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Regulación transcripcional de la glicógeno fosforilasa hepática. PYGL
Problemática.
En una búsqueda en PubMed no es posible encontrar referencias sobre estudios de su regulación transcripcional
Sin embargo, hay diferentes estudios que tratan de explicar algunas variaciones-enfermedades metabólicas mediante la regulación transcripcional de PYGL
Regulación transcripcional de la glicógeno fosforilasa hepática. PYGL
–En todos los estudios existentes se asume el modelo clásico: la concentración del enzima es constante – su actividad depende la concentración de forma activa mediante:
•regulación alostérica (glucosa, ATP…)•metabolitos inductores (glucagón, epinefrina, etc.)
• Mediante chips de expresión genica (Affymetrix RG U34A GeneChip) se aborda la influencia de la alimentación, la dieta, y otros factores extrahepáticos en el transcriptoma hepático en ratas, dentro de un estudio de toxicidad de fármacos.
Influencia de los ritmos circadianos y el ayuno sobre la expresión genética de la glicógeno fosforilasa
Tres grupos de tratamiento.•6 horas de tratamiento. La alimentación se retira a las 8:00, y la necropsia se realiza a las 14:00 (6 horas de ayuno)
•24 horas y 5 días de tratamiento. La alimentación se retira a las 15:00 del día anterior a la necropsia, que se realiza a las 8:00 (17 horas de ayuno)
• Un primer análisis de los datos de expresión mediante PCA (Análisis de componentes principales) muestra diferencias en la expresión génica entre los grupos de 6 y 17 horas de ayuno.
Influencia de los ritmos circadianos y el ayuno sobre la expresión genética de la glicógeno fosforilasa
6 ho
ras
17 h
oras
Influencia de los ritmos circadianos y el ayuno sobre la expresión genética de la glicógeno fosforilasa
Efectos en el metabolismo de Glucógeno
Expresión deEnzima de
Síntesis
Glucógeno
Se inhibe la expresiónde PYGL
La histología con 6 horas de ayuno muestras que el hígado contiene Glucógeno. Mientras que a 17 todo el glucógeno almacenado se ha consumido.
Los datos de expresión del microarray indican:
1. la expresión de la enzima de catabolismo de Glucógeno. PYGL se inhibe con el ayuno
2. Con el ayuno aumenta la expresión de la enzima de síntesis. GYS2
Influencia de los ritmos circadianos y el ayuno sobre la expresión genética de la glicógeno fosforilasa
Otros efectos a considerar – metabolismo de carbohidratos
En ausencia de glucógeno hay una clara evidencia de descenso de la glicólisis:
1. Se inhibe la expresión de Piruvato kinasa. PKLR
2. Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa. GAPDH
No hay evidencia de gluconeogénesis. La enzima de la ruta alternativa (pentosas). Transcetolasa . TKT también esta inhibida.
En los animales con 17h de ayuno la mayor fuente de energía no es la glucosa …. ¿ácidos grasos y cetonas?
Influencia de los ritmos circadianos y el ayuno sobre la expresión genética de la glicógeno fosforilasa
Otros efectos a considerar – metabolismo de lípidos
Se incrementa la expresión de los genes de metabolismo de lípidos.
• CPT1 (carnitina palmitoiltransferasa I) media el transporte de ácidos grasos de cadena larga a través de la membrana
• ACAA1 (acetyl-Coenzyme A acyltransferase 1) Beta oxidación de ácidos grasos
Disminuye la expresión de los genes de almacenamiento de lípidos. FASN (Fatty acid syntase)
Influencia de los ritmos circadianos y el ayuno sobre la expresión genética de la glicógeno fosforilasa
Los genes hepáticos que controlan los ritmos circadianos tienen diferentes patrones de expresión
El receptor nuclear ARNTL heterodimeriza con la proteína expresada por CLOCK y tiene una retroalimentación negativa en la expresión de PER2.
