restricciones fermentativas
TRANSCRIPT
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
1/39
RESTRICCIONES
FERMENTATIVAS:Paralizacin de fermentaciones
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
2/39
Origen de las restricciones
Las restricciones fermentativas se producen porestados de estrs que sufren las levaduras en las etapasde su produccin como inculos y durante su manejoen las etapas de aplicacin industrial.
Las causas de estrs son muy variadas y estnrelacionadas con un amplio numero de factores queafectan las estructuras y el metabolismo celular.
De la mayora de estos factores de estrs no se conocebien su causa precisa pero todos afectan el crecimientode la levadura y la funcionalidad de membranas
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
3/39
Produccin de inoculos (LSA)
La forma general de comercializar levaduras es
como levaduras secas activas (LSA).
La forma en que se obtienen, condiciona su
comportamiento fermentativo
Existen cepas de levaduras que no pueden
producirse industrialmente, ya que no toleranalguna de las etapas del proceso de produccin
Hace falta un mayor desarrollo en este aspecto
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
4/39
Antecedentes generales
La utilizacin de levaduras seleccionadas hace
necesario contar con mtodos de conservacin de
cepas y produccin de biomasa con uncomportamiento fermentativo garantizado
Las condiciones de conservacin y de aumento de la
biomasa, afectan las caractersticas de los inculos.
Las etapas antes sealadas pueden provocar en las
levaduras fenmenos de estrs que afectan su energa
fermentativa y la tolerancia al grado alcohlico.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
5/39
Etapas de produccin de LSA
Activacin de las cepas del cepario
Inoculacin en el medio nutritivo
Regulacin de las condiciones de crecimiento
Recuperacin de la biomasa por centrifugacin
Eliminacin de agua por extrusin Secado en flujo laminar
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
6/39
Factores crticos en la produccin de
LSA
Conservacin de
Inculos
Medios de crecimiento
y condiciones de
conservacin
Tolerancia a stress
osmticos
Programas
nutricionales
Induccin de
protenas de stress
Sntesis de glicerol y
trealosa
Tolerancia al
secado
Programas
nutricionales
condiciones de
crecimiento
Presencia de
protenas de stress.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
7/39
Efectos de la forma de conservacin
de cepas de levaduras
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
8/39
ESTRES PRESENTES DURANTELA FERMENTACION
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
9/39
Limitacin
nutricional
Macronutrientes
Micronutrientes
NitrogenoFosfato
VitaminasMinerales
Inhibicin porsustrato
Exceso de azcar
Toxicidad poretanol
Deficiencias de factores de sobrevida
Deficiencias de oxigenoInoculo de crecimiento inapropiado
Esteroles
Acidos grasos insaturados
Sustancias txicas
Acidos grasos
Residuos de fungicidasToxinas microbianas
Exceso de SO2
Acetato, Propionato
ButiratoCadena media (C6C10)
Levaduras killerMicotoxinas
Deficiencia de
coloides
Clarificaciones de mostos muy
intensas
Alteraciones de la pared
celular
causales de represin durante laactividad fermentativa
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
10/39
Causas de estrs
Elevada variabilidad del medio fermentativo
La variabilidad se ve afectada por la
composicin inicial y los cambios permanentes
durante la evolucin de la fermentacin
La levadura durante la fermentacin debe
modular los regmenes de transporte decompuestos nitrogenados y azcares
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
11/39
Mecanismos de control del estrs
La clula debe activar variados mecanismosde control de estrs durante las etapasiniciales de la fermentacin
Sntesis de protenas de estrs
Sntesis de compuestos osmo-activos
Sntesis de trehalosa para regular choqueosmticos y responder a los efectos del
etanol.Debe acumular glicgeno en condiciones de
deficiencia de azcares
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
12/39
Aspectos nutricionales yfisiolgicos
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
13/39
Estrs producidos por condiciones
nutricionalesLos factores de estrs relacionados con el aspecto nutricional pueden
clasificarse en:
Los que afectan la proliferacin y el crecimiento celular
Los que afectan la actividad metablica en fase estacionaria noproliferante
Estas dos categoras no son necesariamente excluyentes
Los factores menos estudiados se relacionan con la fase estacionaria.
