Replicación de ADN. La doble

hélice es desenrollada y cada

hebra hace de plantilla para la

síntesis de la nueva cadena. La

ADN polimerasa añade los

nucleótidos complementarios a los

de la cadena original.

Replicación de ADNDe Wikipedia, la enciclopedia libre

El proceso de replicación de ADN es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copiaidéntica). De esta manera de una molécula de ADN única, se obtienen dos o más "clones" de la primera. Esta duplicacióndel material genético se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenascomplementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva cadenacomplementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hélice contiene una de las cadenas del ADN original.Gracias a la complementación entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene laimportante propiedad de reproducirse idénticamente, lo que permite que la información genética se transmita de una célulamadre a las células hijas y es la base de la herencia del material genético.

La molécula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las basescomplementarias liberándose dos hebras y la ADN polimerasa sintetiza la mitad complementaria añadiendo nucleótidos quese encuentran dispersos en el núcleo. De esta forma, cada nueva molécula es idéntica a la molécula de ADN inicial.

La replicación empieza en puntos determinados: los orígenes de replicación. Las proteínas iniciadoras reconocen secuenciasde nucleótidos específicas en esos puntos y facilitan la fijación de otras proteínas que permitirán la separación de las doshebras de ADN formándose una horquilla de replicación. Un gran número de enzimas y proteínas intervienen en elmecanismo molecular de la replicación, formando el llamado complejo de replicación o replisoma. Estas proteínas y enzimasson homólogas en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias.

Índice

1 Características generales2 Semiconservadora3 Secuencial y bidireccional desde puntos fijos.

3.1 El origen de replicación3.2 Secuencialidad3.3 La replicación avanza en forma de horquilla

3.4 Bidireccionalidad4 Semidiscontinua

5 ADN Polimerasas6 Modo de operación

7 Proceso general7.1 Iniciación

7.2 Elongación

7.3 Terminación (de los genomas lineales)8 Véase también

9 Referencias10 Bibliografía

11 Enlaces externos

Características generales

• Es una cadena molecular, quiere decir que es una sustancia constituida por distintos tipos de moléculas sencillas ligadas entre sí para así ir formando cadenas.

• Es bastante largo y extremadamente delgado. Si aumentáramos cien veces el tamaño del núcleo celular alcanzaría el tamaño de la punta de un alfiler, mientras queel ADN plegado en ese mismo núcleo alcanzaría la longitud de un campo de fútbol.

• Hay cuatro tipos de eslabones, esos son las moléculas denominadas nucleótidos en la cadena. Sus nombres son: ácido adenílico (adenina), ácido guanílico(guanina), ácido citidílico (citosina) y ácido timidílico (timina) y las abreviaturas, A, G, C, T, para cada una.

Semiconservadora

En cada una de las moléculas madres* se conserva una de las cadenas originales, y por eso se dice que la replicación del ADN es semi conservadora. Hasta quefinalmente se pudo demostrar que la replicación es semiconservadora, se consideraron tres posibles modelos para el mecanismo de la replicación:

Semiconservadora (modelo correcto). En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las cadenas originales.Conservadora. Se sintetiza una molécula totalmente nueva, copia de la original.

Dispersora, o dispersante. Las cadenas hijas constan de fragmentos de la cadena antigua y fragmentos de la nueva.

El experimento de Meselson y Stahl en 1958 permitió demostrar que el mecanismo real se ajusta a la hipótesis de replicación semiconservadora. Para ello sehicieron crecer células de Escherichia coli en presencia de nitrógeno-15, un isótopo del nitrógeno más pesado de lo habitual. En consecuencia, el isótopo seincorporó a las cadenas de ADN que se iban sintetizando, haciéndolas más pesadas.

Tres posibles modelos de replicación. a)

Conservadora, b) Dispersora, c) Semiconservadora

(mecanismo real)

Una vez conseguido el primer objetivo, las células fueron transferidas a un medio que contenía nitrógeno-14, es decir, un medio más ligero, donde continuaron su crecimiento (división celular, que requiere lareplicación del ADN). Se purificó el ADN y se analizó mediante una centrifugación en gradiente de clorurode cesio, en donde hay más densidad en el fondo del tubo que en la parte media del mismo.

En la primera generación (figura 2.b) se obtuvo una única banda de ADN con densidad intermedia. En lasegunda generación (figura 2.c) se obtuvieron dos bandas, una con densidad ligera y otra con densidadintermedia o híbrida. En la tercera generación se obtuvieron dos bandas, una ligera (con una abundancia del75%) y otra intermedia (con el 25% restante).

