relato histórico del instituto de biología y medicina...

Acta Bioquím Clín Latinoam 2011; 45 (4): 599-719

Homenajes Reconocimiento a la trayectoria institucional del IBYME

Relato histórico del Instituto de Biología y Medicina Experimental

Eduardo Charreau

El IBYME nace en un momento de incomprensión eintolerancia en la vida político-científica argentina.

El 16 de octubre de 1943, poco antes de mediodía, laradio anunció que el gobierno había resuelto dejar ce-santes a los profesores universitarios y demás firmantesde un manifiesto publicado en los diarios del día ante-rior, en el que se expresaban anhelos de democraciaefectiva y solidaridad americana. Pero también es ciertoque el IBYME surgió del altruismo y la buena voluntadde gente comprometida con la Argentina.

Alrededor de las tres de la tarde del 18 de octubre, elProfesor Bernardo A. Houssay recibió la visita de dos ca-balleros que ofrecieron ayuda pecuniaria para que él ysu equipo prosiguieran con entera libertad las investi-gaciones desinteresadas, en vista de que el equipo de in-vestigaciones había quedado privado de trabajo. Creíande esta forma servir al país.

La proposición fue formulada por el Dr. Miguel F. Lap-hitzondo y el Sr. Pablo F. Perlender en su nombre y en eldel Sr. Fernando Capdevielle y el Ing. Carlos Sauberan,todos ellos en memoria de Juan Bautista Sauberan.

Casi simultáneamente, Houssay y sus colaboradoresrecibieron numerosos ofrecimientos, para ocupar cáte-dras o posiciones en Uruguay, Chile, Brasil y los EstadosUnidos, pero aunque eran tentadores prefirieron la pro-posición de nuestros compatriotas porque creyeron queera su deber seguir luchando en el país, por su adelantocientífico y la formación de investigadores, obra a lacual habían consagrado sus vidas a pesar de constantesdificultades. Testimonio elocuente de ello es la cartaque el Dr Houssay le dirige desde Washington a unamigo: “...Nos quieren hacer quedar y hasta ofrecentraer todo el personal de Buenos Aires, si quiero... Losrecursos son amplios, la gente amable, ávida para apren-der, llena de interés científico. Pero no olvido que mivida está consagrada a cosas casi imposibles, muchas delas cuales y otras inesperadas han ido llegando. Quierodedicarme al desarrollo científico del país donde nací,me formé, tengo amigos, nacieron mis hijos, luché,aprendí, enseñé, etc.”.

Esta extraordinaria fidelidad y compromiso con la Ar-gentina se hace más admirable si se contempla desde la

óptica de las circunstancias del momento, la tensión, an-gustia e incertidumbre sobre el futuro, en el cual peli-graba la tranquilidad personal y familiar.

Fue precisamente en esos días de conflictos que Hous-say redactó ese tipo de “credo” ampliamente divulgado,en el que expresaba sus convicciones con firmeza.

Dr. Bernardo A. Houssay Director: 1944-1970


600 Instituto de Biología y Medicina Experimental

El sueño de Houssay de fundar un Instituto privado deinvestigación, que no existía en el continente, dedicadoal estudio de los problemas fundamentales de la medi-cina y biología, comenzaba a hacerse realidad y así se re-fería a ese proyecto: “Este Instituto es una de las iniciati-vas más importantes realizadas en el país para establecerun centro de investigaciones científicas de carácter pri-vado e independiente de recursos del gobierno…” yagregaba: “estamos convencidos que este Instituto debetener vida permanente para lo cual deberán hallarse re-cursos y asignarle un personal competente y consagrado”.

La primera gran dificultad fue encontrar un lugaradecuado para su establecimiento y les correspondió alos Dres. Braun Menéndez y Foglia esa tarea preliminar.

Si bien las circunstancias eran favorables para adqui-rir o alquilar una vivienda con las comodidades que serequerían, ya que muchas familias estaban deseosas dereducir sus espaciosas mansiones, tan pronto como se en-teraban del posible destino del inmueble, la negociaciónterminaba. Laboratorio era para la época sinónimo deexplosión, y bioterio, ratas y perros, por consiguiente rui-dos y olores.

Según contara el Dr. Foglia, quien más sufrió la an-siedad provocada por este forzoso período de espera fuela esposa de Houssay, doña María Angélica Catán, queveía a su esposo abatido por no poder continuar con sutrabajo experimental y les suplicó que encontraran ur-gente un lugar para laboratorio como única alternativaterapéutica.

Finalmente, lo tan anhelado se concretó en una ca-sona de Costa Rica 4185. El garaje situado en la esquinay separado de la casa por un jardín cubierto de arbustosy árboles se transformó en bioterio central. En el piso su-perior nacieron tres laboratorios; en el central el come-dor se transformó en biblioteca y sala de lectura y huboespacio suficiente para otros tres laboratorios y dos es-critorios. En el sótano, la cocina fue laboratorio de his-tología y lamentablemente la bodega, bioterio secun-dario.

Rápidamente comenzaron a recibirse donaciones deprofesores universitarios, ciudadanos, empresarios, Fun-daciones y Laboratorios Farmacéuticos con amplia ge-nerosidad. Con los fondos adquiridos se compraronequipamiento, instrumentos y reactivos. La biblioteca seinició con los libros y publicaciones de los fundadoresque vieron rápidamente completarse con donaciones re-alizadas por los fisiólogos Cannon, Evans, Fulton y Wig-geers quienes junto a otros organizaron en Estados Uni-dos el Committee on the Houssay Journal Fund, con el quese pagaron suscripciones de 18 revistas por cinco años yse adquirieron numerosos libros.

El trabajo mayor se había completado y el Instituto deBiología y Medicina Experimental comenzaba a funcio-nar regular y oficialmente el 14 de marzo de 1944, sólocuatro meses después de haber decidido su creación; in-tegrado inicialmente por los doctores Bernardo A. Hous-

say, Juan T. Lewis, Oscar Orías, Eduardo Braun Menén-dez y Virgilio G. Foglia luego se incorporaron CarlosMartínez, Roberto Pinto, José G. Sara, E. Moisset de Es-panés y Dora Potick.

Muchas personas del país y del extranjero pidierontrabajar en el Instituto, pero sólo fue posible aceptar con-tados casos, debido fundamentalmente a limitaciones deespacio, situación que aún hoy persiste. No obstanteello, una brillante generación de científicos argentinosy extranjeros participaron del establecimiento delIBYME y de su progreso: E. Chiodi, S. Gitter, M. R. Co-vian, C. Cardini, A. Paladini, R. Caputto, M. Burgos, C.T. Rietti, R. Gerchman, R. R. Rodriguez, E. De Robertis,R. Mancini, P. Bazerque, H. Prieto Díaz, J. M. Afani, E.Porta, E. Urgoiti, J. C. Penhos, A. di Pietro, E. Ashkar, A.O. Donoso, F. Stefano, M. Barontini, G. Waserman, H.Hartmann, E. M. Krieger, E. Marusic, R. O. Scout, Ulf S.von Euler, y otros.

Nuestro especial agradecimiento a todos ellos.En 1946 el edificio es comprado por Mauricio Braun

Menéndez y un comité de ayuda coordinado por Joa-

Miembros del IBYME en 1945Con guardapolvo blanco, de izquierda a derecha:

1ra. fila: E. Braun Menéndez, O. Orias, B.A. Houssay, J.T. Lewis; 2da. fila: G. Sara, C. Martínez, R. M. Pinto,

V. G. Foglia; 3ra. fila: A. Bernárdez

quín de Anchorena, Pedro Baliña, Marcelino HerreraVegas y Jorge M. Bullrich obtiene numerosos fondospara financiar las actividades.

Seguramente el año 1947 dejó marcas imborrablesen aquellos que trabajaban en el Instituto.

Permítanme suponer que la vida transcurría quizá enritmo provinciano, siguiendo una plácida rutina diaria,cuando repentinamente ocurrió el sobresalto de unanoticia fantástica. Houssay había sido distinguido con elpremio Nobel de Fisiología por sus contribuciones al co-nocimiento de la influencia de la hipófisis en el meta-bolismo de los hidratos de carbono. La prensa de laépoca dio escasa divulgación a esta noticia y por curio-sidad quise informarme cómo había sido registrado enlas memorias del IBYME este acontecimiento, que nosólo era una distinción sobresaliente como tributo a sucarrera científica sino que también constituía un honorpara la Argentina, que por primera vez en su historia ob-tenía tan importante premio en Ciencias.

Con enorme sorpresa transcribo la única menciónque se refiere a tal acontecimiento: “Los miembros delInstituto han recibido distinciones significativas entre lasque figuran el Premio Nobel de Fisiología y Medicina de1947 acordado al Dr. Bernardo A. Houssay”.

El 23 de septiembre de 1949, el Superior GobiernoNacional por decreto 23.551, reconoce a nuestro Insti-tuto como Fundación con persona jurídica de existen-cia posible que tiene por principal objetivo el bien co-mún. La medida tiene efecto retroactivo al 14 de marzode 1944, día de la creación original. El primer triunvi-rato directivo estuvo integrado por Bernardo Houssay,Eduardo Braun Menéndez y Virgilio Foglia.

Hasta 1955 el personal científico técnico y auxiliarfue subvencionado con fondos privados, pero a partir de

entonces y en forma progresiva, los fondos fueron apor-tados por la Universidad de Buenos Aires que lo reco-noce en 1959 como Instituto de Investigaciones de sucompetencia al designar al Dr Bernardo A. HoussayProfesor de Investigaciones en Fisiología, dependienteprimeramente del Rectorado y posteriormente en 1973de la Facultad de Medicina. En este año, establece aso-ciaciones legales con el CONICET del que depende casitotalmente desde hace 38 años.

Las necesidades de espacio fueron apremiantes y ellocal no resultó suficiente para el crecimiento de laInstitución. En 1959, el Ministerio de Asistencia Socialy Salud Pública proporcionó un edificio más amplio enla calle Vuelta de Obligado 2490 y gracias a un subsidiodel Gobierno Nacional e innumerables donaciones pri-vadas se logró terminar de arreglar las instalaciones. Allífuncionamos desde entonces.


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Medalla

Sede, en Vuelta de Obligado 2490, 1959

Premio Nobel de Fisiología y Medicina, 1947

El 16 de enero de ese año, (día en que cumplía 56años) el Profesor Eduardo Braun Menéndez perdía lavida en un trágico accidente de aviación. Hombre emi-nente de ciencia cuyo nombre quedó vinculado parasiempre a adelantos importantes de la Fisiología y Me-dicina experimental, fue uno de los puntales de este Ins-tituto y era uno de los hombres más brillantes y pro-gresistas de nuestra Universidad, cuyos problemas yorientaciones conocía como pocos y por cuyo adelantobregó incesante e infatigablemente. Su posición en elcolegiado Directivo fue ocupada por Luis F. Leloir.

Houssay continuó en la dirección del Instituto hastaaproximadamente un año antes de su fallecimiento en1971, convencido de que los científicos tienen patria ypor ella deben trabajar. Desarrolló investigación cien-tífica donde no existía, probando la falsedad de losprejuicios que declaraban la imposibilidad de investigardonde las dificultades económicas parecían insupera-bles. Durante ese año, ocuparon la dirección interinaLuis Federico Leloir y Virgilio Foglia, quien asume la di-rección efectiva el 22 de septiembre de 1971. El 15 deenero de 1973, la doctora Julia V. M. Uranga es incor-porada al triunvirato directivo.

La década del ochenta encontró nuevamente al Ins-tituto limitado en espacios y presionado por una gene-ración de jóvenes que crecían, acompañando al cono-cimiento del siglo. Fue entonces cuando el CONICETy la cooperación efectiva de un nuevo comité de Ayudacoordinado por el Dr. Jorge Blaquier, por entonces in-vestigador de Instituto y artífice de lo logrado, y la inva-lorable colaboración de los señores Federico Amadeo,Fredy Cameo, Sergio Enaudi, Mario Piñeiro, Oscar Puig-grós y Mario Vazquez, hicieron posible la ampliaciónedilicia inaugurada en 1983.

No sólo los avatares políticos influyeron en la histo-ria del IBYME. Una madrugada de enero de 1985, lafuerza incontenible del agua, como consecuencia de untemporal, arrasó con instalaciones, equipamiento y pro-tocolos de gran parte del IBYME.

Motivados por la adversidad y herederos de un pa-sado de esfuerzos, los miembros del Instituto recons-truyeron lo dañado y continuaron trabajando con el en-tusiasmo de siempre quizá aunque en formainconsciente para que sea verdad el postulado de losfundadores “La mejor manera de convencer a los demáses predicar con el ejemplo”.



Dr. Virgilio Foglia Director: 1971-1993

Nuevo edificio del IBYME inaugurado en 1983

Dr. Luis Federico Leloir Director: 1970-1971

El fallecimiento del Dr. Luis Federico Leloir en 1987y el crecimiento del Instituto, ocasionaron la necesidadde aumentar el número de miembros de la ComisiónAdministradora. Esto trajo como resultado la presenta-ción ante la Dirección General de Personas Jurídicas, deuna Reforma de Estatutos. Desde entonces y mientrasse resolvía dicho pedido, colaboraron con la adminis-tración juntamente con el Dr. Virgilio Foglia y la Dra. Ju-lia Uranga, los Dres. Alberto Baldi, Jorge Blaquier, Ri-cardo Calandra, Eduardo Charreau, Alejandro DeNicola, Enrique Segura, Alicia Roldán, Enrique del Cas-tillo y Marta Tesone.

El 7 de agosto de 1991 Eduardo Charreau es desig-nado por los doctores Foglia y Uranga para integrar laterna administradora, ocupando el lugar dejado por eldoctor Leloir. A la renuncia de la Dra. Julia Uranga en1992, el Dr. Alejandro F. De Nicola completa el cole-giado.

El 15 de julio de 1993 falleció el Dr. Virgilio G. Foglia.Con su desaparición, la ciencia argentina perdía a unode sus firmes propulsores durante más de medio sigloy al último miembro fundador del Instituto de Biologíay Medicina Experimental. Su carácter amable, su entu-siasmo, su incansable dedicación al trabajo (concurrióal Instituto hasta el último día previo a su desaparicióndesarrollando la actividad diaria con su habitual dina-mismo), le valieron el aprecio de todos los que acom-pañamos su gestión. Con su partida se cierra un capítulobrillante de la Ciencia Argentina.

Eduardo Charreau asume la posición de presidentede la Fundación Instituto de Biología y Medicina Ex-perimental y de Director ante el CONICET del Institutode Biología y Medicina Experimental de doble depen-dencia Fundación IBYME-CONICET. El Dr. AlejandroF. De Nicola ejerce la vice-Dirección y el Dr. AlbertoBaldi se incorpora como miembro permanente del Co-legiado Directivo, incorporándose como miembros tran-sitorios los Dres. José Lino Barañao, Damasia Becú yJuan Carlos Calvo, posiciones previstas en la modifica-ción estatutaria aprobada el 4 de septiembre de 1992.

La posibilidad de favorecer la participación institu-cionalizada del sector científico tecnológico en el aseso-ramiento al sector productivo de bienes y servicios, seanpúblicos o privados, en la selección y adaptación de tec-nologías disponibles y en la transferencia de los resulta-dos de la investigación, propulsó la solicitud para la apro-bación de la Fundación Instituto de Biología y MedicinaExperimental como Unidad de Vinculación Tecnológica


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Dr. Alejandro F. De Nicola Director: 2002-2008

Dr. Eduardo H. Charreau Director: 1993-2002 / 2008-2010

Un laboratorio del subsuelo del edificio nuevo luego de la inundación de 1985

(UVT), otorgada por la resolución 314 del 12 de junio de1993, de la entonces Secretaría de Ciencia, Tecnología eInnovación Productiva. Fue la primer UVT registrada alamparo de la ley de Transferencia de Tecnología.

En la subsecuente renovación de autoridades quetuvo lugar el 20 de diciembre de1996 los Dres. Juan Car-los Calvo, Carlos Libertun y Ricardo Calandra fueronelectos como vocales.

En virtud de la designación del Dr. Eduardo Charreauen el cargo de Presidente del Directorio del CONICET(decreto Nº 255/2002 del 8 de febrero de 2002), pasó adesempeñarse como presidente interino de la Funda-ción y vice-director a cargo del Instituto el Dr. AlejandroF. De Nicola, acompañado por los Dres. Alberto Baldi,Juan Carlos Calvo, Claudia Lanari y Damasia Becú.

En las elecciones de fines de 2004 la Dra. PatriciaCuasnicú reemplazó al Dr. Juan Carlos Calvo y en 2006Victoria Lux reemplaza a Claudia Lanari, en 2008 JuanCarlos Calvo sustituye a la Dra. Victoria Lux.

Con motivo de la finalización de la designación dePresidente del CONICET, el 8 de abril de 2008 el Dr.Eduardo H. Charreau reasume la dirección del Insti-tuto y el Dr. De Nicola la vicedirección.

Con el alejamiento del Dr. Eduardo Charreau de la di-rección del IBYME, el CONICET junto con la fundaciónIBYME, mediante concurso, designa a la Dra. DamasiaBecú Directora por el término de cuatro años, quienelige al Dr. Gabriel Rabinovich como vice- Director. ElDr. Charreau reasume como Presidente de la FundaciónInstituto de Biología y Medicina Experimental.

Asimismo, en el mes de diciembre de 2010 una nuevaelección define la constitución del Colegiado Directivode la Fundación IBYME de la siguiente manera:Eduardo H. Charreau como Presidente, Alejandro F. DeNicola como secretario, Alberto Baldi como tesorero ylos doctores Juan Carlos Calvo, Victoria Lux-Lantos yGabriel Rabinovich como vocales. Este mismo cuerpoactúa como Consejo Directivo del Instituto de Biologíay Medicina Experimental dirigido por la Dra. DamasiaBecú.

Es también la hora del recuerdo y del halago para losque custodiaron el esfuerzo de los que hoy son honra-dos. Es por ello que deseamos hacer nuestro sincero ho-menaje a Francisco Gómez, celoso custodio del patri-monio material del IBYME desde 1946 a 1980, a JosefinaYanguas, que no sólo fue la más eficiente administra-dora de la Fundación desde 1946 a 1992, sino que tam-bién nuestra constante consejera, amiga leal y generosa.A nuestra querida Zulema Rinaldo quien fuera desde1949 hasta el 2005 el alma de la biblioteca y la más efi-ciente secretaria administrativa de la Sociedad Argen-tina de Biología, con sede en el IBYME.

El IBYME creció en espíritu y en obras, de aquel pe-queño grupo que le dio origen, más de tres centenaresusufructuamos hoy su obra y al cumplir 67 años con laciencia, corona su trayectoria con alrededor de 3000 pu-blicaciones de alcance internacional, 6000 presenta-



Miembros del IBYME

Dra. Damasia BecúDirectora: Desde 2010

ciones orales de sus trabajos científicos y varias centenasde tesis doctorales. Testimonio elocuente de la calidadde entrenamiento desarrollado, es el número de pro-fesores que, formados en el IBYME fueron simiente deconocimientos en otros lugares del país y del extranjero,sumado a ello, el reconocimiento internacional quenuestra Institución tiene como centro de excelencia.

En la actualidad 82 investigadores de carrera, 97 be-carios, 36 técnicos, 45 pasantes, 27 consultores y admi-nistrativos y 15 auxiliares de servicios, componen elplantel de trabajo. Cuarenta y siete miembros delIBYME realizan docencia de grado y postgrado en Uni-

versidades Argentinas, ocupando 17 de ellos las posi-ciones académicas más destacadas de nuestro sistemauniversitario.

El incremento de los recursos humanos del IBYME,sin duda debido a una agresiva política nacional al res-pecto, lo han llevado a una nueva crisis de infraes-tructura. Así, con la colaboración público-privada en-tre el CONICET y las Fundaciones Sales, Bunge y Born,IBYME, Cherny y aportes desinteresados de particula-res como los del empresario Jorge Ferioli, y las señorasSilvia de Ostri, Raquel Oddone de Ostri, Patricia yEmilse Ostri y María Elvira Varela, se ha logrado edificar


IBYME 605

Nuevos laboratorios 2011

Nueva Biblioteca 2011

alrededor de 2500 metros cuadrados cubiertos de áreasdestinadas a nuevos laboratorios, biblioteca y servicios,permitiendo repatriar a 8 investigadores y lograr la ex-pansión natural interna de otros tantos grupos quecrearán unidades de investigación independientes.

Los fines del Instituto pueden agruparse en cuatrocategorías:

1) investigaciones básicas y aplicadas en fisiología,bioquímica y biología molecular;

2) entrenamiento de estudiantes y becarios pre yposdoctorales;

3) realización de cursos de nivel de pre y posgrado; y 4) desarrollos biotecnológicos y transferencia de tec-

nologías.

Históricamente, los principales descubrimientos fue-ron en el campo de la Fisiología y la Endocrinología. Lasáreas actuales incluyen Neurociencias, Biología de la Re-producción, Oncología Experimental e Inmunología.Los resultados se publican en revistas de jerarquía in-ternacional, que demuestran el nivel de excelencia al-canzado por los distintos grupos de investigación de estaInstitución.

El Instituto de Biología y Medicina Experimentalcuenta en la actualidad con 21 grupos de investiga-ción independientes cuyos objetivos e integrantesson:

LABORATORIO DE ESTEROIDES

Director del laboratorio:Ricardo Saúl Calandra Integrantes: Silvia Gonzalez-Calvar, Mónica Frungieri,Susana Rulli, Betina Gonzalez, María Matzkin, LauraRatner, Soledad Rossi, Guillermina Stevens

El grupo de investigación estudia los fenómenosreproductivos a nivel fisiopatológico, que permitiránesclarecer los mecanismos bioquímicos y molecularesinvolucrados en las interacciones entre los factoresendógenos intratesticulares, impulsando el desarrollode nuevos protocolos enfocados a la optimización dela actividad reproductiva en especies fotoperiódicasde relevancia ganadera (ej.: oveja, cabra).

Por otro lado, los resultados obtenidos en estudiosrealizados en muestras humanas permitirán desarrollarnuevos enfoques en el tratamiento de patologías queinvolucran los cuadros denominados como InfertilidadIdiopática Masculina.

La disponibilidad de un modelo de ratones trans-génicos que sobreexpresa hCG permitirá estudiar losmecanismos que conducen a una alteración del eje hi-potálamo-hipófiso-gonadal y al desarrollo de tumoresgonadales.

En cuanto a transferencia del conocimiento, cabedestacar que los integrantes de este Laboratorio par-ticipan activamente en el dictado de Cursos de pre ypost-grado (UBA, Universidad Austral, etc) y en la di-rección de una Maestría en Fisiopatología Endocrina(Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral,Acreditada por CONEAU).

LABORATORIO DE MECANISMOS

MOLECULARES DE LA FERTILIZACIÓN

Director del laboratorio:Patricia S. CuasnicuIntegrantes: Débora Cohen, María Agustina Battis-tone, Juan Ernesto, Mariana Weigel-Muñoz, ClaudioAugusto Curia, Vanina Da Ros

Nuestros estudios permitirán una mayor compren-sión del proceso por el cual un espermatozoide inte-ractúa con el ovocito brindando información esencialtanto para el desarrollo de nuevas técnicas de regula-ción de la fertilidad como para el diagnóstico y trata-miento de los problemas de infertilidad humana.

LABORATORIO DE FISIOLOGÍA OVÁRICA

Directora del laboratorioMarta TesoneIntegrantes: Fernanda Parborell, Griselda Irusta, Dal-hia Abramovich, Fátima Hernández, Leopoldina Scotti,Diana Bas

En los últimos años la angiogénesis ha sido estu-diada con intensidad, ya que está involucrada en con-diciones patológicas como el cáncer y en enfermeda-des reproductivas como ser la Poliquistosis Ovárica(PCOS) y el Síndrome de Hiperestimulación Ovárica(OHSS). El esclarecimiento de este proceso sin dudaredundará en el tratamiento de estas enfermedades alexplorar nuevas estrategias terapéuticas.

LABORATORIO DE ENDOCRINOLOGÍA

MOLECULAR

Director del laboratorio:Eduardo Charreau Integrantes: Liliana Dain, Violeta Chiauzzi, Cecilia Fer-nandez, Ianina Ferder, Melisa Taboas, Ana Rosa De LaCámara

En las últimas décadas los países desarrollados hanexperimentado un proceso de transición epidemioló-gica, caracterizado por el creciente control de la desnu-



trición y las enfermedades infectocontagiosas y el incre-mento relativo de las afecciones crónico- degenerativas.Aunque el mundo subdesarrollado aún se enfrenta a lasllamadas enfermedades de la pobreza, en ciertas nacio-nes las enfermedades crónicas y los trastornos genéticoscomienzan a ser un problema de salud pública. En Ar-gentina, donde la mortalidad infantil (MI) es de 13,3 pormil, los defectos congénitos constituyen su segundacausa, explicando el 25,1% de la MI total.

Los defectos congénitos incluyen a las alteracionesmorfológicas (malformaciones congénitas) y/o funcio-nales presentes en la infancia o en etapas posteriores dela vida y causados por eventos que preceden al naci-miento, heredados o adquiridos durante la vida prenatal.Los defectos congénitos que pueden identificarse al na-cimiento son generalmente las malformaciones y tienenuna prevalencia de aproximadamente 3%. Sin embargo,debido al diagnóstico de impedimentos fisiológicos ymentales de aparición más tardía, la prevalencia de estosdefectos asciende al 8% a los 5 años de edad. Por otraparte, ciertas afecciones congénitas se manifiestan en laedad adulta, incluyendo tanto enfermedades genéticas debaja frecuencia, como enfermedades comunes de origenmultifactorial (enfermedades cardiovasculares y neuro-degenerativas, cáncer, etc.), responsables de la mayorparte de la morbimortalidad actual.

El gran desarrollo tecnológico de los últimos años hapermitido llevar a cabo diversos estudios moleculares deenfermedades genéticas gracias a los cuales se han podidoidentificar muchos genes involucrados en la etiopatologíade varios desórdenes de origen exclusivamente genético,así como proponer genes asociados a enfermedades deorigen parcialmente genético o multifactorial.

Por otra parte, investigaciones epidemiológicas hansugerido que los diferentes tipos de defectos congénitosy las frecuencias con que los mismos se presentan, varíanentre poblaciones según la distribución geográfica y elorigen étnico de las mismas. De manera similar, los es-tudios moleculares han demostrado que las variantes alé-licas supuestamente relacionadas con genes de predis-posición pueden ser diferentes según el acervo genéticode las poblaciones. Estas observaciones han conducido ala necesidad de realizar estudios genéticos-molecularespara cada población en particular con el propósito de de-terminar los factores de riesgo que se asocian con estaspatologías.

En muestro laboratorio proponemos estudiar genesimplicados en la etiología de enfermedades de origenmonogénico y multifactorial en nuestra población. Se en-foca el estudio en dos enfermedades relacionadas con elsistema reproductivo y endócrino: la deficiencia de 21-hi-droxilasa y la falla ovárica prematura (FOP). La defi-ciencia de 21-hidroxilasa es la enfermedad autosómica re-cesiva de mayor incidencia. Por su parte, dentro de lasenfermedades de origen multifactorial, la FOP afecta al1% de las mujeres en edad fértil. Los estudios com-

prenden la identificación de variantes asociadas a estasenfermedades, así como estudios de las consecuenciasfisiopatológicas de los genes implicados en ellas.

LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA DE LA

REPRODUCCIÓN

Directora del laboratorio:Rosa Inés BarañaoIntegrantes: Gabriela Meresman, Mariela Bilotas, Ana-lía Ricci, Carla Olivares, Juan Ignacio Bastón

La endometriosis se define como la presencia de te-jido endometrial fuera de la cavidad uterina. Esta en-fermedad afecta a un 10-15 % de mujeres en edad re-productiva. Los dos síntomas más comunes de laendometriosis son el dolor y la infertilidad que se ma-nifiesta como dispareunia, dismenorrea o dolor abdo-minal crónico. Este dolor puede ser tan intenso queafecte la calidad de vida de la mujer, desde sus rela-ciones hasta sus actividades diarias. Por otra parte, al-rededor de un 30 a 40% de las mujeres con endome-triosis son infértiles, por lo cual es una de las tresprincipales causas de infertilidad femenina.

Nuestros estudios tienen como objetivo la evalua-ción del efecto in vitro e in vivo de nuevas alternativas te-rapéuticas para tratar esta patología con el fin de hallartratamientos más simples, con medicamentos que ac-túen en forma más directa sobre los implantes, que in-hiban los mecanismos involucrados en el desarrollo dela enfermedad, y que potencialmente sean más eficacesen su acción de erradicar las lesiones endometriósicas.

En nuestro modelo murino evaluamos también la re-lación entre endometriosis e infertilidad y hemos co-menzado el estudio de los posibles mecanismos invo-lucrados en la tolerancia inmunológica hacia losimplantes de tejido endometrial ectópico que se pro-duciría durante el establecimiento de la endometriosis.


MOLECULAR Y TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES

Director del laboratorio:Omar P. PignataroIntegrantes: Carolina Mondillo, Marcos Besio Moreno,Romina Pagotto, Casandra Monzón

REGULACIÓN DE LA FUNCIÓNESTEROIDOGÉNICA EN TESTÍCULO YGLÁNDULA ADRENAL

Las hormonas adenohipofisarias LH (luteinizante)y ACTH (adrenocorticotrofina) son los factores trófi-


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cos principales de la esteroidogénesis testicular y adre-nal, respectivamente.

Sin embargo, debido a que en ambos órganos hay di-ferentes poblaciones celulares, éstas secretan factoresque son capaces de regular las acciones mencionadas.

Nuestro grupo de trabajo ha demostrado que los sis-temas óxido nítrico sintasa/óxido nítrico (NOS/NO)y hemo oxigenasa/monóxido de carbono (HO/CO),y la histamina (HA) modulan los efectos de las hor-monas adenohipofisarias mencionadas, en ambos sis-temas.

Tanto en testículo como en la corteza suprarrenal,los factores descriptos pueden actuar a través de dis-tintos (o similares) mecanismos de transducción paraactivar o inhibir la síntesis de esteroides, a nivel del ca-mino esteroidogénico y/o en la expresión de la pro-teína StAR, regulatoria en el transporte de colesterola la mitocondria. Además de la conocida participa-ción del AMPc en la transducción de la señal de ambashormonas hipofisarias, otros segundos mensajeros pue-den estar involucrados en la respuesta biológica final.

Sin duda, la existencia de interacciones celulares lo-cales capaces de modular las acciones de LH y ACTH,provee un eficiente mecanismo de regulación de lasfunciones testicular y adrenal, evitando la generaciónde respuestas de tipo todo o nada y permitiendo a lasglándulas responder en forma fina y ajustada a los dis-tintos estímulos, sean éstos fisiológicos o patológicos.Así, el objetivo general del proyecto es el estudio de laregulación de la esteroidogénesis en testículo y glán-dula adrenal por factores producidos localmente: HA,NO y CO, la interrelación entre los mismos y los me-canismos moleculares involucrados. Asimismo, se eva-lúa la posible participación de dichos factores comomoduladores de la proliferación y/o diferenciación delas células esteroidogénicas,

Los resultados obtenidos permitirán lograr una me-jor comprensión de los procesos relacionados con lafertilidad humana y con la producción de hormonasesenciales para la vida.

LABORATORIO DE ESTUDIOS DE LA

INTERACCIÓN CELULAR EN REPRODUCCIÓN

Y CÁNCER

Directora del laboratorio:Mónica H. Vazquez-LevinIntegrantes: Clara Marin-Briggiler, María Laura Ma-tos, Lara Lapyckyi, Marina Rosso, María Matilde Ar-zondo, Nadia Edelsztein, María José Besso

El grupo de investigación estudia las bases molecu-lares de los mecanismos involucrados en la adhesióncelular, así como los eventos que se desencadenan

como resultado de las interacciones célula-célula enprocesos fisiológicos y patológicos.

Nuestro interés actualmente se centra en el estudiode miembros de la familia de cadherinas clásicas y mo-léculas relacionadas, utilizando gametas de diversasespecies (humano, murino y bovino), así como en lí-neas celulares establecidas, en muestras de tejidos notumorales y tumorales de diversos orígenes y más re-cientemente en células stem de origen embrionario.Para nuestros estudios utilizamos estrategias celulares,bioquímicas, moleculares y estudios funcionales y co-laboramos con referentes nacionales e internacionalesde trayectoria en los temas de estudio.

Los hallazgos de nuestros estudios podrán contri-buir a comprender las bases moleculares de procesostan importantes como lo son la fecundación y la pro-gresión tumoral. Esperamos, asimismo, con nuestrosestudios contribuir a mejorar el diagnóstico de la in-fertilidad y de la patología del cáncer y, eventualmente,proponer alternativas para su tratamiento.

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

ANIMAL Y FISIOLOGÍA DE LA GLÁNDULA

MAMARIA

Director del laboratorio: Leonardo BussmannIntegrantes: Inés Bussmann, Ursula Bussmann, JuanManuel Perez Saez.

PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS EN LARESISTENCIA A LA MASTITISLa mastitis es la inflamación de la glándula mama-

ria producida predominantemente por la infecciónbacteriana a través del conducto del pezón. La masti-tis bovina es una de las enfermedades de mayor im-pacto económico para la actividad lechera. La glán-dula mamaria responde a las infecciones conmecanismos específicos y no específicos. Los meca-nismos no específicos constituyen la forma de defensaen los estadios tempranos de la infección e involucran,entre otros, a péptidos y proteínas como la lactoferrina(LF) y las defensinas. La digestión de LF genera dis-tintos péptidos, como por ejemplo la lactoferricina(LFcin), siendo algunos de ellos aún más eficientesque la molécula original contra patógenos mamarios.El objetivo de esta línea de investigación es lograrnuevos enfoques de diagnóstico, prevención y trata-miento de la mastitis bovina a través del uso de molé-culas con acción antimicrobiana como LF y LFcin,aunque no de manera excluyente. La expresión re-combinante de análogos de LFcin en la glándula ma-maria como forma de obtener leche diferenciada con



acción antibiótica local y como alimento funcionalaparece como un logro de gran atractivo tanto cientí-fico como tecnológico. Dado que el péptido tendrámayor actividad desde su secreción en la glándula ma-maria, los potenciales animales transgénicos que ex-presen este péptido serán altamente resistentes a lamastitis, disminuyendo la utilización de antibióticos enlos tambos y brindando los consecuentes beneficiospara la salud humana y el medioambiente. Por otrolado, dadas las características extraordinarias de lospéptidos derivados de la LF en cuanto a sus propie-dades nutracéuticas, esta leche será altamente benefi-ciosa para el consumidor, modulando el sistema in-mune, colaborando con la prevención del desarrollode tumores y combatiendo infecciones en el tracto di-gestivo.

DESARROLLO DE MÉTODOS PARA LAGENERACIÓN DE GALLINAS TRANSGÉNICASCOMO BIORREACTORES

La producción de animales transgénicos que ex-presen proteínas terapéuticas permite la producción demoléculas de interés por medios a largo plazo máseconómicos que la obtención por métodos tradicio-nales (expresión en líneas celulares/bacterias). A suvez, en numerosos casos la molécula de interés produ-cida en animales transgénicos es mejor y más apta, omuchas veces es la única opción de obtener las modi-ficaciones post-transduccionales necesarias. Actual-mente se han podido obtener en nuestro país vacas queexpresan proteínas terapéuticas en su glándula ma-maria; sin embargo, el uso de vacas, ovejas o cabras paratales fines resulta en un proceso costoso que exige unaalta inversión en tiempo y en dinero para poder con-seguir un significativo plantel productor de la moléculade interés. Frente a esta dificultad, las aves transgéni-cas se presentan como una alternativa muy atractiva,pues poseen una serie de grandes ventajas que las con-vierten en excelentes posibles biorreactores para la in-dustria farmacéutica. El impacto de la realización delproyecto global de esta línea de investigación será degran importancia, ya que permitirá desarrollar a nivelnacional una tecnología que redundará en beneficioseconómicos y sanitarios, permitiendo la generaciónde un sistema único de producción de proteínas re-combinantes de valor farmacéutico que poseerá gran-des ventajas, incluso frente a los existentes actualmenteen el mundo. Para lograr estos objetivos globales, en ellaboratorio se trabaja también en una línea de investi-gación que se centra en el análisis de promotores te-jido-específico y desarrollo de vectores y sistemas de cul-tivos destinados a la generación de gallinas transgénicascomo biorreactores.

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

DE LA REPRODUCCIÓN ANIMAL Y DE LA

REGULACIÓN HORMONAL DEL TRACTO

REPRODUCTIVO FEMENINO

Director del laboratorio:José Lino S. Barañao A cargo:Patricia SaragüetaIntegrantes: Griselda Vallejo, Ana Mestre-Citrinovit,Adrián Sestelo, Alejandro J. Lagreca, Inti Tarifa

Nuestro laboratorio trata de comprender los meca-nismos celulares y moleculares de acción de las hor-monas ováricas, estradiol y progesterona sobre la pro-liferación y diferenciación celular El endometrioexperimenta procesos cíclicos de proliferación, dife-renciación y muerte celular regulados por las hormo-nas ováricas. Nuestro proyecto se centra en el estudiode los mecanismos de regulación de la expresión gé-nica durante la proliferación y diferenciación induci-das por progesterona y estradiol. En nuestro labora-torio hemos demostrado la participación deprogesterona en la proliferación de células de endo-metrio mediante la activación transitoria de Erk y Aktpor la interacción del receptor de progesterona y es-tradiol, hemos encontrado que progesterona a tiemposcortos de estimulación down-regula la expresión deFactores de Transcripción e inhibidores del ciclo ce-lular por lo que proponemos que el efecto proliferativode progesterona se produce por la inhibición de estosrepresores de ciclo celular y de la acción de los facto-res de transcripción y/o sus genes blancos. Asimismo,proponemos la especificidad tisular para dicho meca-nismo por lo que caracterizaremos la expresión génicatipo celular específica inducida por la activación de cas-cadas de señalización citoplasmáticas dependiente deprogestinas en células endometriales humanas y lascompararemos con resultados previamente obtenidosen células de cáncer de mama humanas T47D. Por otraparte, en nuestro laboratorio hemos caracterizado laexpresión génica asociada a la transdiferenciación de-cidual in vitro y en este proyecto nos proponemos ca-racterizar la diferenciación y reprogramación de célu-las estromales a células deciduales que tiene lugarfisiológicamente bajo el efecto de estrógenos y pro-gesterona. Estos estudios proveerán nuevo conoci-miento acerca de los mecanismos por los cuales laprogesterona actúa en la fisiología de las células en-dometriales y permitirán un nuevo abordaje para la fi-siopatología de varias enfermedades ginecológicas aso-ciadas con proliferación endometrial anormal, entreellas el cáncer y la hiperplasia endometrial.


IBYME 609

LABORATORIO DE QUÍMICA DE

PROTEOGLICANOS Y MATRIZ

EXTRACELULAR

Director del laboratorio:Juan Carlos CalvoIntegrantes: Lucrecia Piñeiro De Calvo, Valeria Ca-reaga, Virginia Pistone Creydt, Marina Romanato, Va-nina Julianelli, Melisa Celeste Sanchez, Amelia JulietaTesone, Bárbara Ferrando, Sabrina Fletcher, PaulaSacca

En nuestro laboratorio comenzamos estudiando loscomponentes de la matriz extracelular, en particularlos glicosaminoglicanos (ácido hialurónico, condroitínsulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato y heparina)como moléculas aisladas o en el contexto de la matrizextracelular. Esta experiencia la plasmamos ahora endos proyectos de investigación que tienen a estos com-puestos como nexo: 1- el estudio de la descondensa-ción de la cromatina del núcleo espermático y, 2- el pa-pel de la matriz extracelular y el entorno celular en laaparición, progresión y metástasis tumoral.

DESCONDENSACIÓN DE LA CROMATINA DELNÚCLEO ESPERMÁTICO

En este proyecto analizamos las etapas y compo-nentes involucrados en el proceso que ocurre una vezque el espermatozoide penetra hacia el interior delovocito. Para que la cromatina quede en situaciónapta para su utilización en la formación de pronúcleoy posterior singamia, hace falta la reducción de puen-tes disulfuro de las protaminas por GSH y la disocia-ción de las mismas con reemplazo por histonas. Ennuestro laboratorio, en modelo humano, encontra-mos que el heparán sulfato es la molécula responsablede esto último. Actualmente estamos estudiando elmetabolismo de este glicosaminoglicano en el folículoen diversos estadios de desarrollo.

EFECTO DEL ENTORNO CELULAR SOBRE ELDESARROLLO TUMORAL

En dos modelos de cáncer, mamario y prostático, es-tudiamos el papel del tejido adiposo como principalexponente del estroma en el caso de la glándula ma-maria y como tejido periprostático en el caso de lapróstata. El primer modelo permite estudiar la inte-racción bidireccional entre epitelio y estroma, mien-tras que el segundo modelo podría ayudar a com-prender el papel del tejido adiposo en la metástasisprostática, aunque no pueda descartarse una acción di-recta sobre el epitelio tumoral a través de moléculas so-lubles.


MOLECULARES DE CARCINOGÉNESIS

Directora del laboratorio:Patricia Virginia ElizaldeIntegrantes: Eduardo Charreau, Roxana Schillaci, Ce-cilia Proietti, Violeta Chiauzzi, María Celeste Díaz Fla-qué, Martín Rivas, Mercedes Tkach, Franco Izzo, LucíaRomero, Leandro Venturutti, Florencia Mercogliano,Rosalía Cordo Russo

El cáncer de mama es una enfermedad compleja y de-vastadora que tiene sin duda un impacto muy significa-tivo sobre la salud en el mundo entero. Una importantecantidad de descubrimientos a lo largo de la última dé-cada ha puesto en evidencia que en el desarrollo de lostumores mamarios hay dos actores clave: los receptoresde las hormonas esteroideas estrógenos (ER) y proges-terona (PR) y los receptores de factores de crecimiento(GFs) con actividad de tirosina quinasa (RTKs). Particu-larmente, existe una familia de receptores con actividadde tirosina quinasa, la familia ErbBs, que tiene un rolclave en el desarrollo del carcinoma mamario. Uno de susmiembros, el ErbB-2, es utilizado actualmente en la te-rapia del cáncer de mama, con relativo éxito, en un tipoparticular de tumor mamario que tiene altos niveles deexpresión de ErbB-2. La terapia consiste en suprimir laactividad de este receptor mediante un anticuerpo mo-noclonal humanizado, Trastuzumab, cuyo nombre co-mercial es Herceptina. Si bien es conocido que los ErbBsinteractúan con el PR y el ER para estimular la prolife-ración del cáncer de mama, los mecanismos que regulanesa interacción y las posibles moléculas activadas por laacción conjunta de ErbBs y de hormonas esteroideaspermanecen muy poco conocidos. El objetivo de nuestrolaboratorio es identificar mecanismos moleculares deconvergencia entre la proteína Heregulina (HRG), li-gando de los receptores ErbBs, y el PR con el objeto deencontrar nuevas herramientas moleculares para inhibirel crecimiento del cáncer de mama resistente a la terapiaendocrina tradicional de primera línea y a terapias de se-gunda línea basadas en el bloqueo de tirosina quinasastales como la Herceptina.

LABORATORIO DE CARCINOGÉNESIS

HORMONAL

Directora del laboratorio:Claudia Lanari Integrantes: Caroline Lamb, Victoria Fabris, VirginiaNovaro, Paola Rojas, María Gorostiaga, Pablo Do-campo, Sebastián Giulianelli, Ana Sahores, VictoriaWargon, María Laura Polo, Marina Riggio, Tomás Gui-llardoy, Gonzalo Sequeira, María May



El objetivo general del laboratorio es investigar losmecanismos que conducen a la hormono indepen-dencia en cáncer de mama. Un 75% de las pacientespresentan tumores que expresan receptores hormo-nales y la enfermedad es, por lo tanto, susceptible a te-rapias endócrinas. Sin embargo, un alto porcentajede estas pacientes sufre con el tiempo la pérdida deesta respuesta como parte de la progresión de la en-fermedad. Comprender los mecanismos por los cualeslos receptores hormonales regulan el crecimiento tu-moral podría facilitar el desarrollo de nuevas terapiaspara prevenir o retardar la aparición de resistencia altratamiento. En particular, nuestras investigaciones es-tán orientadas a conocer los mecanismos por los cua-les se activa el receptor de progesterona y cómo elmismo podría ser utilizado como blanco terapéutico.

LABORATORIO DE HORMONAS Y CÁNCER

Directora del laboratorio:Isabel Alicia LüthyIntegrantes: Ariana Bruzzone, Lilian Fedra Castillo,Cecilia Pérez Piñero

Los compuestos adrenérgicos, adrenalina y nora-drenalina son importantes hormonas/neurotransmisoresliberados durante el estrés. Sus respuestas están mediadaspor la activación de receptores adrenérgicos (RA).Nuestro grupo ha descripto la presencia de α2-RA enlíneas tumorales y no tumorales de cáncer de mama hu-mano y murino. La estimulación de estos receptores estáasociada a un aumento significativo de la proliferacióncelular y el crecimiento tumoral. Los compuestosadrenérgicos son ampliamente utilizados en la clínica,aun en pacientes con historia previa de cáncer de mama.Sin embargo, no existían estudios que evaluaran el efec-to de estos compuestos sobre modelos in vivo de cán-cer de mama.

El objetivo de nuestro trabajo es el estudio de estoscompuestos sobre diferentes modelos de cáncer demama, in vitro e in vivo y el estudio de los mecanismosde señalización intracelulares implicados en estas res-puestas. También evaluamos la regulación del loop au-tócrino-parácrino de la prolactina y su receptor en cé-lulas tumorales mamarias humanas por parte decompuestos adrenérgicos.

Comprendiendo estos mecanismos, se podría de-terminar qué compuestos (agonistas y antagonistas)podrían ser útiles como tratamiento adyuvante delcáncer de mama. Muchos de estos compuestos se uti-lizan ampliamente en la clínica con efectos secundariosmínimos, y podrían eventualmente complementar te-rapias existentes, sobre todo en aquellos casos en losque se desarrolla resistencia a las mismas.

LABORATORIO DE PATOLOGÍA

Y FARMACOLOGÍA MOLECULAR

Director del laboratorio:Alberto Baldi Integrantes: Carina Shayo, Adrián Góngora, MartínGomez, Ramiro Vazquez, Sabrina Copsel, GabrielaBravo, Natalia Alonso, Carolina Flumian, Luís A. HaroDuran

En el Laboratorio de Patología y Farmacología Mo-lecular llevamos a cabo diferentes líneas de investiga-ciones que comprenden áreas involucradas en el de-sarrollo de anticuerpos monoclonales humanizados(AcMh) contra diversos moléculas implicadas en laangiogénesis asociada al desarrollo neoplásico. Es asíque hemos obtenido una serie de AcM recombinantesque bloquean la actividad del factor de crecimiento delendotelio vascular (VEGF), y del factor de crecimientofibroblástico básico (FGFb), similares procedimientosse llevan a cabo para neutralizar a otras moléculas pro-angiogénicas que evaden la acción de dichos reactivos.El AcM anti-VEGF redujo muy significativamente elcrecimiento de células endoteliales tanto in vitro comoin vivo, con la concomitante reducción del volumen tu-moral especialmente en melanomas xenotransplanta-dos en ratones atímicos.

También hemos emprendido una serie de ensayostendientes a silenciar la expresión de genes para dis-minuir la síntesis de proteínas que no pueden ser neu-tralizadas por AcMh. Demostramos que construccionesoligonucleotídicas en formato shRNA (small hair-pinRNA) resultaron muy efectivas en silenciar la ex-presión del FGFb y VEGF. Comenzamos además, conel uso de nanopartículas paramagnéticas como vehí-culos de los reactivos mencionados, las que pueden serdireccionadas en forma tejido-específico mediante uncampo magnético, de forma que el fármaco se reclutede manera selectiva.

Otra área de trabajo se basa en el estudio sobre latransducción de señales relacionadas con la diferen-ciación celular. En este sentido, la histamina modulanumerosos procesos fisiológicos y patológicos a travésde cuatro clases de receptores de la familia de recep-tores acoplados a proteínas G (GPCRs) y juegan un im-portante papel en la modulación de los procesos deproliferación y diferenciación en células leucémicasque son de nuestro interés. Parte de los objetivos eneste campo es definir novedosos blancos terapéuticos.

Además, investigamos las propiedades antiprolife-rativas de estructuras de origen natural y sintético y susmecanismos de acción, con el fin de desarrollar nue-vos protocolos terapéuticos basados en compuestosinnovativos que puedan contribuir al desarrollo de es-trategias para tratamiento de dicha patología.


IBYME 611

En resumen, el conjunto de estos estudios contri-buirán probablemente a un mejor entendimiento dealgunos de los mecanismos moleculares implicadosen el desarrollo neoplásico y la forma con que estas pa-tologías puedan ser controladas para el beneficio de lospacientes.

LABORATORIO DE INMUNOPATOLOGÍA

Director del laboratorio:Gabriel Adrián RabinovichIntegrantes: Norberto Zwirner, Marta Toscano, Ma-riana Salatino, Diego Laderach, Victoria Sundblad,Iván Mascanfroni, Juan Pablo Cerliani, Carolina Do-maica, Diego O. Croci, Lucas Rossi, Damián Avila, Se-bastián Dergan-Dylon, Germán Spallanzani, Laura Gi-ribaldi, Andrea Ziblat, Tomás Dalotto Moreno,Verónica Martinez Allo, Mercedes Fuertes, GimenaRaffo, Santiago Mendez Huergo

Los resultados de las investigaciones de nuestro la-boratorio podrían contribuir a la generación de nue-vas estrategias anti-inflamatorias o anti-tumorales de in-terés para la comunidad, compañías de biotecnologíay/o farmacéuticas. Nuestros proyectos tienen comoobjetivo el desarrollo de inmunomoduladores que mi-meticen las funciones biológicas de lectinas endógenasy /o interfieran con las interacciones entre proteínas yglicanos, modulando así las respuestas inmunológicasasociadas a diversas patologías. Asimismo, a partir de es-tudios básicos, pretendemos identificar factores endó-genos y exógenos que modulen la actividad funcionalde diferentes células del sistema inmune y que podríanser de relevancia durante procesos fisiopatológicos ta-les como el crecimiento tumoral, las enfermedades au-toinmunes, las enfermedades inflamatorias crónicas,infecciones, etc. Mediante la adecuada capitalización detales conocimientos pretendemos realizar un aportepara la optimización de estrategias inmunoterapéuticasy contribuir, de este modo, al mejoramiento de la saludhumana.

LABORATORIO DE INMUNOHEMATOLOGÍA

Directora del laboratorio: Norma Alejandra Chasseing Integrantes: Vivian Labovsky, Valeria Fernandez Va-llone, Leandro Martínez, Julián Otaegui

El laboratorio tiene como objetivo general encon-trar en médula ósea y sangre periférica factores pro-nóstico del desarrollo de futuros desórdenes óseos enpacientes con cáncer de mama y pulmón. Y entender

la contribución del microambiente tumoral, en parti-cular las células madre mesenquimales, en la evolucióndel tumor primitivo y metástasis óseas.

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

NEUROENDÓCRINA

Director del laboratorio:Alejandro F. De Nicola Integrantes: Flavia Eugenia Saravia, Susana LauraGonzalez, María Claudia González Deniselle, MaríaFlorencia Labombarda, María Florencia Coronel, Lu-ciana Pietranera, Juan Beauquis, Laura Inés Garay,María Meyer, Maria Elvira Brocca, Gisella GargiuloMonachelli, Analía Ethel Lima, Paulina Roig, LilianaZugasti

Las investigaciones realizadas por el Laboratoriode Bioquímica Neuroendocrina muestran la posibili-dad de transferencia de los resultados obtenidos enmodelos animales a la clínica humana. Trabajando conmodelos de neuropatologías, tales como envejeci-miento, traumatismo de la médula espinal, esclerosismúltiple y esclerosis lateral amiotrófica, hemos demos-trado el beneficio terapéutico que brinda el tratamientocon progesterona y/o estrógenos. Estudios realizadosen animales hipertensos demuestran una encefalopatíaoriginada en la hiperfunción del sistema mineralocor-ticoide, la cual se corrige por tratamiento con estróge-nos. En la encefalopatía de la diabetes experimental,tanto los estrógenos como los antidepresivos actúancomo neuroprotectores. En el caso de esclerosis lateralamiotrófica, los datos obtenidos en un ratón mutante sehan extrapolado a pacientes que mostraron mayor so-brevida luego de recibir progesterona.

LABORATORIO DE

NEUROENDOCRINOLOGÍA

Director del laboratorio:Carlos Libertun Directora Adjunta:Victoria Ar Lux LantosIntegrantes: Silvia Bianchi, Paolo Catalano, MarinaFernandez, Maria Marta Bonaventura, Natalia IsabelCataldi, Noelia Paula Di Giorgio, Martín Crivello, Na-dia Bourguignon, Verónica Calvo, Paula Lopez, DiegoRodriguez

El control neurológico de la hipófisis tiene impor-tancia por su potencial aplicación en medicina repro-ductiva, y también para establecer la etiopatogenia delos adenomas hipofisarios.



Los estudios sobre regulación de la ingesta y balanceenergético son fundamentales para entender la etio-patogenia y tratamientos de patologías con alteracio-nes del peso corporal.

Aquellos resultados referidos a Bisfenol A son rele-vantes para dilucidar los efectos de los contaminantesambientales en la salud pública.

Los estudios de la participación de los receptoresGABAB en el control del eje hipotálamo-hipofisario yen la regulación de la fisiología pancreática son desuma importancia para comprender patologías endo-crinas de gran prevalencia, como la diabetes, y dado elamplio uso farmacológico de agonistas y antagonistasde dichos receptores, los efectos deseables e indesea-bles de los mismos.

Los estudios referentes a la regeneración de islotespancreáticos por oligodeoxinucleótidos son muy alen-tadores y pueden ser de gran interés para el trata-miento de la diabetes juvenil.

LABORATORIO DE REGULACIÓN

HIPOFISARIA

Directora del laboratorio:Damasia Becu Integrantes: Isabel Lacau, Graciela Díaz, Isabel GarcíaTornadu, Ana Ornstein, Victoria Recouvreux, MariaCecilia Ramirez, Guillermina Luque, Carolina Cris-tina, Rodrigo Lorenzo, María Andrea Camilletti

El laboratorio estudia la fisiopatología de la fun-ción hipofisaria usando modelos murinos transgéni-cos, líneas celulares en cultivo, muestras de tumoreshipofisarios humanos, y bovinos de importancia eco-nómica.

Nuestro laboratorio estudia funciones no conven-cionales del receptor dopaminérgico tipo 2 (RD2).Los RD2 son fundamentales en la coordinación mo-tora, la actividad de locomoción, el planeamiento, lamotivación o aversión y la dominancia social. Por otrolado, diversos mecanismos que aumentan la probabi-lidad de consumir alimentos nutritivos y aparearse re-currentemente usan la estimulación de este subtipo dereceptor. La participación del RD2 en la función en-docrina, motivo de nuestras investigaciones, refuerzasu papel en la reproducción y supervivencia.

Demostramos la participación de este receptor nosólo en el desarrollo de prolactinomas hipofisarios,sino también en el eje del crecimiento, la ingesta y elmetabolismo de glucosa usando en forma combinadaensayos farmacológicos y ratones transgénicos con mu-tación nula del RD2 en todo el organismo, o con mu-tación tejido específica en lactotropos. Asimismo, com-plementamos el enfoque estudiando otros modelos

murinos de prolactinomas, y adenomas humanos ob-tenidos por cirugía.

Nuestros resultados demuestran que este receptorparticipa en un complejo repertorio de funcionesadaptativas que mejoran el desempeño del individuo,su éxito reproductivo y supervivencia

LABORATORIO DE NEUROBIOLOGÍA

Director del laboratorio:Héctor CoiriniIntegrantes: María Sol Kruse, Mariana Rey, María Cri-stina Vega, Marina Roxana Di Pilla

Los estudios que se efectúan en el laboratorio estándirigidos a evaluar de qué manera una patología severadurante la preñez o un evento perinatal agudo son ca-paces de preacondicionar al sistema nervioso centralpara responder ante un evento estresante de una ma-nera anómala y encontrarse directamente relacionadoscon procesos neurodegenerativos que ocurren en losanimales adultos. Paralelamente estudiamos la acciónprotectora de ciertos agentes de naturaleza sintéticaque podrían llegar a utilizarse en un futuro para pre-venir o revertir las lesiones producidas en etapas tem-pranas. La relevancia de estos estudios radica en quelos mismos permitirán conocer y correlacionar cam-bios bioquímicos y morfológicos tempranos altamenterelacionados con el desarrollo de patologías neurode-generativas como la enfermedad de Alzheimer y/o laesquizofrenia que presentan una incidencia mayor enla población occidental y que afectan significativa-mente la calidad de vida del individuo y el entorno cer-cano.

LABORATORIO DE BIOLOGÍA DEL

COMPORTAMIENTO

Director del laboratorio:Enrique SeguraIntegrantes: Marcelo Cassini, Rubén Muzio, SilvanoZanutto, Alejandro Waiselboim, Luciana Frick, ClaudiaMarro, Alberto Yorio, Maximiliano Rapanelli, MarianaIurman, Valeria Natacha Peszano, Martín Puddington,Ángel Tabullo, Francisco Mannara, Cecilia Imperioso,Pamela Lopes Da Cunha, Anabel Miguelez Fernan-dez, Marcia Caruso, Federico Sanchez, Camilo Mi-ninni

Con una larga tradición en el terreno de las regu-laciones fisiológicas centradas en el control neuroen-dócrino de funciones cardiovasculares y reproductivas,se trabaja actualmente en hipótesis originales relacio-


IBYME 613

nadas con el estrés en tanto estrategia evolutivamenteestable en diversas especies de vertebrados. Sobre esabase se han logrado esclarecer ciertos mecanismos defuncionamiento en mamíferos y anfibios, referidos alas condiciones de regulación en situaciones fisiológi-camente críticas. Consecuentemente se está en condi-ciones de ofrecer conocimiento básico y aplicado conrelación a los mecanismos homeostáticos y sus pertur-baciones en diversas enfermedades de sistema como hi-pertensión arterial y alteraciones de la regulación delmetabolismo hidrosalino.

Por otra parte, actualmente se llevan a cabo estudioscon el objeto de contribuir al debate sobre las basescognitivas y neurobiológicas de la adquisición del len-guaje en humanos. Los resultados del grupo señalan laimportancia de los mecanismos de aprendizaje esta-dístico en la adquisición de términos y reglas gramati-cales nuevas.

UNIDAD DE VINCULACIÓN

Y TRANSFERENCIA DE TECNOLOGÍA

En 1983 la Fundación IBYME tomó la decisión decomprometerse con la gestión de proyectos de I+D yfomentar la transferencia tecnológica del conoci-miento surgido a partir de la investigación básica en elamplio rango de las investigaciones que se realizabanen la institución. Fue pionera y en el marco de la re-solución 314 de la SETCYP del 12 de julio de 1993como ya se mencionó, se designó a la Fundación Uni-dad de Vinculación Tecnológica, habilitando su parti-cipación al sector productivo de bienes y servicios(tanto públicos como privados) y a la transferencia delos resultados de sus investigaciones.

Esta transferencia tiene distintas modalidades segúnel tipo de servicio que presta y los destinatarios de losmismos. En nuestro caso, se trata de Servicios Tecno-lógicos de Alto Nivel (STAN-CONICET), prestacionesque se encuentran reguladas por resoluciones otorga-das por el Consejo Nacional de Investigaciones Cien-tíficas y Técnicas, o convenios específicos con empre-sas o instituciones públicas o privadas.

Entre los primeros, merecen citarse.

– Medición de hormonas en bovinos, ovinos, ca-mélidos, equinos y porcinos

– Testeo de construcciones bajo promotor de beta-caseina bovino.

– Transfección y clonado de fibroblastos fetalesbovinos para transferencia nuclear (Institucióntomadora del servicio: BioSidus S.A,)

– Determinación de anticuerpos anti-receptor de lahormona folículo estimulante.

– Determinación de anticuerpos anti-ovario ensuero humano

– Servicio de microdisección láser

Entre los convenios con empresas figuran:

– Obtención de insulina recombinante humana(Laboratorios Beta, S.A.).

– Modificación genética de levaduras recombi-nantes para optimizar la producción de proteínasheterólogas (Laboratorios Beta, S.A.).

– Obtención de anticuerpos monoclonales huma-nizados para el tratamiento en patologías huma-nas (Casara).

– Desarrollo de un sistema de obtención de avestransgénicas (BioSidus).

– Progestágenos y factores de crecimiento en cán-cer de mama humano (Oncomed Reno, S.A.).

– Evaluación de péptidos contra cadherina epitelialy neural en el proceso de interacción de gametas(ADHEREX Technologies Inc- Canada).

– Plataforma biotecnológica para la producciónde proteínas recombinantes de uso en salud hu-mana en leche de bovinos transgénicos (BioSidusS.A.).

AGRADECIMIENTO

La invalorable colaboración de la Lic. Flavia Her-nández en la coordinación y corrección del material re-cibido para este número de homenaje al Instituto deBiología y Medicina Experimental es especialmente re-conocida.



LABORATORIO

DE ESTEROIDES

Avances en la fisiología y patología de lacélula de Leydig

Advances on Leydig Cell physiology andpathology

Avanços na fisiologia e patologia da célula deLeydig

Mónica B. Frungieri, Silvia I. Gonzalez-Calvar, María E. Matzkin, Soledad P. Rossi, Artur Mayerhofer, Ricardo S. Calandra

Resumen

Con el sustento de datos de la literatura y propios, se describela interacción entre distintos neurotransmisores (noradrena-lina (NA), adrenalina (A), ácido γ-aminobutírico (GABA) y se-rotonina (5-HT), melatonina y prostaglandinas y su influen-cia sobre la actividad de las células de Leydig y la posiblerepercusión sobre la espermatogénesis. Brevemente, se ana-lizan las interrelaciones entre los sistemas testiculares sero-toninérgico y melatoninérgico y su participación en la mo-dulación de la expresión testicular de la ciclooxigenasa (COX),enzima clave en la biosíntesis de prostaglandinas. En sínte-sis, los estudios propuestos, además de brindar un mejor co-nocimiento sobre la fisiología testicular, permiten dilucidar as-pectos fisiológicos del testículo en una especie fotosensible(hámster Dorado) y por el otro, posibilitan describir en el hu-mano hallazgos originales en ciertos cuadros de InfertilidadIdiopática (Síndrome de Sertoli Solo, Arresto Germinal o Hi-poespermatogénesis severa). En este contexto, se ha obser-vado en pacientes con distintos grados de Oligospermia y/oAzoospermia, la expresión de COX en células de Leydig,mientras que dicha enzima no se detecta en testículos hu-manos con morfología normal. De este modo, los avances des-criptos pueden contribuir en el estudio de los mecanismos in-volucrados en el desarrollo de patologías testiculares ypermitirían el diseño de nuevas estrategias terapéuticas.

Palabras clave: testículo * neurotransmisores * melatonina *

prostaglandinas * infertilidad

Summary

Data from other authors and our own group describe the pres-ence of different Neurotransmitters—noradrenaline (NA),

adrenaline (A) gamma aminobutyric acid (GABA) and sero-tonin (5-HT), Melatonin and Prostaglandins—in testis andtheir role in male gonadal function. This review describes in-teractions between testicular serotoninergic, catecholamin-ergic and corticotropin-releasing factor systems, and theirparticipation in the regulation of testis expression of ciclo-oxigenase (COX), a key enzyme for steroidogenesis. Moreover,studies on COX expression and Prostaglandin production inGolden hamster Leydig cells are shown. The absence ofCOX-2 in normal human testes also is discussed, as well asits expression in biopsies from infertile patients (Sertolicell-only Syndrome, Germ cell arrest or severe hyposper-matogenesis) and its potential relevance. Within this context,COX expression in Leydig cells has been observed in patientswith some degree of Oligospermia and/or Azoospermia, whilethis enzyme cannot be detected in normal human testes.Consequently, the advances described can contribute to thestudy of the mechanisms involved in the develpment oftestis pathologies and would enable the design of new ther-apeutic strategies.