La importancia toxicológica es que 1. hay diferencias significativa entre las ratas
sacrificadas a las 8:00 AM y a las 2:00 PM >> ¡¡ ojo con los ciclos al realizar ensayos de expresión ¡¡
2. sobre el 10% de los genes hepáticos (y con influencia en el metabolismo de xenobioticos ) tienen patrones circadianos en su expresión.
El receptor nuclear translocador de aril hidrocarburos, también conocido como ARNTL, Bmal1 o Mop3 es una proteína transmembranal codificada por un gen asociado a la susceptibilidad a padecer hipertensión y diabetes tipo 2.)
Influencia de los ritmos circadianos y el ayuno sobre la expresión genética de la glicógeno fosforilasa
Los patrones de expresión de microarrays se pueden enriquecer mediante “redes neuronales”
La red neuronal relaciona las interacciones conocidas (“knowledge database”) con los patrones de expresión obtenidos mediante los microarrays.
Los genes con expresión diferencial “significativa” entre los grupos (6 horas-17 horas) en negro.
Los controladores centrales de la red son: PPARG (factor de trascripción) y PER2 ( según Doi, 2010. PPARG no regula GYS2, CLOCK si). SBREP parece ser un controlador de la red.
Algunos de los factores de transcripción que muestran expresión diferencial “pueden”intervenir en la regulación del metabolismo del glucógeno
Dentro de la red se diferencian dos subredes: Una formada por genes circadianos y otra por genes del metabolismo hepático
Influencia de los ritmos circadianos y el ayuno sobre la expresión genética de la glicógeno fosforilasa
Bmal1 . Puede estar relacionada con PYGLOtros estudios con ratones Knock-out Bmal1. Demuestran la
importancia en la regulación del metabolismo glucógeno
El gen Clock (de sus siglas en inglés "Circadian Locomotor Output Cycles Kaput") codifica una proteína implicada en la regulación de los ritmos circadianos. La proteína CLOCK parece afectar tanto la persistencia como la duración de los ciclos circadianos.
El complejo BMAL1-CLOCK también regula los genes del criptocromo(como Cry1 y Cry2) y los genes Period (como Per1, Per2 y Per3) en mamíferos. Responsables de los ritmos circadianos.
El complejo BMAL1-CLOCK es a su vez regulado por la expresión de los genes Per y Cry.
Influencia de los ritmos circadianos en PYGLEfecto de los knock-out Bmal1
1. Los ratones “wild type” tienen las oscilaciones circadianas del SNC y del hígado en fase con la alimentación y los ciclos insulina-glucagón.
2. Los ratones Bmal1 -/- con el gen silenciado en hígado pierden la sincronía con el SNC dando lugar a estados transitorios de hipo-glicemia
3. Al desactivar Bmal1 en todos los órganos los ratones pierden los ritmos circadianos.
1. Los niveles de enzimas del metabolismo de glucógeno son bajos pero suficientes para mantener los niveles de glucosa (muy) estables.
2. Tienen intolerancia a la glucosa e 3. hiper sensibilidad a insulina
GYS2 está regulada por CLOCK
Los ratones KO – CLOCK tienen una baja expresión de GYS
insulina
glucagón
Los ratones KO – CLOCK tienen el ritmo del glucagón desreglado
¿Puede SBREP1-c regular la transcripción de la glucógeno fosforilasa hepática?. PYGL
Usando una combinación de genética / genómica (micoarrays) y bioinformática identifican un gran número de genes expresados diferencialmente entre los sujetos de ascendencia africana(AA) o europea (CA).
• Los genes en cuestión también contienen SNPs que distinguen a las poblaciones ancestrales.
• Varios de estos genes controlan el metabolismo de los hidratos de carbono son blancos directos de la SREBP1, (factor de respuesta a esteroles) también se expresa diferencialmente entre las poblaciones AA-CA.