La banda intermedia o híbrida representa una molécula de ADN que contiene una cadena pesada (original)y otra ligera (recién sintetizada). Las cadenas ligeras representan una molécula de ADN en la que las doscadenas han sido sintetizadas (no existían aun cuando las células se pusieron en presencia de nitrógeno-15).

El hecho de que cada vez haya más moléculas ligeras y se mantenga el número de moléculas intermedias demuestra que la replicación del ADN essemiconservadora. Si fuera conservadora, aparecería siempre una banda pesada y el resto ligeras (figuras 1.a, 1.b, 1.c) . Si fuera dispersante sólo aparecerían

bandas híbridas de densidad intermedia en todas las generaciones.1

Secuencial y bidireccional desde puntos fijos.

Los orígenes de replicación son los puntos fijos a partir de los cuales se lleva cabo la replicación, que avanza de forma secuencial formando estructuras con formade horquilla. Por otro lado, la replicación se lleva a cabo bidireccionalmente, es decir, a partir de cada origen se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos.

El origen de replicación

La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un único origen de replicación se denomina replicón o unidad funcional de replicación. El genomabacteriano es un replicón único circular. En organismos eucarióticos, la replicación del ADN se inicia en múltiples orígenes a la vez (hay uno cada 20 kb

aproximadamente), es decir, hay varios replicones.2

En las células eucariotas hay varios replicones

Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli permitieron determinar la existencia de ese punto fijo u origen de replicación apartir del cual el genoma empezaba a replicarse. Los experimentos consistían en mantener un cultivo de E. coli creciendo en un medio que contenía timidina tritiada(timina marcada con tritio), de forma que el ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una autorradiografía. A continuación se observaba al

microscopio. Los resultados indicaban que la replicación en E. coli se iniciaba en un punto concreto (OriC).3

Secuencialidad

Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genéticos de complementación de mutaciones que permitieron determinar que desde los orígenes la replicaciónavanza de forma secuencial. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible obtener cultivos sincronizados de forma que todas las células del cultivo estuvieranen la misma fase del ciclo celular. El método consistía en la conjugación bacteriana de cepas silvestres con cepas mutantes incapaces de sintetizar determinadosaminoácidos. Conociendo la localización de los genes que codifican las proteínas implicadas en la síntesis de los diferentes aminoácidos en el cromosomabacteriano, y haciendo crecer las bacterias receptoras en un "medio mínimo" (donde sólo pudiesen crecerlas que hubieran recibido alguno de estos genes), al extraer ADN a diferentes tiempos se observó que, trasla última extracción aparecía con mayor frecuencia el gen implicado en la síntesis de uno de los aminoácidos(el correspondiente a la "posición 1"), que el gen adyacente implicado en la síntesis de otro aminoácido("posición 2"). De la misma forma, el gen que ocupaba la "posición 3" aparecía con menor frecuencia que elque ocupaba la "posición 2", y así sucesivamente.

Como los primeros genes en replicarse en la bacteria donadora serían los primeros en transferirse, elexperimento permitió demostrar, a partir de las frecuencias relativas de los diferentes genes en las bacteriasreceptoras, que la replicación sigue un orden (es secuencial).

La replicación avanza en forma de horquilla

Experimento de Meselson y Stahl.

Experimento de Cairns

Debido a que en la célula ambas cadenas de la doble hélice de ADN se duplican al mismo tiempo, éstasdeben separarse para que cada una de ellas sirva de molde para la síntesis de una nueva cadena. Por eso,la replicación avanza con una estructura en forma de horquilla formándose una burbuja u ojo de replicación(también llamada estructura θ cuando el ADN es circular debido a la similaridad entre la letra griega y laforma que adopta el cromosoma bacteriano en estados intermedios de replicación, no obstante pudiendo

aparecer estructuras alternativas),3 que avanza en dirección a la región de ADN no duplicado dejando atrás

los dos moldes de ADN de cadena simple donde se está produciendo la replicación.2

Bidireccionalidad

El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayoría de los casos, es decir, a partir de un punto sesintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. Esto ocurre en la mayoría de los organismos, pero se danexcepciones en algunos procariontes debido a que los mecanismos de replicación que tienen lugardependen de la propia estructura de su material hereditario (si el ADN es circular, lineal, bicatenario o

monocatenario).3 Así, en casos particulares como el ADN mitocondrial, algunos plásmidos y algunosgenomas monocatenarios de fagos pequeños, la replicación se da unidireccionalmente pudiendo haber unoo dos orígenes de replicación.

En la mayoría de los casos la replicación es bidireccional

No obstante, la replicación se puede considerar, de forma general, bidireccional.