Key words: testis * neurotransmitters * melatonin *

prostaglandins * infertility

Resumo

Com base em dados da literatura e próprios, descreve-se ainteração entre diversos neurotransmissores (noradrenalina(NA, adrenalina (A), ácido γ-aminobutírico (GABA) e seroto-nina (5-HT), melatonina e prostaglandinas e sua influênciana atividade das células de Leydig e a possível repercussãona espermatogênese. Brevemente, são analisadas as inter-relações entre os sistemas testiculares serotoninérgico emelatoninérgico e sua participação na modulação da ex-pressão testicular da ciclooxigenase (COX), enzima chave nabiossíntese de prostaglandinas. Em síntese, os estudos pro-postos, além de oferecerem um melhor conhecimento sobrea fisiologia testicular, permitem elucidar aspectos fisiológi-cos do testículo numa espécie fotossensível (hamster Dou-rado) e por outra parte, possibilitam descrever no humanoachados originais em certos quadros de Infertilidade Idio-pática (Síndrome de Sólo Células de Sertoli, Presença de Cé-lulas Germinais ou Hipoespermatogênese severa). Nestecontexto, foi observado em pacientes com diversos graus deOligospermia e/ou Azoospermia, a expressão de COX em cé-lulas de Leydig, enquanto que dita enzima não é detectadaem testículos humanos com morfologia normal. Deste modo,os avanços descritos podem contribuir no estudo dos meca-nismos envolvidos no desenvolvimento de patologias testi-culares e permitiriam o desenho de novas estratégias tera-pêuticas.

Palavras chave: testículo * neurotransmissores * melatonina *

prostaglandinas * infertilidade


IBYME 615

A continuación contribuciones de los laboratorios que conforman el IBYME

Introducción

De manera creciente se ha ido demostrando que lainfertilidad masculina es debida, sólo en un reducidonúmero de casos, a alteraciones en el eje hipotálamo-hi-pófiso-gonadal (H-H-G). Aproximadamente, un 48% dehombres cursa con esterilidad sin causa aparente y eldesconocimiento de la causa de cualquier patologíahace difícil e ineficaz su tratamiento (1). Por otro lado,los diferentes tipos celulares en el testículo (células deLeydig, Sertoli, germinales, mastocitos, macrófagos,etc) y el avance en el conocimiento en las característi-cas estructurales y productos de su secreción, ha llevadoa que progresivamente los mecanismos que intervienenen la regulación local del testículo adquieran signifi-cancia. Así, nuevos factores intratesticulares fisiológicos,establecidos o potenciales, se involucran en la regula-ción de la función testicular y eventualmente en la fi-siopatología testicular. Han sido descriptos numerososcompuestos como participantes a nivel paracrino (di-fusión entre células vecinas) en el control de la funcióngonadal. Entre los principales compuestos se incluyenlos siguientes:

A) Neurotransmisores (N-T):Noradrenalina(N-A),Adrenalina(A), Ácido γ-aminobutírico (GABA), Acetil-colina (Acet), Serotonina (5-HT), y B) Otros com-puestos: Histamina, Neuropéptido Y (NPY), Factor Li-berador de Corticotrofina (CRF), Melatonina (Mel),Prostaglandinas (PGs), Opiodes, Taquininas (SP, NKA,NPK, NPG, NKB), Arginina-Vasopresina (AVP), Ocito-cina, GnRH, Leptina, Orexina, Grelina, etc.

Este capítulo se refiere a: N-A, A, GABA, 5-HT, CRF,Mel y PGs y estudios sobre los restantes compuestos pue-den ser consultados, entre otras, en las siguientes revi-siones específicas: (2-8).

I- NORADRENALINA/ADRENALINA

El testículo no posee nervios somáticos y la inervaciónes provista a través de nervios autonómicos. Sin embargo,aunque se ha descripto en algunas especies la presenciade un escaso número de fibras colinérgicas en la cápsulatesticular (9) la mayoría de los nervios testiculares son deorigen simpático. En este sentido, el principal N-T aso-ciado a las fibras simpáticas post-ganglionares es la N-A yen menor grado neuropéptidos (péptido intestinal va-soactivo, VIP y neuropéptido Y, NPY).

Los nervios simpáticos se hallan a lo largo de las ar-terias que llegan al testículo y constituyen el nervio es-permático superior e inferior, localizándose en el es-pacio intersticial en el hombre, mono Rhesus, perro,gato y cobayo. En cambio, en la rata las fibras nerviosasexhiben una alta densidad sólo en la cápsula testicular,pero ello no es menos importante por cuanto hay cé-lulas de Leydig próximas a zonas de la cápsula y a vasossanguíneos muy inervados por varicosidades y vesículas

con N-T. Esto se considera una “inervación indirecta”,en donde los N-T liberados por la inervación simpáticaalcanzan a las células vecinas (células de Leydig), in-mersas en el líquido intersticial (10). También se ha ob-servado en el mono otro posible orígen de las cateco-laminas en el testículo y se refiere por un lado a ladetección de la enzima tirosina-hidroxilasa (TH) y do-pamina-hidroxilasa (DH), y por el otro, al relacionadoa la presencia de células similares a neuronas (neuron-like cells).

En el mismo sentido, se comprobó en las células deLeydig correspondientes a distintos roedores (ratasadultas, ratón, ratón del desierto, hámster y cobayos) in-munoexpresión de marcadores neuronales y gliales(neurofilamento de 200 kD, proteína ácida gliofibrilar,vimentina, citoqueratina, etc) y otros marcadores, loscuales son típicos de células neuroendocrinas y gliales(11). Otra manera de demostrar la participación de N-Ay A, ha sido realizada en nuestro laboratorio, donde sedemostró luego de la denervación quirúrgica uni y bi-lateral del testículo de rata, con preservación de la es-tructura celular, una disminución en la producción deandrógenos post-estímulo con hCG y un descenso ex-clusivo y simultáneo en los receptores de LH en las cé-lulas de Leydig (12).

En algunos estudios se han utilizado testículos dehámster debido a la versatilidad del modelo, al permi-tir estudiar al animal en diferentes estadíos de la fun-ción gonadal, según el fotoperíodo de exposición (13).Este modelo en la adultez presenta cambios morfoló-gicos y fisiológicos que son compatibles con una invo-lución testicular severa cuando los animales son ex-puestos a un fotoperíodo de 6 h de luz y 18 h deoscuridad durante al menos 16 semanas. Luego de 28semanas en foto-restricción, los animales inician una re-activación espontánea que los lleva a restituir su perfilhormonal y fertilidad. Esto es importante por cuantopreviamente se señaló que las catecolaminas son más ac-tivas durante el desarrollo y la reactivación que ocurreluego de la involución por exposición a un fotoperíodobreve, que en cierta manera semeja el desarrollo pu-beral. Así, inicialmente indicamos que la estimulaciónpor N-A y A no es mediada a través de AMPc (14) y, se-gún la edad, el antagonista del receptor adrenérgico α1prazosin, bloquea dicho estímulo, mientras que propa-nolol, un β bloqueante, no lo modifica. Estos resultadosindican un efecto directo de las catecolaminas sobre eltestículo, diferenciándose este efecto según el grado defuncionalidad gonadal, al punto que en testículos pre-puberales o en involución, la sensibilidad a las cateco-laminas es mayor, lo cual coincide con niveles muy dis-minuídos de LH/FSH.

En resumen, es posible referir que ante la casi au-sencia de gonadotrofinas, se postula que las catecola-minas intervendrían en las situaciones referidas conun rol predominante sobre la esteroidogénesis.



II-ÁCIDO γ-AMINOBUTÍRICO (GABA)

GABA es un potente N-T en el SNC y participa en laproliferación neuronal y modulación de la producciónde neuroesteroides. En relación a este N-T, en el labo-ratorio se ha identificado GABA en el testículo de rata,preferentemente en el estadío prepuberal (15), de-mostrando un efecto estimulatorio en la esteroidoge-nésis y la presencia de receptores-GABA (Rs-GABA) encélulas de Leydig purificadas (16). Además de su loca-lización en el intersticio testicular, se describe la pre-sencia de GABA y Rs-GABA tipo A en espermatozoideshumanos eyaculados, facilitando la iniciación de la re-acción acrosomal y una mayor motilidad espermática.Más recientemente, en colaboración con el Grupo delDr. Mayerhofer (Munich, Alemania), hemos descriptopor medio de técnicas de biología molecular: a) Rs-GABA-A/B y sus diferentes subunidades en células deLeydig purificadas del testículo en distintas especies in-cluido el humano, b) la enzima GABA-glutamato de-carboxilasa (GAD65 y/o 67) y c) la expresión deltransportador vesicular inhibitorio de aminoácidos(VIAAT/VGAT). A su vez, la presencia de la subunidadα1 del Rs-GABA-A- en las células de Leydig de rata fueconfirmada por la técnica de microdisección por cap-tura láser y RT-PCR (17).

En resumen, GABA podría : 1) regular la función es-teroidogénica de las células de Leydig ; 2) intervenir enla maduración y diferenciación de las células germina-les y participar en la reacción acrosomal y 3) influir enla proliferación y diferenciación del intersticio testicu-lar, debido a hallazgos que señalan al GABA como un re-gulador trófico.

III-SEROTONINA (5-HT)/CORTICOTROPINRELEASING FACTOR (CRF)

Otros autores autores han descripto previamenteelevadas concentraciones de 5-HT en el testículo derata, pero de manera especial al nacimiento. En nues-tro grupo se observó inicialmente un efecto directo deesta indolamina sobre la esteroidogénesis testicular asícomo la presencia de sitios específicos de unión de la 5-HT-3H a membranas testiculares (18). Más tarde fuedescripta la presencia de 5-HT en la cápsula testiculary células intersticiales y ausencia en los túbulos seminí-feros. Se indicó que en un porcentaje considerable, elorigen del N-T es a partir de una inervación serotoni-nérgica. También, fue llamativa la elevada concentra-ción de 5-HT y ácido 5-hidroxiindolácetico en el lí-quido intersticial, indicando esto último la presencia deactividad monoamino oxidasa (19). Estudios posterio-res, y correspondientes a otros autores, indican que lascélulas de Leydig de rata producen 5-HT, su síntesis esestimulada por AMPc y de manera autocrina/paracrina,la indolamina interviene en la liberación testicular de

CRF por las células de Leydig (20). Este péptido es uninhibidor en la producción de testosterona post-hCG ypor lo tanto, se ha postulado que la 5-HT modularía enforma indirecta la esteroidogénesis testicular.

A través de la utilización del modelo fotosensibledel hámster, en nuestro grupo se observó no sólo la sín-tesis local de 5-HT y su localización celular, sino quetambién se demostró su variación durante el desarrollosexual y durante el proceso de involución/reactivaciónfotoinducible (21).

En el origen testicular de la 5-HT pueden estar in-volucrados los mastocitos, los que también secretan, almenos en roedores, una serie de compuestos entre losque se hallan: histamina, citoquinas, prostaglandinas(PGs), factores de crecimiento y proteasas. Estas célulasestán en la proximidad de las fibras nerviosas y de loselementos neuronales testiculares. La interacción entreestos elementos y las células de Leydig, al menos en eltestículo de mono, sería mediada por los mastocitos(22) y vía sus productos secretorios influirían sobre lafunción testicular. Estudios de otros grupos y este La-boratorio, han descripto en el testículo humano que losmastocitos se hallan localizados en el compartimento in-tersticial y en la pared de los túbulos seminíferos. Así,en biopsias testiculares y por técnicas inmunohistoquí-micas, se observó un aumento significativo en la po-blación de mastocitos en muestras de pacientes con elSíndrome de Sertoli Solo (o Del Castillo, Trabucco y dela Balze) y Arresto Germinal (22).También se halló quelos mastocitos testiculares contienen triptasa, una pro-teasa de serinas (23). En ese sentido, se describió queejerce una acción fibroproliferativa que involucra laactivación del receptor activado por proteasas 2 (PAR2),un aumento en la expresión de la enzima ciclo-oxige-nasa 2 (COX2, clave en la biosíntesis de PGs) y unión de15-deoxi-Δ12,14-PGJ12 (15d-PGJ2) a sus receptores nu-cleares PPARγ.

En consecuencia, la triptasa se halla estrechamenteligada a la relación entre mastocitos y los procesos fi-bróticos (24).Es interesante resaltar, que el testículohumano presenta los componentes del sistema trip-tasa—PAR2—COX2—15d-PGJ2—PPARγ, y en conse-cuencia un aumento en la población mastocitaria po-dría estar involucrada en la fibrosis peritubular en laspatologías mencionadas.

IV-MELATONINA (MEL)

Es reconocido el efecto de la Mel sobre el eje H-H enespecies fotosensibles y en especial en la regulación dela actividad reproductiva en modelos con variación es-tacional (25). El efecto de Mel depende de la especie,tiempo, extensión y niveles hormonales alcanzados. Ade-más de su efecto en el eje H-H, la Mel ejerce un efectodirecto sobre las células de Leydig. Esta hormona in-fluencia la capacidad reproductiva a nivel cerebral y so-


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bre la hipófisis regula la síntesis de gonadotrofinas. Laseñal fótica (impulso lumínico) llega a través de la re-tina a la glándula pineal modulando la síntesis de Mel.Además de este mecanismo melatoninérgico centralsobre el control de la reproducción, también hemos de-mostrado en el hámster Dorado un efecto intratesticu-lar de la Mel vía receptores mel1a en las células de Ley-dig y una regulación inhibitoria en la expresión génicade la proteína StAR y enzimas esteroidogénicas(P450scc, 3β-HSD, 17β-HSD). Más aún, en las células deLeydig ha sido posible establecer la presencia de las en-zimas específicas que intervienen en la síntesis de Mel,sugiriendo un origen gonadal (26).

Se ha observado que la Mel regula el número de mas-tocitos testiculares. En estudios de este Laboratorio, seobservó en hámsteres expuestos a un fotoperíodo re-ducido (8h luz-día), simultáneamente un aumento enel número de mastocitos testiculares y en los niveles deMel (26). En este sentido, previamente se señaló la in-teracción entre el sistema serotoninérgico—catecola-minérgico—CRF en las células de Leydig de hámster(22). Recientemente, se describió en estas células la ex-presión de la serotonina N-acetiltransferasa, enzima pí-vot en la síntesis de Mel. También se detectaron Rs-Mel1a, una inhibición por Mel en la producciónpost-estímulo con hCG de AMPc y andrógenos así comoen la expresión de StAR y enzimas relacionadas (26).Por lo tanto, los resultados indican la existencia de unsistema melatoninérgico testicular y un rol de Mel a dis-tintos niveles en el camino de la esteroidogénesis go-nadal. En síntesis, los nuevos conocimientos en la re-gulación de la esteroidogénesis testicular, sugieren unfine tunning o tono fino, ejercido por compuestos loca-les (ej. N-T, Mel, 5-HT), los que bien podrían ser de re-levancia en una mejor comprensión de la fisiología a ni-vel celular.

V-PROSTAGLANDINAS (PGs)

Las PGs son compuestos derivados del ácido araqui-dónico vía la intervención en sus etapas iniciales por dosisoenzimas tales como la ciclooxigenasa tipo 1 (COX-1)y ciclooxigenasa tipo 2 (COX-2) y a posteriori por otrasenzimas (PGE sintasa, PGD sintasa, etc). La COX-1 esconstitutiva, se halla en la mayoría de las células y encambio la isoenzima COX-2 es inducible y se expresa enestadíos tempranos de la diferenciación celular. El de-sarrollo de ratones deficientes en COX-1 y COX-2, hapermitido delimitar el rol de ambas isoenzimas en la re-producción. En ratones machos deficientes en COX-1y COX-2 no se observan trastornos de la fertilidad. Sinembargo, estudios previos señalaron en ratones ma-chos y en la línea celular de testículo MA-10, que las PGspodrían estar inhibiendo la esteroidogenésis. Más re-cientemente, se indica que el descenso en la biosíntesisde testosterona testicular en la rata Brown-Norway en

envejecimiento, se relaciona con la actividad de la iso-enzima COX-2. En este sentido, hemos indicado que di-ferentes especies que incluyen monos Rhesus adultos,cerdo, ratas Wistar y Sprague Dawley, y ratones BALBcy hamsteres prepuberales o en involución gonadal porfotorestricción, no mostraron expresión de la isoen-zima COX-2, mientras que células de Leydig de hams-teres adultos y puberales en fotoperíodo normal indi-caron expresión positiva (27). PGD2 y PGF2α, modulanla síntesis de testosterona en estas células. Además, es-tudios recientes nos señalan que la expresión de COX-2 y la síntesis de PGs en células de Leydig del hámster,son reguladas por testosterona a través de un meca-nismo no clásico (28).

Finalmente, es importante señalar que en testículos depacientes con ciertos cuadros de infertilidad, tales comoel Síndrome de Sertoli Solo y en el Síndrome de ArrestoGerminal, hemos hallado expresión de COX-2. Por elcontrario, en muestras de testículos provenientes de pa-cientes sin anormalidades morfológicas del testículo laexpresión es negativa (29). Conectado a estos hallazgos,el número total de macrófagos se encuentra aumentado.Estas células inmunes, localizadas en el espacio inters-ticial y los túbulos seminíferos, expresan interleuquina1α/β y TNFα (30). Al respecto, recientemente hallamosuna significativa correlación entre los niveles de inter-leuquina 1β y la expresión de COX-2 en el testículo hu-mano (31). De este modo, ciertas citoquinas serían ca-paces de modificar la función de las distintas células deltestículo y en consecuencia podrían estar involucradasen el desarrollo de cuadros de infertilidad que se clasi-fican como idiopáticos.

AGRADECIMIENTOSLos estudios descriptos han sido apoyados con Subsidios prove-nientes del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Téc-nicas (CONICET), Agencia Nacional de Promoción Científica yTécnica (ANPCYT), Facultad de Medicina-Universidad de Bue-nos Aires, Fundación Antorchas, Fundación A.J.Roemmers,Deutsche Forsschungsgemeinschaft (DFG) (Alemania), Aca-demy of Sciences for the Developing World (TWAS).

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LABORATORIO DE ESTEROIDES

Efectos gonadales y extra-gonadales de lahipersecreción de la hormona gonadotrofinacoriónica humana: evaluación en un modelode ratones transgénicos.

Gonadal and extra-gonadal effects of humanchorionic gonadotropin hypersecretion:evaluation in a transgenic mouse model

Efeitos gonadais e extra-gonadais dahipersecreção do hormônio gonadotrofinacoriônica humana: avaliação num modelo decamundongos transgênicos

Susana B. Rulli, Laura D. Ratner, GuillerminaStevens, Betina González, Ricardo S. Calandra

Resumen

Nuestro grupo de investigación está enfocado en estudiarlos efectos gonadales y extra-gonadales que ejerce la hor-mona gonadotrofina coriónica humana (hCG) sobre la fun-ción endocrina y reproductiva, particularmente en condi-ciones de secreción desregulada y persistente. Latecnología transgénica ha resultado ser una herramientafundamental a la hora de proveer nuevas evidencias sobreel rol de las gonadotrofinas en la patofisiología reproduc-tiva. En este sentido, los ratones transgénicos hipersecre-tores de hCG han resultado un excelente modelo para lle-var a cabo dichas investigaciones. Hemos realizadoestudios de caracterización del modelo, que nos han per-mitido tener un profundo conocimiento del mismo e iden-tificar un gran número de anomalías en distintos nivelesde regulación endocrina, que serán el foco de atención enfuturas investigaciones. Las mismas tienen un considera-ble potencial en el campo de la biomedicina, ya que ayu-darán a identificar los mecanismos regulatorios afectadospor un estímulo disruptivo como puede ser una hiperse-creción hormonal, y permitirán la exploración de nuevasestrategias terapéuticas que interfieran en las patologíasendocrinas asociadas. Nuestras investigaciones sobre elmodelo de hipersecreción crónica de hCG en ratonesmuestran claramente que niveles elevados y persistentesde esta hormona promueven múltiples anomalías endo-crinas que están acompañadas de tumores gonadales yextra-gonadales.

Palabras clave: gonadotrofina coriónica humana * ratones

transgénicos * reproducción * hormona * tumores

Summary

This investigation is focused in studying the gonadal andextra-gonadal effects that the human chorionic gonadotropinhormone (hCG) exerts on endocrine and reproductive func-tions, particularly under deregulated and persistent secretionconditions. Transgenic technology has turned out to be afundamental tool when providing new evidences on therole of gonadotropins in reproductive physiopathology. Inthis sense, transgenic mice hCG hypersecretion has beenan excellent model to perform these investigations.Characterization studies of the model have been devel-oped to identify a great number of anomalies in differ-ent levels of endocrine regulation, which will be the cen-ter of attention in subsequent investigations. These havea considerable potential in the field of biomedicine andwill help to identify the regulatory mechanisms affectedby a disruptive stimulus, such as hormonal hypersecre-tion, and will enable the exploration of new therapeuticstrategies to interfere with endocrine pathologies. Ourinvestigations on the model of chronic hypersecretion ofhCG in mice show clearly that high and persistent levelsof this hormone promote manifold endocrine anomaliesthat are accompanied by gonadal and extra-gonadaltumors.

Key words: human chorionic gonadotropin * transgenic mice *

reproduction * hormone * tumors

Resumo

Nosso grupo de pesquisa está focado em estudar os efei-tos gonadais e extra-gonadais que exerce o hormônio gona-dotrofina coriônica humana (hCG) sobre a função endócrinae reprodutiva, particularmente em condições de secreçãodesregulada e persistente. A tecnologia transgênica temresultado ser uma ferramenta fundamental na hora de for-necer novas evidências sobre o papel das gonadotrofinas napatofisiologia reprodutiva. Nesse sentido, os camundongostransgênicos hipersecretores de hCG têm resultado um exce-lente modelo para levar a cabo tais pesquisas. Temos reali-zado estudos de caracterização do modelo, que nos têm per-mitido ter um profundo conhecimento do mesmo eidentificar um grande número de anomalias em diferentesníveis de regulação endócrina, que serão o foco de atençãoem futuras pesquisas. As mesmas têm um considerávelpotencial no campo da biomedicina, visto que ajudarão aidentificar os mecanismos regulatórios afetados por um estí-mulo disruptivo como pode ser uma hipersecreção hormonal,e permitirão a exploração de novas estratégias terapêuticasque interfiram nas patologias endócrinas associadas. Nossaspesquisas sobre o modelo de hipersecreção crônica de hCGem camundongos mostram claramente que níveis elevados epersistentes deste hormônio promovem múltiplas anomaliasendócrinas que estão acompanhadas de tumores gonadais eextra-gonadais.

Palavras chave: gonadotrofina coriônica humana * camundon-

gos transgênicos * reprodução * hormônio * tumores



El eje hipotálamo-hipófiso-gonadal es el pilar fun-damental en la regulación endocrina de la funciónreproductiva. Cualquier alteración en la regulación delas diferentes hormonas o receptores involucrados en elfuncionamiento de este eje puede provocar cambios enel inicio de la pubertad, infertilidad, y también cáncer,desórdenes metabólicos o disfunciones cardiovascula-res. La acción fisiológica de las gonadotrofinas está biencaracterizada y se sabe que son esenciales en la folicu-logénesis, ovulación y esteroidogénesis en las hembras,y en el desarrollo testicular, espermatogénesis y este-roidogénesis en los machos. Existen condiciones fisio-lógicas y patológicas donde la secreción y/o acción delas gonadotrofinas están elevadas. Por ejemplo, duran-te el primer trimestre de embarazo, cuando la hormo-na gonadotrofina coriónica humana (hCG) es esencialen el mantenimiento de la preñez y la masculinizacióndel feto (1). La posmenopausia es una condición fisio-lógica donde las mujeres están expuestas a niveles ele-vados de gonadotrofinas durante décadas, y se ha pro-puesto que éste es un factor de riesgo para el desarrollode tumores de ovario (2). Por último, condiciones pato-lógicas con elevada secreción/acción de gonadotrofi-nas incluye tumores hipofisarios, mutaciones activantesde sus receptores, síndrome de ovario poliquístico,enfermedades trofoblásticas y tumores testiculares.

La tecnología transgénica ha resultado ser unaherramienta fundamental a la hora de proveer nuevasevidencias sobre el rol de las gonadotrofinas en la pato-fisiología reproductiva. La hCG, normalmente secreta-da por la placenta, está estructural y funcionalmenterelacionada con la hormona luteinizante (LH), y pro-duce el mismo efecto biológico a través de la unión aun mismo receptor, estimulando la esteroidogénesisgonadal. Los descubrimientos que vinculan a la acciónde LH con actividad de promotor tumoral, fueron elincentivo para esclarecer las consecuencias fenotípicasde una acción aumentada de LH/hCG (3-8). Con el finde lograr una elevada actividad de LH/hCG circulante,se han desarrollado dos líneas de ratones transgénicosque sobreexpresan hCG: 1) simple transgénicos porta-dores del gen de la subunidad β de hCG (hCGβ+); 2)doble transgénicos portadores de los genes de las subu-nidades α y β de hCG (hCGαβ+). Ambos transgenes seencuentran bajo el promotor universal Ubiquitina C.

Nuestro grupo de investigación está enfocado enestudiar los efectos gonadales y extra-gonadales que ejer-ce la hCG sobre la función endócrina y reproductiva,particularmente en condiciones de secreción desregu-lada y persistente. En este sentido, los ratones transgé-nicos hipersecretores de hCG han resultado un exce-lente modelo para llevar a cabo dichas investigaciones.Estos animales se han desarrollado en la Universidad deTurku, Finlandia, bajo la dirección y coordinación de losDres. I. Huhtaniemi y M. Poutanen, con quienes se man-tiene una activa colaboración. Hemos realizado estudios

de caracterización del modelo, que nos han permitidotener un profundo conocimiento del mismo e identifi-car un gran número de anomalías en distintos niveles deregulación endocrina, que serán el foco de atención enfuturas investigaciones. Las mismas tienen un conside-rable potencial en el campo de la biomedicina, ya queayudarán a identificar los mecanismos regulatorios afec-tados por un estímulo disruptivo como puede ser unahipersecreción hormonal, y permitirán la exploraciónde nuevas estrategias terapéuticas que interfieran en laspatologías endocrinas asociadas.

Hemos descrito que en el modelo de ratones trans-génicos hCGβ+ se producen moderados niveles de hCGbioactiva, producto de la dimerización de la subunidadhCGβ transgénica y la subunidad α expresada endóge-namente en la hipófisis (9)(10). Mientras que los machoshCGβ+ son fértiles, las hembras presentan pubertad pre-coz y son infértiles debido a alteraciones en el ciclo estraly defectos en la estructura uterina. Los ovarios se mues-tran con quistes hemorrágicos ocasionales y altamenteluteinizados como consecuencia de la activa estimula-ción con hCG. Estos animales producen elevados nive-les circulantes de andrógenos, estrógenos y progestero-na desde edades tempranas del desarrollo sexual. Se handetectado también varios fenotipos extragonadales eneste modelo: a edades avanzadas, las hembras desarrollanhiperprolactinemia acompañada de macroprolactino-mas y tumores mamarios metastásicos (9)(11)(12). Loscomplejos cambios hormonales, y consecuentemente eldesarrollo de dichos tumores se atribuyen a la hiperesti-mulación crónica del ovario por hCG, ya que la ovariec-tomía impide su formación, a pesar de mantener unapersistente y elevada secreción de hCG.

El modelo de ratones doble transgénicos hCGαβ+produce una excesiva secreción de la forma diméricabioactiva de hCG (3)(4)(10)(13). Esta condición per-mitió identificar fenotipos patológicos que no se habí-an manifestado en el modelo de simples transgénicoscon moderada expresión de hCG. Hemos observadoque las hembras también presentan pubertad precoz,infertilidad y significativas alteraciones en el perfil dehormonas esteroideas circulantes desde edades tem-pranas de la maduración sexual. La principal caracte-rística que diferencia este modelo con el del simpletransgénico es el desarrollo de tumores de ovario detipo teratoma (3)(4). Al inicio de la edad adulta,hemos detectado la presencia de células gigantes deltrofoblasto en el ovario hCGαβ+, normalmente invo-lucradas en la implantación del feto y vascularizaciónde la decidua materna, así como la formación de unamasa tumoral compuesta de tejidos derivados de lastres capas embrionarias, que imita desordenadamenteel desarrollo embrionario. Estos tumores surgen a par-tir de la activación partenogenética de los ovocitos den-tro del ovario. Hemos analizado si el desarrollo tumo-ral está influenciado por la acción de los esteroides


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gonadales producidos en exceso por dichos ovarios, através de tratamientos in vivo con el antiandrógeno flu-tamida, el antiestrógeno fulvestrant y el antiprogestá-geno mifepristone en ratones hembras hCGαβ+ (14).Si bien los tratamientos antihormonales no lograronimpedir la activación teratogénica, los mismos tuvieronun claro efecto sobre la progresión tumoral, frenandoel crecimiento explosivo del teratoma. Por otra parte,hemos estudiado la capacidad ovulatoria y la expresiónde distintos factores involucrados en la ovulación enhembras inmaduras hCGαβ+ sometidos a un protoco-lo de inducción de la ovulación con PMSG/hCG.Observamos que el mecanismo de ovulación resultósignificativamente afectado en las hembras transgéni-cas, indicando que niveles elevados de hCG estaríanproduciendo una alteración en la correcta expresión delos factores involucrados en el proceso de señalizaciónintrafolicular, que conllevaría a la anovulación (15).

En cuanto a los machos, la hipersecreción crónica dehCG causa hiperplasia/hipertrofia de las células deLeydig de origen fetal, hiperandrogenismo, infertilidady severas alteraciones en los órganos reproductivos mas-culinos (10)(13). Hemos demostrado además, que lahipersecreción de hCG en machos produce una inhi-bición persistente sobre la síntesis y secreción de FSH,a través de alteraciones a nivel de la hipófisis y del hipo-tálamo, que no revierten con la castración o con el blo-queo de la acción androgénica por flutamida (16). Dadoque la sobreexpresión de hCG en este modelo ocurredesde el estadío fetal, este efecto se debería a una mayorexposición a esteroides del sistema neuroendócrinodurante etapas tempranas de diferenciación sexual, reve-lando nuevos roles de los andrógenos y/o sus metaboli-tos producidos localmente en la (des)regulación de launidad hipotálamo-hipofisaria masculina.

Nuestras investigaciones sobre el modelo de hiperse-creción crónica de hCG muestran claramente que nive-les elevados y persistentes de esta hormona promuevenen ratones múltiples anomalías endocrinas que estánacompañadas de tumores gonadales y extra-gonadales.

Estas investigaciones han sido financiadas con sub-sidios de la Agencia Nacional de Promoción Científicay Tecnológica, el Consejo Nacional de InvestigacionesCientíficas y Técnicas de la República Argentina yFundación Roemmers.


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MOLECULAR

Falla ovárica prematura

Premature ovarian failure

Falência ovariana prematura

Violeta Chiauzzi, Victoria Sundblad, Ianina Ferder,Liliana Dain, Eduardo Charreau

Resumen

La falla ovárica prematura (FOP) es un sindrome carac-terizado por amenorrea hipergonadotrófica antes de los40 años. Las causas del desarrollo de FOP pueden serautoinmunes, genéticas, cromosómicas e idiopáticas. Esimportante identificar marcadores para predecir la cesa-ción prematura de los ciclos y planear una concepcióntemprana.

Palabras clave: falla ovárica prematura * síndrome de ovario

resistente a las gonadotrofinas * autoinmunidad ovárica * gen

R-FSH * gen inhibina α * gen FMR-1

Summary

Premature ovarian failure (POF) is defined as hyper-gonadotropic amenorrhea before the age of 40. The causesof POF development could be autoimmune, genetic, chro-mosomic and idiopathic. It is important to identify markersthat can predict the premature cessation of menses andenable early conception planning.Key words: premature ovarian failure * resistant ovary syndrome *

ovarian autoimmunity * R-FSH gen * inhibin-α gen * FMR-1 gen

Resumo

A falência ovariana prematura (FOP) é uma síndrome carac-terizada por amenorreia hipergonadotrófica antes dos 40anos. As causas do desenvolvimento de FOP podem serautoimunes, genéticas, cromossômicas e idiopáticas. Éimportante identificar marcadores para predizer a cessaçãoprematura dos ciclos e planificar uma concepção precoce.Palavras chave: falência ovariana prematura * síndrome de

ovário resistente às gonadotrofinas * autoimunidade ova-

riana * gene R-FSH * gene inibina α * gene FMR-1

Introducción

La falla ovárica prematura (FOP) es una patologíaque afecta al 1% de las mujeres en edad fértil, caracte-rizada por presentar amenorrea primaria o secundariaantes de los 40 años, hipoestrogenismo e hipergonado-trofismo, con distintos grados de atresia folicular. Es unsindrome muy heterogéneo y de patogénesis multicau-

sal. Entre las causas de FOP se hallan alteraciones cro-mosómicas, enzimáticas, causas iatrogénicas, infecciosaso autoinmunidad. Asimismo y debido a la presencia devarios casos de FOP en una misma familia, se ha sugeri-do que este sindrome podría ser de origen genético.

Se ha propuesto al sindrome de ovario resistente alas gonadotrofinas (SOR) como una forma folicular deFOP, el cual se caracteriza por la presencia de nume-rosos folículos primordiales morfológicamente nor-males en los ovarios. Dado que las estructuras folicula-res se encuentran conservadas en el SOR, seríateóricamente posible la recuperación de la funciónovárica, ya sea de forma espontánea o inducida.

Presentación clínica

La FOP puede presentarse con amenorrea primariao secundaria. Las mujeres con defectos cromosómicosen general presentan amenorrea primaria. Sin embar-go, si el defecto se presenta con cierto grado de mosai-cismo, las pacientes pueden poseer algo de tejido gona-dal funcional que conduciría a distintos grados dedesarrollo sexual y a ciclicidad menstrual transitoria.

En muchos casos, la falla ovárica se desencadenadespués de una historia menstrual normal con posibi-lidades incluso de fertilidad. En otras mujeres, la ame-norrea ocurre después del parto o de la suspensión detratamientos con anticonceptivos orales. Su apariciónno es un fenómeno de “todo o nada” y el diagnósticodefinitivo de su comienzo es difícil de establecer. En losúltimos años, algunos autores prefieren el término“disfunción ovárica prematura” (DOP) o “insuficienciaovárica prematura” (IOP) para describir un curso clí-nico progresivo hacia la cesación de la función ovári-ca. Asimismo, la deficiencia en los esteroides sexualesque se observa en este síndrome puede conducir a unriesgo elevado de osteoporosis, de enfermedad cardio-vascular, así como a la pérdida de fertilidad debida enla mayoría de los casos, a la ausencia de folículos.

Etiología

La falla ovárica prematura puede ocurrir como con-secuencia de: a) una reducción del tamaño del reser-vorio folicular inicial; b) un aumento de la atresia foli-cular; c) una interrupción en la maduración de losfolículos. Las causas del desarrollo de FOP pueden ser:autoinmunes (~15%), genéticas (~ 20%), cromosómi-cas (~5%) e idiopáticas (~60%). Nuestro grupo de tra-bajo se ha dedicado al estudio de las causas inmuno-lógicas y genéticas del desarrollo de FOP.

I- CAUSAS INMUNOLÓGICASEl ovario humano puede ser blanco de procesos

autoinmunes en varias circunstancias. Uno de los ele-


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mentos en la identificación de la etiología autoinmunede FOP es la detección de anticuerpos circulantes diri-gidos hacia antígenos del ovario, junto con la asocia-ción a otras enfermedades autoinmunes, sistemáticas uórgano-específicas. En algunas pacientes, hay tambiénuna documentación histológica de infiltrado linfocita-rio en sus ovarios (1). Cuando la FOP se asocia a autoin-munidad adrenal (2-10% de los casos) las pacientes pre-sentan anticuerpos circulantes a células esteroideas(SCA) (2). Los mismos reconocen células productorasde esteroides en la corteza adrenal, testículo, placentay ovario, y se correlacionan con la falla gonadal.

Sin embargo, en los casos de FOP no asociado aautoinmunidad adrenal y en los casos de FOP aislado,es necesario detectar autoanticuerpos circulantes diri-gidos a antígenos del ovario como marcadores deautoinmunidad ovárica. En estudios previos de nuestrolaboratorio, mediante una técnica de Western blot enfracción citosólica de ovarios humanos, detectamosreacción positiva hacia una proteína de aproximada-mente 54 KDa, en el 19,1% de una población de 110pacientes FOP. Esta proteína fue identificada comoenolasa-α (3). No se ha podido establecer aún si estosanticuerpos anti-ovario son causa o consecuencia delproceso que conduce a la FOP y actualmente, su utili-dad clínica es controvertida.

Por otro lado, el SOR puede considerarse un casoraro de FOP autoinmune dado que el mismo presentainmunoglobulinas circulantes dirigidas al receptor dela hormona folículo estimulante (Ig-RFSH) (4). En unestudio retrospectivo de 247 pacientes FOP, 23 de lascuales fueron diagnosticadas como SOR, hallamos quetodas las pacientes SOR presentaron este anticuerpo(5). Esta inmunoglobulina bloquea la unión de FSH asus receptores o a un sitio muy próximo, impidiendosu acción (4). Estos datos son consistentes con lasmanifestaciones histopatológicas de las pacientes SORy podrían explicar la resistencia de los folículos a laacción de la FSH.

II- CAUSAS GENÉTICAS

El gen del R-FSH ha sido uno de los genes candida-tos más estudiados. La primera mutación fue descrip-ta en el exón 7 de este gen, en mujeres con disgenesiaovárica hipergonadotrófica pertenecientes a 6 familiasde Finlandia (6). Hasta el presente se han descripto 8mutaciones inactivantes del gen del R-FSH, todas ellasen casos aislados. En nuestros trabajos, no detectamosmutaciones en la secuencia codificante completa delgen R-FSH en los individuos analizados (7). Estos datosson coincidentes con estudios realizados en otraspoblaciones, sugiriendo que las mutaciones en el gendel R-FSH son poco frecuentes en las pacientes FOP.Asimismo, se conocen dos sitios polimórficos en elexón 10 del gen del R-FSH que dan lugar a 2 isoformas

del receptor. Nuestros resultados indicaron que lospolimorfismos del exón 10 no representan un factorde riesgo para el desarrollo de FOP, si bien, la presen-cia de una isoforma particular del receptor estaría aso-ciada a una forma más severa del sindrome (8).

Por su parte, el gen de la inhibina alfa ha sido pro-puesto como otro gen candidato para el desarrollo deFOP, debido al rol de las inhibinas en la regulación dela FSH. En este gen se han descripto un polimorfismoy una sustitución, los cuales se han asociado al desa-rrollo de la enfermedad. Sin embargo, resultados denuestro laboratorio estarían indicando que estasvariantes no constituyen un factor de riesgo para laenfermedad ya que no hallamos asociación de los mis-mos con la aparición de FOP en nuestra población (9).

Otro de los genes candidatos propuestos es el genFMR-1. Este gen se encuentra en el cromosoma X y secaracteriza por poseer en su región 5´ no codificanteun número variable de trinucleótidos CGG. Los indi-viduos normales poseen hasta 50 repeticiones CGG,mientras que la expansión en más de 200 repeticiones(mutación completa) es responsable del “síndrome defragilidad del X” (SFX), una forma de retardo mental.Los alelos que contienen entre 50-200 repeticiones sonconsiderados premutados y pueden expandirse a muta-ción completa en una generación. Las mujeres con ale-los premutados en el gen FMR-1 tienen un riesgoaumentado de desarrollar FOP. De hecho, se ha esti-mado que la incidencia de FOP entre las mujeres por-tadoras de la premutación es de alrededor del 15%(10). Por otro lado, aproximadamente 4% de las muje-res afectadas de FOP son portadoras de la premutaciónen el gen FMR-1. Nuestros estudios sobre 100 pacien-tes FOP y 156 controles, mostraron la presencia de tri-pletes expandidos de este gen en 7 pacientes FOP denuestra población. Teniendo en cuenta la posibilidadde descendencia del SFX, se aconseja solicitar el estu-dio de la zona repetitiva CGG del gen FMR-1 a laspacientes FOP, a los efectos de brindar asesoramientogenético (11).

Tratamiento

El criterio actual para mujeres con FOP es la terapiade reemplazo hormonal hasta la edad fisiológica de lamenopausia (50 años) con el objeto de cubrir el défi-cit estrogénico de sus ovarios y disminuir el riesgo deosteoporosis y enfermedad cardiovascular. Además, sesuplementa con testosterona para mejorar la funciónsexual. Alrededor de 5-10% de las mujeres con FOPlogran ovulación y embarazos espontáneos, razón porla cual se debe proteger al ovario con esta terapia y noprivar a la paciente de esa posible fertilidad. Los trata-mientos con clomifeno, gonadotrofinas, agonistas deGNRH o inmunosupresores, no mejoraron significati-vamente la posibilidad de embarazos, y en consecuen-



cia, se han dejado de usar. Existen sólo algunos casosreportados de pacientes FOP autoinmunes que hanrecuperado el ciclo menstrual y embarazo con la tera-pia inmunosupresora (12). Actualmente, el tratamien-to de elección para recuperar la fertilidad de la mujercon FOP es la donación de óvulos mediante el proce-so de reproducción asistida. También se propone lacriopreservación de ovocitos para su posterior creci-miento y maduración in vitro.

Desarrollos futuros

El entendimiento de los posibles mecanismos queconducen a la FOP contribuirían al diagnóstico tem-prano de esta condición, para así lograr la protecciónde los folículos antes del desarrollo de la misma. Esimportante identificar marcadores que puedan prede-cir la cesación prematura de los ciclos y planear unaconcepción temprana.


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MOLECULARES DE LA FERTILIZACIÓN

Mecanismos moleculares involucrados en elproceso de fertilización

Molecular mechanisms involved in thefertilization process

Mecanismos moleculares envolvidos noprocesso de fertilizaçãoDébora J. Cohen, Julieta A. Maldera, Mariana Weigel Muñoz, Juan I. Ernesto, Gustavo Vasen, María A. Battistone, Patricia S.Cuasnicu

Resumen

El proceso de fertilización en mamíferos involucra una seriede interacciones entre el espermatozoide y el ovocito media-das por mecanismos de tipo ligando-receptor. Una de lasmoléculas mediadoras del proceso de fertilización es la pro-teína epididimaria CRISP1 (Cysteine Rich Secretory Protein 1),la cual se asocia con dos afinidades diferentes a los esper-matozoides durante la maduración. Mientras la poblacióndébilmente unida al espermatozoide se libera durante la capa-citación, la población fuertemente unida, se comporta comouna proteína integral de membrana, permanece en el esper-matozoide luego de la capacitación, y participa en el procesode interacción de gametas. Recientes estudios indican que, sibien los ratones knockout para CRISP1 son fértiles, sus esper-matozoides exhiben menores niveles de fosforilación de pro-teínas en tirosina durante la capacitación, como así tambiénuna significativamente menor capacidad de interactuar tantocon la zona pellucida como con la membrana plasmática delovocito (fusión). Dado que la proteína testicular CRISP2 tam-bién participa en el proceso de fusión, la misma sería la can-didata más probable a compensar la falta de CRISP1 en elanimal knockout. En conjunto, nuestros resultados apoyan la


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idea de diferentes roles para una misma proteína CRISP, y lacooperación entre proteínas CRISP homólogas con el fin degarantizar el éxito de la fertilización.

Palabras clave: espermatozoide * ovocito * fertilización

Summary

Mammalian fertilization involves a series of sperm-egg inter-actions mediated by ligand-receptor mechanisms. One of themolecules proposed to participate in this process is epi-didymal protein CRISP1 (Cysteine Rich Secretory Protein 1)which associates with two different affinities with sperm dur-ing maturation. While the loosely bound population isreleased from the cell during capacitation, the stronglybound population behaves as an integral protein, remains onthe sperm after capacitation, and participates in gameteinteraction. Recent results revealed that although CRISP1knockout mice are fertile, their sperm exhibit lower levels ofprotein tyrosine phosphorylation during capacitation as wellas a significantly reduced ability to interact with both ZP andthe oolema (fusion). Considering evidence showing that tes-ticular CRISP2 also participates in gamete fusion, this pro-tein is a likely candidate to compensate for the lack ofCRISP1 in knockout mice. Together, these results supportthe idea of different roles for the same CRISP protein, anda functional cooperation between homologous CRISP pro-teins to ensure the success of fertilization.

Key words: sperm * egg * fertilization

Resumo

O processo de fertilização em mamíferos envolve uma sériede interações entre o espermatozoide e o ovócito mediadospor mecanismos de tipo ligando-receptor. Uma das molé-culas mediadoras do processo de fertilização é a proteínaepididimária CRISP1 (Cysteine Rich Secretory Protein 1),a qual se associa com duas afinidades diferentes aos esper-matozoides durante a maduração. Enquanto a populaçãounida de forma fraca ao espermatozoide se libera do esper-matozoide durante a capacitação, a população fortementeunida se comporta como uma proteína integral de mem-brana, permanece no espermatozoide depois da capacita-ção, e participa no processo de interação de gametas.Recentes estudos indicam que embora os camundongosknockout para CRISP1 sejam férteis, seus espermatozoidesexibem menores níveis de fosforilação de proteínas em tiro-sina durante a capacitação, bem como uma significativa-mente menor capacidade de interagir tanto com a zonapelúcida quanto com a membrana plasmática do ovócito(fusão). Visto que a proteína testicular CRISP2 também par-ticipa no processo de fusão, a mesma seria a candidatamais provável a compensar a falta de CRISP1 no animalknockout. Em conjunto, nossos resultados apoiam a ideiade diferentes papéis para uma mesma proteína CRISP, e acooperação entre proteínas CRISP homólogas visando agarantir o êxito da fertilização.

Palavras chave: espermatozoide * ovócito * fertilização

El proceso de fertilización involucra una serie deinteracciones entre el espermatozoide y el ovocitomediadas por mecanismos de tipo ligando-receptorentre moléculas complementarias presentes en lasmembranas de ambas gametas (1). Sin embargo, apesar de la importancia de este proceso, la informa-ción acerca de la identidad de las moléculas involu-cradas es aún muy escasa (2).

Una de las proteínas postuladas como mediadorasdel proceso de fertilización es la proteína epididimariaCRISP1 (32 kDa) (3), la cual se asocia a los esperma-tozoides a medida que los mismos transitan por el epi-dídimo (4). Originalmente localizada en la región dor-sal de la cabeza del espermatozoide, CRISP1 migra alsegmento ecuatorial con la ocurrencia de la reacciónacrosomal (5). Dado que el segmento ecuatorial es laregión por la cual el espermatozoide se fusiona con elovocito, se investigó el posible papel de CRISP1 en estepaso específico de la fertilización. Los resultados indi-caron que tanto la presencia de anti-CRISP1, como dela proteína CRISP1 purificada, durante la co-incuba-ción de gametas, inhibía significativamente la fusiónespermatozoide-ovocito sin afectar la etapa de uniónentre ambas gametas (6). Estos resultados no sólo con-firmaron la participación de CRISP1 en la etapa defusión sino también la existencia de sitios comple-mentarios para esta proteína en la membrana plasmá-tica del ovocito (oolema). Ensayos posteriores deinmunoflorescencia indirecta permitieron detectar lapresencia de dichos sitios en toda la superficie del ovo-cito, excepto en una región a la que se denominó áreanegativa y que resultó coincidente con la región por lacual el espermatozoide no se fusiona con el ovocito(6). De este modo, mientras la proteína CRISP1 esta-ría localizada en la región fusogénica del espermato-zoide, sus sitios complementarios se localizarían en laregión fusogénica del ovocito. Estos resultados repre-sentaron una importante contribución al campo de lafusión de gametas ya que constituyeron la primeraevidencia de la existencia de sitios específicos parauna proteína del espermatozoide en la superficie delovocito de mamíferos. Posteriores resultados indica-ron que CRISP1 se asociaría a la membrana del esper-matozoide con dos afinidades diferentes, dando lugara la presencia de dos poblaciones sobre la gameta:una población mayoritaria, asociada débilmente porinteracciones iónicas y que se libera de la céluladurante el proceso de capacitación, y una poblaciónfuertemente unida que corresponde a la proteína quemigra al segmento ecuatorial y que participa en elproceso de fertilización (7). La relevancia de CRISP1para la fertilidad fue confirmada por experimentosen los cuales ratas inmunizadas con CRISP1 presen-taban anticuerpos específicos contra la proteína, yuna inhibición significativa de la fertilidad en ambossexos (8).



CRISP1 recibe este nombre por haber sido el pri-mer miembro descripto de la familia de proteínasdenominadas CRISP (Proteínas Secretorias Ricas enCisteínas), las cuales poseen un total de 16 cisteínas, 10de las cuales se localizan en el extremo C-terminal dela molécula. Resultados de nuestro laboratorio indicanque, al igual que CRISP1 de rata, las proteínas homó-logas de ratón y humano también participan en el pro-ceso de fusión de gametas a través de sitios de uniónen la superficie de los respectivos ovocitos (9)(10).Posteriores estudios de nuestro grupo revelaron que,además de su rol en el proceso de fusión de gametas,CRISP1 también participaría en la etapa previa de inte-racción espermatozoide-zona pellucida (ZP) a travésde su interacción con sitios complementarios presen-tes en la ZP (11).

Mientras se ha encontrado que el dominio C-ter-minal de varias proteínas CRISP presenta la capaci-dad de regular canales iónicos (12), resultados denuestro laboratorio indican que el dominio N-termi-nal contendría el sitio por el cual CRISP1 se une a lamembrana plasmática del ovocito (13). Más aún,hemos encontrado que dicha actividad reside en unaregión de sólo 12 aminoácidos que corresponde auna secuencia consenso compartida por todas las pro-teínas CRISP, denominada Signature 2 (13). Por suparte, nuestras observaciones indican que la capaci-dad de CRISP1 de interactuar con la ZP no residiríaen una región específica de la molécula sino quedependería de su conformación (11). En conjunto,no sólo habría dos poblaciones de CRISP1 sobre elespermatozoide sino también dos dominios en lamolécula con dos actividades diferentes. Mientras lacapacidad de unirse al ovocito se encontraría asocia-da a la proteína fuertemente unida y residiría en eldominio N-terminal, la proteína débilmente unida alespermatozoide cumpliría un rol en el proceso decapacitación regulando canales iónicos a través deldominio C-terminal. Recientes resultados de nuestrogrupo indican que la población de CRISP1 débil-mente unida al espermatozoide, se asociaría a travésde la formación de un complejo entre la proteína y elzinc (14), mientras que la población fuertementeunida, lo haría a través de los epididimosomas pre-sentes en el fluido epididimario (resultados no publi-cados).

Con el fin de confirmar la importancia de CRISP1para la fertilización, nuestro laboratorio generó ani-males knockout (KO) para la proteína CRISP1 estu-diando posteriormente su fenotipo. Los estudiosindicaron que, si bien los animales KO eran fértiles,los espermatozoides presentaban una marcada dismi-nución en el nivel de fosforilación de proteínas entirosina, evento clave dentro del proceso de capacita-ción de los espermatozoides como así también exhi-bían una disminución significativa en su capacidad de

interactuar con la ZP y fusionarse con el oolema, con-sistente con los roles propuestos para CRISP1 en elproceso de fertilización (15). Asimismo, la exposiciónde ovocitos a espermatozoides KO en presencia dediversas proteínas CRISP disponibles en el laborato-rio indicó que, además de CRISP1, otras proteínashomólogas estarían cooperando con CRISP1 paragarantizar el éxito de la fertilización. En base a resul-tados de nuestro grupo indicando que la proteína tes-ticular CRISP2, altamente homóloga a CRISP1, tam-bién participa en el proceso de fusión (16), CRISP2sería la candidata más probable a compensar la faltade CRISP1 en el animal KO.

En conjunto, nuestros resultados apoyan la idea dediferentes roles para una misma proteína CRISP, y laparticipación de diferentes proteínas CRISP en unmismo evento reproductivo (Figura 1). Dado que losespermatozoides son células inactivas a nivel trans-cripcional, es probable que esta redundancia funcio-nal exista en el espermatozoide como un mecanismopara garantizar el éxito de un evento esencial comolo es la fertilización.


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Figura 1. Representación esquemática de las funciones de las pro-teínas CRISP en fertilización: La proteína epididimaria CRISP1cumpliría funciones a nivel de A: la regulación de la fosforilaciónde proteínas en tirosina durante la capacitación, B: la unión delespermatozoide a la zona pellucida (ZP) y C: la fusión de gametas,mientras que la proteína testicular CRISP2 cooperaría con CRISP1en el evento de fusión (D).

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LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR

Y MOLECULAR DE LA REPRODUCCIÓN

Mecanismos moleculares relacionados con laexocitosis acrosomal en espermatozoides demamíferos

Molecular mechanisms associated with mam-malian sperm acrosomal exocytosis

Mecanismos moleculares relacionados com aexocitose acrossomal em espermatozoides demamíferos

Mariano G. Buffone, Ana Romarowski, Florenza A. La Spina.

Resumen

Los espermatozoides de mamífero adquieren capacidad fe-cundante durante su paso por el tracto femenino en un pro-ceso denominado ¨capacitación¨ espermática. Durante esteproceso, el espermatozoide adquiere la capacidad de rea-lizar la ¨exocitosis acrosomal¨ que permite penetrar la zonapellucida (matriz extracelular que rodea al ovocito). En elproceso de exocitosis acrosomal, la membrana acrosomalexterna y la membrana plasmática se fusionan en múltiplespuntos, produciéndose la liberación y dispersión del con-tenido acrosomal. Esta exocitosis es un tipo particular desecreción regulada, que comparte mucho de los mismosmecanismos básicos que se han descrito en otras célulassecretoras, como neuronas o células del sistema endocrino.Durante la capacitación, se ha observado que el esperma-tozoide atraviesa estadios intermedios de exocitosis acro-somal con una exposición gradual de componentes intra-acrosomales. Este fenómeno se da coincidentemente conuna estabilización de las estructuras involucradas, de ma-nera tal que la exocitosis se produzca sólo en respuesta alestímulo adecuado. A pesar de que se han descripto nu-merosos cambios bioquímicos asociados al proceso de ca-pacitación y exocitosis, la pregunta que aún no ha podidoser contestada es: ¿cuáles son los cambios bioquímicosesenciales que transforman un espermatozoide sin capa-cidad de realizar exocitosis acrosomal ante un estímulo fi-siológico (no capacitados) en una célula capaz de hacerlo(capacitados)? Asimismo, durante la capacitación se pro-duce una polimerización de la actina globular (G) en fila-mentosa (F) en la cabeza del espermatozoide, sitio dondeademás, han sido identificados numeroso componentes re-lacionados con el citoesqueleto de actina. El citoesqueletode actina actúa como un modulador de la exocitosis en di-versos sistemas celulares. Nuestros resultados prelimina-res indican que la polimerización de la actina es necesa-ria para que los espermatozoides puedan formar los



estadios intermedios de exocitosis y eventualmente, reac-cionar ante el estímulo adecuado.

Palabras clave: espermatozoide * exocitosis acrosomal *

citoesqueleto de actina

Summary

Mammalian sperm must undergo a process termed capaci-tation in order to become competent to fertilize an egg. Ca-pacitation renders the sperm competent by priming thecells to undergo an exocytotic event called acrosomal exo-cytosis that is stimulated by the zona pellucida (ZP) of theegg. During exocytosis, the outer acrosomal membrane(OAM) and the plasma membrane (PM) fuse, resulting in therelease of the acrosomal components. Although many aspectsof acrosomal exocytosis are similar to exocytosis in other celltypes, there are also some major differences. As incubationunder capacitating conditions proceeds, sperm progressesthrough intermediate stages of acrosomal exocytosis thatlead to the incremental exposure and eventual release of se-lected acrosomal components. The formation of these inter-mediate stages is coincidental with stabilization of a primedevent (membrane docking/fusion) so that the exocytosis is re-stricted to and occurs only in response to a specific stimulus(ZP). Over many years, several biochemical events have beenassociated with the capacitation process; however, the ques-tion that has remained unanswered in investigations of ca-pacitation is: what is the underlying reaction or set of reac-tions that transform the sperm cell from a state unresponsiveto ZP-stimulated acrosomal exocytosis to the state primed torespond to these stimuli? During the course of capacitation,sperm intracellular globular (G)-actin is polymerized to fila-mentous (F)-actin. In other systems, the cortical actin networkacts as a dominant negative clamp which blocks constitutiveexocytosis. Preliminary results suggest that actin polimeriza-tion is essential for acrosomal exocitosis to occur.

Key words: spermatozoon * acrosomal exocytosis * actin cy-

toskeleton

Resumo

Os espermatozoides de mamífero adquirem capacidadefecundante durante sua passagem pelo trato feminino numprocesso denominado ¨capacitação¨ espermática. Duranteeste processo, o espermatozoide adquire a capacidade derealizar a ¨exocitose acrossomal¨ que permite penetrar azona pelúcida (matriz extracelular que rodeia o ovócito). Noprocesso de exocitose acrossomal, a membrana acrossomalexterna e a membrana plasmática se fundem em múltiplospontos, produzindo-se a liberação e dispersão do conteúdoacrossomal. Esta exocitose é um tipo particular de secre-ção regulada, que muito compartilha dos mesmos meca-nismos básicos que se têm descrito em outras células se-cretoras, como neurônios ou células do sistema endócrino.Durante a capacitação, foi observado que o espermatozoideatravessa estádios intermediários de exocitose acrossomalcom uma exposição gradual de componentes intra-acros-somais. Este fenômeno se dá em coincidência com uma es-

tabilização das estruturas envolvidas de maneira tal que aexocitose seja produzida só em resposta ao estímulo ade-quado. Apesar de que foram descritas numerosas alteraçõesbioquímicas associadas ao processo de capacitação e exo-citose, a pergunta que ainda não pôde ser respondida é:quais são as alterações bioquímicas essenciais que trans-formam um espermatozoide sem capacidade de realizarexocitose acrossomal diante de um estímulo fisiológico (nãocapacitados) numa célula capaz de fazê-lo (capacitados)?Do mesmo modo, durante a capacitação se produz uma po-limerização da actina globular (G) em filamentosa (F) na ca-beça do espermatozoide, lugar onde também, têm sidoidentificados numerosos componentes relacionados com ocitoesqueleto de actina. O citoesqueleto de actina agecomo um modulador da exocitose em diversos sistemas ce-lulares. Nossos resultados preliminares indicam que a po-limerização da actina é necessária para que os esperma-tozoides possam formar os estádios intermediários deexocitose e eventualmente, reagir diante do estímulo ade-quado.

Palavras chave: espermatozoide * exocitose acrossomal * ci-

toesqueleto de actina

Exocitosis acrosomal

Los espermatozoides de mamíferos adquieren capa-cidad fecundante durante su paso por el tracto feme-nino en un proceso denominado capacitación esper-mática (1). Este proceso puede también ocurrir in vitroen medios definidos que emulan la composición delfluído oviductal. Varios eventos han sido asociados alproceso de capacitación, entre los que se encuentran loscambios en el patrón de movimiento (hiperactividad),cambios en la localización de proteínas, incremento enla fluidez de membrana y en la permeabilidad a ciertosiones como calcio y bicarbonato, fosforilación de pro-teínas, principalmente en tirosina, y polimerización dela actina G a F en la cabeza del espermatozoide (2).

Mediante la capacitación, el espermatozoide ad-quiere la competencia para realizar la exocitosis acro-somal que le permite penetrar la zona pelúcida, matrizextracelular que rodea al ovocito, en donde la mem-brana acrosomal externa (MAE) y la membrana plas-mática (MP) se fusionan en múltiples puntos produ-ciéndose la liberación y dispersión del contenidoacrosomal. Este mecanismo de exocitosis es un tipo par-ticular de secreción regulada que comparte caracte-rísticas similares con mecanismos básicos descriptosen otras células secretoras, como neuronas o células delsistema endócrino. Las diferencias esenciales son: 1) elacrosoma es una vesícula secretoria única; 2) se formanmúltiples puntos de fusión entre la membrana acroso-mal externa (MAE) y la plasmática (MP); 3) esta fusiónforma vesículas híbridas que son liberadas al medio cir-cundante durante la exocitosis; 4) no existe reciclado


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de las membranas luego de la exocitosis acrosomal,siendo éste un proceso irreversible.

ESTADÍOS INTERMEDIOS DE EXOCITOSISACROSOMALDurante la capacitación, el espermatozoide atraviesa

estadíos intermedios de exocitosis acrosomal con unaexposición gradual de componentes intra-acrosomales.Estudios realizados mediante microscopía electrónicade transmisión sobre espermatozoides humanos en pro-ceso de exocitosis acrosomal revelaron seis estadios in-termedios (3). Más recientemente, Zanetti y Mayorga(4) han mostrado cambios morfológicos graduales enla formación de vesículas híbridas previo a la exocitosiscompleta, con un hinchamiento del acrosoma durantela capacitación que disminuye la distancia entre las dosmembranas y que, posiblemente, facilite el anclaje o for-mación de los poros de fusión.

En especies como ratón y cobayo, se han descriptocuatro estadíos intermedios que representan sucesivospasos hacia una exocitosis completa (5). Utilizando ra-tones transgénicos que expresan en forma soluble laproteína fluorescente verde (GFP) en sus acrosomascomo herramienta para evaluar la integridad acrosomal,Kim y Gerton (5) han demostrado mediante el uso deesferas conjugadas con anticuerpos anti-sp56 (prote-ína de la matriz acrosomal) la relación temporal entrecuatro estadíos intermedios de exocitosis. Los esper-matozoides comienzan con proteína GFP en sus acro-somas y sin unir esferas con el anticuerpo anti-sp56.Luego, atraviesan dos estadíos intermedios en los cua-les comienzan a mostrar unión a las esferas demos-trando la exposición de la proteína sin perdida del con-tenido acrosomal para, posteriormente, perder laproteína GFP y seguir mostrando unión a las esferas, yaque la matriz acrosomal continúa asociada a la cabezadel espermatozoide por un cierto tiempo luego de re-alizada la exocitosis acrosomal. Finalmente, todos los es-permatozoides pierden la asociación con las esferasanti-sp56 debido a la completa liberación de la matrizacrosomal.

Consistente con la idea de que existen estadíos in-termedios de exocitosis, reportes previos han definidocuatro patrones de tinción con el colorante clortetra-ciclina (6). Los espermatozoides no capacitados po-seen el patrón “N”, los capacitados sin reaccionar el pa-trón “B”, los capacitados en vías de sufrir exocitosisacrosomal el patrón “S” y los reaccionados el patrón“AR”. Los patrones B y S representan estadíos interme-dios de exocitosis y los espermatozoides pueden seratrapados químicamente en estos estadíos mediante eluso de diferentes sustancias. Estudios electromicroscó-picos del estadío “S” revelaron que las membranas MAEy MP comienzan a unirse.

El espermatozoide capacitado podría formar pe-queñas regiones de fusión que llevan a una creciente ex-

posición y eventual liberación de los componentes acro-somales. Dos modelos celulares para estudiar este fe-nómeno son las células lactotropas de la glándula pi-tuitaria de rata y las células secretoras de insulina INS-I.Ambas células forman poros estables de fusión que per-sisten por períodos prolongados de tiempo. En estosdos modelos hay un retraso entre la apertura del porode fusión y la liberación de los contenidos vesiculares(7). En espermatozoides de mamíferos existen eviden-cias que apoyarían este concepto como son los estudiosde Flaherty y Olson (8). Estos autores preincubaron es-permatozoides de cobayo en un medio libre de calcioy en presencia de lisolecitina. Luego, agregaron calciopara estimular la exocitosis acrosomal de manera sin-cronizada. Utilizando microscopía electrónica, obser-varon que la fusión entre la MAE y la MP no ocurría enel segmento apical del acrosoma y sí en las zonas peri-féricas.

