedad de degradar el ADN a fracciones de menor peso molecular. Esta característica se ha utilizado para identificar las especies de Serratia marcescens y Staphylococcus aureus. Weckman y Catlin (Weckman B.G. y Catlin B.W., 1957, Journal of Bacteriology, 73: 747-753) demostraron la estrecha correlación entre la producción de DNAsa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la producción de coagulasa. Principio Los m.o. DNAsa positivos degradan el DNA cuando son incubados en un medio que lo contiene. Esto puede ser visualizado de diferentes maneras: ya sea inundando las placas crecidas con HCl 0,1 N y observando zonas transparentes alrededor de las estrías o incorporando al medio indicadores como azul de toluidina o verde de metilo (viran a rosado cuando el test es positivo). Medios y reactivos DNAsa agar Triptosa 20 g ADN 2 g NaCl 5 g Agar 15 g Azul de toluidina* 0,1 g Agua c.s.p. 1 L * o verde de metilo Procedimiento Estriar la superficie de la placa e incubar a 35°C durante 18-24 horas. Observar el viraje del indicador a rosado alrededor de las estrías. Interpretación Un resultado positivo está dado por el viraje del indicador en la zona de la estría a rosado. Controles Positivo: S.aureus y Serratia marcescens Negativo: S.epidermidis: PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA Introducción La prueba de la bilis-esculina está basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los enterococos, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 4%. La esculina es, químicamente, un derivado de la cumarina (6-b-glucósido-7-hidroxicumarina), que por su estructura pertenece a los glucósidos. Por definición, éstos están constituídos por dos restos unidos por un puente de oxígeno. En el caso de la esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la 7-hidroxicumarina (que no es un hidrato de carbono, y es denominado aglucona).


Principio Las bacterias capaces de crecer en presencia de bilis a esa concentración y también de hidrolizar esculina, producen glucosa y esculetina (7,7 dihidroxicumarina) y ésta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por formación de un complejo marrón oscuro o negro. Algunos medios bilis-esculina incluyen también azida sódica para inhibir el desarrollo de organismos Gram negativos. Medios y reactivos Medio bilis-esculina Peptona 5 g Extracto de carne 3 g Bilis de buey 40 g Esculina 1 g Citrato férrico 0,5 g Agar 15 g Agua destilada 1 L Procedimiento Se estría el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta del medio bilis-esculina. Se incuba a 37°C durante 24 horas. Interpretación La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reacción es positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrón oscuro o negro alrededor de las colonias en placa. Controles Positivo: Enterococcus sp. Negativo: Streptococcus sp. UREASA Introducción La urea es una diamida del ácido carbónico que puede ser hidrolizada con liberación de amoníaco y dióxido de carbono.


Principio La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de m.o. que pueden hidrolizar urea de acuerdo a la siguiente reacción química produciéndose alcalinización y aumento de pH del medio

Medios y reactivos El caldo urea y agar urea de Christensen son los dos medios mas comúnmente usados en los laboratorios para la detección de la ureasa de m.o. Caldo de Stuart Extracto de levadura 0,1 g Fosfato monopotásico 9,1 g Fosfato disódico 9,5 g Urea 20 g Rojo fenol 0,01 g Agua 1 L pH = 6,8 Agar urea de Christensen Peptona 1 g Glucosa 1 g Cloruro de sodio 5 g Fosfato monopotásico 2 g Urea 20 g Rojo fenol 0,012 g Agar 15 g Agua 1 L pH = 6,8 Procedimiento Inocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o estriar la superficie del agar. Incubar a 35°C durante 24 hs. Interpretación Los m.o. que hidrolizan urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en 1 a 3 hs. Las especies mas lentas pueden requerir 3 o mas días. Caldo: una coloración rojiza indica alcalinazación e hidrólisis de urea Agar: una coloración rojiza en el medio indica hidrólisis de urea positiva. Los degradadores lentos producen coloración parcial (generalmente el pico), los rápidos producen coloración en todo el tubo. Si no hay hidrólisis el medio permanece con el colo original (amarillo) y se observa crecimiento. Controles Positivo: Proteus sp Negativo: Escherichia coli

Urea + 2H2O CO2 + H2O + 2NH3


PROBLEMAS DE DISCUSIÓN GENERALIDADES La identificación de una cepa bacteriana requiere comparar las características de esa cepa con las características de las especies conocidas descritas. Esta descripción se encuentra en el Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Las propiedades que usa para clasificar los procariotas en grandes grupos (secciones del Manual de Bergey) son las morfológicas, el tipo de pared y la tolerancia al oxígeno. Esas son generalmente las características por donde se comienza la identificación de una bacteria. Puede ocurrir que esta sea una nueva bacteria, en ese caso comparando con las ya descritas sólo podremos decir que se parece mucho a una especie ya descrita pero que no pertenece a la misma. En la mayoría de los análisis de rutina en un laboratorio de microbiología el problema que se presenta no es identificar una bacteria aún no descrita, sino determinar si una cepa aislada pertenece o no a una especie de interés. El conocimiento de las propiedades de esa especie de interés se utiliza en el proceso de aislamiento para seleccionar especies con determinadas características. Por ej. si se quiere determinar si en una muestra de agua están presentes estreptococos fecales (cocos Gram positivos anaerobios facultativos) utilizará medios y condiciones de incubación tales que excluyan a otros grandes grupos de bacterias como los cocos Gram positivos anaerobios estrictos y durante su análisis incubará aeróbicamente. La información de la ecología del m.o. aislado, es decir la muestra de la cual proviene, así como el proceso de aislamiento del mismo reducen considerablemente el espectro de especies posibles. Por ello, en el proceso de identificación es posible que no necesite analizar todas las características que indica el Manual de Bergey. Otra razón por la cual el número de características a analizar puede reducirse es que en la mayoría de los análisis microbiológicos se busca confirmar o descartar que la cepa aislada pertenece a una especie dada. Si la cepa no pertenece a la especie de interés, no es necesario identificarla. Por ej. si en una muestra dada para la cual se exige ausencia de Pseudomonas aeruginosa se aisla una bacteria que pertenece al género Pseudomonas pero no es de la especie P. aeruginosa, no es necesario determinar a que especie del género pertenece. Problema I (E.coli) Antecedentes Las bacterias de la especie Escherichia coli son bastones Gram negativos que no reducen sulfato cuyo hábitat natural es el intestino humano y de animales de sangre caliente. Las cepas de E. coli generalmente no son patógenas, sino indicadores de contaminación fecal. Su presencia en una muestra implica que otros m.o. de origen fecal, incluyendo patógenos, pueden estar presentes en la misma. Sólo algunas cepas de E.coli son agentes etiológicos de infecciones gastrointestinales. Estas cepas patógenas entéricas se diferencian entre si y de las no patógenas por su biotipo, generalmente asociado a la presencia de plásmidos. En los procedimientos de rutina de análisis de especialidades farmacéuticas y de alimentos se determina la presencia o el número de bacterias de la especie E.coli pero no se determina si esas cepas son potenciales patógenos entéricos. Cuando hay sospecha de presencia de E.coli patógena se realiza una serotipificación de un número determinado de cepas aisladas y/o se envían a Centros de referencia. La contaminación fecal puede originarse en las materias primas utilizadas en la elaboración de un producto o por contaminación durante o posteriormente al proceso de elaboración. El número de bacterias generalmente depende del tipo de producto y proceso y determina el procedimiento que se realizará para aislar bacterias que pertenezcan a la especie E.coli. El otro factor que determina el procedimiento de aislamiento es la flora acompañante: la proporción relativa de E.coli a las demás bacterias presentes y las propiedades fisiológicas de esas otras bacterias. En muestras que se preparan a partir de materias primas que no deben tener contaminación fecal (como medicamentos preparados a partir de materias primas sintéticas) o en muestras en las cuales después de su preparación se ha realizado un proceso para disminuir la carga bacteriana (alimentos pasteurizados) se podría esperar un número muy bajo de E.coli. En esas muestras se


realiza un procedimiento de búsqueda, en el cual por siembra en medios de enriquecimiento se aumenta el número de bacterias para después realizar su aislamiento e identificación. En muestras de origen natural (generalmente materias primas de origen natural como leche no pasteurizada, aguas presumiblemente contaminadas) se podría esperar un número mas alto de estas bacterias. En ese caso no se realiza la etapa de enriquecimiento sino que directamente se cuenta el número de estas bacterias empleando un método de recuento de bacterias viables en un medio selectivo para E.coli. En ambos casos la etapa siguiente es determinar si las colonias aisladas pertenecen o no a la especie E.coli. Los procedimientos oficiales para su detección en alimentos y medicamentos generalmente llegan a esta etapa después del aislamiento en medios selectivos y diferenciales. Los medios selectivos mas comunes utilizan inhibidores para las bacterias de origen fecal que acompañan a E.coli (como enterococos) o para bacterias que no son de origen fecal. Los medios sólidos generalmente contienen sales biliares y cristal violeta y los medios líquidos que se emplean para el recuento por número más probable de coliformes en alimentos y agua (Caldo Lauril Sulfato, Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante y caldo Escherichia coli) contienen lauril sulfato de sodio o sales biliares y verde brillante. Estos medios son generalmente diferenciales porque tienen además lactosa - E.coli fermenta lactosa y glucosa- y un modo para detectar su fermentación (indicadores de cambio de pH) o la producción de gas en medio líquido (campanas de Durham). Las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros debido a que el inhibidor del medio puede detener el crecimiento de los otros m.o. contaminantes sin eliminarlos. Se debe reaislar en un medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En el reaislamiento se debe observar si hay colonias con una o varias morfologías y se debe proseguir el análisis sólo con las colonias con morfología macro y microscópica características de la especie que se busca aislar. Problema En jarabes preparados a partir de extractos naturales de plantas la Farmacopea Europea exige ausencia de E.coli en 1 mL de jarabe. Para realizar dicho análisis se realiza un enriquecimiento en caldo lactosa, se aislan colonias de dos tipos en medio Mac Conkey incubado entre 43-45ºC: 1) colonias rojas con halo de precipitación alrededor, 2) colonias incoloras sin halo de precipitación. ¿Cuáles son las colonias que podrían pertenecer a la especie E. coli? Ud. recibirá un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol. ¿Cómo crecería una cepa de E. coli en ese medio? ¿Que ensayos adicionales a la observación de la colonia y de sus características en el medio de cultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede ser E. coli? ¿Que otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, la cepa que tiene en ese reaislamiento podría pertenecer a la sección en la cual el Manual de Bergey ubica a E.coli? ¿En que Familia se ubica a E. coli? ¿Que propiedades debería determinar para distinguir esa Familia de las otras de la misma sección? ¿En que caso puede afirmar que tiene un cultivo puro? ¿Puede continuar con las etapas de identificación? Si no puede, ¿que procedimiento realizaría? De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (colonias típicas en el medio selectivo) indica la presencia probable de E.coli. Para la confirmación se recomienda el test para la producción de indol y otras pruebas bioquímicas. ¿En qué consiste la prueba de indol? ¿Qué resultado espera para esta prueba si fuese E.coli? Utilice la tabla de pruebas bioquímicas para Enterobacterias resumida del Manual de Bergey. (recuerde que el número que aparece en la tabla es el % de cepas que dan un resultado positivo para ese test en el total de cepas analizadas) Podría “perderse” alguna cepa de E.coli si realizara sólo esta prueba? Es decir una cepa que, siendo E.coli, no la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atípico en la producción de indol.