Distinción entre la

replicación unidireccional

y la bidireccional

mediante el recuento de

copias de genes

marcadores. O es el

origen de replicación y A,

B, C, D, E son genes

marcadores.

La evidencia experimental del crecimiento bidireccional de la hebra de ADN viene dada por una técnica basada en el marcaje radiactivo del ADN usando timidinamarcada con tritio. Primero se añade timidina sin marcar y luego marcada con tritio; siguiendo el rastro de tritio se observa hacia dónde se ha replicado la molécula

de ADN.3 También se puede, mediante el recuento de copias de genes marcadores, determinar si la replicación es unidireccional o bidireccional. Otras técnicas sebasan en medir la distancia desde los ojos de replicación hasta los extremos de un ADN lineal (o circular convertido en lineal mediante enzimas de restricción).

Semidiscontinua

La replicación siempre se produce en sentido 5' → 3', siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del cual se produce laelongación del ADN. Esto plantea un problema, y es que las cadenas tienen que crecer simultáneamente a pesar de que sonantiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de lascadenas debería ser sintetizada en dirección 3' → 5'.

Este problema lo resolvieron los científicos japoneses Reiji Okazaki y Tsuneko Okazaki en la década de 1960, al descubrir que unade las nuevas cadenas de ADN se sintetiza en forma de trozos cortos que, en su honor, se denominan fragmentos de Okazaki. Sulongitud suele variar entre 1000 y 2000 nucleótidos en las bacterias y entre 100 y 400 nucleótidos en eucariontes.

La cadena que se sintetiza en el mismo sentido que avanza la horquilla de replicación se denomina hebra adelantada (en inglés,leading strand, que a veces se traduce por líder o conductora) y se sintetiza de forma continua por la ADN polimerasa, mientrasque la que se sintetiza en sentido contrario al avance se denomina hebra rezagada o retrasada (en inglés, lagging strand), cuyasíntesis se realiza de forma discontinua teniendo que esperar a que la horquilla de replicación avance para disponer de una cierta

longitud de ADN molde.2

ADN Polimerasas

La ADN polimerasa es la enzima que cataliza la síntesis de la nueva cadena de ADN a partir de desoxirribonucleótidos y de lamolécula de ADN plantilla o molde que es la que será replicada. La enzima copia la cadena de nucleótidos de forma complementaria(A por T, C por G) para dar a cada célula hija una copia del ADN durante la replicación.

Modo de operación

En cada horquilla de replicación, la ADN polimerasa y otras enzimas sintetizan dos nuevas cadenas de ADN que son complementarias respecto a las 2 cadenasoriginales. Durante este proceso, la ADN polimerasa reconoce una base nucleotídica no apareada de la cadena original y la combina con un nucleótido libre quetiene la base complementaria correcta. Luego, la ADN polimerasa cataliza la formación de nuevos enlaces covalentes que ligan el fosfato del nucleótido libre

La replicación es semidiscontínua

Estructura en 3D de un ADN

polimerasa

entrante con el azúcar del nucleótido previamente agregado en la cadena hija en crecimiento. De esta forma, la ADN polimerasa sintetiza el esqueleto de azúcar-fosfato de la cadena hija.

Las ADN polimerasas también realizan otras funciones durante el proceso de replicación. Además de participar en la elongación, desempeñan una funcióncorrectora y reparadora gracias a su actividad exonucleasa 3', que les confiere la capacidad de degradar elADN partiendo de un extremo de éste. Es importante que existan estos mecanismos de corrección ya quede lo contrario los errores producidos durante la copia del ADN darían lugar a mutaciones.

Proceso general

La helicasa rompe los puentes de hidrógeno de la doble hélice permitiendo el avance de la horquilla de replicación.

La topoisomerasa impide que el ADN se enrede debido al superenrollamiento producido por la separación de ladoble hélice.

Las proteínas SSB se unen a la hebra discontínua de ADN, impidiendo que ésta se una consigo misma.

La ADN polimerasa sintetiza la cadena complementaria de forma continua en la hebra adelantada y de formadiscontínua en la hebra rezagada.

La ARN primasa sintetiza el cebador de ARN necesario para la síntesis de la cadena complementaria a la cadena

Función correctora exonucleasa 3' → 5' de las ADN

polimerasas.

rezagada.

La ADN ligasa une los fragmentos de Okazaki.

El proceso se puede dividir en 3 fases: iniciación, elongación y terminación.

El cebador: son pequeñas unidades de RNA que se unen a los fragmentos para que la ADN

polimerasa reconozca donde debe unirse.

Los cebadores los quita la pol. I y coloca bases a la cadena en crecimiento por la ligasa.

