Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Campo 1

Carrera: Química

Asignatura: Bioquímica estructural

Grupo: 2601

Reporte de la práctica No. 8 “Cinética enzimática de la ureasa”

Equipo No. 2

Chávez Ramos Kenia

León León Donaldo Gamaliel

Fecha de realización de la práctica: 25 de abril de 2012

Fecha de entrega del reporte: 2 de mayo de 2012

Asesoras:

Q. Karla Hernández Pérez

QFB Jessica Filisola Villaseñor

Introducción

Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: Una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible (ver Energía libre de Gibbs), pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas.

Figura 1. Graficas de las energias de las diferentes fases de una reacción química.

Las velocidades de las enzimas dependen de las condiciones de la solución y de la concentración de sustrato. Aquellas condiciones que desnaturalizan una proteína, como temperaturas elevadas, pH extremo o altas concentraciones de sal, dificultan o impiden la actividad enzimática, mientras que elevadas concentraciones de sustrato tienden a incrementar la actividad. Para encontrar la máxima velocidad de una reacción enzimática, la concentración de sustrato se incrementa hasta que se obtiene una tasa constante de formación de producto.

A la máxima velocidad (Vmax) de la enzima, todos los sitios activos de dicha enzima tienen sustrato unido, y la cantidad de complejos ES es igual a la cantidad total de enzima. Sin embargo, Vmax es sólo una de las constantes cinéticas de la enzima. La constante de Michaelis-Menten (Km), que viene a ser la concentración de sustrato necesaria para que una enzima alcance la mitad de su velocidad máxima. Cada enzima tiene un valor de Km característico para un determinado sustrato, el cual puede decirnos cómo de afín es la unión entre el sustrato y la enzima.

Figura 2. Curva de saturación de una reacción enzimática donde se muestra la relación entre [S] y la velocidad de reacción.

Los inhibidores son moléculas que regulan la actividad enzimática, inhibiendo su actividad. A grandes rasgos, pueden clasificarse en reversibles e irreversibles. Las irreversibles se unen covalentemente a la enzima sin posibilidad de revertir la modificación, siendo útiles en farmacología. Las reversibles se unen de forma reversible a la enzima, pudiendo clasificarse a su vez, según la forma en que intervienen en la reacción, en competitivas, acompetitivas y mixtas.

Figura 3. Inhibición enzimática.

Objetivos.

Extraer ureasa de frijol de soya aplicando homogeneización mecánica con un mortero y empleando centrifugación esto con el fin de analizar factores que modifican la cinética de esta enzima sobre la urea.

Analizar los siguientes factores: concentración de sustrato, temperatura, pH y tiempo en la modificación de la velocidad de reacción enzimática para determinara la condiciones óptimas de trabajo de la enzima.

Obtener experimentalmente valores de Vmáx y de Km por medio del modelo de Michaellis-Menten y por el modelo de Lineweaver-Burk y estos compararlos con los reportados en la literatura.

Diagrama ecológico.

Metodología.

La extracción de la enzima, se llevo a cabo por cada equipo. La modificación realizada a la práctica, fue que se repartió el resto de las actividades; siendo el pH el factor con el que trabajamos empleando la metodología indicada en el manual de Bioquímica, correspondiente a la práctica No. 8, página 65.

Observaciones y resultados.

Se trituraron 0.3g de frijol de soya y se agregaron 10 mL de etanol hasta obtener un homogeneizado.

Kenis no recuerdo si tomast foto a esto, si si lo tomast anexala sino omite esto.

Figura 4. Homogeneizado de frijol de soya.

Se centrifugo el homogeneizado a 2500 rpm durante 15 min.

La misma indicación anterior kenis.

Figura 5. Centrifugado del homogeneizado.

Se preparo una serie de 5 tubos de acuerdo a las indicaciones en el manual de prácticas que serian los blancos, también se preparo otra serie de tubos siguiendo otra metodología también indicada en el manual pero estos serán los tubos problema. Estas dos series de tubos se incubaron a 50°c durante 5 minutos pasado este tiempo se les adiciono 0.5 mL del extracto de ureasa mientras volviéndose a incubar por 30 min a 50°C, terminado el tiempo a los tubos problema se les adiciono 4 gotas de bicloruro de mercurio y a ambas series se les agrego 2 gotas de rojo de metilo y se procedió a valorar con HCl 0.1N hasta un vire de color canela.

Figura 6. Coloración canela esperada.

Cálculos y gráficos.