En ella destacan Fallas en la disponibilidad de una fuente de energa
Fallas en la disponibilidad de aminocidos para la sustitucin deprotenas degradadas
Deficiencias de compuestos necesarios para minimizar los efectosdel etanol en la membrana factores de sobrevida
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
14/39
Un evento critico:
El crecimiento de la levadura
El crecimiento de la levadura es definidocomo una asimilacin coordinada de
nutrientes del medio y su subsecuente
metabolismo para producir
La nueva biomasa formada es el resultado del aumento en tamaocelular y la proliferacin que resulta de la reproduccin celular.
La produccin del vino durante lafermentacin del mosto es un
subproducto del crecimiento de las
levaduras
Eficiencia
fermentativa
Produccin de biomasa con la
menor cantidad de nutrientes
Fermentacin con el menor
tiempo de residencia
El manejo de la fermentacin requiere del control del crecimiento celular y de la
velocidad de reproduccin celular
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
15/39
Rgimen de crecimiento
La extensin de cada fase es dependiente de las condiciones culturales,
de la composicin del medio fermentativo y del estado fisiolgico de lasclulas.
La naturaleza de la cepa la composicin del medio
y las condiciones fsicas, tales como: temperatura,
presin y grado de agitacin determinan la
velocidad de crecimiento.
La optimizacin biotecnolgica es
manipular las condiciones ambientales
para controlar el crecimiento y el
metabolismo de las levaduras paraproducir un producto de calidad
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
16/39
La sntesis de esteroles
La formacin de esteroles, acoplada
a la movilizacin de glicgeno, es un
prerrequisito para una transicin de
la clulas desde la fase lag a la
fase de crecimiento exponencial.
Existe una relacin lineal entre las cantidades de glicgeno
desasimilado y el nivel de sntesis de esteroles durante la
fermentacin
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
17/39
OXIGENO
La concentracin de oxigeno
suplementado al mosto al inicio, es uno de
los principales reguladores del crecimiento
de la levadura
Existe una directa correlacin entre la
concentracin inicial de O disuelto y el
nivel de crecimiento celular
La magnitud depende de
composicin del mostoEl aumento en la disponibilidad de O2
promueve un elevado crecimiento celular a
expensas del azcar, con un menorrendimiento en etanol.
Variadas combinaciones cepa/mosto, aunque no todas, presentan una inversa
correlacin entre concentracin de O2 y conc. de esteres en la bebida.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
18/39
Alteraciones de los mecanismos de
transporte
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
19/39
Aspectos relacionados con la accin de
los transportadores
La perdida de actividad de los transportadores se haestablecido como el principal factor de las restriccionesfermentativas
Los transportadores para su normal funcionamiento debencambiar de conformacin. Por ese mecanismo vuelcan los
sustratos al interior de la clula La modificacin se hace difcil cuando la membrana es muy
rgida
Los cambios de la conformacin se favorecen con la mayor
presencia de cido grasos insaturados en la membrana
La suplementacin de algunos aminocidos en la faseestacionaria ha demostrado que tiene un efecto en laprolongacin de la actividad fermentativa, no as las
adiciones de nitrgeno amoniacal.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
20/39
Aspectos relacionados con la accin de
los transportadores
La perdida de actividad de los transportadores seha establecido como el principal factor de las
restricciones fermentativas
Perdida de
actividad de lostransportadores
Problemas de sustitucin de
transportadores desgradados
Deficiencias estructurales
de las membranas
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
21/39
Alteraciones en el flujo de transporte
de azcares La estructura del mecanismo de transporte es muy compleja
Participan 18 genes de estructura similar que codifican igual numerode protenas
El transporte de los azcares se responde a una accin acumulativade ms de un transportador
Los transportadores depende de la concentracin de azcares delmedio
Transportadores de alta afinidad son inhibidos por elevadasconcentraciones de azucares; funcionan a bajas concentraciones desustrato
Transportadores de baja afinidad funcionan cuando laconcentracion de glucosa esta por debajo de unos 8 g/L.