La formación de estadíos intermedios durante la ca-pacitación podría representar el anclaje de la mem-brana acrosomal externa con la membrana plasmática,que es necesario para que se lleve a cabo el proceso defusión de membranas de la exocitosis acrosomal. Esteproceso de formación de estadíos intermedios se daconjuntamente con una estabilización de estas estruc-turas por mecanismos aún no conocidos, de manera talque la exocitosis se produzca sólo en respuesta al estí-mulo adecuado.

CITOESQUELETO DE ACTINA ENESPERMATOZOIDES Y SU RELACIÓN CON LAEXOCITOSIS

En otros sistemas celulares, se ha demostrado que elcitoesqueleto de actina actúa como una barrera que blo-quea la exocitosis constitutiva. Mediante el uso de un sis-tema de imágenes con excitación por dos fotones, se haobservado que los gránulos de fusión de células acina-res del páncreas son rápidamente recubiertos de actina-F. Esta malla de actina-F disminuye la tasa de fusión sinafectar el proceso fisiológico global de exocitosis, esta-bilizando las estructuras participantes en la fusión.

En espermatozoides de mamíferos, la actina se en-cuentra presente en su forma monomérica (actina-G)y polimerizada o filamentosa (actina-F). La actina hasido identificada en el espacio acrosomal, la regiónecuatorial y postacrosomal así como también en la coladel espermatozoide (8). Durante la capacitación se pro-duce una polimerización de la actina globular (G) en fi-lamentosa (F) en la cabeza del espermatozoide (2).Este fenómeno, sumado a la presencia de numerosasproteínas relacionadas con actina en el espermatozoide,sugeriría que el citoesqueleto de actina participa acti-vamente en la función espermática.

Usando membranas aisladas de espermatozoides,Spungin y colaboradores (9) demostraron que la in-



ducción de la exocitosis acrosomal en espermatozoidescapacitados de ratón, produce una rápida desapariciónde la actina-F. Esta despolimerización sería promovidapor el marcado aumento de calcio que se produce du-rante la exocitosis acrosomal. La inhibición de la poli-merización de actina que ocurre durante la capacitacióninhibe la exocitosis acrosomal. Estos resultados sugeri-rían que la polimerización de actina es necesaria paraque la exocitosis ocurra, y que una vez que la actina hasido polimerizada a la forma F, debe ocurrir una rápidadespolimerización para que la exocitosis pueda ocurrir.

Si bien otros han demostrado el rol de las proteínasSNAREs y la synaptotagmina en los estadíos finales defusión de las dos membranas (10), aún no se conoce elmecanismo que explique el movimiento o acercamientode las membranas que precede a la formación de lospuntos de fusión. El citoesqueleto de actina juega un pa-pel importante en la exocitosis de diversos tipos celu-lares, y se piensa que el mismo es importante para po-sicionar las membranas de los gránulos secretorios enproximidad con la membrana plasmática, pero que enun estadío posterior, los filamentos de actina deben di-sociarse para permitir el contacto entre las dos mem-branas. Esta polimerización de la actina durante la ca-pacitación espermática podría estar participando eneste acercamiento de las membranas intervinientes enla fusión, para que los demás eventos moleculares pue-dan llevarse a cabo.


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LABORATORIO DE QUÍMICA DE PROTEOGLICANOS Y MATRIZ EXTRACELULAR

El papel de los glicosaminoglicanos en elproceso de descondensación cromatínicadel espermatozoide humano

Role of glycosaminoglycans in spermchromatin decondensation in humans.

O papel dos glicosaminoglicanos noprocesso de descondensação cromatínicado espermatozoide humano

Marina Romanato, Vanina Julianelli, Bárbara Farrando, Lucrecia Calvo, Juan Carlos Calvo

Resumen

En el núcleo del espermatozoide, la cromatina se encuentrade 6 a 8 veces más condensada que en los núcleos de lascélulas somáticas. Esta condensación es el resultado del in-tercambio de histonas por protaminas durante el proceso deformación de los espermatozoides, otorgando al material ge-nético una resistencia única al ataque por especies reacti-vas de oxígeno como también al estrés que significa el tra-yecto hasta su encuentro con el ovocito en el oviducto. Estacondensación tan alta debe ser relajada, una vez producidala fecundación del ovocito, para permitir la formación delpronúcleo masculino y la posterior singamia. Para que ocu-rra la descondensación es necesaria la reducción de los


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puentes disulfuro de las protaminas, reacción que lleva acabo el glutatión y, además, la remoción de las protaminascon intercambio posterior o concomitante por las histonasovocitarias. En este punto, todavía no hay consenso sobre lamolécula involucrada. En nuestro laboratorio postulamosque sería el heparán sulfato, basados en análisis de des-condensación in vitro, en las características estructurales dela molécula y en su presencia en el ovocito murino, con evi-dencias preliminares de su presencia también en el ovocitohumano (datos no mostrados).

Palabras clave: glicosaminoglicanos * cromatina * descon-

densación * espermatozoides * heparán sulfato

Summary

In the sperm nucleus, chromatin is 6 to 8 times more con-densed than in the nuclei of somatic cells. This high con-densation is the result of the exchange between histones andprotamines during the process of spermatogenesis, and pro-vides the genetic material with unique resistance to the at-tack of reactive oxygen species, as well as to the stress of thevoyage towards the encounter with the oocyte in the oviduct.This high condensation must be relaxed, once the fertiliza-tion of the oocyte has taken place, in order to allow for theformation of male pronucleus and subsequent syngamy. Forthe decondensation to occur, it is necessary to reduce thedisulfide bonds in the protamines, reaction that takes placewith the assistance of glutathione, and also to remove the pro-tamines with the subsequent or concomitant exchange withoocyte histones. At this point, there is no consensus regard-ing the molecule involved in this process. In these studies,it has been postulated that this molecule is heparan sulfate,based on in vitro decondensation studies, on the structuralcharacteristics of the molecule and the fact that it is presentin the murine oocyte, with preliminary evidence of its pres-ence also in the human oocyte (data not shown).

Key words: glycosaminoglycans * chromatin * decondensa-

tion * spermatozoa * heparan sulfate

Resumo

No núcleo do espermatozoide, a cromatina se encontra de6 a 8 vezes mais condensada que nos núcleos das célulassomáticas. Esta condensação é o resultado da troca de his-tonas por protaminas durante o processo de formação dos es-permatozoides, outorgando ao material genético uma resis-tência única ao ataque por espécies reativas de oxigênio bemcomo ao estresse que significa o trajeto até seu encontro como ovócito no oviduto. Esta condensação tão alta deve ser re-laxada, assim que é produzida a fecundação do ovócito, parapermitir a formação do pronúcleo masculino e a posterior sin-gamia. Para que ocorra a descondensação é necessária a re-dução das pontes dissulfeto das protaminas, reação que levaa cabo o glutation e, também, a remoção das protaminas comtroca posterior ou concomitante pelas histonas oocitárias.Neste ponto, ainda não há consenso sobre a molécula en-volvida. No nosso laboratório postulamos que seria o heparansulfato, baseados em análises de descondensação in vitro, nas

características estruturais da molécula e em sua presença noovócito murino, com evidências preliminares de sua presençatambém no ovócito humano (dados não mostrados).

Palavras chave: glicosaminoglicanos * cromatina * descon-

densação * espermatozoides * heparan sulfato

Introducción

La función de la gameta masculina en el proceso defertilización no culmina con la penetración al ooplasma,sino que requiere además la fusión de su material ge-nético con el material genético del ovocito. Para lo-grarlo, el núcleo del espermatozoide, una vez ingresadoal ovocito, sufre una serie de cambios ultraestructuralesque culminan con la formación del pronúcleo mascu-lino. Es conocido el alto grado de condensación de lacromatina espermática, comparado con el de las célu-las somáticas, y el impacto que la misma tiene en la pro-tección del material genético de las especies reactivas deoxígeno, como también de los daños físicos durante eltránsito hacia el encuentro con el ovocito en las trompas.Con el objetivo de explicar las fallas de fertilización ob-servadas en procedimientos de reproducción asistida,surgió en la última década, el interés por estudiar másdetalladamente el núcleo del espermatozoide, el procesode descondensación nuclear y los factores espermáticosy ovocitarios involucrados en dicho proceso. Esto es par-ticularmente cierto con el advenimiento del ICSI, puesya no interesa si el espermatozoide puede interactuar efi-cazmente con el cúmulus, la zona pelúcida o el oolemay cobran especial importancia todos los procesos queocurren una vez que el espermatozoide se encuentradentro del ooplasma.

ORGANIZACIÓN CROMATÍNICA DEL NÚCLEOESPERMÁTICO

El núcleo del espermatozoide presenta una organi-zación muy particular de la cromatina, diferente de lade las células somáticas (1)(2). La cromatina espermá-tica se encuentra altamente condensada debido a quedurante la espermatogénesis testicular, la mayor partede las histonas es reemplazada por proteínas transicio-nales y luego por protaminas. Estas son proteínas máspequeñas (50-60 aminoácidos), más básicas que las his-tonas y con un alto contenido de residuos de cisteína yarginina que neutralizan muy eficazmente las cargas delADN y permiten su mayor compactación. El complejoaltamente condensado de protamina – ADN es estabi-lizado por uniones disulfuro intra e intermolecularesentre los residuos de cisteína de las protaminas, confi-riendo al núcleo espermático de una extraordinaria es-tabilidad mecánica y química. De esta forma se impe-diría la descondensación prematura de la cromatinadurante el tránsito del espermatozoide por el tracto ge-



nital masculino y el femenino, antes de incorporarse de-finitivamente al ooplasma, y además se protegería alADN espermático de la acción de agentes mutagénicos.

Se han descripto dos grupos de protaminas, P1 y P2.Las P1 están presentes en los espermatozoides de todaslas especies y tienen un alto contenido de cisteína y ar-ginina, mientras que las P2 que están presentes en al-gunas especies (incluyendo el humano), contienen his-tidina además de cisteína y arginina y pueden unir Zn2+.

La importancia de una adecuada interacción prota-mina /ADN espermático en el proceso de fertilizaciónha quedado confirmada por la observación que ratonesknockout para P1 o P2 son infértiles (3). En el hombre,se ha documentado la presencia de una relación P1/P2alterada o incluso la ausencia de P2 en individuos in-fértiles (4)(5). Por otra parte, el eyaculado común-mente contiene cantidades variables de espermatozoi-des que no han reemplazado la mayoría de sus histonaso proteínas transicionales por protaminas (6-8), cuyosnúcleos se conocen generalmente como núcleos inma-duros (9), observándose que el eyaculado de hombresinfértiles contiene una mayor proporción de los mismosque el de hombres fértiles (10)(11).

LA DESCONDENSACIÓN DEL NÚCLEOESPERMÁTICO

El núcleo del espermatozoide se descondensa rápi-damente luego de su penetración en el ovocito (12). Lareducción de los puentes disulfuro, por el glutatión(GSH) presente en el ovoplasma, sería el primer pasode la descondensación del núcleo espermático en elovocito. Esta reducción es necesaria pero no suficientepara que se produzca la descondensación nuclear. Se hapropuesto la participación de una macromolécula confuerte carga negativa que pueda competir con el ADNpor las protaminas, y actuar como aceptora de las mis-mas, posibilitando así el reemplazo de las protaminas es-permáticas por histonas ovocitarias.

La descondensación de la cromatina del espermato-zoide humano in vitro puede inducirse utilizando he-parina y GSH (13)(14). No existe duda de la participa-ción del GSH como tiorreductor en este proceso, peroel papel de la heparina es aún motivo de controversia,proponiéndose una interacción de tipo ligando-recep-tor (15-18) o un efecto directo sobre la cromatina delespermatozoide, ya que se ha demostrado que la hepa-rina posee una fuerte afinidad por las protaminas y escapaz de combinarse con éstas formando un complejoinsoluble (19). Sin embargo, ninguna de las evidenciasexistentes es directa y contundente. Unos de los puntosa considerar es que no se ha encontrado heparina en elcomplejo cumulus-ovocito y que la única célula capaz desintetizar heparina in vivo es el mastocito. Sin embargo,existen en la literatura numerosas evidencias de la pre-sencia de otros glicosaminoglicanos (GAGs) en el com-

plejo cumulus – oocito en distintas especies (20-23). En-tre ellos, el heparán sulfato (HS) es un análogo estruc-tural de la heparina que posee en muchos sistemas bio-lógicos acciones equivalentes a la misma (24-27). Lasevidencias experimentales acumuladas en nuestro la-boratorio en los últimos años, nos han llevado a plan-tear la hipótesis de que el HS efectivamente podría ac-tuar como aceptor de protaminas durante ladescondensación cromatínica del espermatozoide hu-mano in vivo (14)(28).

EL HEPARÁN SULFATO COMO ACEPTOR DEPROTAMINAS

En nuestro laboratorio, estudiamos desde hace variosaños, la descondensación nuclear del espermatozoidehumano in vitro, a fin de dilucidar el papel de la hepa-rina en este proceso. Utilizando muestras de semen dedonantes normospérmicos de acuerdo con los crite-rios establecidos por la Organización Mundial de la Sa-lud (29) y mediante un ensayo de descondensaciónnuclear originariamente descrito por Reyes et al. (13) yluego modificado en nuestro laboratorio (14), se evaluóla capacidad descondensante de distintas heparinas yotros GAGs sobre espermatozoides humanos capacita-dos y sobre núcleos aislados a partir de dichos esper-matozoides. El comportamiento de los núcleos aislados,situación que se asemeja más a lo que ocurre in vivo de-bido a que el núcleo se encuentra desnudo dentro delooplasma antes de descondensarse, fue, en todos los ca-sos, semejante al de los espermatozoides enteros.

La actividad descondensante de la heparina se viofuertemente afectada por la sulfatación de la molécula,y los resultados sugirieron que se trata no sólo de unefecto de carga neta sino que también es importante laposición de las cargas en la molécula (14)(28). Tambiénevaluamos el efecto del tamaño de la molécula de he-parina sobre su capacidad descondensante, encon-trándose que la actividad descondensante de la hepa-rina era independiente de su peso molecular, por lomenos dentro del rango de pesos moleculares estu-diado (3000-18800 Da) (14)(28)).

Una vez demostrado que la actividad desconden-sante de la heparina in vitro está relacionada con ca-racterísticas estructurales de la molécula, evaluamos laactividad descondensante de otros GAGs presentes enel complejo cumulus-ovocito con el fin de encontrar al-gún equivalente a la heparina in vivo. Sólo el HS, aná-logo estructural de la heparina, mostró actividad des-condensante in vitro, mientras que el ácido hialurónico,el condroitín sulfato y el dermatán sulfato fueron inac-tivos (14)(28). Más aún, la actividad descondensante dela heparina y del heparán sulfato fueron similares, a pe-sar del hecho que el heparán sulfato se encuentra le-vemente menos sulfatado que la heparina, y posee me-nor carga negativa neta.


IBYME 633

El conjunto de estos resultados nos llevó a proponerque el HS, presente en el complejo cumulus-oocito yademás análogo estructural de la heparina (25)(30)(31),podría estar funcionando como aceptor de protaminasen el proceso de descondensación del núcleo espermá-tico humano in vivo. Recientemente (32) encontramosque el heparán sulfato se encuentra presente en el cito-plasma del ovocito murino, siendo este un punto clavepara nuestros estudios presentes y futuros. Mientrastanto, el papel del heparán sulfato en la descondensa-ción nuclear in vivo es una hipótesis factible.


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LABORATORIO

DE INMUNOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN

Caracterización del endometrio y delambiente peritoneal de mujeres quepadecen endometriosis. Estudios in vivo ein vitro de nuevas alternativas terapéuticaspara esta enfermedad

Characterization of endometrial andperitoneal environment of women withendometriosis. In vivo and in vitro studiesof new therapeutic alternatives for thisdisease

Caracterização do endométrio e doambiente peritoneal de mulheres quepadecem endometriose. Estudos in vivo e in vitro de novas alternativas terapêuticaspara esta doença

Gabriela Meresman, Mariela Bilotas, Carla Olivares,Analía Ricci, Juan Ignacio Bastón, Rosa Inés Barañao

Resumen

El tema de estudio de nuestro laboratorio es la endometrio-sis, patología benigna que afecta alrededor de un 15% delas mujeres en edad reproductiva y que se caracteriza por lapresencia de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina,provocando fuertes dolores pélvicos, metrorragia y, en un50% de los casos, infertilidad. Hemos realizado investiga-ciones básicas sobre el ambiente peritoneal de las mujeres

con endometriosis y analizamos las características del tejidoendometrial de estas pacientes. En la actualidad continua-mos con nuestros estudios tendientes a esclarecer no sólo laposible etiología de la endometriosis sino también a mejo-rar su tratamiento. Nuestros estudios tienen como objetivola evaluación del efecto in vitro e in vivo de nuevos meca-nismos para tratar esta patología en la búsqueda de nuevasalternativas terapéuticas que ofrezcan tratamientos mássimples, con medicamentos que actúen en forma más directasobre los implantes, que inhiban los mecanismos involu-crados en el desarrollo de la enfermedad, y que potencial-mente sean más eficaces en su acción de erradicar las le-siones endometriósicas. Además, comenzamos a evaluar losposibles mecanismos involucrados en la tolerancia inmuno-lógica hacia los implantes de tejido endometrial ectópico quese produciría durante el establecimiento de la endometriosis.

Palabras clave: macrófagos * citoquinas * tratamiento * fac-

tor de crecimiento del endotelio vascular * ciclooxigenasa

2 * aromatasa P450

Summary

The subject matter of our laboratory is endometriosis, a be-nign disease that affects around 15% of women of repro-ductive age, characterized by the presence of endometrial tis-sue outside the uterine cavity, causing severe pelvic pain,metrorrhagia, and infertility in 50% of the cases. Basic re-search on the peritoneal environment of women with en-dometriosis has been conducted and the characteristics ofthese patients’ endometrial tissue was analyzed. Currently,studies to clarify the etiology of the endometriosis but alsoto improve its treatment still continue. Said studies aim toassess the in vitro and in vivo effects of new mechanisms totreat the condition in the search for new therapeutic alter-natives that provide simple treatments with drugs that actmore directly on the implants, that inhibit the mechanismsinvolved in the development of the disease, and which arepotentially more effective in their efforts to eradicate en-dometriotic lesions. Furthermore, the likely mechanisms in-volved in the immunological tolerance to ectopic endometrialtissue implants that would occur during the establishmentof endometriosis started to be assessed.

Key words: macrophages * cytokines * treatment * vascular

endotellium growth factor * ciclooxygenase 2 * aromatase

P450

Resumo

O tema de estudo de nosso laboratório é a endometriose, pa-tologia benigna que afeta aproximadamente 15% das mu-lheres em idade reprodutiva e que se caracteriza pela pre-sença de tecido endometrial fora da cavidade uterina,provocando fortes dores pélvicas, metrorragia e, em 50% doscasos, infertilidade. Temos realizado pesquisas básicas so-bre o ambiente peritoneal das mulheres com endometriosee analisamos as características do tecido endometrial des-tas pacientes. Na atualidade continuamos com nossos es-tudos tendentes a esclarecer não apenas a possível etiologiada endometriose, mas também a melhorar seu tratamento.


IBYME 635

Nossos estudos têm como objetivo a avaliação do efeito invitro e in vivo de novos mecanismos para tratar esta patolo-gia na busca de novas alternativas terapêuticas que ofereçamtratamentos mais simples, com medicamentos que atuem emforma mais direta sobre os implantes, que inibam os meca-nismos envolvidos no desenvolvimento da doença, e que po-tencialmente sejam mais eficazes em sua ação de erradicaras lesões endometrióticas. Também começamos a avaliar ospossíveis mecanismos envolvidos na tolerância imunológicapara os implantes de tecido endometrial ectópico que se pro-duziria durante o estabelecimento da endometriose.

Palavras chave: macrófagos * citocinas * tratamento * fator

de crescimento do endotélio vascular * ciclooxigenase 2 * aro-

matase P450

El principal tema de investigación de nuestro labo-ratorio es la endometriosis. Esta patología se caracterizapor la presencia de tejido endometrial fuera de la cavi-dad uterina formando quistes y/o lesiones ectópicasprincipalmente en el peritoneo pélvico y ovarios. Es unade las enfermedades ginecológicas benignas más fre-cuentes en mujeres de edad reproductiva y su etiologíaaún se mantiene sin elucidar.

En un intento de esclarecer la posible causa de estaenfermedad comenzamos nuestros estudios evaluandoel ambiente peritoneal. Como resultado de estas eva-luaciones concluimos que el ambiente peritoneal de laspacientes con endometriosis presenta alteraciones tantoen los niveles de citoquinas, estradiol (E2), progesterona(P4) y prostaglandina E2 (PGE2) y en el número y fun-cionalidad de macrófagos. Este ambiente peritoneal al-terado facilitaría la implantación y crecimiento del te-jido endometriósico fuera del útero (1)(2). Ademásobservamos que mientras el líquido peritoneal de las pa-cientes con endometriosis mínima producía un efectomitogénico sobre la proliferación celular en cultivos deendometrio normal, el líquido peritoneal de pacientescon endometriosis avanzada o severa producía un efectoinhibitorio de dicha proliferación (3)

A continuación evaluamos el tejido endometrial eu-tópico de estas pacientes y nuestros resultados demos-traron que el mismo era menos susceptible a morirapoptosis y que además poseía una proliferación celu-lar aumentada, hechos que lo predispondría a crecer enun sitio ectópico (4).

Posteriormente observamos que, en mujeres con en-dometriosis, el tratamiento con anticonceptivos oralescombinados o bien con progestágenos solos como el de-sogestrel, producía una disminución de la prolifera-ción celular y un aumento de la apoptosis del tejido en-dometrial eutópico (5).

Puesto que dentro de los tratamientos comúnmenteempleados para esta patología se destacan los agonistasy antagonistas de GnRH, decidimos evaluar el efecto invitro de ambos análogos de GnRH en cultivos de célulasde epitelio endometrial y observamos que los agonistas

de GnRH estimulaban la apoptosis e inhibían la proli-feración celular endometrial (6). Empleando el mismomodelo evaluamos también el efecto de los análogos deGnRH sobre la producción de interleuquina 1 β (IL-1β)y el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF),como factores pro-mitogénicos, en relación con la apop-tosis de las células endometriales en cultivo (7). Asi-mismo observamos que existiría una regulación de la ex-presión de proteínas pro y anti-apoptóticas por parte delos agonistas y antagonistas de GnRH (8).

Además de continuar con nuestros estudios in-vitrosobre cultivos primarios de tejido endometrial hemosdesarrollado un modelo de endometriosis experimen-tal murina que se basa en el transplante autólogo de te-jido endometrial en un sitio ectópico. Este modelo nospermite realizar estudios in-vivo y evaluar el efecto deposibles tratamientos médicos.

El tejido endometrial expresa aromatasa P450, esen-cial en la biosíntesis de estrógenos. En nuestro labora-torio hemos observado que existe expresión de la en-zima aromatasa P450 en las lesiones endometriósicasperitoneales rojas y negras y que la expresión de la aro-matasa está significativamente aumentada en el tejidoendometrial eutópico de pacientes con endometriosiscon respecto a las mujeres controles. Por lo tanto, la ac-tividad de esta enzima favorecería la generación de unambiente hiperestrogénico que permitiría mayor desa-rrollo y expansión de la enfermedad. Esto llevó a pen-sar que el uso de inhibidores de la aromatasa podría te-ner un potencial terapéutico en estas pacientes.

En nuestros estudios in vitro observamos que los in-hibidores de aromatasa (Letrozole y Anastrozole) pro-ducen un efecto beneficioso induciendo una significa-tiva disminución de la proliferación celular y unaumento en la apoptosis (9) y en el modelo de endo-metriosis murino, observamos que el tratamiento conestos inhibidores al inicio de la inducción de las lesio-nes no impidió el desarrollo de las mismas pero causóuna disminución significativa de su tamaño, inhibiciónde la proliferación celular y aumento de la apoptosis(10). Estos resultados refuerzan la idea de que la inhi-bición de la aromatasa podría ser una estrategia nove-dosa de tratamiento de la endometriosis.

Tal como hemos observado en nuestros primerosestudios, en las mujeres con endometriosis existe una al-teración del ambiente peritoneal debido al estado in-flamatorio producido por la presencia de los focos detejido endometrial ectópico. Esta inflamación sueleproducir fuertes dolores y en la actualidad uno de lostratamientos anti-inflamatorios empleados en estas pa-cientes es el celecoxib, un inhibidor selectivo de la ac-tividad de la ciclo-oxigenasa 2 (COX-2). Por estos mo-tivos decidimos evaluar el efecto de celecoxib sobre laproliferación celular, la apoptosis, la expresión de COX-2 y los niveles de VEGF y PGE2 en cultivos primarios decélulas epiteliales endometriales. Observamos que el ce-



lecoxib indujo una significativa disminución de la pro-liferación celular y aumento de apoptosis, tanto en loscultivos celulares de pacientes con endometriosis comode controles. De la misma manera, el celecoxib au-mentó significativamente la expresión de COX-2 encultivos de células de epitelio endometrial de pacientescon endometriosis. Además, inhibió significativamentela secreción de VEGF y de PGE2 en células epiteliales en-dometriales de estas pacientes (11).

Por otra parte, es un hecho conocido que en cual-quier tejido u órgano autotransplantado es imprescin-dible una adecuada irrigación sanguínea para que puedasobrevivir. Por este motivo, en los últimos años comenzóa cobrar mayor importancia la posibilidad de la regula-ción de la angiogénesis en endometriosis ya que ésta po-dría ser una nueva opción terapéutica para esta patolo-gía. Uno de los principales factores involucrados en laneovascularización del tejido endometrial ectópico es elVEGF, el cual no sólo sería producido por el mismo te-jido endometrial sino también por los macrófagos peri-toneales. Por otra parte, la secreción de este factor an-giogénico sería estimulada por los esteroides ováricos,particularmente por el aumento de estradiol.

Estos antecedentes nos llevaron a evaluar el efecto dela terapia anti-angiogénica con bevacizumab (un anti-cuerpo monoclonal humanizado, anti VEGF) en el mo-delo de endometriosis murino. Observamos que el tra-tamiento con bevacizumab indujo una disminuciónsignificativa en el volumen promedio de las lesiones de-sarrolladas por ratón así como en los niveles de VEGF dellíquido peritoneal. Sin embargo, no se observaron dife-rencias significativas en el número de lesiones desarro-lladas por ratón. Por otra parte, el bevacizumab indujo unaumento altamente significativo de la apoptosis en las le-siones endometriósicas así como una disminución signi-ficativa de la proliferación celular en estas lesiones. Nues-tros resultados sugieren que si bien el bevacizumab nodisminuiría el número de lesiones endometriósicas de-sarrolladas, reduciría su tamaño, a través de un aumentoen la apoptosis y una inhibición en la proliferación ce-lular. Consistentemente, la acción del anticuerpo se ve re-flejada en una disminución de los niveles de VEGF.

Actualmente estamos evaluando tanto in vivo comoin vitro la acción de dos tratamientos con polifenoles na-turales: el resveratrol (Res), una fitoalexina presente enlas uvas, y el galato de epigalocatequina (EGCG), cate-quina más abundante del té verde. Se ha visto que am-bos polifenoles poseen propiedades antioxidantes, an-tiinflamatorias y anticarcinogénicas. Observamos in vivoque EGCG en las distintas dosis ensayadas disminuyó elnúmero y el tamaño de las lesiones desarrolladas por ra-tón, sin embargo el Res sólo en una concentración de25 mg/kg disminuyó el tamaño de las lesiones. Porotra parte, observamos in vitro que ambos compuestosindujeron una inhibición de la proliferación de las cé-lulas de epitelio endometrial. Nuestros resultados su-

gieren un efecto inhibitorio de Res y EGCG, in vivo e invitro, sobre el crecimiento del tejido endometrial y ava-lan seguir investigando estos compuestos como estra-tegias novedosas para tratar la endometriosis (12).

Finalmente, estamos evaluando una de las posibles víasde escape inmunológico de los implantes endometriósi-cos. Nuestra hipótesis plantea que la expresión de Ga-lectina-1 (Gal-1) en las lesiones endometriósicas facilitala implantación y sobrevida de las células endometrialesen un sitio ectópico. Para ello, en un estudio preliminar,se indujeron lesiones endometriósicas en ratones hem-bras adultos C57BL/6 wild-type y knock-out para Gal-1(Lgals1-/-). Luego de cuatro semanas se contó el númerode lesiones, se midió el tamaño promedio, se analizó suhistopatología y se determinó la proliferación celular enlas mismas. Los resultados muestran una reducción sig-nificativa del tamaño promedio de las lesiones en los ra-tones Lgals1-/-, aunque el número de lesiones no fue di-ferente entre ambos grupos. Asimismo, la tasa deproliferación celular fue significativamente menor enlas lesiones de ratones deficientes de Gal-1. Estos resul-tados sustentan nuestra hipótesis sobre el rol de Gal-1 fa-cilitando el crecimiento y desarrollo de las lesiones en-dometriósicas al promover la proliferación de las célulasendometriales ectópicas que forman la lesión.

En síntesis, nuestro laboratorio apunta a investigarlos mecanismos fisiopatológicos implicados en la etio-logía de la endometriosis y estos conocimientos sus-tentan a su vez, nuestros estudios de nuevas alternativasterapéuticas para tratar esta enfermedad.


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6. Meresman GF, Bilotas M, Buquet RA, Baranao RI, SueldoC, Tesone M. Gonadotropin-releasing hormone agonist in-duces apoptosis and reduces cell proliferation in eutopicendometrial cultures from women with endometriosis. Fer-til Steril 2003; 80 Suppl 2:702-7.

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12. Ricci AG, Olivares CN, Bilotas MA, Singla JJ, MeresmanGF, Barañao RI. Estudio de nuevas terapéuticas natu-rales posibles para el tratamiento de la endometriosis(EDT). Medicina (Bs As ) 2010; 70(Suppl. II): O69.

LABORATORIO

DE FISIOLOGÍA OVÁRICA

Mecanismos fisiológicos y patológicosinvolucrados en la función y angiogénesisovárica

Physiological and pathological mechanismsinvolved in ovarian angiogenesis and funcionMecanismos fisiológicos e patológicosenvolvidos na função e angiogênese ovariana

Marta Tesone, Fernanda Parborell, Griselda Irusta,Dalhia Abramovich, Diana Bas, Fátima Hernandez,Leopoldina Scotti.

Resumen

El desarrollo y regresión del folículo ovárico es un procesocontinuo y cíclico que depende de señales endocrinas, pa-

racrinas, autocrinas y de interacciones célula- célula. El re-clutamiento y selección de folículos lleva a la formación deuno o más folículos preovulatorios, cuyo número varía encada especie. Estos procesos involucran la síntesis de fac-tores locales que producen la selección y maduración de losfolículos dominantes desencadenando la ovulación. Luego dela ovulación, se forma el corpus luteum (CL), que es unaglándula transciente que se forma de las paredes remanen-tes del folículo. Si la preñez o embarazo no ocurre, el CL nosigue produciendo progesterona y regresiona en un procesollamado luteólisis. Aunque todos estos procesos (crecimientoy regresión folicular, desarrollo del CL y luteólisis) requierencambios en la red vascular ovárica, su regulación aún es de-bate de investigación. En este estudio, hemos investigado elpapel del sistema Notch y su ligando DLL4 en la angiogé-nesis y su relevancia en la fisiología ovárica. Estos datos secomplementaron estudiando si cambios en la regulación delos procesos angiogénicos están involucrados en las altera-ciones vasculares observadas en modelos de PCOS (poli-quistosis ovárica) y OHSS (síndrome de hiperestimulaciónovárica) desarrollados en roedores.

Palabras clave: ovario * angiogénesis * poliquistosis ovárica *

síndrome de hiperestimulación ovárica * sistema Notch

Summary

Ovarian follicular development and regression is a continu-ous and cyclic process that depends on a number of en-docrine, paracrine and autocrine signals. The cyclic recruit-ment and selection of follicles eventually leads to theformation of one or more preovulatory follicles, whose num-ber varies in each species. These processes, involving anumber of locally-produced factors, result in the selectionand maturation of the dominant follicles that finally ovulate.After ovulation, the corpus luteum (CL) is the transient en-docrine gland that forms from the remaining wall of the ovar-ian follicle, and if pregnancy does not occur (at the end ofeach nonfertile ovarian cycle) or when it is no longer requiredfor maintenance of pregnancy, the CL ceases to produceprogesterone and regresses in a process called luteolysis. Al-though all these processes (follicular growth and regressionand CL development and luteolysis) require dynamic changesin the ovarian vascular network, their regulation is not wellunderstood. The role of the Notch ligand DLL4 system in an-giogenesis and its relevance in ovarian physiology were in-vestigated in this study. These data were complemented bystudying whether changes in the angiogenesis regulation areassociated with the vascular ovarian alterations observed inPCOS and OHSS models developed in rodents.

Key words: ovary * angiogenesis * polycystic ovaric syn-

drome * ovarian hyperstimulation syndrome * Notch system

Resumo

O desenvolvimento e regressão do folículo ovariano é um pro-cesso contínuo e cíclico que depende de sinais endócrinos,parácrinos, autócrinos e de interações célula- célula. O re-crutamento e seleção de folículos levam à formação de umou mais folículos pré-ovulatórios, cujo número varia em



cada espécie. Estes processos envolvem a síntese de fatoreslocais que produzem a seleção e amadurecimento dos folí-culos dominantes desencadeando a ovulação. Depois daovulação, forma-se o corpus luteum (CL), que é uma glân-dula transiente que se forma das paredes remanescentes dofolículo. Se a prenhez ou gravidez não ocorrer, o CL não con-tinua produzindo progesterona e regride num processo cha-mado luteólise. Embora todos estes processos (crescimentoe regressão folicular, desenvolvimento do CL e luteólise) pre-cisem de modificações na rede vascular ovariana, sua regu-lação ainda é debate de pesquisa. Neste estudo, temos pes-quisado o papel do sistema Notch e seu ligando DLL4 naangiogênese e sua relevância na fisiologia ovariana. Estes da-dos foram complementados estudando se modificações naregulação dos processos angiogênicos estão envolvidas nasalterações vasculares observadas em modelos de PCOS (po-licistose ovariana) e OHSS (síndrome de hiperestimulaçãoovariana) desenvolvidos em roedores.

Palavras chave: ovário * angiogênese * policistose ovariana *

síndrome de hiperestimulação ovariana * sistema Notch

El desarrollo y regresión del folículo ovárico es unproceso continuo y cíclico que depende de señales en-docrinas, paracrinas, autocrinas y de interacciones cé-lula- célula. Estos procesos involucran la síntesis de fac-tores locales que producen la selección y maduración delos folículos dominantes desencadenando la ovulación.Luego de la ovulación, las células remanentes del folí-culo ovárico formarán una glándula endocrina transi-toria: el cuerpo lúteo (CL). La principal función del CLen mamíferos es la de secretar progesterona, la cual esesencial para la implantación del blastocisto y mante-nimiento de la preñez/embarazo. Sin embargo, si éstano ocurre o cuando ya no es necesario para el mante-nimiento de la placenta, el CL cesa de producir pro-gesterona y regresiona en un proceso llamado luteóli-sis. La apoptosis juega un papel crítico en la luteólisis yatresia folicular. Además, todos estos procesos (creci-miento y regresión folicular, desarrollo del CL y luteó-lisis) requieren cambios dinámicos en la red vascularovárica cuya regulación aún plantea interrogantes.

La apoptosis es un proceso fisiológico que regula elmantenimiento de la homeostasis en organismos mul-ticelulares. Las señales apoptóticas ocurren a través demúltiples caminos independientes que convergen enuna maquinaria de destrucción celular. Los factores decrecimiento disparan distintos caminos de transduc-ción de señales que promueven la supervivencia celularo inhiben la apoptosis. Entre éstos, se destacan los me-diados por Erk ½ y por PI3K/Akt .

Durante el desarrollo embrionario los vasos sanguí-neos se diferencian de precursores endoteliales pormedio de una activa vasculogénesis, mientras que en eladulto se originan de vasculatura pre-existente por unproceso denominado angiogénesis. Este proceso hasido estudiado en patologías como el cáncer, aunque en

condiciones fisiológicas la angiogénesis se limita a al-gunos aspectos de la reproducción, como los cambioscíclicos en el ovario y endometrio uterino. La diferen-cia entre la angiogénesis patológica y fisiológica recaeen la regulación precisa del balance de factores pro- yantiangiogénicos. Durante la neovascularización fisio-lógica los vasos formados maduran, se estabilizan y de-tienen su proliferación. Por el contrario, los vasos encondiciones patológicas pierden el balance apropiadoentre los reguladores positivos y negativos, no detienensu crecimiento y se encuentran en constante remode-lación, dando lugar a un sistema vascular aberrante. Enel caso del ovario, los folículos primordiales y primariosreciben nutrientes y oxígenos por difusión pasiva, peropara continuar con su crecimiento más allá de estos es-tadios los folículos requieren de una vasculatura que seforma alrededor de cada uno de ellos. Esta vasculaturaestá confinada a la teca de los folículos, siendo la capade células de la granulosa avascular durante todo el pro-ceso de foliculogénesis. Entre los factores que se en-cuentran regulando la angiogénesis folicular, uno de losprincipales es el VEGF (Factor de crecimiento del en-dotelio vascular). Además, este factor actúa en coordi-nación con otros factores angiogénicos como ANGPT(Angiopoyetinas), PDGF (Factor de crecimiento deri-vado de plaquetas) y FGF2 (Factor de crecimiento fi-broblástico). A medida que el desarrollo folicular con-tinúa estos factores aumentan sus niveles permitiendoasí, un intenso desarrollo de la vasculatura luego de laovulación. En nuestro laboratorio hemos demostradoque factores angiogénicos ováricos (VEGF y Angiopo-yetina 1) tienen un papel protector de la atresia folicu-lar mediado por inhibición de la apoptosis [1-3], ade-más que el camino PI3K/Akt está involucrado en elefecto de VEGF [3].

El sistema Notch es un camino de señalización queincluye comunicación intercelular y regula la home-ostasis de células embrionarias, la proliferación y lamuerte celular. El sistema está formado por cuatro re-ceptores (Notch1-4) y cinco ligandos (Jagged1, -2; Delta-like 1 (DLL1), DLL3 y DLL4), todas proteínas de mem-brana. Los receptores Notch, una vez que interactúancon los ligandos, sufren una serie de clivajes por dife-rentes enzimas. Estos culminan, por acción de la en-zima γ-secretasa, en la liberación del dominio intrace-lular del receptor el cual se transloca al núcleo dondeactúa sobre genes blanco de la familia Hes y Hey. Losratones deficientes en alguno de estos componentes,mueren durante la embriogénesis con defectos en el re-modelamiento vascular [4]. En estudios realizados enmamíferos donde los receptores Notch están constitu-tivamente activos, se ha observado que los mismos re-gulan la proliferación, diferenciación y apoptosis de va-rios tipos celulares.

Se ha descripto la interacción entre componentes delsistema Notch y la angiogénesis. En particular el li-


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gando DLL4, los receptores Notch1, Notch4 y el Factorde Crecimiento del Endotelio Vascular A (VEGF) estáninvolucrados en este proceso. Se demostró que la inhi-bición de la señalización de Notch en ovario de ratónneonatal, disminuyó la formación de folículos primor-diales [5].

En carcinomas ováricos se ha observado que tantoNotch 3 como Jagged 2 se encuentran aumentadoscomparado a epitelio de ovario normal [6] y en tumo-res de ovario epiteliales se ha observado la presencia devarios elementos de la familia de Notch y la existenciade las formas activadas de estos receptores [7].

Uno de los objetivos del laboratorio es evaluar la ac-ción del sistema Notch sobre el desarrollo folicular,función de las células de granulosa y la angiogénesis ová-rica. En relación a esto hemos demostrado que la ad-ministración de un inhibidor de la γ secretasa (DAPT)a ratas preñadas, disminuye los niveles séricos de Pro-gesterona, y que este fenómeno está vinculado a la re-gulación de la vía de Notch, lo cual conduce a la apop-tosis del CL [8]. Estos resultados demuestran porprimera vez, que la supresión de la vía de Notch causaun efecto directo sobre la función luteal.

En relación a la participación del sistema Notch enel crecimiento e invasión de células de granulosa tu-morales (línea celular KGN), resultados preliminares denuestro grupo demuestran que el DAPT es capaz de in-hibir estos procesos en cultivos de esta línea celular.

Otro de los objetivos es dilucidar la participación dediferentes sistemas angiogénicos en la fisiopatologíadel síndrome de hiperestimulación ovárica (OHSS) ydel síndrome de ovario poliquístico (PCOS) y evaluarnovedosas alternativas terapéuticas para el tratamientode estas patologías reproductivas. En estas patologías hasido descripto un aumento en la producción ovárica deVEGF.

El OHSS es una complicación iatrogénica severa delcrecimiento y maduración folicular ocasionada por lainducción de la ovulación con gonadotrofinas en tra-tamientos de fertilización asistida (ART). Aunque laprevalencia de la forma severa de OHSS es baja (0,3-5%de ciclos de estimulación), es importante destacar queel OHSS es una complicación causada por ART que enalgunos casos puede tener resultados fatales. Las ca-racterísticas de la enfermedad involucran: aumento enel tamaño del ovario, sobreproducción de hormonas es-teroideas y sustancias vasoactivas, contribuyendo deesta manera al aumento de permeabilidad vascular,presencia de ascitis y formación de quistes. Estos quis-tes son de tejido luteal y hemorrágicos, y probable-mente el mecanismo se deba o bien a un aumento dela proliferación/diferenciación de las células foliculareso a la inhibición de la apoptosis.

Cabe resaltar que las concentraciones de VEGFA enfluido peritoneal y folicular en pacientes con riesgo aOHSS se correlacionan con el desarrollo del síndrome.

Varios autores han mostrado que el VEGFA en pacien-tes que desarrollan OHSS, proviene de un ovario hipe-restimulado, siendo la concentración de VEGFA enfluido folicular 100 veces mayor que la observada ensuero [9]. También se ha observado en mujeres que de-sarrollan la enfermedad, que el VEGFA se expresa en cé-lulas de granulosa-luteínicas y se libera al fluido folicu-lar en respuesta a hCG, aumentando la permeabilidadvascular y, por consiguiente, la presencia de ascitis.

En los últimos años, se propuso en el laboratorio elestudio de enfermedades reproductivas femeninas conuna angiogénesis alterada como es el caso de OHSS yPCOS. Para ello, se desarrolló en el laboratorio un mo-delo animal que manifiesta OHSS en ratas inmaduras.Uno de los objetivos fue evaluar como posible estrate-gia terapéutica, el efecto in vivo de un agonista deGnRH, Acetato de Leuprolide (LA), sobre el desarrollofolicular y la formación del cuerpo lúteo, ya que estetipo de molécula es ampliamente utilizada en la clínicaginecológica. Los resultados mostraron que en el mo-delo de OHSS desarrollado en rata, el agonista dismi-nuía la expresión de P450scc, StAR, ANGPT-1 y su re-ceptor Tie-2 y afectaba la estabilidad vascular como laproliferación de células del cuerpo lúteo conducién-dolo a la regresión [10]. Por otro lado, en nuestro la-boratorio se han observado altos niveles de ANGPT-1 enpacientes sometidas a ART con alta probabilidad de de-sarrollar OHSS comparado a pacientes controles, locual también se ha detectado en folículos periovulato-rios provenientes de ratas que desarrollaron la patolo-gía de OHSS (resultados preliminares).

El PCOS, por su parte, afecta a un 5 a 10% de lasmujeres en edad reproductiva causando infertilidad yse caracteriza porque las pacientes presentan altera-ciones endocrinas, metabólicas y reproductivas. Losprincipales signos y síntomas son hiperplasia de lateca interna y del estroma con excesiva producción deandrógenos, hirsutismo, obesidad, resistencia a insu-lina, fertilidad disminuida y ovarios poliquísticos hi-pertrofiados. A pesar de que este síndrome fue des-cripto hace más de 50 años, aún no se conoceexactamente su etiología. Varios estudios demuestranque las pacientes con PCOS tienen altos niveles deVEGFA en suero y se cree que este factor proviene deuna elevada producción ovárica [11]. Se ha demos-trado que las mujeres que presentan PCOS tienen au-mentado el flujo sanguíneo del estroma ovárico y queesto estaría relacionado al aumento sérico de VEGFA.Además existen mayores niveles de VEGFA en fluidofolicular de pacientes con PCOS comparadas con pa-cientes control [12]. Cabe destacar que las mujeresque presentan PCOS, tienen mayor riesgo de desen-cadenar OHSS cuando son sometidas a técnicas de fer-tilización asistida y esto estaría relacionado al aumentode la permeabilidad vascular dada por los altos nivelesde VEGFA ováricos y séricos descriptos en estas pa-



cientes. Todas estas características estarían indicandoque la angiogénesis juega un rol muy importante en eldesarrollo de estas patologías. Cabe mencionar que lahCG no posee actividad vasoactiva por sí misma, por lotanto, sus acciones deben estar mediadas a través deuna o más sustancias angiogénicas liberadas por losovarios en respuesta a gonadotrofinas. Uno de los can-didatos es el VEGF, que es un mediador de la angio-génesis ovárica.

Con estos antecedentes se comenzó a estudiar elefecto del Trap (inhibidor de VEGF) en un modelo dePCOS desarrollado en ratas. Para ello, ratas SpragueDawley prepúberes fueron inyectadas con DHEA, 6mg/100 g de peso corporal durante 15 días consecuti-vos. Este modelo ha sido utilizado para mimetizar elPCOS humano en roedor [13]. Tiene la ventaja de ex-hibir las principales características ováricas del PCOS,como ser quistes ováricos y alteraciones en la foliculo-génesis, anovulación, ausencia de ciclos menstruales ehiperandrogenismo.

Las ratas PCOS mostraron un aumento en el por-centaje de área de células periendoteliales. El Trap dis-minuyó el reclutamiento de estas células hasta niveles in-feriores a los normales. Se realizó además un recuentofolicular para caracterizar las alteraciones en el desa-rrollo de los folículos ováricos que presentan las ratasPCOS y el efecto del Trap sobre el mismo.

Se observa que en las ratas PCOS, hay un mayor %de folículos primarios a expensas de los FPO y CLs.También se observa una gran cantidad de quistes. ElTrap fue capaz de revertir la acumulación de folículosprimarios y disminuyó el número de quistes, a pesar deque esto no se vio reflejado en un aumento en el % defolículos ovulados o capaces de ovular. Sin embargo,cuando analizamos el número de ratas que presentabaCLs en cada uno de los grupos, vimos que el Trap lo-gró revertir la disminución en el número de ratas queovularon hasta un valor no diferente del grupo con-trol.

Estos resultados resultan prometedores para estu-diar la interrelación entre distintos mecanismos angio-génicos en el ovario y diseñar novedosas estrategias te-rapéuticas en patologías reproductivas femeninas conangiogénesis alterada.


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IBYME 641

LABORATORIO DE

ENDOCRINOLOGÍA MOLECULARTRANSDUCCIÓN

DE SEÑALES

Regulación de la función esteroidogénicaen testículo y glándula adrenal

Regulation of steroidogenic function intestis and adrenal gland

Regulação da função esteroidogênica emtestículo e glândula adrenal

Omar P. Pignataro, Romina Pagotto, Casandra M.Monzón, Marcos Besio, Carolina Mondillo.

Resumen

Si bien las hormonas hipofisarias LH y ACTH son los regu-ladores primarios de la esteroidogénesis tanto en células deLeydig (CL) como en la zona fasciculada (ZF) adrenal, res-pectivamente, evidencias crecientes indican que diversosfactores, locales y externos, modulan sutilmente (regulaciónfina) la fisiología de las glándulas esteroidogénicas. El pasoregulatorio de la esteroidogénesis es el transporte del co-lesterol a la membrana interna de la mitocondria para sertransformado a pregnenolona y la proteína StAR es muy im-portante en este proceso. La presencia de otras poblacionesen testículo (células de Sertoli, peritubulares, macrófagos ymastocitos) y en corteza adrenal (células endoteliales, ma-crófagos, mastocitos y células de la médula adrenal) llevó aenfocar el estudio hacia compuestos que son secretados poresos tipos celulares o incluso por las propias CL o ZF y queregulan las acciones respectivas de la LH y de la ACTH enforma autócrina y/o parácrina. Nuestro grupo de trabajo hademostrado que factores tales como óxido nítrico (NO), mo-nóxido de carbono (CO) e Histamina (HA) modulan los efec-tos de las hormonas adenohipofisarias mencionadas. Enambos órganos, los diversos factores pueden actuar a travésde distintos (o similares) sistemas transductores, ya seapara activar o inhibir la síntesis de esteroides. Además de laconocida participación del AMPc, otros segundos mensaje-ros están involucrados en la respuesta biológica final

Palabras clave: célula de Leydig * células corticoadrenales *

esteroidogénesis * óxido nítrico * hemo oxigenasa * histamina

Summary

Although steroidogenesis in both Leydig (CL) and zona fas-ciculata (ZF) adrenal cells are under the primary control ofpituitary hormones LH and ACTH, respectively, increasing ev-idence suggests that local or external factors modulate (finetunning) the physiology of steroidogenic glands. The limit-

ing step in the synthesis of all steroid hormones is the trans-port of the substrate—cholesterol—from the outer to the in-ner mitochondrial membrane, where it is converted intopregnenolone. The participation of StAR protein in the mech-anism is very important in this process. The presence of othercell types in testis (Sertoli and peritubular cells, macrophagesand mast cells) and in the adrenal cortex (endothelial cells,macrophages, mast cells and the near medullary cells) ledto focus this study in factors secreted by these cell types oreven the same Leydig or ZF cells that are able to modulateLH and ACTH actions in an autocrine or paracrine way.These studies have shown that the NO/NOS, HO/CO and his-tamine systems modulate the effect of the above mentionedpituitary hormones. These factors can act through similar ordifferent signal transduction pathways to activate or inhibitsteroid synthesis. In addition to the very well documentedparticipation of cAMP in the mechanism of action of bothhormones, other second messengers are also involved in thegeneration of the final biological effect.

Keywords: Leydig cells * corticoadrenal cells * steroidogen-

esis * nitric oxide * heme oxygenase * histamine

Resumo

Embora os hormônios hipofisários LH e ACTH sejam os re-guladores primários da esteroidogênese tanto em células deLeydig (CL) quanto na zona fasciculada (ZF) adrenal, res-pectivamente, evidências crescentes indicam que diversosfatores, locais e externos modulam sutilmente (regulaçãofina) a fisiologia das glândulas esteroidogênicas. O passo re-gulatório da esteroidogênese é o transporte do colesterol paraa membrana interna da mitocôndria para ser transformadoem pregnenolona e a proteína StAR é muito importanteneste processo. A presença de outras populações em testí-culo (células de Sertoli, peritubulares, macrófagos e mastó-citos) e em córtex adrenal (células endoteliais, macrófagos,mastócitos e células da medula adrenal) levou a focar o es-tudo em compostos que são secretados por esses tipos ce-lulares ou inclusive pelas próprias CL ou ZF e que regulamas ações respectivas da LH e da ACTH em forma autócrinae/ou parácrina. Nosso grupo de trabalho tem demonstradoque fatores tais como óxido nítrico (NO), monóxido de car-bono (CO) e Histamina (HA) modulam os efeitos dos hor-mônios adeno-hipofisários mencionados. Em ambos os ór-gãos, os diversos fatores podem atuar através de diferentes(ou similares) sistemas transdutores, seja para ativar ou ini-bir a síntese de esteroides. Além da conhecida participaçãodo AMPc, outros segundos mensageiros estão envolvidos naresposta biológica final

Palavras chave: célula de Leydig * células córtico-adrenais *

esteroidogênese * óxido nítrico * hemo oxigenase * histamina

La función normal del testículo, dependiente de lasgonadotrofinas hipofisarias, involucra la producción deespermatozoides en los túbulos seminíferos y la síntesisde andrógenos, principalmente testosterona, en las cé-lulas intersticiales de Leydig (CL). La producción de tes-



tosterona es imprescindible para la función sexual nor-mal, el mantenimiento de los caracteres sexuales secun-darios, la espermatogénesis normal, y el mantenimientode la hematopoyesis y de la masa muscular y ósea.

En los últimos años se ha aceptado que, si bien lahormona luteinizante hipofisaria (LH) es el reguladorprincipal de la esteroidogénesis testicular, factores pro-ducidos por las diversas poblaciones celulares del testí-culo (células de Sertoli, peritubulares, macrófagos ymastocitos) modulan las acciones de la hormona, ac-tuando de forma autócrina y/o parácrina. Dichos fac-tores serían también capaces de modular a la LH en supapel como regulador de la diferenciación y prolifera-ción de las CL inmaduras.

En forma semejante a lo descripto para testículo, sibien la esteroidogénesis adrenal es regulada principal-mente por la hormona ACTH, los diversos tipos celu-lares que conforman la estructura de la corteza y de lamédula suprarrenal, secretan compuestos que puedenmodular la acción hormonal. Los corticosteroides pro-ducidos en respuesta a ACTH (aldosterona en la zonaglomerulosa, y cortisol - o corticosterona en roedores-en la zona fasciculada) están implicados en una varie-dad de mecanismos fisiológicos, incluyendo aquellosque regulan la inflamación, el sistema inmune, el me-tabolismo de hidratos de carbono, el catabolismo deproteínas, los niveles electrolíticos en plasma y los quecaracterizan la respuesta frente al estrés. ACTH es, ade-más, responsable del mantenimiento de la integridadanatómica y funcional de la glándula adrenal, lo cualtambién estaría sujeto a regulación local.

Sobre la base de publicaciones previas de nuestrogrupo de trabajo, los sistemas óxido nítrico sintasa/óxidonítrico (NOS/NO) y hemo oxigenasa/monóxido de car-bono (HO/CO) y la histamina (HA), modulan los efec-tos de las hormonas adenohipofisarias mencionadas

1- SISTEMAS NOS/NO Y HO/CO

El NO es un radical libre inorgánico gaseoso, cuyafunción como mensajero intracelular ha sido amplia-mente establecida en una gran variedad de tipos celu-lares. La enzima oxido nítrico sintasa (NOS) cataliza lasíntesis de NO y L-citrulina a partir de L-arginina. Sehan identificado al menos tres isoformas de NOS, pro-ducto de tres genes distintos: la nNOS (NOSI), la iNOS(NOSII) y la eNOS (NOSIII). El NO modula la este-roidogénesis en células granulosas-luteales del ovariohumano y en células de zona glomerulosa adrenal. Tra-bajos propios y de otros grupos han demostrado que elNO regula la síntesis de esteroides en CL, en ZF de ratay en células glomerulosas bovinas (1-4). En particular,el trabajo de Del Punta et al. de 1996 tiene 137 citacio-nes según la base de datos Scopus, de las cuales 52 sonen los últimos 5 años, lo cual muestra la vigencia y re-conocimiento de nuestros resultados

Por su parte, se ha propuesto al CO, producido porel clivaje oxidativo del hemo, como un modulador confunciones semejantes a las del NO. El CO es producidoen la reacción catalizada por la HO, en la que se generaasimismo biliverdina e hierro. Clásicamente se ha aso-ciado esta actividad enzimática con el catabolismo dehemoproteínas. Sin embargo, en forma más reciente, sehan descripto efectos citoprotectores relacionados conla actividad de HO. Hasta el momento se han caracte-rizado tres isoformas de la enzima: la HO-1 o inducibley las HO-2 y 3 que son constitutivas. Resultados de nues-tro grupo y de otros han permitido la identificación deHO-1 y de HO-2 en células de ZF adrenal de rata, en lalínea celular Y1, y en CL tumorales MA-10 y normales derata (5)(6). Dado que la HO regula los niveles celularesde hemoproteínas, su actividad modularía los niveles delas enzimas dependientes de citocromo P450, esencia-les en el camino esteroidogénico. La expresión consti-tutiva de HO-2 en testículo y glándula adrenal proba-blemente cumpla esa función.

Evidencias experimentales de los últimos años de-muestran que los sistemas de generación y los meca-nismos de acción del NO y del CO coinciden en diver-sos aspectos. Ambos mediadores comparten al menosun blanco de acción común como es el grupo hemo dela guanilil ciclasa soluble, y su acción se ha asociado aun aumento en los niveles de GMPc. Una estrategia bio-lógica para evitar esta redundancia podría consistir enla regulación mutua y coordinada entre ambos sistemasenzimáticos. En este sentido, resulta cada vez más evi-dente que ambos mediadores no actúan siempre enforma independiente, sino que uno puede modular laactividad del otro. Se ha demostrado que el NO inducela expresión de HO-1 y que la HO podría regular los ni-veles de la hemoproteína NOS. En macrófagos obteni-dos de animales inyectados con LPS, la HO-1 actuaríacomo un inhibidor fisiológico de NOS disminuyendo ladisponibilidad del grupo hemo para la actividad de laiNOS. También se ha sugerido que hay un sinergismoentre CO y NO para proveer citoprotección. Se estándesarrollando experimentos que intentarán ver si estosmecanismos son posibles en nuestros modelos experi-mentales.

Los procesos infecciosos e inflamatorios compro-meten fuertemente las funciones testicular y adrenal.Sin embargo, los mecanismos involucrados en estosefectos aún no han sido elucidados. La inflamación in-volucra, entre otros procesos, la activación de monoci-tos, macrófagos y mastocitos, lo que lleva a la produc-ción de citoquinas proinflamatorias y especies reactivasde oxígeno (ROS) citotóxicas, las cuales modulan la sín-tesis de esteroides en CL y en células adrenales. La pro-ducción de estos mediadores, que ocurre en forma sis-témica y también localmente, se incrementa ante unestímulo como el LPS. Al respecto, el aumento en lamuerte celular programada (apoptosis, autofagia) o no


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programada (necrosis) ocurre durante la injuria celu-lar y puede contribuir a la etiología de varios estados fi-siopatológicos. La HO-1 (a través de alguno de sus pro-ductos: CO, biliverdina y/o bilirrubina) confierecitoprotección en varios tipos celulares inhibiendo laapoptosis, la inflamación y la proliferación celular. Di-cho efecto de la HO-1 puede involucrar diferentes sis-temas de transducción de la señal que incluye, entreotros, p38MAPK, PI-3-K/AKT o NFkB (7-9). Estamos es-tudiando si la inducción de HO regula la proliferaciónde células de Leydig testiculares.

2- HISTAMINA

Clásicamente reconocida como mediadora en pro-cesos inflamatorios, la histamina (HA) ha sido gene-ralmente asociada a los mastocitos presentes en casi to-dos los tejidos. Sin embargo, también se ha descriptosíntesis de HA en basófilos, plaquetas, células endote-liales y neuronas, y existen evidencias de su participa-ción en una gran variedad de procesos fisiológicos y pa-tológicos. La síntesis de HA se produce a partir delaminoácido L-histidina, en una reacción catalizada porla enzima L-histidina descarboxilasa (HDC). HA ejercesus múltiples efectos a través de la unión a receptoresacoplados a proteínas G en la membrana de sus célulasblanco. Los mismos han sido designados HRH1, HRH2,HRH3 y HRH4, y se diferencian en su patrón de ex-presión y mecanismos de transducción de la señal (10,11). Varios de los procesos en los que HA intervienecomo modulador involucran proliferación celular y/oapoptosis. Más aún, HA tendría efectos pro apoptóticoso anti apoptóticos según el tipo celular.

Tanto en condiciones fisiológicas como patológicas,el efecto final de HA sobre la proliferación celular y/oapoptosis estaría definido por el subtipo de receptorcon el que la amina interactúa en la membrana de suscélulas blanco, lo cual desencadena la activación demecanismos de transducción de la señal específicos se-gún el tipo celular. Estos incluyen la activación o inhi-bición de las vías MAPK/ERK, IKK/NF-KB, SAPK/JNKy JAK/STAT, en el caso de la regulación de la prolife-ración celular, y cambios en la expresión de proteínasde la familia BCL2 en el caso de inducción de apopto-sis. La mayoría de los trabajos realizados hasta el mo-mento involucran receptores HRH1 y HRH2, pero enlos últimos años se centró la atención en los subtiposHRH3 y HRH4 y su papel en la regulación de la proli-feración celular. Al respecto, cabe destacar que eviden-cias recientes indican que HRH3 y HRH4 se expresanen diferentes líneas celulares de glándula mamaria hu-mana, tanto normales como transformadas, siendo laexpresión de HRH3 significativamente mayor en estasúltimas. Además, se demostró una correlación entre laexpresión de HRH3, HDC y el antígeno nuclear deproliferación celular (PCNA), y un efecto estimulatorio

de HA mediado por HRH3 sobre la migración de las cé-lulas malignas. Por su parte, la activación de receptoresHRH4 mostró un efecto inhibitorio sobre la prolifera-ción celular, induciendo apoptosis (12, 13). Se están re-alizando estudios relacionados con los subtipos HRH3y HRH4 y con la regulación de la proliferación celular

Existen muy pocas evidencias en la literatura acercadel posible papel de la HA como modulador de la fi-siología de las células esteroidogénicas. Se vio que HAestimula la síntesis de progesterona a través de recep-tores del subtipo HRH2 por un mecanismo mediadopor AMPc, en folículos preovulatorios de rata. Tam-bién se ha reportado que HA tiene un efecto estimula-torio directo sobre la secreción de progesterona y es-tradiol en células de la granulosa humana, sugiriendoun rol fisiológico en la regulación de la función de di-chas células durante el ciclo menstrual. Respecto a lasfunciones reproductivas en el macho, Mayerhofer et al.(14) han sugerido que HA estimula la esteroidogénesisa través de los receptores HRH1 en el parénquima tes-ticular del hámster dorado. Además, dos trabajos re-cientes sugieren, por un lado, la existencia de un sis-tema histaminérgico en testículo humano (15) y porotra parte, que la HA estaría involucrada en la madu-ración del testículo, ya que en ratones KO para HDC, seobservó atrofia testicular parcial, alteraciones morfoló-gicas de las CL y esteroidogénesis disminuída (16). Alrespecto en este punto, en nuestro conocimiento, los 3trabajos publicados por nuestro grupo en células deLeydig, representan las mayores contribuciones en eltema (17-19). Además, hemos publicado, por invita-ción del Editor, un capítulo de libro (20).

Los niveles testiculares de HA presentan variacionesa diferentes edades, siendo considerablemente mayoresen ratas prepúberes, donde predominan formas inma-duras de células de Leydig, en forma simultánea con unmayor número de mastocitos intersticiales. Los altos ni-veles de HA hallados en animales prepúberes estaríanasociados a un incremento en la proliferación y/o unainhibición de la diferenciación, mientras que los nive-les más bajos, hallados en los animales adultos, estaríanasociados a una disminución de la proliferación, a unaumento de la diferenciación, y a la regulación de lasfunciones diferenciadas. Estas diferentes concentracio-nes de HA en distintos estadíos estarían de alguna ma-nera correlacionadas con los efectos bifásicos que he-mos observado previamente.

Considerando los estudios que realizó nuestro grupoen CL y dada la escasa, contradictoria y poco actualizadabibliografía acerca de la acción directa de la HA sobrela corteza adrenal, es que se están realizando estudiosen células córticoadrenales (21). Los efectos de ACTHen la glándula adrenal incluyen la estimulación de lasíntesis de esteroides y una marcada vasodilatación re-flejada por el aumento en el flujo sanguíneo a través dela glándula. Se han localizado mastocitos en las paredes



de arteriolas en el punto de contacto de la corteza adre-nal con la cápsula de tejido conectivo, y se ha sugeridoque la HA y la serotonina producidas por dichas célu-las incrementan el flujo del medio de perfusión y la se-creción de esteroides en la glándula aislada perfun-dida en ausencia de ACTH. También se sugiere que laHA causa relajación de arteriolas córticoadrenales yque estimula la síntesis de aldosterona en células glo-merulosas (ZG) adrenales bovinas. En lo que respectaa proliferación, un trabajo reciente (22) compara la ex-presión de proteínas y genes relacionados con la HA en-tre cortezas adrenales humanas normales y tumoresadrenocorticales, demostrando un patrón de expre-sión diferencial entre ambos, en cuanto a la expresiónde la enzima HDC, contenido de histamina y perfil deexpresión de los receptores.