Se procedió a calcular los micromoles de urea hidrolizados para cada uno de los factores de cada uno de los tubos, teniendo en cuenta que al hidrolizarse la urea se producen dos iones de amonio que reaccionan con el HCl 0.1N que contiene 100 micromoles/mL, de tal manera que los micromoles de urea hidrolizados se obtienen multiplicando el valor de titulación corregido (VTC) de cada tubo por 50, esto porque por cada dos iones de amonio reacciona un micromol de HCl, es decir, se tienen 50 micromoles por cada molécula de amonio formada por la hidrólisis de la urea

que están reaccionando con los 100 micromoles de HCl. Creo q s x esto el 50, si cres q s otro cosa kenis, asmelo saber!.

micromolesde ureahidrolizados=VTC x 50

VTC=VTP ( vol de titulacióndel problema )−VTB(vol de titulaciondel blanco)

Tabla 1. Efecto del pH sobre la velocidad de la reacción.

Tubo pH VTB VTP VTC µmoles de urea hidrolizadas1 4.5 0 0 0 02 6 0.1 0.6 0.5 253 7.2 1.7 2.3 0.6 304 8.5 2.4 2.6 0.2 105 10 2.6 2.8 0.2 10

Cabe mencionar que la coloración inicial de la muestra a valorar con la gotas de rojo de metilo era de color amarillo y al adicionar HCl 0.1N y alcanzar el volumen de vire se observaba una coloración color canela como se menciono anteriormente. En el caso de los tubos 1 y ya que los valores son de 0 en el caso del blanco presentaba una coloración rojiza intensa esto significa que el pH en el medio es más bajo en comparación de la muestra problema que está presentaba la coloración canela.

Se realizo un grafico de Velocidad de reacción donde esta se expresa en micromoles/mL en función del pH.

4 6 8 10 120

5

10

15

20

25

30

35

pH

V /

µmol

es m

L-1

pHopt

Gráfica 1. Velocidad de reacción en función del pH.

La línea punteada muestra que el pH óptimo de trabajo es de 7.2, esto quiere decir, que al valor de pH mencionado es el valor donde la enzima presenta su mayor actividad catalítica.

Como método alternativo; el pH es una función logarítmica de la concentración de protones ([H+]) por lo tanto se realizara un grafico parecido al anterior con la diferencia que ahora se expresara la velocidad de reacción en escala logarítmica, es decir, se graficara log v en función del pH. Ya que el primer valor es cero, a este no se le aplicara logaritmo ya que es un error matemático.

4 5 6 7 8 9 10 110

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

pH

log

V

pHopt

Gráfica 2. Logaritmo de la velocidad de reacción en función del pH.

De acuerdo al gráfico la velocidad máxima se da al valor de pH de 7.2, mismo valor determinado anteriormente, por lo tanto, el pH óptimo es de 7.2

Para obtener los micromoles de urea hidrolizadas para el resto de los factores en estudio, los equipos nos proporcionaron sus resultados para poder lograr los objetivos, presentados en las posteriores tablas (tabla 2, 3 y 4) posteriormente se realizo un grafico para cada factor de velocidad de reacción (µmoles de urea hidrolizadas) en función de cada factor.

Tabla 2. Efecto del tiempo sobre la velocidad de la reacción.

Tubo t/min VTB VTP VTC µmoles de urea hidrolizadas1 10 0.4 0.3 -0.1 -52 20 0.3 0.3 0 03 30 0.4 0.3 -0.1 -54 40 0.3 0.5 0.2 105 50 0.4 0.4 0 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

t/min

V /

µmol

es m

L-1

Gráfica 3. Velocidad de reacción en función del tiempo.

Ya que el grafico no presenta el comportamiento correcto, se retiraran los datos (30,-0.5) y (50,0) y posteriormente se tratara el análisis de esta grafica; por el momento se indicara que el retirar los datos es incorrecto pero se hará con fines de análisis de resultados.

5 10 15 20 25 30 35 40 45

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

t/min

V /

µmol

es m

L-1

Gráfica 4. Velocidad de reacción en función del tiempo corregida.

Tabla 3. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción.

Tubo T/°C VTC µmoles de urea hidrolizadas1 0 0.2 102 26 0.3 153 50 0.6 304 70 0.2 105 90 0.1 5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000

5

10

15

20

25

30

35

T/°C

V /

µmol

es m

L-1

Topt

Gráfica 5. Velocidad de reacción en función de la temperatura.

De acuerdo a la gráfica se pudo obtener la temperatura óptima de trabajo, es decir, la temperatura a la cual la enzima tiene su mayor actividad catalítica siento este valor de 50°C.

Para el efecto de la concentración de sustrato, primeramente se calcularon los micromoles de urea iniciales por mL para cada tubo tomando en cuenta que cada mL de solución 0.25M de urea contiene 250 micromoles/mL así como el volumen total en cada tubo. El cálculo de los micromoles hidrolizados se realizo de la manera anteriormente mencionada.