La sucesin de los transportadores es un evento critico
Los transportadores de azucares presentan una elevada tasa de
recambio en clulas en fase estacionaria, por ello para su sntesis senecesita un constante a orte de nitr eno.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
22/39
Variaciones en la velocidad de transporte
intracelular de glucosa en funcin de su
concentracin en el mosto
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
23/39
Efectos represores del etanol
Represin de los mecanismos de transporte activo a
travs de la membrana
Inhibe el bombeo activo de protones asistidoenergticamente por la ATPasa de la membrana.
El etanol tambin desactiva la GAP por
modificacin de su parte proteica.
Altera la selectividad de las membranas celulares.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
24/39
Efecto del etanol en la membrana
El etanol produce una
perdida de la selectividadfrente a los protonesexternos y provoca uningreso pasivo deprotones a la clula.
La difusin facilitada de
aminocidos esfuertemente inhibida por eletanol (compite con ladifusin pasiva de
protones).
AltoEtanol
MOSTO CITOPLASMA
Plasmalema
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
25/39
Efectos citoplasmticos causados por el
etanol: posibles factores de resistencia
Las alteraciones no solo provocan estrs a nivel de lamembrana
La acumulacin intracelular de etanol provocaalteraciones citoplasmticas que modifican el estadoinico de las protenas y como resultado su conformacin.
Se observan cambios en la viscosidad del citoplasma
La sntesis de trehalosa es un mecanismo de proteccinfrente a estos efectos
Las disponibilidades de glicina en el mosto al pareceracta en el mismo sentido. Este aminocido es deficienteen mostos de elevada madurez y en mostos con ataques deBotrytis.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
26/39
Mas efectos de grado alcohlico
Disminucin de la velocidad de captacin de azucares
Disminucin de la velocidad de utilizacin de oxigeno
Mayores niveles de secundarios indeseados. Acetato deetilo, acido sulfhdrico
Algunas respuestas adaptativas
Disminucin de la relacin saturados/insaturados en lamembrana
Aumento de la concentracin de trehalosa
Sntesis de protenas de strees (HSP)
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
27/39
Efectos del grado alcohlico:
Modificacion en la expresin gnica
Induccin de un elevado numero de genes
relacionados con:
a) Protenas de stressb) Metabolismo de trehalosa
c) Metabolismo glicoltico y TCA
d) Componentes de membranas
e) Protenas transportadoras
f) Degradacin de protenas vacuolares
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
28/39
Efectos represores de la temperatura
Las temperaturas afectan el comportamiento de lostransportes a travs de la membrana
La temperatura afecta la fluidez de la membrana almodificar la viscosidad de los cidos grasos.
Las bajas temperatura disminuyen la fluidez y restringenlos cambios de la conformacin de los transportadores.
Las temperaturas elevadas alteran la asociacin entre eltransportador y la membrana, afectan tambin el cambiode su conformacin.
Los efectos son muy semejantes a los del etanol por ellolas acciones estn correlacionadas. Sobre todo en el rangoalto
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
29/39
Efectos represores de la temperatura (II)
Los cambios abruptos de temperatura tambin afectana las enzimas citoplasmticas y con ello elfuncionamiento de los organelos subcelulares.
Los cambios drsticos de temperaturas generan la
expresin de genes que sintetizan protenas de estrs. La posibilidad de las clulas de sintetizar estas
protenas en la fase estacionaria es clave paraenfrentar los cambios drsticos en el medio.
Si los cambios de temperatura ocurren en condiciones
de limitaciones nutricionales, las clula son incapacesde compensar los efectos del estrs.
Ef t d l t i
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
30/39
Efecto de las competencias
microbiolgicas Las fermentaciones lentas o las inoculaciones tardas
permiten el desarrollo de poblaciones de levaduras noSaccharomyces y bacterias lcticas
Existen cepas que son muy sensibles al desarrollo de bacteriaslcticas en el mosto.
Los mostos en los que ha ocurrido un desarrollo de bacteriasrequieren el aporte de cantidades superiores de vitaminas.
En California una bacteria identificada como Lactobacilluskunkeei, ha causado graves paralizaciones de fermentacin en
funcin de las cepas de levadura que se trate. Las inhibiciones cruzadas son bastante especficas por ello se
cree que no deberan tener gran importancia industrial. Eso sies necesario conocerlas para evitarlas
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
31/39
Efecto de las concentracin de
slidos en suspensin
Los estudios han determinado que la cantidad deslidos y coloides en suspensin afectan la porosidadde pared celular.
