Revisin de mtodos espectroscpicos y elaboracin de curva estndar de protena.

Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Reporte No. 5, equipo 1, OCTUBRE DE 2015, p. 1-5

ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIN DE CIDOS NUCLECOS.TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II:TRANSFORMACIN

Campos Silva R., Cortes Hernndez L. N.,

Laboratorio de bioqumica experimental, Facultad de qumica UNAM.

Resumen. En esta parte II llamada transformacin bacteriana, se procedi a Identificar al DNA como portador de la informacin gentica mediante los mecanismos por los que una bacteria puede adquirir un plsmido. Mediante el uso del vector recombinante pET-TEM-1-ompA-lactamasa, se llev a cabo mecanismo por el cual se realiza la transformacin bacteriana como un fenmeno de transferencia horizontal de material gentico y aprender a identificar clulas transformantes mediante su fenotipo, conociendo la definicin de organismo transgnico y las aplicaciones de la transformacin bacteriana, sus beneficios y riesgos.

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Introduccin.Aunque las bacterias se reproducen por un proceso asexual (fisin binaria), poseen mecanismos para lograr la variabilidad gentica que necesitan para adaptarse a un entorno cambiante. En general existen dos formas de cambiar la dotacin gentica de una bacteria, las mutaciones y la transferencia de fragmentos de ADN de unas bacterias a otras con posterior recombinacin de los fragmentos adquiridos en el cromosoma o en los plsmidos de las bacterias receptora. Conocemos dos formas de recombinacin: la recombinacin homloga y la transposicin. En la recombinacin homloga el fragmento de ADN aceptado es muy similar a una parte del genoma del a bacteria y, tras situarse al lado, se intercambian con l por un mecanismo de rotura, entrecruzamiento y reunin de sus cadenas de ADN. La transferencia previa a este tipo de recombinacin puede ocurrir mediante tres vas: la penetracin de ADN desnudo directamente a travs de la pared de la clula receptora (transformacin), mediante un bacterifago que infecta diferentes poblaciones bacterianas (transduccin), o por transferencia de plsmidos y en su caso de genes cromosmicos arrastrados por plsmidos desde las bacterias donadoras a las receptoras (conjugacin).Transformacin En la transformacin la bacteria receptora acepta molculas desnudas de ADN que penetran por su pared desde el medio externo. De forma natural podra ocurrir cuando las bacterias receptoras comparten su ecosistema con una poblacin de bacterias donadoras que muere y cuyos cromosomas se fragmentan. El ADN desnudo es destruido rpidamente por DNAsas que son enzimas muy frecuentes en muchos medios, por lo que la probabilidad de que ocurran transformaciones naturales es pequea. Adems la pared de la clula receptora debe estar relativamente permeable para dejar pasar fragmentos de ADN. Suelen ser competentes, es decir, capaces de sufrir transformacin las especies de Streptococuus, Staphylococcus, Haemophilus, Neisseria y Bacillus. Sin embargo en el laboratorio puede forzarse la competencia mediante cambios en la concentracin de calcio del medio. Esta tcnica se emplea para introducir en la bacteria molculas mixtas de ADN recombinante de las que interesa obtener copias (clonacin).

Metodologa.

Transformacin de clulas competentescon el vector PET-TEM/-1 por el mtodo de choque trmico. (Manual de prcticas de Bioqumica experimental (MPBE), tema 3, Parte I. [MPBE (0141), Sobeida S.N. pg. 28-32]).

Resultados.No se observ crecimiento de colonias en la placa de Agar LB canamicina.Anlisis de resultados y conclusiones.No hubo transformacin de clulas competentes con el vector PET-TEM-1 por el mtodo de choque trmico debido a que no se obtuvo crecimiento en la placa de Agar LB canamicina, por lo que tampoco se pudo realizar el clculo de la eficiencia de la transformacin y esto se atribuye a que las clulas competentes ya estaban previamente desnaturalizado o al momento de permeabilizar la membrana en el choque trmico a 42C, se agit el medio.

CUESTIONARIO

1. 1.Qu es un organismo transgnico?1. Debido a que el DNA contiene un cdigo gentico esencialmente igual para todos los organismos, en principio se pueden transferir secuencias de genes de organismos no relacionados y producir organismos con caractersticas tiles y particulares que de otra manera sera imposible obtener los organismos transgnicos. La transgnia es una de las biotecnologas cuyo fin es la creacin y produccin de Organismos Genticamente Modificados OGM o GMOs por sus siglas en ingls Genetically Modified Organisms ms conocidos como trangnicos. Los genes se encuentran agrupados en paquetes muy comprimidos de cido desoxirribonucleico (ADN) llamados cromosomas. Cuando se introduce un nuevo gen se pretende alterar la clula para que produzca o deje de producir un tipo especfico de enzima o protena, para que as la clula realice nuevas funciones.

1. 2.Qu es un vector de clonacin?1. Es un sistema que permite introducir en una clula hospedera el fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener mltiples copias); en sta clula hospedera el vector se replica y se expresa. La molcula que resulta de la unin de un DNA vector con el DNA de inters (inserto) se denomina molcula vector recombinante. Los vectores de clonacin son secuencias de ADN que sirven para transferir nuevas secuencias de ADN a clulas husped.