Uno de los puntos de integración entre los factoresmencionados consiste en investigar si alguno de losefectos de la HA involucra a la modulación del sistemade las hemo oxigenasas (HO). Tal estudio se funda-menta en que recientemente hemos descripto (19) queconcentraciones de HA inhibitorias de la esteroidogé-nesis en CL actúan, al menos en parte, a través de la ac-tivación del sistema NOS/NO. Esto concuerda con re-sultados anteriores de Del Punta y col (1) acerca de queel NO inhibe el proceso esteroidogénico. Si hubiere unaregulación recíproca entre los sistemas NOS/NO yHO/CO y su relación con los parámetros de estrés oxi-dativo (incluyendo la producción de ROS) tal comoplanteamos en el bloque 1, entonces la HA regularíaambos sistemas a través de uno o más de sus subtipos dereceptores. Si así fuere, los resultados representarían unnovedoso sistema de regulación multifactorial que po-dría extrapolarse no sólo a otros sistemas esteroidogé-nicos, sino también a varios tipos celulares con dife-rentes funciones biológicas.

Otro punto de vista de la importancia de estos estu-dios radica en que los resultados obtenidos atraeránatención hacia nuevos efectos colaterales potencialesdel uso de antihistamínicos, que podrían alterar el nor-mal funcionamiento del testículo y la glándula adrenal,comprometiendo la fertilidad humana y la producciónde hormonas esenciales para la vida.


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LABORATORIO

DE ENDOCRINOLOGÍA

MOLECULAR

Estudios genéticos y moleculares enhiperplasia suprarrenal congénita pordéficit de 21-hidroxilasa

Molecular and Genetic studies in 21-hydroxylase deficiency

Estudos Genéticos e Moleculares emHiperplasia Suprarrenal Congênita porDéficit de 21-Hidroxilase

Liliana Dain1,2, Cecilia Fernández1,2,Melisa Taboas2, Noemí Buzzalino2, Liliana Alba2,Eduardo Charreau1, 1. Instituto de Biología y Medicina Experimental, CONICET.2. Centro Nacional de Genética Médica, ANLIS.

Resumen

La Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) por déficit de21-hidroxilasa representa la enfermedad autosómica recesivade mayor frecuencia y la causa del 90-95% de los casos deHSC. El objetivo de nuestro trabajo es la caracterización mo-lecular de los defectos genéticos asociados a este déficit. Enla actualidad 650 familias han sido caracterizadas, entre lascuales hallamos 7 mutaciones noveles ubicadas en regionescodificantes, sitios de splicing y en una región regulatoria.Estudios de modelado molecular indican diferencias en la es-tabilidad de la proteína mutada y/o de la carga de aminoá-cidos de superficie y resultados preliminares demostrarían

una disminución de la actividad residual in vitro. Por suparte, estudios in silico predicen que la variante de la regiónregulatoria alteraría la topología y curvatura del ADN. Los en-sayos funcionales sugieren diferencias en la tasa transcrip-cional del gen. Asimismo, hemos observado una gran varia-bilidad en la estructura genómica que contiene al CYP21A2(módulo RCCX) y hemos podido establecer que muchas delas pacientes No Clásicas poseen sólo un alelo con mutacióno bien ninguno, lo que sugeriría que los valores hormonalesconsiderados para la inclusión de estos pacientes estarían so-breestimando la frecuencia de la patología.

Palabras clave: deficiencia de 21-hidroxilasa * caracteriza-

ción molecular * mutaciones noveles

Summary

Congenital adrenal hyperplasia (CAH) due to 21-hydroxylasedeficiency is the most frequent inborn error of metabolism,and it accounts for 90–95% of CAH cases. The goal of ourstudy is to fully determine all the molecular defects leadingto 21 hydroxylase deficiency in Argentinian patients. So far,650 families have been characterized. Our analysis revealedthe presence of 7 novel mutations not previously describedin the literature, located in the coding region, splicing sitesand a variant located in a distal regulatory region. In silicoanalyses of novel coding point mutations revealed changesin protein stability or in the surface charge of the mutant en-zymes. Functional preliminary results suggest that the en-zymatic activity is impaired. Similarly, bioinformatic studiespredict that the variant in the distal regulatory region intro-duces distortions in the local conformation of DNA. In vitroassays suggest differences in the transcriptional activity ofthe gene. In addition, a great variability in the genomic struc-ture of the RCCX module was found where the CYP21A2gene is located. On the other hand, our analyses revealed thatthe cut-off value in the ACTH-stimulated 17- hydroxyprog-esterone test might overestimate the diagnosis of the non-classical form by including some patients with heterozygousstatus.

Key words: 21-hydroxylase deficiency * molecular charac-

terization * novel mutations

Resumo

A Hiperplasia Suprarrenal Congênita (HSC) por déficit de 21-hidroxilase representa a doença autossômica recessiva demaior frequência e a causa de 90-95% dos casos de HSC.O objetivo do nosso trabalho é a caracterização molecular dosdefeitos genéticos associados a este déficit. Na atualidade,650 famílias têm sido caracterizadas, dentre as quais en-contramos 7 mutações novéis localizadas em regiões codi-ficantes, sítios de splicing e numa região regulatória. Estu-dos de modelagem molecular indicam diferenças naestabilidade da proteína mutada e/ou da carga de aminoá-cidos de superfície e resultados preliminares demonstrariamuma diminuição da atividade residual in vitro. Por sua vez, es-tudos in silico predizem que a variante da região regulatóriaalteraria a topologia e curvatura do DNA. Os ensaios funcio-



nais sugerem diferenças na taxa transcricional do gene. Domesmo modo, temos observado grande variabilidade na es-trutura genômica que contém o CYP21A2 (módulo RCCX) epudemos estabelecer que muitas das pacientes Não-Clássicaspossuem apenas um alelo com mutação ou então nenhum, oque sugeriria que os valores hormonais considerados para ainclusão destes pacientes estariam superestimando a fre-quência da patologia.

Palavras chave: deficiência de 21-hidroxilase * caracteriza-

ção molecular * mutações novéis

Con el nombre de Hiperplasia Suprarrenal Congé-nita (HSC) se conoce a un conjunto de enfermedadeshereditarias de origen autosómico recesivo que pre-sentan trastornos en la esteroidogénesis suprarrenal yque causan déficit en la biosíntesis del cortisol y aldos-terona. La deficiencia de la enzima 21-hidroxilasa es eldesorden más común, representando al 90-95% de loscasos de HSC (1). La sintomatología clínica del déficitde 21-hidroxilasa comprende un amplio espectro demanifestaciones que van desde formas severas con pér-dida salina hasta aquellas con signos leves de hiperan-drogenismo. La variabilidad de expresión es una mani-festación del grado de actividad residual que presenta laenzima. Así, la deficiencia de 21-hidroxilasa puede va-lorarse clínicamente como severa o clásica y leve o no clá-sica o de presentación tardía. La clásica, que posee dosvariantes Virilizante simple (VS) y Perdedora de sal (PS),se manifiesta durante el período perinatal con signos clí-nicos debido a la falta de producción de aldosterona y/ocortisol, mientras que la no clásica (NC) presenta ma-nifestaciones clínicas menos severas después del naci-miento, en la primera infancia, en la pubertad o en laedad adulta y sus signos son principalmente el hiperan-drogenismo. Las prevalencia han sido estimadas en1/15.000 para la forma clásica y de 1/100 a 1/1.000 parala NC, dependiendo del origen étnico de los afectados.Esta patología es pasible de un tratamiento de bajo costoque permite una calidad de vida normal. Asimismo, eltratamiento prenatal con dexametasona, puede evitar lavirilización en las formas clásicas, sin que se hayan des-cripto efectos teratogénicos con las dosis usadas.

El gen codificante, CYP21A2, está ubicado en el cro-mosoma 6p21.3 conformando un bloque que se en-cuentra normalmente duplicado. Este bloque denomi-nado RCCX (ΑP, Α4, Α21 y TNα comprende parte delgen RP1, los genes del factor 4 del Complemento, los ge-nes CYP21 y una región del gen TNXB que codifica parauna proteína del citoesqueleto. Las regiones duplicadasde TNXB y RP1 constituyen pseudogenes truncados lla-mados TNXA y RP2, respectivamente(1)(2). Aproxi-madamente el 60% de los cromosomas contienen 2módulos RCCX, conformando el siguiente arreglo detelómero a centrómero: RP1-C4A-CYP21A1P-TNXA(Módulo largo)- RP2-C4B-CYP21A2-TNXB (Módulo

corto), con un gen activo (CYP21A2) en uno de ellos yun pseudogen inactivo (CYP21A1P) en el otro, amboscon 98% de identidad de secuencia. Sin embargo, sehan descripto cromosomas monomodulares, trimodu-lares y tetramodulares, por duplicación/deleción delmódulo que contiene al gen o al pseudogen.

Gran parte de los defectos genéticos responsables dela deficiencia son producto del apareamiento desigualentre el gen y el pseudogen, causando deleciones delgen o bien la transferencia de mutaciones deletéreas delpseudogen al gen por conversión génica. Si bien la ma-yor parte de los afectados poseen mutaciones que pro-vienen del pseudogen, en los últimos años se han iden-tificado más de 130 mutaciones espontáneas comocausantes de la patología (3).

Nuestro grupo de trabajo inició el estudio molecularde la deficiencia de 21-hidroxilasa en el año 1996. Losprimeros estudios nos permitieron estimar la distribu-ción de las 10 mutaciones más frecuentes en una mues-tra preliminar de afectados (4)(5). Actualmente, más650 familias han sido estudiadas, detectando entre el 85y el 95% de los alelos clásicos y alrededor del 70% de losalelos pertenecientes a pacientes NC. En un grupo depacientes en los que restaba identificar al menos unaalelo, hemos llevado a cabo una búsqueda de mutacio-nes menos frecuentes y/o noveles por secuenciación.Nuestros resultados demostraron la presencia de 12mutaciones poco frecuentes previamente descriptas,algunas de ellas asociadas a una diferente forma depresentación de la patología (6) y 7 mutaciones nove-les, 5 en regiones codificantes, 1 en un sitio dador desplicing y 1 variante en una región regulatoria distal. Lasvariantes en la región proteica involucran a residuosaminoacídicos muy conservados evolutivamente en laproteína (7-8). Estudios de modelado molecular indicandiferencias en la estabilidad de la proteína y/o de lacarga de aminoácidos de superficie como consecuenciade estas mutaciones (8). Asimismo, estudios prelimi-nares de la actividad residual in vitro de las variantes mu-tadas demostrarían una disminución en la capacidad deconversión de los sustratos de la enzima en sus pro-ductos. Por su parte, estudios bioinformáticos predicenuna alteración de la topología y curvatura del ADNpara la variante hallada en una de las regiones regula-torias analizadas. Los estudios preliminares de su ex-presión in vitro, sugerirían una diferencia en la tasatranscripcional del gen (9).

Estudios previos de nuestro grupo han demostradotambién, una gran variabilidad en la estructura de la re-gión genómica en donde está ubicado el gen CYP21A2(bloque RCCX). Las mismas incluyen deleciones y du-plicaciones del gen y pseudogen, así como la presenciade genes quiméricos (10). Estos resultados demuestranla gran complejidad que posee esta región genómica ysu caracterización contribuye a una mejor comprensiónde los mecanismos patológicos de la deficiencia.


IBYME 647

Finalmente, nuestro estudio de búsqueda de muta-ciones menos frecuentes o noveles en los pacientes,nos ha permitido establecer que muchas de las pacien-tes diagnosticadas como NC poseen sólo un alelo conmutación o bien ninguno (11). Estos resultados co-bran importancia dado que demostrarían que el hipe-randrogenismo que se observa en estos pacientes sedebe a otras causas y no a la deficiencia de 21-hidroxi-lasa, y que los valores hormonales considerados como lí-mite de corte para su inclusión, estarían sobreesti-mando la frecuencia de la patología. De hecho, todosaquellos pacientes analizados que presentan valores de17 OH- progesterona post-estímulo con ACTH menoresa 14 ng/mL (valor de corte: 10 ng/mL(4) poseen sóloun alelo del gen mutado o bien ninguno (4) (11)(12).


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LABORATORIO DE ESTUDIOSDE LA INTERACCIÓN CELULAR ENREPRODUCCIÓN Y CÁNCER

Bases moleculares de la interaccióncelular en modelos de reproducción y cáncer: identificación de proteínas ymecanismos involucrados

Molecular basis of cell-cell interaction inreproduction and cancer models:identification of proteins andmechanisms involved

Bases moleculares da interação celularem modelos de reprodução e câncer:identificação de proteínas e mecanismosenvolvidos

Mónica H. Vazquez-Levin, Laura I. Furlong, Clara I. Marín-Briggiler, Carolina Veaute, María F. Veiga, María L. Matos, Lara Lapyckyj,Nieves Gabrielli, Marina Rosso, María M. Arzondo,Nadia Y. Edelsztein, María J. Besso

Resumen

La interacción entre las células somáticas y entre las gametasinvolucra una serie de eventos moleculares que no han sidodilucidados totalmente. Nuestro grupo de investigación hadesarrollado proyectos dirigidos a profundizar el conoci-miento de dichos eventos. Los estudios han comprendido elanálisis de moduladores de la funcionalidad espermática (ej.



efecto de la temperatura de incubación, las concentracionesdel ión calcio, los anticuerpos antiespermáticos de fluidosbiológicos en la motilidad, la capacitación y la exocitosisacrosomal). Asimismo, hemos caracterizado componentes delespermatozoide (ej. CaM Kinasa IV, proacrosina/acrosina) yde secreciones del tracto femenino (ej. Grp78/BiP), evaluadosu rol en el desarrollo de capacidad fecundante y, en algu-nos casos, investigado su relación con la infertilidad. En añosrecientes, nuestros proyectos se han extendido al estudio delas cadherinas en eventos de adhesión celular durante la fe-cundación; hemos caracterizado la expresión de cadherinaepitelial y neural en tejidos reproductivos y gametas y eva-luado su participación en la fecundación. Dada su recono-cida relevancia en el cáncer, hemos abordado estudios en di-versos modelos tumorales. Nuestras investigaciones hancontribuido a la comprensión de los eventos de interacciónde las gametas durante la fecundación así como entre las cé-lulas somáticas durante la progresión tumoral.

Palabras clave: interacción celular * fecundación * pro-

gresión tumoral * proacrosina/acrosina * Grp78/Bip * cad-

herinas clásicas

Summary

Cell-cell interaction between somatic cells as well as gametesinvolves molecular events that have not been completely elu-cidated. Our research group has developed projects aimed atstudying proteins and mechanisms participating in these in-teractions. Several modulators of sperm functions have beenanalyzed (i.e. incubation temperature, calcium ion concen-tration, and antisperm antibodies present in biological flu-ids upon sperm motility, capacitation and acrosomal exocy-tosis). In addition, proteins from spermatozoa (i.e. CaMKinase IV, proacrosin/acrosin) and from secretions of the fe-male tract (Grp78/BiP) have been characterized, and theirrole in the development of sperm fertilizing ability assessed.In some cases, their relationship with infertility was evalu-ated. In recent years, our projects have been extended tostudy members of the cadherin superfamily and related pro-teins; in particular, the expression of epithelial and neuralcadherin in reproductive tissues and gametes was charac-terized and evidence of their participation in fertilization-re-lated cell-cell adhesion events shown. Based on the vast ev-idence of the role of these proteins in tumor progression, ourcurrent research also involves studies of cancer models.Our projects have contributed to the understanding of themolecular basis of cell-cell interaction during fertilization aswell as during tumor progression.

Key words: cell-cell interaction* fertilization* tumor progres-

sion* proacrosin/acrosin* Grp78/Bip * classical cadherins

Resumo

A interação entre as células somáticas e entre os gametas en-volve uma série de eventos moleculares que não têm sido elu-cidados totalmente. Nosso grupo de pesquisa tem desenvol-vido projetos encaminhados a aprofundar o conhecimento detais eventos. Os estudos têm compreendido a análise de mo-

duladores da funcionalidade espermática (ex. efeito da tem-peratura de incubação, as concentrações do íon cálcio, os an-ticorpos antiespermáticos de fluidos biológicos na motilidade,a capacitação e a exocitose acrossomal). Do mesmo modo, ca-racterizamos componentes do espermatozoide (ex. CaM KinaseIV, proacrosina /acrosina) e de secreções do trato feminino (ex.Grp78/BiP), avaliamos seu papel no desenvolvimento de ca-pacidade fecundante e, em alguns casos, investigamos sua re-lação com a infertilidade. Em anos recentes, nossos projetosse têm estendido ao estudo das caderinas em eventos de ade-são celular durante a fecundação; temos caracterizado a ex-pressão de caderina epitelial e neural em tecidos reprodutivose gametas e avaliamos sua participação na fecundação. Dadasua reconhecida relevância no câncer, temos abordado estu-dos em diversos modelos tumorais. Nossas pesquisas têm con-tribuído à compreensão dos eventos de interação dos game-tas durante a fecundação bem como entre as células somáticasdurante a progressão tumoral.

Palavras chave: interação celular * fecundação * progressão

tumoral * proacrosina/acrosina * Grp78/Bip * caderinas

clássicas

Introducción

La interacción entre las células somáticas y entre las ga-metas involucra una serie de eventos moleculares com-plejos que no han sido dilucidados totalmente. Desde suconstitución hace 15 años, nuestro grupo de investigaciónha desarrollado proyectos de investigación dirigidos al es-tudio de los mecanismos moleculares y las entidades queparticipan en el reconocimiento de las gametas durantela fecundación. Como parte de los proyectos, hemos es-tudiado el rol de diversos componentes del espermato-zoide y de las secreciones del tracto femenino en el de-sarrollo de su capacidad fecundante, así como hemosevaluado requerimientos in vitro (ej. el rol de la tempe-ratura de incubación y del ión calcio (Ca2+) del medio decultivo de espermatozoides para el desarrollo de estrate-gias de abordaje de algunos de los eventos de este pro-ceso). En años recientes nuestras investigaciones están en-focadas en el estudio de miembros de la superfamilia demoléculas de adhesión llamadas cadherinas y proteínas re-lacionadas a éstas en eventos de adhesión celular du-rante la fecundación. Dada la reconocida relevancia demiembros de esta familia de moléculas de adhesión en laprogresión del cáncer, nuestras investigaciones se hanextendido a su estudio en diversos modelos tumorales.Los diseños experimentales han involucrado el uso de ga-metas y tejidos reproductivos de distintas especies de ma-míferos (modelo humano, murino y bovino) así como lí-neas celulares y muestras de tejidos no tumorales ytumorales de diversos orígenes. En los abordajes de es-tudio empleamos estrategias celulares, bioquímicas, mo-leculares y funcionales. En los párrafos siguientes se pre-senta una revisión de algunos de los proyectos realizados.


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GENERALIDADES DEL PROCESO DE LAFECUNDACIÓN

La fecundación involucra una secuencia coordinadade interacciones moleculares entre el espermatozoidey el óvulo que dan origen a una zigota. Los espermato-zoides son células altamente especializadas y polariza-das, que se forman de manera continua en el epitelio se-minífero del testículo durante la espermatogénesis. Sinembargo, el espermatozoide que deja la gonada es in-mótil o presenta motilidad no progresiva y no puede fe-cundar al ovocito; ambas propiedades son adquiridasdurante su tránsito por el epidídimo en un proceso co-nocido como maduración epididimaria. Luego de laeyaculación, los espermatozoides deben permanecerun tiempo en el tracto reproductivo femenino dondesufren una serie de cambios metabólicos y funcionalesconocidos en conjunto como capacitación espermá-tica. Los espermatozoides interactúan con las células deltracto reproductivo de la hembra y sus secreciones y de-sarrollan un patrón de motilidad llamado hiperactiva-ción, que facilita su acercamiento y la penetración de lasenvolturas del ovocito. Una vez en el sitio de fecunda-ción, los espermatozoides comienzan una serie com-pleja de interacciones con el ovocito y sus envolturas,particularmente las células del cumulus y la corona ra-diata y la zona pellucida (ZP) hasta alcanzar el cito-plasma. Los espermatozoides sufren la exocitosis acro-somal (EA), evento que permite la liberación deenzimas acrosomales que asisten al espermatozoide enel proceso, así como la redistribución de proteínas endiferentes subregiones de la gameta y el consecuentedesarrollo de capacidad fusogénica del segmento ecua-torial, que participaría en la fusión con el oolema (1-3).

En las últimas décadas, mucho se ha avanzado en re-lación al conocimiento de las bases de este proceso; sinembargo, los mecanismos moleculares involucradosaún no han sido dilucidados en su totalidad. La identi-ficación y caracterización de las moléculas que partici-pan en el proceso de fecundación así como la com-prensión de los mecanismos que regulan su expresióny funciones pueden contribuir no solo a comprender losmecanismos involucrados en la interacción espermato-zoide-ovocito, sino también al mejoramiento de las he-rramientas actuales para el manejo de las gametas, el de-sarrollo de nuevas alternativas para el diagnóstico ytratamiento para la infertilidad humana y nuevos mé-todos anticonceptivos.

REQUERIMIENTOS DE TEMPERATURA Y DEIONES CALCIO EN LOS PROCESOS DECAPACITACIÓN Y DE EXOCITOSIS ACROSOMAL

Los eventos de la capacitación y la EA se encuentranestrechamente relacionados, situación que hace difi-cultosa la evaluación de los mecanismos y los compo-nentes involucrados de manera independiente. En un

proyecto orientado a disociar estos procesos, evaluamoslos requerimientos de temperatura e iones Ca2+ para suocurrencia en condiciones in vitro en el modelo del es-permatozoide humano. Los resultados de estos estudiosrevelaron que la incubación de los espermatozoides a 20°C impide la capacitación espermática pero es sufi-ciente para sontener una respuesta a la inducción de laEA por un inductor fisiológico (fluido folicular) en es-permatozoides previamente capacitados (4). Los estu-dios permitieron determinar además el requerimientode concentraciones diferenciales de iones Ca2+ en el me-dio de incubación de los espermatozoides in vitro parala ocurrencia de ambos eventos: mientras 0,22 mM essuficiente para el desarrollo de eventos asociados a la ca-pacitación (niveles de fosforilación en proteínas fosfo-riladas en residuos tirosina y motilidad hiperactivada),se necesitan concentraciones mayores del catión diva-lente (al menos 0,58 mM) para producir la máxima res-puesta de las gametas a la inducción de la EA mediadapor el fluido folicular y para obtener la máxima tasa deunion a la ZP (5). La formulación de medios de cultivocon cantidades diferenciales de ión Ca2+ permitió abor-dar otros estudios, entre ellos identificar anticuerpos an-tiespermáticos inductores de la EA en sueros de muje-res en consulta/tratamiento por infertilidad ydeterminar su efecto sobre la interacción espermáticasobre componentes de la ZP (6)(7), así como determi-nar que la chaperona Grp78/Bip, que se incoporaría alespermatozoide durante la capacitación, modula la in-teracción entre ambas gametas de manera dependientede los iones Ca2+ (8 ver en detalle más adelante). Te-niendo en cuenta que los medios de cultivo para manejode espermatozoides en general tiene concentracionesmilimolares de iones Ca2+ (2 mM), la formulación demedios de cultivo con cantidades diferenciales del catióndivalente podrán impactar en el manejo de patologíasespermáticas, entre ellas la ocurrencia prematura de lacapacitación y/o EA.

PROTEÍNAS INVOLUCRADAS EN LAMOTILIDAD DEL ESPERMATOZOIDE: KINASASDEPENDIENTES DEL IÓN CALCIO EN ELESPERMATOZOIDE HUMANO

Los mecanismos involucrados en la regulación de lamotilidad del espermatozoide de mamíferos no se co-nocen totalmente. Los estudios mencionados en la sec-ción anterior (5) revelaron que los iones Ca2+ jueganun rol clave en el mantenimiento de la motilidad. Sinembargo, los mecanismos subyacentes a este fenómenono han sido dilucidados. Dado que los iones Ca2+ pue-den unirse a calmodulina y este complejo regula la ac-tividad de muchas enzimas, entre ellas las proteinas ki-nadas dependiente de Ca2+/calmodulina (CaM kinasas),desarrollamos un estudio iniciado como parte de la te-sis doctoral de la Dra. C. Marín Briggiler y luego com-pletado de manera conjunta con el grupo liderado por



el Dr. P. Visconti, en ese momento miembro de la Univ.de Virgina, EEUU. En el mismo, evaluamos la relevanciade la presencia de iones Ca2+ en el medio de incubaciónpara la motilidad de los espermatozoides humanos y es-tudiamos la participación de las proteínas CaM kinasas enla motilidad. Los estudios confirmaron el requerimientode los iones Ca2+ en el medio de incubación para elmantenimiento de la motilidad, determinándose queuna concentración de 0,22 mM del ión divalente es su-ficiente para su mantenimiento. La participación de lasCaM kinasas en la regulacion de la motilidad espermá-tica dependiente de los iones Ca2+ fue confirmada a tra-vés del uso de inhibidores de estas kinasas (activos:KN62, KN93; inactivos: KN04 y KN92), observándoseuna disminución significativa en el porcentaje de es-permatozoides mótiles; en particular, la incubación conel KN62 condujo a una reducción significativa en los va-lores de los parámetros cinemáticos y afectaron negati-vamente de manera significativa la cantidad de ATP enla gameta, pero no alteraron la viabilidad celular, la fos-forilación global en residuos tirosina y la respuesta delas células a inductores fisiológicos de la EA. Final-mente, estudios adicionales permitieron a detectar unaforma de 61 KDa para la proteína kinasa IV Ca2+ /cal-modulina-dependiente (CaM kinasa IV) espermática,que fue localizada en el flagelo; los estudios además de-mostraron un aumento de su actividad durante la ca-pacitacion y su inhibición con KN62 (9).

ADQUISICIÓN DE PROTEÍNAS DURANTE LACAPACITACIÓN: LA CHAPERONA Grp78/BiP

Como se mencionara previamente, los espermato-zoides completan la adquisición de su capacidad fe-cundante durante su tránsito por el tracto reproductorde la hembra (1-3). Numerosas evidencias sugieren queel entorno oviductal tiene un rol esencial en las etapasfinales de la adquisición de competencia funcional delas gametas que llevan al éxito de la fecundación. Los es-permatozoides que llegan al oviducto, interactuan conlas células del epitelio oviductal y con sus secreciones,habiéndose observado un efecto del medio condicio-nado de cultivos de estas células en la preservación dela vitalidad y motilidad espermáticas, así como en la es-timulación de eventos relacionados con la capacitaciónen animales, especialmente en el modelo bovino (10).Sin embargo, los efectos sobre la capacitación en elmodelo humano no son concluyentes (11). Teniendoen cuenta evidencias previas que demostraron la de-tección de una forma secretoria la chaperonaGrp78/BiP (Glucose regulated protein 78/ Binding immu-noglobulin Protein) y hallazgos preliminares en nuestro la-boratorio sobre su detección en el fluido folicular, rea-lizamos un proyecto en colaboración con la Dra. V.Corrigal y col. del King’s College London School of Medicine(Londres, Reino Unido) para estudiar su expresión en

tejidos y secreciones del oviducto humano y evaluar suasociación al espermatozoide y su rol en eventos rela-cionados con la fecundación. En cortes histológicos delas secciones del isthmus y ampulla del oviducto hu-mano, la Grp78/BiP fue inmunolocalizada en las cé-lulas oviductales de ambas regiones, presentando ma-yor señal en la última. La forma secretoria de estachaperona fue inmunodetectada en perfiles electro-foreticos de proteínas de fluido oviductal y de mediocondicionado de cultivos de células de tejido tubariohumano. El análisis de los fluidos recuperados en di-ferentes momentos del ciclo menstrual además revelóla presencia de mayores niveles de Grp78/BiP en el pe-ríodo periovulatorio. Asimismo, Grp78/BiP recombi-nante se asoció a la región acrosomal de la cabeza delespermatozoide humano capacitado y demostró tenerun rol modulador de la interacción entre las gametasde manera dependiente de los iones. Ca2+. Los resul-tados obtenidos concordaron con dos informes publi-cados durante el curso de la investigación en el modelohumano que describieron formas secretorias de la cha-perona, su expresión en el oviducto y su capacidad deinteractuar con el espermatozoide (12)(13). El estudiocompletado por nuestro grupo reportó, por primeravez, la secreción de la Grp78 por las células epitelialesoviductales humanas, así como demostró su asocia-ción a la región del capuchón acrosomal del esper-matozoide y presentó evidencias de su rol moduladorde la activación de la gameta en eventos de la fecun-dación (Figura 1).

PROTEASAS ESPERMÁTICAS Y EL PROCESODE LA FECUNDACIÓN:PROACROSINA/ACROSINA

La participación de proteasas de tipo tripsina en lainteracción de gametas fue propuesta a partir de estu-dios que revelaron la capacidad de los inhibidores detripsina de bloquear la penetración espermática delovocito (14). De las proteasas acrosomales de este tipo,una de las más abundantes y estudiadas es Acrosina(EC 3.4.21.10), una endoproteasa con sitio activo de se-rina y especificidad por las uniones peptídicas de resi-duos Arginina o Lisina. Acrosina se sintetiza y almacenacomo zimógeno inactivo (proacrosina) en el acrosomade las espermátidas redondas de todos los mamíferos es-tudiados y se activaría durante la EA en el sitio de la fe-cundación (15)(16).

En estudios realizados por nuestro grupo de investi-gación, el sistema proacrosina/acrosina fue immuno-localizado en la región apical de la cabeza y corres-pondiente al gránulo acrosomal de espermatozoidespermeabilizados no capacitados y capacitados, mientrasque luego de la EA se observó inmunoreactividad en laregión ecuatorial o desaparición de la señal para laproteasa. Dado que la secuencia aminoacídica de pro-


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acrosina no indica la presencia de regiones transmem-brana, la proteasa no estaría asociada directamente a lamembrana del acrosoma y sería un componente de lamatriz acrosomal. La proenzima humana puede ser ex-traída de espermatozoides utilizando soluciones ácidasque permiten disociar complejos formados con proteí-nas acrosomales y con el agregado de inhibidores deproteasas para prevenir su activación. En electroforesisbajo condiciones reductoras, proacrosina humana mi-gra como una forma doble de Mr 53.000-55.000 y58.000-61.000, igual tamaño molecular que el observadoen ensayos de zimografía de extractos ácidos. La acti-vación de la proenzima seguiría el mecanismo pro-puesto para la isoforma de cerdo, observándose formasde 52 kDa y 34 kDa que representarían el intermedia-rio α-acrosina y la proteasa activa β-acrosina, respecti-vamente, además de otras formas de procesamiento de22-24 y 16 KDa. Su activación puede ser completamenteinhibida en presencia de benzamidina, sugiriendo laparticipación de serina proteasas en el mecanismo deactivación. Si bien proacrosina purificada tiene capaci-dad de autoactivarse in vitro, el proceso de activación enel acrosoma estaría regulado por otros factores. En par-ticular, estudios conjuntos entre nuestro laboratoriocon el grupo del Dr Coronel de la Universidad de Cór-doba, Argentina, revelan que tanto la activación comola actividad de la proteasa humana presente en extrac-tos ácidos serían inhibidas por la proteína caltrin delplasma seminal (16-18).

En relación a las funciones del sistema proacro-sina/acrosina, estudios realizados utilizando el modelode knock out indicaron que esta enzima no sería esencialpara el proceso de fecundación (19)(20). Sin embargo,los espermatozoides deficientes en proacrosina/acrosinamostraron un retraso en la penetración de la ZP nor-males y en ensayos de competencia espermática no fe-cundaron al ovocito (20). Estudios complementariosllevaron a proponer su participación en la activa-ción/liberación de los contenidos acrosomales durantela EA. En concordancia con estas observaciones, se iden-tificaron alteraciones en los patrones de activación deproacrosina de espermatozoides de individuos subférti-les sin alteraciones en los parámetros seminales y conuna capacidad disminuida de fecundar ovocitos in vitro(21) así como un anticuerpo monoclonal dirigido con-tra el dominio de activación de la proenzima produjouna inhibición del porcentaje de espermatozoides hu-manos reaccionados sobre la ZP homóloga (22).

Además de su función de proteasa, el sistema proa-crosina/acrosina tendría un rol en el reconocimiento yunión del espermatozoide a glicoproteínas de la ZP ho-móloga (15); sin embargo, los estudios en el modelo hu-mano eran escasos. Empleando ensayos de unión en fasesólida (Ligand blot y ensayo en placa de poliestireno) secompletaron una serie de experimentaciones para ca-racterizar la interacción entre proacrosina/acrosina hu-



Figura 1. Expresión de Grp78 en el oviducto humano, su incorpora-ción al espermatozoide humano y efecto sobre la interacción de lasgametas. A. Inmunolocalización de Grp78 en secciones de trompade Fallopio (isthmus y ampulla) humanas utilizando anticuerpo antiGrp78 (Santa Cruz Biotech) 2 mg/mL, anti conejo marcado con FITC(1:100), y contratinción con ioduro de propidio. Como control se in-cluye tinción con IgG de conejo 2 μg/mL. B. Unión de Grp78 re-combinante (Grp78 rec) a espermatozoides humanos. Los esperma-tozoides capacitados por 4 h se incubaron con Grp78 rec (100 μg/mL)o PBS (control) por 4 h adicionales, fueron lavados para eliminar laproteína no unida y procesados para inmunocitoquímica. Se utilizóanti Grp78(Santa Cruz Biotech) 20 μg/mL, anti conejo marcado conCY3 (1:750). C. Efecto de la incubación de espermatozoides sobrela interacción con la ZP. Los espermatozoides mótiles fueron incu-bados por 4 h en condiciones capacitantes y expuestos a Hemizo-nae (HZ) en presencia de diferentes concentraciones de Grp78 rec.La HZ correspondiente fue incubada con PBS como control. Luegode 4 h de incubación, se removieron los espermatozoides débilmenteunidos y se contaron los espermatozoides unidos por HZ. Se reali-zaron ensayos con 100 μg/mL de β-galactosidasa como control. Losresultados se expresan como media ± EEM; n ≥ 7. * P < 0.05 vs.control. El experimento fue realizado en medio conteniendo Ca2+ oSr2+ (datos de ref. 8).

mana y glicoproteínas de la ZP homóloga. Para los es-tudios se utilizó proacrosina/acrosina recuperada deespermatozoides y glicoproteínas obtenidas de ovocitoshumanos de descarte de programas de fecundación invitro, así como formas recombinantes de proacrosina(Rec-40) y productos truncados de su expresión (Re-30,Rec-20, Rec-10. Rec-6) generados en bacterias y glico-proteínas recombinantes de la ZP expresadas en célulasCHO (rec-hZPA, rec-hZPB, rec-hZPC). Los estudios re-velaron la capacidad máxima de Rec-40 de interactuarprincipalmente con rec-hZPA, en concordancia con es-tudios en otras especies y demostraron el rol de los azú-cares fucosa y manosa, presentes en los oligosacáridos dela ZP, en la interacción con la proenzima (23-25).

Teniendo en cuenta las funciones identificadas para elsistema de proacrosina/acrosina y que anticuerpos con-tra proteínas espermáticas han sido asociados a infertili-dad humana, resultó relevante determinar la incidenciade anticuerpos contra el sistema proacrosina/acrosina enel suero de las mujeres en consulta por infertilidad. Em-pleando un ensayo de ELISA con la proacrosina hu-mana recombinante (Rec-40) como antígeno (ELISA-Acro), se determinó una incidencia del 19% sobre untotal de 179 sueros con anticuerpos contra el sistema dela proteasa. Una evaluación en paralelo realizada con elmétodo de rutina de diagnóstico de infertilidad inmu-nológica (ensayo de immunobeads, IBT), arrojó resul-tados similares (incidencia de anticuerpos antiespermá-ticos contra proteínas espermáticas de superficie: 20%).Sin embargo, de los sueros antiacrosina positivos, sólo 6fueron IB positivos, indicando que el ensayo clínico de ru-tina no permite predecir la presencia de anticuerpos an-tiacrosina. Estudios complementarios permitieron iden-tificar un grupo de sueros que sólo reconocieron laregión C-terminal de proacrosina, involucrada en el me-canismo de activación de la proenzima y en la interacciónde proacrosina con componentes de la ZP. Todos esossueros afectaron la unión de proacrosina recombinantea la proteína ZPA y en algunos casos también inhibieronla activación de la proenzima (26) (Figura 2). Estos es-tudios, en conjunto con los que realizamos usando un an-ticuerpo monoclonal contra la proenzima que mostraronun comportamiento similar y que inhibieron la EA (22),sugirieron el posible efecto deletéreo de los anticuerposanticrosina sobre la fertilidad. Empleando un modelo ex-perimental murino de inmunización genética contraproacrosina humana, se comprobó la respuesta humoralhacia la proacrosina/acrosina humana en los animales in-munizados, determinándose además la capacidad deesos anticuerpos generados de afectar la activación deproacrosina y de bloquear la interacción con la rec-hZPA;asimismo, los anticuerpos inhibieron de forma dosis-de-pendiente la fecundación in vitro y afectaron la fertilidadin vivo de los ratones, observándose un menor númerode crías en las hembras inmunizadas y de un tamaño sig-nificativamente menor que las nacidas de hembras con-

troles (27), confirmando su efecto negativo sobre la fer-tilidad e indirectamente la relevancia de este complejoenzimático en el proceso de la fecundación.

EXPRESIÓN DE MIEMBROS DE LASCADHERINAS CLÁSICAS EN TEJIDOSREPRODUCTIVOS Y GAMETAS Y EVALUACIÓNDE SU PARTICIPACIÓN EN LA FECUNDACIÓN

La adhesión célula-célula regula numerosos procesoscomo el crecimiento, la movilidad, la diferenciación yla supervivencia de las mismas. Las cadherinas confor-man una superfamilia de glicoproteínas transmem-brana que intervienen en la unión célula-célula en


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Figura 2: El sistema proacrosina/acrosina. Detección de anticuerposen el suero de mujeres en consulta por infertilidad y reactividad adistintas regiones de la proenzima. A. Detección de anticuerpos anti-proteínas espermáticas de superficie, mediante “Immunobead BindingTest” (IBT) y anticuerpos anti-proacrosina/acrosina, mediante ELISAindirecto (ELISA-Acro). Se analizaron los sueros de 179 mujeres enconsulta por infertilidad, 36 (20%) presentaron anticuerpos contra an-tígenos de superficie según ensayo de IBT (>50% de espermatozoidesunidos a microesferas) y en 34 (19%) se detectaron anticuerpos anti-proacrosina, según ensayo de ELISA-Acro. Sólo en 6 pacientes se en-contró concordancia entre ambos ensayos. B. Análisis de las regionesde proacrosina reconocidas por los anticuerpos presentes en pacien-tes en consulta por infertilidad. Los sueros en los que se detectaronanticuerpos anti-proacrosina (n=34) utilizando proacrosina recombi-nante humana (Rec-40; aa 1-402) como antígeno fueron enfrentadosa segmentos de la proteína truncados en el extremo C-terminal: Rec-30 (aa 1-300), Rec-20 (aa 1-190) y Rec-10 (aa 1-160). De los 34 sue-ros analizados, 25 presentaron reactividad contra Rec-30 y 9 recono-cieron a Rec-20 y Rec-10. En línea de puntos se indica el valor de corteestablecido para el ensayo (DO=0,270) (datos de ref. 26).

forma dependiente de iones Ca2+. Dentro de la familiade las cadherinas Tipo I o clásicas, se encuentran la cad-herina epitelial (uvomorulina, CAM120/80; cadE) y lacadherina neural (cadN). Como el resto de los miem-bros de la familia, poseen 5 dominios extracelulares cad-herina (EC1-EC5), un dominio único transmembranay un dominio citoplasmático. Los dominios cadherinaextracelulares participan en las interacciones con mo-léculas de cadherina en la superficie de células adya-centes; una vez más los iones Ca2+ cumplen un rolclave, dado que su unión a sitios específicos cambia laconformación de la proteína haciendo que el dominioEC1 adquiera rigidez y permita la interacción entrecadherinas. Por su parte, el dominio citoplasmáticoune a la cadherina con moléculas adaptadoras, entreellas β-catenina, y a través de ellas interactua con la redde filamentos de actina, para estabilizar la adhesión ce-lular; esta región de la proteína también está involu-crada en el tráfico y señalización celular (28)(29).

Dado que cadE y cadN participan en la adhesión ce-lular dependiente de iones Ca2+y que el proceso de lafecundación involucra eventos de adhesión celular en-tre células somáticas y gametas y entre gametas entre síque requieren de la presencia de este catión divalente,surgió el interés de caracterizar la expresión de ambasmoléculas de adhesión en tejidos reproductivos y ga-metas y evaluar su posible participación en la fecunda-ción; al inicio del proyecto, los estudios reportados so-bre su presencia en las gametas eran escasos y el estudiode su rol en la fecundación no tenía antecedentes. Laexpresión de cadE en el epidídimo fue confirmada,determinándose la presencia del transcripto, así comola proteína en las células principales del epitelio epidi-dimario y la forma completa de Mr 120.000 en extrac-tos proteicos del epidídimo y de espermatozoides. CadEfue inmunolocalizada en espermatozoides no capacita-dos, capacitados y reaccionados, en regiones subcelu-lares que participan en la interacción gamética en par-ticular en la membrana plasmática del ovocito; laproteína adaptadora β-catenina acompañó la localiza-ción de cadE. En ensayos in vitro de interacción de ga-metas (ensayo de Hemizona para evaluar la interac-ción espermática con la ZP y ensayo de penetración deovocitos de hámster sin ZP para evaluar la unión y fu-sión del espermatozoide al ovocito) los anticuerposanti-cadE inhibieron de manera significativa la unióndel espermatozoide a componentes asociados a la es-tructura de la ZP y la penetración de los espermatozoi-des a ovocitos de hámster (30). Asimismo, se identificóla presencia y colocalización en el espermatozoide deun modulador negativo de las funciones de cadE, la pro-teína disadherina e inicialmente identificada principa-mente en células tumorales invasivas (31).

Los estudios sobre cadN confirmaron la expresiónde la molécula de adhesión en el testículo y permitie-ron determinar los niveles de expresión del trans-

cripto en la gonada y el epidídimo. Asimismo, las eva-luaciones revelaron la presencia de la forma completade cadN de 135 KDa en extractos de testículo y esper-matozoides eyaculados. La proteína fue inmunoloca-lizada en el capuchón acrosomal de espermatozoidesno capacitados y capacitados, mientras que se localizóen el segmento ecuatorial de los reaccionados. Asi-mismo, cadN fue localizada en la superficie del ovo-cito. La preincubacion de los espermatozoides conanticuerpos específicos no afectó su capacidad de in-teractuar con la ZP pero produjo una inhibición sig-nificativa de la penetración de los ovocitos de hámster,permitiendo proponer un rol para cadN en eventosque llevan a la fusión del espermatozoide al ovocito(32) (Figura 3).

Los estudios para ambas proteínas se han extendidoa los modelos murino (Veiga et al, resultados no publi-cados) y bovino (Caballero et al., en consideración; Ar-zondo et al., resultados no publicados), obteniéndose re-sultados que apoyan los encontrados en el modelohumano.



Figura 3. Cadherinas epitelial y neural. Inmunodetección en game-tas humanas. Inmunolocalización de cadE y cadN en espermato-zoides y ovocitos humanos A. Los espermatozoides fueron seleccio-nados y posteriormente fijados y sometidos a ensayos deinmunocitoquímica y registro por microscopía laser confocal. B. In-munodetección de cadE y cadN en ovocitos humanos de descarte deprogramas de reproducción asistida sin ZP (estudios realizados encolaboración con el centro CEGYR) y evaluación empleando mi-croscopía laser confocal. En A. y B. se emplearon los anticuerpos anticadE (H-108) y anti cadN (H-63) (2 μg/mL, Santa Cruz Biotech) se-guido de incubación con anti conejo marcado con CY3 (1:750). Comocontrol se incluyó tinción con IgG de conejo 2 μg/mL (datos no mos-trados) (datos de ref. 30 y 32).

CADHERINA EPITELIAL Y LA PROGRESIÓNTUMORAL. ALTERACIONES EN LA ADHESIÓNCELULAR MEDIADA POR CADHERINAEPITELIAL. ESTUDIOS EN LÍNEAS CELULARES

La alteración de la adhesión celular es un mecanismoclave en la progresión tumoral y en los procesos de me-tástasis; como parte de ese proceso, en numerosos cán-ceres se han identificado anormalidades en la expresiónde cadE, la que se asocia de manera inversa a la agresi-vidad del tumor. La pérdida de cadE en las células trans-formadas impide la formación de las uniones adheren-tes y les permite ignorar el ordenamiento tisular, infiltrarel estroma y eventualmente migrar hacia otros sitios. Lasupresión de la adhesión célula-célula puede disparar laliberación de células tumorales del tumor primario yconferirle propiedades invasivas. Los cambios en la ex-presión de cadE inducen respuestas celulares que llevana la conversión de las células epiteliales en células con ca-racterísticas mesenquimales, con un aumento de la mo-tilidad y la invasividad, en un proceso llamado transiciónepitelio-mesenquimal (EMT, por sus siglas en inglés Epit-helial-Mesenchymal Transition) (33).

La presencia de alteraciones en la expresión de cadEha sido documentada en numerosos tumores de diversosorígenes tisulares. Particularmente, el cáncer de mama esla causa principal de mortalidad por cáncer en mujeres,representando el 14%; es el tipo de cáncer más comúnen las mujeres y representa el 23% de los canceres fe-meninos. Se ha descripto que la disminución parcial o to-tal de cadE se asocia con la pérdida de características dediferenciación, la adquisición de invasividad celular, unmayor grado tumoral, un comportamiento metastásicode las células y un pronóstico pobre. Los estudios in vi-tro demuestran que las líneas celulares de cáncer hu-mano con morfología epiteloide y diferenciada expresancadE y son poco invasivas, mientras que las líneas con unamorfología del tipo fibroblastoide son invasivas y han per-dido la expresión de cadE. Como parte de los proyectosdesarrollados por nuestro grupo en este área de investi-gación, se caracterizó la expresión de cadE y de proteí-nas relacionadas en las líneas celulares IBH-6 e IBH-4.Ambas líneas celulares fueron desarrolladas en el IBYMEpor la Dra. I.Luthy y col. a partir de carcinomas ductalesinfiltrantes de mama humanos. Como parte de los re-sultados, se identificó una forma distintiva de cadE de 89KDa, truncada en el extremo C-terminal y presente en ba-jos niveles (<30% de la forma completa en células MCF-7),determinándose además la presencia de niveles de trans-cripto de cadE aproximadamente 1000 veces menoresque en MCF-7. CadE presentó una localización intrace-lular puntillada y se contrapuso a la típica localizaciónproteica en los bordes celulares y sitios de contacto enMCF-7; β-catenina acompañó a cadE y se identificaroncambios en la estructura de los filamentos de actina condetección de fibras de estrés de actina y una disminuciónde las adhesiones focales. Estos cambios son característi-

cos de la transformación celular y sugieren una reorga-nización dinámica del citoesqueleto celular (Figura 4).Los estudios se han extendido a la evaluación de mode-los experimentales de cáncer murino de mama (Lapyckyjet al, manuscrito en elaboración), y de vejiga (Lapyckyj etal., manuscrito en elaboración). En colaboración con elgrupo liderado por el Dr. J Reventós y col. del Hospitalde Vall d’Hebron de Barcelona, España, nos encontra-mos estudiando diversos modelos de estudio de cáncerde endometrio y de ovario (análisis en curso). Los mo-delos serán empleados en el estudio de las bases mole-culares del cáncer y podrán ser utilizados en el diseño deestrategias y herramientas para su diagnóstico y trata-miento.

En conclusión, los proyectos abordados por nuestro grupo deinvestigación han contribuido a la comprensión de los eventosde interacción de las gametas durante la fecundación, así comoentre las células somáticas durante la progresión tumoral.


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Figura 4. Expresión de miembros del complejo adherente: cadherinaepitelial, β-catenina y actina filamentosa en líneas celulares de cán-cer de mama humano. Análisis de localización de miembros del com-plejo adherente (cadE, β-catenina y actina filamentosa) líneas celularesde cáncer de mama humano IBH-4, IBH-6 y MCF-7. A. Inmunocito-química de fluorescencia y análisis por microscopía laser confocal decadE (HECD-1, Zymed seguido de incubación con anti conejo marcadocon CY3 1:750) en células IBH-6, IBH-4 y MCF-7. B. Detección deactina filamentosa (F-actina, verde) con faloidina-FITC (InvitrogenLife Technologies) en ensayos de colocalización con β-catenina(610153, BD Biosciences 1:1000), seguido de incubación con anticonejo marcado con CY3 1:750). Como control se incluyó tinción conIgG de conejo o ratón agregado a la misma concentración que el pri-mer anticuerpo específico (datos no mostrados) (datos de ref. 34).

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LABORATORIO DE MECANISMOS MOLECULARES DE CARCINOGÉNESIS

Interacciones entre factores de crecimiento(GFs) y el receptor de progesterona (PR) encáncer de mama.

Growth factors (GFs) and progesteronereceptor (PR) crosstalks in breast cancer

Interações entre fatores de crescimento(GFs) e o receptor de progesterona (PR)em câncer de mama.

Patricia V. Elizalde, Cecilia Proietti, RoxanaSchillaci, Maria E. Balaña, Leticia Labriola, Mariana Salatino, Wendy Béguelin, Romina Carnevale, Celeste Díaz Flaqué, Eduardo H. Charreau

Resumen

En trabajos previos hemos demostramos la existencia de in-teracciones bi-direccionales entre las vías de los progestá-genos y de la heregulina (HRG) en cáncer mamario. Encon-tramos que los progestágenos regulan la actividad y expresióndel ErbB-2 y de la HRG. Describimos que la interacción en-

tre la vía de la progesterona y de la HRG ocurre a nivel delPR que es activado transcripcionalmente por la HRG. Ade-más encontramos que los progestágenos inducen la activa-ción transcripcional de la proteína transductora de señalesy activadora de la transcripción 3 (Stat3), que es un requi-sito para el crecimiento inducido por progestágenos en cán-cer mamario. Demostramos que Stat3 es un punto de con-vergencia entre las vías de PR y de HRG/ErbB-2 en cáncerde mama, ya que la HRG, a través del ErbB-2, induce la ac-tivación de Stat3 mediante la integración del PR como mo-lécula señalizadora. En línea con estos resultados, descri-bimos la función de Stat3 como coactivador del PR activadopor progesterona y como integrante de un complejo trans-cripcional en donde ErbB-2 actúa como coactivador deStat3 sobre el promotor de ciclina D1. Estos resultadosproveen nuevos blancos moleculares como terapéuticas al-ternativas para el tratamiento del cáncer de mama resistentea las terapias anti-hormonales y anti-tirosina quinasa.

Palabras clave: cáncer de mama * receptor de progesterona *

ErbB2 * heregulina

Summary

Accumulating findings, including ours, have proven the pre-sence of bidirectional interactions between progestins andheregulin (HRG) signaling pathways in breast cancer. On theone hand, we showed that PR activates the HRG/ErbB-2pathway. On the other, we found that HRG induces PR trans-criptional activation. We have provided the first demonstra-tion that progestins induced transcriptional activation of thesignal transducer and activator of transcription 3 (Stat3),which is an absolute requirement for progestin-mediated invitro and in vivo breast cancer growth. We have identifiedStat3 as a convergence point between PR and HRG/ErbB-2signaling pathways in breast cancer, given that Stat3 is acti-vated by HRG via ErbB-2 and through the co-option of PRfunction as a signaling molecule. In line with these results,we have described Stat3 as a coactivator of ligand activated-PR and as part of a novel transcriptional complex whereErbB-2 functions as a Stat3 coactivator in progestin-inducedcyclin D1 promoter activation. These results provide novelmolecular targets as alternative therapies for breast cancerresistant to anti-hormonal and anti-tyrosine kinase therapies.Key words: Breast cancer * progesterone receptor * ErbB2 *

heregulin ErbB2

Resumo

Em trabalhos prévios temos demonstrado a existência deinterações bidirecionais entre as vias dos progestágenos e daheregulina (HRG) em câncer mamário. Encontramos que osprogestágenos regulam a atividade e expressão do ErbB-2 eda HRG. Descrevemos que a interação entre a via da proges-terona e da HRG ocorre em nível do PR que é ativado trans-cricionalmente pela HRG. Além disso encontramos que os pro-gestágenos induzem a ativação transcricional da proteínatransdutora de sinais e ativadora da transcrição 3 (Stat3), queé um requisito para o crescimento induzido por progestágenosem câncer mamário. Demonstramos que Stat3 é um ponto


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de convergência entre as vias de PR e de HRG/ErbB-2 emcâncer de mama, já que a HRG, através do ErbB-2, induz aativação de Stat3 mediante a integração do PR como molé-cula sinalizadora. Em linha com estes resultados, descreve-mos a função de Stat3 como coativador do PR ativado porprogesterona e como integrante de um complexo transcri-cional onde ErbB-2 atua como coativador de Stat3 sobre opromotor de ciclina D1. Estes resultados fornecem novosalvos moleculares como terapêuticas alternativas para o tra-tamento do câncer de mama resistente às terapias anti-hor-monais e anti-tirosina quinase.

Palavras chave: câncer de mama * receptor de progestero-

na * ErbB2 * heregulina

Los efectos de la progesterona en la glándula ma-maria son controversiales debido a la complejidad es-tructural y funcional de este órgano. Dependiendo delmodelo experimental, del contexto celular y de la du-ración del tratamiento, la progesterona puede ejercerefectos proliferativos o antiproliferativos en el creci-miento del epitelio mamario. Se ha hipotetizado que,luego de una ronda de proliferación, el pulso inicial deprogesterona actúa como un factor iniciador para las ac-ciones de factores secundarios involucrados en vías pro-liferativas, de diferenciación o apoptóticas. Entonces, se-rían los múltiples factores secundarios que regulan elcrecimiento y desarrollo de un tumor de mama, encombinación con la progesterona, los que contribuyencon esta variedad de efectos (1).

Nuestro laboratorio trabaja en el estudio de las in-teracciones funcionales entre hormonas esteroideas,en particular la progesterona, GFs y factores de trans-cripción en cáncer de mama. En este campo de in-vestigación hemos demostrado la existencia de inte-racciones bi-direccionales entre los caminos detransducción de señales de los progestágenos y de laheregulina (HRG), proteína ligando de los recepto-res con actividad de tirosina quinasa tipo I (RTKs tipoI). Específicamente hemos encontrado que los pro-gestágenos regulan la actividad y expresión de los RTKs,tipo I (ErbB-1, ErbB-2, ErbB-3 y ErbB-4) y de su li-gando, HRG, en cáncer de mama, en modelos de ratóny humanos (2). Encontramos también que existe una in-teracción jerárquica funcional entre el ErbB-2 y el re-ceptor del factor de crecimiento semejante a la insulinatipo I (IGF-IR), perteneciente a los RTKs tipo II, en elcáncer de mama (3). Este trabajo demostró por primeravez que el IGF-IR dirige la activación del ErbB-2,abriendo una nueva posibilidad de intervención tera-péutica en cáncer de mama resistente a estrategias debloqueo del ErbB-2.

Con el fin de investigar la participación de los pro-gestágenos y del PR en la progresión tumoral, estudia-mos la regulación de caveolina-1, componente estruc-tural de las caveolas y cuya expresión está asociada a laprogresión y metástasis de tumores de mama y de prós-tata. Reportamos la inducción de caveolina-1 en cáncer

de mama y demostramos su rol en la proliferación in-ducida por progestágenos, constituyendo así un posibleblanco en el tratamiento del cáncer de mama (4).

Nuestro grupo describió que la interacción entre lavía de la progesterona y de la HRG ocurre a nivel del PRque es activado transcripcionalmente por la HRG (5).Esta activación requiere la presencia de un ErbB-2 fun-cional y activo. Esta fue la primera demostración en li-teratura de la activación transcripcional ligando-inde-pendiente del PR.

En nuestra línea de trabajo más reciente nos encon-tramos investigando la formación de complejos multimé-ricos entre receptores de hormonas esteroideas y proteí-nas transductoras de señales y activadoras de transcripción(Stats) en los promotores de genes que participan en laregulación del crecimiento y capacidad metastásica delcáncer de mama. En este campo, hemos demostrado la ca-pacidad de los progestágenos de activar transcripcional-mente a Stat3 (6). Dicha activación es un evento necesa-rio para la proliferación inducida por progestágenos en lascélulas de cáncer de mama humanas y murinas. En líneacon estos resultados, probamos que Stat3 y PR forman uncomplejo transcripcional en donde Stat3 actúa como co-activador del PR en la transcripción de los genes bcl-X yp21CIP1, involucrados en la regulación del ciclo celular in-ducida por progestágenos (7). Evaluamos además la par-ticipación de Stat3 en la red de interacciones bi-direccio-nales entre PR y HRG/ErbB-2 en cáncer de mama.Probamos que la HRG, a través del ErbB-2, induce la acti-vación de Stat3 mediante la integración necesaria del PRcomo molécula señalizadora (8). Más aún, demostramosque la activación de Stat3 es un requisito absoluto en laproliferación inducida por HRG en células de cáncer demama. Stat3 activada actúa así como un factor efector ríoabajo de la vía HRG/ErbB-2 y del PR activado indepen-diente de su ligando para estimular la proliferación delcáncer de mama. Esta interacción entre ErbB-2, PR y Stat3necesaria para el crecimiento del cáncer de mama, juntocon los novedosos y recientes resultados sobre la localiza-ción nuclear del ErbB-2 y su función como reguladortranscripcional, nos impulsaron a estudiar la localizaciónnuclear del ErbB-2 inducida por progestágenos y la aso-ciación física y funcional con Stat3 a nivel nuclear (9).Nuestros resultados describen por primera vez que losprogestágenos inducen el ensamblado de un complejotranscripcional integrado por Stat3/ErbB-2 en dondeErbB-2 actúa como coactivador de Stat3. Dilucidamos ade-más la presencia del PR en este complejo. Probamos quela función de ErbB-2 como coactivador de Stat3 regula latranscripción del gen de ciclina D1, inducido por proges-tágenos y esencial para el crecimiento del cáncer de mama.El bloqueo de la translocación de ErbB-2 mediante latransfección de una forma mutante dominante negativa in-capaz de migrar al núcleo, inhibió la expresión de ciclinaD1 y la proliferación inducida por progestágenos en cé-lulas de cáncer de mama. Nuestros hallazgos revelan una



nueva intervención terapéutica para tumores mamariosPR+/ErbB-2+ que consiste en el bloqueo específico de latranslocación de ErbB-2 al núcleo. Otro campo de activainvestigación en nuestro laboratorio son los efectos no ge-nómicos de los progestágenos en el desarrollo del cáncerde mama. Demostramos que los progestágenos inducen elcrecimiento celular, regulan la actividad de las metalo-proteasas y la metástasis a través de la capacidad del PR deactivar vías de señalización dependientes de la quinasa c-Src (10). Estos resultados sugieren una intervención tera-péutica para tumores PR+ que consiste en el bloqueo es-pecífico de la función del PR como activador de las vías deseñalización.

Actualmente estamos estudiando los efectos no ge-nómicos de los progestágenos en el factor de trans-cripción AP-1, dímero compuesto por Jun y Fos, acti-vados por fosforilación y cuya presencia en tumoresmamarios está asociada a mal pronóstico. Nuestro ob-jetivo es demostrar la activación de AP-1 por progestá-genos y demostrar su participación en la transcripcióndel gen de ciclina D1 que contiene elementos respon-dedores a AP-1 en su promotor.


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LABORATORIO DE CARCINOGÉNESISHORMONAL

Crecimiento del cáncer de mamadependiente de receptores hormonales:aportes de un modelo experimental

Growth of hormone receptor dependentbreast cancer: Contributions of anexperimental modelCrescimento do câncer de mama receptorde hormônio dependente: contribuiçõesde um modelo experimental

Claudia Lanari,Virginia Novaro, Carolina Lamb,Victoria Fabris, Paola Rojas, Sebastián Giulianelli,María Gorostiaga, Victoria Wargon, Tomás Guillardoy,María Laura Polo, Marina Riggio, Gonzalo Sequeira,Ana Sahores, María Pampera

Resumen

Si bien los estrógenos han demostrado tener un rol prota-gónico en el cáncer de mama, hoy se sabe que la progeste-rona, así como sus derivados sintéticos, ejercen roles proli-ferativos tanto en la glándula mamaria normal como


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neoplásica. Utilizando un modelo experimental de cáncermamario murino, iniciado en la Academia Nacional de Me-dicina y trasladado al IBYME en el año 1995, demostramosla importancia de los fibroblastos asociados a tumor en laprovisión de factores de crecimiento que activan en forma li-gando-independiente a los receptores de progesterona (RPs)en las células tumorales. En este artículo mencionamos laimportancia por un lado de la proporción de isoformas del RPen la determinación de la respuesta al tratamiento hormo-nal, y por otro, los mecanismos por los cuales el factor de cre-cimiento fibroblástico 2 (FGF2) estromal participaría en elcrecimiento tumoral imitando la acción de la hormona.

Palabras clave: cáncer de mama * receptores de progeste-

rona * hormono independencia * estroma * factor de creci-

miento fibroblástico * receptores de factor de crecimiento fi-

broblástico

Summary

It is well known that estrogens are key players regulatingbreast cancer growth. In addition, there is compelling evi-dence pointing out that progestins induce proliferative effectsin normal and in neoplastic mammary glands. Using a murinebreast cancer model, first developed in the National Academyof Medicine in Buenos Aires, and then moved to the IBYMEin 1995, we demonstrated that carcinoma associated fibrob-lasts provide growth factors such as fibroblast growth factor 2(FGF2), which are involved in the ligand independent activa-tion of progesterone receptors (PR) of tumor cells. This arti-cle briefly describes, on one hand, the relevance of the eval-uation of the PR isoform ratio to predict hormoneresponsiveness, and on the other hand, the mechanisms bywhich stromal FGF2 mimics the effects of progesterone tostimulate tumor growth.

Key words: breast cancer * progesterone receptors * hormone

independence * stroma,* fibroblast growth factor * fibrob-

last growth factor receptors

Resumo

Embora os estrógenos tenham demonstrado ter um papelprotagônico no câncer de mama, hoje se sabe que a proges-terona, bem como seus derivados sintéticos, exerce papéis pro-liferativos tanto na glândula mamária normal quanto neoplá-sica. Utilizando um modelo experimental de câncer mamáriomurino, iniciado na Academia Nacional de Medicina e trasla-dado ao IBYME no ano 1995, demonstramos a importância dosfibroblastos associados a tumor na provisão de fatores decrescimento que ativam em forma ligando-independente os re-ceptores de progesterona (RPs) nas células tumorais. Neste ar-tigo mencionamos a importância, de um lado, da proporção deisoformas do RP na determinação da resposta ao tratamentohormonal, e do outro, dos mecanismos pelos quais o fator decrescimento fibroblástico 2 (FGF2) estromal participaria nocrescimento tumoral imitando a ação do hormônio.

Palavras chave: câncer de mama * receptores de progeste-

rona * hormônio independência * estroma * fator de cresci-

mento fibroblástico (FGF) * receptores de FGF (FGFR)

Cuando en el año 1983, trabajando en el Laborato-rio de Leucemia Experimental de la Academia Nacionalde Medicina con el Dr. A Molinolo y la Dra. CD Pas-qualini, teníamos ratones BALB/c tratados con acetatode medroxiprogesterona (MPA) para inhibir la fibro-matogénesis inducida por un cuerpo extraño, y apare-cieron carcinomas mamarios, nos sorprendimos. Si bienhabía datos que vinculaban a los progestágenos concáncer de mama, la mayoría de ellos apuntaban a los es-trógenos como hormonas promotoras y/o iniciadorasen cáncer de mama. Hoy, casi treinta años después, noquedan dudas que los progestágenos participan en eldesarrollo del cáncer de mama. El uso de MPA en la te-rapia de reemplazo hormonal fue lo que marcó la di-ferencia. Las evidencias experimentales estaban a lavista sin embargo el consenso se obtuvo después de lapublicación del WHI Study en Estados Unidos en el2002 (1) y del Million Study en Inglaterra 2003 (2)(3),que mostraron claramente un aumento de cáncer demama en mujeres tratadas con ambas hormonas.