La recomendación de la American Public Health Association (APHA) para el análisis de alimentos incluye tres pruebas además del indol: Rojo de Metilo, Voges –Proskauer y Citrato. Las 4 pruebas se resumen en la sigla IMViC (Indol, Metilo, Voges, Citrato). ¿Qué cree que se logra incluyendo mas pruebas bioquímicas? ¿En qué consisten estas pruebas? ¿Qué resultados espera para E.coli? Los manuales de métodos del APHA dan por identificada una cepa como Ecoli si el resultado de las pruebas IMViC es ++-- (Indol y Rojo de Metilo positivos, VP y Citrato negativos) o si es -+--. ¿Podría “perderse” una cepa de E.coli en este caso? ¿Podría darse el caso al revés, es decir que identifique como E.coli una cepa que no es? Problema II (Salmonella) Antecedentes Las bacterias del género Salmonella son bastones Gram negativos que no reducen sulfato cuyo habitat es el intestino humano y de animales. Aunque no todas las especies de Salmonella son igualmente patógenas, todas son importantes para la salud pública, y por tanto el procedimiento de análisis debe estar dirigido a recuperar cualquier especie que pertenezca a este género. En especialidades farmacéuticas y alimentos –a diferencia de muestras clínicas- se espera un número bajo de estas bacterias, que además pueden estar fisiológicamente dañadas debido al procesamiento y almacenamiento de la muestra. Debido a ello en el análisis de estas muestras se incluyen siempre etapas de enriquecimiento. El aislamiento generalmente se realiza en mas de un medio de cultivo (no todas las especies de Salmonella crecen en un solo tipo de medio sólido). Los medios selectivos más comunes utilizan inhibidores como el colorante verde brillante (inhibe Gram positivos) o sales biliares para bacterias que no son de origen fecal. Varios de estos medios son diferenciales porque tienen además lactosa o xilosa y un modo para detectar su fermentación (indicadores de cambio de pH) o lisina y la detección de la decarboxilación. La etapa siguiente es determinar si las colonias aisladas pertenecen o no al género Salmonella. Las pruebas bioquímicas y la serología se usan de rutina para la identificación presuntiva en laboratorios de análisis microbiológico. La identificación definitiva se realiza en centros de referencia por serología. Recuerde que las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros debido a que el inhibidor del medio no elimina los otros m.o. contaminantes. Se debe reaislar en un medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En el reaislamiento se debe observar si hay colonias con una o varias morfologías y se debe proseguir el análisis sólo con las colonias con morfología macro y microscópica características de la especie que se busca aislar. Problema En preparaciones farmacéuticas que contienen plantas medicinales la Farmacopea Europea exige ausencia de Salmonella en 10 g de la preparación. Para realizar dicho análisis se realizan dos etapas de enriquecimiento: una en caldo lactosa y la siguiente en un caldo selectivo con tetrationato, bilis y verde brillante. A partir de allí se aislan colonias en mas de un tipo de medio de cultivo selectivo: en uno de ellos, el Agar Verde Brillante (que tiene además lactosa, sacarosa y rojo fenol), crecen dos tipos de colonias: 1) colonias que viran el medio a amarillo, 2) colonias incoloras que no viran el medio a su alrededor. ¿Cuáles colonias podrían pertenecer al género Salmonella? Ud. recibirá un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol. ¿Cómo crecería una cepa de Salmonella en ese medio? ¿Qué ensayos adicionales a la observación de la colonia y de sus características en el medio de cultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede ser una especie de Salmonella? ¿Qué otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, ¿la cepa que tiene en ese reaislamiento podría pertenecer al grupo de bacterias en el cual el Manual de Bergey ubica a las especies de Salmonella? ¿En qué Familia se ubica a las especies de Salmonella? ¿Que propiedades debería determinar para distinguir esa Familia de las otras de la misma sección?


¿En qué caso puede afirmar que tiene un cultivo puro? ¿Puede continuar con las etapas de identificación? Si no puede, ¿que procedimiento realizaría? De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (colonias típicas en los medios selectivos) indica la presencia probable de bacterias del género Salmonella. La identificación presuntiva se realiza con la prueba bioquímica llamada Tripe Sugar Iron (TSI). ¿En que consiste esta prueba? ¿Que resultados espera para las distintas especies del género Salmonella? Utilice la tabla de pruebas bioquímicas para Enterobacterias resumida. ¿Podría “perderse” alguna cepa de Salmonella? Es decir una cepa que, siendo Salmonella sp., no la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atípico en esta prueba. La Farmacopea Europea recomienda la realización de otras pruebas bioquímicas y pruebas serológicas para la identificación definitiva. La recomendación de la American Public Health Association (APHA) para el análisis de alimentos sigue un procedimiento similar para enriquecimiento y aislamiento pero usa otras pruebas bioquímicas como la producción de indol, y la descarboxilación de lisina entre otras. Recuerde además que, durante el aislamiento, se eligieron para la identificación las cepas no fermentadoras de lactosa. ¿Que cree que se logra incluyendo mas pruebas bioquímicas? ¿En que consisten estas pruebas? Que resultados espera para las especies de Salmonella? ¿Podría “perderse” alguna cepa de Salmonella en este caso? ¿Podría darse el caso al revés, es decir que identifique como una especie del género Salmonella a una cepa que no lo es? Problema III (P. aeruginosa) Antecedentes En el curso de una investigación epidemiológica de varios casos de infección por Pseudomonas aeruginosa en una sala de atención de quemados, se realizaron cultivos de los posibles fuentes o reservorios de la bacteria en el ambiente. Ud. recibirá una placa de Agar Cetrimide sembrada con uno de los antisépticos analizados, cultivada durante 24 horas a 37C, en aerobiosis. Se solicita que determine si el antiséptico pudo ser el reservorio o fuente de la cepa de Pseudomonas aeruginosa que provocó los casos de infección. ¿Qué tipo de medio de cultivo es el Agar Cetrimide? ¿Las bacterias que crecen en él requieren factores de crecimiento? ¿Requiere altas concentraciones de NaCl? ¿A cuál sección del Manual Bergey corresponde la o las bacterias en estudio? ¿Podría tratarse de una bacteria aerobia estricta? Como haría para confirmar que se trata de una bacteria aerobia estricta? ¿Cuál es el fundamento de los ensayos King A y King B? Si una cepa creciera en Agar Cetrimide con producción de un pigmento difusible de color azul, realizaría ambos ensayos? ¿Es el antiséptico analizado un posible reservorio de la cepa que causó las infecciones en los pacientes? El antiséptico del cual se obtuvo este aislamiento fue una solución de un compuesto de amonio cuaternario. ¿Es posible suponer que fuera un reservorio para P. aeruginosa? Problema IV (S. aureus) Antecedentes Las bacterias pertenecientes a la especie Staphylococcus aureus son cocos Gram positivos, que pueden ser patógenos para el hombre. Las principales afecciones que producen son intoxicación


alimentaria, por producción de una toxina termoresistente en alimentos, e infecciones de piel. Existen seres humanos que son portadores sanos de S. aureus, el cual se aloja en narinas y piel. A partir de esas fuentes, puede llegar a los alimentos donde su proliferación constituye un riesgo potencial para la salud pública por la posible producción de enterotoxinas. Las siguientes situaciones llevan a analizar los alimentos para determinar la presencia o el número de células de S. aureus: A) confirmar si es el agente causal de una enfermedad alimentaria. B) determinar si un alimento o ingrediente es una fuente potencial de estafilococos enterotoxigénicos C) demostrar contaminación post-proceso, que generalmente se debe a contacto humano con alimentos procesados. Los alimentos que se sospecha fueron vectores de una toxiinfección alimentaria debida a S. aureus frecuentemente presentan altos números de células del m.o.. En cambio, si se sospecha una contaminación post proceso, puede esperarse una población menor. En general S. aureus no es el único m.o. presente en el alimento, por lo cual debe emplearse medios selectivos para su aislamiento y recuento. Las especialidades farmacéuticas también se analizan para detectar S. aureus, debido a la posibilidad de causar infecciones en piel y mucosas. En este tipo de muestras, por lo general se exige ausencia de S. aureus en 1 g de producto. Los medios selectivos contienen inhibidores de otros m.o., de modo de impedir el desarrollo de otras especies. Los agentes selectivos más comúnmente usados en medios para S. aureus son NaCl (S. aureus puede crecer en presencia de concentraciones entre 5.5% y 10%) y telurito de potasio (K2TeO3, S. aureus reduce el telurito de potasio, produciendo colonias negras), y otros cloruro de litio, polimixina, azida de sodio y neomicina. Debe considerarse que el uso de los agentes selectivos no garantiza la completa inhibición de otros m.o., como por ejemplo miembros de los géneros Bacillus, Micrococcus, Streptococcus y aún levaduras. Por esta razón, la aparición de colonias típicas no es suficiente y debe confirmarse si dichas colonias típicas desarrolladas en placas de medio selectivo verdaderamente pertenecen a la especie S. aureus. Problema Una familia presenta síntomas de toxiinfección alimentaria 2 a 4 horas después de comer, con náusea, vómitos, diarrea y dolor abdominal. Esta sintomatología puede deberse al desarrollo de elevados números de S. aureus y formación de toxina en el alimento ingerido. Se decide analizar una muestra remanente de queso artesanal que formó parte de la comida, de modo de determinar si el m.o. responsable fue S. aureus. ¿Qué método puede usarse para aislar S. aureus de dicha muestra si el m.o. estuviera presente en números altos? A Ud. se le entregará una placa de MSA proveniente de esta muestra. Considerando que las bacterias del genero Staphylococcus son fermentadoras de glucosa y manitol. ¿Es posible afirmar que en la muestra había S. aureus? ¿Por qué? En caso de que haya que continuar el análisis: ¿cómo determinaría si las colonias típicas corresponden a S aureus o no? ¿Qué morfología y reacción al Gram presenta el género Staphylococcus? ¿Cómo se clasifican las bacterias de este género según sus relaciones con el oxígeno? ¿Cómo puede diferenciarse el género Staphylococcus de otros relacionados? (Deberá recurrir a Tablas del Manual de Bergey que tendrá para consulta en clase) ¿Cómo puede diferenciarse S. aureus de otras especies del género Staphylococcus?


DETERMINACIONES CUANTITATIVAS DE BIOMASA - RECUENTOS

Se propone la siguiente clasificación: 1. Determinación del número de microorganismos o recuentos Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado Método de las diluciones múltiples o del Número Más Probable Filtración por membrana e incubación de ésta sobre medio de cultivo sólido Recuento microscópico directo de los microorganismos, ya sea en frotis o en cámaras Filtración por membrana, coloración del filtro, y conteo al microscopio. Conteo electrónico, usando contadores de partículas. 2. Determinación de la masa celular Medida de la masa Medida del volumen Determinación del contenido de N Turbidimetría Nefelometría 3. Determinación de la actividad celular Determinación de una actividad enzimática Determinación de un metabolito Medida del consumo de oxígeno Medida de ATP Calorimetría Medida de impedancia Radiometría (de CO2) Al momento de elegir la técnica a emplear, se debe tener en cuenta el tipo de muestra sobre la que se va a trabajar, porque es posible que algunos de los métodos no sean aplicables. Cuando es necesario llevar a cabo diluciones, la toma y preparación de la muestra se realiza de la manera descrita en muestreo.


DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS RECUENTO EN PLACA Permite determinar el número de m.o. presentes en una muestra en base a que se desarrollen en medio de cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan por este método sólo las células microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmósfera, temperatura). Como las colonias pueden originarse tanto de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (ufc) para expresar el resultado. Además, a los efectos de que todas las células que están en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que la incertidumbre del método sea menor, se establece que las condiciones óptimas de recuento se dan cuando desarrollan entre 25 y 250 colonias por placa en medios no selectivos (otros autores indican 30 a 300) para recuento de bacterias y levaduras. Para hongos filamentosos se considera generalmente que el rango adecuado de colonias a contar está entre 5 a 50 ufc por placa dado que el tamaño de una colonia filamentosa es muy superior al de la mayoría de colonias de bacterias y levaduras. Si fuera posible y necesario se puede repetir el recuento para obtener placas con un número de colonias óptimas. Procedimiento La preparación de la muestra se realiza como para cualquier método utilizando diluyentes adecuados. Se preparan diluciones decimales sucesivas (relación muestra/volumen de dilución 1 en 10), partiendo en general de 10 g o mL de muestra en 90 mL de diluyente para la primera dilución (1/10 o 10-1 o -1). Para la segunda dilución (1/100 o 10-2 o-2) se toma 1 mL de la dilución 10-1 y se descarga en 9 mL de diluyente y así sucesivamente. Se descarta la pipeta luego de cada descarga y se toma una nueva para preparar la siguiente dilución. Cada vez que se prepara una dilución en necesario homogeneizarla adecuadamente para lograr una distribución de los m.o. en todo el volumen de dilución. Esto se logra por agitación (si es un frasco con tapón hermético se realiza con agitación formando un arco de aprox. 30 cm mediante un movimiento de inversión durante 25 veces, si es un tubo puede emplearse con Vortex). También puede cargarse y descargarse un determinado volumen de la dilución con una nueva pipeta (al menos tres veces), y finalmente tomar el volumen deseado. Según la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar. Cuando se esperan cargas altas, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas Ej.: 1:10 (10-1 o -1), 1:100 (10-2 o -2), 1:1000 (10-3 o -3). Una vez preparadas las diluciones, se siembra dentro de los 15 minutos siguientes. ANTES DE PROCEDER A LA SIEMBRA SE ROTULAN LAS PLACAS CON LOS SIGUIENTES DATOS: Identificación de la muestra: Nombre y/o código Dilución, Volumen sembrado Superficie o incorporado Fecha Operador Siembra incorporada Se procede de la dilución mayor a la menor, y se deposita 1 mL de cada dilución en placas estériles, vacías, por duplicado. Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45ºC en baño o estufa cuidando de no volcar agar fuera de la placa o sobre la tapa de la misma. Se agita suavemente moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular, horario y antihorario y hacia delante y atrás.