Iniciación

Mediante consumo de ATP en dirección a la horquilla de replicación, es decir, en dirección 5' → 3' en lahebra rezagada y 3' → 5' en la hebra adelantada,la helicasa actúa rompiendo los puentes de hidrógeno que

mantienen unida la doble hélice.3 El siguiente conjunto de proteínas reclutadas son las denominadasproteínas SSB (single-stranded DNA binding proteins, proteínas ligantes de ADN monocatenario)encargadas de la estabilización del ADN monocatenario generado por la acción de las helicasas, impidiendo así que el ADN se renaturalice o forme de nuevo ladoble hélice, de manera que pueda servir de molde. Estas proteínas se unen de forma cooperativa, por lo que su unión al DNA conforme avanza la helicasa esrápida. Por otro lado, conforme las helicasas van avanzando se van generando superenrollamientos en la doble cadena de ADN por delante de la horquilla y siéstos no fueran eliminados, llegado a un punto el replisoma ya no podría seguir avanzando. Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los

superenrollamientos cortando una o las dos cadenas de ADN y pasándolas a través de la rotura realizada, sellando a continuación la brecha.2

Elongación

En el siguiente paso, la holoenzima ADN Pol III cataliza la síntesis de las nuevas cadenas añadiendo nucleótidos sobre el molde. Esta síntesis se dabidireccionalmente desde cada origen, con dos horquillas de replicación que avanzan en sentido opuesto. Cuando el avance de dos horquillas adyacentes las lleva aencontrarse, es decir, cuando dos burbujas se tocan, se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el cromosoma ha quedado replicado.

Puesto que la holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que una ARN primasa catalice la formación de un fragmento cortoespecífico de ARN llamado cebador, que determinará el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos. Así, durante la síntesis, en cadahorquilla de replicación se van formando dos copias nuevas a partir del cebador sintetizado en cada una de las dos hebras de ADN que se separaron en la fase deiniciación, pero debido a la unidireccionalidad de la actividad polimerasa de la ADN Pol III, que sólo es capaz de sintetizar en sentido 5´ → 3', la replicación sólopuede ser continua en la hebra adelantada; en la hebra rezagada es discontinua, dando lugar a los fragmentos de Okazaki.

Enzimas que participan en la replicación de

E. coli: helicasa, proteínas SSB,

topoisomerasa, ARN primasa, Holoenzima

ADN Pol III

Hebra rezagada: síntesis de cebadores,

unión de fragmentos de Okazaki y

eliminación de los cebadores

La mitad del dímero de la holoenzima ADN Pol III sintetiza la hebra adelantada y la otra mitad la hebra rezagada.3 La elongacion de la hebra rezagada ocurre pormedio del modelo del trombón.

En la hebra rezagada, cuando la ADN Pol III hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de éste es eliminado y losdos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado son unidos. Una vez se han juntado todos se completa la doble hélice de ADN. La eliminación decebadores también se da en la hebra conductora, de síntesis continua, pero debido a que en ésta hay un solo cebador es un proceso que sólo tiene lugar una vez,mientras que en la hebra rezagada se dará tantas veces como fragmentos de Okazaki haya.

En la eliminación del fragmento de Okazaki (también denominado iniciador, cebador o primer) intervienen dos enzimas: por un lado la ADN Pol I, que vaeliminando el ARN con su actividad exonucleasa 5' → 3' y simultáneamente rellenando con ADN mediante su actividad polimerasa 5' → 3' (proceso denominado

nick-traslation). Al final queda rotura (o "mella") entre el extremo 3'-OH libre y el fosfato 5' de la cadena sintetizada; por último, la ADNligasa sella esa rotura catalizando la reacción de condensación entre elgrupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del nucleótido contiguo,completando el enlace fosfodiéster; para ello, es preciso hidrolizar una

molécula de ATP.2

Nota: diversos autores difieren en los enzimas implicados en esta etapa.Para algunos no es la propia ADN Pol I la que rellena el hueco traseliminar el primer, sino que lo hace la ADN Pol III (la misma quepolimeriza el resto de la cadena). Del mismo modo, algunos autoressiguen empleando el término ribonucleasa o (RNasa) para referirse a laADN Pol I en esta etapa, ya que hasta hace poco se desconocía que lapropia ADN Pol I tenía la capacidad exonucleasa 5' → 3, y se pensabaque esto lo realizaba otro enzima, que recibía este nombre genérico.

Terminación (de los genomas lineales)

El final de la replicación se produce cuando la ADN polimerasa III seencuentra con una secuencia de terminación. Se produce entonces eldesacople de todo el replisoma y la finalización de la replicación.

Véase también

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