3.Cules son los requisitos que debe de cumplir un vector de clonacin para ser utilizado para transformar un organismo?

Tener su propio origen de replicacin y, por tanto, la capacidad de replicacin autnoma e independiente del genoma del hospedero.Tener un sitio de clonacin mltiple (SCM) que permite la apertura del DNA con enzimas de restriccin (enzimas que cortan secuencias internas de DNA de manera especfica) y hace posible la clonacin de insertos de DNA en la forma y orientacin deseada.Poseer marcadores genticos seleccionables que permitan aislar a las clulas hospederas que contengan al vector, generalmente resistencia a un antibitico. La mayora de los plsmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una tarea de la ingeniera gentica ha consistido en la construccin de plsmidos artificiales, combinando en una misma molcula diversos rasgos tiles procedentes de los plsmidos naturales. En general: Vector de clonacin- molcula de DNA transportadoraReplicacin independiente (ori*) Sitios de corte nicosMarcador de seleccinRecuperacin sencilla

4.Da dos ejemplos de vectores que son usados para la clonacin de fragmentos de DNA de alto peso molecular

Plsmido y E. coli.5.Qu tipo de vector de clonacin es el pET24?

Plsmido pTE24 que es un marcador de seleccin resistente a la kanamicina, es decir que tiene a la protena -lactamasa que inactiva al antibitico.

6.Cul es el mtodo de transformacin que se utilizar en la prctica?

Por mtodo de choque trmico

7.Describe al menos otros dos mtodos para transformar clulas ya sea de animales hongos o plantas.

Existen varias tcnicas para la introduccin del transgene en la clula u organismo, como son la microinyeccin, la infeccin de una clula husped con virus que contenga al vector, o mediante el uso de bacterias (principalmente para la transformacin de plantas).Nanotubos de carbono funcionalizados con aminas: Un grupo de investigadores de la Facultad de Qumica (FQ) de la UNAM, encabezados por Tzvetanka Dimitrova Dinkova, desarrolla un mtodo para transformar clulas de maz y tabaco mediante el uso de nanotubos de carbono funcionalizados con aminas

1. 8.Para realizar la transformacin de clulas, adems del vector de clonacin se necesitan las clulas receptoras, qu tipo de clulas receptoras son las E. coli DH5 y las clulas E.coli BL21?1. E. coli DH5: Es una cepa de clonacin con mltiples mutaciones que permiten transformaciones de alta eficiencia. Las mutaciones que la cepa DH5-alfa tiene son: dlacZ Delta M15 Delta (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (RK-mK +) supE44 thi-1 gyrA96 relA1. Estas mutaciones corresponden a las distintas caractersticas que hacen que la cepa DH5-alfa sobresalir en los procedimientos de clonacin de laboratorio.LacZ Delta M15 mutacin: Permite la deteccin azul-blanco de clulas recombinantes. EndA1 mutacin: Permite la degradacin endonucleasa inferior que garantiza altas tasas de transferencia de plsmidos. RecA1 mutacin: reduce la recombinacin homloga para una insercin ms estable.E.coli BL21: Qumicamente competentes, clulas adecuadas para la transformacin y expresin de la protena.Eficiencia de transformacin: 1-5 x 107 ufc / g de ADN pUC19T7 Expresin StrainDeficiente en proteasas Lon y OmpTResistente al fago T1 (fhuA2)B Strain

Libre de productos de origen animal

9.Cul es el marcador de seleccin de las cepas transformantes y dnde se encuentra codificado? El marcador de seleccin es la resistencia a la kanamicina y se encuentra codificado en el vector.

10.Despus de obtener un organismo transgnico, cules son los cuidados que se deben tener para su manipulacin o almacenamiento?Los cuidados referentes a cualquier organismo transgnico se deben realizar de manera higinica y adecuada, teniendo en todo momento una manipulacin adecuada e higinica, teniendo en cuenta que durante la manipulacin y proceso de almacenamiento, esto no conlleve a una alteracin fsica o qumica, para ello se tienen que de saber tales propiedades.

Pginas consultadas. A. Jimnez Snchez, R. Guerrero (1982); Gentica Molecular Bacteriana; Editorial Revert, S.A; Espaa; Pp. 99-114. Y. Stainer Roger, [et al.]; (1992); Microbiologa; 2 Edicin; Editorial Revert, S.A.; Espaa; Pp. 286-288. Loeza Lara Pedro D., [et al.]; (2004)Mecanismos de Replicacin de los plsmidos bacterianos; REB23 (2): 71-78; consultado el da 18 de Octubre de 2015 desde: http://www.facmed.unam.mx/publicaciones/ampb/numeros/2004/06/71-78_PEDRO_D.pdf

http://www.uniprot.org/uniprot/P00340 http://mural.uv.es/monavi/disco/primero/bioquimica/Tema4.pdf http://www.datoanuncios.org/?a=21191