Por ejemplo para el primer tubo que contenía 0.5mL de urea 0.25M y un volumen total de 10mL el cálculo de los micromoles iniciales es de la siguiente manera:

0.5mL( 250µmoles1mL )( 110mL )=12.5 µmolesmL

Tabla 4. Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción.

Tubo Concentración inicial de urea en µmoles/mL en el medio

VTC µmoles de urea hidrolizadas

1 12.5 0.8 402 25 1.2 603 50 1 504 125 1 505 187.5 1 50

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

10

20

30

40

50

60

70

f(x) = 50

[S]i / µmoles mL-1

V /

µmol

es m

L-1

KM=7.5

1/2 Vmáx=25

Gráfica 6. Velocidad de reacción en función de la concentración de sustrato inicial.

Aunque el grafico anterior no presenta el comportamiento correcto, se determino el valor de KM característico de esta enzima, siendo es de 7.5 µmoles/mL.

Ya que estos valores no son del todo correctos por el mal comportamiento del grafico, con fines de obtener mayor utilidad de estos datos, se procedió a realizar un grafico de dobles reciprocos (ecuación de Lineweaver-Burk), donde la expresión es la ecuación de una línea recta:

1v=KMV máx ( 1[S ] )+ 1

V máx

Tabla 5. Valores de 1/[S] y 1/V.

1/[S] 1/V0 0

0.08 0.0250.04 0.016666670.02 0.02

0.008 0.020.00533333 0.02

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.090

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

1/[S]

1/V

Gráfica 7. Gráfica de dobles recíprocos.

El comportamiento no es el esperado, y por lo tanto no se puede obtener de manera consistente valores para Vmáx y KM.

Discusión de resultados.

Primeramente, las enzimas son sensibles al pH; esta dependencia del pH se debe, normalmente, a la presencia de uno o más aminoácidos cargados en el sitio activo de la enzima o del propio sustrato. Como se podría esperar, la dependencia del pH de una enzima normalmente refleja el medio ambiente en el cual la enzima esta activa, es decir, existe un valor de pH en donde la enzima presenta su actividad máxima, se le conoce como pH optimo, así que por debajo o por encima de este valor de pH la enzima se inactiva. De acuerdo a esto, el valor obtenido experimentalmente corresponde a un valor de pH de 7.2, esto es corroborado con la literatura y por lo tanto, el efecto del pH sobre la actividad de la ureasa es notorio en la velocidad de reacción para valores de pH mayores y menores de 7.2, su máxima actividad catalítica es a este valor de pH.

Con respecto al efecto del tiempo en la velocidad de reacción, experimentalmente no se obtiene el resultado esperado ya que el grafico no presenta el comportamiento característico, el cual debió haber sido parecido al de la gráfico 4 supuestamente corregida, pero como se menciono anteriormente, esa corrección es errónea ya que no se están tomando casi la mitad de datos y se está forzando a tomar la tendencia esperada.

La tendencia correcta (Gráfica 4) es válida para cuando la concentración de sustrato es mayor que la concentración del enzima, esto porque a mayor concentración del sustrato la enzima se cubre de en su totalidad por este haciendo que la actividad de la enzima se lleve a cabo en su totalidad.

La desaparición de sustrato por la acción de la enzima es una función lineal del tiempo, esta velocidad alcanza un límite de acuerdo a la naturaleza de la enzima y del sustrato.

Ahora, porque no se obtuvo una línea recta parecida a la mostrada en la figura 7, esto error puede radicar en la temperatura en la que se trabajo, es decir, que por alguna razón esta haya excedido los 50°C y la enzima al sobrepasar esta temperatura se inactiva, y que de acuerdo a los datos experimentales, los cuales algunos presentan signo negativo significaría que la enzima no existe en el sistema. Otra posible respuesta a esto conlleva a un error experimental, que no se hayan tenido los cuidados pertinentes y que antes de la valoración hubiera existido una confusión entre muestra problema y muestra blanco y esto se vea reflejado en los signos negativos que se obtuvieron. Justificación para esto podrían existir más pero lo antes mencionado es lo que consideramos razonable para este problema.

Con respecto al efecto de la temperatura, la velocidad de reacción catalizada por una enzima aumenta con la temperatura, ya que el incremento en la energía cinética de las moléculas de la enzima y del sustrato, conduce a un mayor número de colisiones facilitando la unión correcta al sustrato. Sin embargo se llega un punto en el que el aumento en la temperatura es desfavorable porque la enzima se comienza a desnaturalizar. Por lo tanto se alcanza una temperatura en donde la enzima presenta su actividad máxima y que por debajo de esta la reacción se lleva a menor velocidad y por arriba de esta la enzima se inactiva. Experimentalmente el valor obtenido de temperatura óptima de trabajo es a 50°C, dato que se corrobora con la literatura, siendo esta temperatura a la cual la ureasa presenta su mayor actividad y como se menciono anteriormente, el sobrepasar de esta temperatura pudo haber provocado que la enzima se inactivara y así hubieran existido errores experimentales.