¿Puede SBREP1-c regular la transcripción de la glucógeno fosforilasa hepática?. PYGL
1. Mediante SAM (Significance analysis ofmicroarrays ) se filtran 2531 genes expresados diferencialmente entre las poblaciones (verde);
2. El conjunto de genes de 2531 se restringió a los genes que tenían SNPsdepositados dentro del proyecto HapMap, resultando un total de 897 genes (amarillo);
3. Sólo los genes que tienen fold-changemedio de 1,3 se seleccionan : 151 genes geo-ancestrales (morado).
¿De muestras de sangre de puede extrapolar a metabolismo hepático?
Estrategia de identificación de los genes diferencialmente expresados Análisis de microarrays
¿Puede SBREP1-c regular la trascripción de la glucógeno fosforilasa hepática?. PYGL
Expresión tisular de PYGL
vejiga – Sangre??
PYGL se expresa en gran número de tejidos pero principalmente en:
•Vejina•Sangre•.. Y tambien en tejido adiposo(no mostrado)
¿Puede SBREP1-c regular la transcripción de la glucógeno fosforilasa hepática?. PYGL
PYGL está menos expresado en la población AA que en CA
Otros genes del metabolismo de hidratos de carbono diferencialmente expresados: HK2, GPT, PGM1
Los 151 genes identificados se validan por qRT-PCR(PCR cuantitativa)
SREBP1 también estádiferencialmente expresado entre las poblaciones AA-CA
Resultados de expresión diferencial entre las poblaciones
¿Puede SBREP1-c regular la transcripción de la glucógeno fosforilasa hepática?. PYGL
Tratan de encontrar patrones de expresión mediante buscando factores de transcripción comunes en TRANSFARC (no dicen como exactamente)
>>> El elemento de repetición mas significativo corresponde a SBRP1-c
El motivo V$SRBP1_Q6 se encuentra en diversos genes del metabolismo de HC.
Existen evidencias experimentales en los genes: HKII y PGD
¿Puede SBREP1-c regular la transcripción de la glucógeno fosforilasa hepática?. PYGL
Conclusión final del estudio: Las diferencias interétnicas observadas entre las poblaciones AA y CA son debidas a dos tipos de factores
• Diferentes SNPsentre ambas poblaciones.
• Expresión diferencial de algunos factores de trascripción entre los que se encuentra SBREP1-c
¿¿PYGL?? >>no hay evidenciaExperimental¡¡¡
Mecanismo de regulación de SBREP1
Las proteínas de unión al elemento de respuesta a esteroles (SREBPs; Sterol-Regulatory Element Binding Proteins) constituyen
una familia de factores de trascripción que coordinan el metabolismo de lípidos y recientemente de carbohidratos
•Los SREBPs se detectaron por su capacidad de unirse a elementos de respuesta a esteroles “SRE” presentes en los promotores de genes implicados en la síntesis y captación de colesterol.
•La familia SREBP está constituida por tres miembros: SREBP1a, SREBP1c y SREBP2.
•SREBP1a y 1c son productos de un gen común (SREBF1) localizado en el cromosoma 17p11.2.
•La isoforma -1a es mucho más activa transcripcionalmente comparado con la 1c.
Mecanismo de regulación de SBREP1
•En presencia de esteroles, el complejo SCAP-SREBP interacciona con proteínas de la familia INSIG y es retenido en el RE.
•Ante una disminución de los niveles de esteroles, SCAP sufre un cambio conformacional que le libera de su unión con las proteínas INSIG, de forma que SCAP y SREBP migran al complejo de golgi a través de vesículas (recubiertas de proteínas COP-II). Estas vesículas también contienen una serina-proteasainactiva (Site-1 protease; SP1).
•Una vez incorporadas en la membrana de golgi, la proteasa SP1 se activa y corta SREBP en el medio de su bucle hidrófilo intermembrana.