En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en general no más de 3 mL por placa. Siembra en superficie Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 mL de cada dilución. Se realiza duplicado para cada dilución. Se puede emplear la misma pipeta para todas las diluciones si se comienza por la más diluida. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas para que se absorba, usando rastrillo estéril. Medio de cultivo Se elige según el tipo de microorganismo que se quiere contar pudiendo emplearse medios selectivos o no selectivos. Incubación Una vez enfriado el agar en el caso del recuento incorporado, y absorbida la muestra en el caso de recuento en superficie, las placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde según los microorganismos a contar, durante el tiempo propuesto en la técnica correspondiente. Interpretación Finalizado el período de incubación se observa con buena luz a efectos de visualizar las colonias puntiformes y diferenciar cualquier partícula de muestra que pueda haber. Si molesta borrar la escritura. Contar las colonias desarrolladas por placa. Se cuentan como colonias individuales, todas aquellas que disten de las colonias próximas una distancia al menos igual al diámetro de la colonia más pequeña. Cuando se utilizan medios NO SELECTIVOS se procede de la siguiente forma (para otros casos se sugiere consultar Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 1992, 3rd Ed):

1) Placas que tengan entre 25 y 250 colonias Se hace el cálculo multiplicando por la inversa de la dilución y por la inversa del volumen sembrado y luego se promedian –si corresponde- los valores de las distintas placas y

10 mL ó g 1 mL 1 mL 1 mL

90 mL

9 mL 9 mL 9 mL 9 mL

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

10-4 10-5 1 0 - 6

0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

1 mL

MUESTRA


diluciones. Si sólo una de las placas de los duplicados contiene 25 a 250 colonias contar igualmente ambas placas y promediar SI ES POSIBLE CONSIDERAR SOLAMENTE ESTAS PLACAS PARA INFORMAR EL RECUENTO. 2) Ninguna placa con 25 a 250 colonias Sin ninguna de las placas contienen 25 a 250 colonias seleccionar las placas que contengan el número de colonias mas cercano a 250, contar, hacer el cálculo e informar el resultado como ESTIMADO 3) Todas las placas con menos de 25 colonias Se hace el cálculo multiplicando por la inversa de la dilución y por la inversa del volumen sembrado y se informa igualmente el resultado como ESTIMADO.. Si no hubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como: Menor que 1 o 10 (según sea incorporado en superficie) por la inversa de la dilución menor. 4) Todas las placas con más de 250 colonias Si no es posible distinguir colonias individuales (crecimiento confluente) se puede informar el resultado como mayor de 250 por la inversa de la dilución mayor y del volumen sembrado. Si es posible distinguir colonias individuales se cuentan las colonias en una superficie conocida de la placa y luego se extrapola a la superficie total de la placa: 65 cm2 para las de vidrio comunes, o 57 cm2 para las de plástico y se informa el resultado como ESTIMADO.

Se siguen las siguientes reglas: • Si hay menos de 10 colonias por cm2, se cuentan 12 cuadrados de 1 cm de

lado: 6 consecutivos horizontales y 6 consecutivos verticales. Se promedia el número de colonias contadas y según el tipo de placa se multiplica por 65 o 56 para el resultado de toda la placa.

• Si hay más de 10 colonias por cm2, se cuentan 4 cuadrados de 1 cm de lado, y el promedio se multiplica por 65 o 56 según el tipo de placa.

• Si hay más de 100 colonias en 1 cm2, no se cuentan sino que se estima el resultado como mayor de 6500 o 5600 por placa.

Una vez estimado el número de colonias por placa, se aplica el factor de conversión para expresar el resultado por gramo o mL de muestra, de acuerdo al método (incorporado o superficie), y a las diluciones sembradas.

SPREADERS O COLONIAS EXTENDIDAS Hay tres tipo de “spreaders”: a) cadena de colonias que no pueden distinguirse separadamente y que pueden haberse originado a partir de la desintegración de un acumulo de bacterias, b) los que se desarrollan en un film de agua que se forma entre el fondo de la placa y el agar y c) los que se desarrollan en el film de agua que se forma en el borde o sobre la superficie del agar. Estos dos últimos tipos se originan debido a la humedad acumulada en el lugar donde se originó la colonia y probablemente representa el crecimiento a partir de una sola célula. Cuando el spreader cubre más del 50% de la placa, ésta no debe contarse. Cuando el spreader cubre una superficie menor del 50%, se cuentan las colonias en el resto de la placa, SOLO si están uniformemente distribuidas, se calcula el recuento por cm2, luego se extrapola al resto de la placa multiplicando por 65 o 56 y se expresa el resultado como ESTIMADO. Si en todas las placas hay spreaders se informa: Spreaders Todas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casos anteriores, (ej.: contaminación, mal funcionamiento del medio), se informa como: "Accidente de laboratorio" Cuando se emplean medios SELECTIVOS, el número de colonias que se considera óptimo para contar, suele ser menor de 250, es necesario referirse a la técnica correspondiente (de referencia) a los efectos de la interpretación de los resultados.


Expresión de los resultados: Se informan los resultados de recuento con sólo DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS, redondeando los valores cuando corresponda. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata superior si la tercera cifra es 6 ,7, 8 o 9. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata inferior si la tercera cifra es 1, 2, 3 y 4. Si la tercera cifra es 5 redondear hacia arriba si la segunda cifra es impar y hacia abajo si es par Ej.: 137 se informa 140 ó 1,4 x 102 145000 se informa 1,4 x 105 En el informe de un recuento en placa se expresa: Recuento de ..............(tipo de microorganismo) = X u.f.c. /g o mL o Recuento estimado de ..............(tipo de microorganismo )= X u.f.c. /g o mL.

Nº de colonias

dilución Muestra

10-2 10-3

Recuento (ufc/g o mL) Regla

228a 28 A

240 26 2,5 x 104 1

175 16 B

208 17 1,9 x 104 1

275 25 C

280 35 3,0 x 104 1

18 2 D

16 0 1,7 x 103 estimado 3

0 0 E

0 0 <100 3

>250 >250 F

>250 >250 > 2,5 x 105 estimado 4

287 23 G

263 19 2,8 x 104 estimado 2

>250 7150b H >250 spreader

> 6,5 x 106 estimado 4

>250 870c I >250 830c

8,5 x 105 estimado 4

a se indican subrayados los datos que se utilizaron para informar el recuento.

b estimado por el método de los cuadrados; se contaron más de 100 colonias por cm2.

c estimado por el método de los cuadrados (entre 10 y 100 colonias por cm2).

Ejemplos de cálculo de resultados de recuento cuando se siembrandos placas por dilución en placas de 9 cm.


VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE AMBOS MÉTODOS

Incorporado Superficie

Mayor cantidad de muestra. Menor cantidad de muestra

Menor error Mayor error

Mejor aprovechamiento de nutrientes Peor aprovechamiento de nutrientes

Dificultades al subcultivar colonias Facilidad para subcultivar colonias

Visualización de colonias dificultosa Fácil visualización de colonias

Temperatura del agar puede afectar la viabilidad de algunos m.o. No se afectan los m.o. termosensibles

Se desarrollan m.o. microaerofilicos En aerobiosis sólo crecen aerobios y anaerobios facultativos

NUMERO MAS PROBABLE (NMP) O METODO DE LOS TUBOS MULTIPLES Es un método de recuento de microorganismos viables. El fundamento de este método es inocular tubos de medios líquidos apropiados con diluciones seriadas de la muestra tales que para alguna de esas diluciones en los inóculos no se lleven células viables. De esta forma una vez incubados los tubos se obtendrá crecimiento para alguna de las diluciones mientras que no lo habrá para otras. Ese patrón de crecimiento y no crecimiento permite estimar la población microbiana presente en la muestra. Los resultados son interpretados en base a una distribución de Poisson y se emplean tablas ya preparadas. Las tablas están construídas para ciertas condiciones (siembras por triplicado o quintuplicado de cada una de tres diluciones seriadas al décimo) y dan para cada conjunto de resultados positivos un índice de NMP así como los valores para los intervalos de confianza del 95%. Así, por ejemplo si se quiere usar la tabla III para series de tres tubos por dilución serán necesarios un total de nueve tubos. Los medios líquidos a usarse dependen del tipo de m.o que se desea contar pudiendo ser selectivos o nutrientes. En función de ésto se pueden considerar como positivos aquellos tubos en los que:

1) Haya crecimiento, que se detecta como aparición de turbidez (siempre que la muestra sembrada no enturbie el medio). 2) Se detecten productos del metabolismo del m.o.:

a) producción de gas, que se observa en un pequeño tubo invertido (campana de Durham) en el tubo. c) viraje de indicador (de pH, de potencial redox, etc). d) producción de pigmento. e) otros (reducción de NO3

-, producción de indol, hidrólisis de una proteína, etc) Ocasionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o presuntamente positivos a otro tubo (con el mismo u otro medio) o a una placa a efectos de confirmar el resultado. Los resultados se expresan como NMP de ....... (tipo de m.o.) / cantidad (g ó mL) Este método es especialmente útil para determinar cargas microbianas bajas, el límite de detección en las condiciones de la Tabla IV es <2/100 mL, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando diluciones apropiadas. Ejemplo de siembra: Se quiere hacer un recuento de microorganismos mesófilos por técnica de NMP con series de tres tubos. La muestra es líquida y se supone tiene una carga de 100 m.o..


mesófilos/ml. El medio a usar es TSB y las condiciones de incubación serán a 35ºC durante 24 a 48 horas. La siembra se puede realizar de la siguiente forma:

- opción 1: 10 mL de la dilución 10 -2 en la primer serie de tubos (medio formulado al doble de concentración), 1 mL de la dilución 10 -2 en la segunda serie de tubos y 0,1 mL de la dilución 10 -2 en la tercer serie de tubos.

- opción 2: 1 mL de la dilución 10 -1 en la primer serie de tubos, 1 mL de la dilución 10 -2 en la segunda serie de tubos y 1 mL de la dilución 10 -3 en la tercer serie de tubos.

Con cualquiera de estas opciones se están colocando 10 mo en la primer serie de tubos, 1 mo en la segunda y probablemente ninguno en la tercera. Nota: los volúmenes posibles de ser usados en esta técnica para inocular los tubos son 10, 1 ó 0,1 ml. En el caso de usarse 10 ml los medios deben ser de doble concentración. Ejemplos de interpretación y expresión de resultados Ejemplo 1: Nº de tubos sembrados: 3 3 3 Volumen por tubo (mL) 1 1 1 Dilución de la muestra: 10-2 10-3 10-4 Nº Tubos positivos 3 1 0 El resultado 3-1-0 se busca en tabla y se obtiene un valor de 43/100 mL. Como la Tabla III está construída inoculando con 10 mL la primer serie de tubos, 1mL para la segunda y 0,1 mL para la tercera se debe corregir el valor ya que no estamos en las mismas condiciones. En este caso estamos sembrando mil veces menos en la primera serie de tubos (1 mL de 10 -2 , equivalente a 10 mL de la dilución 10 -3), por lo tanto el factor a utilizar es 1000 y se debe multiplicar el valor obtenido de la tabla. El resultado a informar es entonces: NMP de (tipo de m.o) = 430/mL.

1 mL 1 mL 1 mL

9 mL 9 mL 9 mL

- 10-2

1 mL 1 mL 1 mL

0,01mL muestra 0,001mL muestra

+ + + + − − − − −

0,0001mL muestra

3 1 0

10 mL ó g

90 mL

10-1

MUESTRA 10-3 10-4

EQUIVALENTE A:

Lectura de los tubos:


Una manera general de calcular el resultado es multiplicar el valor de tablas por el inverso de la dilución sembrada en la serie del medio si con ella se usó 1mL para inocular los tubos. Ej: Ejemplo 2: Nº de tubos sembrados: 5 5 5 Volumen de muestra en c/u (mL): 10 1 0,1 Dilución de la muestra: 10-1 10-1 10-1 Nº Número de tubos positivos: 2 0 0 (dos tubos positivos para la primera dilución, ninguno en las siguientes) De la tabla IV surge el valor: 5/100 mL. Como la siembra no esta realizada en las condiciones de la tabla debe aplicarse un factor de corrección. El resultado final se informa: NMP de ...... (tipo de m.o):= 5 x 1/10-1= 50/100 mL ó 0,5/mL 100 Si la muestra es agua es habitual informar el resultado por 100 mL. Es de fundamental importancia antes de leer la tabla, asegurarse que esté construida para condiciones similares a las de trabajo, que sea para igual número de tubos por serie, y para cantidades de muestra que sean múltiplo o submúltiplo ya que hay variedad de tablas según el número de tubos y diluciones a sembrar. La corrección se hace utilizando proporcionalidad inversa. Dado que la distribución de las células obedece una distribución de Poisson puede calcularse el número de células promedio de la dilución sembrada cuando no se trabaja en las condiciones más comunes para las que existen tablas, usando la siguiente ecuación: NMP/g o mL = ___________Nº de tubos positivos____________________ (mL o g de muestra X mL o g de muestra) en tubos negativos en todos los tubos VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL MÉTODO: Este método es especialmente útil para determinar cargas microbianas bajas, el límite de detección en las condiciones de la Tabla IV es <2/100 mL, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas... Para sólidos como no puede ponerse 10 g en la primer serie de tubos y se deben colocar 10 mL de la -1, el límite de detección resulta 10 veces mayor que para los liquidos. (<20/ 100g) Asimismo, es el único método a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvos insolubles, en los que no es aplicable el método de filtración ni es recomendable el recuento en placa debido a la presencia de partículas.