Al comparar un mosto con 380 NTU frente a otro de34 NTU, se observ que la menor turbidez provoca:
Cambios estructurales: mayor concentracin de protenas, ydiferente tipo; menor grado de glicosidacin (manosa)
Aumento de porosidad de la pared celular en la faseestacionaria del crecimiento poblacional.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
32/39
Razones para el efecto
La mayor porosidad de la pared permite la perdidade macromolculas desde la clula lo que debeafectar el comportamiento metablico de lasmismas.
El grado de produccin de coloides celulares,depende de la turbidez del medio.
Por otra parte, los mostos con mayor cantidad deslidos permiten una mejor eliminacin del CO
2del tanque de fermentacin, moderando los efectosrestrictivos que produce su acumulacin.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
33/39
Slidos suspendidos y activacin
Son variados los materiales que se han testeadospara evaluar su comportamiento activador de lafermentacin en mostos muy limpios.
Celulosa microcristalina
Paredes de levaduras
Bentonita
Tierras de diatomeas
En otras industrias tambin se han obtenido datossemejantes: ejemplos son la industria de lacerveza, whisky y del ron.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
34/39
Presencia de cido actico
Las elevadas presiones osmticas del mediofermentativo provoca modificaciones metablicasque generan concentraciones mas elevadas de c.actico.
El cido actico es un cido dbil que por estarpoco disociado en el vino puede traspasar lasmembranas de las clulas provocando una fuerterestriccin metablica por acidificacin del
citoplasma)La presencia de cido actico reduce severamente
la capacidad de Saccharomyces para utilizar yretener tiamina.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
35/39
Fermentacin y levaduras saludables
Aspectos nutricionales
Fuentes
Nutricin integral
Reconocimiento de diferencias entre cepas
Momento de aplicacin de los complementos
nutricionales
Control de las bacterias lcticas (uso de lizosima)
Aporte de oxigeno
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
36/39
Principales requerimientos
nutricionales Concentraciones moderadas de azucares (20 a
23 Brix)
Nitrgeno asimilable por la levadura (YAN) Orgnico simple
Orgnico complejo
Micronutrientes Vitaminas
Minerales
O2durante las etapas de induccin fermentativa y de
crecimiento exponencial.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
37/39
Mejora la cintica fermentativa
Disminuye la produccin de acetaldehdo
Disminuye la formacin de compuestosazufrados y de acidez voltil
Efecto sinrgico con el nitrgeno
Mejora la cintica de la FAAumenta la produccin de esteres
Mejora la viabilidad el final de FA
Micronutrientes de importancia
Mejor crecimiento celular
Menor sntesis de acetaldehdoMenor sntesis de acidez voltil
Esencial para la formacin de
fosfolpidos de membrana
Tiamina
Biotina
Pantotenato
Inositol
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
38/39
Estrs producidos por deficiencia de
tiamina
Recientemente se ha demostrado queKloeckera es muy eficiente en la absorcinde tiamina del mosto esto deja el mostodeficiente para las necesidades deSaccharomyces.
De manera complementaria el SO2 reaccionacon la tiamina reduciendo su disponibilidad.
Estos factores pueden actuar de manerasinrgica en mostos con decantacin estticaque permitan el desarrollo de levaduras delgenero Kloeckera.
-
7/31/2019 Restricciones Fermentativas
39/39
Micronutrientes Minerales
Mejora resistencia al etanol temperatura y choqueosmotico, aumenta el rendimeiento en etanol ,relacion necesaria Ca:Mg < 1
Cofactor enzimatico de la glicolisissis,incrementa la tolerancia al alcohol regulacin enla produccin de productos secundarios de la FA
(esteres, alcoholes, acidos grasos)
Efecto sinrgico con el Zn,Disminuye los tiempos de generacin (tiempoentre dos reproducciones )
Elemento esencial, pero toxico sobre 1-2 mg/L
Debe estar sobre los 300 mg/lL cuando los pH
d l t t b j l 3 3
Magnesio
Zinc
Cobre
Potasio
Manganeso