Las investigaciones en nuestro laboratorio se basaronen caracterizar este nuevo modelo experimental en elcual la mayor parte de los tumores de mama se clasifi-caron como carcinomas mamarios ductales infiltrantescon expresión de receptores de estrógenos (RE) y deprogesterona (RP) y se mantenían por transplantes sin-geneicos en ratones tratados con hormona. Ocasional-mente surgían variantes tumorales con crecimiento au-tónomo, llamadas hormono-independientes por sucapacidad de crecer sin el aporte exógeno de hormona.Cuando se evaluó la capacidad de los tumores de res-ponder a distintos tratamientos hormonales descubri-mos que muchos de ellos desaparecían casi completa-mente con tratamiento con antiprogestágenos oestrógenos y parcialmente con tamoxifeno. Otros tu-mores eran resistentes desde el comienzo; sin embargo,todos mantenían la expresión de RE y RP. Esto motivóque la mayor parte de las investigaciones de nuestro la-boratorio, ya mudado en 1995 al IBYME se han dedicadoa tratar de comprender los mecanismos por los cuales lostumores se vuelven hormono independientes o se hacenresistentes a la terapia hormonal (revisado en (4)).

Correlación de expresión de isoformas de receptor de progesterona y respuesta altratamiento hormonal

Existen dos isoformas del RP ampliamente recono-cidas que se transcriben a partir del mismo gen: la másgrande es la isoforma B (RP-B) de 115 kDa y la más pe-queña la isoforma A (RP-A) de 83 kDa en ratón y 94 kDaen humanos. La isoforma RP-A se ve más comprometidaen cáncer de mama, ya que hay un mayor porcentaje detumores RP positivos que expresan mayores niveles de



isoforma A que B. A su vez éstos responderían menos altamoxifeno en comparación con los que expresan másisoforma B que A (5). Nuestro grupo demostró que elperfil de isoformas de RP es diferente en carcinomasmamarios con distinta respuesta hormonal. Los tumo-res HI que regresionaban con antiprogestágenos o es-trógenos expresaban altos niveles de RP-A, mientrasque los resistentes constitutivos o los que fueron expe-rimentalmente manipulados para ser resistentes (resis-tencia adquirida) mostraban mayores niveles de RP-B.Eso nos llevó a evaluar el porqué del silenciamiento deRP-A en tumores resistentes. Lo que sabemos al día dehoy es que los tumores resistentes constitutivos muestranmetilación del promotor. Por lo tanto, el tratamiento deestos tumores con agentes desmetilantes, induce la re-expresión de RP-A y la consiguiente recuperación de lasensibilidad a los antiprogestágenos (6). No ocurre lomismo con los resistentes adquiridos, pero en éstos, eltratamiento con estrógenos induce la reexpresión deRP-A, respondiendo ahora a la terapia conjunta de es-trógenos y antiprogestágenos (7). Esta ida y vuelta deRP-A sugiere la presencia de mecanismos regulatoriosepigenéticos más allá de la metilación que se están es-tudiados actualmente en el laboratorio. El mensaje clí-nico de esta parte de nuestro trabajo, es la sugerenciaque aun los tumores que se hicieron resistentes a la te-rapia endócrina pueden ser direccionados para otro ci-clo de tratamiento.

Quién activa a los receptores hormonales cuandolas hormonas no están presentes o lo están enmuy pequeña cantidad?

El otro tema que nos interesó es conocer qué es loque activa a los receptores hormonales en tumores HIde modo tal que el bloqueo de los receptores permitefrenar al crecimiento tumoral. Utilizamos nuestro mo-delo experimental para tratar de contestar este inte-rrogante. Observaciones del laboratorio nos mostra-ban primero, que es muy difícil cultivar estos tumoresen ausencia de fibroblastos, cuando los cultivos estabancontaminados con fibroblastos crecían mucho mejor ypor otro lado, cuando las células tumorales purificadasde un tumor HD o de uno HI eran cultivados en plás-tico, eran indistinguibles entre sí. Esto sugería clara-mente que factores del huésped participan en el creci-miento HI. Uno de los componentes que conforma elestroma tumoral son los fibroblastos asociados a carci-noma (CAF). Postulamos entonces que los CAF de untumor HI producirían factores de crecimiento que ac-tivarían a receptores de las células epiteliales que a suvez interactuarían con RP para activar la proliferacióncelular. Nos concentramos en el factor de crecimientofibroblástico 2 (FGF2) y sus receptores FGFR. Elegi-

mos este factor porque de los varios estudiados en sumomento, fue el único capaz de reemplazar al MPA ensu efecto proliferativo in vitro.

De acuerdo a la hipótesis planteada, demostramosque el estroma del tumor HI es diferente al del tumorHD (8) y que in vitro los CAF de los tumores HI pro-ducen más FGF2 que los tumores HD. El FGF2 porotra parte induce la activación de los RP. Demostramosasimismo que el FGF2 activa al FGFR2 e induce la tras-locación nuclear del mismo de modo que interaccio-naría con el RP junto con STAT5 induciendo la trans-cripción de genes blanco, como MYC y Ciclina D1, y laexpresión de diversas proteínas reguladas por proges-terona. La interacción entre FGFR-2 y RP fue confir-mada por estudios de microscopía confocal, co-inmu-noprecipitaciones y ensayos de EMSA en placa. Paraconfirmar la hipótesis planteada que el eje FGF2-FGFR-2 está involucrado en el crecimiento HI demostramosque el inhibidor de FGFR (PD173074) inhibe el creci-miento HI y que la administración exógena de FGF2 aun tumor HD es capaz de estimular el crecimiento deun tumor imitando la acción de la hormona (9)(10).

Todos estos estudios fueron corroborados en la líneacelular humana T47D que se comportó de manera muysimilar a los tumores de nuestro modelo experimental.Más aun, la transfección constitutiva de un dominanteactivo del FGFR-2 a células T47D logró volverlas tumo-rigénicas al implantarlas en ratones inmunosuprimi-dos en ausencia de hormona (11).

En conjunto estos resultados muestran la participa-ción del estroma en el crecimiento tumoral y sugierenel uso de terapias combinadas incorporando a inhibi-dores de FGFR en conjunto con la terapia endocrinapara demorar la resistencia endocrina.


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LABORATORIO DE HORMONAS Y CÁNCER

Receptoresα2-adrenérgicos y cáncer demama

α2-adrenoceptors and breast cancer

Receptores α2-adrenérgicos e câncer demama

Isabel Alicia Lüthy, Ariana Bruzzone, Cecilia Pérez Piñero, Lilian Castillo

Resumen

El cáncer de mama es la neoplasia más frecuente entre lasmujeres. Las experiencias estresantes causan la liberaciónde adrenalina y noradrenalina, que se unen a 9 receptoresadrenérgicos. Nuestro grupo ha trabajado durante los últimos

años en la caracterización de los receptores α2-adrenérgicosy en el efecto de su estimulación en diferentes modelos ex-perimentales de cáncer de mama para contribuir a mejorarla calidad de vida de las pacientes. En células tumorales yno tumorales mamarias humanas encontramos que las ca-tecolaminas endógenas adrenalina y noradrenalina y el ago-nista específico α2-adrenérgico clonidina estimulan signifi-cativamente la proliferación celular. La inhibición de losniveles de AMP cíclico correlacionan con la estimulación dedichos receptores. Hemos descripto la expresión de por lomenos un subtipo de receptor α2-adrenérgico en estas líneastanto a nivel de ARNm (medida por RT-PCR) como de pro-teína (por inmunocitoquímica y unión de un antagonista ra-diactivo). Además hemos demostrado que los agonistas α2-adrenérgicos aumentan el crecimiento tumoral en modelosexperimentales de cáncer de mama (tumores inducidos ori-ginalmente por acetato de medroxiprogesterona y xeno-transplantes de células tumorales humanas). En todos los ca-sos el antagonista α2-adrenérgico rauwolscina inhibió elcrecimiento de los tumores control, pudiendo pensarse enutilizarlo como terapia adyuvante.

Palabras clave: cáncer de mama * receptores adrenérgicos *

clonidina * rauwolscina

Summary

Breast cancer is the most frequent women neoplasia. Stress-ing experiences enhance adrenalin and noradrenalin re-lease. These catecholamines bind to 9 different adrenocep-tors. Our group has described and characterized theα2-adrenoceptors and analyzed their effect in breast cancermodels in order to contribute to a better quality of life in pa-tients. The stimulation of these receptors with adrenalin, no-radrenalin or α2-adrenergic agonists in both tumor and non-tumor human breast cells significantly stimulates cellproliferation, in correlation with inhibited cyclic AMP levels.At least one α2-adrenergic subtype in expressed in every cellline studied at the mRNA level (by RT-PCR) and at the pro-tein level (immunocytochemistry and a radioactive antago-nist binding). We have also found that the α2-adrenergic ag-onists enhance tumor growth in experimental models ofbreast cancer (transplanted mouse tumors originally in-duced by medroxyprogesterone acetate and human breastcancer cells xenotransplanted in nude mice). In every tumormodel the α2-adrenergic antagonist rauwolscine inhibited tu-mor growth, suggesting the possibility of its utilization as anadjuvant therapy.

Key words: breast cancer * adrenoceptors * clonidine * rau-

wolscine

Resumo

O câncer de mama é a neoplasia mais frequente entre as mu-lheres. As experiências estressantes causam a liberação deadrenalina e noradrenalina, que se unem a 9 receptores adre-nérgicos. Nosso grupo tem trabalhado durante os últimosanos na caracterização dos receptores α2-adrenérgicos e noefeito de sua estimulação em diferentes modelos experi-



mentais de câncer de mama para contribuir a melhorar aqualidade de vida das pacientes. Em células tumorais e nãotumorais mamárias humanas encontramos que as catecola-minas endógenas adrenalina e noradrenalina e o agonista es-pecífico α2-adrenérgico clonidina estimulam significativa-mente a proliferação celular. A inibição dos níveis de AMPcíclico se correlaciona com a estimulação de tais receptores.Temos descrito a expressão de pelo menos um subtipo de re-ceptor α2-adrenérgico nestas linhas tanto em nível de ARNm(medida por RT-PCR) quanto de proteína (por imunocito-química e união de um antagonista radiativo). Além disso te-mos demonstrado que os agonistas α2-adrenérgicos au-mentam o crescimento tumoral em modelos experimentaisde câncer de mama (tumores induzidos originalmente poracetato de medroxiprogesterona e xenotransplantes de cé-lulas tumorais humanas). Em todos os casos o antagonistaα2-adrenérgico rauwolscine inibiu o crescimento dos tumo-res controle, podendo pensar em utilizá-lo como terapia ad-juvante.

Palavras chaves: câncer de mama * receptores adrenérgicos *

clonidina * rauwolscine

El cáncer de mama es la neoplasia más frecuente en-tre las mujeres (23%) (1). En la Argentina, cada año,mueren aproximadamente 5.400 mujeres y se estimaque se diagnostican alrededor de 17.000 casos nuevos(2). Es, además, el cáncer más prevalente en la mayoríade las áreas geo grá ficas. Por lo tanto el cán cer de mamaes un problema relevante para la salud en nuestro paísasí como en la mayoría de los países del mundo. Los an-tiestrógenos han sido la terapia más im por tante para laspacientes con cáncer de mama con receptores positivosy han logrado un indu dable progreso en el tratamiento,mejorando significativamente la sobrevida (3). Sin em-bargo, en una gran proporción de pacientes, sobretodo en aquellas con recurrencia o metás ta sis, se pro-duce resistencia al tratamiento (3). Por esta razón es deimportancia clínica encontrar otros tratamientos conmecanismos de acción diferente para complementar lasterapias disponibles.

Las experiencias estresantes activan componentesdel sistema límbico, que incluye el hipotálamo, el hi-pocampo y la amígdala entre otras regiones. En res-puesta a señales neurosensoriales, se activa por un ladoel eje hipotálamo-hipófiso-suprarrenal y por otro ladoel sistema simpático. Los ganglios cercanos a la médulaespinal liberan noradrenalina, mientras que las célulascromoafines de la médula suprarrenal liberan adrena-lina (4). Las catecolaminas naturales adrenalina y no-radrenalina se unen a 9 receptores adrenérgicos, que sedividen en tres grandes grupos, receptores α1, α2 y β-adrenérgicos, ejerciendo su acción a través de estaunión. Los receptores adrenérgicos pertenecen a la fa-milia de receptores de siete pasos trans mem bra na aco -pla dos a proteína G (GPCR). Lue go de la unión de losligandos endógenos epine fri na y nor epi ne fri na, se pro-

duce un cam bio conformacional que lleva a la activa -ción de pro teí nas heterotriméricas que unen GTP. Losreceptores α2-adrenérgicos se acoplan fundamen tal -men te con pro teí nas G de la familia Gi/o. La se -ñalización es tanto por la subunidad Gα in hibitoria co -mo por las sub uni dades βγ. La activación de la pro teínaGαi lleva a una in hibición de la adenilil ci clasa que re-sulta en una disminución de los ni ve les intra ce lu la res deade no sina mono fos fato cíclico (AMPc). En cambio, laliberación de las sub uni dades βγ cum ple im por tantes ro-les en la función celular (por ejemplo neu ro nal) me -dian te la regula ción de cana les de Ca2+ y la activaciónde proteína kinasas activadas por mitó ge nos (MAPK)fun da men talmente kinasas reguladas por señales ex-tracelulares (Erk) 1/2 (5).

Nuestro grupo ha estado trabajando durante los úl-timos años en la caracterización de los receptores α2-adrenérgicos y en el efecto de su estimulación en dife-rentes modelos experimentales de cáncer de mamapara contribuir a mejorar la calidad de vida de las pa-cientes. El objetivo de estos trabajos es contribuir al co-nocimiento de la influencia de estos receptores sobre laprogresión de estos tumores.

En un primer trabajo sobre acción adrenérgica en cé-lulas tumorales mamarias humanas MCF-7 (6), encon-tramos que las dos catecolaminas endógenas, adrenalinao epinefrina y noradrenalina o norepinefrina, así comotambién el agonista específico α2-adrenérgico clonidinaestimulan significativamente la proliferación celular(medida por incorporación de timidina tritiada) a con-centraciones ente 10 pM y 10 nM. Al incubar las célulasen presencia de antagonistas de los receptores adrenér-gicos, se observó que el antagonista α-adrenérgico pro-panolol no revertía este aumento de la proliferación ce-lular, mientras que el antagonista α-adrenérgicofentolamina y el antagonista α2-adrenérgico yohimbinasí lo hacían. Para corroborar un efecto α2-adrenérgico,se analizaron los niveles de AMP cíclico (AMPc) con lasdiferentes incubaciones. Se observó que adrenalina, no-radrenalina y clonidina provocaban una inhibición de es-tos niveles, que era revertida por la presencia simultáneadel antagonista α2-adrenérgico yohimbina.

Posteriormente hemos descripto los receptores α2-adrenérgicos en diversas líneas celulares de mama hu-mana, tanto tumorales como no tumorales (7). Las lí-neas mamarias humanas IBH-6 e IBH-7 desarrolladas enel laboratorio a partir de tumores primarios de pacien-tes (8), la línea MCF-7 y la no tumoral HBL-100 expre-san los subtipos de receptor α2B y α2C-adrenérgicos. Encambio expresan un solo subtipo las células malignasHS-578T (α2A) y MDA-MB-231 y la línea no tumoralMCF-10A (α2B). Todos los compuestos α y α2-adrenér-gicos compitieron efectivamente en ensayos de bindingpor los receptores α2-adrenérgicos, incluyendo adre-nalina o epinefrina, noradrenalina o norepinefrina,yohimbina, clonidina, rauwolscina y prazosin (que es un


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antagonista α1-adrenérgico con alta afinidad por lossubtipos α2B y α2C). Se comprobó la expresión de di-chos receptores mediante inmunocitoquímica. En todaslas líneas celulares los agonistas α2-adrenérgicos pro-vocaban un incremento en la proliferación celular.

Además hemos demostrado que los compuestos α2-adrenérgicos aumentan el crecimiento tumoral en mo-delos experimentales de cáncer de mama (9). Se con-firmó la expresión de receptores α2-adrenérgicos en lalínea tumoral mamaria murina MC4-L5 mediante in-munocitoquímica, inmunofluorescencia y RT-PCR. Laincubación de esta línea tumoral por 2 días con ago-nistas α2-adrenérgicos (clonidina y dexmedetomidina)incrementa significativamente la proliferación celular.Estos agonistas también estimularon significativamenteel crecimiento de todos los tumores analizados (C4-HD, CC4-2-HD y CC4-3-HI) independientemente de lasensibilidad al acetato de medroxiprogesterona y de lainoculación de esta hormona a los ratones. Estos tu-mores fueron desarrollados en el laboratorio de la Dra.Claudia Lanari (10). Los antagonistas α2-adrenérgicosyohimbina y rauwolscina revirtieron completamente elefecto del agonista clonidina. Sin embargo, el grupoque recibió solamente yohimbina mostró en todos loscasos un incremento constante aunque no significativodel crecimiento tumoral mientras que la rauwolscinasola disminuyó en todos los casos significativamente elcrecimiento tumoral, comportándose como un ago-nista inverso. En los tumores CC4-3-HI, el tratamientocon rauwolscina aumentó la apoptosis y disminuyó el ín-dice mitótico, mientras que la clonidina tuvo la accióninversa. Posteriormente (11) se analizó el efecto de laslíneas tumorales mamarias humanas desarrolladas en ellaboratorio y creciendo en ratones desnudos (12). Secomprobó que la clonidina también aumentó el creci-miento tumoral de las células IBH-4 e IBH-6 creciendoen ratones inmunodeficientes. En este modelo experi-mental también se observó una reversión del efectodel agonista α2-adrenérgicos por parte del antagonistarauwolscina, que en ausencia del agonista inhibió el cre-cimiento tumoral, comportándose nuevamente comoagonista inverso. Se realizaron cultivos primarios de es-tos tumores, separando las células epiteliales de las es-tromales. Al incubar las células en cultivo con clonidina,se observó que la misma estimulaba la proliferacióncelular de la fracción en ri quecida en células epiteliales,de la fracción enriquecida en fibroblastos asociados a tu-mor y del cocultivo de ambas fracciones en ambos tu-mores (IBH-4 e IBH-6). El antagonista α2-adrenérgicorauwolscina revirtió en todas las fracciones el efecto declonidina. Sin embargo cuando se incubaron las célulassolamente en presencia de rauwolscina todas las frac-ciones procedentes de tumores IBH-4 evidenciaron unainhibición de la proliferación celular, mientras que nose observó este efecto en las fracciones provenientes detumores IBH-6. En ese mismo trabajo describimos que

los fibroblastos murinos normales y asociados a tumorexpresaban receptores α2-adrenérgicos mediante in -mu no cito química e inmuno histo quí mica. Esta marca-ción era también visible en tumores murinos y humanostanto en células epiteliales como estromales. Los com-puestos α2-adrenérgicos en todos los casos estimularonla proliferación de ambos tipos celulares.

En conjunto, estos trabajos demuestran que los re-ceptores α2-adrenérgicos se expresan en tumores demama tanto humanos como murinos y que su activaciónestá asociada a un incremento de la proliferación celu-lar y del crecimiento tumoral. En todos los casos el an-tagonista α2-adrenérgico rauwolscina revirtió el efectoproliferativo, y, lo que es más importante aun, en au-sencia de agonistas inhibió la proliferación celular y elcrecimiento tumoral al compararlo con el control, su-giriendo la posibilidad de su empleo como terapia com-plementaria para el cáncer de mama.


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LABORATORIO DE SEÑALIZACIÓN EN MELANOMA

El receptor Ror1 y su rol en cáncer

The role of Ror1 receptor in cancer

O receptor Ror1 e seu papel em câncer

Pablo López Bergami

Resumen

Las proteínas Wnt son ligandos que activan señales involu-cradas en proliferación, sobrevida, adhesión, migración, di-ferenciación y polaridad celular y como tal están involucra-das en una amplia variedad de patologías. A diferencia de lavía Wnt canónica (o dependiente de beta-catenina) la vía nocanónica posee numerosas ramificaciones y ha sido muypoco estudiada. Evidencias obtenidas en los últimos años su-gieren que la vía Wnt no canónica (a través de Wnt5a) juga-ría un importante rol en la progresión de numerosos tipos detumores, incluyendo melanoma. Tradicionalmente, la mayorparte de la señalización por Wnt ha sido atribuida a la acti-vación de Fzd y LRP. Sin embargo, evidencias mas recientesindican que Wnt puede ejercer sus efectos a través de re-ceptores alternativos Ror1 y 2 (receptor huérfano 1 y 2 similara tirosina quinasa). Estas proteínas son receptores de TirosinaQuinasa con una arquitectura funcional excepcional dentro desu familia ya que son los únicos en poseer dominios Kringley dominios ricos en serina y treonina en el extremo C-termi-nal. Originalmente clonados como receptores huérfanos, sucaracterización como receptores Wnt es relativamente recientepor lo cual su rol está en proceso de ser dilucidado.

Palabras clave: Wnt no-canónico * receptores Ror * cáncer

Summary

Wnts are ligands that stimulate several signal trans-duction pathways involved in cell proliferation, sur-vival, migration, and differentiation. Wnt pathway mal-

function has been implied in various forms of disease.The most extensively studied Wnt pathway, termedcanonical, results in stabilization of β-catenin and acti-vation of gene expression by TCF and LEF transcription fac-tors. However, Wnts can also activate numerous non-canon-ical pathways which are independent of β-catenin. Thesenon-canonical pathways have been much less studied. Re-cent evidences suggest that the Wnt non-canonical pathway(via Wnt5a) would play an important role in several types ofcancer, including melanoma. The Wnt signaling has usuallybeen related to activation of Fzd and LRP receptors. How-ever, more recent data indicate that Wnt can activate the al-ternative receptors Ror1 and 2 (receptor tyrosine kinase-likeorphan receptor 1 and 2). These proteins belong to the Ty-rosine kinase family and have particular functional domainsuch as the Kringle domains and Serine/Threonine domainsat the C-terminal. Originally cloned as orphan receptors, theywere more recently characterized as Wnt receptors and theircellular role is being elucidated.

Key words: non-canonical Wnt * Ror receptors * cancer

Resumo

As proteínas Wnt são ligandos que ativam sinais envolvidos emproliferação, sobrevida, adesão, migração, diferenciação epolaridade celular e como tal estão envolvidas numa ampla va-riedade de patologias. À diferença da via Wnt canônica (ou de-pendente de beta-catenina) a via não canônica possui nume-rosas ramificações e tem sido muito pouco estudada.Evidências obtidas nos últimos anos sugerem que a via Wntnão canônica (através de Wnt5a) teria um importante papelna progressão de numerosos tipos de tumores, incluindo me-lanoma. Tradicionalmente, a maior parte da sinalização porWnt tem sido atribuída à ativação de Fzd e LRP. Entretanto,evidências mais recentes indicam que Wnt pode exercer seusefeitos através de receptores alternativos Ror1 e 2 (Recep-tor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 and 2). Estas pro-teínas são receptores de Tirosina Quinase com uma arqui-tetura funcional excepcional dentro de sua família já que sãoos únicos em possuir domínios Kringle e domínios ricos emserina e treonina no extremo C-terminal. Originalmente clo-nados como receptores órfãos, sua caracterização como re-ceptores Wnt é relativamente recente pelo qual seu papelestá em processo de ser elucidado.

Palavras chave: Wnt não-canônico * receptores Ror * câncer

El melanoma es un grave problema sanitario debidoa su creciente incidencia (es el quinto tumor más fre-cuente), su pésimo diagnóstico en el estadio metastásicoy la falta de terapias efectivas. Distintos enfoques tera-péuticos han fallado debido, entre otros motivos, a queen este tumor se observa una activación simultánea devarias vías de señalización. El objetivo general de los es-tudios que lleva adelante nuestro laboratorio es contri-buir a mejorar el conocimiento de las vías de transduc-ción de señales activas en melanoma. La suma de estos


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esfuerzos, sin duda, resultará en más y mejores alter-nativas terapéuticas contra esta enfermedad. A conti-nuación se resumen los actuales proyectos del labora-torio.

Proyecto 1: Estudio del rol biológico de la vía de se-ñalización Wnt/Ror1 en melanoma.

Proyecto 2: Caracterización de la vía de señalizaciónWnt no canónica.

Proyecto 3: Estudio del rol de GDF9 en cáncer. Proyecto 4: Identificación y caracterización de blan-

cos transcripcionales de STAT3. Las vías de señalización Wnt no canónico,

JAK/STAT3 y TGF-β se encuentran activas en formaconstitutiva en melanoma y se ha demostrado su con-tribución a distintos aspectos del desarrollo y progresiónde melanoma.

La vía de señalización Wnt no canónica ha sido muypoco estudiada y los mecanismos biológicos y molecu-lares involucrados se conocen sólo superficialmente. Elprimero de los proyectos tiene como objetivo determi-nar los mecanismos por los cuales la activación de estavía contribuye al desarrollo y progresión de melanoma.El segundo proyecto complementa al anterior ya quepretende identificar los ligandos Wnt, los receptores ylos mediadores celulares involucrados en esta vía de se-ñalización.

GDF9 (Growth Differentiation Factor 9) es un miem-bro de la familia de TGF-β que ha sido caracterizadocomo un factor de crecimiento ovárico. Sin embargo,hemos observado que GDF9 es sobreexpresado enmelanoma y podría contribuir al desarrollo tumoral.Actualmente, nos encontramos avocados a determinarel rol biológico de este factor de crecimiento en me-lanoma.

El factor de transcripción STAT3 cumple un impor-tante rol en tumorigénesis. Nuestro objetivo es identi-ficar nuevos blancos transcripcionales de STAT3 y ca-racterizar sus funciones en el contexto del desarrollo yprogresión tumoral. Trabajos realizados en el labora-torio han establecido que la proteína scaffold RACK1 yla proteína quinasa PDK1 son reguladas por STAT3 y alaumentar su expresión incrementan la actividad deotras vías de señalización tales como PKC, JNK yPI3K/Akt.

El receptor Ror1 y su rol en cáncer

La señalización Wnt canónica y no-canónica

Las glicoproteínas Wnt forman una familia de 19miembros que poseen entre 20% y 85% de identidad deaminoácidos entre sí. Estas proteínas son secretadas y ac-túan como ligandos extracelulares en forma autócrinay parácrina activando diferentes vías de señalizacióninvolucradas en proliferación, adhesión, sobrevida, mi-

gración, diferenciación y polaridad celular (1). Las pro-teínas Wnt se unen básicamente a tres tipos de recep-tores de membrana: Frizzled (Fzd o Fz, perteneciente ala familia de Receptores acoplados a proteína G), LRP(Low-density lipoprotein receptor- related protein) y ciertos re-ceptores de tirosina quinasa (Ror1, Ror2 y Ryk) (1)(2).La unión de Wnt a sus receptores lleva a la fosforila-ción y activación de la proteína citosólica Disheveled(Dvl) mediante mecanismos no completamente es-clarecidos. Dvl (particularmente Dvl2) juega un rolclave, ya que río abajo de esta proteína la señal se ra-mifica hacia la denominada vía canónica y múltiplesvías no canónicas (1).

La vía canónica involucra la unión de Wnt a recepto-res de tipo Fzd en presencia de co-receptores LRP. En estavía, la activación de Dvl estabiliza β-catenina, que de otramanera es ubiquitinada y degradada. β-catenina puede asítranslocar al núcleo, activar al factor de transcripciónTcf/Lef y regular la expresión de numerosos genes. Másrecientemente se ha demostrado que Wnt puede activarvías alternativas, independientes de β-catenina y por lo tan-to denominadas no-canónicas. En estos casos, las prote-ínas LRP no son necesarias y Wnt se une a receptores Fzdy, como se estableció mas recientemente, a los de tipo Ti-rosina Quinasa Ror1/2 o Ryk. El término “vías no canó-nicas” es utilizado en realidad para referirse a un conjuntonumeroso de vías de señalización alternativas, tales comoWnt/calcineurina/NFAT, Wnt/PKC, Wnt/CAMKII,Wnt/Rho/ROCK, Wnt/proteína Gβ/γ/fosfodiesterasa/cGMP (PDE), Wnt/proteína Gβ/γ/ fosfolipasa C (PLC)y Wnt/JNK que se activan en respuesta a señales no ca-nónicas (2). Esta sobre-simplificación pone de manifies-to la superficialidad de nuestro conocimiento de estas víasno canónicas. Aspectos tales como los factores que de-terminan la activación de una vía por sobre las otras o elgrado de superposición entre ellas no han sido elucida-dos aún.

Otro interrogante clave que no ha sido esclarecidoaún es porque algunos Wnts inducen alternativamentedistintas vías de señalización y regulan aspectos tan di-versos de la vida celular en distintos sistemas. Sin dudas,el elevado número de genes intervinientes ha dificul-tado su estudio. En mamíferos, se han identificado 19genes Wnt y 10 genes Fzd además de un inusual númerode moduladores solubles como sFRP, Dickkopf (Dkk) yWIF1, entre otros. El sistema se torna aún mas complejopor el hecho de que varios Fzd pueden actuar como re-ceptores de un Wnt particular y que ciertos Fzd puedeunir varios Wnts. Inicialmente, se consideró que algunosWnts eran específicos para la vía canónica o no-canó-nica (por ejemplo, Wnt1, Wnt3a, Wnt3b, Wnt7a y Wnt8para la canónica y Wnt2, Wnt4 Wnt5a, Wnt5b, Wnt6,Wnt7b y Wnt11 para la no canónica) pero más recien-temente se ha demostrado en forma concluyente queesta especificidad no es tal y que en ciertas circunstan-cias aún los Wnts considerados “más específicos” pue-



den afectar ambas vías (1). Wnt5a, por ejemplo, ademásde activar la vía no-canónica suele inhibir la vía canó-nica. Estas y otras evidencias similares han dado origena un nuevo paradigma que sostiene que la capacidad deactivar una u otra vía no reside solo en los ligandos Wntsino que además esta dada por el conjunto de recepto-res expresados por la célula (2).

Los Receptores de Tirosina Quinasa Ror1 y Ror2

Tradicionalmente, la mayor parte de la señalizaciónpor Wnt ha sido atribuida a la activación de Fzd y LRP.Sin embargo, evidencias más recientes indican que Wntpuede ejercer sus efectos a través de receptores alter-nativos como Ryk y Ror. Los receptores Ror1 y Ror2 (Re-ceptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 and 2) fue-ron clonados hace 19 años y caracterizados comoReceptores de Tirosina Quinasa huérfanos por desco-nocerse sus ligandos (3). Ror1 y Ror2 poseen 58% deidentidad a nivel de aminoácidos y comparten todos susdominios funcionales. Estos receptores poseen una ar-quitectura funcional excepcional dentro de su familiaya que son los únicos en poseer dominios Kringle y do-minios ricos en Serina y Treonina en el extremo C-ter-minal. Gracias a estos dominios (involucrados en la for-mación de uniones proteína-proteína), se especula queestos receptores podrían regular y/o ser regulados porproteínas hasta ahora no involucradas en la señalizaciónpor receptores de Tirosina Quinasa. Interesantemente,los dominios de Serina/Treonina se encuentran con-servados entre ortólogos de Ror2 pero no entre ortó-logos de Ror1. Estudios en roedores demuestran pa-trones definidos de expresión espaciotemporal de Ror1y Ror2 en tejidos embrionarios, congruentes con su rolcrítico en desarrollo y organogénesis (4). Los diferen-tes fenotipos observados en estos estudios sugieren queRor1 y Ror2 cumplen distintos roles en el organismo.Luego del nacimiento estas proteínas dejan de expre-sarse (4) y no son detectadas en tejidos normales adul-tos (5).

El descubrimiento en 2003 de que estas proteínas ac-tuaban como receptores de Wnt (a través de su dominiorico en cisteínas, CRD) (6) aumentó el interés en ellas.La mayoría de los estudios hasta la fecha se han focali-zado en Ror2. Recientemente, se ha propuesto un mo-delo por el cual Ror2 (y probablemente también Ror1)cumplirían en la vía no canónica un rol similar al del co-receptor LRP5/6 en la vía canónica (7). De esta ma-nera, distintos Wnt, al unirse con receptores Ror o LRPactivarían la vía no canónica o la canónica. De esta ma-nera la competencia de estos coreceptores por Fzd pro-duce una inhibición recíproca. Este modelo resalta laimportancia de la expresión diferencial de receptoresy permite explicar el hecho de que Ror2 puede activarla vía canónica o la no canónica en distintos tipos celu-lares. Estas y otras observaciones abonan el concepto de

que la señalización por Wnt es fuertemente depen-diente del balance entre los distintos Wnts expresadosy sobretodo de la cohorte de receptores en la célula (2).Por razones difíciles de comprender, los trabajos que in-volucraron a Ror1 son muchísimo menos numerososque los que tratan sobre Ror2, a pesar de que evidenciasgenéticas y bioquímicas sugieren que ambos receptoresposeen funciones distintas. Por este motivo, se ha pro-fundizado muy poco en las funciones y características dela señalización de este receptor en una célula humanaadulta. Se ha demostrado que Ror1 se une a Wnt5a perono a Wnt3, Wnt5b, o Wnt16 en células HEK293 y que escapaz de activar Rac en respuesta a Wnt5a en célulasHeLa y L. Se ha descripto que la activación de Ror1 porWnt5a requiere la fosforilación de Ror1 por GSK3 (7),aunque también se ha descripto la transfosforilación deRor1 por parte del receptor Met. Recientemente se de-terminó que Ror1 sufre procesos de glicosilación ymono-ubiquitinación pero no se ha establecido comoestos afectan su funcion.

Participación de Ror1 en cáncer

Las evidencias que proponen un rol de Ror1 en cán-cer son escasas aunque muy importantes desde el puntode vista funcional. Debe destacarse sin embargo, que lamayoría de los hallazgos que aquí se describen son muyrecientes, reflejando el creciente interés en las funcio-nes de Ror1. Se ha establecido claramente que Ror1(pero no Ror2) esta sobreexpresado en leucemias (5)y cáncer renal. Dada su falta de expresión en tejidos nor-males adultos se ha propuesto el uso de Ror1 como mar-cador o como posible blanco terapéutico en leucemialinfocítica crónica (LLC). Mas allá de estos trabajos re-alizados en leucemias, Ror1 juega un rol importante enla célula tumoral (8). Se ha demostrado que la inhibi-ción de Ror1 mediante RNA de interferencia inducemuerte celular en dos tipos de células muy disímiles:HeLa y linfocitos B provenientes de LLC. La inhibiciónde Ror1 también ha sido asociada a una reducción en laproliferación y en la capacidad tumorigénica de célulasde carcinoma gástrico y cáncer de pulmón. Se determinoque Ror1 podria intervenir en la activación de la vía Wntno canónica en metástasis cerebrales de cáncer demama. Estas observaciones se han producido en paralelocon el reconocimiento del importante rol en cáncer deRor2 (9). Otro punto a tener muy en cuenta es que el rolde Ror1 debe ser analizado conjuntamente con el de lasproteínas Wnt, sus únicos ligandos conocidos. Este as-pecto será detallado en la siguiente sección.

La vía Wnt en melanoma

La activación de la vía canónica en melanoma sedebe en muchos casos a modificaciones en interme-diarios de esta vía como APC e ICAT que llevan a la ac-


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tivación y localización nuclear de β-catenina. Los Wntque más frecuentemente activan esta vía en melanomason Wnt1 y Wnt3a. Originalmente se considero que lavía canónica tenía un rol prooncogénico pero en la ac-tualidad su rol se encuentra sujeto a debate (10).

La activación constitutiva de la vía no-canónica, fun-damentalmente a través de Wnt5a, también es una ca-racterística distintiva de melanoma aunque se descono-cen en profundidad los mecanismos molecularesinvolucrados. La expresión de otros Wnt “no canónicos”asociados a otros tipos de tumores como Wnt2, Wnt4,Wnt7b y Wnt11 no ha sido estudiada en melanoma.Wnt5a se encuentra sobreexpresada en melanoma (pre-sumiblemente por la acción de STAT3) e induce au-mentos en la adhesión, motilidad e invasión, la activaciónde EMT (Transición Epitelial-Mesenquimal), la inhibi-ción de la expresión de supresores de metástasis comoKiss-1 y el aumento de expresión de activadores de me-tástasis como CD44 (11). Muchos de estos efectos son me-diados por la activación de PKC, aunque persisten dudassobre que isoforma es la involucrada. Sin embargo, debehacerse notar que algunos de los experimentos en estostrabajos fueron realizados induciendo la sobreexpresiónde Wnt5a en células que naturalmente expresaban altosniveles de este ligando, lo cual relativiza el significado deestas conclusiones. Interesantemente, la detección deWnt5a en biopsias se correlacionó directamente con es-tadíos más avanzados e inversamente con la sobrevida delpaciente. La sobreexpresión de Wnt5a en los tumores eslocalizada y ocurre en sitios de invasión activa y las célu-las muestran características morfológicas asociadas a uncomportamiento agresivo. Los receptores de Wnt5a ca-racterizados hasta el presente en melanoma son Fzd5 yRor2. La expresión de este ultimo no solo correlacionacon la de Wnt5a sino que es necesaria para la inducciónde metástasis de células B16 dependiente de Wnt5a.


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LABORATORIO DE PATOLOGÍA Y FARMACOLOGÍA MOLECULAR

siARN y shARN: Aspectos básicos yaplicados. Su uso como agentes terapeúticos

siRNA and shRNA: basic and appliedaspects. Their use as therapeutic agents

siARN e shARN: aspectos básicos eaplicados. Seu uso como agentesterapêuticos

Carolina Flumian, Gabriela Levy, Gabriela Bravo,Carla Gatto Cáceres, Martín Gómez, Adrián Góngora,Alberto Baldi

Resumen

La interferencia del ARN es un fenómeno por el cual pe-queñas moléculas de ARN doble cadena inhiben la expresióngénica de manera secuencia específica. Esta vía se en-cuentra altamente conservada en los organismos eucariotas.Existen varios tipos de ARN interferentes, entre ellos se en-cuentran los shARN (del inglés short hairping RNA) que a suvez, dan lugar a los siARN (del inglés small interferingRNA). La activación de esta vía de manera exógena consti-tuye una estrategia prometedora para el tratamiento de múl-tiples enfermedades humanas tales como el cáncer, las in-fecciones virales, las enfermedades autoinmunes yneurodegenerativas. En el presente artículo se realiza la



descripción de estas pequeñas moléculas, así como tambiénde la vía involucrada y cuáles son los efectos de su activa-ción. También se explican los problemas que presenta suaplicación y las perspectivas de su uso como agentes tera-péuticos.

Palabras clave: iARN * siARN * shARN * silenciamiento gé-

nico * vectores virales * cáncer

Summary

RNA interference is a phenomenon in which small doublestranded RNAs mediate sequence-specific regulation ofgene expression. This pathway is highly preserved in eu-karyotic organisms. There are many types of interferingRNAs, among them, shRNAs (short hairping RNA) which giverise to siRNA (small interfering RNA). The exogenous acti-vation of this pathway is a promising strategy as a treatmentfor various human diseases such as cancer, viral infections,autoimmune, and neurodegenerative diseases. In this articlethese small molecules, the pathway involved and the effectsof their activation are described. In addition, the problemsand perspectives of their application as therapeutic agentsare presented.

Key words: iRNA * siRNA * shRNA * gene silencing * viral

vectors * cancer

Resumo

A interferência do ARN é um fenômeno pelo qual pequenasmoléculas de ARN cadeia dupla inibem a expressão gênicade maneira sequência específica. Esta via se encontra alta-mente conservada nos organismos eucariotas. Existem váriostipos de ARN interferentes, entre eles se encontram osshARN (do inglês short hairping RNA) que por sua vez, dãolugar aos siARN (do inglês small interfering RNA). A ativa-ção desta via de maneira exógena constitui uma estratégiapromissora para o tratamento de múltiplas doenças huma-nas tais como o câncer, as infecções virais, as doenças au-toimunes e neurodegenerativas. No presente artigo é reali-zada a descrição destas pequenas moléculas, bem como davia envolvida e quais são os efeitos de sua ativação. Tambémse explicam os problemas que apresenta sua aplicação e asperspectivas de seu uso como agentes terapêuticos.

Palavras chave: iARN * siARN * shARN * silenciamento gê-

nico * vetores virais * câncer

Interferencia del ARN

La interferencia del ARN (iARN) es un mecanismomuy conservado en el cual moléculas pequeñas de ARNsilencian la expresión génica de manera post-trascrip-cional (1). Esta vía ha sido reconocida como una de lasprincipales formas de regulación de la expresión génicaen células eucariotas (2). Existen varios tipos de ARN pe-queños regulatorios. Entre ellos, se encuentran los ARNspequeños interferentes (siARN, del inglés small interfering

RNAs) que consisten en moléculas de ARN doble ca-dena de 21-23 nucleótidos con 2 ó 3 nucleótidos libres enel extremo 3´ de manera simétrica (3). También existenlos shARN (del inglés short hairping RNA) que son ARNsdoble cadena que poseen una zona perfectamente com-plementaria y un rulo que no presenta complementa-riedad. Los shARNs son tomados en el citoplasma poruna enzima llamada Dicer, que es una ribonucleasa tipoIII, que corta el shARN dando lugar al siARN (4). En-tonces, los siARNs son incorporados a un complejo lla-mado RISK (del inglés RNA-induced silencing complex)cuyo núcleo catalítico está constituido por la proteína Ar-gonauta 2 (Ago2) que degrada una de las dos hebras.Cuál de las dos hebras es degradada se determina por laspropiedades termodinámicas de las terminales del siARNque, a su vez, determinan su orientación dentro del Ago2y cuál de las dos hebras va a servir como hebra guía (5).Esto da lugar a un complejo RISK activado que contieneun fragmento de ARN simple cadena que es antisentidocon respecto al ARN mensajero (ARNm) blanco (6).Este complejo permite la unión con el ARNm y Ago2rompe la unión fosfodiéster del ARNm que se ubica enel medio del sitio de reconocimiento siARN:ARNm. Losfragmentos del ARNm resultantes son liberados, y, porende, son degradados al ser reconocidos como trans-criptos aberrantes. El complejo activado puede actuar so-bre varias moléculas de ARNm de manera sucesiva, am-pliando el efecto de silenciamiento (7).

Por otro lado, además del efecto post-transcripcional,los siARNs promueven la modificación del ADN, facili-tando el silenciamiento de la cromatina, mediante la ex-pansión de segmentos de heterocromatina, a través delcomplejo RITS (del inglés RNA-induced transcriptional si-lencing) (8).

Silenciamiento génico selectivo

Conociendo la existencia de este tipo de mecanismoen los organismos, se pensó en la posibilidad de regu-lar la expresión de ciertos genes induciendo esta vía pormedio de la introducción de siARNs de manera exó-gena. Esto podría permitir contrarrestar la sobreex-presión de genes que se observa en distintas patologías,entre ellas, el cáncer. La interferencia de la expresióndel ARN pude ser lograda de dos formas: 1) mediantela introducción al citoplasma de siARNs, o 2) mediantela incorporación al núcleo de casetes que codifiquenshARNs. En ambos casos, el mecanismo de ARNi sólopermite una inhibición parcial o knock down de la ex-presión del gen de interés, a diferencia de las técnicasexistentes de knock out (9).

Se debe tener en cuenta que la eficacia del siARN di-señado depende de la accesibilidad de la zona de apa-reamiento en el ARNm, de la presencia de estructurassecundarias o de su asociación con proteínas.


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Efectos inespecíficos (off-target)

Los siARNs y los shARNs, pueden producir una re-ducción no deseada de la expresión de algunos genescuya secuencia es similar a la reconocida por siARN, de-bido al corte del ARNm correspondiente o por la inhi-bición de su traducción (10)(11). Estos efectos puedenreducirse mediante la modificación química del se-gundo residuo de la hebra activa del siARN, sin afectaral silenciamiento del ARNm específico (12). Además, esnecesario eliminar en el diseño todos los siARNs quepresenten una cierta similitud con las moléculas deARNm no buscadas, mediante la utilización de BLAST.

El problema de la llegada a destino

Los siARNs son moléculas cargadas negativamenteque no pueden a penetrar fácilmente las membranas li-pídicas celulares sin algún compuesto carrier que lasasista. Además, los siARNs que no se modifican quími-camente generalmente son degradados por las ARNa-sas presentes en el suero. A su vez, se debe tener encuenta la dificultad adicional que representa la admi-nistración in vivo de siARNs, ya sea que se realice de ma-nera sistémica o localizada.

In vitro, estas dificultades pueden ser superadas parala mayoría de los tipos celulares si los siARNs se unen areactivos lipídicos catiónicos. Sin embargo, existen mu-chas limitaciones en el uso de esta estrategia debido a lafalta de especificidad con respecto al tipo celular que sepretenda como blanco del tratamiento, como así tam-bién, debido a la toxicidad de muchos de estos reactivos.

Con el fin de lograr una mayor especificidad de lossiARNs por la población celular blanco in vivo, se ha de-sarrollado una serie de estrategias que incluyen la con-jugación de los siARNs a agentes que reconocen demanera específica moléculas presentes en la superficiecelular de la población blanco, como por ejemplo an-ticuerpos, ligandos y aptámeros.

La duración del efecto de silenciamiento

Las formas antes mencionadas de administración delos siARNs llevan a un silenciamiento transitorio, yaque la concentración intracelular de los siARNs va a irdisminuyendo debido a las divisiones celulares y a su de-gradación. Por el contrario, si se logra que la poblaciónblanco exprese los shARNs de interés, esto va a permi-tir que el efecto de silenciamiento dure hasta tanto la cé-lula los transcriba. Esto es una cualidad ideal para el tra-tamiento de enfermedades crónicas. En este contexto,los virus y vectores derivados de los mismos constituyenun sistema que permite no sólo superar el problema deatravesar la membrana plasmática, sino también de pe-netrar la envoltura nuclear resultando en la incorpora-

ción de la secuencia que codifica para el shARN al ge-noma, posibilitando la expresión de los shARNs de ma-nera estable.

El diseño de vectores virales fue posible gracias al des-cubrimiento de que la expresión de shRNAs induce lamaquinaria de ARNi (13). Esta estrategia involucra elclonado de un oligonucleótido que codifica para elshARN en un plásmido o vector viral que permite la ex-presión endógena del shARN, que luego es procesadoen el citoplasma de la célula hospedadora, dando lugara los siARNs.

Perspectivas terapéuticas

Un gran número de trabajos constituyen la pruebade que el mecanismo de ARNi puede ser potencial-mente utilizado para el tratamiento de una gran varie-dad de enfermedades (14)(15). Más aún, algunossiARNs ya están siendo utilizados en pruebas clínicas(16). Particularmente, en nuestro laboratorio, teniendocomo modelo de trabajo al melanoma humano, nospropusimos estudiar los beneficios del silenciamientode factores proangiogénicos que se encuentran sobre-expresados en este tipo de cáncer como posible terapia,ya que estos genes contribuyen al desarrollo y progre-sión de la enfermedad. Con este fin, hemos desarro-llado algunos shARNs que tienen como blanco a uno deestos factores y, utilizando vectores virales derivados deretrovirus, se lograron establecer líneas celulares que ex-presan de manera estable el shARN y que muestran unsilenciamiento de entre el 75 y el 95% que, a su vez, co-rrelaciona con un aumento en la apoptosis.

Sin embargo, y a pesar del gran potencial de estas téc-nicas, existen grandes limitaciones en el uso de siARNsdebido a las fallas con respecto a la seguridad y efectivi-dad de los métodos para su administración específica enlos tejidos o tipos celulares deseados. A pesar de estas di-ficultades consideramos que, con el continuo avance enlas investigaciones, estas dificultades podrán ser supera-das y que el uso de siARNs y shARN dará lugar a trata-mientos efectivos contra enfermedades humanas.


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Potencial proangiogénico de los productos dedisolución de materiales vítreos bioactivos

Angiogenic potential of bioactive glassesionic dissolution products

Potencial proangiogênico dos produtos dedissolução de materiais vítreos bioativos

Luis A. Haro Durand1,2, Adrián Góngora1, MartínGomez1, Alberto Baldi1, Alejandro Gorustovich2

1Instituto de Biología y MedicinaExperimental IByME- CONICET,Buenos Aires, Argentina; 2Grupo Interdisciplinario en Materiales, IE-SIING-UCASAL, INTECIN, UBA-CONICET, Salta, Argentina

Resumen

La angiogénesis es un proceso complejo caracterizado poruna cascada de eventos que llevan a la activación, prolife-ración y migración de células endoteliales y al remodeladoy estabilización del tejido vascular. Recientes intentos por es-timular angiogénesis se han enfocado en la entrega de fac-tores de crecimientos tales como el factor de crecimiento en-dotelial (VEGF) y el factor de crecimiento fibroblástico básico(bFGF), terapia génica y terapia basada en células, pero es-tos procedimientos son caros y los mecanismos de entregaóptimos son aún poco comprendidos, por lo tanto, contar conestrategias más sencillas y menos costosas para inducir an-giogénesis, representarían una muy buena alternativa al usode factores de crecimientos costosos para estimular la neo-vascularización en un tejido en reparación. Los vidrios bio-activos han sido ampliamente investigados para la regene-ración de tejido óseo, sin embargo ha habido pocainvestigación en la aplicación de los vidrios biactivos para re-parar tejidos blandos altamente vascularizados y particular-mente, la influencia que tienen sobre la neovascularización.Sin embargo recientes trabajos han mostrado la habilidad delos vidrios bioactivos para promover angiogénesis lo cual escrítico para numerosas aplicaciones en la reparación de he-rida y en estrategias para la ingeniería de tejidos. Este artí-culo, en la primera parte; presenta una visión general de losvidrios bioactivos haciendo énfasis en las característicasque determinan la bioactividad de los vidrios de silicato bio-activos y en la segunda parte, revisa la evidencia existenteen la bibliografía sobre estudios que han demostrado el po-tencial de los vidrios bioactivos, particularmente el 45S5Bioglass® de estimular la angiogénesis, a través de susproductos de disolución iónica.

Palabras clave: angiogénesis * vidrios bioactivos * bioglass *

reparación y regeneración de tejidos * ingeniería de tejidos

Summary

Angiogenesis is complex multi-step process that involves en-dothelial cell activation, dissolution of surrounding basementmembrane, increased endothelial cell proliferation and mi-gration, tube formation to form a vascular network. Recentattempts to stimulate angiogenesis have focused on the de-livery of growth factors and cytokines, such us vascular en-dothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growthfactor (bFGF), gene therapy and cells-based therapy. How-ever the growth factors are expensive and the optimal deliv-ery strategies are unclear. Therefore use others easier andcheaper strategies to induce angiogenesis could provideand alternative approach to the use of expensive growth fac-tor for stimulating neovascularization of wound repair. Whilethe bioactive glasses have been extensively investigated forbone repair and regeneration, there has been relatively lit-tle research on the application of bioactive glass to highlyvascularized soft tissues repair and particularly, the effect onthe neovascularization. However, there is emerging evidencein the literature that the use of bioactive glasses in bioma-terial-based tissue engineering strategies may improve thevascularization, it is the major limitation of tissue engineer-


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ing approaches for the replacement of diseased or damagedtissue. This article, in the first part, reviews the bioactivitycharacteristics of silicate bioactive glasses. In the secondpart, discusses the evidences in the literature showing theangiogenic potential of bioactive glasses ionic dissolutionproducts, focusing on 45S5 bioglass®.

Key words: angiogenesis * bioactive glasses * bioglass *

wound repair and tissue engineering

Resumo

A angiogênese é um processo complexo caracterizado poruma cascata de eventos que levam à ativação, proliferaçãoe migração de células endoteliais e à remodelagem e esta-bilização do tecido vascular. Recentes tentativas por esti-mular angiogênese têm se focado na entrega de fatores decrescimentos tais como o fator de crescimento endotelial(VEGF) e o fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF),terapia gênica e terapia baseada em células, mas estes pro-cedimentos são caros e os mecanismos de entrega ótimos sãoainda pouco compreendidos, portanto, poder contar com es-tratégias mais simples e menos custosas para induzir an-giogênese, representariam uma muito boa alternativa ao usode fatores de crescimentos custosos para estimular a neovas-cularização num tecido em reparação. Os vidros bioativostêm sido amplamente pesquisados para a regeneração de te-cido ósseo, entretanto tem havido pouca pesquisa na aplica-ção dos vidros bioativos para reparar tecidos moles altamentevascularizados e particularmente, a influência que têm sobrea neovascularização. Entretanto recentes trabalhos têm mos-trado a habilidade dos vidros bioativos para promover angio-gênese o qual é crítico para numerosas aplicações na repara-ção de ferida e em estratégias para a engenharia de tecidos.Este artigo, na primeira parte; apresenta uma visão geral dosvidros bioativos fazendo ênfase nas características que deter-minam a bioatividade dos vidros de silicato bioativos e, na se-gunda parte, revisa a evidência existente na bibliografia sobreestudos que têm demonstrado o potencial dos vidros bioati-vos, particularmente o 45S5 Bioglass® de estimular a angio-gênese, através de seus produtos de dissolução iônica.

Palavras chave: angiogênese * vidros bioativos * bioglass * re-

paração e regeneração de tecidos * engenharia de tecidos

Biomateriales

Los biomateriales son materiales sintéticos o naturalesmodificados que tienen la habilidad de coexistir en con-tacto con tejidos del cuerpo humano sin causar ningúngrado de daño al cuerpo (1). Los biomateriales han sidocategorizados, según el comportamiento biológico de-sencadenado por los mismos, en: biomateriales de pri-mera, segunda y tercera generación. Los materiales deprimera generación han demostrado un comporta-miento bioinerte (no-bioactivo), mientras que los de se-gunda y tercera generación poseen propiedades bioac-tivas (2). La nueva generación de materiales bioactivos,

denominada tercera generación, comprende a todosaquellos materiales biorreabsorvibles y/o biodegrada-bles que tienen la capacidad de estimular respuestas ce-lulares específicas a nivel molecular como resultado de laliberación de iones a partir de los mismos (3).

Vidrios Bioactivos

Un material bioactivo ha sido definido como un ma-terial que ha sido diseñado para inducir un respuestabiológica específica (4). La característica común quecomparten todos los materiales bioactivos es una mo-dificación cinética, dependiente del tiempo que ocurrebajo implantación (5). La superficie forma una capa dehidroxicarbonatoapatita (HCA) biológicamente activaque provee la interfase de unión con los tejidos. LaHCA que se forma sobre el implante bioactivo es es-tructural y químicamente equivalente a la fase mineraldel hueso (5). La habilidad de un material de precipi-tar sobre su superficie una capa de HCA cuando es su-mergido en un fluido fisiológico simulado in vitro, es amenudo tomado como un indicador de bioactividad(6), pero este concepto esta siendo cuestionado de-bido a la creciente evidencia de que no siempre la bio-actividad observada in vitro, implique estrictamente unabioactividad in vivo (4). La unión al tejido óseo fue pri-mero demostrado para ciertos rangos de composiciónde vidrios bioactivos que contenían SiO2, Na2O, CaO yP2O5 en proporciones especificas, estos presentabantres características composiciónales claves que los dis-tinguían de los vidrios tradicionales: [1] menos del 60%de SiO2, [2] alto contenido de Na2O y CaO y (3) alta re-lación CaO/P2O5. Estas características composiciona-les hacen a la superficie del material altamente reactivacuando es expuesta a medios acuosos (5).

Vidrios de Silicato Bioactivos

Desde su descubrimiento hace aproximadamente40 años, el vidrio de silicato bioactivo 45S5 Bioglass(composición en %; 45% SiO2 24,5% Na2O, 24,5%CaO, y 6% P2O5) ha sido el más ampliamente investi-gado para aplicaciones biomédicas (4). Este materialinorgánico provee un medioambiente ideal para la co-lonización, proliferación y diferenciación de osteoblas-tos para formar hueso nuevo exhibiendo, una uniónmecánicamente fuerte a la superficie del implante. Porotro lado, las reacciones sobre la superficie del vidriobioactivo induce la liberación de concentraciones cri-ticas de iones solubles, por ejemplo, Si, Ca y P, los cua-les han mostrado favorecer respuestas intacelulares y ex-tracelulares que promueven una respuesta rápida deformación de hueso (7), genéticamente controlada,por la sobreregulación de genes que participan en la



proliferación de osteblastos (8-10). Si bien los vidriosbioactivos, particularmente el 45S5, han sido amplia-mente investigados para la regeneración y reparaciónde hueso, hay relativamente pocos estudios respecto ala aplicación de los vidrios bioactivos para reparar o re-generar tejidos blandos. Sin embargo, recientes traba-jos han mostrado la habilidad de los vidrios bioactivosde promover angiogénesis in vitro (11-13), lo cual es unobstáculo cuando se precisa establecer un sistema vas-cular maduro en un tejido en regeneración. Recientesintentos por estimular angiogénesis se han enfocado enla entrega de factores de crecimientos tales como el fac-tor de crecimiento endotelial (VEGF) y el factor decrecimiento fibroblástico básico (bFGF), terapia génicay terapia basada en células (13), pero estos procedi-mientos son caros y los mecanismos de entrega óptimosson aun poco comprendidos. Por lo tanto la habilidadde un vidrio bioactivo para inducir angiogénesis podríaproveer una buena alternativa al uso de factores de cre-cimiento caros, para estimular la neovascularizaciónde un tejido en reparación (4).

Vidrios de boro-silicatos bioactivos

Nuevos vidrios bioactivos basados en el 45S5 Bio-glass®, han sido desarrollados, reemplazando comple-tamente el SiO2 en el 45S5 por B2O3 (generando un vi-drio de boro bioactivo), reemplazando parcialmente elSiO2 por B2O3 en el vidrio 45S5 o simplemente agre-gando a la formula 45S5 ciertas concentraciones deB2O3 (produciendo vidrios de borosilicato bioactivos)(14)(15). Estos vidrios bioactivos debido a su baja du-rabilidad química se degradan más rápido y se con-vierten más completamente en un material similar a laHCA en un medio fisiológico cuando son comparadoscon el 45S5. Por lo tanto, la fácil fabricación, la posibi-lidad de controlar la tasa de degradación de estos vidriosvariando la concertación de B y por otro lado, ya que hasido bien establecido que el boro desempeñaría fun-ciones en la angiogénesis y la reparación tisular (16-18),estas características lo hacen especialmente útil paraaplicaciones en ingeniería de tejidos (4). Si bien sepuede establecer que la bioactividad de los vidrios 45S5Bioglass® dopados con Boro ha sido bien documen-tada, los datos existentes con especto a los efectos bio-lógicos son escasos y controversiales por lo que son ne-cesarios más estudios tanto, in vitro como in vivo parapoder clarificar esta cuestión.

Productos de Disolución Iónica IDPs

Por mucho tiempo se asumió que la formación deuna capa de HCA superficial era el requerimiento crí-tico para la bioactividad de un material. Sin embargo,

hoy se sabe que la formación de HCA es útil, pero noes un fenómeno crítico para determinar la bioactivi-dad (19). Nueva evidencia científica indica que los pro-ductos de disolución de los vidrios bioactivos son laclave para comprender el comportamiento bioactivode un vidrio tanto in vitro como in vivo (20). La libe-ración de iones a partir de un vidrio bioactivo, se dacomo resultado de una secuencia de reacciones quí-micas que se llevan a cabo en la superficie del materialbioactivo, que en ultima instancia llevan a la precipi-tación de una capa de HCA policristalina (5). Resu-midamente, cuando el vidrio bioactivo toma contactocon un fluido fisiológico del cuerpo o simulado seproduce una rápida reacción de intercambio iónico deNa+ y Ca2+ desde el material con H+ (o H3O+) desde lasolución llevando a la formación de grupos silanoles(Si-OH) sobre la superficie del vidrio. Esta etapa elevael pH de la solución lo que genera el ataque de SiO2liberándose el Si en forma de acido salicílico Si(OH)4.La continua liberación Si(OH)4 y formación de Si-OH, lleva a la condensación y polimerización de unacapa rica en SiO2 en el material carente de Na+ y Ca2+.La disolución del material continúa, y ahora acopladoal intercambio iónico de Ca2+ y (PO4)3- entre el vidrioy la solución se forma una capa de fosfato de calcioamorfa (ACP) sobre la capa rica en SiO2. Esta capa al-tamente reactiva, una vez formada, incorpora (OH)- y(CO3)- desde la solución cristalizando como una capade HCA policristalina. Como implante y en contactocon fluidos fisiológicos del cuerpo y luego de formadala capa de HCA, sobre el vidrio se genera una super-ficie de reacción que incrementa la adsorción y de-sorción de factores de crecimientos y el periodo detiempo de permanencia de macrófagos en la zona tra-tada que son requeridos para preparar el sitio de im-plante para la reparación tisular, el proceso de unióndel vidrio con el tejido y la posterior diferenciación yproliferación de las células involucradas en la regene-ración del tejido. La mineralización de la matriz quele sigue a la maduración de osteocitos luego que se en-capsulan en una matriz de HCA-colágeno es el pro-ducto final observado in vivo cuando el tejido en cues-tión es el tejido óseo (4)(19).

Mecanismos de acción de los productos dedisolución iónica

Como se expuso anteriormente, el fenómeno clavede bioactividad de los vidrios bioactivos y en particularel Bioglass®, era la tasa controlada de liberación de io-nes, especialmente concentraciones criticas de Si, Ca, Py Na (19). La subsecuente liberación de estos ionesluego de la exposición de los vidrios bioactivos a un am-biente fisiológico incrementaría la bioactividad de estosmateriales y serian los responsables de la respuesta bio-


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lógica observada hasta ahora. Con respecto a la osteo-génesis ya ha sido bien establecido, con estudios in vi-tro e in vivo, el potencial osteogénico del Bioglass®(5)(19). Si bien aún no está muy claro el mecanismo deacción a nivel molecular de los IDPs se cree que estos ac-tuarían regulando la expresión génica de ciertas molé-culas relevantes, que intervienen en los procesos decontrol del ciclo celular de osteoblastos y en la prolife-ración y diferenciación, promoviendo además, la pro-ducción de componentes de la matriz ósea (8)(9) posi-blemente a través de señales celulares que involucraríanlas vías de señalización de las MAP Kinasas (10). La bi-bliografía actual sobre el efecto de los vidrios sobre elproceso angiogénico es escasa y la mayoría de los estu-dios fueron realizados en modelos in vitro de cultivo decélulas relevantes en contacto directo con el material.Hoppe (20) postula, basado en la bibliografía, que losIDPs actuarían estimulando la secreción de factores decrecimiento angiogénicos desde los fibroblastos comoel VEGF y bFGF lo que llevaría a un incremento en laproliferación, diferenciación y migración de células en-doteliales generando una red de túbulos de células en-doteliales conectadas. Hasta ahora se ha postulado, ba-sado en la bibliografía existente, que los vidriosbioactivos estimularían la proliferación de células en-doteliales, pero estos trabajos son escasos y fueron ba-sados en la respuesta observada de células endotelialeshumanas en contacto directo con el material (7). Por lotanto, son necesarios más trabajos futuros que analicenla respuesta angiogénica, tanto in vitro como in vivo, alos productos de disolución iónica de los vidrios bioac-tivos.