3 1 0 en Tabla III 43/ 100 mL NMP de tipo de m.o/ 100 mL = 43 x 1/dilución de la serie del medio = 43 x 1/10-3 = 430/mL ó 4,3 x 102/mL 100 100


Se prefiere también este método cuando los m.o. son de lento crecimiento, cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecación, etc.) o para los que no crecen en medio sólido. Es posible enumerar también por este método m.o. anaerobios utilizando en los tubos medio prerreducido, que se tapan con vaselina-parafina luego de inocular, e incuban en condiciones aerobias. Desventajas: Debido a que este método es menos preciso (se obtiene una estimación de la carga microbiana) no es el de elección en caso de poder emplearse recuento en placa o filtración por membrana.

FILTRACION POR MEMBRANA Este método consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra líquida, o disuelta en agua o en un solvente apropiado (miristato de isopropilo) a través de un filtro de membrana estéril (diámetro 50 mm, poro 0.45 μm), colocado en un equipo de filtración. Luego de enjuagar con soluciones estériles apropiadas se retira el filtro, y se lo coloca sobre la superficie de un medio de cultivo sólido dispensado en una placa de Petri y se incuba. Los filtros pueden ser de distintos materiales; en microbiología generalmente se emplean filtros de nitrato o acetato de celulosa, y pueden tener bordes hidrofóbicos, que minimizan la adsorción de conservadores y antimicrobianos. Luego de transcurrido el tiempo de incubación, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. Se considera que las condiciones óptimas del método se dan cuando desarrollan entre 20 y 200 colonias en el filtro. Se utilizan filtros reticulados, y existen reglas para el conteo: 1) Si hay 1 o 2 colonias por cuadrado del retículo, o menos, se cuentan todas. 2) Si hay entre 3 y 10 por cuadradito, se cuentan 10 cuadrados, y se promedia, multiplicando por 100 para obtener el número de colonias en el filtro (se multiplica por 100 porque el arrea del cuadrado representa la centésima parte del área total del filtro). 3) Si hay entre 10 y 20 se cuentan 5 cuadrados y promedia, multiplicando luego por 100. 4) Si hay más de 20 se considera >2000 por filtro Toda vez que se utilice el promedio por cuadrado, el recuento se informa como ESTIMADO. Ventajas y desventajas: Sirve para determinar cargas muy bajas, pues se puede filtrar volúmenes de hasta 500 mL por vez. Es además el método de elección para muestras líquidas o solubles que contienen agentes antimicrobianos ya que no es necesario neutralizarlos. Expresión de los resultados: Una vez conocido el número de colonias por filtro, se expresa el valor en u.f.c. al igual que en el recuento en placa expresándolo por gramo, o mililitro de muestra.


RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO Este método permite determinar el número de células microbianas, por observación a través del microscopio. La muestra puede utilizarse tal cual, (leche, o cultivos puros en medio líquido), o puede prepararse una dilución tal como se realiza para otros métodos de recuento. Se basa en contar microorganismos en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis coloreados, cámaras del tipo de las de contar glóbulos, o las especialmente diseñadas para contar hongos en alimentos como la cámara de Howard. Se determina el número TOTAL de células presentes (VIABLES Y NO VIABLES) Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados metabólicos de las células. Por ejemplo en un recuento en cámara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las células VIABLES (no absorben el colorante, se verán transparentes) de las NO VIABLES (absorben el colorante y se verán azules). Recuento sobre frotis coloreado Se marca sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, un cuadrado de 1 cm de lado. Sobre la superficie opuesta del portaobjetos, se deposita en el centro 0,01 mL de muestra ya sea con ansa calibrada o con pipeta. Se extiende por todo el cuadrado con ansa. Se deja secar en posición horizontal. Se fija y colorea, ya sea por Gram o con azul de metileno 1 minuto (método de Breed para leche). Se observa por inmersión, contando los microorganismos en cada uno de varios campos. El número de campos a contar depende del número de microorganismos por campo y del factor del microscopio. Se transcribe la tabla que se propone para el recuento directo en leche (Standard Methods for the Examination of Dairy Products APHA) Número de campos a contar según el factor del microscopio y el número de microorganismos:

Factor del microscopio Microorganismos por campo

300000 400000 500000 600000

Menos de 1 30 40 50 60 1 a 10 20 20 20 30 Más de 10 10 10 10 20 Cálculo del factor del microscopio Con objetivo de 40 x, o 100 x, se mide el radio del campo utilizando un portaobjetos calibrado, o el retículo de una cámara cuenta glóbulos. Si se utiliza el de 40 x, luego debe hacerse la corrección utilizando el factor 40/100 para llevarlo al aumento de trabajo. Se calcula el área del campo: π r2 El número de campos por cm2 es: 1 / π r2


Si se extendió en 1 centímetro cuadrado 0,01 mL de muestra, el número de campos por mililitro, llamado Factor del Microscopio (FM), se calcula de la siguiente forma: FM = 100 / π r2 donde r se expresa en cm, o FM = 10000/ π r2 con r en mm. Expresión de resultados Una vez contado el número de microorganismos en los campos que corresponde, se promedia, y multiplica por el Factor del microscopio; de esa forma se obtiene el resultado que se expresa en términos de: Recuento microscópico directo = N microorganismos por mL Recuento en cámara de Neubauer Es una cámara que se utiliza para contar glóbulos (En E se cuentan eritrocitos y en L los leucocitos) y está diseñada de manera de contener una cantidad fija de líquido. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada uno de ellos está, a su vez, dividido en 16 cuadrados. Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros laterales de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cámara. Esto determina que el líquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3. Ventajas del método: Es rápido Los frotis se pueden guardar Las exigencias de equipo son mínimas Se pueden observar las diferentes morfologías de los microorganismos. Se observan tanto los microorganismos viables como los no viables Desventajas del método: La cantidad de muestra analizada es poca Provoca cansancio del operador Sólo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000 por mL. Es difícil distinguir los microorganismos de las partículas de muestra Una inadecuada distribución de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores.


DETERMINACIÓN DE LA MASA CELULAR TURBIDIMETRÍA Este método da información sobre el contenido de macromoléculas, y no sobre el número de células. En el laboratorio de microbiología se usa un colorímetro, o un espectrofotómetro y se mide la absorbancia de la suspensión de microorganismos en comparación con un blanco que es el medio esterilizado, y sin sembrar. Cuanto mayor es el número de células en suspensión, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio. Se cumple una ley similar a la de Lambert-Beer y expresando la relación en términos de masa microbiana y absorbancia, la ecuación es la siguiente: A= k x W donde: Absorbancia k: constante W: masa celular La gráfica correspondiente construida con valores reales muestra una desviación a medida que aumenta la masa microbiana. Para utilizar la medida de la absorbancia como método de recuento, es necesario hacer para cada microorganismo una curva de calibración, midiendo el número de microorganismos por otro método de recuento. El método se emplea fundamentalmente para preparar inóculos, cuando se trabaja con cultivos puros.

A

W


Escala de Mac Farland Existe la posibilidad de estimar cargas altas de microorganismos, comparando a simple vista con una escala formada por tubos numerados de 1 a 10 y elaborada con diferentes cantidades de sulfato de bario. Se conoce la cantidad aproximada de células bacterianas a que corresponde cada tubo, y de esa forma se puede estimar la cantidad de microorganismos presentes. Este método sólo da una estimación del número de m.o. (viables y no viables) y sirve sólo para cargas altas. Por otra parte, es muy rápido. Tubo Millones de bacterias/ mL 1 300 2 600 3 900 4 1.200 5 1.500 6 1.800 7 2.100 8 2.400 9 2.700 10 3.000


ALGUNAS APLICACIONES DE RECUENTOS

Microorganismos indicadores Los métodos usados para el aislamiento y el recuento de los microorganismos patógenos en agua, alimentos, etc. pueden no ser eficaces debido a que dichos microorganismos se encuentran en muy baja cantidad, sobre todo en presencia de números altos de otros microorganismos, o que tengan una distribución irregular en el producto. Aún cuando se cuenta con métodos sensibles, en general son largos y costosos; además, hay patógenos que no pueden determinarse en laboratorios no especializados, como, por ejemplo, el virus de la hepatitis A. Estas dificultades han hecho que se utilicen grupos de microorganismos de detección y enumeración más fáciles y cuya presencia en cierto número se considera como una indicación de que la muestra estuvo expuesta a condiciones que pudieron determinar la llegada a la misma de microorganismos peligrosos y/o permitir la proliferación de especies patógenas. Estos grupos de microorganismos se denominan indicadores. Se usan como microorganismos indicadores aquellos cuya relación con los patógenos ha sido estudiada. Los indicadores más frecuentes son: - mesófilos aerobios totales o heterótrofos - Enterobacterias - Coliformes totales y fecales - Estreptococos fecales - Enterococos - Clostridios sulfito-reductores AGUA El análisis microbiológico de muestras de agua tiende a determinar la calidad sanitaria de éstas y su aptitud para distintos usos. En general, los métodos utilizados están diseñados de modo de detectar el grado de contaminación del agua con desechos de origen humano y/o animal. Tradicionalmente se han usado ensayos para la determinación de microorganismos indicadores más que para la determinación de patógenos. El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los distintos tipos de agua; el número de coliformes en una muestra se usa como criterio de contaminación y por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma. Los coliformes son bastones Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con formación de gas cuando se incuban 48 horas a 35ºC. Incluye los géneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y especies lactosa positivas de otros géneros. También interesa la determinación de coliformes fecales que representan la fracción de coliformes, en general, de intestinos y materias fecales de hombre y animales de sangre caliente (coliformes termotolerantes). Esto provee información importante sobre la fuente y el tipo de contaminación presente. Un método muy utilizado para el recuento de coliformes en agua ha sido siempre el NMP, pero han ido variando los medios de cultivo, las condiciones y las técnicas de manera de obtener cada vez mayor sensibilidad y precisión hasta hacerlo aceptable como método standard. Los distintos métodos de NMP para coliformes totales se basan, en primera instancia, en una selección de los microorganismos que producen ácido y gas de lactosa a 35ºC. Por ello, el primer paso es siempre


la siembra en tubos de algún caldo lactosado, con o sin inhibidores, con tubo de fermentación para recoger el gas que pueda producirse. A esto sigue una confirmación en un medio líquido selectivo y/o una determinación de los coliformes fecales cuya diferenciación se realiza en base al hecho de que pueda producir gas de lactosa en un medio apropiado cuando se incuba a 44,5ºC mientras que los demás coliformes no. También es muy utilizado el método de filtración por membrana para el recuento de bacterias coliformes totales y fecales. Es un método altamente reproducible, puede usarse para analizar volúmenes de muestra relativamente grandes y se obtienen resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. También se encuentra entre los métodos standard. A los efectos de la filtración por membrana debe replantearse la definición de coliformes: bastones Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, que dan colonias oscuras con brillo metálico en medio Endo, luego de 24 hs. de incubación a 35ºC. La determinación de coliformes fecales por filtración puede hacerse a partir de las colonias desarrolladas en Endo o directamente incubando la membrana en medio m-FC e incubando a 44,5ºC. Para la detección simultánea de coliformes totales y Escherichia coli se puede utilizar la prueba de sustrato enzimático. En este caso el grupo de coliformes totales se define incluyendo todas las bacterias que presentan la enzima beta-D-galactosidasa, que hidroliza el sustrato cromogénico (por ejemplo, ONPG) liberando el cromógeno. Como E. coli se incluyen todas las bacterias que dan positiva la reacción de coliformes totales y que tienen actividad beta-glucuronidasa, que rompe el sustrato fluorogénico (por ejemplo, MUG) que se revela al UV. Este método permite llevar a cabo tanto recuentos como ensayos de ausencia/presencia. También se usa como indicador de contaminación fecal el grupo Estreptococos fecales que incluyen especies de Estreptococos grupo D de Lancefield (Enterococcus faecalis, E. faecium, Streptococcus equinus, S. bovis) y algunas subespecies y una especie del grupo Q (Streptococcus avium). El grupo Enterococos estaría incluído dentro de estreptococos fecales y comprende las especies Enterococcus faecalis y E. faecium y sus subespecies (origen humano) y también se usa como indicador de contaminación fecal en agua. El hábitat normal de los estreptococos fecales es el intestino del hombre y los animales de sangre caliente, por lo tanto son indicadores de contaminación fecal, sobre todo en muestras de lagos, estuarios, ríos, etc. La identificación de las especies puede proporcionar información sobre la fuente de contaminación debido a que algunas especies son específicas de sus huéspedes; por ejemplo, una predominancia de S. bovis o S.equinum indicaría una contaminación por heces no humanas. La información de los estreptococos fecales es útil si se acompaña del índice de coliformes fecales. Existen distintos métodos estándar para su estimación: - NMP - Filtración por membrana El recuento de heterótrofos totales consiste en un método estandarizado para determinar la densidad de bacterias heterótrofas, mesófilas aerobias y anaerobias facultativas en el agua. Así se obtiene información útil que se estudia junto con el índice de coliformes; también se le usa para controlar un proceso de tratamiento de agua o para verificar la calidad del agua tratada, luego de recorrer toda la red de distribución. También interesa estudiar la presencia o el recuento de Pseudomonas aeruginosa en distintos tipos de agua (potables, recreacionales, de industrias, etc.)