Los factores SREBP son sintetizados como una forma precursora inactiva anclada a la membrana del RE y a la membrana nuclear. Esta forma precursora interacciona a través de su dominio carboxiterminal con la proteína SCAP (SREBP cleavage-activating protein), otra proteína de membrana del RE. En la proteina SCAP las hélices 2-6 constituyen el dominio sensor de esteroles (SSD;sterol-sensing domain).
Mecanismo de regulación de SBREP1
•Este proceso denominado “RIP” (regulatedintermembrane proteolysis) libera la región aminoterminal denominada "forma madura" que en su región bHLH contiene una señal de localización nuclear que interacciona con importina, permitiendo su transporte al núcleo.
•Tras este corte, SP2, una metaloproteasa transmembrana dependiente de zinc,, vuelve a cortar a SREBP en la región intramembrana del lado citoplasmático.
Mecanismo de regulación de SBREP1 •La primera evidencia de la regulación transcripcional de SREBP1c se obtuvo en ensayos de ayuno/ingesta en roedores, demostrando que estos cambios nutricionales regulan la expresión de SREBP1c en hígado, tejido adiposo y músculo.
•La expresión de SREBP1cdisminuye durante el ayuno pero aumenta marcadamente cuando los animales son realimentados con una dieta rica en carbohidratos.
•Posteriores experimentos en adipocitos y en hepatocitos muestran que SREBP1c es inducido por insulina.
•Los efectos de la insulina sobre la trascripción de SREBP1c son opuestos a los que ejerce elglucagón vía cAMP
memb
rana
Form
a
madura
Mecanismo de regulación propuesto de SBREP1
Posiblemente uno de los mecanismos de regulación transcripcional de SREBP1 sobre PYGL sea similar al encontrado para
> FASN (fatty acid syntase) y PKLR (piruvato kinasa)Son valores de expresión, no de actividad
¿TRANSFAC? … tienen validez los resultados de la busqueda?
TRANSFAC es una base de datos de factores de trascripción> Se puede buscar por nombre del gen regulador (SREBP)> o por secuencia etc ….
… se puede enviar una secuencia para que busque elementos reguladores (con diferentes opciones de busqueda)
TRANSFAC …. … tienen validez los resultados de la busqueda?
1.- Descargar la secuencia … el trozo en donde queramos buscar el promotor…..2.- Elegir búsqueda con BLASTX (nucleotidos)
Buscar elementos reguladores en una secuencia …
c-Rel esta relacionado con la respuesta inmunitaria, Pax y Gx2 con el desarrollo embrionario, RXR es el receptor del acido retinoico
TRANSFAC …. … tienen validez los resultados de la busqueda?
Buscar elementos reguladores en una secuencia … ahora de PYGL
3.- Elegimos simple búsqueda con BLAST
La búsqueda simple con BLASTX no es significativa ¡¡¡¡… solo da una idea
TRANSFAC …. Como se hace?
Buscar elementos reguladores en la secuencia de PYGL3.- Elegimos búsqueda con AliBaba … Buscando únicamente motivos de la familia 1.3.2.3 >>>Solo hay un sitio y es de un factor similar a SBREP
Conclusiones finales
1. La glucógeno fosforilasa hepática esta principalmente regulada por mecanismos alostericos y metabolitos (metabolismo clásico).
2. Esta expresada de forma abundante en diferentes tejidos (sangre –vejiga - hígado). Hace presuponer que está regulada por diversos factores de transcripción.
3. Su actividad depende de la fosforilación por la fosforilasa quinasa y protein fosfatasa. Por tanto puede estar expresada pero no activa.
4. La regulación transcripcional de PYGL está regulada por factores de transcripción regulados a su vez por ciclos circadianos diferentes a GYS2.
5. Aunque su patrón de expresión se puede explicar mediante SBREP-1c, hasta el momento no hay evidencia experimental de que así sea.
6. Una búsqueda sencilla sobre TRANSFAC no es indicativo de regulación transcripcional
Reference List
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