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El sistema eph/ephrin, un ejemplo deversatilidad y diversidad funcional enbiología molecular del cáncer y laangiogénesis

The eph/ephrin system, an example ofversatility and functional diversity inmolecular biology of cancer andangiogenesis

O sistema eph/ephrin, um exemplo deversatilidade e diversidade funcional embiologia molecular do câncer e aangiogênese

Martín C. Gómez, Gabriela B. Bravo, Carla Gatto Cáceres, Adrián Góngora, Alberto Baldi

Resumen

Los receptores Eph y Ephrin son moléculas altamente ver-sátiles, reguladoras de procesos tan diversos como la guía deaxones, la modulación de plasticidad sináptica, la morfogé-nesis del sistema vascular y el tamaño y organización de ór-ganos. Los receptores Eph comprenden la familia más nu-merosa de receptores de tirosina quinasa y sus ligandosEphrin están anclados o atraviesan la membrana plasmática.El sistema Eph/Ephrin se caracteriza por desencadenar víasde señalización bi-direccional, tanto a través del receptorcomo a través del ligando. Mediante contacto célula-célula,y dependiendo del repertorio de receptores expresados, deltipo y el contexto celular, pueden controlar respuestas ce-lulares muy diversas como la adhesión, morfología, prolife-ración y migración. Estos roles no están confinados a pro-cesos fisiológicos, sino su importancia resalta aún más enuna variedad de patologías humanas y, en particular, en cán-cer. El receptor EphB4 está sobre-expresado en varios tipostumorales y, con respecto a su funcionamiento, diversos ar-tículos publicados muestran discrepancias, ya que su acti-vación puede desencadenar señales pro- o anti-tumorales se-gún la naturaleza del contexto celular. La expresión de suligando EphrinB2, tanto en las células tumorales como enel endotelio asociado, está relacionado a su alta vasculari-zación. Entender los mecanismos que controlan la funcióndel sistema Eph/Ephrin proporcionaría conocimientos pro-fundos para comprender los principios biológicos y permitirel desarrollo de nuevas drogas terapéuticas. Por ejemplo,mientras que anticuerpos contra VEGF ya son utilizadospara el tratamiento del cáncer, la interferencia simultánea

del sistema EphB4/EphrinB2 sería útil para actuar durantela angiogénesis tumoral y la progresión del cáncer.

Palabras clave: Eph/Ephrin * angiogénesis

Summary

Eph receptors and Ephrins are highly versatile regulators ofprocesses as diverse as axon guidance, modulation of synap-tic plasticity, morphogenesis of the vascular system or the pat-terning of organs. The Eph receptors are the largest family ofreceptor tyrosine kinases and their Ephrin ligands are boundto the plasmatic membrane or are transmembrane. TheEph/Ephrin system is characterized by activating bi-directionalsignals, throughout both the receptor and the ligand. Bycell-cell contact, and depending on the expressed receptorsset, cell type and context, it can trigger a wide array of cel-lular responses like cell adhesion, morphology, proliferationand migration. These roles are not confined to physiologicalprocesses, but are highly relevant for a variety of humanpathologies and, in particular, cancer. EphrB4 receptor isoverexpressed in various tumor types and with respect to itsfunction, several published articles have shown discrepancies,since its activation can trigger pro- or anti-tumoral signals. Theexpression of its EphrinB2 ligand in both tumor cells and inthe associated endothelium is related to its high vascularity.Thus, understanding the key mechanisms controllingEph/Ephrin function would not only provide deeper insightinto interesting biological principles, but it might also enablethe development of new therapeutic reagents. For example,while antibodies against VEGF are already used for the treat-ment of cancer, inhibition of ephrin-B2 might be useful to si-multaneously interfere with the function of VEGFR2 andVEGFR3, which act together during angiogenesis.

Key words: Eph/Ephrin * angiogenesis

Resumo

Os receptores Eph e Ephrin são moléculas altamente versá-teis, reguladoras de processos tão diversos como guia de axô-nios, modulação de plasticidade sináptica, morfogênese dosistema vascular e o tamanho e organização de órgãos. Osreceptores Eph compreendem a família mais numerosa dereceptores de tirosina quinase e seus ligandos Ephrin estãoancorados ou atravessam a membrana plasmática. O sistemaEph/Ephrin se caracteriza por desencadear vias de sinaliza-ção bidirecional, tanto através do receptor quanto através doligando. Mediante contato célula-célula, e dependendo do re-pertório de receptores expressos, do tipo e o contexto celu-lar, podem controlar respostas celulares muito diversas comoa adesão, morfologia, proliferação e migração. Estes papéisnão estão confinados a processos fisiológicos, mas sua im-portância salienta mais ainda numa variedade de patologiashumanas e, em particular, em câncer. O receptor EphB4 estásobre-expresso em vários tipos tumorais e, com relação a seufuncionamento, diversos artigos publicados mostram diver-gências, visto que sua ativação pode desencadear sinais próou anti-tumorais conforme a natureza do contexto celular. A


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expressão de seu ligando EphrinB2, tanto nas células tu-morais quanto no endotélio associado, está relacionada comsua alta vascularização. Entender os mecanismos que con-trolam a função do sistema Eph/Ephrin proporcionaria co-nhecimentos profundos para compreender os princípios bio-lógicos e permitir também o desenvolvimento de novas drogasterapêuticas. Por exemplo, enquanto anticorpos contra VEGFjá são utilizados para o tratamento do câncer, a interferênciasimultânea do sistema EphB4/EphrinB2 seria útil para atuardurante a angiogênese tumoral e a progressão do câncer.

Palavras chave: Eph/Ephrin * angiogênese

Familias de Eph y Ephrin

Los receptores denominados Eph (erytropoietin-pro-ducing hepatocellular carcinoma) comprenden la familiamás numerosa de receptores de tirosina quinasa delreino animal y están presentes en la mayoría de los tiposcelulares. Los receptores Eph han sido subdivididos endos clases, EphA y EphB, basándose en la homología desus secuencias y en las propiedades de sus ligandos Eph-rins (Eph receptor interacting protein). Estos ligandos se di-viden en EphrinA, los cuales se encuentran anclados a lamembrana plasmática por glucosil-fosfatidil-inositol(GPI), y EphrinB, caracterizados por ser proteínas trans-membrana. A diferencia de los clásicos receptores de fac-tores de crecimiento, la unión del receptor/ligandoEph/Ephrin desencadena transducciones de señales bi-direccionales, tanto en las células que presentan el re-ceptor (proceso denominado “señalización forward”)como también en las células que presentan el ligando(“señalización reverse”)(1). La interacción del receptorEph con su ligando Ephrin conduce a la regulación dela morfología, adhesión y migración a través de la mo-dificación de la organización del citoesqueleto e in-fluenciando las actividades de moléculas de adhesión in-tercelular. Recientes trabajos han mostrado que ademásparticipan en el control de la proliferación y la sobrevida,como también en otras funciones celulares específicas ta-les como plasticidad neuronal, secreción de insulina, re-modelación del hueso y regulación inmunológica (2).

En humanos, nueve receptores EphA (EphA1-EphA9) se unen en forma promiscua a cinco EphrinA(EphrinA1-EphrinA5), y cinco receptores de la subclaseEphB (EphB1-B4 y EphB6) se unen a tres ligandos Eph-rinB (EphrinB1-EphrinB3), con la única excepción queEphB4 sólo es activado por EphrinB2. La parte extrace-lular de los receptores Eph incluye un dominio de unióna Ephrin N-terminal que es necesario y suficiente parael reconocimiento y la unión al ligando, una región ricaen cisteína y dos repeticiones similares a fibronectinatipo III las cuales podrían estar involucradas en las in-teracciones de dimerización receptor-receptor (3). Se-parado por un dominio transmembrana, el dominio ci-toplasmático incluye un segmento yuxtamembrana, un

dominio tirosina quinasa y un dominio SAM. Los ligan-dos de Ephrin están caracterizados por la presencia deun único dominio de unión al receptor en el extremo N-terminal separado de la membrana por un segmento de40 aminoácidos. Las moléculas de la subclase EphrinA,ancladas a la célula por GPI, se encuentran agrupadas endominios de membrana tipo lipid rafts, las cuales estaríanasociadas con proteínas citoplasmáticas. Los ligandos deEphrinB atraviesan la membrana y poseen un dominiocitoplasmático que incluye un motivo PDZ C-terminal,capaz de activar la vía de la familia de quinasa Src (2).

Recientes estudios estructurales y biofísicos sugierenque el mecanismo para la iniciación de la señalizaciónbidireccional involucra inicialmente un contacto célula-célula y posteriormente la unión de ligandos y recepto-res en una relación estequiométrica de 1:1. Estos com-plejos de heterodímeros Eph-Ephrin crean superficiesde interacción que juntan pares de dímeros en estruc-turas tetraméricas desencadenando la señalización “for-ward” y “reverse”. Aunque la formación de estos comple-jos de tetrámeros Eph-Ephrin es suficiente para lafosforilación del receptor, la agregación de varios de es-tos tetrámeros y el tamaño de estos agregados serían ab-solutamente esenciales para determinar la intensidad dela señal y su naturaleza fisiológica. Sin embargo, se hadescrito que existen otros mecanismos que definen la se-ñalización del sistema Eph/Ephrin, como la activaciónen cis entre moléculas receptor y ligando de una mismacélula, la interacción con otros receptores (por ejemplo:Erb2, E-cadherina) (4) y la trans-endocitosis, haciendoque el estudio de este sistema sea un tanto complejo.

Si bien los receptores Eph y sus ligandos Ephrin es-tán presentes en la mayoría de los tipos celulares, sus ac-tividades se encuentran mejor caracterizadas en el sis-tema nervioso central y en el desarrollo embrionario delsistema circulatorio. En el sistema nervioso central re-gulan varios procesos tales como guía de direcciona-miento de axones, la migración de células de la crestaneural y la sinaptogénesis. La activación de receptoresEph en las células de la cresta neural o en los conos decrecimiento axonal dispara la retracción ante los tejidosque expresan las moléculas de ligando Ephrin com-plementarias a los mismos (5).

El corte enzimático de las moléculas de Ephrin porla metaloproteasa ADAM10 unida a membrana pre-senta otra posible explicación molecular para cambiarentre adhesión y repulsión. Se ha mostrado que launión de EphA3 con EphrinA5 expone un motivo dereconocimiento de metaloproteasas y dispara el cortede EphrinA5 por ADAM10. Esta liberación de Ephrinde la superficie del axón conduce a la retracción de lascélulas que expresan EphA5, mientras que el bloqueode la escisión conduce a una interacción adhesiva ex-tensa (6).

Otro mecanismo que media la conversión de inte-racciones adhesivas en señales repulsivas consiste en re-



tirar el complejo Eph-Ephrin de la superficie celular porendocitosis. Durante este proceso denominado transendocitosis, el complejo receptor-ligando intacto, y posi-blemente las proteínas citoplasmáticas asociadas, juntocon la membrana circundante son endocitados por lacélula que expresa Eph o Ephrin. Estructuras intrace-lulares revestidas por doble membrana fueron obser-vadas por microscopía electrónica en hipocampo derata (7). La trans endocitosis cesa la adhesión y permitela retracción celular. Este proceso de despegado de cé-lulas que requiere tanto de la activación de Eph (vía for-ward) como de la internalización del complejo de se-ñalización, depende de la polimerización de moléculasde actina y de la actividad de la GTPasa pequeña Rac1.

Recientes descubrimientos han evidenciado que lainteracción Eph-Ephrin no está confinada a la zona decontacto entre dos células adyacentes, sino que ademásse han reportado interacciones en cis entre receptoresy ligandos expresados en la misma célula. Mientras lasinteracciones convencionales en trans entre células dis-tintas involucran el dominio de Ephrin y el correspon-diente dominio de unión a ligando del receptor, Eph-rinA5 puede unirse en cis al dominio extracelular defibronectina tipo III del receptor EphA3 en la misma cé-lula, bloqueando la activación del mismo y contrarres-tando la señalización forward desencadenada por elcontacto célula-célula. Este modelo de inhibición en cispodría explicar cómo se generan gradientes de recep-tores activos parcialmente solapados durante el desa-rrollo del sistema visual (8).

Eph y ephrin en el sistema cardiovascular

El posicionamiento espacial y temporal apropiado decélulas endoteliales durante el nacimiento de los vasoses un requerimiento necesario para la formación deanastomosis y redes diferenciadas de vasos sanguíneosque eventualmente permitirían la dirección del flujosanguíneo. Diversas moléculas Eph-Ephrin son expre-sadas en el sistema cardiovascular, sin embargo EphB4y su ligando EphrinB2 han atraído mayor interés. Eph-rinB2 es expresada principalmente en el endotelio ar-terial, mientras que EphB4 es específica del endoteliovenoso. Por esto, se ha propuesto a estas dos moléculascomo marcadores candidatos para la diferenciación ar-terio-venosa (9). La relevancia del funcionamiento deEphB4 y EphrinB2 durante la vasculogénesis es indis-cutida, dado que ratones transgénicos knockout paraEphB4 o EphrinB2 mueren en estadíos embrionariostempranos por una desorganización de vasos sanguí-neos. Recientemente se demostró que el calibre de ar-terias y venas y la localización de células endotelialescuyo destino es la aorta o las venas cardinales está fina-mente regulado por un balance entre Notch y el sistemaEphB4/EphrinB2 (10).

Durante etapas tardías del desarrollo embrionario yen el adulto, la formación regenerativa o patológica denuevos vasos se caracteriza por el remodelamiento y lageneración de nuevos capilares por brotación de la vas-culatura existente, proceso denominado angiogénesis.La expresión de EphrinB2 está aumentada durante elremodelamiento activo de vasos, sin embargo su roldurante la angiogénesis no es tan claro. La activación deEphB4 en células endoteliales en cultivo y en la córneade ratón induce la proliferación, la migración, la for-mación de túbulos y la angiogénesis (9) lo que indica-ría que la vía forward puede promover la brotación denuevos vasos. En modelos de isquemia cardíaca se ob-servó que EphrinB2 señalizando a través de EphB4 escapaz de estimular la mitosis de cardiomiocitos, au-mentar la densidad de capilares y el desarrollo de vasoscolaterales funcionales (11), sugiriendo a EphrinB2como un candidato potencial para la terapia angiogé-nica en enfermedades de isquemia de corazón.

Eph y Ephrin en cáncer

EphA1 fue el primer miembro de la familia de re-ceptores Eph en ser clonado a partir de una línea celu-lar de carcinoma hepatocelular humano productor deeritropoyetina. EphA1 se encuentra sobre-expresado enesta línea celular en niveles relativamente elevados, loque sugirió a esta nueva familia de tirosina quinasa unrol en la tumorigénesis (12). Desde entonces, cadamiembro de la familia Eph ha sido identificado por suscaracterísticas de expresión o desregulación en dife-rentes tipos de tumores humanos (13). Entre los recep-tores EphA, EphA2 ha sido el más intensamente estu-diado en oncología y sus altos niveles de expresión estáncorrelacionados con el estadío y la progresión del tumor.Además, la sobre-expresión de EphA2 en células epite-liales no transformadas de mama induce transforma-ción maligna y confiere potencial tumorigénico (14).

Las funciones durante la tumorigénesis de los recep-tores y ligandos de la clase B parecen más complejas. Lasobre-expresión de EphrinB2 en células de cáncer pareceestar correlacionada con un aumento de invasión y unaalta vascularización de tumores humanos conduciendo aun pobre pronóstico. El receptor EphB4 se encuentra so-bre-expresado en diversos tumores humanos y con res-pecto a su funcionamiento, diversos artículos publicadosmuestran discrepancias, ya que su activación puede de-sencadenar tanto señales pro-oncogénicas como tam-bién señales anti-tumorales, según la naturaleza del con-texto celular. EphB4 incrementa el crecimiento tumoral,la motilidad de células cancerosas y la metástasis en lapróstata, mesotelio y útero. Por otra parte, también pa-rece actuar como supresor de tumores en cáncer demama y colon. Diversas estrategias han sido exploradaspara evidenciar el funcionamiento de EphB4. Mediante


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la inhibición de la señalización por EphB4 utilizando re-ceptores EphB4 truncados solubles, sobre-expresandoun dominante negativo del receptor, o bien mediantetécnicas de interferencia de ARN se observó una dismi-nución de la proliferación, migración y del crecimientotumoral en modelos de melanoma y de próstata(15)(16). Hemos observado en nuestro modelo de cé-lulas de melanoma humano que el estímulo con molé-culas solubles de EphrinB2 activa el receptor EphB4 e in-duce la proliferación y migración (datos aun nopublicados). En células de cáncer de mama, sorpresiva-mente se observó que a pesar de los niveles de expresiónde EphB4, la fosforilación en tirosinas es mucho másbaja comparada con células epiteliales MCF-10A notransformadas (17), y la activación del receptor EphB4y señalización mediante la vía Abl–Crk inhibe la capaci-dad tumoral de células de cáncer de mama.

El efecto promotor de tumores durante el creci-miento de un tumor de mama podría no depender ex-clusivamente de la señalización forward de EphB4. Se ob-servó que la expresión de un receptor EphB4 con sudominio citoplasmático defectivo resultó en un incre-mento del crecimiento del tumor y un fuerte desarro-llo de la angiogénesis tumoral (18). Este descubrimientoresalta a la señalización reverse mediante la molécula deEphrinB2 e implica la participación de interaccionesEphB4/EphrinB2 entre células tumorales y células delestroma. Además, la señalización por EphrinB2 tambiénpromueve la interacción entre células endoteliales, pe-ricitos y células de la musculatura lisa vascular (19), su-giriendo que la regulación por EphrinB2 podría esta-bilizar los vasos de los tumores recurrentes después deuna terapia anti-angiogénica utilizando anticuerposcontra el factor de crecimiento endotelio vascular(VEGF). Siguiendo este razonamiento, inhibir el sis-tema de Eph podría ser particularmente útil para tera-pias anti-angiogénicas, y posiblemente lograría superarla resistencia a las terapias anti VEGF.

Hasta la actualidad, se han identificado moléculas pe-queñas que inhiben la actividad del dominio quinasa deEph y dos de ellas, dasatinib y XL647, han sido evalua-das en ensayos clínicos. Dasatinib es un potente inhibi-dor de EphA2, estudiado hasta fase II en leucemia mie-loide crónica y en tumores sólidos, mientras que XL647,probado en cáncer de pulmón, es un inhibidor de EphB4y de los receptores del factor de crecimiento epidérmico(EGF) y VEGF (http://clinicaltrials.gov). Otra estrategiade terapia anti-angiogénica para el cáncer ha consistidoen inhibir las interacciones Eph/Ephrin y la señalizaciónbidireccional. Para esto se han desarrollado moléculaspequeñas, péptidos, receptores solubles y anticuerposmonoclonales antagonistas (20) que han sido capaces dedisminuir con el crecimiento tumoral y la angiogénesisasociada en diferentes modelos in vitro y en ratón. De ma-nera interesante, existen también anticuerpos agonistasy ligandos que han sido utilizados exitosamente para re-

ducir la progresión tumoral, a pesar de ser activadoresde la señalización de Eph/Ephrin (17). La respuestaante una terapia particular contra el sistemaEph/Ephrin dependerá del tipo de tumor, del estadíode avance y del microambiente tumoral. Seleccionar laestrategia óptima enfocada en interferir con las funcio-nes de Eph como terapia contra el cáncer requiere unmejor entendimiento de los mecanismos de señalizaciónen los diferentes compartimientos celulares del tumor.


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LABORATORIO DEINMUNOHEMATOLOGÍA

Importancia de las Células MadreMesenquimales en el desarrollo delcáncer de mama

Importance of mesenchymal stem cells inbreast cancer developmentImportância das Células TroncoMesenquimais no desenvolvimento docâncer de mama

Valeria Fernández Vallone, Vivian Labovsky, Leandro Martinez, Norma Chasseing

Resumen

La mayoría de las pacientes con cáncer de mama (PCM)avanzado desarrollan metástasis óseas, de tipo osteolíticas,como resultado de un desbalance entre los procesos de os-teogénesis, osteoclastogénesis y resorción ósea. Nosotros en-contramos en la médula ósea (MO) de las PCM avanzado(carcinoma mamario ductal infiltrante, estadío clínico III yIV, sin metástasis en MO y hueso) una disminución de la efi-ciencia de clonado de las células madre mesenquimales(MSC), medida como el número de unidades formadoras decolonias fibroblásticas (CFU-F), así como una disminuciónen su capacidad de diferenciación osteogénica en compa-ración con las voluntarias sanas (VS). Además, observamososteoclastogénesis espontánea en MO y sangre periférica de

las PCM, mientras que no lo hicimos en las VS. Por último,consideramos importante la evaluación de la diferenciaciónosteogénica de las MSC de MO y del potencial osteoclasto-génico de los progenitores hematopoyéticos de MO y de losmonocitos de sangre periférica, como posibles factores pro-nósticos de futuros desórdenes óseos que pueden favorecerla invasión de las células del CM en el hueso.

Palabras clave: células madre mesenquimales * cáncer de

mama * médula ósea * hueso * osteogénesis * osteoclasto-

génesis

Summary

Most advanced breast cancer patients (BCP) develop oste-olytic bone metastasis as a result of the imbalance betweenosteogenesis, osteoclastogenesis and bone resorptionprocesses.In bone marrow (BM) aspirates of untreated BCP(infiltrative ductal breast carcinoma, clinical stage III and IV,without bone and BM metastasis), a decrease in cloning ef-ficiency of BM-mesenchymal stem cells (MSC), measured asnumber of colony forming unit-fibroblasts (CFU-F), and a de-crease in its osteogenic differentiation capacity compared tohealthy volunteers (HV) were found . Moreover, spontaneousosteoclastogenesis (SpOC) in BM and peripheral blood ofBCP were observed, while SpOC was not observed in BM ofHV. Finally, evaluation of the osteogenic differentiation ofBM-MSC and osteoclastogenic potential of BM-hematopoi-etic progenitors as well as peripheral blood-monocytes areconsidered important as possible prognostic factors for fu-ture bone disorders that may favor the invasion of BC cellsinto bone.

Key words: mesenchymal stem cell * breast cancer * bone

marrow * bone * osteogenesis *osteoclastogenesis

Resumo

A maior parte das pacientes com câncer de mama (PCM)avançado desenvolve metástases ósseas, de tipo osteolíticas,como resultado de um desequilíbrio entre os processos de os-teogênese, osteoclastogênese e ressorção óssea. Nós en-contramos na medula óssea (MO) das PCM avançado (car-cinoma mamário ductal infiltrante, estágío clínico III e IV,sem metástase em MO e osso) uma diminuição da eficiên-cia de clonagem das células tronco mesenquimais (MSC),medida como o número de unidades formadoras de colôniasfibroblásticas (CFU-F), bem como uma diminuição em suacapacidade de diferenciação osteogênica em comparaçãocom as voluntárias saudáveis (VS). Além disso, observamososteoclastogênese espontânea em MO e sangue periféricadas PCM, enquanto que não o fizemos nas VS. Por último,consideramos importante a avaliação da diferenciação os-teogênica das MSC de MO e do potencial osteoclastogênicodos progenitores hematopoiéticos de MO e dos monócitos desangue periférico, como possíveis fatores prognósticos de fu-turas desordens ósseas que possam favorecer a invasão dascélulas do CM no osso.

Palavras chave: células tronco mesenquimais, câncer de

mama, medula óssea, osso, osteogênese, osteoclastogênese


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El cáncer de mama, a pesar de ser tema de gran nú-mero de investigaciones, continúa siendo el tipo de cán-cer más común entre las mujeres y la segunda causa demuerte particularmente en EE.UU. (1). Cada año, másde 44.000 mujeres mueren de cáncer de mama. La esta-dística indica que la mortalidad en el año 2000 fue de24,2 y 26,7 en EE.UU. y Argentina, respectivamente (1).En ambos casos, se trata de cifras de mortalidad especí-fica expresadas como número de muertes por año, por100.000 habitantes. Y a pesar de los esfuerzos realizadospara detectar el cáncer mama en estadíos tempranos, estono garantiza la mejor sobrevida del paciente. Observa-ción que indica la necesidad de contar con métodos mássensibles para detectar las células epiteliales tumoralesmamarias (CEpTM) y/o las células madre tumorales(TSC) presentes en la mama, así como también la nece-sidad de continuar profundizando sobre la biología delcáncer de mama en sus estadíos iniciales y estudiando losmecanismos que llevan al desarrollo de las metástasis.

Por otra parte, el cáncer fue considerado durantemucho tiempo como un desorden constituido por cé-lulas transformadas que adquirieron un alto grado deproliferación y autorrenovación, así como mayor capa-cidad de sobrevida e invasión a través de la activación deoncogenes e inactivación de genes supresores del tumor(2). Sin embargo, en los últimos años se demostró quela formación de un tumor clínicamente relevante de-pende de la composición y función del microambientetumoral (MT) formado por células estromales y acceso-rias, matriz extracelular y factores solubles (2). Dentrode este MT se han encontrado fibroblastos, pericitos, leu-cocitos (linfocitos T y B, células naturalmente citotóxi-cas, neutrófilos, eosinófilos, monocitos-macrófagos, ba-sófilos y mastocitos), miofibroblastos, células dendríticas,células derivadas de médula ósea (MO) entre las cualesse encuentran las células madre mesenquimales (MSC)y los progenitores mesenquimales, células endotelialesvasculares linfáticas y de sangre (2). Numerosos estudiosexperimentales muestran una interacción activa y recí-proca entre las CEpTM y las células estromales/ acce-sorias y demás componentes del MT, eventos críticos quedeterminan y promueven el crecimiento del tumor pri-mitivo y su progresión hacia una futura metástasis (2).Por lo tanto, el análisis del MT, en particular la presen-cia y función de las MSC de MO, así como de los pro-genitores endoteliales y células endoteliales, fibroblastosasociados al tumor y macrófagos asociados al tumor detipo M2, son actualmente tema de múltiples estudios des-tinados a comprender más sobre la biología del tumory así poder desarrollar tratamientos terapéuticos que in-hiban o retrasen el crecimiento del tumor primitivo y lasmetástasis (3)(4).

Por otro lado, el cerebro, hueso, hígado y pulmón sonlos sitios preferidos de metástasis en las pacientes concáncer de mama (PCM). Ha sido reportado que las me-tástasis pueden ocurrir incluso en ausencia del tumor

primario de mama y, en hueso, es el resultado de un des-balance fisiológico y físico como son la lesión lítica y lahipercalcemia (5). Es importante recordar que las me-tástasis óseas se expresan clínicamente por: 1)- Doloróseo en el 60-70% de las PCM; 2)- Fractura patológica enel 30-40% de las PCM (68% en fémur y 28% en hú-mero); 3)- Síndrome de comprensión medular en el 20-30% de las PCM; 4)- Hipercalcemia en el 15% de lasPCM y 5)- en los casos de afección vertebral, puede exis-tir dolor local e irradiado, con o sin signos de déficit neu-rológico. Alteraciones que reducen la calidad de vida delpaciente y se suman por lo tanto a la necesidad de pro-fundizar sobre la compleja interacción entre las CEpTMy los componentes de MO y hueso (1)(5). Ambos tejidosproveen un microambiente favorable donde las célulastumorales pueden proliferar y, así, la MO y el hueso seconvierten en un reservorio de la enfermedad. Muchosavances recientes se han realizado en el tratamientoquimioterápico de las PCM avanzado (estadío clínico IIIy IV) pero la principal limitación es la falta de respuestaal tratamiento de las CEpTM quiescentes presentes enMO, así como la presencia de células madre tumorales.

Hasta el momento, no se ha descrito en humanos, si an-terior al desorden óseo que implica la invasión tumoral ydesarrollo de la metástasis ósea (MTsO) existe una altera-ción en el potencial osteogénico de la MSC de MO paradar osteoblastos/osteocito y/o en su migración al huesoafectado. Y tampoco se estudió in vitro qué pasaba con laformación de osteoclastos a partir del progenitor hema-topoyético comprometido con el linaje monocítico de laMO en estas PCM avanzado sin MTsO. Sin embargo, lo quesí se encontró recientemente, es que la producción y ac-tividad de los osteoclastos está regulada por los factores so-lubles liberados tanto por las MSC como por preosteo-blastos/ osteoblastos, así como por las CEpTM presentesen el hueso con metástasis [RANKL, M-CSF, TRAIL, OPG(receptor soluble de RANKL soluble o RANKL de mem-brana y TRAIL), IL-1β, IL-6, IL-11, IL-8, MIP-1α, PTHrP,TNF-α, TGF-β, PGE2, MMP-7, etc.], sin descartar un efectoindirecto por la liberación de estos factores desde el tumorprimario en mama (6, 7). Los factores osteoclastogénicospueden ser de acción directa como el RANKL, IL-11 o in-directa como la PTHrP, IL-6, IL-1, MIP-1α, PGE2, TNF-α,MMP-7 pues inducen la liberación de M-CSF y RANKL porparte del osteoblasto y MSC del microambiente de MO yhueso afectado (6, 7). En relación a la formación de oste-oclasto, el RANKL se une a su receptor el RANK presenteen la membrana del preosteoclasto estimulando sucesiva-mente la diferenciación, la fusión a una célula multinu-cleada, la activación y la sobrevida del osteoclasto (8).Además, el M-CSF es un factor primordial en la osteoclas-togénesis pues incrementa directamente el pool de pre-osteoclastos en hueso y favorece la diferenciación a oste-oclasto pues al unirse a su receptor el c-fms presente en lamembrana del preosteoclasto incrementa la expresión deRANK y su unión con RANKL (8).



En trabajos anteriores demostramos, por primeravez, una disminución significativa de la capacidad declonado de las MSC para dar unidades formadoras decolonias fibroblásticas (CFU-F) en MO de PCM avan-zado, libres de tratamiento y sin metástasis en MO yhueso, así como una disminución significativa del po-tencial osteogénico de las MSC de MO de estas PCM encomparación con las voluntarias sanas (VS) (9). Hechosambos que se asocian posiblemente a una disminuciónde los niveles de Dkk-1 en los medios condicionados delos cultivos de CFU-F= MSC (Dkk-1 en medio de no di-ferenciación favorece la proliferación de la MSC y su so-brevida) y a un aumento de los niveles de Dkk-1 libe-rado en los medios condicionados de las MSC cultivadasen medio de diferenciación osteogénico (Dkk-1 inhi-bidor de la vía de las Wnt, factor este último inductor dela diferenciación osteogénica de la MSC), resultados es-tos últimos que encontramos en estas PCM (10). Tam-bién cuantificamos un incremento significativo de Dkk-1 en plasma de sangre periférica (SP) de estas PCMavanzado en comparación con las VS (11).

Por otra lado, observamos osteoclastogénesis espon-tánea in vitro en estas PCM avanzado (libres de trata-miento y sin MTsO), independiente de que la diferen-ciación se hiciera a partir de precursores mielomono-cíticos de MO o de monocitos CD14+ de SP en compa-ración con las VS que presentaron una nula o mínimaformación espontánea de osteoclastos. Los cultivos delas PCM tampoco respondieron in vitro a los factores os-teoclastogénicos conocidos (vitamina D3, RANKL y M-CSF). Mas aún, los medios condicionados de los cultivosde células mononucleares, no estimuladas, de MO de es-tas PCM avanzado fueron capaces de inducir la dife-renciación osteoclástica de monocitos de SP de las VS avalores de % de osteoclasto semejantes al inducido conM-CSF + RANKL (11). Mas aún, se evaluó un incrementosignificativo de RANKL soluble y Dkk-1 (inhibidor de laosteogénesis e indirecto activador de la osteoclastogénesispor favorecer el pool de osteoblastos productores deRANKL) en SP de estas PCM; incremento significativode ICAMs (activador de osteoclastos y factor que favorecela proliferación, migración y MTsO de la CEpTM) y dis-minución significativa de IL-10 (factor anti-osteoclasto-génico e inhibidor de algunos tumores) ambos en SP deestas PCM en comparación con las VS e incremento sig-nificativo de GM-CSF (factor que en exceso favorece lamultinucleación de los preosteoclastos y su actividad) enlos medios condicionados (7 días) de MSC de las PCM,así como un incremento en la expresión/ MSC de RANKLde membrana en estas pacientes (11). Todos los factoresantes descriptos favorecen la osteoclastogénesis espon-tánea encontrada en MO y SP de estas PCM avanzado,pudiendo ser marcadores pronóstico de futuras MTsO.

Por último, encontramos que las MSC que quedancomo reserva en la MO de las PCM avanzado, sin MTsO,poseen una disminución significativa de la capacidad de

diferenciación no sólo osteogénica como se detallóanteriormente sino también adipogénica, a expensa dellinaje condrogénico que está aumentado respecto a losvalores de las VS. Esta deficiente plasticidad de la MSC deMO de estas PCM avanzado se relaciona con ladisminución del % de la población de MSC con fenotipoCD146+ (marcador de MSC del nicho vascular) así comocon una disminución del índice de fluorescencia relativade CD146. Otros autores encontraron (12) que la mayorintensidad de fluorescencia relativa de CD146/ MSCcorresponden a las MSC que presentan triple plasticidady mayor autorrenovación, así como mayor capacidad deregular la hematopoyesis en comparación a las queexpresan menos intensidad de fluorescencia relativa quecorresponden a las MSC unipotenciales de baja eficienciade clonado. De este último resultado y de nuestros estu-dios de años anteriores se desprende que en estas PCMavanzado previa aparición de las MTsO existe un menorreservorio de MSC con alta autorrenovación, sobrevida,migración y multipotencialidad, pues posiblemente al ini-cio del desarrollo tumoral hayan migrado las más efecti-vas al tumor primitivo como se describió en modelos mu-rinos y las que quedan en la MO en este momento deldesarrollo tumoral tengan como función principal favo-recer la osteoclastogénesis y resorción ósea, procesosambos que favorecen el desarrollo de las MTOs.


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Glicómica de la respuesta inmune: eluniverso de glicanos y lectinas enmicroambientes inflamatorios y neoplásicos

Glycomics of the immune response: the universe of glycans and lectins ininflammatory and neoplasicmicroenvironments

Glicômica da resposta imune: o universo deglicanos e lectinas em microambientesinflamatórios e neoplásicos

Victoria Sundblad, Juan P. Cerliani, Daniel Compagno,Diego O Croci, Tomas Dalotto Moreno, L. Sebastián Dergan-Dylon, Santiago Di Lella, Claudia Gatto, Lucas Gentilini, Laura Giribaldi,Carlos M. Guardia, Juan M. Ilarregui, Diego J. Laderach, Verónica Martinez Alló, Iván D. Mascanfroni, Santiago Méndez Huergo,Mariana Salatino, Juan C. Stupirski, Marta A. Toscano,Gabriel A. Rabinovich

Resumen

Las galectinas, una familia de lectinas que reconocen glico-conjugados específicos en la superficie celular y la matriz, par-ticipan en diversos procesos biológicos como reguladores de la ho-meostasis de la respuesta inmune y de la progresión tumoral.Considerando el papel inmunomodulador de Galectina-1 (Gal-1) en modelos de inflamación crónica y su contribución a la cre-ación de microambientes tolerogénicos, durante los últimos añosexploramos el impacto de esta proteína sobre el balance de cé-lulas T y la funcionalidad de células dendríticas (CDs). Mientraslas células Th1 y Th17 poseen el repertorio de glicanos necesa-rios para la unión de Gal-1, los linfocitos Th2 son resistentes ala unión de esta proteína, lo cual explicaría el incremento en lasusceptibilidad de los linfocitos Th1 y Th17 a la apoptosis in-ducida por Gal-1 y la consecuente desviación en el balance dela respuesta inmune hacia un perfil Th2. Además, identificamosun circuito tolerogénico en el que Gal‐1 induce la diferenciaciónde CDs tolerogénicas productoras de IL‐27, la consecuente ex-pansión de células T regulatorias productoras de IL‐10 y la su-presión de la inflamación mediada por células Th1 y Th17. Pos-tulamos un nuevo mecanismo de regulación homeostática de larespuesta inmune basado en la interacción entre Gal‐1 y sus gli-canos específicos, el cual permite anticipar nuevos horizontes te-rapéuticos, en los que la modulación de la expresión de Gal‐1 osus glicanos nos permitiría regular la respuesta inmune.

Palabras clave: galectina-1 * células T * células dendríticas *

tolerancia inmunológica

Summary

Galectins, a family of endogenous glycan-binding proteins ableto recognize specific glycoconjugates on cell surface and extra-cellular matrix, control critical immunological processes in-volved in immune homeostasis and tumor progression. Given theimmunosuppressive role of Galectin-1 (Gal-1) in different mod-els of chronic inflammation and its contribution to the creationof tolerogenic microenvironments in cancer and pregnancy mod-els, the impact of this protein on T helper cell balance and den-dritic cells (DCs) functionality was explored. A novel mechanism,based on the differential glycosylation of T helper cell subsets,by which Gal-1 preferentially eliminates antigen-specific Th1 andTh17 cells, leading to a shift toward a Th2 profile was identified.While Th1- and Th-17–differentiated cells expressed the reper-toire of cell surface glycans that are critical for Gal-1–inducedcell death, Th2 cells are protected from Gal-1 through differentialsialylation of cell surface glycoproteins. More recently, the abil-ity of Gal-1 to trigger the differentiation of tolerogenic dendriticcells (DCs), which promote resolution of autoimmune inflam-mation, was demonstrated. A tolerogenic circuit linking Gal-1 sig-naling, IL-27-producing DCs and IL-10-secreting T cells wasidentified. It can be postulated that molecular interactions be-tween endogenous galectins and specific glycans constitute anovel mechanism of homeostatic regulation of immune re-sponses. Understanding the role of protein-glycan interactionsin the establishment of tolerogenic or inflammatory programs willenable the design of more rational immunotherapeutic strategieswith broad biomedical implications.Key words: galectin-1* T cells* dendritic cells * immune tol-erance



Resumo

As galectinas, uma família de lectinas que reconhecem gli-coconjugados específicos na superfície celular e a matriz,participam em diversos processos biológicos como regula-dores da homeostase da resposta imune e da progressão tu-moral. Considerando o papel imunomodulador de Galec-tina-1 (Gal-1) em modelos de inflamação crônica e suacontribuição à criação de microambientes tolerogênicos,durante os últimos anos exploramos o impacto desta proteínasobre o balanço de células T e a funcionalidade de célulasdendríticas (CDs). Enquanto as células Th1 e Th17 possuemo repertório de glicanos necessários para a união de Gal-1,os linfócitos Th2 são resistentes à união desta proteína, oqual explicaria o incremento na suscetibilidade dos linfóci-tos Th1 e Th17 à apoptose induzida por Gal-1 e o conse-guinte desvio no balanço da resposta imune para um perfilTh2. Além disso, identificamos um circuito tolerogênico noqual Gal‐1 induz a diferenciação de CDs tolerogênicas pro-dutoras de IL‐27, a conseguinte expansão de células T re-gulatórias produtoras de IL‐10 e a supressão da inflamaçãomediada por células Th1 e Th17. Postulamos um novo me-canismo de regulação homeostática da resposta imune ba-seado na interação entre Gal‐1 e seus glicanos específicos,que permite antecipar novos horizontes terapêuticos, nosquais a modulação da expressão de Gal‐1 ou seus glicanosnos permitiria regular a resposta imune.

Palavras chave: galectina-1 * células T * células dendríticas *

tolerância imunológica

Introducción

En los últimos años, el estudio de la glicosilación di-ferencial de proteínas de superficie celular ha cobradorenovado interés, debido a la posibilidad de descifrar in-formación biológica clave codificada en sacáridos espe-cíficos (1). Una gran variedad de glicanos, producto dela acción secuencial de un amplio repertorio de enzimasdenominadas glicosiltransferasas y glicosidasas, decora lasuperficie de las células de nuestro organismo (2). La gli-cosilación de proteínas de superficie de células del sis-tema inmune puede modificarse drásticamente en con-diciones fisiológicas y patológicas, regulando de estaforma procesos críticos de la respuesta inmune, talescomo la activación de células T, la migración linfocitariay la síntesis de citoquinas (1). Es así que el repertorio deglicanos en la superficie celular codifica información fi-siológica clave que regula la homeostasis del sistema in-mune. La tarea de decodificar dicha información recaesobre un número limitado de proteínas de unión a gli-canos o lectinas endógenas (1)(3).

Las galectinas constituyen una familia de lectinasextremadamente conservadas a través de la evoluciónque reconocen y se unen a glicanos con configuración[Galβ1-4-NAcGlc] (4). Durante los últimos años se hainvolucrado a esta familia en diversos procesos biológi-

cos como reguladores de la homeostasis de la respuestainmune (3) y de la progresión tumoral (6). Hasta el mo-mento se han descripto 15 miembros de esta familia endiversos tejidos de distintas especies (4). A pesar de lasimilitud de secuencia y especificidad de interaccióncon carbohidratos, algunos miembros de la familia degalectinas se comportan como amplificadores de la res-puesta inmune, mientras que otros regulan negativa-mente el desarrollo de procesos inflamatorios (3).

Gal-1: una lectina endógena con propiedadesanti-inflamatorias

Numerosas evidencias asignan a galectina-1 (Gal-1),un miembro ‘proto-tipo’ de la familia de galectinas,una función crítica en la homeostasis de la respuesta in-mune e inflamatoria (3)(4) (Figura 1). Esta proteína escapaz de inhibir la proliferación y expansión clonal delinfocitos T activados, mediante mecanismos que invo-lucran bloqueo de la activación, arresto del ciclo celu-lar e inducción de apoptosis (3)(4). Gal-1 se halla au-sente en linfocitos T en reposo; sin embargo comienzaa expresarse durante la activación de células T contri-buyendo de este modo a la regulación negativa de la res-puesta efectora. Más aún, se ha demostrado que Gal-1se expresa en forma incrementada en células T regula-torias CD4+CD25+FoxP3+ contribuyendo a su potencialinmunosupresor (3)(4).

En diferentes modelos experimentales de inflama-ción crónica y autoinmunidad (incluidos modelos de ar-tritis reumatoidea, enfermedad inflamatoria intestinal,uveitis autoinmune y diabetes), la administración exó-gena de Gal-1 logró suprimir la inflamación depen-diente de citoquinas Th1, promoviendo un incrementoen la apoptosis de linfocitos T patogénicos y un desvíode la respuesta inflamatoria hacia un perfil Th2 (4). Porotro lado, en un modelo murino de abortos inducidospor stress, observamos que Gal-1 logró reestablecer la to-lerancia inmunológica, disminuyendo las tasas de re-chazo fetal al incrementar la frecuencia de células T re-gulatorias y células dendríticas (DCs) tolerogénicas enla interfase materno-fetal (5).

Se ha observado que Gal-1 se expresa en forma abun-dante en diversos tipos de tumores tales como próstata,melanoma, ovario, y mama, y su expresión correlacionacon la malignidad de dichos tumores y su potencialmetastásico (6). En este contexto, en nuestro laborato-rio demostramos que Gal-1 juega un papel crítico en fe-nómenos inmunosupresores en el microambiente tu-moral. En el modelo experimental de melanoma B16en ratones, demostramos previamente que Gal-1, sin-tetizada y secretada por células de melanoma, inhibe eldesarrollo de una respuesta inmune Th1 antitumoralefectiva favoreciendo la progresión tumoral (7). El blo-queo de la actividad inmunosupresora de Gal-1 en el mi-


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croambiente tumoral condujo a una respuesta mediadapor células CD8 y Th1, lo cual resultó en un rechazo tu-moral. Este efecto lo confirmamos en linfoma Hodgkindemostrando el papel de Gal-1 como factor promotordel escape tumoral a través de un mecanismo depen-diente del factor de transcripción AP1 (8). En con-junto, estos hallazgos sugieren fuertemente que la ex-presión de Gal-1 por células tumorales constituye unnuevo mecanismo de escape tumoral.

Teniendo en cuenta el papel de Gal-1 en diferentesmodelos de inflamación crónica y su contribución a lacreación de microambientes tolerógenicos, el estudiode los posibles mecanismos involucrados en estos efec-tos resulta de particular interés. Es así que en el labo-ratorio exploramos el impacto de Gal-1 sobre el ba-lance de células T efectoras, y su efecto sobre lafuncionalidad de DCs.

Impacto de la interacción entre Gal-1 y glicanosen la regulación de la fisiología de células T

Procesos como maduración tímica, activación, mi-gración y apoptosis de linfocitos T constituyen algunos delos eventos de la fisiología linfocitaria que son reguladospor interacciones entre proteínas y glicanos (9). Se ha de-mostrado que Gal-1 interacciona con alta avidez con gli-coconjugados que contienen residuos poli-LacNAc pre-sentes en N- y O-glicanos (3)(4). La expresión y actividadde las glicosiltransferasas involucradas en la síntesis de se-cuencias de poli-LacNAc determinan la susceptibilidad ala apoptosis inducida por esta lectina in vivo. Además, laincorporación de ácido siálico en un enlace α(2→6) a li-

gandos poli-LacNAc en N-glicanos, por la enzima ST6GalI, inhibe la unión de Gal-1 y reduce la susceptibilidad delinfocitos T a la acción de esta proteína (3). De estemodo, el enmascaramiento de ligandos específicos en lasuperficie celular podría controlar la unión de Gal-1 y evi-tar la inducción de apoptosis de linfocitos T.

En este sentido, en el laboratorio demostramos quela interacción entre Gal‐1 y sus glicanos específicosconstituye un paso clave en la regulación homeostáticaselectiva de las respuestas T. Notablemente, observamosque linfocitos Th1, Th2 y Th17 presentan una suscep-tibilidad diferencial a la apoptosis inducida por Gal-1.Al explorar los mecanismos involucrados, encontramosque, mientras las células Th1 y Th17 poseen el reper-torio de glicanos necesarios para la unión de Gal-1, loslinfocitos Th2 son resistentes a la unión de esta prote-ína ya que los residuos LacNAc se hallan decoradoscon acido siálico en posición α2,6 merced a la expresiónde la sialiltransferasa ST6Gal I. In vivo, demostramosque la administración de Gal‐1 inhibe la inflamaciónmediada por células Th1 y Th17 durante la encefalo-mielitis autoinmune experimental (EAE). En este con-texto, ratones deficientes en el gen de Gal-1 (Lgals1-/-)exhiben un incremento de la severidad de la respuestainflamatoria frente al desafío con estímulos antigénicosen modelos experimentales de autoinmunidad (10).

Papel crítico de Gal-1 en la diferenciación de células dendríticas tolerogénicas

Las DCs son células presentadoras de antígeno alta-mente especializadas en reconocer, procesar y presentar



Figura 1. Propiedades inmunomoduladoras de Galectina-1 (Gal-1)

Localización:En sitios inmunoprivilegiados:Retina, testículo, placenta y tumores.En diferentes tipos celulares del sistemainmune:• Macrófagos activados• Limfocitos T activados• Linfocitos B activados

Suprime las manifestaciones clinicas endiferentes modelos experimentales deinflamación crónica y autoinmunidad:• Artritis inducida por colágeno (Rabino et al., J Exp Med (1999).• Colitis experimental inducida por TNBS(Santucci et al., Gastroenterol, 2003).• Hepatitis inducida por ConA (Santucci et al., Hepatology, 2000)• Diabetes autoinmune experimental (Perone et al., J Immunol, 2006)• Uveítis autoinmune experimental(Toscano et al., J Immunol, 2006)• Encefalomielitis autoinmune experimental(Toscano et al., Nat Immunol, 2007)

Estructura:Galectina prototipo.Homodímero compuesto por dossubunidades de 14.5 kDa

El bloque de la expresión génica de Gal-1 en elmicroambiente tumoral genera una respuestade tipo Th1 previamente reprimible(Rubinstein et al., Cancer Cell 2004;Juszczynski et al., PNAS 2007)

Induce apoptosis:• Timocitos inmaduros y célulasT activadas

Cumple un papel crítico en la interfasematerno-fetal (Blois et al., Nat Med 2007)

La glicosilación diferencial de células Th1,Th2 y Th17 genera una susceptibilidaddiferencial a Gal (Toscano et al., NatImmunol 2007)

antígenos a células T vírgenes. Tradicionalmente se haidentificado a las DCs como células capaces de promo-ver la iniciación y amplificación de la respuesta inmuneadaptativa. Sin embargo, evidencias recientes indicanque las DCs poseen a su vez la facultad de promover to-lerancia y silenciar la respuesta inmune favoreciendo laexpansión de células T regulatorias con fenotipoCD4+CD25+Foxp3+ (Tregs) ó FoxP3- productoras de IL-10 (Tr1) (11). Se ha observado que citoquinas produci-das por el estroma tumoral y mediadores anti-inflama-torios pueden favorecer la diferenciación de DCscapaces de silenciar la respuesta inmune (11). En bús-queda de posibles mecanismos responsables de la ac-ción anti-inflamatoria de Gal-1 y considerando el papelcrítico que cumplen las DCs en las decisiones entre to-lerancia e inflamación, en nuestro laboratorio explora-mos el impacto de Gal-1, tanto exógena como endógena,sobre la diferenciación, maduración, funcionalidad ycapacidad regulatoria de DCs utilizando diferentes mo-delos experimentales in vitro e in vivo.

DCs derivadas de médula ósea diferenciadas en pre-sencia de Gal-1 (DCGal-1) exhibieron un perfil regula-torio dependiente de la producción de IL-27 y de la ac-tivación del factor de transcripción STAT3, encomparación con DCs controles (12). La función tole-rogénica de DCGal-1 fue confirmada en cultivos alogé-nicos in vitro y desafíos antígeno-específicos in vivo. Larelevancia fisiopatológica de DCs diferenciadas en pre-sencia de Gal-1 fue demostrada en modelos experi-mentales de cáncer e inflamación crónica. DCGal-1 de-mostraron menor capacidad de proteger ratones

singénicos frente al desafío con melanoma B16, favo-reciendo la inducción de tolerancia en el microam-biente tumoral. En un abordaje terapéutico, observa-mos que la administración de DCGal-1 suprimió lasmanifestaciones clínicas de autoinmunidad e inhibió lasrespuestas patogénicas Th1 y Th17. Nuestros resultadosrevelaron la capacidad de Gal-1 de iniciar un circuito to-lerogénico al interaccionar con glicanos presentes enDCs inmaduras, y de esta forma generar DCs tolerogé-nicas productoras de IL-27 que inducen la diferencia-ción de células Tr1 productoras de IL-10 (12). Estos ha-llazgos sugieren un papel jerárquico clave para Gal-1 enla iniciación de circuitos inmunosupresores in vivo y enla generación de DCs regulatorias con potencial tole-rogénico en enfermedades inflamatorias y cáncer.

Conclusiones y Perspectivas Futuras

En conjunto estos resultados permiten postular unnuevo mecanismo de regulación homeostática de larespuesta inmune basado en la interacción entre Gal‐1y sus glicanos específicos. La glicosilación diferencial delos linfocitos Th1, Th2 y Th17 explicaría el incrementoen la susceptibilidad de los linfocitos Th1 y Th17 a lamuerte celular inducida por activación y la consecuentedesviación en el balance de la respuesta inmune hacia unperfil Th2, observados en modelos de inflamación cró-nica luego del tratamiento con esta lectina (Figura 2).Además, identificamos un circuito tolerogénico en elque la señalización vía Gal‐1 conduce a la diferenciación


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Figura 2. Galectinas: Un nuevo paradigma en la respuesta inmune. Acción selectiva de Gal-1 sobre células dendríticas (DC) y diferentespoblaciones de células T (Th1, Th17 y Th2).

de DCs tolerogénicas productoras de IL‐27, con la con-secuente expansión de células T regulatorias produc-toras de IL‐10 y la supresión de la inflamación mediadapor células Th1 y Th17 (Figura 2). A la luz de estos re-sultados es posible anticipar nuevos horizontes tera-péuticos en diferentes patologías, tales como procesosneoplásicos o infecciosos, en los que la inhibición de laexpresión de Gal‐1 o sus glicanos nos permitiría po-tenciar la respuesta inmune. Por otro lado en procesosinflamatorios crónicos, enfermedades autoinmunes y enepisodios de rechazo de transplantes, la inducción deDCs con capacidad tolerogénica por estimulación conGal‐1 brindaría importantes beneficios terapéuticos ge-nerando efectos inmunomoduladores selectivos lo cualconstituye EL MAYOR DESAFÍO DE LA INMUNO-LOGÍA DE ESTE NUEVO MILENIO.

AGRADECIMIENTOSLos trabajos de nuestro equipo fueron financiados en los últimos5 años por el CONICET (PIP 2008), la Agencia Nacional de Pro-moción Científica y Tecnológica (FONCYT; PICT 2006; PICT Bi-centenario 2010), la Universidad de Buenos Aires (UBACYT2010-2012), la Fundación Florencio Fiorini (2007), la FundaciónSales (Programa Sales/CONICET 2000-presente), el Cancer Re-search Institute (New York 2006-2011), la Mizutani Foundationfor Glycoscience (Tokio, Programa 2005 y Programa 2011), laProstate Cancer Research Foundation (London; 2009-2012).Agradecemos a todos los miembros y colaboradores adminis-trativos y técnicos del IBYME por su apoyo y colaboración de-sinteresada


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Células NK: una interfase entre la inmunidadinnata y adaptativa con potencialinmunoterapéutico.

NK cells: an interphase between innate andadaptive immunity with immunotherapeuticpotential

Células NK: uma interfase entre a imunidadeinata e adaptativa com potencialimunoterapêuticoNorberto W. Zwirner, Mercedes B. Fuertes, Carolina I. Domaica, Lucas E. Rossi, Damián E. Ávila,Raúl G. Spallanzani, Andrea Ziblat, Ximena Raffo Iraolagoitía

Resumen

Las células citotóxicas naturales o NK juegan un rol críticoen la inmunovigilancia contra tumores y regulan la res-puesta inmune a través de la secreción de citoquinas y lacitotoxicidad. Los receptores NKG2D y NKp46 juegan unrol central en dichos procesos. No obstante, las células NKson blanco de mecanismos de escape tumoral tal como la



retención intracelular de MICA (MHC class I chain-relatedprotein A) en retículo endoplásmico de algunos melanomashumanos. Las células NK también se activan por citoqui-nas (IL-12 o IFN-α) y receptores de tipo Toll, efecto quees potenciado por tumores que promueven la microagre-gación de NKG2D. Asimismo, el contacto célula tumo-ral–linfocito T induce la secreción de IFN-α por células NKa través de la adquisición de ligandos de NKG2D y NKp46de células tumorales por linfocitos T, los que subsecuen-temente promueven la estimulación de las células NK a tra-vés de NKG2D y NKp46. Por consiguiente, células de la in-munidad adaptativa regulan a las células de la inmunidadinnata, lo que podría tener relevancia en la inmunidad anti-tumoral. Además, determinadas drogas anti-neoplásicascomprometen la función de las células NK, lo que atentacontra su eficacia terapéutica. En resumen, las células NKposeen un gran potencial inmunoterapéutico para cuya ex-plotación deberemos elucidar los mecanismos celulares ymoleculares que gobiernan el desarrollo de sus funcionesefectoras.

Palabras clave: células NK * receptores * tumores * inter-

ferón * inmunoterapia

Summary

Natural killer (NK) cells critically participate in the immunesurveillance against tumors and are pivotal regulators of theadaptive immune through the secretion of cytokines and thecytotoxic function. NKG2D and NKp46 are two key receptorsinvolved in these processes. Howeverr, NK cells are targetsof tumor immune escape mechanisms such as ntracellularretention of MICA (MHC class I chain-related protein A) inthe endoplasmic reticulum of certain human melanomas. NKcells also become activated in a cooperative manner bycytokines (IL-12 or IFN-α) and Toll like receptors, an effectthat is potentiated by tumors that promote engagement ofNKG2D. Moreover, tumor cell-T cell contact induce secretionof IFN-γ by NK cells through acquisition of tumor-derivedNKG2D and NKp46 ligands by T cells, which subsequentlypromote NKG2D- and NKp46-dependent NK cell stimula-tion. Therefore, cells from the adaptive immune response reg-ulate the activity of cells of the innate immune response,which may have relevance during anti-tumor immunity. Also,some anti-neoplastic drugs impair an NK cell function, whichreduces their therapeutic efficacy. In summary, NK cells havea great immunotherapeutic potential but to fully exploit it, thecellular and molecular mechanisms that govern their effec-tor function must be elucilated first.

Keywords: NK cells, receptors, tumors, interferon, immu-

notherapy

Resumo

As células citotóxicas naturais ou NK têm um papel críticona imunovigilância contra tumores e regulam a respostaimune através da secreção de citocinas e a citotoxicidade. Osreceptores NKG2D e NKp46 têm um papel central em taisprocessos. Não obstante isso, as células NK são alvo de

mecanismos de escape tumoral tal como a retenção intrace-lular de MICA (MHC class I chain-related protein A) em retí-culo endoplásmico de alguns melanomas humanos. As célu-las NK também são ativadas por citocinas (IL-12 ou IFN-α)e receptores de tipo Toll, efeito que é potenciado por tumo-res que promovem a microagregação de NKG2D. Do mesmomodo, o contato célula tumoral–linfócito T induz a secreçãode IFN-γ por células NK através da aquisição de ligandos deNKG2D e NKp46 de células tumorais por linfócitos T, os queimediatamente promovem a estimulação das células NK atra-vés de NKG2D e NKp46. Por conseguinte, células da imu-nidade adaptativa regulam as células da imunidade inata, oque poderia ter relevância na imunidade antitumoral. Alémdisso, determinadas drogas antineoplásicas comprometem afunção das células NK, o que atenta contra sua eficáciaterapêutica. Em resumo, as células NK possuem um grandepotencial imunoterapêutico para cuja exploração deveremoselucidar os mecanismos celulares e moleculares que gover-nam o desenvolvimento de suas funções efetoras.

Palavras chave: células NK * receptores * tumores * inter-

feron * imunoterapia

Introducción

Células NK, receptores y ligandos

Evidencias obtenidas en los últimos años han con-tribuido a una comprensión de los eventos celularesy moleculares que regulan la activación de las célulascitotóxicas naturales o células NK contra células tu-morales (1) y durante la respuesta inmune contra pa-tógenos (2). La función primordial de las células NKes la secreción de citoquinas pro-inflamatorias (IFN-γ, TNF-α, TNF-β, GM-CSF e IL-10 (3), siendo el IFN-α crítico para la polarización de la respuesta inmunehacia un perfil TH1 (4)(5). Además, las células NK es-timulan la activación de macrófagos hacia perfilesclásicos o de tipo 1 (M1) y promueven la maduraciónde las células dendríticas (CDs) a través de un con-tacto célula-célula (6)(7).

El reconocimiento de las células blanco por las cé-lulas NK es llevado a cabo por receptores activadoreso inhibidores que regulan sus funciones efectoras(8)(9). Los receptores inhibidores reconocen molé-culas de clase I del complejo mayor de histocompati-bilidad (CMH) y dentro de este grupo se destacan al-gunos miembros de la familia KIR (killer Ig-like receptors)en humanos y de la familia Ly49 en ratones. Los re-ceptores activadores constituyen un grupo heterogé-neo de moléculas de superficie entre las que se desta-can la molécula CD16 (receptor para porción Fc deinmunoglobulinas de tipo IIIA), el receptor NKG2D(CD314), el receptor DNAM-1 (CD226), el receptor2B4 (CD244) y los miembros de la familia de recep-tores de citotoxicidad natural (natural cytotoxicity re-ceptors o NCRs), integrada por las moléculas NKp46


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(CD335), NKp44 (CD336) y NKp30 (CD337). Los re-ceptores NKG2D y NKp46 son críticos para la detec-ción temprana y eliminación de tumores ya que rato-nes deficientes en NKG2D (10) o en NKp46 (11)muestran una mayor susceptibilidad a la generación detumores, y el bloqueo in vivo de NKG2D mediante laadministración de un anticuerpo monoclonal favo-rece la iniciación y crecimiento tumoral (12). En hu-manos, se conoce que existe una mayor incidencia detumores de diferentes fenotipos en individuos quepresentan una baja actividad citotóxica natural en cé-lulas de sangre periférica (13). Este cúmulo de datosdemuestra que las células NK censan la presencia decélulas tumorales a través de NKG2D y NKp46, y deesta manera protegen al individuo del desarrollo yprogresión tumoral.

La mayoría de los receptores activadores reconocenligandos inducibles en células infectadas o tumorales (8,9). La identidad de los ligandos de los NCRs sobre cé-lulas tumorales es aún desconocida aunque NKp30 re-conoce a la molécula B7-H6 (14). Para NKG2D se handescripto cerca de 10 ligandos (NKG2DLs) diferentes(15, 16). DNAM-1 reconoce como ligandos al receptordel virus de la polio (PVR o CD155) y a la molécula nec-tina-2 (CD112) (17), y participa en la eliminación de cé-lulas tumorales (18)(19).

Células NK, respuesta anti-tumoral ymecanismos de escape

El rol crítico de las células NK en la inmunidad anti-tumoral hace que no sea sorprendente que existan me-canismos de escape tumoral que involucran a ligandosreconocidos por diversos receptores activadores decélulas NK (20-22). En particular, MICA (MHC class Ichain-related protein A) es un NKG2DL inducido por es-tímulos de estrés genotóxico que se expresa en su-perficie celular de diversos tumores y que promueve laactivación de las células NK y de linfocitos T CD8 ci-totóxicos (16). Sin embargo, en nuestro laboratoriohemos observado que determinados melanomas hu-manos poseen la particularidad de promover una re-tención intracelular de la molécula MICA en retículoendoplásmico debido a la acumulación de formas in-maduras del polipéptido (21). Esta retención intrace-lular confiere resistencia a mecanismos efectores de lascélulas NK y privilegio inmunológico (Fig. 1) por loque constituye un novedoso mecanismo de escape tu-moral cuya elucidación permitirá diseñar estrategiastendientes a restaurar la expresión de MICA en su-perficie de células tumorales con el fin de mejorar lacalidad de la respuesta inmune anti-tumoral mediadapor células NK.



Figura 1. Mecanismo de escape tumoral en melanomas humanos basado en la retención intracelular de MICA. La expresiónde MICA se inicia como consecuencia de la transformación maligna de melanocitos normales. Células de melanoma que ex-presan MICA en superficie son detectadas por células NK a través de NKG2D, lo que promueve la secreción de IFN-γ, la cito-toxicidad contra las células tumorales y, si el proceso es eficiente, contribuye con la regresión tumoral (parte superior de la fi-gura). Células de melanoma que desarrollan el mecanismo de retención intracelular de MICA en el retículo endoplásmico adquierenla capacidad de prevenir el reconocimiento por células NK a través de NKG2D y consecuentemente, se favorece la apariciónde variantes tumorales resistentes, lo que favorece el escape tumoral y la progresión (parte inferior de la figura).

Células NK y activación por citoquinas yreceptores de tipo Toll (TLRs)

Las células NK también pueden activarse por cito-quinas tales como IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 e IFN-α (coincidentemente, estas citoquinas han mostrado re-sultados promisorios en protocolos de inmunoterapiadel cáncer (23), y a través del reconocimiento de pa-trones moleculares asociados a patógenos ya que ex-presan diversos receptores de tipo Toll (TLRs) (24). Enparticular, IL-12, IL-15 e IL-18 son secretadas por CDsdurante la respuesta inmune contra patógenos y tu-mores, lo que establece un diálogo recíproco entreCDs y células NK (2)(4)(5)(7). Además, la activación delas células NK se encuentra regulada negativamentepor TGF-β producido por células T regulatorias (25).En nuestro laboratorio hemos demostrado la existenciade efectos cooperativos para la secreción de IFN-α porcélulas NK desencadenados por agonistas de TLR3 oTLR7 en presencia de dosis subóptimas de IL-12 o IFN-α (24). Asimismo, observamos una secreción de IFN-γmayor aún por células NK cuando fueron estimuladascon dichos agonistas e IL-12 en presencia de tumoresque sobre-expresan MICA. Por lo tanto, la activación decélulas NK a través de diferentes tipos de receptores po-tencia notablemente la secreción de IFN-γ (Fig. 2). Porello, las estrategias terapéuticas con agonistas de TLR3o TLR7 favorecerían no sólo la maduración de las CDsy la activación de la respuesta inmune adaptativa sinotambién el desarrollo de funciones efectoras mediadaspor células NK, lo que podría ser más relevante aún enpacientes con tumores que expresan NKG2DL.