Otro grupo de indicadores que ha comenzado a utilizarse en aguas lo constituyen los colifagos. Los colifagos son bacteriófagos de coliformes que se encuentran siempre que haya coliformes totales y fecales. De acuerdo a estudios de correlación entre número de colifagos y coliformes en agua, se podría utilizar el índice de colifagos como índice de calidad sanitaria de agua. Además, como son más resistentes a la cloración que los coliformes, pueden ser mejores indicadores de desinfección que éstos últimos. El método de enumeración se basa en la formación de playas de lisis. Los colifagos (bacteriófagos) infectan y se multiplican en bacterias sensibles a ellos. Esto provoca la lisis celular de esas bacterias y liberación de partículas virales que infectarán a las células bacterianas adyacentes. A medida que éstas bacterias se vayan lisando, se formarán zonas claras, conocidas como “playas de lisis”, entre el crecimiento confluente de la bacteria utilizada. La cepa utilizada en los ensayos es una cepa de E. coli sensible a la infección por colifagos (ATCC 13706). La metodología empleada está descripta en el “Standards Methods for the examination of water and wastewater". BIBLIOGRAFÍA Los métodos de referencia para los análisis antedichos se pueden encontrar en: - "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", APHA-AWWA-WPCF, 20th Ed. Normas UNIT: 856-91, 857-91, 858-91, 893-91, 894-91, 942-93, 943-93. Normas ISO (varias) Las normas vigentes en nuestro país respecto a la calidad microbiológica de los diversos tipos de agua se pueden encontrar en: - Normas de calidad de agua potable...…………… OSE - Reglamento Bromatológico Nacional …………… Ordenanza P.E. 315/94 - Ordenanza Bromatológica Municipal ...................I.M.M (Decreto 27235) - Norma 833/90....................………………………...UNIT - Decreto 253/79 (12/89).....…………………...........Poder Ejecutivo - Decreto 16235 (1974)....…………………..............Junta de Vecinos de Montevideo Para el análisis de diferentes tipos de muestras, y los límites aconsejados se puede consultar: -"Standard Methods for the examination of Dairy Products", APHA, 16 th Ed., 1992. -"Bacteriological Manual", Food and Drug Administration, 7thEd., 1992 -"Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th Ed., 1995. -"Microorganisms in foods 1 & 2" ICMSF. - USP 30. - Reglamento Bromatológico Nacional - Normas UNIT (varias) - Ordenanza Bromatológica Municipal (IMM) - Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 1992, 3rd Ed. - Farmacopea Europea (11111997) y suplementos - Normas ISO (varias)


EJERCICIOS DE RECUENTOS 1) Se realiza un recuento en placa de una muestra sólida por siembra incorporada de 0,5 mL en cada placa en VRBA de las diluciones que se indican. Se incuba 24 hs a 35 ºC. Se cuentan las colonias rojas desarrolladas. Informe claramente los recuentos para los siguientes resultados:

Dilución sembrada y número de ufc Muestra

10-2 10-3 10-4

1 0 0 0

2 190 28 0

3 > 250 114 9

4 5 0 0 2) Se realizaron recuentos por NMP en dos muestras de gelatina en caldo lauril triptosa. Se sembraron tres tubos por dilución, (1 mL de dilución por tubo) y se incubó a 35ºC durante 48 horas. ¿Cómo informaría los recuentos si obtuvo los siguientes resultados?:

Dilución sembrada y tubos positivos Muestra

10-2 10-3 10-4

A 3/3 1/3 0/3

B 3/3 3/3 3/3 3) Diseñar un método de recuento para cada uno de los siguientes casos:

a) Determinar la aceptación o rechazo de una muestra de carne a la que se le acepta un límite de S aureus de 104 /g. b) Determinar la aceptación o rechazo de una muestra de harina a la que se le exige menos de 100 microrganismos aerobios mesófilos por gramo.

4) En una muestra de almidón se exige una carga bacteriana menor de 105 /g. ¿Cuál de los siguientes métodos utilizaría para el análisis y cuáles no? Fundamente su elección y diseñe el o los experimentos (diluciones a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubación).

Recuento en placa Recuento microscópico directo NMP Turbidimetría

5) Explique que método (volúmenes a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubación) utilizaría para hacer el recuento de coliformes en agua potable si la exigencia es de 0/100 mL.


6) Se realizó el recuento en una muestra de agua de pozo por filtración. Se filtraron 10mL de la dilución 1/10 (-1), se colocó la membrana en una placa de TSA y se incubó por 48hs, se contaron 30 colonias en la placa. ¿Cómo se expresa el resultado? 7) ¿Cómo informaría el recuento por NMP de las siguientes muestras de agua con los siguientes resultados?

Muestra 1. (se sembró 1 mL de cada dilución se incubaron los tubos a 35°C por 48 hs.)

Dilución sembrada y tubos positivos Medio

-1 -2 -3

CLT 3/3 3/3 2/3

CLBVB (subcultivo) 1/3 0/3 0/3 Muestra 2. (se sembró 1 mL de cada dilución se incubaron los tubos de CLT a 35°C por 48 hs. y EC a 44,5 °C por 24 hs.)

Dilución sembrada y tubos positivos Medio

-2 -3 -4

CLT 2/3 1/3 0/3

EC (subcultivo) 0/3 0/3 0/3 8) Las normas vigentes para la calidad microbiológica del pescado fresco indican: n= 5, c=3, m=106 M=107 Heterótrofos mesófilos. n= 5, c=3, m=104 M=106 Heterótrofos psicrófilos. n= 5, c=3, m=103 M=2x103 Staphylococcus aureus. n= 5, c=3, m=4 M=400 Coliformes fecales. ¿Cómo haría cada recuento? Especificar el método, las diluciones, medios de cultivo y temperatura de incubación. 9) Las normas de calidad microbiológica de un producto farmacéutico líquido de uso oral indican: un límite de 500 ufc/mL para bacterias heterótrofas. Se realiza el recuento del producto en TSA de dicho producto (que contiene parabenos) sembrando 1 mL (incorporado) de las diluciones que se indican y se obtienen los siguientes resultados:

Dilución sembrada y número de ufc

0 -1 -2

3 40 5 De acuerdo a estos resultados ¿qué puede concluir?


Se realiza la validación del procedimiento expuesto en el ejercicio anterior. Para ello se prepara una suspensión de un cultivo de E. coli . Se realiza el recuento de esta suspensión de E. coli y se obtiene: Recuento en placa (TSA) en superficie (0,1mL)

Para realizar la validación, se inocula 1 mL de la dilución –7 de la suspensión de E. coli preparada anteriormente y se agrega a cada una de las placas sembradas con las diluciones del producto líquido (0, -1 y -2) y se obtiene el siguiente resultado:

¿Se considera el método validado? ¿Qué recomendaciones haría para analizar esta muestra? ¿Podría utilizar otro método?.

Dilución sembrada y número de ufc

-5 -6 -7

358 70 6

Dilución sembrada de producto (+ suspensión) y número de ufc

0 -1 -2

55 113 75


MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO

La primera etapa del análisis microbiológico es la extracción de la o las muestras de un lote y cualquier resultado carece de significado si la muestra no ha sido apropiadamente tomada. Es responsabilidad del laboratorio de control constatar que la muestra que se analizará es representativa del lote y rechazarla antes de realizar el análisis si se tiene indicios de que no lo es. Generalmente en los textos especializados se describen los protocolos para el muestreo en las áreas clínicas, de alimentos, de aguas y de medicamentos y es necesario referirse a ellos en primera instancia. Aquí señalaremos algunas consideraciones generales aplicables a las tres últimas áreas. El lote es el número de unidades o la cantidad de un producto que ha sido sometido a las mismas condiciones durante un proceso determinado. Esta es una consideración teórica puesto que es difícil asegurar la uniformidad durante la mayoría de los procesos conocidos. Por ej. en una esterilización por vapor no todas las zonas del autoclave alcanzan la misma temperatura, sin embargo se considera que todos los recipientes sometidos a ese proceso en esa instancia constituyen un lote. Se considera que una muestra o un conjunto de muestras son representativas de un lote cuando reflejan, tanto como sea posible, la totalidad del lote. El resultado de la o las muestras luego de analizadas va a ser empleado -con cierto criterio- para adoptar una decisión respecto a si todo el lote va a ser rechazado o aceptado. La elección particular del procedimiento de muestreo, el numero de muestras a analizar de un lote y el criterio de decisión se denomina PLAN DE MUESTREO. Un plan de muestreo por atributos adecuado para alimentos puede ser de dos clases (la decisión de aceptar o rechazar el lote se basa en dos números n y c) ó tres clases (se acepta o rechaza el lote en base a una decisión secuencial y se clasifica la calidad del lote en tres clases basados en dos niveles m y M: aceptable, marginal y no aceptable). En el Cuadro I figuran las definiciones para los Planes de Muestreo por Atributos. Cuadro I: Definiciones para los Planes de Muestreo por atributos

Por ej. en un plan de dos clases, si para la búsqueda de Salmonella n = 10 y c = 0, significa que se deben analizar individualmente 10 muestras y ninguna de ellas puede dar como resultado presencia de Salmonella sp. En cambio si para un alimento se exige NMP de coliformes < 100/g, con n = 10 y c = 2, significa que el lote solo puede aceptarse si 2 o menos muestras dan un resultado < 100/g. En cambio en un plan de tres clases para un alimento, el recuento de S. aureus indica n = 5, c =2, m = 102/g y M =104/g, significa que ninguna de las muestras puede tener un recuento > 104/g y que como máximo dos muestras de las cinco analizadas pueden tener un recuento > 102/g.

n = número de unidades de muestra a analizar c = máximo número permitido de muestras que dan un resultado insatisfactorio m = límite inferior M = límite superior


Para determinar que la muestra es representativa y que no se ha alterado después de la extracción deben tenerse en cuenta las etapas de: recolección, transporte y preparación para el análisis propiamente dicho. 1) Recolección. Los planes de muestreo determinan el número, tamaño y zonas de recolección de la muestra. Se diseñan por criterios estadísticos teniendo en cuenta además algunas características del producto tales como: - riesgo potencial para el consumidor, si el riesgo es alto se aumentar el número de muestras para disminuir la probabilidad de que llegue al consumidor una muestra contaminada - facilidad de homogeneizar el lote. Si la producción es en batch y el producto es fácilmente mezclable, como un líquido, se requiere menor número de muestras que si no lo es; si el lote es un conjunto de unidades y se presume que no es de calidad uniforme entonces se extraerán muestras de los puntos donde se supone que la calidad es inferior los cuales se denominan puntos críticos (en el ejemplo del autoclave éstos serían las zonas donde se alcanza menor temperatura). A su vez deber considerarse la homogeneidad dentro de la unidad o envase, p.ej. en un alimento congelado hay un gradiente de temperatura durante el proceso de enfriamiento de tal manera que la zona central es la que tarda mas tiempo en alcanzar la temperatura de congelamiento. - posibilidad de controlar y registrar el tratamiento al cual ha sido sometido el producto; cuanto mayor sea la seguridad de que el tratamiento ha sido correcto para la totalidad del lote, se requiere menor número de muestras. Debe tenerse en cuenta que el aumento del número de muestras está restringido por el costo del análisis y porque existe un límite por encima del cual no hay un aumento significativo de los intervalos de confianza. La muestra se extrae de unidades cuyo envase externo esté inalterado. La extracción se realiza en forma aséptica para evitar la contaminación de la muestra y del resto del contenido del envase. La muestra debe identificarse con un número, fecha, origen, contenido e iniciales del extractor. 2) Transporte Para un producto almacenado en batch la muestra se toma y transporta en recipientes previamente esterilizados y herméticos. El transporte se realiza de acuerdo a las condiciones de almacenamiento. Si es un producto alterable debe transportarse refrigerado (0º-4ºC) por no mas de 24hs. Si se trata de un alimento congelado debe conservarse a la temperatura de congelamiento. El recipiente de transporte no debe llenarse completamente (hasta un 75% de su capacidad) para permitir homogenizar. 3) Preparación para el análisis Se debe realizar la observación macroscópica de la muestra y del envase de transporte y registrar cualquier particularidad. Se procede a la homogeneización de la muestra mediante manipulación aséptica. Si es un sólido o una pasta se diluye en buffer o agua peptonada estériles y se mezcla en una licuadora o en bolsas de plástico previamente esterilizados. Si es un producto oleoso (p.ej. una pomada) se termostatiza en el diluyente a 35ºC para lograr una emulsión.