Por último, la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente, aumenta con la concentración de sustrato pero de tal forma que cada incremento adicional de sustrato, da como resultado un aumento menor de la velocidad de reacción. De manera más precisa, se alcanzara un punto en donde ya no se observara ningún cambio en la velocidad de reacción. Al alcanzar este punto, sin importar el incremento en la concentración de sustrato, la velocidad de reacción permanecerá constante, a este punto se le conoce como velocidad máxima (Vmáx). Esta relación corresponde al modelo empleado por Michaellis-Menten que se puede ejemplificar de la siguiente manera:

Figura 7. Relación entre velocidad de reacción y concentración de sustrato.

Experimentalmente no se obtuvo una tendencia de este tipo (gráfica 6), pero con fines de enriquecer este análisis, se procedió a determinar Vmáx y Km. Se obtuvo un valor de 50 µmoles/mL como Vmáx, para determinar el valor de Km, se consideraro:

KM=V máx2

Y aplicando interpolación se obtuvo dicho valor, siendo este de 7.5 µmoles/mL, teóricamente el valor de Km es de 2.5x10-2 M es decir 25 µmoles/mL, por lo que el resultado obtenido no es el correcto, esto puede ser justificado por qué no existió la tendencia esperada en este grafico (gráfica 6).

Ya que el primer grafico 6 no es congruente y no se obtuvieron resultados favorables se procedió a realizar el grafico de dobles recíprocos (modelo Lineweaver-Burk), en este tipo de grafico se obtiene una función lineal, la cual es un arreglo al modelo empleado por Michaellis-Menten. El grafico teórico presenta la siguiente tendencia.

Figura 8. Representación del modelo de Lineweaver-Burk.

De nueva cuenta, experimentalmente, no se obtiene el resultado esperado (gráfica 7) y por esta razón, y como se menciono anteriormente, no se pueden obtener valores para Vmáx y Km.

De haberse propuesto la obtención de estos valores, habrían sido erróneos con la justificación del mal comportamiento de dicha gráfica pero esta demás determinarlos.

Conclusiones.

Se extrajo uresa apartar del frijol de soya aplicando homogeneización mecánica con un mortero y empleando el método de centrifugación, en donde el sobrenadante contenía esta enzima. Dicha enzima fue empleada para la hidrólisis de la urea.

En la hidrólisis se analizaron diversos factores que pueden modificar la velocidad de esta reacción, entre ellos, el pH, la temperatura, el tiempo y la concentración de sustrato. A partir de esto se obtuvieron las condiciones óptimas de trabajo de la enzima, las cuales son:

pH=7.2 T=50°C

Estas condiciones, fueron corroboradas con las reportadas en la literatura, siendo correctas.

No se obtuvo la linealidad esperada con respecto al tiempo, en donde se planteo como justificación un incremento en dicha temperatura, el cual pudo propiciar la desnaturalización de la enzima o bien, un error en cuanto a la metodología a seguir.

A partir del efecto propiciado por la concentración de sustrato se espero determinar el valor de Vmáx y de Km; experimentalmente se obtuvo una Vmáx de 50µmoles/mL y un valor de Km de 7.5µmoles/mL, este último no corresponde con el valor teórico reportado, el cual es de 25 µmoles/mL.

Asimismo se comprendió la relación que existe entre los factores antes mencionados y la velocidad de reacción de una reacción catalizada enzimáticamente así como la modificación de esta, por la sensibilidad a dichos factores.

Referencias.

BECKER. W.M. (2012). “Biología celular y molecular”. Primera edición, Editorial Pearson Educación, México. Pags. Consultadas: 176-187.

LEHNINGER. A. L. (1985). “Curso breve de Bioquímica”. Primera edición, Editorial Omega, Barcelona. Pags. Consultadas: 74-77.

LAGUNA. J y PIÑA E. (1995) “Bioquímica”. Primera edición, editorial ciencia y cultura latinoamericana, México. Pags. Consultadas: 60-72.

Valor de Km de la ureasa. [en línea]. Recuperado el 28 de Abril de 2012, de http://books.google.com.mx/books?id=r5bedH_aST0C&pg=PA495&lpg=PA495&dq=valor+de+km+de+la+ureasa&source=bl&ots=RlgOjTwaO8&sig=nYoU3iALgm8r0x5nSNPTt2AvzRY&hl=es&sa=X&ei=6lmfT9-GC8W42wWzxvHOAg&ved=0CDkQ6AEwBA#v=onepage&q=valor%20de%20km%20de%20la%20ureasa&f=false