Células NK y regulación por linfocitos T CD4

Durante los últimos años se ha elucidado cómo es laintrincada relación entre los tumores y el huésped du-rante distintas etapas del crecimiento tumoral (26) y se

han descubierto un gran número de mecanismos queregulan la respuesta inmune contra tumores y de escapetumoral (27). Sin embargo, poco es lo que se conoceacerca de la existencia de posibles mecanismos regula-torios entre células NK y linfocitos T CD4. En nuestrolaboratorio hemos observamos que el contacto célula tu-moral–linfocito T promueve el desarrollo, por partede estos últimos, de funciones estimuladoras para cé-lulas NK, lo que gatilla la secreción de IFN-γ a través deun mecanismo que involucra la adquisición de molé-culas de superficie de las células tumorales por parte delos linfocitos T durante el contacto mutuo (fenómenoconocido como trogocitosis)(28). Entre las moléculas ad-quiridas se destacan MICA y ligandos de NKp46, los quesubsecuentemente promueven la estimulación de las cé-lulas NK a través de NKG2D y NKp46 y el desarrollo defunciones efectoras (Fig. 3). Así, demostramos por pri-mera vez que células de la inmunidad adaptativa (cé-lulas T CD4) adquieren propiedades estimulatoriaspara células de la inmunidad innata (células NK) me-diante un fenómeno de trogocitosis que podría tener re-levancia en la respuesta anti-tumoral y en otras situa-ciones patológicas donde se observe alta expresión deligandos de NKG2D y NKp46, y reclutamiento de célu-las T CD4 y NK.

Células NK y terapias anti-tumorales

Aunque la radio- y la quimioterapia son las estrategiasterapéuticas más efectivas para el tratamiento de las en-fermedades neoplásicas en seres humanos, no están exen-tas de efectos secundarios indeseables. Esto ha movilizadoel desarrollo de nuevas drogas anti-tumorales, muchas delas cuales han mostrado resultados promisorios. Sin em-bargo, en muchos casos se desconoce si estos compuestosejercen efectos deletéreos sobre células del sistema in-mune comprometidas en la inmunovigilancia, lo que


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Figura 2. Efectos cooperativos de receptores de tipo Toll, receptores de citoquinas y receptores activadores (NKG2D) sobre la capacidadde secreción de IFN-γ en células NK. La estimulación simultánea a través de estas categorías de receptores es un poderoso estímulo parala secreción de IFN-γ por parte de las células NK.

atentaría contra la efectividad terapéutica de estas drogas.En los últimos años se ha puesto interés en el papel de lasdeacetilasas de histonas (HDACs), ya que existen eviden-cias que las vinculan con el desarrollo de tumores. Esto hamovilizado el desarrollo de inhibidores de HDACs(HDACi) y su empleo como drogas anti-tumorales (29-31). Aunque algunos HDACi aumentan la expresión deNKG2DLs haciendo a las células tumorales más suscep-tibles a los mecanismos efectores de las células NK in vi-tro (32), en nuestro laboratorio hemos observado quecomprometen la actividad funcional de las células NK, loque podría atentar contra su eficacia terapéutica.

Conclusiones generales

Las células NK, si bien son críticas en la inmunovi-gilancia contra tumores, no están exentas de padecermecanismos de escape tumoral. Algunos melanomashumanos promueven una retención intracelular en elretículo endoplásmico de ligandos de NKG2D, lo queconfiere resistencia a mecanismos efectores de las cé-lulas NK y privilegio inmunológico. Asimismo, las célu-las NK pueden activarse por citoquinas y a través deTLRs, efectos que se ven potenciados por estímulos através de NKG2D, por lo que estrategias de inmunote-rapia con agonistas de TLRs podrían favorecer el desa-rrollo de funciones efectoras de las células NK, sobretodo en pacientes con tumores que expresan NKG2DL.Además, los linfocitos T CD4, a través de un fenómenode trogocitosis de MICA y de ligandos de NKp46, ad-quieren la capacidad de promover la secreción de IFN-γ por células NK luego de haber contactado células tu-

morales, lo que indica que células de la inmunidadadaptativa pueden regular la actividad de células de lainmunidad innata.

Asimismo, el empleo de nuevas drogas para el trata-miento de enfermedades neoplásicas tales como losHDACi constituye un arma de doble filo ya que el efectoanti-tumoral de estas drogas va acompañado de efectossupresores de la actividad funcional de las células NK,lo que podría atentar contra su eficacia terapéutica.Por lo tanto, las células NK poseen un gran potencial in-munoterapéutico pero para explotar tales capacidadesdeberemos profundizar en el estudio de los mecanismoscelulares y moleculares que gobiernan el desarrollo desus funciones efectoras.


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Figura 3. Estimulación de células NK por linfocitos T activador como consecuencia de la captura (trogocitosis) de MICA y ligandos de NKp46desde la superficie tumoral. Cuando linfocitos T activados contactan células tumorales, capturan moléculas de la superficie de éstas, ta-les como MICA y ligandos de NKp46. Estas moléculas, ahora ubicadas en la superficie de los linfocitos T activados, promueven la secre-ción de IFN-γ por parte de las células NK por medio del reconocimiento a través de NKG2D y NKp46.

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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA NEUROENDOCRINA

Desarrollo de estrategias terapéuticasbasadas en esteroides neuroactivos yneuroesteroides para el tratamiento deneuropatologías experimentales

Development of therapies based onneuroactive steroids and neurosteroids forthe treatment of experimentalneuropathologies

Desenvolvimento de estratégias terapêuticasbaseadas em esteroides neuroativos eneuroesteroides para o tratamento deneuropatologias experimentais

Alejandro F. De Nicola, Juan Beauquis, Florencia Coronel, Laura I. Garay, Maria ClaudiaGonzalez Deniselle, Susana L. Gonzalez, Florencia Labombarda, Luciana Pietranera, Flavia E. Saravia; Maria Meyer, Gisella Gargiulo, Elvira Brocca, Lydia van Overveld, Analia Lima,Paulina Roig

Resumen

Los esteroides activos en el sistema nervioso (“neuroactivos”)ejercen actividades neuroprotectoras o neurotóxicas, de-pendiendo de su estructura química, de las concentracionescirculantes o tisulares, del tipo de receptores intervinientesy de los mecanismos de señalización intracelular empleados.Estas propiedades han sido estudiadas en modelos anima-les de neuropatologías humanas. Bajo condiciones experi-mentales que remedan el traumatismo de la médula espinal,dolor neuropático, esclerosis múltiple y esclerosis lateralamiotrófica, el tratamiento con progesterona produjo bene-ficios terapéuticos relacionados con la neuroprotección, re-mielinización e inhibición de la neuroinflamación. Por otraparte, estudios realizados en animales hipertensos demues-tran una pronunciada encefalopatía en cuya etiopatogenia in-terviene la hiperfunción del sistema mineralocorticoide, yaque similares anormalidades neuroquímicas aparecen en ani-males normales tratados con mineralocorticoides. Por con-siguiente, la neurotoxicidad podría ser consecuencia de la hi-peractividad del sistema mineralocorticoide. La encefalopatíade la hipertensión es similar a la de la diabetes mellitus y ala del cerebro añoso. En los tres casos, los estrógenos actúancomo agentes neuroprotectores, promoviendo la neurogéne-sis hipocampal, la expresión de factores neurotróficos y dis-

minuyendo la astrogliosis, confirmándose la plasticidad delsistema nervioso al estímulo estrogénico. Por consiguiente,el empleo de esteroides neuroactivos en modelos animaleshace factible la transferencia a corto plazo de los resultadosexperimentales a la clínica humana.

Palabras clave: diabetes mellitus * dolor neuropático * ence-

falopatía hipertensiva * esclerosis lateral amiotrófica * escle-

rosis múltiple * esteroides neuroactivos * neuroesteroides *

trauma de médula espinal

Summary

Steroids showing activity on the nervous system are knownas “neuroactive steroids”. They exert neuroprotective or neu-rotoxic activities, depending on their chemical structure, cir-culating or tissue concentrations, binding to different recep-tors and the mechanisms of intracellular signalling employed.In order to elucidate these properties, work was performed onanimal models of human neuropathologies, including spinalcord injury, neuropathic pain, multiple sclerosis, and amy-otrophic lateral sclerosis. In these models, treatment withprogesterone has shown great therapeutic effectiveness. In an-other set of studies, it was shown that hypertensive animalsbear a pronounced encephalopathy, possibly caused by anoverdrive of the mineralocorticoid system. It has been sug-gested that overdrive of the mineralocorticoid system playsa neurotoxic role, based on the development of similarbrain abnormalities following mineralocorticoid treatment ofotherwise normal animals. Hypertensive encephalopathy issimilar to that developed by diabetes mellitus and aging an-imals. In the three cases, estrogen treatment provided strongneuroprotection, as shown by enhanced hippocampal neu-rogenesis, increased neurotrophic factor expression and de-creased astrogliosis. Thus, the use of estrogens supports theregenerative capacity and plasticity of the nervous system.Therefore, animal models become useful tools to transfer ex-perimental data to the human patient in the short-term.

Key words: diabetes mellitus * neuropathic pain * hyper-

tensive encephalopathy * amyotrophic lateral sclerosis *

multiple sclerosis * neuroactive steroids * neurosteroids *

spinal cord trauma

Resumo

Os esteroides ativos no sistema nervoso (“neuroativos”)exercem atividades neuroprotetoras ou neurotóxicas, de-pendendo de sua estrutura química, das concentrações cir-culantes ou tissulares, do tipo de receptores intervenientese dos mecanismos de sinalização intracelular utilizados.Estas propriedades têm sido estudadas em modelos animaisde neuropatologias humanas. Sob condições experimentaisque remedam o traumatismo da medula espinal, dor neuro-pática, esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica, otratamento com progesterona produziu benefícios terapêu-ticos relacionados com a neuroproteção, remielinização e ini-bição da neuroinflamação. Por outra parte, estudos realiza-dos em animais hipertensos demonstram uma pronunciadaencefalopatia em cuja etiopatogenia intervém a hiperfunção



do sistema mineralocorticoide, visto que similares anorma-lidades neuroquímicas aparecem em animais normais tra-tados com mineralocorticoides. Por conseguinte, a neuroto-xicidade poderia ser consequência da hiperatividade dosistema mineralocorticoide. A encefalopatia da hipertensãoé similar à da diabetes mellitus e à do cérebro idoso. Nos trêscasos, os estrogênios atuam como agentes neuroprotetores,promovendo a neurogênese hipocampal, a expressão de fa-tores neurotróficos e diminuindo a astrogliose, confirmando-se a plasticidade do sistema nervoso ao estímulo estrogênico.Por conseguinte, o emprego de esteroides neuroativos emmodelos animais torna fatível a transferência em curto prazodos resultados experimentais para a clínica humana.

Palavras chave: diabetes mellitus * dor neuropática * ence-

falopatia hipertensiva * esclerose lateral amiotrófica * escle-

rose múltipla * esteroides neuroativos * neuroesteroides *

trauma de medula espinhal

1) La progesterona ejerce efectosneuroprotectores en diversas enfermedades delsistema nervioso central y periférico:

Los estudios clásicos consideraron a la progesteronacomo una hormona relacionada con la ovulación, pre-ñez y comportamiento sexual. Sin embargo, ya en 1941Hans Selye había demostrado que poseía propiedadesanestésicas, mientras finalmente Baulieu y colaborado-res (1) describieron que además de actuar como un es-teroide neuroactivo, se producia localmente en el sis-tema nervioso, acuñando el término “neuroesteroide”.Actualmente, la progesterona es reconocida por sus ac-ciones mielinizantes y neuroprotectoras luego de la in-juria del sistema nervioso central, en la neurodegene-ración, neuroinflamación y como calmante del dolorneuropático. La progesterona ejerce estas propiedadesactuando sobre todas las poblaciones celulares del sis-tema nervioso central, es decir neuronas, oligodendro-citos, astrocitos y microglia.. Entre numerosos ejem-plos, describiremos las acciones de la progesterona enla lesión de la medula espinal, en un modelo inducidode esclerosis múltiple, en un modelo genético de de-generación de motoneurona y en el dolor neuropáticoexperimental (2).

Como resultado de una lesión de la médula espinalproducida en la rata, las motoneuronas del asta ventraldegeneran por un proceso denominado cromatólisis,por el cual la sustancia de Nissl (ribonucleoproteínas)se agolpa en la membrana plasmática dándole un as-pecto atigrado a la neurona.. La cromatólisis, que es unproceso reversible al contrario de la apoptosis, cursacon disminución de la expresión de moléculas funda-mentales para el funcionamiento neuronal, incluyendofactores neurotróficos, enzimas de la neurotransmisióny la bomba de sodio que mantienen el potencial demembrana. Asimismo, se descontrola la actividad de la

glia (astrocitos, microglia ) y de los progenitores de oli-godendrocitos (OPC). La lesión medular produce des-mielinización con disminución de las proteinas centra-les de la mielina y de los factores de transcripcion de lamielina central, mientras que los OPC proliferantes nose diferencian a oligodendrocitos maduros productoresde mielina. Los astrocitos y microglia reactivos produ-ced sustancias proinflamatorias y tóxicas para las neu-ronas, acentuando la desmielinización y neurodegene-ración.

Es altamente auspicioso comprobar que la adminis-tración in vivo de progesterona a ratas por períodos en-tre 3 a 21 dias revierte las anormalidades debidas a la le-sión de la médula espinal. Por ejemplo, disminuye lacromatólisis neuronal, estimula la proliferación de losOPC e induce su diferenciación y maduración para sin-tetizar mielina. El tratamiento agudo con progesteronainhibe la proliferación de astrocitos y microglía, mien-tras que su continuación por 21 días inhibe la activaciónde estos tipos gliales. En conclusión, la administraciónde progesterona luego del trauma de la medula espinalinhibe la astrogliosis y microgliosis, ejerce efectos an-tiinflamatorios por inhibición de la microglia y de las ci-toquinas proinflamatorias, favorece la remielinizacióna partir de la proliferación de OPC y su diferenciacióna células capaces de generar mielina; y previene la de-generación neuronal. Por consiguiente, la progeste-rona constituye un arma terapéutica importante para laslesiones de la médula espinal (3)( 4).

Las acciones anti-inflamatorias e inmunomodulatoriasde la progesterone se han explorado con profundidad enmodelos animales de enfermedades autoinmunes. Estosestudios se basaron en conocidas observaciones clínicasen mujeres embarazadas que padecían de esclerosismúltiple (EM). La EM es una enfermedad autoinmuneque ataca la mielina, y en mujeres embarazadas los re-lapsos de la enfermedad remiten en el 3º trimestre, de-bido a los altos niveles de esteroides sexuales circulan-tes. Para explicar este hallazgo clínico, se ha empleadoun modelo experimental denominado encefalomielitisautoinmune experimental (EAE), por el cual ratonesson inmunizados con un péptido de la mielina llamadoMOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein). Estos ratones de-sarrollan signos clínicos tales como pérdida de la toni-cidad de la cola, espasticidad, parálisis de miembrosposteriores, etc. A nivel neuroquimico, la médula espi-nal sufre de infiltración linfocitaria y macrofágica, des-mielinización en focos con disminución de las proteínascentrales de la mielina : MBP (proteína básica de lamielina) y PLP (proteolípido proteína), se desarrolla as-trogliosis y aparecen lesiones y pérdida de axones ade-más de cambios degenerativos de las neuronas. El pre-tratamiento con progesterona de estos animalesprodujo resultados espectaculares, tales como el re-tardo en la aparición de la enfermedad y la atenuacióndel grado clínico. A nivel de la médula espinal, la pro-


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gesterona produjo marcado descenso de la desmielini-zación, demostrada por la mayor expresión de MBP yPLP, menor infiltración macrófagica y de células del sis-tema inmune, y disminución de la astrogliosis (5). Asi-mismo, la progesterona ejerce poderosos efectos an-tiinflamatorios locales, disminuyendo la expresión delos ARN mensajeros del factor de necrosis tumoral alfa(TNFα), interleuquina 1α y del marcador de microgliaC11b determinados por reacción de la polimerasa entiempo real (6). En la EAE, los efectos de la progeste-rona incluyen: neuroprotección y promielinización dela médula espinal, además de suprimir la respuesta in-mune. Teniendo en cuenta que los efectos de proges-terona podrían ser sistémicos por supresión del sistemainmune periférico, se realizaron nuevos estudios em-pleando un modelo focal de desmielinización por in-yección intraespinal de la gliotoxina lisolecitina. Los re-sultados fueron similares a los obtenidos con el modeloEAE, lo que sugiere que las acciones de la progesteronason en parte independientes del sistema inmune sisté-mico. Los datos resultan importantes por su aplicaciónla clínica. En este sentido, un estudio multicéntrico eu-ropeo (POPART-MUS) emplea actualmente la proges-terona, en agregado a estrógenos, para prevenir los re-lapsos post-parto de mujeres con EM.

En agregado a los ejemplos mencionados anterior-mente, el rol protector de la progesterona se extiendetambién a un modelo de neurodegeneración de moto-neurona y a humanos que padecen de esclerosis lateralamiotrófica (ELA). La ELA es una enfermedad crónicaque afecta las motoneuronas espinales y bulbares,siendo la sobrevida inferior a 5 años. Existen varios mo-delos de ELA, uno de ellos es el ratón Wobbler, que pre-senta una mutación de la proteína de tráfico intracelu-lar Vps54. En las motoneuronas espinales, se observadegeneración no apoptótica, con extensa vacuolizacióndebida al aumento del estrés oxidativo. La expresión demoléculas tales como el factor neurotrofico derivado delcerebro (BDNF) se encuentra disminuída en Wobblersen estadio clínico sintomático, mientras que la proges-terona corrige esta deficiencia (7). Estudios posterioresse desarrollaron en ratones Wobblers genotipificadoswr/wr de 3 estadios: progresivo temprano (1-2 meses),establecido (5-8 meses) y tardio (12 meses) y controlesNFR/NFR de edades similares. La mitad de cada gruporecibió progesterona por 3 semanas. Los estudios in-ciales evaluaron la vacuolización de motoneuronas, laexpresión del ARNm para BDNF, y parámetros gliales ta-les como la densidad de astrocitos, la expresión de la en-zima detoxificante del glutamato -glutamina sintetasa-y el número de oligodendrocitos en los diversos estadíosevolutivos de la enfermedad. El tratamiento con pro-gesterona de Wobblers disminuyó la degeneración va-cuolar en todos los estadios, elevó la expresión delBDNF en los estadios establecido y tardio, disminuyo laastrogliosis y aumentó la densidad de oligodendrocitos

maduros y de células que expresaban glutamina sinte-tasa (8). Funcionalmente, el tratamiento prolongadocon progesterona mejoró la fuerza muscular y la so-brevida de los Wobblers. Los resultados han sido extra-polados en cierta medida a humanos con ELA. Esta en-fermedad es habitualmente tratada con riluzole, unfármaco antiglutamatérgico. Dados los datos que de-mostraban las acciones neuroprotectora de progeste-rona en el Wobbler, se evaluó la utilidad de la misma enpacientes con ELA. El dosaje de esteroides en sangre de-mostró que la sobrevida se asociaba positivamente alos niveles más elevados de progesterona, al contrario delo que ocurría con el cortisol plasmático. Asimismo, enforma preliminar se ha podido demostramos que la te-rapia combinada con riluzole + progesterona mostróuna tendencia a prolongar la sobrevida con baja pro-babilidad de efectos adversos (9).

Las acciones protectoras y antiinflamatorias de laprogesterona no se circunscriben al sistema nerviosocentral sino que también abarcan al periférico. La Aso-ciación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP,por sus siglas en inglés), define al dolor neuropáticocomo aquel dolor causado por una lesión o enferme-dad del sistema nervioso, ya sea periférico o central. Esun dolor crónico, severo, y refractario a los tratamien-tos farmacológicos disponibles, lo que motiva el di-seño de nuevas estrategias terapéuticas. Existen mo-delos experimentales de lesión espinal o de nerviosperiféricos, que reproducen las características princi-pales de la condición clínica en humanos y permitenexplorar las alteraciones neuroquímicas, celulares ymoleculares del dolor neuropático. De hecho, más del60% de los pacientes con trauma directo o disfunciónespinal desarrolla dolor neuropático de difícil trata-miento. Asimismo, el modelo de compresión del ner-vio ciático representa la causa más frecuente de neu-ropatía periférica, generalmente debida a injuria físicade los nervios, por caídas, accidentes automovilísticos,actividades deportivas, o hernia discal, que provocanatrapamiento o compresión de los nervios afectados. Sibien numerosos mecanismos participan en la génesis yel mantenimiento del dolor crónico, la activación sos-tenida de los sistemas nociceptivos espinales juega unrol crucial. Existen datos experimentales que describenlas alteraciones temporales que ocurren en la expre-sión de moléculas clave en el proceso de sensibilizacióncentral a nivel espinal, entre ellas el receptor NMDA,la isoforma gamma de la proteína kinasa C (PKCγ), ladinorfina y el receptor kappa opioide. Se parte de la hi-pótesis que parte de estos mecanismos podrían ser unblanco de modulación por esteroides neuroactivos,abriendo la posibilidad de una nueva perspectiva tera-péutica. Más recientemente, se ha demostrado que laprogesterona previene el desarrollo de la conductanociceptiva en los modelos experimentales, a la vez quemodula la expresión de las moléculas antes mencio-



nadas. El panorama molecular y celular observadoluego de la administración de progesterona permitiríaexplicar, aunque sea en parte, las acciones analgésicasdel esteroide luego de la injuria. Por consiguiente, sehan conseguido avances en el conocimiento de los me-canismos involucrados en el desarrollo del dolor neu-ropático y en el valor de la administración de proges-terona como posible modulador del dolor crónico, afin de contribuir al diseño de nuevas estrategias tera-péuticas (10).

Finalmente, es preciso mencionar que los efectosdescritos en los distintos modelos experimentales pue-den originarse en mecanismos genómicos, a través delreceptor nuclear clásico para progesterona (PR) que ac-túa como un factor regulador de la transcripción de ge-nes blanco. Existen dos isoformas de PR, llamadas PRAy PRB. Asimismo, existe la posibilidad de efectos no ge-nómicos, a través de receptores de membrana alterna-tivos (mPR) de los cuales se han descrito 3 variedades:α, β y γ acoplados a proteína G, y un cuarto receptor demembrana denominado 25 DX, fuertemente expre-sado en el asta dorsal de la medula espinal. Para com-plicar más el panorama, la progesterona puede redu-cirse a dos metabolitos, uno con capacidad de unión alRP, la 5-dihidroprogesterona, y otro que actúa comoagonista del receptor GABAa, la tetrahidroprogeste-rona (alopregnanolona). Ambos ejercen acciones neu-roprotectoras. Como puede apreciarse, son múltipleslos mecanismos e intermediarios de la acción de este es-teroide pleiotrópico, la progesterona (2) a nivel de lamédula espinal y nervios periféricos.

El empleo a nivel clínico de la progesterona, ademásde lo ya detallado para la ELA, se ha realizado en casosde injuria traumática del cerebro (TBI, traumatic braininjury). Los trabajos de Stein y colaboradores (11) mos-traron que la progesterona mostraba efectos neuro-protectores en humanos con TBI. Mientras que al prin-cipio esto se demostró en ensayos clínicos en fase II,actualmente existen en fase III en los EE.UU., Europay Asia.

1) Los estrógenos son reconocidos como agentesneuroprotectores para las enfermedades delsistema nervioso asociadas al envejecimiento:diabetes e hipertensión arterial

De manera similar a lo expresado para la progeste-rona, los trabajos iniciales que señalaban a los estróge-nos como las hormonas típicas que regulaban los fe-nómenos reproductivos, fueron seguidos por unaavalancha de evidencias sobre el rol fundamental quejuegan los estrógenos para la neuroprotección. Desdetiempos inmemoriales, se asociaron los estrógenos a laterapia de reemplazo hormonal del climaterio, aun-que ciertas dudas sembradas al respecto hicieron re-

troceder su generalización (12). Sin embargo, hoy diase re-evalúa el papel de los estrógenos en sus diversasformas, ya sean naturales como sintéticos y a los regu-ladores selectivos del receptor estrogénico (SERM),como los agentes de elección para el tratamiento del ce-rebro senil y los cambios que aparecen durante el cli-materio (13). La hipótesis de la protección cerebralpor los estrógenos se ha extendido a varias enfermeda-des neurodegenerativas y síndrome psiquiatricos, entreellos el accidente cerebovascular agudo, la isquemiacerebral, esquizofrenia, enfermedades de Parkinson yAlzheimer, trastornos cognitivos leves, etc. (14). Sinembargo, es necesario reconocer que no existe con-senso generalizado sobre si el tratamiento estrogénicoen humanos está libre de efectos indeseables y si real-mente provee efectos beneficiosos para las enfermeda-des neurológicas.

Los estrógenos actúan de diversas maneras en el sis-tema nervioso. Existen dos subtipos de receptores es-trogénicos clásicos, denominados ERalfa y ERbeta, pro-ducto de dos genes diferentes, aunque con similitudaminoacídica en los diferentes dominios. ERα y ERβmuestran una distribución diferente en el sistema ner-vioso. Por ejemplo, ERα se expresa mayormente en elnúcleo arcuato y ventromediano del hipotálamo, mien-tras que el ERβ se concentra en el hipocampo, núcleosparaventricular y ventromediano del hipotálamo y en elarea preóptica. Se han descrito receptores de mem-brana que unen estrógenos, tales como el receptorunido a proteína G (GCR30) que está acoplado a la ac-tivación rápida de la proteína quinasa activada por mi-tógenos (MAPK/ERK), el ERX especifico para el 17 αestradiol, y la interacción proteína/proteína entre elERα y el receptor para el factor de crecimiento insulina-simil (15). La intervención de uno o varios de estos me-canismos llevaa al control, a nivel cellular, de la neuro-génesis, prevención de la muerte neuronal, aumento dela supervivencia neuronal y crecimiento de neuritas,prevención de la excitotoxicidad glutamatérgica, la es-timulación de la sinaptogénesis y a los efectos antioxi-dantes y anti-inflamatorios (14)(16 ).

Un tema de gran actualidad es el empleo de la neu-roprotección estrogénica para las enfermedades neuro-degenerativas que aparecen durante el envejecimiento,entra las que se halla la encefalopatía de la hipertensiónarterial. La hipertensión arterial en el humano es cau-sante no solamente de accidentes cerebrovaculares, sinotambién se asocia a una importante encefalopatia, queafecta al hipocampo. El hipocampo es una región cere-bral importante para la memoria de corta duración,aprendizaje y la génesis de nuevas neuronas en el cere-bro adulto. Un modelo de elección es la rata espontá-neamente hipertensa (SHR) de causa poligénica, cuyaencefalopatía cursa con atrofia cerebral y del hipocampo,hidrocefalia y pérdida de sustancia blanca (17). Asi-mismo, las SHR presentan disminución de la génesis de


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nuevas neuronas en el giro dentado, proliferación de as-trocitos y pérdida neuronal en el hilio del giro dentadodel hipocampo. Estos cambios revierten luego del trata-miento con estradiol administrado in vivo (18). Como sesabe que el cerebro fabrica sus propios “neuroesteroides”luego del descubrimiento de Baulieu, también investi-gamos la expresión de aromatasa, enzima responsable dela síntesis endógena (local) de estradiol, pensando quela síntesis de estrógenos endógenos podria estar defec-tuosa en las ratas SHR. Se sabía que la enzima aromatasase expresa en el sistema nervioso particularmente en elhipocampo, está involucrada en la regulación de la plas-ticidad neuronal, se le reconoce un efecto neuroprotec-tor y su expresión aumenta en respuesta a la injuria. Loque resultó una verdadera sorpresa, fue la observaciónque la expresión del gen de la aromatasa determinadapor reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real,y la determinación de la proteína por inmunohistoqui-mica, estaba aumentada en los animales SHR. Lo inte-resante fue comprobar que las SHR mostraban un au-mento posterior de la aromatasa cuando se trataban conestradiol. Concluimos que los estrógenos exógenos y loslocalmente producidos por la aromatasa actuarían enconjunto ejerciendo efectos neuroprotectores sobre laencefalopatía hipertensiva, aumentando la génesis denuevas neuronas necesarias para incorporar nuevas me-morias y aprendizajes, y para el correcto funcionamientoneuroendócrino del hipocampo (19).

En forma similar a la hipertensión arterial, la diabe-tes mellitus afecta múltiples sistemas entre los que se en-cuentra el sistema nervioso central, siendo el hipocampouna de las estructuras más vulnerables. En forma seme-jante a lo descrito para los mineralocorticoides en ratasSHR, los glucocorticoides resultaron ser esteroides mo-duladores negativos (neurotóxicos) para la prolifera-ción celular en el giro dentado del hipocampo. Esto sedebía a que la corticosterona plasmática resultó ele-vada, el ritmo circadiano estaba ausente y la respuesta dela adrenal a la ACTH in vitro se encontraba aumentada,convirtiendo a la sobreactivación del sistema glucocor-ticoide en un factor responsable de la encefalopatía dela diabetes mellitus. Esta hipótesis se comprobó me-diante la administración del antagonista del receptorpara glucocorticoides (GR) conocido como RU486 o Mi-fepristone. Se determinó la proliferación celular en elgiro dentado mediante inmunomarcación para Ki67 y seencontró una disminución en los animales diabéticos yuna recuperación por el tratamiento con RU486. La di-ferenciación de las nuevas células hacia neuronas se es-tudió por inmunofluorescencia para bromodesoxiuri-dina y microscopía confocal. En los animales diabéticosse encontró una menor diferenciación y el RU486 logróuna reversión hacia valores controles, lo cual apoyaba elpapel neurotóxico de los glucocorticoides sobre la neu-rogénesis hipocampal (20). El sistema, sin embargo, re-sultó ser altamente plástico y con capacidad de recupe-

ración por tratamiento estrogénico. Mediante el trata-miento con estradiol por un plazo de 10 dias, se rever-tió completamente la reducción de la proliferación ce-lular del ratón diabético. Al mismo, tiempo, las neuronasdel hilio del giro dentado volvieron a valores normales,asi como la densidad de los astrocitos volvió a nivelescontroles. Fue interesante constatar que la administra-ción de estrógenos no alteró el estado hiperglicémico delos animales ni tampoco la tasa proliferativa neuronal enlos controles. Por consiguiente, comprobamos el valorde los estrógenos como una herramienta adicional parael tratamiento de los trastornos cerebrales de la diabetesmellitus (21). Podemos concluir que la maquinaria ce-lular puesta en marcha durante la protección estrogé-nica en las enfermedades asociadas al envejecimiento esintrinsicamente compleja y podría mostrar distintas mo-dalidades dependientes de la patología pre-existente. Anivel celular, sin embargo, son varias las funciones defi-citarias en el envejecimiento, hipertensión arterial y dia-betes mellitus cuyo denominador común es la respuestapositiva a los esteroides neuroactivos con estructura es-trogénica.

RECONOCIMIENTOSLos trabajos del Laboratorio de Bioquímica Neuroendocrina hanrecibido apoyo económico del CONICET (PIP # 112-200801-00542), Proyecto Santaló (CONICET/CSIC), Convenio de Coo-peración Internacional INSERM/CONICET, Universidad de Bue-nos Aires (20020100100089 y M614), y PICT 2007 01044.


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LABORATORIO DE NEUROENDOCRINOLOGÍA

Alteraciones neuroendocrinas causadas por disruptores endocrinos: el ejemplo delBisfenol A

Neuroendocrine alterations by endocrinedisruptors: the example of Bisphenol A

Alterações neuroendócrinas causadas pordisruptores endócrinos: o exemplo doBisfenol A

Nadia Bourguignon1, Marina Fernández1,2, Victoria Lux-Lantos1, Carlos Libertun1,2

1 Instituto de Biología y Medicina Experimental, Consejo Nacionalde Investigaciones Científicas y Técnicas, Buenos Aires, Argentina;2 Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Argentina

Resumen

Los contaminantes ambientales, como los disruptores en-docrinos, podrían provocar profundos cambios en los seresvivos. Aquí se analizan las alteraciones neuroendocrinas y re-productivas en mamíferos, incluyendo las descriptas en hu-manos, causadas por una molécula de origen industrial, elBisfenol A.

Palabras clave: xenoestrógenos * Bisfenol A * neuroendo-

crinos* reproducción

Summary

Exposure to endocrine disruptors may produce profound al-terations in several species. As an example, the neuroen-docrine and reproductive alterations due to Bisphenol A inmammals are summarized here.

Key words: xenoestrogen * Bisphenol A * neuroendocrine *

reproduction

Resumo

Os contaminantes ambientais, como os disruptores endó-crinos, poderiam provocar profundas alterações nos seres vi-vos. Aqui são analisadas as alterações neuroendócrinas e re-produtivas em mamíferos, incluindo as descritas emhumanos, causadas por uma molécula de origem industrial,o Bisfenol A.

Palavras chaves: xenoestrógenos * Bisfenol A * neuroendó-

crinos* reprodução


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El conocimiento de las acciones que los contami-nantes ambientales ejercen sobre los seres vivos es deimportancia vital. Su estudio, en extensión y en pro-fundidad, es crítico para la salud animal y vegetal,para conservar la biodiversidad y esencial para la saludhumana. Aquellos que afectan al sistema hormonal selos conoce como disruptores endocrinos y se los definecomo “agentes exógenos que interfieren con la sín-tesis, secreción, transporte, unión, acción o elimina-ción de las hormonas naturales que son responsablesde mantener la homeostasis, reproducción, desarrolloy/o conducta del individuo” (1)(2). Entre los disrup-tores endocrinos se hallan los xenoestrógenos, com-puestos que mimetizan las acciones de los estrógenosnaturales. Los Xenoestrógenos hallados naturalmenteen vegetales como la soja y ciertas legumbres, fitoes-trógenos, son capaces de interferir con los estrógenosendógenos. Se les han atribuidos ciertos efectos be-néficos para la salud humana a los fitoestrógenos, porejemplo en ciertos estudios epidemiológicos, dismi-nución de la sintomatología menopáusica o disminu-ción de la incidencia de ciertos tumores. Existe un se-gundo grupo de xenoestrógenos, producto deactividad industrial humana, al que se le han atribuidoacciones mayormente nocivas. El Bisfenol A (BPA) esproducido en todo el mundo en grandes cantidadesindustriales, Es un constituyente de los plásticos poli-cabonatados y resinas epoxy utilizados en la industriay en odontología. Los polímeros se hidrolizan a altatemperatura y liberan BPA. Cantidades de BPA son in-geridas por humanos en sólidos y en el agua de bebida,ya que cantidades detectables del mismo fueron ha-lladas en latas de alimentos, contenedores para mi-croondas, botellas y biberones plásticos, accesorios deuso médico de policarbonato, selladores dentales, en-tre otros objetos de uso diario y distribución universal.BPA fue encontrado en aguas de ríos, lagos y mares.

En humanos, cantidades claramente detectablesde BPA fueron halladas en saliva, sangre, cordón um-bilical, calostro y leche materna. Se estima que la ex-posición diaria de los recién nacidos e infantes dehasta 6 meses depende del esquemas de alimenta-ción, siendo menor con alimentación natural quecon alimentación por fórmulas comerciales en bibe-rón plástico (3 - 5)

Los efectos del BPA, como los de otros xenoestró-genos, son condicionados por la especie, dosis y rutasde administración, tiempo de exposición y en granmedida por la edad del organismo expuesto, como loindican estudios experimentales. Los adultos son engeneral más resistentes a ciertos efectos adversos y enalgunos casos los mismos son reversibles al suspen-derse la exposición (6). En cambio la exposición pe-rinatal in útero, o neonatal, al actuar durante el pe-riodo organizacional, puede provocar efectosprofundos, persistentes e irreversibles en ratas (7-11).

En general, muchos de los efectos permanentes coin-ciden con aquellos descriptos para los estrógenos na-turales cuando actúan durante el desarrollo sobre,por ejemplo, la diferenciación sexual encéfalo hipo-fisaria. Además de su actividad estrogénica, al BPAtiene otros efectos como antagonizar ciertas accio-nes de los propios estrógenos, andrógenos y hormo-nas tiroideas, actuar por vías no genómicas e influirsobre ciertas enzimas y expresión de algunos recep-tores (12).

En nuestros estudios, en el Instituto de Biología yMedicina Experimental, hallamos que el BPA ac-tuando luego del nacimiento en la rata hembra, pro-voca cambios reproductivos e hipotálamo hipofisa-rios notorios a medida que el animal madura, talescomo adelanto de la eclosión puberal, alteraciones delciclo estral y de la pulsatilidad de la neurona GnRH,de la secreción gonadotrópica y de la respuesta deciertos mensajeros intracelulares del gonadotropo enrespuesta al GnRH (13). Más aún, en estas hembrasexpuesta al BPA al nacer, cuando llegan a la adultezhallamos en sangre testosterona y estrógenos eleva-dos, baja progesterona, cambios en la estructura ová-rica, con múltiples quistes, y fertilidad disminuida re-medando el sindrome de ovario poliquístico,patología de alta prevalencia en mujeres en edad re-productiva (14).

En resumen, el Bisfenol A es un xenostrógenoabundante en el medio ambiente, producto de la ac-tividad humana, y cuyas acciones influyen grande-mente sobre los seres vivos y la salud humana. Suefecto es más notorio cuando actúa a edades muy tem-pranas, el período organizativo perinatal, y persisten-tes a edades posteriores.

La importancia de este contaminante llevó a que re-cientemente varios países implementaran normas pararestringir su uso y que los productos que contienenBPA lleven advertencias para los consumidores. Detodas maneras los efectos de esta norma se consideraque serán de utilidad en muchos años, por el altocontenido hoy presente de BPA en el hábitat y su lentadesaparición aún luego del cese de su producción. Suestudio podría ser guía sobre las investigaciones queimperiosamente debemos desarrollar sobre los conta-minantes de nuestro ambiente.


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LABORATORIO DE REGULACIÓN HIPOFISARIA

El receptor dopaminérgico D2: acciones endocrinas no clásicas

Non-conventional endocrine functions ofdopamine type 2 receptor: new insightsgained from transgenic mice

O receptor dopaminérgico D2: açõesendócrinas não clássicas

Isabel Garcia Tornadú, María Victoria Recouvreux,Maria Cecilia Ramirez, María Guillermina Luque,Maria Ines Perez-Millan, Rodrigo Lorenzo, María Cristina Camilletti, Ana María Ornstein, Isabel Lacau-Mengido, Carolina Cristina, Graciela Diaz-Torga, Damasia Becu-Villalobos

Resumen

El receptor dopaminérgico D2 (RD2) participa en un com-plejo repertorio de funciones adaptativas para mejorar eldesempeño del individuo, su éxito reproductivo y super-vivencia. Utilizando estrategias combinadas de ensayosfarmacológicos, líneas celulares y ratones transgénicos,nuestro laboratorio demostró la participación del RD2 nosólo en el desarrollo de prolactinomas, sino en el eje delcrecimiento, la ingesta y el metabolismo de glucosa. De-terminamos que el desarrollo de prolactinomas por au-sencia de RD2 correlaciona con un aumento de VEGF yuna disminución de TGFβ1 y su receptor TGFβ tipo II, po-sicionando estos factores como posible terapia comple-mentaria en prolactinomas resistentes a agonistas dopa-minérgicos. En el eje de crecimiento, postulamos que laacción de RD2 facilita la liberación de GHRH, y la au-sencia del receptor condiciona la población reducida desomatotropos, y produce enanismo. Respecto a la ingesta,los resultados indicaron que la ausencia de RD2 modulavarios factores orexígenos y anorexígenos, revelando unamayor complejidad del sistema. Por último, demostramosque la dopamina a través del RD2 pancreático modula laliberación de insulina, esclareciendo en parte por qué eluso de antisicóticos conlleva a un desarrollo de diabetestipo II. En conjunto nuestros resultados destacan la im-portancia de este receptor en acciones endocrinas no clá-sicas y su participación en forma integral en la fisiologíadel individuo.

Palabras clave: dopamina * prolactina * hormona del creci-

miento * ingesta * glucosa * homeostasis


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Summary

Dopamine D2 receptors (D2R) participate in a complex sys-tem of adaptive functions to improve performance, repro-ductive success and survival of individuals.Using combinedstrategies with drug, cell lines and transgenic mice, our lab-oratory demonstrated that D2R take part, not only in the de-velopment of prolactinomas, but also in the regulation of thegrowth axis, food intake and glucose metabolism. It was de-termined that the development of prolactinomas due to thelack of D2R correlates with increased VEGF and decreasedTGF β1 and TGF type II receptor, positioning these factors aspotential targets in complementary therapies for dopamine ag-onist resistant prolactinomas. With regard to the growth axis,it was postulated that D2R facilitates the release of GHRH,and the absence of the receptor determines a decrease in thesomatotroph population and produces dwarfism. Regardingfood intake, it was demonstrated that the absence of D2Rmodulates several orexigenic and anorexigenic factors, point-ing to a complexity of the system. Finally, it was shown thatdopamine modulates insulin release through pancreatic D2R,partly clarifying why the use of antipsychotics leads to de-velopment of type II diabetes. Overall, our results highlight theimportance of this receptor in non-classical endocrine actionsand enable the understanding of the integral physiology of theD2R in homeostasis.

Key words: dopamine * prolactin * growth hormone * food

intake * glucose * homeostasis

Resumo

O receptor dopaminérgico D2 (RD2) participa num complexorepertório de funções adaptativas para melhorar o desem-penho do indivíduo, seu êxito reprodutivo e sobrevivência.Utilizando estratégias combinadas de ensaios farmacológicos,linhas celulares e camundongos transgênicos, nosso labora-tório demonstrou a participação do RD2 não só no desenvol-vimento de prolactinomas, mas no eixo do crescimento, a in-gestão e o metabolismo de glicose. Determinamos que odesenvolvimento de prolactinomas por ausência de RD2 cor-relaciona com um aumento de VEGF e uma diminuição deTGFβ1 e seu receptor TGFβ tipo II, posicionando estes fa-tores como possível terapia complementar em prolactinomasresistentes a agonistas dopaminérgicos. No eixo de cresci-mento, postulamos que a ação de RD2 facilita a liberaçãode GHRH, e a ausência do receptor condiciona a populaçãoreduzida de somatotrofos, e produz nanismo. A respeito daingestão, os resultados indicaram que a ausência de RD2modula vários fatores orexígenos e anorexígenos, revelandouma maior complexidade do sistema. Por último, demons-tramos que a dopamina através do RD2 pancreático modulaa liberação de insulina, esclarecendo em parte por qué o usode antipsicóticos leva a um desenvolvimento de diabetes tipoII. Em conjunto nossos resultados destacam a importânciadeste receptor em ações endócrinas não clássicas, e sua par-ticipação em forma integral na fisiologia do indivíduo.

Palavras chave: dopamina * prolactina * hormônio do cres-

cimento * ingestão * glicose * homeostase

A lo largo de la evolución el receptor dopaminérgicotipo 2 (RD2) ha participado en un complejo repertoriode funciones adaptativas para mejorar el desempeño delindividuo, su éxito reproductivo y supervivencia. Di-versos mecanismos que aumentan la probabilidad deconsumir alimentos nutritivos y aparearse recurrente-mente usan la estimulación de este subtipo de receptor.Los RD2 también son fundamentales en la coordina-ción motora, la actividad de locomoción, el planea-miento, la motivación o aversión y la dominancia social.La participación del RD2 en la función endocrina re-fuerza su papel en la reproducción y supervivencia.

Es bien conocido en la fisiología endocrina que elRD2 regula la hormona prolactina, pero su participa-ción en el control de otras hormonas relacionadas alcrecimiento, ingesta de alimentos o metabolismo de laglucosa no ha sido extensamente estudiada. En general,la relevancia del RD2 ha sido demostrada usando agen-tes farmacológicos con limitada especificidad in vivo, oen estudios in vitro que no permiten un análisis inte-grador fisiológico. Nosotros demostramos la participa-ción de este receptor no sólo en el desarrollo de pro-lactinomas, sino también en el eje del crecimiento, laingesta y el metabolismo de glucosa usando en formacombinada ensayos farmacológicos y ratones transgé-nicos con mutación nula del RD2 en todo el organismo.

La dopamina inhibe la síntesis, secreción de prolac-tina y la proliferación de lactotropos hipofisarios ac-tuando a través del RD2. Nuestros primeros estudios serelacionaron a la tumorogénesis hipofisaria, sus meca-nismos de control y las alteraciones producidas duranteeste proceso. En particular, los estudios se centralizaronen los prolactinomas, los tumores hipofisarios más fre-cuentes, dentro de los adenomas secretantes. Estos tu-mores se diferencian del resto de los tumores hipofisa-rios, pues en su mayoría son tratados exitosamente conagonistas dopaminérgicos logrando, en general, una rá-pida reducción del tamaño tumoral con liberación delos síntomas de compresión.

Sin embargo, en un 15% de los casos los prolactino-mas pueden ser resistentes a drogas dopaminérgicas yes necesario recurrir a la cirugía para su extirpación. Lahiperprolactinemia producida por los prolactinomasafecta la reproducción, por lo que el abordaje tera-péutico del prolactinoma tiene como objetivo revertirdichas manifestaciones, como así también las de tiponeurológico y/u oftalmológico provocadas por la ex-pansión tumoral.

En pacientes con prolactinomas resistentes a drogasdopaminérgicas sigue abierta la búsqueda de nuevas te-rapéuticas.

Nosotros abordamos el estudio de prolactinomas re-sistentes desde varias perspectivas experimentales, ana-lizando los posibles factores involucrados en el procesode desarrollo y funcionalidad del tumor. Utilizamos di-ferentes modelos experimentales tales como líneas ce-



lulares tumorales, generación de tumores por trata-mientos farmacológicos, y modelos de animales trans-génicos específicos. Por último, para tener una mayorcomprensión del proceso patológico se realizaron es-tudios en tumores hipofisarios humanos.

Los ratones que carecen de la expresión del RD2, ra-tones Drd2-/-, desarrollan en forma espontánea hiper-prolactinemia seguida de hiperplasia de la hipófisis y fi-nalmente un adenoma hipofisario. Este modeloexperimental es útil para entender en parte lo que su-cede en tumores hipofisarios resistentes a agentes do-paminérgicos (1).

Como ocurre para otros tipos de tumores, el creci-miento de los adenomas hipofisarios requiere de unaadecuada vascularización una vez que el tumor sobrepasaunos pocos milímetros de tamaño. El factor de creci-miento del endotelio vascular, VEGF, es uno de los fac-tores angiogénicos más potentes que se conocen. En ra-tones transgénicos Drd2-/- demostramos que existe unaumento de la expresión de VEGF en las hipófisis y queeste aumento es regulado por la falta de acción dopami-nérgica (2). Por otro lado, no se vieron incrementados losfactores angiogénicos PTTG [3] o FGF2 (4) (Fig. 1), loque posiciona al sistema VEGF como blanco terapéuticoen los adenomas hipofisarios secretores de prolactina yresistentes a agentes dopaminérgicos. En concordancia,tratamientos con terapia anti-VEGF resultaron en una in-hibición del crecimiento tumoral y de la síntesis de pro-lactina en hipófisis Drd2-/- (5). Además, los bajos nivelesde FGF2 y PTTG encontrados podrían relacionarse al cre-cimiento lento y la rareza de metástasis que acompañana estos tumores de naturaleza benigna.

Por otro lado, como sucede en el desarrollo de otrostumores, durante la tumorogénesis hipofisaria se pro-ducen profundos cambios en la estructura de los com-ponentes de la matriz extracelular. Sin embargo, los pro-lactinomas rara vez producen metástasis. Por ello estu-diamos los componentes de la matriz extracelular. En-tre ellos, el factor de crecimiento transformante beta 1(TGFβ1), una citoquina que se encuentra implicada enmúltiples y potentes acciones locales, procesos biológi-cos como embriogénesis, desarrollo y homeostasis celular,proliferación y modificaciones de la matriz extracelular.El TGF-β1 y su receptor TGFβ tipo II (TβRII) están ex-presados en los lactotropos donde se ha descripto queejercen un efecto inhibitorio sobre la proliferación ce-lular y la secreción de prolactina. Nosotros demostramosque la expresión, activación y acción del TGFβ1 en hi-pófisis está disminuida en los ratones Drd2-/- (6). Estosresultados apuntan hacia la búsqueda de nuevas drogaspara el tratamiento de tumores resistentes a drogas do-paminérgicas relacionadas con TGFβ1 y sus activadoreslocales.

Por último, en tumores hipofisarios humanos y enparticular en prolactinomas resistentes al tratamientocon agonistas dopaminérgicos, determinamos un in-

cremento de VEGF y su asociación con marcadores devascularización como el CD31 y CD34 (7)(8). Estos ha-llazgos ponen de relevancia la vascularización del tumorhipofisario también en el humano, en oposición a tra-bajos que cuestionaban el aumento de vasculatura en es-tos adenomas.

El uso de antisicóticos en la clínica ha demostradoque además de la participación e importancia de la do-pamina como neurotrasmisor y neuromodulador en laregulación del sistema nervioso central los RD2 tienenfunciones a nivel periférico que no son tan claras.

En particular, nosotros demostramos que la dopa-mina a través del RD2 modula el eje de crecimiento. Losanimales transgénicos Drd2-/- presentaron un eje decrecimiento alterado, con una baja talla y un menorpeso corporal. Esto se correlacionó con menores nive-les de hormona de crecimiento secretados por la hipó-fisis, y menor IGF-I circulante (9)(10). Postulamos quela dopamina central a través del RD2 impediría la co-rrecta liberación de GHRH del hipotálamo en la ven-tana temporal del período neonatal, y por ende el de-sarrollo de la población de somatotropos estaríaalterado (Fig. 2). En concordancia, en humanos se haobservado que la L- DOPA puede acelerar el creci-miento en niños con deficiencia de GH, y que una po-blación de niños con polimorfismos en el RD2 pre-sentó deficiencias en el eje de crecimiento, con tallabaja idiopática. Finalmente, en adultos bajo tratamientocrónico con antisicóticos se demostró una respuestaanormal de GH durante el sueño. En conjunto todos es-tos datos apuntan a una participación del RD2 en la re-gulación del eje GHRH-GH.


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Figura 1. Efectos de la disrupción del RD2 en la hipófisis anterior.El aumento de prolactina por la falta del tono inhibitorio correlacionacon un aumento de VEGF y una disminución de TGFβ1. Otros fac-tores angiogénicos como el PTTG y el FGF2 están disminuidos, qui-zás poniendo un freno a la angiogénesis inducida por VEGF.

La dopamina regula el hambre y la saciedad ac-tuando a nivel hipotalámico. Sin embargo, los efectos dela dopamina sobre la ingesta no son claros ya que inte-ractúa con distintos núcleos hipotalámicos y estimuladistintos subtipos de receptores.

En ratones mutantes nulos para el RD2 se observó unincremento en los gramos de alimento consumido porg de peso corporal. Sin embargo simultáneamente sedescribieron dos eventos anorexigénicos en estos rato-nes: un aumento en la α-MSH sérica e hipotalámica (laα-MSH es un potente anorexígeno), y una disminu-ción del precursor de las orexinas (11). Estos eventosfueron compensados por el gran aumento de los nive-les de prolactina que actúan como estímulo orexigénico(Fig. 3). Se ha descripto que la prolactina estimula la in-gesta y la deposición de grasa en ratas hembras y que ra-tones deficientes del receptor de prolactina tienen unareducción progresiva en el peso corporal.

De nuestros resultados se destaca la compleja regu-lación del sistema de la ingesta, sistema primordial parala supervivencia. Múltiples factores actuarían en la re-gulación de la ingesta por el RD2, por un lado estos re-ceptores tienen acciones orexigénicas estimulando lasorexinas y la α-MSH, y por otro, anorexigénicas inhi-biendo en forma constante la secreción de prolactina.

En humanos, la reducción de los RD2 se asocia concomportamientos adictivos, pero la evidencia sobre mu-taciones en el RD2 y obesidad es escasa, aunque en ge-neral las mutaciones con pérdida de función se asociana sobrepeso.

Recientemente se describió que existe una estrechavinculación del uso de drogas antisicóticas y el desa-rrollo de diabetes tipo II. Nosotros demostramos que ladopamina también actúa a nivel del islote de Langer-

hans, regulando en forma inhibitoria la secreción de in-sulina. Utilizando los modelos animales de mutantes nu-los, definimos que la ausencia de la acción dopaminér-gica sobre el islote (dada por ejemplo por el uso dedrogas que antagonizan al RD2, o en forma constitutivaen los transgénicos), produce una secreción aumentadade insulina, lo que crónicamente conduce a un lento de-terioro y agotamiento de las reservas insulínicas del is-lote (Figura 4) [12].

Este es un enfoque original, no presentado hastaahora en la literatura, que resalta al páncreas como po-sible blanco no deseado de los tratamientos antisicóti-cos, y destaca la necesidad de desarrollar nuevos fár-macos más específicos teniendo en consideración losposibles efectos negativos a este nivel.



Figura 2. La falta de RD2 a nivel hipotalámico produce un descensoen la expresión de GHRH, y esta falla condiciona una inadecuada ex-pansión del linaje somatotropo, con menor secreción de GH, y porende de IGF-I circulante. En conjunto estas alteraciones producenuna talla baja en roedores.

Figura 3. La disrupción del RD2 afecta distintos componentes re-guladores de la ingesta. A nivel central se produce una disminuciónde las orexinas, y un aumento de αMSH. A nivel de la neurohipófi-sis se produce un aumento de secreción de αMSH por parte de losmelanotropos, y en la hipófisis anterior un aumento de prolactina.El gran aumento de prolactina podría estar relacionado con el au-mento de la ingesta del modelo, a pesar del descenso de orexinas yel incremento de αMSH (anorexígeno).

Figura 4. La falta de RD2 en el islote promueve la liberación de in-sulina, si esto se mantiene en forma crónica los islotes se agotan, yfinalmente no descargan insulina en forma adecuada.

Nuestros resultados en su conjunto, traen a la luz lascomplejas acciones endocrinas de los RD2 a distintos ni-veles del organismo, el hipotálamo, la hipófisis y el pán-creas, destacando que el funcionamiento de estos re-ceptores en forma orgánica y coordinada promueve eléxito reproductivo, el crecimiento, la ingesta y un me-tabolismo equilibrado.


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LABORATORIO DE NEUROBIOLOGÍA

Eventos tempranos condicionantes de enfermedades neurodegenerativas

Early events as conditioning factors of neurodegenerative diseases

Eventos precoces condicionantes de doençasneurodegenerativas

Héctor Coirini, María Sol Kruse, Mariana Rey, MarinaRoxana Di Pilla, María Cristina Vega

Resumen

Estudios clínicos sugieren que las complicaciones obstétri-cas están relacionadas con el desarrollo de alteracionesfuncionales en el sistema nervioso central del individuoadulto. Una hipótesis establecida indica que las enferme-dades neurodegenerativas estarían asociadas a un procesoiniciado por un estrés oxidativo temprano, y mediante dis-tintos modelos experimentales tratamos de identificar cam-bios que pueden producirse durante la preñez, o al momentodel nacimiento, relacionados con trastornos conductuales ocognitivos descriptos en enfermedades neurodegenerativas.De esta manera mediante una asfixia perinatal global que noafecta la sobrevida del individuo, hemos descripto alteracio-nes en las sinapsis de neoestriado e hipocampo, observandoagregación proteica y ubiquitinación aumentada así comocambios en el contenido de actina, mientras que en retinadescribimos alteraciones en la actividad de la oxido nítrico sin-tasa. Resultados similares fueron reproducidos in vitro usandocultivos organotípicos, donde las estructuras del cerebro y lasconexiones entre los diferentes núcleos se conservan. En untercer modelo donde se induce una diabetes gestacional(DG) hemos evidenciado alteraciones importantes en las víasde señalización intracelular en cerebro embrionario involu-cradas en el proceso de muerte celular programada. En estemismo modelo estamos evaluando los efectos de la DG sobrela expresión de receptores hepáticos X y su relación con la ex-presión de la enfermedad de Alzheimer.

Palabras clave: estrés oxidativo * cultivos organotípicos * as-

fixia perinatal * óxido nítrico sintasa * enfermedad de

Alzheimer * diabetes gestacional * retina

Summary

Clinical studies suggest that obstetric complications are re-lated to the development of functional alterations in the cen-tral nervous system of an adult. An established hypothesissuggests that neurodegenerative diseases would be associated


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to a process initiated by early oxidative stress. Then, usingdifferent experimental models, early changes that may occurduring pregnancy or at the perinatal period related to be-havioral or cognitive disorders described in neurodegenera-tive diseases are identified. Using the model of perinatal as-phyxia without affecting the survival of the individual,changes in neostriatum and hippocampus synapses, such asincreased protein aggregation and ubiquitination as well aschanges in the actin content have been described. On theother hand, in the retina, alterations of nitric oxide synthasewere also observed. Similar results were reproduced in vitrousing organotypic cultures where the brain structures andconnections between different nuclei are preserved. In a thirdmodel, induction of gestational diabetes (GD) has shown sig-nificant alterations in the intracellular signaling pathways in-volved in the embryonic brain related to programmed celldeath. In this model, we are currently evaluating the effectsof GD on the levels of liver X receptors and their possible re-lationship with the expression of Alzheimer disease.

Key words: oxidative stress * organotypic cultures * perina-

tal asfixia * nitric oxide sintasa * Alzheimer disease * gestational

diabetes * retina

Resumo

Estudos clínicos sugerem que as complicações obstétricasestão relacionadas com o desenvolvimento de alteraçõesfuncionais no sistema nervoso central do indivíduo adulto.Una hipótese estabelecida indica que as doenças neurode-generativas estariam associadas a um processo iniciado porum estresse oxidativo precoce, e através de diferentes mo-delos experimentais procuramos identificar alterações quepodem ser produzidas durante a prenhez, ou no momento donascimento, relacionados com transtornos de conduta oucognitivos descritos em doenças neurodegenerativas. Destemodo, mediante uma asfixia perinatal global que não afetaa sobrevida do indivíduo, temos descrito alterações nas si-napses de neoestriado e hipocampo observando agregaçãoproteica e ubiquitinação aumentada bem como alterações noconteúdo de actina, ao passo que em retina descrevemos al-terações na atividade da óxido nítrico sintase. Resultados si-milares foram reproduzidos in vitro usando culturas organo-típicas, onde as estruturas do cérebro e as conexões entre osdiferentes núcleos se conservam. Num terceiro modelo ondese induz uma diabetes gestacional (DG) temos evidenciadoalterações importantes nas vias de sinalização intracelular emcérebro embrionário envolvidas no processo de morte celu-lar programada. Neste mesmo modelo estamos avaliando osefeitos da DG sobre a expressão de receptores hepáticos Xe sua relação com a expressão da doença de Alzheimer.

Palavras chave: estresse oxidativo * culturas organotípicas *

asfixia perinatal * óxido nítrico sintase * doença de Alzhei-

mer * diabetes gestacional * retina

Un gran número de estudios clínicos sugieren quelas complicaciones obstétricas estarían relacionadascon el desarrollo de alteraciones funcionales en el sis-

tema nervioso central (SNC) del individuo adulto. Pro-cesos neurodegenerativos, tales como la espasticidad ce-rebro-espinal, una retinopatía proliferativa isquémica(RPI), el desencadenamiento de la esquizofrenia y hastael riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer, tie-nen su origen en edad temprana, no solo en la expre-sión precoz de la disfunción sino por la presencia de unprecondicionamiento del individuo a otros factores de-sencadenantes. Ciertas complicaciones que ocurren du-rante el desarrollo fetal o incluso en la etapa posnataltemprana, como una injuria cerebral, procesos infla-matorios o el desarrollo a una resistencia a insulina, ade-más de alteraciones cromosómicas o genéticas, puedengenerar una expresión clínica particular, la cual enprincipio no es deletérea pero que a largo plazo, se con-vierte en un importante factor de riesgo. La hipótesisgeneral es que las enfermedades neurodegenerativas,estarían asociadas a un proceso iniciado por un estrésoxidativo temprano. El daño producido en el sistemanervioso central durante el período perinatal, afectaríaprincipalmente el desarrollo neuronal y glial condu-ciendo a anormalidades en la respuesta celular o grupode células involucradas, a corto, mediano y largo plazo.La evaluación de las alteraciones y su comparación en-tre sistemas similares, permitirá entonces establecer pa-rámetros para la detección temprana de anomalías yplantear el desarrollo de posibles terapias paliativas.

En nuestro laboratorio se utilizan modelos experi-mentales relacionados, a fin de reproducir complica-ciones que pueden producirse durante la preñez, o almomento del nacimiento, evaluando su efecto a largoplazo sobre cambios que se producen a nivel celular ybioquímico.

Asfixia perinatal

La asfixia perinatal es considerada como una de lasmás comunes de las complicaciones obstétricas, pro-duce una injuria hipóxico-isquémica del sistema ner-vioso central, generalmente asociada con una cascadade eventos moleculares, que conducen a la muerte ce-lular por apoptosis o necrosis. Entre los mecanismosnocivos implicados más importantes, se encontraría laliberación de aminoácidos excitatorios que generanun aumento del calcio intracelular con liberación deóxido nítrico (NO) y la producción de especies reac-tivas del oxígeno. En el modelo experimental utilizadose produce una asfixia global al momento del naci-miento y luego se evalúan cambios estructurales y ul-traestructurales, (1) así como alteraciones en la ex-presión de la óxido nítrico sintasa (NOS) en animalesadultos o a edades tempranas, utilizándose tambiénmetodologías físicas y farmacológicas, a fin de preve-nir o revertir la aparición de las anormalidades pro-vocadas por la asfixia.



Alteraciones sinápticas en el cerebro

Las sinapsis de neoestriado e hipocampo, presentancaracterísticas diferentes en cuanto a las densidadespost-sinápticas (DPSs). Las alteraciones en estas es-tructuras durante un proceso hipóxico-isquémico, aso-ciadas a la producción de NO, provocan alteraciones es-tructurales en las sinapsis que llevan a la muerteneuronal. Estos cambios así como el posible daño en lasproteínas específicas que forman parte de estas estruc-turas, han sido vinculados con agregación proteica y ubi-quitinación sináptica. (2). Una de las posibles proteínasdañadas sería la F-actina, la cual está altamente con-centrada en las espinas dendríticas, por lo que cambiosen el contenido de actina podrían estar relacionadoscon la patogenia de la hipoxia (3).

Asfixia perinatal y retina

Un alto porcentaje de niños prematuros con algúngrado de asfixia, desarrollan una RPI como conse-cuencia de la variación de los niveles de oxígeno du-rante el desarrollo de la vasculatura retiniana (4). Es-tudios realizados en el laboratorio han indicado queratas sometidas a una asfixia perinatal en normotermiapresentan RPI. Esta patología pudo ser evidenciadapor fondo de ojo, en animales adultos y se encontróasociada a cambios en la expresión de la isoenzima in-ducible de la óxido nítrico sintasa (iNOS) a 21 y 30días posteriores a la asfixia (5) con un marcado au-mento en la inmunorreactividad para iNOS en la epi-rretina. Asímismo, la actividad de esta enzima deter-minada a 7, 15, 21, 30 y 60 días de edad presentó unaumento con la edad en ratas C con valores máximosa los 30 días de edad, mientras que los animales APpresentaron en cambio una actividad mayor que loscontroles a los 21 días de edad que se mantuvo en to-das las edades (6).

Diabetes gestacional

Alteraciones en la progenie de madres diabéticas

En este modelo se induce una diabetes experimen-tal no controlada en animales preñados, que conlleva al-teraciones endocrino-metabólicas, un medio internoalterado para el desarrollo fetal y a un trabajo de partocomplicado con riesgos perinatales. Estudios prelimi-nares se enfocaron sobre posibles alteraciones en las víasde señalización intracelular en cerebro embrionariode madres diabéticas, utilizando técnicas de western blotpara evaluar la expresión de p-Akt, Bax y Caspasa-3 auna edad embrionaria de 19 días, observándose una dis-minución de la p-Akt y de la proteína Bax indicando laexistencia de múltiples alteraciones en las vías de seña-lización que conducen a un proceso defectuoso de

muerte celular programada, lo cual podría estar rela-cionado con la susceptibilidad de la progenie de madresdiabéticas a ciertas patología (7).