Si el análisis se realizará por filtración es necesario disolver el producto en un solvente orgánico inocuo para los microorganismos (p.ej.miristato de isopropilo). Para alimentos se recomienda que la toma no sea inferior a 10 g y que la relación con el diluyente sea 1:10. Esta dilución debe prepararse inmediatamente antes del análisis. APLICACIONES. I) Muestreo de equipos y utensilios. Se puede realizar por varios métodos: a) Enjuagado: consiste en enjuagar el equipo con un volumen medido de medio de cultivo o de buffer, el cual es sometido al análisis microbiológico. b) Contacto de superficie: consiste en deslizar un hisopo embebido en buffer por un área determinada del equipo y posteriormente descargar el hisopo en un volumen medido de diluyente el cual es analizado. Este método es recomendado para zonas de difícil acceso, en cambio para áreas planas se recomienda el contacto directo de la superficie a analizar con una placa RODAC con agar nutriente (RODAC Replicate Organism Direct Agar Contact Plates) y se expresa el resultado por área total muestreada. También pueden emplearse esponjas estériles (humedecidas en suero fisiológico u otro diluyente) que se pasan por la superficie y luego la esponja es inoculada en un caldo (si se realiza una búsqueda) o se diluye en un volumen medido de suero fisiológico y se realiza el recuento de esta solución para expresar finalmente el resultado por unidad de superficie muestreada. c) Inmersión: los utensilios se sumergen en un volumen determinado de diluyente y se determina el número de microorganismos por unidad. II) Muestreo de aire. a) Sedimentación: se exponen placas de agar durante 15 min a 2h dependiendo de la contaminación del área a analizar. Se detectan sólo los microorganismos que están adheridos a partículas sedimentables. b) Impacto: se hace pasar un volumen determinado de aire mediante aplicación de vacío y el aire impacta sobre la superficie de un agar nutriente adecuado. También existen equipos que permiten el pasaje del aire a través de una serie de tamices que retienen distinto tamaño de partícula. Los tamices son incubados sobre agar y se puede determinar el número de microorganismos asociados a partículas de distinto tamaño. c) Impregnación de líquidos: consiste en hacer burbujear un volúmen determinado de aire a través de un diluyente estéril el cual retiene los microorganismos presentes. Bibliografía - Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. APHA (American Public Health Association), 1976. Ed.Spceck,M. - Microorganismos in Foods 2: Sampling for microbiological analysis, Principles and specific applications. ICMSF (International commision on Microbiological Specifications for Foods), 1974. Ed. Ingram,M. - Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater APHA, 1976. 14th. ed. Ed.Rand,M.


VALIDACIÓN

CONCEPTOS Validar un proceso cualquiera significa verificar que el procedimiento seguido es el adecuado para obtener el fin propuesto. Ejemplos: Para validar un proceso de llenado aséptico de ampollas inyectables se prepara un lote en el que se sustituye el producto con medio de cultivo. Se incuba entonces las ampollas y se observa si hay o no crecimiento, lo que validará o no, el procedimiento de llenado. Para validar un proceso de esterilización de un producto en un envase dado, se prepara un lote de envases llenos con medio de cultivo inoculado con una cepa adecuada. Luego del ciclo de esterilización se incuba y se observa el crecimiento. Este concepto se puede aplicar a un proceso analítico. Por ejemplo, si se busca iodo en una sal de mesa, se ensaya la técnica de análisis en una muestra adicionada de determinada cantidad de iodo demostrando así que con la técnica empleada se puede detectar el iodo en la concentración buscada. El concepto de validación es de especial interés en el análisis microbiológico. Validar la búsqueda de un microorganismo en determinada cantidad de una muestra dada, significa demostrar que si hubiera estado presente dicho microorganismo en determinada concentración, se hubiera encontrado con la técnica empleada. Validar el recuento de microorganismos en una muestra determinada, significa demostrar que si hubieran estado presentes en determinado número, se hubiera determinado ese número por el método en cuestión. PROCEDIMIENTO DE VALIDACION Para validar los procedimientos en si mismos, se parte del medio de cultivo de enriquecimiento (en el caso de una búsqueda) o del disolvente inicial (si se trata de un recuento) inoculado con el microorganismo adecuado. Para validar la aplicabilidad de dicho procedimiento a una muestra dada se parte de la muestra en cuestión inoculada con el microorganismo que se desee. Teóricamente, se debe validar para cada microorganismo que se busque o se quiera contar. Como no siempre esto resulta práctico, se pueden seleccionar uno o dos m.o. que se consideren representativos de los distintos grupos fisiológicos. Por ejemplo, se recomienda validar con un Gram positivo y uno Gram negativo para bacterias y una levadura y un hongo filamentoso en el caso de hongos. ¿Qué número de microorganismos se agrega? Dependerá de la sensibilidad exigida al método que a su vez es función de la muestra. En general debemos pensar que si las muestras fueron sometidas a alguna condición drástica, por ejemplo calor, si los microorganismos están presentes lo estarán en bajo número. Por lo tanto, se debe demostrar que el procedimiento empleado es capaz de recuperar microorganismos aun si se encuentran en bajo número. Al validar un procedimiento de búsqueda habitual (con 10 g de muestra en 90 mL de caldo de enriquecimiento) se suele agregar de 10 a 100 células del microorganismo adecuado. INTERPRETACION DE RESULTADOS a) Se considerará que el procedimiento de búsqueda está validado si se detecta el microorganismo inoculado. Para el caso de validación de recuento se espera que el valor de ufc obtenido en presencia del producto no difiera en un factor de 2 respecto al valor obtenido en el control (en ausencia de producto).


b) Si se detecta o se determina el número de m.o. empleando la técnica sobre la muestra inoculada se concluye que el procedimiento en cuestión es aplicable a dicho tipo de muestra. En caso de obtener resultados negativos en a) hay que analizar cada paso del procedimiento seguido, medios de cultivo empleados, condiciones de incubación, etc. En general, estos factores están bajo control en un laboratorio de rutina, y se emplean procedimientos ya descriptos. Es más frecuente el caso de que no valide b), o sea que un procedimiento ya descripto en la bibliografía y válido en si mismo no resulta adecuado para determinado tipo de muestra. La causa más frecuente de no validación es la presencia de poder inhibitorio en la muestra analizada. Es decir la muestra presenta la propiedad de inhibir el desarrollo de microorganismos, ya sea por contener agentes conservadores, declarados o no, por su pH u otros motivos. Se debe estudiar entonces, hasta donde sea posible, la composición de la muestra. Si se conoce la presencia de conservadores se debe eliminar su acción. Esto se puede conseguir de tres maneras fundamentales: a) Por neutralización química, esto es, agregando una sustancia capaz de anular la acción del agente antimicrobiano. Por ejemplo la acción de penicilinas puede neutralizarse empleando ß-lactamasas.

Agente inhibidor Neutralizante

Hipoclorito, yodo, mercuriales Tiosulfato de sodio

Fenoles, alcoholes, aldehídos Dilución

Parabenos Polisorbato

Comp. amonio cuaternario y mercuriales, parabenos Lecitina

Glutaraldehído Sulfito ácido de sodio

Mercuriales Tioglicolato

EDTA Iones de Ca o Mg

b) Por dilución, llevándolos a concentraciones subinhibitorias. Esto se consigue disminuyendo la toma de muestra o aumentando el volumen del medio inicial. c) Por filtración, removiendo mecánicamente el conservador. Se efectúa la filtración por membranas con un tamaño de poro definido que retendrán los microorganismos. Su uso se limita a muestras líquidas o solubles. BIBLIOGRAFIA - USP 30, <61>Microbial Limit Tests, <71>Sterility Tests. - European Pharmacopeia.1997.pag 84 - British Pharmacopeia, 1988. Test for Microbial Contamination. Validity of the test for specified microorganisms and Validity of the counting methods, Apendix XVI B - Microbial Applications of the Inactivation of Antimicrobial Agents, A.D. Russell and col., review of the Journal of Applied Bacteriology, 1978.


CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

INTRODUCCIÓN Para controlar el crecimiento de los m.o. se pueden emplear dos estrategias: a) eliminar los m.o. presentes, b) impedir su multiplicación. Para dicho fin se emplean métodos que involucran agentes físicos, químicos o biológicos. El efecto sobre los m.o. puede ser CIDA (provoca la muerte de los m.o.) o STASIS (inhibe el crecimiento de los m.o.). Así el término bactericida significa que en el proceso se destruyen bacterias mientras que bacteriostático implica que el proceso impide la proliferación bacteriana. De la misma forma fungicida y fungistático son los términos empleados cuando los m.o. afectados son los hongos. Los procesos por los cuales se eliminan los m.o. pueden buscar la reducción parcial o total (esterilización) de la carga microbiana. Se define así Esterilización como la completa destrucción o eliminación de toda forma de vida. No hay grados de esterilización: algo está estéril o no lo está. La acción de los agentes de control depende a grandes rasgos de los siguientes factores:

• el tipo de m.o. que se quiere controlar y la carga inicial del mismo. • la dosis del agente, que involucra la concentración o intensidad aplicada durante un

determinado tiempo. • el medio en el cual se encuentran los m.o.

AGENTES FÍSICOS

1) TEMPERATURA Los m.o. tienen una temperatura mínima, óptima y máxima de crecimiento. Las temperaturas por debajo de la mínima usualmente tiene una acción de "stasis" o sea detienen el crecimiento microbiano, pero no provocan la muerte celular. Las temperaturas por encima de la máxima usualmente tienen una acción "Cida" o sea provocan la muerte del m.o. por desnaturalización de enzimas y otras proteínas. El uso de altas y bajas temperaturas está muy difundido y resulta muy efectivo para controlar el crecimiento microbiano. La sensibilidad de los m.o. a las altas temperaturas varía con la especie y con el estado en que se encuentren. Las esporas bacterianas son las estructuras vivas más termorresistentes. Ya que resisten tratamientos térmicos más drásticos que las formas vegetativas. Por ejemplo esporas de m.o. mesófilos en suspensión son capaces de resistir 30 minutos a 80 ºC, lo cual es letal para las formas vegetativas. Existen también ascosporas de hongos filamentosos que son más termorresistentes que la correspondiente forma micelial (ej. ascosporas de Byssochlamys fulva) ALTAS TEMPERATURAS (CALOR) El calor en presencia o ausencia de humedad puede ser utilizado para desinfectar o esterilizar. La ventaja de los tratamientos en presencia de humedad (calor húmedo) es que se requiere menor temperatura para el mismo efecto. Esto se debe a la capacidad de penetrar en las células, desnaturalizando proteínas y afectando todos los componentes celulares. Calor húmedo a) Pasteurización La pasteurización es un método empleado para reducir la carga microbiana. No se destruyen por este método las esporas bacterianas. No es un método esterilizante. Se ha utilizado durante mucho tiempo para reducir la carga microbiana en la leche. Las condiciones de pasteurización en este caso son las siguientes: a) calentamiento a 71,6 ºC por al menos 15 segundos o b) calentamiento por 30 minutos a 62,9 ºC. b) Calentamiento a ebullición El agua a ebullición generalmente mata células vegetativas en menos de 10 minutos. Sin embargo ciertos virus, como el virus de la hepatitis, puede sobrevivir hasta 30