Asociación con enfermedad de Alzheimer

La progenie de madres con diabetes presenta un au-mento en el riesgo a desarrollar obesidad y/o diabetestipo II a edades tempranas. Estas complicaciones (obe-sidad y diabetes) han sido vinculadas con un aumentosignificativo en el riesgo de desarrollar la enfermedadde Alzheimer (AD). Tanto en la diabetes tipo II comoen la AD existe una deficiencia en la respuesta a insu-lina y alteraciones en el metabolismo de colesterol.Los niveles de insulina y colesterol tienen papeles crí-ticos en los procesos metabólicos básicos de los tejidosperiféricos pero ambos actúan también como molécu-las reguladoras de la función neuronal, teniendo unaacción de importancia sobre los procesos de memoriay en las enfermedades neurodegenerativas. Los re-ceptores hepáticos X (LXR) recientemente descrip-tos, se encuentran involucrados en el control del me-tabolismo energético interviniendo tanto en elmetabolismo lipídico como en el de hidratos de car-bono y ambos metabolismos están altamente correla-cionados con las patologías descriptas anteriormente.Hemos iniciado estudios de caracterización y localiza-ción de los LXR en el cerebro de animales nacidos demadres con diabetes experimental a fin de evaluar si es-tas alteraciones pueden estar asociadas al riesgo de de-sarrollar AD (8).

Cultivos organotípicos

Con el fin de estudiar en detalle los procesos mole-culares provocados por una asfixia global, iniciamosestudios con cultivos organotípicos, para ello se utilizancortes de tejido cerebral, los cuales son mantenidoscon vida, durante 21 días; esto permite evaluar cambiosestructurales una semana después de provocarles unaasfixia-hipoxia in vitro. Asimismo con este modelo po-demos evaluar la acción de compuestos neuroprotec-tores a un proceso excitotóxico. Uno de los agentes eva-luados fue alopregnanolona (Alo) utilizando cultivosorganotípicos de estriado (St) e hipocampo (Hc).Luego de 1h de hipoxia todos los cultivos presentaronun aumento de LDH que fue mayor y significativo a las24h post-hipoxia, provocando un aumento en las neu-ronas positivas para NADPH en St (38%) pero no enHc. Ensayos con microscopía confocal mostraron un au-mento de la señal de GFAP 24h después de la hipoxia.El pretratamiento con Alo provocó una disminución dela señal de GFAP que fue dosis dependiente (50nM y5μM) en ambos tejidos siendo significativo en el hipo-campo [9].


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Otros proyectos

El laboratorio desarrolla proyectos en colaboraciónentre los que se destaca la evaluación de la interacciónde diversos esteroides sintéticos, análogos de metaboli-tos reducidos de progesterona, producidos en el De-partamento de Química Orgánica, FCEyN-UBA [10,11], los cuales interactúan con el receptor para GABAtipo A. Seguida la caracterización del comportamientode unión a los distintos sitios de ese receptor se realizanestudios sobre las características neuroprotectoras de es-tos, ante los eventos hipóxico-isquémico en cultivos or-ganotípicos, tejido fresco e in vivo.


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9. Kruse MS, Rey M, Barutta J, Coirini H. Allopregnanoloneeffects on astrogliosis induced by hypoxia in organ-otypic cultures of striatum, hippocampus, and neocor-tex. Brain Res 2009; 1303: 1-7.

10. Alvarez LD, Veleiro AS, Baggio RF, Garland MT, Edel-sztein VC, Coirini H, et al. Synthesis and GABA(A) re-ceptor activity of oxygen-bridged neurosteroid analogs.Bioorg Med Chem 2008; 16: 3831-8.

11. Durán FJ, Edelsztein VC, Ghini AA, Rey M, Coirini H,Dauban P, et al. Synthesis and GABA(A) receptor activityof 2,19-sulfamoyl analogues of allopregnanolone. Bio-org Med Chem 2009; 17: 6526-33.

LABORATORIO DE BIOLOGÍA DEL COMPORTAMIENTO, INSTITUTO DE BIOLOGÍA Y MEDICINA

Un análisis integral del concepto de estrés

A comprehensive analysis of the concept ofstress

Uma análise integral do conceito de estresse

Marcelo H. Cassini, Enrique T. Segura

Resumen

El concepto de estrés es utilizado en una gran diversidad dedisciplinas biológicas, desde la biología molecular hasta laecología de ecosistemas. Sin embargo, no existe una teoríauniversal del estrés y cada disciplina utiliza una definiciónde estrés que resulta funcional al proceso que está investi-gando pero que agrega confusión a la posibilidad de definirel estrés con criterio riguroso. Nuestro objetivo fue realizarun análisis exhaustivo del uso del concepto de estrés en lasciencias biológicas. No pretendimos realizar una revisióncompleta de la literatura sino poner énfasis en la diversidadde procesos en los que el estrés está involucrado. A partir delanálisis de esa diversidad, surgieron patrones en el uso deltérmino que permiten ir delimitando una definición única delestrés. El análisis que realizamos incluyó: (a) comparaciónde definiciones de la literatura; (b) identificación de sietecomponentes que conforman el proceso del estrés: estresor,contexto del estresor, efecto del estresor, mecanismo de re-conocimiento del estresor, mecanismo de generación derespuesta, respuesta de estrés y consecuencia de la res-puesta de estrés; (c) análisis de la intensidad y efecto del es-tresor y del tipo de resultado del estrés; (d) clasificación deltipo de consecuencias de la respuesta de estrés en reversi-bles o irreversibles y de corto, mediano o largo plazo; (e) re-flexión sobre la especificidad de la respuesta y predictibili-dad del estresor. Concluimos que conviene restringir lanoción de estrés al proceso que incluye la interacción entre



un estresor impredecible (en cierto grado) y un mecanismoindividual de respuesta inespecífica (en cierto grado). Losefectos predecibles deberían quedar enmarcados dentro delcontexto del estrés, y las respuestas poblacionales y de ni-veles superiores, dentro de las consecuencias ecológicas dela respuesta de estrés.

Palabras clave: condiciones ambientales adversas * estrés a

nivel celular * fisiológico y ecológico * estresor * respuesta

de estrés * consecuencias genéticas del estrés

Summary

The concept of stress is used in a variety of biological dis-ciplines, from molecular biology to ecosystem ecology. How-ever, there is no universal theory of stress and each disciplineuses a definition of stress that is functional to the processbeing investigated, but adds confusion to the possibility ofdefining stress using rigorous criteria. Our objective was toconduct a thorough analysis of the use of the concept ofstress in the biological sciences. We did not attempt a fullreview of the literature but to emphasize the diversity ofprocesses that stress involved. From the analysis of this di-versity, patterns emerged in the use of the term that enableda delimitation of a single definition of stress. The analysisperformed includes: (a) comparison of definitions from theliterature; (b) identification of seven components that makeup the process of stress: stressor context, stressor, effect ofthe stressor, stressor recognition mechanism, a mechanismfor response generation, stress response, and consequenceof the stress response; (c) analysis of the intensity and ef-fect of the stressor and type of result of stress; (d) classifi-cation of the type of consequences of the stress response inreversible or irreversible, and short, medium or long term; (e)analysis of the specificity of the response and predictabilityof the stressor. It can be concluded that it is advisable to re-strict the notion of stress process to the interaction be-tween a—to some degree—unpredictable stressor and asingle—to some degree—non-specific response mechanism.The predictable effects should be framed within the contextof stress, and population responses and higher levels withinthe ecological consequences of the stress response.

Key words: noxious environmental conditions * cellular *

physiological and ecological stresses * stressor * genetic con-

sequences of stress

Resumo

O conceito de estresse é utilizado em uma grande diversidadde disciplinas biológicas, da biologia molecular até a ecolo-gia de ecossistemas. Entretanto, não existe uma teoria uni-versal do estresse e cada disciplina utiliza uma definição deestresse que resulta funcional ao processo que está pesqui-sando mas que agrega confusão à possibilidade de definir oestresse com critério rigoroso. Nosso objetivo foi realizar umaanálise exaustiva do uso do conceito de estresse nas ciên-cias biológicas. Não pretendemos realizar uma revisão com-pleta da literatura mas colocar ênfase na diversidade de pro-cessos nos quais o estresse está envolvido. A partir da

análise dessa diversidade, surgiram padrões no uso do termoque permitem ir delimitando uma definção única do estresse.A análise que realizamos incluiu: (a) comparação de defini-ções da literatura; (b) identificação de sete componentes queconformam o processo do estresse: estressor, contexto do es-tressor, efeito do estressor, mecanismo de reconhecimentodo estressor, mecanismo de geração de resposta, resposta deestresse e consequência da resposta de estresse; (c) análiseda intensidade e efeito do estressor e do tipo de resultadodo estresse; (d) classificação do tipo de consequências daresposta de estresse em reversíveis ou irreversíveis e decurto, médio ou longo prazo ; (e) reflexão sobre a especifi-cidade da resposta e preditibilidade do estressor. Concluímosque convém restringir a noção de estresse ao processo queinclui a interação entre um estressor impredizível (em certograu) e um mecanismo individual de resposta inespecífica(em certo grau). Os efeitos predizíveis deveriam ficar en-quadrados dentro do contexto do estresse, e as respostas po-pulacionais e de níveis superiores, dentro das consequênciasecológicas da resposta de estresse.

Palavras chave: condições ambientais adversas * estresse a

nível celular * fisiológico e ecológico * estressor * resposta

de estresse * consequências genéticas do estresse

La noción de estrés es utilizada en diversas áreas dela ciencia, desde la física a la medicina. Además seaplica a diversas condiciones de la vida cotidiana. Enesta revisión nos concentramos en el uso que se lebrinda en el vasto campo de las ciencias biológicas. Elconcepto de estrés se aplica a numerosos fenómenosbiológicos. Los especialistas que la usan en un campo dela biología frecuentemente no tienen la intención de ex-trapolar sus conclusiones acerca del estrés a otros cam-pos, como si se trataran de fenómenos diferentes. Sinembargo, la entidad es por naturaleza inter-disciplina-ria porque relaciona diversos niveles de organizaciónentre sí y con el medio ambiente. Tiene el atractivo te-órico de ligar los mecanismos fisiológicos con los pro-cesos ecológicos y la evolución. Los estímulos ambien-tales adversos disparan procesos a nivel molecular ycelular y la respuesta del organismo al estrés refleja elrol de las fuerzas ambientales externas en determinar ladistribución, la abundancia y los procesos evolutivosde las especies (1- 4).

La disciplina “madre” del concepto de estrés es la en-docrinología de los vertebrados. El ‘descubridor’ del es-trés, Hans Selye describió en 1935 las alteraciones fi-siológicas en ratas de laboratorio sometidas acondiciones de estrés. la reactividad del eje hipotalá-mico-pituitario-adrenal es uno de los primeros y mejorcomprendidos de los mecanismos fisiológicos asociadosal estrés. El concepto de estrés fue rápidamente incor-porado a la medicina y la psicología y se volvió un con-cepto popular para describir las alteraciones de saludprovocadas por el frenesí de la vida moderna. La nociónde estrés también se fue incorporando al léxico de di-


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versas disciplinas científicas, desde la biología molecu-lar a la ecología. Para evaluar la frecuencia y distribu-ción del uso de este concepto en las ciencias biológicasactuales, realizamos una relevamiento de los artículospublicados en la revista PLoS Biology que contienen eltérmino stress, desde el primer número publicado en el2003 hasta junio 2011. Se cita la palabra estrés (sin in-cluir los casos en que el término “stress” se usa con el sig-nificado de “enfatizar”) en 485 de 2780 artículos, es de-cir un 17,5%. La distribución de los porcentajes demención del término es bastante pareja entre las pri-meras 9 disciplinas (Genética & Genómica, Biología ce-lular, Biología molecular, Biología del Desarrollo, Neu-rociencias, Bioquímica, Microbiología, Biologíacomputacional y Ecología), con un mínimo de 14,9%de citas con el término en ecología y un máximo de27,2% en microbiología. El resultado de este rápido pa-neo sobre las publicaciones sugiere que es un conceptovigente en las ciencias biológicas modernas con una dis-tribución amplia entre diversas disciplinas.

El objetivo de este trabajo es realizar un análisis ex-haustivo del uso del concepto de estrés en las cienciasbiológicas. Describimos diferencias y similitudes en eluso del concepto entre diferentes disciplinas y diferen-tes autores. Investigamos si es posible generar una de-finición universal de estrés. En caso de encontrar dife-rencias conceptuales insalvables entre diferentesaproximaciones al estrés, evaluamos la posibilidad deser más cuidadosos en el uso del término, reemplazar suuso por términos más precisos o aceptar que el tér-mino estrés sea utilizado más como una metáfora decondiciones adversas que un concepto científico conuna definición precisa.

Algunos usos actuales del concepto de estrés

Como ya dijimos, son muchas las disciplinas bioló-gicas que utilizan el concepto de estrés. En esta secciónse darán algunos ejemplos de su uso dentro de doscampos que tienen escalas de trabajo contrapuestas: labiología celular y la ecología. La biología celular ha te-nido un enorme desarrollo en las últimas décadas.Buena parte de este crecimiento está asociado a cues-tiones biomédicas y concomitantemente, al descubri-miento de los mecanismos celulares involucrados en di-versas patologías en los humanos. Como veremos, lanoción de enfermedad o disfunción está estrechamenterelacionada al concepto de estrés. En este contexto, elconcepto de estrés se incorpora como el medio am-biente anómalo que provoca la disfunción de algúnmecanismo celular que precede al surgimiento del sín-toma. Algunos de las condiciones y mecanismos de es-trés más estudiados a nivel celular y molecular son: el es-trés oxidativo, el estrés del retículo endoplasmático, elestrés genotóxico, el estrés osmótico, el estrés mecánico,

el estrés de la replicación, las proteínas del estrés, las fi-bras del estrés y los gránulos del estrés. Cada uno de es-tos términos resumen un área completa de investiga-ciones con extensas referencias bibliográficas. Aquí sólodaremos breves definiciones extraídas de esa literaturacomo forma de ilustrar la diversidad de usos del con-cepto de estrés.

El estrés oxidativo es producido por un exceso de ra-dicales libres que provocan daños en las proteínas ce-lulares, en los lípidos de las membranas y en los ácidosnucleicos, y puede llevar eventualmente a la muerte ce-lular (5). El estrés oxidativo se ha asociado al origen dediversas enfermedades como la aterosclerosis, la enfer-medad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Elretículo endoplasmático cumple múltiples funcionescelulares que pueden ser alteradas por diversas pertur-baciones externas tales como privación de glucosa, in-fecciones virales y obesidad (6)(7). El retículo endo-plasmático responde al estrés disparando una respuestaconservada evolutivamente, conocida con el nombre de‘respuesta a proteínas desdobladas’, la cual involucraprogramas transcripcionales que inducen la expresiónde genes específicos (7). El estrés genotóxico resulta dela exposición de las células a ciertos químicos que im-pactan sobre el ADN y producen alteraciones del ma-terial genético (8). Este fenómeno ha sido reconocidocomo uno de los factores asociados al desarrollo del cán-cer en humanos (9). Para responder al daño celularprovocado por este tipo de estrés, las células han desa-rrollado un repertorio de respuestas que involucra mu-chos factores celulares que forman un extensa red detransducción de señales (9). Las variaciones de osmo-ralidad del medio ambiente pueden provocar estréscelular particularmente en bacterias y plantas. Existensimilitudes sorprendentes en la respuesta celular al es-trés osmótico entre grupos taxonómicos diversos (10).

El estrés mecánico es una fuerza que opera sobre lasuperficie celular y que puede ser provocada por unacompresión operando hacia el interior, una tracción opor cizallamiento (shear) en la superficie de los tejidos(11). La respuesta al estrés mecánico, como los canalesde iones sensibles al estiramiento, está presente en bac-terias, hongos, invertebrados y vertebrados (11). Enhumanos, ha sido intensamente investigada en rela-ción al impacto del estrés por cizallamiento de la paredproducido por variaciones en la presión sanguínea, lascuales resultan en enfermedades cardio-vasculares y laateroesclerosis (11). Las proteínas del estrés (heat shockproteins) probablemente sean el mecanismo más famosode defensa contra el estrés celular (12). Son universalesy con diversos roles funcionales, de las cuales la más es-tudiada es la de ‘chaperones’ moleculares (13). Losgránulos del estrés son sitios citoplasmáticos dinámicosy transitorios que contienen agregados de ARNm (14).Estos gránulos son la consecuencia morfológica de larespuesta de estrés de proteínas involucradas en even-



tos normales de procesamiento del ARNm. Esta res-puesta de estrés puede ser disparada por shocks de calor,exposición a oxidantes, proteínas desdobladas o ARNde doble cadena (14).

La ecología es una disciplina muy amplia que analizalas interacciones con el medio ambiente de varios nive-les de organización, incluyendo individuos, poblaciones,comunidades y ecosistemas. Existen diversos estresoresambientales que afectan a los organismos vivos a esos dis-tintos niveles. La depredación y las condiciones climáti-cas extremas son ejemplos típicos. Sin embargo, el usodel concepto de estrés en ecología se expandió a partirde los estudios del impacto de las actividades humanas so-bre el medio ambiente natural (15). La contaminación,la degradación del hábitat y el cambio climático generancondiciones estresantes para la vida silvestre.

La ecología de poblaciones investiga la respuesta deespecies individuales a variaciones temporales en lascondiciones del ambiente. La medida más importantedel efecto del ambiente sobre las poblaciones es la tasade crecimiento poblacional y los parámetros que laafectan como las tasas de natalidad, mortalidad y fe-cundidad (16)(17). El efecto del estrés se mide sobre es-tas variables. Si bien los mecanismos de estrés operan anivel individual, el impacto que tiene sobre una pobla-ción depende de la proporción de individuos que tie-nen capacidad de responder adaptativamente al estrés,por lo que poblaciones aparentemente viables con fit-ness positivo bajo condiciones de estrés pueden encon-trarse en el límite de la extinción (18). La ecología depoblaciones vegetales fue una de las primeras ramas dela ecología en estudiar el estrés, a punto tal de consi-derar la ‘resistencia al estrés’ como un propiedad de his-toria de vida de las especies, junto a características talescomo tiempo y duración de la floración y la longevidaddel banco de semillas (19). La ecología de comunidadesestudia la estructura y dinámica de conjuntos de po-blaciones. Se ha investigado profusamente el efectoque tiene el estrés sobre dos procesos fundamentales (ycontrapuestos) de las comunidades: la competencia in-ter-específica y la facilitación. Una de las hipótesis eneste campo plantea que la importancia relativa de estosdos procesos en las comunidades depende de la inten-sidad de estrés abiótico, siendo las interacciones positi-vas más frecuentes cuando la intensidad del estrés esmás alta (20)(21).

El estrés que opera sobre la organización de los eco-sistemas produce una gran diversidad de efectos, de-pendiendo de los componentes y procesos que se venafectados. Estos efectos perturbadores son más eviden-tes cuando son producto del impacto antrópico. Porejemplo, la contaminación biológica de los lagos pro-duce una alteración en las bases de las tramas tróficasacuáticas, aumentando la productividad primaria, in-duciendo floraciones de algas con las consiguientes al-teraciones sobre los consumidores; otro ejemplo en la

dirección opuesta es la explotación pesquera que nor-malmente implica la remoción del los peces carnívoros‘tope’ lo que provoca un efecto en cascada sobre latrama trófica (22). Un tercer ejemplo es la respuesta delos microorganismos del suelo a estresores tales comolas sequías o las heladas tiene consecuencias sobre losnutrientes del suelo que afectan la productividad vege-tal y los eslabones tróficos superiores (3).

Este rápido paneo realizado solamente dentro de dosáreas de la biología, sirve para ilustrar la diversidad ycomplejidad de condiciones en las que se aplica el con-cepto de estrés. Dada esta situación, es de esperar queexistan numerosas y variadas definiciones de estrés.

Diversidad de definiciones de estrés

El término estrés ha sido uno de los más controver-tidos de los términos biológicos. A continuación se enu-mera una serie de definiciones provenientes de distin-tos campos de la biología:

• Un estado de tensión no específica en organismosvivos (23)

• Una respuesta no específica del cuerpo a cualquierdemanda de cambio (24)

• Una resultante fisiológica de demandas que exce-den las capacidades regulatorias del organismo(25).

• Un factor ambiental que causa un cambio poten-cialmente nocivo en un sistema biológico (26).

• Un factor ambiental, usualmente uno físico, quetiene algún efecto sobre el fitness (2).

• Una condición externa que reduce el crecimiento,la supervivencia y/o la fecundidad de un orga-nismo (21)

• Un contexto en el cual el fitness absoluto del tiposalvaje es reducido en comparación con el fitness ab-soluto en algún otro contexto de referencia (27)

• Un estado fisiológico de un animal en relación alestresor experimentado (1).

• Una reducción en la ganancia neta de recursos deun organismo relativa a su potencial máximo in-cluso luego de aclimatación o adaptación a unacondición ambiental (28)

• Una amenaza crónica que impone costos fisiológi-cos (4)

• Una amenaza, real o implícita, a la homeostasis(29)

• El estado en el que la homeostasis ha sido perdida(30)

¿Cuáles son los componentes del estrés?

De lo anteriormente expuesto queda claro que el es-trés es un concepto vigente que se utiliza con frecuencia


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para explicar numerosos fenómenos biológicos que tie-nen que ver con el impacto de factores ambientales ad-versos, pero que no existe una definición común quedescriba todos esos fenómenos. Con el objeto de orde-nar la variedad de conceptos invocados en nombre delestrés y avanzar hacia una teoría unificada para este fe-nómeno, comenzamos por realizar una ‘disección’ delproceso involucrado en el estrés. Identificamos sietecomponentes en el estrés: estresor, contexto del estre-sor, efecto del estresor, mecanismo de reconocimientodel estresor, mecanismo de generación de respuesta,respuesta de estrés y consecuencia de la respuesta de es-trés. A continuación se describe brevemente cada unode esos componentes.

Los estresores son los factores del ambiente que afec-tan negativamente al organismo. Los estresores son va-riados dependiendo del tipo de organismo conside-rado. Por ejemplo, la labranza o la remoción completade árboles producen alteraciones estructurales del sueloque son estresores para los micro-organismos del suelo(4) mientras que la fuerza de las corrientes de aguapuede volverse estresante para un caracol que habitaambientes lóticos (31). Frecuentemente se distingue en-tre el efecto de estresores naturales y aquellos de origenantrópico. Otra forma de clasificación es la de estreso-res de corto término (fuego, tormentas, cosechas) y delargo término o crónicos (sequías, toxinas) (4). Para laecología de sistemas, los primeros tienden a denomi-narse ‘perturbaciones’. Algunos autores hablan de queel ambiente puede ser interno (genético o celular) o ex-terno (ecológico). Ejemplos de estresores internos sonla endogamia, las mutaciones deletéreas y el envejeci-miento celular (32). Es importante no confundir el es-tresor con el contexto o ambiente donde opera el es-tresor.

El contexto del estresor son las condiciones físicas y psi-cológicas presentes cuando el estresor aparece (33). Elambiente social, las condiciones climáticas, la disponi-bilidad previa de recursos, el grado de control sobre elestresor, determinan un contexto que influye sobre lacapacidad de respuesta frente al estresor. Más adelantese discutirá como algunos de los normales denominadosestresores deberían ser considerados parte del contextoestresante. El contexto del estresor es una de las causasque determinan que diferentes individuos muestrendistintas intensidades de respuesta frente al mismoefecto del estresor.

El efecto del estresor es el tipo de impacto negativo queprovoca el estresor sobre el organismo. El efecto directodel estresor es siempre a nivel de organismos individua-les, pudiendo afectar al individuo completo, alguno desus sistemas o solo alguno tejidos. Puede tener conse-cuencias sobre poblaciones, comunidades y ecosistemas,pero el efecto directo es siempre sobre individuos.

El mecanismo de reconocimiento del efecto del estresores un proceso fisiológico o uno molecular (depen-

diendo el tipo de efecto del estresor) que permite iden-tificar la ocurrencia y el nivel del efecto del estresor. Esel segundo de los factores que determina el grado de va-riación de respuesta a un estresor, ya que el sistema dereconocimiento se seleccionaría en función del estresor.Esto determinaría que los mecanismos de reconoci-miento puedan ser específicos pero, como veremos, larespuesta es inespecífica.

El mecanismo de generación de respuesta de estrés es elrasgo de diseño adaptativo disponible al organismopara responder al efecto del estresor. En micro-orga-nismos, existen varios mecanismos que han sido consi-derados como respuestas de estrés. El entrar en estadode inactividad (dormancy) es considerado una respuestaa condiciones estresantes extremas (4). Las bacterias uti-lizan los mecanismos de transferencia horizontal degenes como una herramienta genética altamente efi-ciente para responder a condiciones adversas del medioambiente. Su extendida capacidad para generar resis-tencia anti-biótica es una clara demostración de esta ca-pacidad (34). En invertebrados, los mecanismos de res-puesta a los tóxicos del ambiente son diversos y resultanen una disminución en la captación (v.g. disminuir per-meabilidad en poliquetos), un aumento de la depura-ción (v.g. aumentar excreción en insectos), una mejo-ría de los procesos de desintoxicación, o mejorar losprocesos reparación (vg. una mutación puntual que re-duce el efecto del tóxico), entre otros (revisado por 3).En vertebrados, el mecanismo más reconocido de res-puesta al estrés es el ya mencionado eje hipotálamo-hi-pofisiario-adrenal. También el sistema nervioso auto-nómico, particularmente la respuesta simpática de lamédula adrenal y los nervios simpáticos (29). Deacuerdo a la amplitud en la definición del concepto deestrés, se puede incluir al sistema inmune (27) y al re-pertorio de conductas de evitación (32) como meca-nismos de estrés.

La respuesta de estrés es lo que produce el meca-nismo frente al efecto del estrés. A la respuesta de estréstambién se la llama “resistencia al estrés” (stress resis-tance). La respuesta de estrés en el caso del eje hipotá-lamo-hipofisiario-adrenal de los vertebrados incluye lamovilización de glucosa a los músculos, la estimulaciónde la gluconeogénesis hepática, el incremento del tonocardiovascular, la estimulación de la función inmune yla inhibición de las conductas reproductora y alimen-taria (35). La respuesta de estrés es, en la mayoría de loscasos, inmediata al efecto del estrés.

La consecuencia de la respuesta de estrés es el efectoa mediano o largo plazo, reversible o irreversible quepuede tener el estrés en un organismo, población, co-munidad o ecosistema. Los mecanismos de estrés puedeinteraccionar con otros mecanismos fisiológicos o con-ductuales (v.g. eje con respuesta inmune) y ecológicos(competencia y facilitación), diversificando sus efec-tos. Un área muy investigada de las consecuencias de la



respuesta de estrés es en el comportamiento social delos vertebrados, por ejemplo en las relaciones de do-minancia dentro de los grupos sociales (v.g. 36) y en elvalor de las asimetrías fluctuantes para la selección se-xual (vg. 37). Para muchos autores, las consecuenciasdel estrés son consideradas respuestas de estrés pero,como discutiremos más adelante, la distinción facilita al-canzar una definición más estricta del estrés.

¿Puede haber estrés sin que haya respuestaadaptativa de estrés?

La mayor confusión que se ha generado en la litera-tura en relación al estrés radica en la respuesta a esta pre-gunta. Existe una considerable contradicción entre la de-finición originaria del estrés y muchas definiciones deestrés utilizadas por los biólogos en las últimas décadas.

Para los físicos que fueron quienes acuñaron el tér-mino, el estrés es una medida de las fuerzas que actúansobre un cuerpo que puede ser deformado. El materialque compone el cuerpo responde con un cambio deforma y tiene un límite de tolerancia a las fuerzas queoperan sobre él. Superado ese umbral, ocurren fallas es-tructurales. Es decir que para los físicos, el estrés existeporque existe la respuesta de estrés. Si se aplica unafuerza sobre un cuerpo y este se rompe sin oponer re-sistencia, significa que no hay estrés. Bajo una condiciónestresante, un cuerpo puede responder ‘adaptativa-mente’ cuando el estímulo es de intensidad intermediao puede sufrir un efecto negativo permanente, cuandoesa intensidad supera un umbral.

H. Selye (23) fue el primero en aplicar el conceptoa los seres vivos y lo definió como ‘una respuesta no es-pecífica del cuerpo a cualquier demanda de cambio’. Esdecir que para el ‘descubridor’ del estrés, es también larespuesta de estrés. Al igual que para los físicos, para losprimeros fisiólogos el efecto negativo del estrés solo apa-rece cuando la respuesta del estrés no alcanza paracompensarlo. En otras palabras, los primeros investi-gadores del estrés estaban especialmente interesados enlos últimos dos componentes: mecanismos y respuestas.

Cuando el concepto de estrés se vuelve popular, lohace con una connotación más negativa. El estrés esvisto como un efecto que implica una disminución defuncionalidad del organismo, que puede producir en-fermedad física o psíquica, sin que el individuo tengaposibilidad de responder adaptativamente al estresor.Cuando el concepto de estrés es adoptado por la eco-logía, lo hace influenciado por este concepto negativodel estrés, más cercano al concepto de distress de Selye(23). La mortalidad se vuelve una medida fácil para me-dir el estrés (2). En otras palabras, se produce un cam-bio en los componentes del estrés sobre los que se rea-liza el énfasis, hacia los primeros dos componentes:

estresor y efecto del estresor, enfatizando los efectoscuando ya no es efectiva la respuesta de estrés.

En síntesis, a lo largo de la historia del concepto deestrés, se pasa de un período inicial en el que lo más im-portante era la respuesta de estrés, al concepto quepuede haber estrés sin que haya una respuesta de estrés.En los últimos años, desde la biología celular se ha pro-ducido un reflorecimiento parcial del énfasis sobre losmecanismos de estrés, ya que esta disciplina hace focoen los procesos metabólicos y la funcionalidad celularque provocan los estresores.

¿Es el estímulo estresante intermedio entre lo normal y lo letal? ¿Hay efectos positivos del estrés?

Para muchos investigadores, la existencia de estrésdepende de la intensidad del estímulo negativo. Estosautores asignan al estrés un efecto intermedio: el estí-mulo estresante debe encontrarse por debajo de los ran-gos ‘normales’ de tolerancia y por encima de los rangos‘letales’ (2). Sin embargo, hay otros autores que consi-deran estresantes a estímulos negativos normales y otrosque hacen lo mismo con estímulos letales.

Es fundamental diferenciar el efecto del estrés sin ycon respuesta de estrés. Estrictamente hablando, elefecto que tiene el estresor debe siempre considerarsecuando no hay respuesta de estrés. Bajo esta defini-ción, el efecto del estresor siempre es negativo. Lo queocurre es que las respuestas de estrés pueden neutrali-zar el efecto del estresor y, en algunos casos, puedemejorar la condición del organismo. Un ejemplo sen-cillo es la aparición de un depredador. Gracias a la res-puesta de estrés el organismo puede escapar, por lo queno habría ningún efecto negativo del estresor sobre lafuncionalidad ni el fitness del organismo (quizás re-presente un pequeño costo metabólico). Pero el efectodel estresor es el daño potencial que produciría el es-tresor si no hubiera esa respuesta de estrés. De acuerdoa esto, el efecto directo del estrés es siempre negativo yhay efectos letales que deben ser considerados estre-santes.

Cuando un factor ambiental tiene un efecto negativodentro de los rangos ‘normales’ de una especie, en-tonces se dice que no hay estrés. La cuestión es definir‘normalidad’. En términos estrictos, un efecto normalsería aquel que no afecta el fitness sin necesidad queoperen mecanismos de estrés. Dentro de este rango de‘normalidad’ están las respuestas adaptativas específicas,es decir adaptaciones que no tienen relación con el es-trés. Las respuestas adaptativas a estímulos negativos queno son respuestas de estrés son el producto de evoluciónfrente a factores ambientales estables y predecibles.Este concepto será analizado en una sección posterior.


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¿Cómo puede resultar la interacción entre elestresor y el organismo?

Como acabamos de analizar, por definición el estresorsiempre tiene potencialmente un efecto inmediato ne-gativo. Este efecto puede ser neutralizado por la res-puesta de estrés o puede expresarse si la respuesta de es-trés no existe o es débil en relación a la intensidad delestímulo. A nivel de los organismos, el estrés pueden te-ner cinco resultados diferentes, dependiendo de cómointeractúa el efecto del estresor con la respuesta de estrés:(1) puede ser letal, si el estresor es intenso y no hay res-puesta de estrés o esta no es suficiente; (2) puede afec-tar directamente el fitness por efecto sobre la funciona-lidad (v.g., enfermedad) o la reproducción, cuando larespuesta de estrés no es suficiente para anular un efectono letal del estresor; (3) puede afectar indirectamente elfitness por efecto sobre el balance energético; (4) puedeser neutro si la respuesta de estrés es efectiva; y (5) puedeser positivo, si predispone al organismo a responder máseficientemente a exposiciones futuras al estresor.

El tercer tipo de efecto, que significa considerar el es-trés como un ‘costo’ merece una explicación más am-plia. Cuando se define al estrés como una respuesta‘adaptativa’ o ‘plástica’, en realidad se puede aceptarque esa respuesta igual conlleva un efecto indirecto so-bre el fitness. Como los recursos energéticos y detiempo son finitos, la asignación de recursos a la res-puesta de estrés inevitablemente implica un costo en tér-minos de asignación de recursos, por más que no tengaun impacto directo sobre la funcionalidad que se reflejaen la salud o en la reproducción. Si hay efecto indirecto,puede haber disminución del fitness, pero no por dis-minución de la funcionalidad sino por alteración delpresupuesto energético (26)(29). Seria análogo a la di-ferencia entre alimentación y reposo. La alimentación esmás costosa que el reposo y además frecuentemente esmás riesgosa. Sin embargo, no se puede decir que la ali-mentación afecte la funcionalidad de un organismo. Esuna actividad esencial como es esencial poder respon-der eficazmente a disminuciones temporales en la cali-dad del hábitat, que sería la definición ‘adaptativa’.

Las consecuencias reversibles e irreversibles del estrés

Para un organismo, las consecuencias del estrés pue-den ser reversibles o irreversibles. Cuando las conse-cuencias son reversibles, el impacto puede ser de cortotérmino o de mediano término. En estas definicionesentra los conceptos clásicos de homeostasis y alostasis(29). Cuando las consecuencias son reversibles y decorto término, se puede decir que hay una perturbaciónmomentánea del equilibrio interno del organismo quese restablece luego de superado el estado de estrés.

Ejemplo comunes de consecuencias reversibles de cortotérmino son la huída de un depredador o la respuestaa una helada nocturna por los micro-organismos delsuelo. Dado que las condiciones ambientales cambiancontinuamente en forma tanto predecible como im-predecible, muchas veces resulta conveniente cambiarde condición de equilibrio para ajustarse a una nuevacondición ambiental. A este mantenimiento de la esta-bilidad interna a través del cambio se la conoce comoalostasis (29). Cuando estas respuestas reversibles decambio de estado estacionario ocurren como respuestaal efecto de un cambio negativo más o menos impre-decible, estamos frente a un tipo de consecuencia derespuestas de estrés. Un ejemplo para ilustrar una con-dición alostática cíclica y otra impredecible. Durante elestado de preñez para una hembra de mamífero, las de-mandas cambian de forma de pasar a un estado meta-bólico diferente que seguramente requerirá de un au-mento de la ingesta de alimento. Si esta hembrahipotética debe gestar en un invierno inusualmentecrudo, queda sometida a una condición estresante queimplica un aumento todavía más elevado de las de-mandas energéticas. En algunas especies de mamíferos,condiciones climáticas adversas persistentes durante lapreñez desencadenan una respuesta de estrés extremacual es el aborto espontáneo.

Cuando son irreversibles, las consecuencias del estréspara un organismo pueden ser de mediano o de largoplazo. Los efectos de mediano plazo son cambios per-manentes en la vida de un organismo, mientras que losde largo plazo son cambios genéticos que trascienden alorganismo. Si bien el efecto potencial inmediato del es-tresor es siempre negativo, las consecuencias a medianoy largo plazo pueden ser neutras e inclusive positivas obeneficiosas. Esto se debe a que el organismo o la po-blación responde al estresor y esta respuesta puede neu-tralizar el efecto del estrés o inclusive mejorar el estadodel individuo o población. En otras palabras, es muy im-portante diferenciar entre el efecto del estresor y elefecto de las respuestas que provoca el estresor, es decirlas consecuencias de la respuesta de estrés.

Todas las consecuencias descriptas hasta ahora enesta sección afectan a organismos individuales. Cuandoel efecto es supra-individual, se habla de consecuenciasecológicas del estrés. Los estresores pueden afectar amuchos organismos simultáneamente, lo que trae con-secuencias en las interacciones dentro y entre pobla-ciones. Como ya hemos visto, el estrés afecta la dinámicade las interacciones competitivas intra- e inter-específi-cas y las relaciones tróficas dentro de los ecosistemas.

¿Es la respuesta de estrés inespecífica y es elestresor impredecible?

La noción de especificidad del estrés ha ido cam-biando a lo largo del tiempo. La definición original in-



cluía esta noción. Para Selye, el estrés era inespecífico,en el sentido que la misma respuesta se evoca para unadiversidad de estresores. Esta característica permiteexcluir de la definición de estrés a muchas respuestasadaptativas que sí son específicas. A medida que la de-finición de estrés se fue relajando, lo mismo ocurriócon su especificidad. En las definiciones más modernasde estrés, no se hace referencia al grado de especifici-dad de la respuesta. Implícitamente se incluyen lasrespuesta específicas e inclusive se hace innecesaria laexistencia de respuesta para que se considere estrés,como fue descripto antes.

Si se analiza el concepto de estrés con una miradaevolutiva, se puede deducir que toda respuesta de es-trés debería ser inespecífica, y que el estresor debe serimpredecible.

Existe una relación entre especificidad de la res-puesta y predictibilidad del estresor, determinada porla manera en que opera la selección natural. La se-lección natural tiende a generar rasgos biológicos (di-seños) que son eficientes bajo las condiciones natura-les en que estos evolucionan (38). Esta es la nociónbásica de adaptación. Cuanto más estables son las con-diciones ambientales, más específicos son los diseñosproducidos por la selección natural. En otras palabras,cuando hay un cambio en el ambiente, la selección di-reccional (positiva) tiende a producir un carácteradaptativo que luego es mantenido por selección esta-bilizadora (negativa) (39). Cuando un estresor am-biental se puede predecir, entonces la selección natu-ral inevitablemente se orientará a generar respuestasespecíficas. Podríamos decir que existe entonces unrango de adaptaciones especie-específicas que estándiseñadas para responder a cambios negativos pre-decibles del ambiente. Los ritmos biológicos proba-blemente sean el mejor ejemplo. Estas respuestas es-pecíficas han sido tradicionalmente consideradasfuera de la órbita del estrés, pero las definiciones másrecientes y relajadas de estrés pueden incluirlas. Laimportancia de la predictibilidad del estresor ha sidoenfatizada repetidamente en la literatura (v.g.: 1). Lascondiciones adversas pero predecibles del ambiente,como las reducciones estacionales en la temperaturao la oferta de alimento puede afectar negativamente elbalance energético pero no actúan en sí mismos comoestresores. Este tipo de condiciones pueden ser partedel componente del estrés: ‘contexto del estresor’ ypor lo tanto puede hacer al organismo más susceptibleal estrés real, per no pueden ser descriptos como es-tresantes en sí mismos.

Las definiciones modernas más relajadas del estrésque no incluyen la existencia obligatoria de una res-puesta de estrés, tienen el problema que confundendos contextos evolutivos diferentes: una situación am-biental estable en la que existentes estímulos impre-decibles y una situación inestable en la que aparecen

variables negativas nuevas en el ambiente. Ejemplos deesto serían el ataque de predadores y la contaminaciónde origen antropogénico, respectivamente. En la sec-ción siguiente mostraremos cómo una definición de-masiado amplia de estrés lleva a confusión respecto alas consecuencias evolutivas del estrés.

¿Cuáles son las consecuencias evolutivas delestrés?

Existe un concepto generalizado que establece quelas condiciones estresantes pueden actuar como fuer-zas evolutivas que fuerzan a las poblaciones a respon-der adaptativamente (32). En otras palabras, que la dis-minución en el fitness provocada por el estrés afecta latasa de selección. Este concepto está muy difundidopero debe ser reflexionado. La validez de esta afirma-ción depende de la propia definición de estrés y solose cumple cuando se considera estrés a cualquier efectonegativo de un estresor. Diferente es cuando se consi-dera que hay estrés sólo cuando los organismos exhi-ben una respuesta adaptativa a estímulo impredeci-bles.

Cuando el ambiente es estable pero con cambiosimpredecibles dentro de un rango de posibles condi-ciones, entonces se espera que se favorezcan meca-nismos inespecíficos de respuesta a esas condicionesque varían al azar. Bajo estas condiciones las condi-ciones estresantes no provocarán ningún cambio adap-tativo. Cuando el ambiente sufrió un cambio perma-nente estable recientemente y los organismos todavíano están adaptados, entonces los estímulos negativosseguramente van afectar la tasa de selección y las po-blaciones van a tender a responder adaptativamente alcambio.

Agrawal & Whitlock (27) revisaron la informaciónempírica alrededor de la idea que el estrés afecta lafuerza de la selección sobre nuevas mutaciones. Estosautores encontraron que diferentes tipos de estrés afec-tan la selección en forma diferente y concluyeron queesta idea que el estrés típicamente incrementa la se-lección, debe ser rechazada. Sin embargo, no pudieronencontrar un explicación clara acerca de los mecanis-mos subyacentes a esta variabilidad. Es probable que losdiferentes resultados observados en este estudio esténrelacionados con diferentes contextos evolutivos deestrés. Si las condiciones en las que se evaluó el estrésson estables y existían respuestas adaptativas previas, nose espera que haya un cambio en la tasa de mutaciones,porque la presencia de un estímulo negativo no espre-condición obligatoria para un cambio evolutivo. Sipor el contrario, los organismos fueron expuestos a es-tresores nuevos para los que no existe una respuesta deestrés previa, se establecen condiciones para que operela selección natural.


IBYME 713

Conclusiones

En este trabajo se han analizado dos categorías de de-finiciones de estrés. Las más amplias y modernas que de-finen al estrés en función del efecto negativo de los es-tresores y las más restrictivas y antiguas que relacionanel estrés con la respuesta positiva de los organismos aesos estresores.

Las definiciones generalistas del estrés presentan di-versas vaguedades: (1) puede o no haber respuesta deestrés, (2) la respuesta de estrés puede ser inespecíficao específica, (3) el estresor puede ser predecible o im-predecible, (4) el efecto del estrés puede o no ser le-tal o benigno, y (5) el estrés puede o no tener efectossobre la tasa de selección natural. En síntesis, la defi-nición amplia del estrés incluye todas las condicionesadversas del ambiente y las respuestas individuales,poblacionales y ecosistémicas, de corto y largo plazo,a esas condiciones. Otra característica de la noción ge-neralista de estrés es que tiene una connotación ne-gativa, ya que enfatiza el efecto directo del estresorque, como hemos visto, siempre es negativo. Desde unpunto de vista fisiológico, esta visión negativa del estrésestá entroncada con la idea de homeostasis, que a suvez se asocia con la idea de un equilibrio estático (29).Desde un punto de vista evolutivo, esta visión con-fiere al estrés un rol fundamental en el proceso evo-lutivo forzando a las poblaciones a responder adapta-tivamente.

La definición más restrictiva del estrés incluye laexistencia de una respuesta de estrés y está respuesta esinespecífica y adaptativa. El estresor es impredecible ycon un efecto entre lo letal y lo benigno. A niveles ba-jos de acción del estrés, la respuesta de estrés amorti-gua los efectos negativos o tiene un impacto solo sobreel balance de costos-beneficios, con un efecto débil so-bre el fitness. A niveles altos del estímulo, la respuestade estrés se vuelve ineficiente, por lo que hay un efectosobre la funcionalidad y/o directamente sobre el fit-ness. Este efecto no impacta sobre la tasa de selección.Esta definición de estrés circunscribe al estrés a unrango de efectos de estresores y mecanismos fisiológi-cos concretos. Esta visión parcialmente positiva del es-trés se acerca a una aproximación a los sistemas fisio-lógicos de equilibrio dinámicos y retroalimentaciónpositivas.

En síntesis, hay dos definiciones diferentes del es-trés. Enfatizando componentes distintos, difieren en as-pectos substanciales en la concepción del funciona-miento de los sistemas fisiológicos y del rol del estrés enlos procesos evolutivos. Mientras persistan estas dosconcepciones básicamente diferentes, el uso del tér-mino estrés seguirá siendo confuso y convendría ser re-emplazado por términos que describan mejor el fenó-meno que se investiga. Nuestra opinión es queconviene restringir la noción de estrés al proceso que

incluye la interacción entre un factor ambiental ad-verso impredecible (en cierto grado) y un mecanismoindividual de respuesta inespecífica (en cierto grado).Los efectos predecibles deberían quedar enmarcadosdentro del contexto del estrés, y las respuestas pobla-cionales y de niveles superiores, dentro de las conse-cuencias ecológicas de la respuesta de estrés. Este cri-terio permite acomodar fácilmente cada fenómenoque involucra el impacto de una factor ambiental ne-gativo dentro o fuera de la órbita del estrés. Solo un parde ejemplos para ilustrar los beneficios de esta defini-ción. ¿Los cambios genéticos pueden ser considera-dos respuestas de estrés? De acuerdo a nuestra defini-ción, depende del tipo de proceso genético: laadquisición de resistencia a antibióticos por una bac-teria a través de mecanismos de transferencia hori-zontal de genes entra dentro de la órbita del estrés, yaque es una respuesta relativamente inespecífica a uncambio impredecible del ambiente que opera a nivelde un individuo. Por el contrario, la resistencia a in-secticidas producto exclusivamente de cambios en lasfrecuencias génicas dentro de una población de insec-tos no se corresponde con esta definición de estrés por-que no es una respuesta individual. ¿Es la parición (elparto en humanos) una situación de estrés? Si bien laparición, como la gestación y el amamantamiento soncostosas para la hembra, no pueden considerarse estrésya que son estados predecibles. Sí pueden predisponera la hembra a ser más susceptible al estrés y por ello es-tas etapas de la reproducción pueden ser incluidasdentro del contexto del estresor.

A modo de corolario, vale la pena volver a enfatizarque el análisis realizado en este trabajo también per-mitió confirmar que el concepto de estrés es funda-mental por dos motivos. Primero, porque liga la eco-logía con la fisiología y segundo, porque enfatiza lanoción de alostasis sobre la de homeostasis. Estas ca-racterísticas le otorgan un grado de universalidad al es-trés que pocos conceptos poseen en biología. Hemoscitado una pequeñísima parte de la bibliografía dispo-nible sobre estrés y hemos dado solo algunos ejemplosde casos de estrés de la gran cantidad de ellos que hayen la literatura. Pero el objetivo de este trabajo no fueel de realizar una revisión completa sino de navegar através de la diversidad de usos y aplicaciones del con-cepto con la esperanza de arribar a una conclusión res-pecto al mejor destino que se le puede dar al uso delconcepto de estrés.

AGRADECIMIENTOSAgradecemos a la Lic. Claudia Marro por sus aportes en la dis-cusión de conceptos analizados en este trabajo. Los autores deeste trabajo son investigadores del CONICET. Este trabajo fue fi-nanciado con subsidios del CONICET (PIP Nº 11420090100367)y el MINCYT RES Nº383/10.




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IBYME 715

LABORATORIO DE BIOLOGIA DEL COM-PORTAMIENTO

Modelo experimental de lesión medular sacraen ratas: correlatos clínicos yelectrofisiológicos del segmento metaméricoafectado

Experimental model of spinal lesion in rats:clinical and electrophysiological correlates inthe metameric affected segment.

Modelo experimental de lesão medular sacraem camundongos: correlatos clínico eeletrofisiológicos do segmento metaméricoafetado.

Francisco Mannará1,2, Enrique Segura1, Silvina Figu-relli2, Héctor Coirini1, Alberto Yorio1,2

1. Hospital de Agudos Juan A. Fernández (GCABA).2. Instituto de Biología y Medicina Experimental (CONICET).

Resumen

La lesión experimental de la médula espinal a nivel sacro enla rata produce un modelo animal con baja morbilidad res-pecto a los investigados con lesiones de la médula espinala nivel torácico. La descripción y cuantificación de la es-pasticidad clínica en la cola de la rata causada por la lesiónde la médula espinal sacra es escasa en la bibliografía. Porotro lado, no hay investigaciones acerca de las correlacionesentre el grado de espasticidad en la cola de rata y paráme-tros electrofisiológicos, por lo que nuestro objetivo es estudiarla espasticidad de la cola con estudios clínicos y electro-miográficos. Se realizaron cirugías espinales experimentalesen 10 ratas Sprague Dawley. El nivel sacro fue elegido paraproducir la espasticidad sólo en la cola. En el tiempo posto-peratorio se evaluó la cola buscando signos de espasticidad,como paresia e hipertonía, y el grado de espasticidad se ca-tegorizó utilizando una escala cuantitativa del tono muscular.Además, se realizaron estudios de electromiografía para ob-tener respuesta de los músculos de la cola por estimulacióndel nervio caudal (ondas M y F). Luego, los animales fueronsacrificados y perfundidos. Las lesiones de médula espinalfueron verificadas con histopatología. Todos los animales conlesión medular presentaron paresia de la cola. Los signos deespasticidad se iniciaron en la segunda semana del estudio.En relanción con la escala de tono muscular cinco ratas pre-sentaron espasticidad de grado 2, tres ratas espasticidad degrado 4, y sólo una espasticidad de grado 3. La electrofi-siología mostró patrones de respuesta en relación con la evo-

lución clínica y el grado de espasticidad. Los resultados ob-tenidos muestran la correspondencia entre el grado de es-pasticidad y los patrones electrofisiológicos causado por elgrado de excitabilidad de las motoneuronas del segmento es-pinal afectado. Este modelo experimental que permite haceruna evaluación clínica y de la correspondencia con la elec-trofisiología con la menor morbilidad general provocada porla lesión de médula espinal.

Palabras clave: lesión espinal * espasticidad * electromio-

grafía

Summary

The experimental sacral spine lesion in the rat produce ananimal model with low morbidity than those with toracicspinal lesions. The clinical spasticity quantification in the tailof the rat caused by sacral cord lesion was poorly describedin the bibliography. Furthermore, there are no investigationsabout the relantionship between electrophysyological pa-rameters and the grade of spasticity in the rat tail, so our pur-pose is to evaluate tail spasticity with clinical and elec-tromyographic studies. Experimental spinal surgeries weredone in 10 Sprague Dawley rats. Sacral level was choosento produce spasticity only in the tail. On the postoperatorytime the tail was evaluated searching signs of spasticity, suchas paresia and hypertonia, and then the grade of spasticitywas categorizated using a muscular tone quantitative scale.On the other hand, electromyographic studies were done toobtain the muscular responses of the tail to the caudalnerve stimulation (M, F and waves). Then, the specimenswere sacrificed and perfunded. Spinal cord lesions were ver-ified with hystopathology. All the animals with spinal lesionpresented paresia of the tail. The spasticity signs began atthe second postoperative week. In relantionship with themuscular tone scale five rats presented grade 2 spasticity,three rats grade 4 spasticity, and only one grade 3 spastic-ity. The electrophysiology showed patterns of response in re-lation with the clinical evolution and the grade of spasticity.The results obtained showed correspondence between thegrade of spasticity and the electrophysiological patternscaused by the grade of the motoneuron excitability. This ex-perimental model allows to make a clinical evaluation andthe correspondence with the electrophysiology, with thelowest general morbidity.

Key words: spinal injury * spasticity * electromyography

Resumo

A lesão experimental da medula espinhal a nível sacro no ca-mundongo produz um modelo animal com baixa morbilidadea respeito dos pesquisadores com lesões da medula espinhala nível torácico. A descrição e quantificação da espasticidadeclínica na cauda do rato causada pela lesão da medula es-pinhal sacra é escassa na bibliografia. Por outro lado, não hápesquisas acerca das correlações entre o grau de espastici-dade na cauda do rato e parâmetros eletrofisiológicos, por-tanto o nosso objetivo é estudar a espasticidade da caudacom estudos clínicos e eletromiográficos. Foram realizadas



cirurgias espinhais experimentais em 10 ratos Sprague Daw-ley. O nível sacro foi escolhido para produzir a espasticidadesó no rabo. No tempo pós-operatório foi avaliado o rabo naprocura de sinais de espasticidade, como paresia e hiperto-nia, e o grau de espasticidade se categorizou utilizandouma escala quantitativa do tom muscular. Além disso, foramrealizados estudos de eletromiografia para obter resposta dosmúsculos da cauda por estimulação do nervo caudal (ondasM e F). Depois, os animais foram sacrificados e perfundidos.As lesões de medula espinhal foram verificadas com histo-patologia. Todos os animais com lesão medular apresenta-ram paresia da cauda. Os sinais de espasticidade foram ini-ciados na segunda semana do estudo. Em relação à escalade tom muscular cinco ratos apresentaram espasticidade degrau 2, três ratos espasticidade de grau 4, e só um espasti-cidade de grau 3. A eletrofisiologia mostrou padrões de res-posta com relação à evolução clínica e o grau de espastici-dade. Os resultados obtidos mostram a correspondênciaentre o grau de espasticidade e os padrões eletrofisiológicoscausado pelo grau de excitabilidade dos motoneurônios dosegmento espinhal afetado. Este modelo experimental per-mite fazer uma avaliação clínica e da correspondência coma eletrofisiologia com a menor morbilidade geral provocadapela lesão de medula espinhal.

Palavras chave: lesão espinhal * espasticidade * eletromio-

grafia

Introducción

Las alteraciones clínicas y fisiopatológicas provocadaspor lesión traumática de la médula espinal son el re-sultado no sólo de la lesión primaria propiamente di-cha, sino también de la conjunción de factores infla-matorios, necrosis hemorrágica progresiva, destrucciónneuronal, proliferación glial y trastorno vascular, co-nocidas como lesiones secundarias y terciarias (1). Losmodelos animales experimentales de lesión medularconstituyen una herramienta útil para la investigaciónde los mecanismos fisiopatológicos involucrados y losposibles procedimientos terapéuticos. En la bibliografíase describen los efectos clínicos de la lesión medular ex-perimental en ratas así como también hallazgos elec-trofisiológicos observados en los niveles afectados. Sinembargo, las descripciones se refieren generalmente alos efectos producidos por lesiones en el nivel torácicode la médula espinal y es infrecuente el estudio de lascorrelaciones entre los hallazgos clínicos y los electro-fisiológicos (2)(3).

En este estudio se utiliza un modelo experimental delesión espinal en la rata albina Sprague Dawley a niveldel segmento medular sacro, porque en este modelo sepuede observar los efectos clínicos de la lesión espinala nivel de la cola del animal con menor morbilidad, yaque se evita el compromiso esfinteriano y de la loco-moción. El objetivos es el de correlacionar los efectosclínicos y electrofisiológicos de la lesión medular.

Materiales y Métodos

Se utilizaron 14 ratas macho Sprague-Dawley (250-300 gramos), procedentes del bioterio del Instituto deBiología y Medicina Experimental (IBYME, CONICET).La lesión medular se realizó en 10 animales; las restan-tes correspondieron al grupo control: 1 rata con lesiónfalsa y 3 ratas sin lesión.

Procedimientos quirúrgicos

Las cirugías se realizaron con anestesia profundacon mezcla de ketamina (80 mg/kg, i.p.) y xylazina(10 mg/kg, i.p), manteniendo la temperatura corporala 37 oC. El control del sangrado se efectuó con Gelfoam.En distintos animales se utilizaron dos procedimientos:a) Lesión falsa, en la se efectuó sección de tejidos blan-dos, laminectomía posterior sin apertura de la dura-madre y sutura. b) Lesión de médula espinal (LME), uti-lizando microscopio quirúrgico, laminectomía posterioren nivel L1-2 (correspondiente a la metámera S1 de lamédula espinal), apertura de la duramadre y transec-ción de médula espinal con tijera de iridectomía, conposterior sutura de duramadre y tejidos blandos.

Estudios clínicos

El estado general y el tono muscular y la motilidad ac-tiva de la rata se examinaron en forma diaria. Se evaluóparticularmente el segmento de la cola por medio de lainspección, la motilidad pasiva y la respuesta a estímu-los táctiles. Para cuantificar el grado de compromiso deltono muscular de la cola se utilizó una escala diseñadapor los investigadores (Tabla I).

Tabla I. Grados de alteración del tono muscular, en categorías según signos clínicos observados en el examen físico de la cola.

Grado Categoría Signos clínicos

0 Cola atónica Flexibilidad marcada y escasa resistencia la movilización pasiva.

1 Cola tónica normal Flexibilidad habitual y resistencia perceptible a movilización pasiva.

2 Cola hipertónica Actitud rectificada esporádica ysin espasmos resistencia marcada a la

movilización pasiva.

3 Cola hipertónica Espasmos laterales transitorioscon espasmos (segundos de duración)

espontáneos o por estimulación táctil.

4 Cola hipertónica Cambio permanente de actitud con actitud anómala de la cola (curvada en formapermanente de S).


IBYME 717

Estudios electrofisiológicos

Los registros se realizaron bajo anestesia ligera conketamina (60 mg/kg), a la 1ª, 2ª, 3ª y 4ª semana de re-alizada la LME. En músculo de la cola mediante elec-trodo coaxial se registraron los potenciales compuestosde acción muscular provocados por estimulación conelectrodos subcutáneos del nervio caudal. Se detectaronuna onda de corta latencia (respuesta M) y una onda delatencia tardía (respuesta F). Se midieron latencia enmilisegundos y amplitud en milivolts de ambas ondas.La estimulación del nervio caudal se efectuó a 1, 2, 4 y8 hertz a fin de evaluar los efectos de la estimulación re-petitiva sobre la excitabilidad del segmento de médulaespinal sacro. Se computaron las amplitudes porcen-tuales de la respuesta H respecto a la amplitud máximaobtenida a frecuencias de estimulación de 0.25 hertz. Seconfeccionaron curvas de amplitud porcentual en fun-ción de la frecuencia de estimulación.

Estudios histológicos

Los animales fueron sacrificados en forma incruentaen la cuarta semana posterior al inicio de las evalua-ciones. La médula espinal fue removida y el segmentomedular caudal a S1, disecado y fijado en formol al 10%durante 48 horas. Posteriormente se analizaron los re-sultados obtenidos para determinar el grado de lesiónen los diferentes niveles de la médula espinal sacra,tanto proximales como distales al sitio de sección.

Resultados

Las 10 ratas con LME (100%) presentaron hipotoníay parálisis total de la cola inmediatamente distal a la le-sión medular. La duración de la fase aguda o de hipo-tonía fue variable, entre 1 y 4 días después de la lesión.Además, en 3 ratas se observó una leve paresia en al-guna de las extremidades posteriores, transitoria, conrecuperación ad-integrum luego de la primera semanaposoperatoria. Los hallazgos clínicos a nivel de la colafueron marcadamente distintos de acuerdo al tiempotranscurrido posterior a la cirugía, por lo que se consi-deraron dos etapas desde el punto de vista clínico: laetapa aguda, correspondiente a la primera semana pos-quirúrgica, y la etapa crónica, correspondiente a la evo-lución a partir de la segunda semana posquirúrgica. Lasexploraciones electrofisiológicas realizadas durante lafase aguda de la lesión medular permitieron observarque las respuestas electromiográficas de la cola a la es-timulación del nervio caudal fueron en general res-puestas M y F de incidencia, configuración y amplitudvariables, con predominio de la disminución de las am-plitudes. Una de las ratas con LME falleció dentro de laprimera semana posquirúrgica.

Como se consignó previamente, luego de la segundasemana postoperatoria se manifestaron signos claros deincremento del tono muscular de la cola. De acuerdocon la escala de espasticidad utilizada, 5 ratas (55%) pre-sentaron espasticidad grado 2, una (11%) grado 3 y lasotras 3 restantes (33%) espasticidad grado 4. Los regis-tros electrofisiológicos realizados en la fase crónicamostraron que los parámetros de la respuesta M fueronconstantes. A diferencia de lo observado en los anima-les del grupo control, las curvas de amplitud porcentualrespecto a la frecuencia de estimulación fueron menospronunciadas en los animales con LME, por menor va-riación en la amplitud de la respuesta F. En las ratas conmayor grado de espasticidad (grados 3 y 4) las res-puestas F prácticamente no presentaron variaciones deamplitud a las distintas frecuencias de estimulación.

La histología permitió corroborar la existencia desección completa medular a nivel de S1 y varias anor-malidades histológicas en los segmentos adyacentes a lazona lesionada: degeneración neuronal (vacuolizacióndel neuropilo), y astrogliosis.

Discusión y Conclusiones

La lesión medular experimental en ratas se asocia acambios clínicos y electrofisiológicos distintos según eltiempo transcurrido desde la lesión. En la primera se-mana posterior a la lesión existe un cuadro de parálisisfláccida, hipotonía y arreflexia de la cola, que se asocia auna disminución de las respuestas electromiográficasrespecto a los animales controles. Luego de la segundasemana se pueden observar signos clínicos de hipertoníaen los músculos de la cola de las ratas lesionadas y cam-bios correlativos en las respuestas electromiográficas a laestimulación. Estos resultados son coincidentes con lo re-portado por otros autores, que describen parálisis mus-cular e hipotonía de la cola en el período temprano pos-terior a la lesión medular, asociadas a la ausencia ovariabilidad de las respuestas electromiográficas, e hi-pertonía de la cola en relación a salvas de actividad elec-tromiográfica en los períodos posteriores (4).

Nuestros resultados también concuerdan con los deotros investigadores respecto a la posibilidad de evaluaren un modelo animal de lesión medular el grado detono muscular del segmento corporal afectado porLME en forma cuantitativa por medio de una escala deespasticidad (5). En la bibliografía también se men-ciona que hay diferencias en la respuesta electromio-gráfica tardía de los animales con lesión medular respectoa los controles; esto se atribuye a un aumento de la exci-tabilidad de las motoneuronas, resultante de la secciónde las vías descendentes en la médula espinal (11)(12).A diferencia de estos trabajos, que estudian la onda elec-tromiográfica tardía en la pata trasera en modelos de le-sión medular en niveles más altos (6)(11)(13-16), nuestros



resultados muestran efectos de la onda electromiográ-fica tardía en la cola del animal en un modelo de lesiónmedular sacra. Estos resultados sugieren la validez delmodelo experimental propuesto, con menor morbi-mortidad e invasión sobre la integridad física y com-portamental del los animales.

Desde el punto de vista fisiopatológico, se consideraque ambas fases clínicas (hipotonía y espasticidad), sonel resultado de alteraciones del balance entre los me-canismos inhibitorios y excitatorios que normalmenteactúan sobre las motoneuronas. En la fase aguda existeun evidente defecto de los mecanismos excitatorios so-bre las motoneuronas ubicadas en el segmento medu-lar distal a la lesión. En la fase crónica, la recuperaciónde los mecanismos excitatorios se expresa mediante lareaparición y aumento de la reactividad neuromuscular.Además, la lesión medular interrumpe las influencias in-hibitorias que provienen del tronco cerebral proyec-tándose a través de los fascículos laterales de la médulaespinal. De esta manera, los aminoácidos monoami-nérgicos no llegan a ejercer su influencia moduladorasobre las interneuronas y motoneuronas espinales. Enestas condiciones, la desinhibición medular resulta enun aumento de la excitabilidad de las motoneuronas,que se presenta como un incremento de la descarga delos potenciales de acción de las fibras musculares en res-puesta a la estimulación.


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IBYME 719

relato histórico del instituto de biología y medicina...

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