minutos, mientras que las esporas de ciertas especies de los géneros Clostridium y Bacillus soportan tratamientos de más de una hora. c) Calor húmedo a presión superior a la atmosférica. El tratamiento en autoclave emplea este tipo de tratamiento. El agua a presión atmosférica hierve a 100 ºC, pero a presiones superiores, la temperatura de ebullición aumenta, por lo que se pueden realizar tratamientos con calor húmedo a temperaturas más altas de 100 ºC. Este tipo de tratamiento puede ser esterilizante. En el laboratorio para esterilizar material con baja carga microbiana se emplea un ciclo de 15 minutos a 121 ºC en autoclave. Se pueden emplear otras condiciones, variando la temperatura y/o el tiempo para lograr la esterilización. Por ejemplo, en el caso que la carga microbiana inicial sea mayor, se debe realizar un tratamiento de mayor tiempo a 121 ºC. En caso de que el material a esterilizar no resista la temperatura de 121º, se puede utilizar una menor temperatura durante mayor tiempo. Calor seco La acción letal del calor seco se debe a la oxidación de las proteínas. a) Tratamiento con aire caliente Para este tipo de tratamiento se emplean hornos que alcancen temperaturas mayores de 150 ºC. Estos tratamientos pueden ser esterilizantes. Las condiciones de esterilización de material con baja carga pueden ser: a) 180 ºC una hora o b) 160 ºC durante dos horas. Si se empleara calor seco a 121 ºC se debería realizar un tratamiento de 16 horas. Este tipo de tratamiento se usa para esterilizar material de vidrio, instrumentos de metal o aceites y polvos que soporten esas altas temperaturas b) Incineración Los incineradores se utilizan en caso de materiales descartables. También se usa la incineración para esterilizar las ansas antes o después de utilizarlas. BAJAS TEMPERATURAS Las bajas temperaturas inhiben el crecimiento microbiano por enlentecimiento o suspensión del metabolismo celular. Como ejemplos se puede mencionar la refrigeración en heladera (5 ºC – 8 ºC) y el almacenamiento en freezer a temperaturas más bajas de 0 ºC. Para el mantenimiento de cepas microbianas se utiliza el almacenamiento a –20 ºC. A esta temperatura se suspende el crecimiento microbiano pero en general no hay muerte celular. 2) PRESIÓN OSMÓTICA Los m.o. en su ambiente natural están sometidos a constantes cambios de presión osmótica. El agua tiende a fluir a través de las membranas semipermeables como lo son las membranas celulares, hacia el lugar de mayor concentración de solutos. Cuando la concentración de solutos es mayor en el interior que en el exterior de las células, se está en presencia de un medio hipotónico y el agua tiende a fluir hacia el interior celular. Las rígidas paredes de las bacterias y los hongos impiden la explosión celular. Si la concentración de solutos es mayor afuera de la célula, el agua fluye hacia el exterior. En estas condiciones la célula se deshidrata y su crecimiento se inhibe. El aumento de la presión osmótica es una forma de conservación muy utilizada. Ejemplos de ello son el uso de altas concentraciones de azúcar (mermeladas, dulces) y de sal. 3) RADIACIÓN Radiación ultravioleta La radiación ultravioleta incluye longitudes de onda entre 100 y 400 nm. La actividad microbicida de la luz ultravioleta depende entre otros factores de la longitud de onda utilizada y del tiempo de exposición. Las longitudes de onda con mayor actividad microbicida están entre 260-270 nm, longitudes de onda donde absorben los ácidos nucleicos. Una característica de la luz UV es su bajo poder de penetración. Sólo los m.o. que se encuentran en la superficie de los materiales expuestos a la luz UV pueden ser afectados. Por lo tanto se utiliza este tipo de tratamiento especialmente para desinfectar superficies. Es usado también en la desinfección de agua. En este caso se hace pasar el agua por un dispositivo de cuarzo (material penetrable por la luz UV) sobre el cual impacta la radiación ultravioleta.


Radiación ionizante La radiación ionizante como los rayos gamma y rayos X tiene mucha más energía y poder de penetración que la radiación ultravioleta. Su acción consiste en ionizar el agua y otras moléculas para formar radicales que pueden romper las hebras de ADN. Se utiliza para esterilizar guantes, suturas, catéteres, jeringas e incluso placas de Petri. También está aceptado su uso para disminuir la carga microbiana en alimentos. 4) FILTRACIÓN Los filtros retienen los m.o. impidiendo el pasaje a través de los mismos. Los filtros de membrana retiene a los m.o. en la superficie por poseer poros de tamaño pequeño (0,2 micras) a través de los cuales los m.o. no pueden pasar. Los filtros de profundidad retienen a los m.o. atrapándolos en su matriz. Un ejemplo de filtros de profundidad es el tapón de algodón que se utiliza para tapar los tubos de medio de cultivo. Los filtros de membrana se utilizan para esterilizar soluciones, especialmente en aquellos casos en que no se pueda realizar esterilización por calor.

AGENTES QUÍMICOS

Los agentes químicos son compuestos que matan o inhiben el crecimiento de los m.o. Incluyen sustancias usados como conservadores y antisépticos así como las usadas para el tratamiento de enfermedades infecciosas de plantas y animales. Tipo de agente químico antimicrobiano: Antisépticos Agentes microbicidas que pueden aplicarse sobre la piel y mucosas pero no pueden ser utilizados internamente. Ejemplos: mercuriales, nitrato de plata, solución de yodo, alcoholes, detergentes. Desinfectantes Agentes que matan m.o. pero no necesariamente sus esporas y no deben aplicarse sobre tejidos sino sobre objetos inanimados como mesas, pisos, utensilios, etc. Ejemplos: cloro, hipoclorito, compuestos clorados, soda, sulfato de cobre, compuestos de amonio cuaternario, etc. Nota: Los desinfectantes y antisépticos se distinguen en base a si pueden o no ser usados de forma segura sobre membranas mucosas. Muchas veces esta seguridad depende de la concentración del agente. Por ejemplo, el cloro es agregado en concentraciones seguras en el agua potable. Conservadores Agentes usados frecuentemente en alimentos pero también en productos farmacéuticos para inhibir el crecimiento de m.o. Por consiguiente al ser ingeridos no deben ser tóxicos. Ej: propionato de calcio, benzoato de sodio, formaldehído, nitrato, dióxido de azufre. La acción de desinfectantes y antisépticos depende de varios factores, entre ellos:

• La concentración del agente químico • La temperatura a la cual el agente es usado. • La clase de m.o. presente. • El número de m.o. presentes. • La naturaleza de material que acompaña a los m.o. (materia orgánica, etc)


El mejor resultado se obtiene cuando el número inicial de m.o. es bajo y la superficie a ser desinfectada es limpia y libre de sustancias que interfieran. Los dos modos de acción más comunes de antisépticos y desinfectantes son:

• Daño a los lípidos y/o proteínas de la membrana citoplasmática resultando en su ruptura y en la salida del material celular.

• Desnaturalización de enzimas y otras proteínas generalmente por ruptura de puentes de hidrógeno y disulfuro. Bloquean el metabolismo.

Tabla V. Desinfectantes y antisépticos más comunes.

Agente químico Acción Usos

Etanol (50-70%) Desnaturaliza proteínas y solubiliza lípidos Antiséptico usado en piel

Isopropanol (50-70%) Desnaturaliza proteínas y solubiliza lípidos Antiséptico usado en piel

Formaldehído (8%) Reacciona con grupos-NH2, -SH y -COOH

Desinfectante, mata endosporas

Tintura de yodo(2% I2 en 70% alcohol) Inactiva proteínas Antiséptico usado en piel

Cloro (Cl2) gas Forma ácido hipocloroso (HClO), un fuerte agente oxidante

Desinfección en general y en particular para agua potable

Nitrato de plata (AgNO3) Precipita proteínas Antiséptico general y usado en ojos de recién nacidos

Cloruro de mercurio Inactiva proteínas por reacción con los grupos sulfuro

Desinfectante. En ocasiones usado como componente en antisépticos para piel

Detergentes (ej. amonios cuaternarios)

Ruptura de membranas celulares

Desinfectantes y antiséptico de piel

Compuestos fenólicos (ej. hexilresorcinol, hexaclorofenol)

Desnaturalizan proteínas y rompen las membranas celulares

Antisépticos a bajas concentraciones, desinfectantes a altas concentraciones

Oxido de etileno (gas) Agente alquilante

Desinfectante usado para esterilizar objetos sensibles al calor como goma y plásticos


Tabla VI. Lista de los conservadores más comunes usados en alimentos, productos farmacéuticos y cosméticos.

Conservador Concentración efectiva Usos Alcoholes variable Cosmética

Ácido propiónico y propionatos 0,32% Agente antifúngico en panes, tortas, queso

Acido sórbico y sorbatos 0,2% Agente antifúngico en quesos, mermeladas, jugos y tortas

Esteres del ácido p-hidroxibenzoico: metil, etil, propil, butil y heptil ésteres (parabenos o ésteres del PHB)

variable Industria farmacéutica, cosmética, alimentaria

Formaldehído Cosmética: productos de enjuague como shampoo

Acido benzoico y benzoatos 0,1% Agente antifúngico en margarina, sidra, bebidas gaseosas.

Diacetato de sodio 0,32% Agente antifúngico en panes

Acido láctico variable Agente antimicrobiano en queso, manteca, yogur y pickles.

Dióxido de azufre, sulfitos 200-300 ppm Agente antimicrobiano en frutas secas, uvas, melazas

Nitrito de sodio 200 ppm Agente antimicrobiano en alimentos curados, pescado

Cloruro de sodio variable Previene el deterioro microbiano en carnes, pescado, etc

Azúcar variable Previene el deterioro microbiano en mermeladas, jugos, jaleas,etc

Ahumados variable Previene el deterioro microbiano en carnes, pescado, etc

AGENTES BIOLÓGICOS

Los agentes antimicrobianos biológicos son sustancias sintéticas, semisintéticas o producidas por m.o. capaces de matar o inhibir el desarrollo de otros m.o. Los agentes antivirales, antibacterianos y antifúngicos, se definen como aquellos agentes biológicos capaces de inactivar virus, bacterias y hongos, respectivamente. Los agentes antimicrobianos pueden variar según la toxicidad selectiva que presenten. A diferencia de los antisépticos y desinfectantes, los antibióticos no actúan de manera similar en todos los tipos celulares -por el contrario- presentan una toxicidad selectiva y según se trate de una agente antifúngico o uno antibacteriano, inactivará células fúngicas o bacterianas. Para el control de las enfermedades infecciosas en plantas, animales y humanos es indispensable el uso de antibióticos con la capacidad para inhibir las bacterias u otros m.o. sin


causar daño al huésped. El agente biológico deberá entonces actuar contra alguna función o estructura microbiana que no esté presente en el huésped o que de lo contrario sea sustancialmente diferente. A diferencia de los m.o. procariotas, los m.o. eucariotas presentan estructuras y funciones muy relacionadas con las encontradas en el huésped. Este es el motivo por el cual existe una variedad reducida de agentes biológicos contra hongos en comparación con la amplia variedad dirigida hacia m.o. procariotas. Los antibióticos son sustancias producidas por ciertos m.o. que a bajas concentraciones son capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros m.o. Los antibióticos constituyen una clase especial de agentes quimioterapéuticos que se distinguen por el hecho de que se trata de sustancias naturales (producto de la actividad microbiana) más que de sustancias obtenidas por síntesis química. Debido a que al presente varios antibióticos han sido modificados químicamente e incluso sintetizados totalmente de novo en el laboratorio, varios autores consideran indistinto los términos antibiótico y agente quimioterapéutico. Los agentes antimicrobianos quimioterápicos se pueden clasificar en base a su estructura química y a su modo de acción. A continuación se muestran los mecanismos de acción que presentan los diferentes grupos químicos de antibióticos.

1- Inhibición de la síntesis de peptidoglicano a- Antibióticos beta-lactámicos naturales y semisintéticos (penicilinas, cefalosporinas, carbapenems, monobactam) b- Vancomicina (natural) c- Bacitracina (natural)

2- Alteración de la membrana citoplasmática

a- Polimixina B (natural) b- Anfotericina B (natural) c- Nistatina (natural) d- Imidazoles (natural)

3- Inhibición de la síntesis proteica

Bloqueo de la transcripción (prevención de la síntesis de ARN) a- Rifampicina (natural) b- Etambutol (no natural) Bloqueo de la traducción (alteración de ribosomas bacterianos) a- aminoglicósidos (natural)

b- tetraciclinas (natural) c- Lincosamina y clindamicina (natural) d- macrólidos (naturales y semisíntéticos)

4- Interferencia con la síntesis de ADN

a- Fluoroquinolonas (no natural, Ej: ciprofloxacina) b- Sulfonamidas y trimetroprim (no naturales)


EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

EVALUACIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS 1) Cálculo de tiempo D Para conocer el efecto que determinado tratamiento (un determinado agente, a una determinada concentración) frente a un determinado tipo y número de m.o. en un determinado sustrato, se determina el valor D o tiempo de reducción decimal. El valor D se define como el tiempo necesario para disminuir en un orden la carga de m.o. presentes en una muestra. Este valor se puede determinar a partir de la curva de muerte. Dicha curva se construye determinando el número de m.o. sobrevivientes al tratamiento a lo largo del tiempo. En general la curva de muerte es una exponencial negativa, por lo cual se puede linealizar graficando el ln del número de sobrevivientes en función del tiempo. La inversa (con signo cambiado) de la pendiente de dicha gráfica es el valor D. Como se ve el valor D no depende de la carga microbiana inicial. Pero se debe tener en cuenta la carga microbiana de que se parte para poder estimar el número de tiempos D que se debe aplicar a la muestra para bajar su carga un determinado número de órdenes decimales. De esta forma conociendo el valor D y la carga inicial se puede determinar el tiempo de exposición necesario para lograr una determinada disminución de la carga microbiana luego del tratamiento. Por ejemplo si el valor D para Salmonella sp. en huevo líquido es de 1,1 minutos a 61 ºC, por lo tanto se necesitan 3,3 minutos (3D) en esas condiciones, para llegar a una carga microbiana de 10 ufc/ml habiendo partido de una carga inicial de 104 ufc/mL. 2) Otros métodos Es posible evaluar la eficacia de los desinfectantes y antisépticos por medio de ensayos in vitro o de ensayos in use. Los ensayos in vitro se realizan en condiciones de laboratorio artificiales y controladas mientras los ensayos in use se realizan en las condiciones de uso. Existen muchos y variados métodos para la evaluación de un agente químico. Estos métodos se clasifican según el tipo de m.o. ensayado, según su acción (bactericida, bacteriostático, etc), de acuerdo al objetivo (ensayos preliminares, de screening, determinación de la concentración óptima para un dado uso etc.), ensayos cuantitativos, etc. También existen normas en distintos países: EN (comunidad europea), AFNOR (Francia), AOAC (USA), DGHM (Alemania), etc. cuyos ensayos tienen validez siempre que se sigan estrictamente las condiciones especificadas. EVALUACIÓN DE AGENTES BIOLÓGICOS En general la susceptibilidad de un m.o. a un determinado antibiótico no se puede predecir conociendo la identidad del m.o., ya que cepas diferentes de la misma especie pueden presentar distinta sensibilidad frente a los mismos antibióticos. Generalmente las bacterias gram positivas son más sensibles que las gram negativas, aunque algunos antibióticos actúen solamente sobre las bacterias gram negativas. Un antibiótico que actúa sobre ambos grupos de bacterias, gram positivas y gram negativas se denomina antibiótico de amplio espectro. Existen dos métodos ampliamente utilizados en el laboratorio para medir la actividad antimicrobiana de un antibiótico, los cuales están rigurosamente estandarizados en la Norma National Committee Clinical Laboratory Standards (NCCLS): el ensayo de dilución en tubo y el ensayo de difusión en agar (Ensayo de Kirby-Bauer) Ensayo de dilución en tubo 1- El ensayo de dilución en tubo nos permite conocer un valor llamado concentración inhibitoria mínima (C.I.M.). Se prepara una serie de tubos conteniendo un medio líquido nutriente y concentraciones seriadas al medio del antibiótico. Los tubos son inoculados con una suspensión estandarizada del m.o. en estudio e incubados a la temperatura adecuada durante 16-20 horas. Luego de la incubación los tubos son examinados en base a la aparición o no de evidencia macroscópica de crecimiento visualizada por la presencia de turbidez, velo o sedimento. La C.I.M.


se define como la mínima concentración del agente capaz de prevenir el desarrollo microbiano, es decir, la concentración en la cual no hubo evidencia macroscópica de crecimiento. La C.I.M. no es una constante absoluta para un antibiótico dado, puesto que está afectada por varios factores como son la naturaleza del m.o. utilizado, el tamaño del inóculo, la composición del caldo de cultivo, el tiempo y condiciones de incubación. Por lo tanto para comparar diferentes antibióticos con el fin de determinar cual es el más efectivo contra un determinado m.o. o para evaluar la susceptibilidad de varios m.o. ante a un determinado antibiótico, es indispensable estandarizar estrictamente las condiciones del ensayo. Ensayo de difusión en agar Es un método comúnmente utilizado para determinar la susceptibilidad de un m.o. frente a un antibiótico. Se prepara una placa de Petri conteniendo un medio de cultivo adecuado para el desarrollo del m.o. en estudio. Luego se prepara un inóculo estandarizado del m.o. equivalente al tubo 0.5 de la escala Mac Farland y se inocula el medio de cultivo hisopando la superficie entera de la placa. Se sumerge un disco de papel de filtro en cada una de las diferentes concentraciones conocidas del antibiótico y se colocan en la superficie del agar a una distancia de 1,5 cm entre sí y del borde de la placa. Luego se incuban las placas a temperatura adecuada durante 18-20 horas. Durante la incubación el antibiótico difunde desde el papel de filtro hacia el agar. Cuanto mayor es la distancia de difusión menor es la concentración del agente en ese punto. A una determinada distancia desde el disco ocurrirá una inhibición del crecimiento del m.o., visualizándose una zona o halo de inhibición, cuyo diámetro será proporcional a la cantidad de antibiótico agregado al disco de papel de filtro y que se podrá medir con una regla o calibre. En los laboratorios de Microbiología Clínica se utilizan discos de papel adquiridos comercialmente que contienen una concentración estandarizada del antibiótico. La reproducibilidad de este método está afectada por los mismos factores que afectan al método de dilución en tubo sumado a otros factores como la constante de difusión del agente, la velocidad de crecimiento del m.o. y el espesor del medio de cultivo. Se pueden realizar ensayos de difusión utilizando otros métodos de inoculación (siembra incorporada) y otro tipo de reservorio para los antimicrobianos (cilindros de vidrio, de metal, etc.). Fotografía de un ensayo de difusión de actividad antimicrobiana de extractos vegetales sobre el hongo Aspergillus niger. Inoculación: incorporada. Reservorios utilizados: cilindros metálicos


EJERCICIOS DE AGENTES QUÍMICOS 1. Una resina para purificación de agua está contaminada con 1012 ufc/ml de E.coli. Se agrega

formaldehído de forma de lograr una concentración final del 8%. ¿Cómo haría para determinar el tiempo de contacto necesario entre el agua y el agente para lograr bajar la carga a 102 ufc/mL? ¿Dé qué factores depende dicho proceso?

2. Se quiere descontaminar un matraz de 100 mL que contiene un cultivo puro de S.aureus en

TSB, con una carga de 109 ufc/mL. Para ello se emplea hipoclorito de sodio concentrado. ¿Cómo haría para determinar el tiempo de contacto necesario para que la concentración microbiana sea <1 ufc/100 mL?

3. Conociendo que el D de S. aureus determinado con hipoclorito al 4% en TSB es de 0,2 min,

¿Cuál sería el tiempo mínimo de contacto de una suspensión de 5 x 109 ufc/mL de S. aureus (en TSB con hipoclorito al 4%) para bajar la carga a 1000 ufc/mL? Explique como se determinó ese tiempo D.


TABLA MODIFICADA DE COWAN´S & STEEL PARA IDENTIFICACION DE BACTERIAS HETERÓTROFAS

tinción gram (cultivo fresco) + + + + + + + + – – – – –

forma coco coco coco coco bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón coco

agrupación racimos racimos cadenas tétradas pares

crecimiento aerobio + + + + + – + + + + + + +

crecimiento anaerobio – + + + + + + – – – + + –

esporas – – – – – + + + – – – – –

movilidad – – – – – + o – + o – + o – + o – + o – + o - + –

catalasa + + – – – – + + + + + + +

oxidasa + + – + +

fermentación de glucosa a ácido o a ácido + gas

– + + + + + o – + – – – + + –

O/F – O F F O

Micrococcus X

Staphylococcus X

Streptococcus X

Lactococcus X

Enterococcus X

Leuconostoc X

Pediococcus X X

Aerococcus X

Lactobacillus X

Clostridium X

Bacillus X X

Alcaligenes X

Pseudomonas X

Enterobacterias X

Aeromonas X

Chromobacterium X

Neisseria X


Tabla extraída del artículo: “Biochemical Identification of New Species and Biogroups of Enterobacteriaceae Isolated from Clinical Specimens”. Journal of Clinical Microbiology, Jan. 1985, p. 46-76 Vol. 21, No. 1. J. J. Farmer et al.


Tabla III, Índice de NMP y límite de confianza del 95% para varias combinaciones de resultados positivos para una serie de 3 tubos cada uno con 10, 1 y 0,1 g ó mL de muestra.

Límites de confianza del 95%

Límites de confianza del 95%

Combinación de tubos positivos

NMP/100 g ó mL Inferior Superior



0-0-0 <3 - - 3-0-0 23 4 120 0-0-1 3 < 0,5 9 3-0-1 39 7 130 0-1-0 3 < 0,5 13 3-0-2 64 15 380 1-0-0 4 < 0,5 20 3-1-0 43 7 210 1-0-1 7 1 21 3-1-1 75 14 230 1-1-0 7 1 23 3-1-2 120 30 380 1-1-1 11 3 36 3-2-0 93 15 380 1-2-0 11 3 36 3-2-1 150 30 440 2-0-0 9 1 36 3-2-2 210 35 470 2-0-1 14 3 37 3-3-0 240 36 1300 2-1-0 15 3 44 3-3-1 460 71 2400 2-1-1 20 7 89 3-3-2 1100 150 4800 2-2-0 21 4 47 3-3-3 >2400 - - 2-2-1 28 10 150


Tabla IV. Índice de NMP y límite de confianza del 95% para varias combinaciones de resultados positivos para una serie de 5 tubos cada uno con 10, 1 y 0,1 g ó mL de muestra. Límites de

confianza del 95% Límite de confianza

del 95% Combinación

de tubos positivos




0-0-0 <2 -- 4-3-0 27 9 80 0-0-1 2 <0,5 7 4-3-1 33 11 93 0-1-0 2 <0,5 7 4-4-0 34 12 93 0-2-0 4 <0,5 11 5-0-0 23 7 70 1-0-0 2 <0,5 7 5-0-1 31 11 89 1-0-1 4 <0,5 11 5-0-2 43 15 110 1-1-0 4 <0,5 11 5-1-0 33 11 93 1-1-1 6 <0,5 15 5-1-1 46 16 120 1-2-0 6 <0,5 15 5-1-2 63 21 150 2-0-0 5 <0,5 13 5-2-0 49 17 130 2-0-1 7 1 17 5-2-1 70 22 170 2-1-0 7 1 17 5-2-2 94 28 220 2-1-1 9 2 21 5-3-0 79 25 190 2-2-0 9 2 21 5-3-1 110 31 250 2-3-0 12 3 28 5-3-2 140 37 340 3-0-0 8 1 19 5-3-3 180 44 500 3-0-1 11 2 25 5-4-0 130 35 300 3-1-0 11 2 25 5-4-1 170 43 490 3-1-1 14 4 34 5-4-2 220 57 700 3-2-0 14 4 34 5-4-3 280 90 850 3-2-1 17 5 46 5-4-4 350 120 1000 4-0-0 13 3 31 5-5-0 240 68 750 4-0-1 17 5 46 5-5-1 350 120 1000 4-1-0 17 5 46 5-5-2 540 180 1400 4-1-1 21 7 63 5-5-3 920 300 3200 4-1-2 26 9 78 5-5-4 1600 640 5800 4-2-0 22 7 67 5-5-5 >2400 -- 4-2-1 26 9 78


ÍNDICE

Guía de Práctico Primer Ciclo: Identificación primaria de bacterias y hongos……………………………..... 1

Calendario……………………………………………………………………………..... 2

Segundo Ciclo: Búsqueda y Recuento – Análisis microbiológico de muestras…………. 3 Calendario……………………………………………………………………………..... 4

Técnica general de análisis microbiológico de una muestra ……………………………………. 5 Recuentos……………………………………………………………………………...... 5 Búsquedas……………………………………………………………………………..... 6 Recuento de heterotróficos por el método de membrana filtrante……………………… 10 Recuento de coliformes fecales en agua de playa por NMP. ………………………….11 Recuento de coliformes totales y fecales en agua potable por NMP. …………………11 Composición de medios a emplear……………………………………………………..13

Tercer Ciclo: Agentes físicos, químicos y biológicos………………………………………17 Calendario……………………………………………………………………………....17 Agentes Físicos: calor…………………………………………………………………..18 Evaluación de Desinfectantes…………………………………………………………..18 Evaluación de agentes biológicos………………………………………………………21

Fundamentación teórica Normas básicas de seguridad ……………………………………………………………… 22

Utilización y mantenimiento del microscopio……………………………………………… 23

Citología y morfología de bacterias………………………………………………………… 24

Técnicas………………………………………………………………………………………. 28

Citología y morfología de hongos………………………………………………………….. 30 Figuras de hongos……………………………………………………………….…. 33

Siembra y aislamiento – Búsqueda………………………………………………………… 35

Medios de cultivo……………………………………………………………………………... 38 Tabla: Características de algunos medios de cultivo………………………………… 41

Test de esterilidad………………………………………………………………………..…… 42

Identificación de una cepa bacteriana……………………………………………………… 48 Pruebas bioquímica primarias…………………………………………………..…… 51 Pruebas bioquímica secundarias………………………………………………..…… 55 Problemas teóricos…………………………………………………………………… 67

Determinaciones cuantitativas de biomasa - Recuentos………………………………….72 Escala de Mac Farland………………………………………………………………..84 Algunas aplicaciones de recuentos……………………………………………..…….85 Ejercicios de recuentos………………………………………………………………..88

Muestreo para análisis microbiológico………………………………………………………91

Validación……………………………………………………………………………………… 94


Control del crecimiento microbiano…………………………………………………….…… 96 Tabla: Desinfectantes y antisépticos más comunes…………………………….…… 99 Tabla: Conservadores más comunes………………………………….…………… 100

Evaluación de la actividad antimicrobiana……………………………………...………… 102 Ejercicios de agentes químicos……..………………………………….…………… 104

Tablas: Identificación de bacterias heterótrofas……………………………………………….. 105 Identificación de enterobacterias…………………………………………………….. 106 Índice de NMP serie de 3 tubos…………………………………………………….…107 Índice de NMP serie de 5 tubos…………………………………………………….…108

resume n

Documents