“Título de la tesis”  

(Tratar de hacerlo comprensible para el público general, sin abreviaturas)

 

 

INSTITUTO POTOSINO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA, A.C.

 

  

POSGRADO EN CIENCIAS AMBIENTALES    

Reducción biológica de As(V) y sulfato en sedimentos de un sistema hidráulico contaminado con arsénico

     

Tesis que presenta  

Erika Elizabeth Ríos Valenciana   

Para obtener el grado de  

Maestría en Ciencias Ambientales        

Directora de la Tesis: Dra. María de Lourdes Berenice Celis García

     

San Luis Potosí, S.L.P., Octubre del 2015

iii 

  

 

 Créditos Institucionales

   

Esta tesis fue elaborada en los Laboratorios de la División de Ciencias Ambientales del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C., bajo la dirección de la Dra. María de Lourdes Berenice Celis García.  Durante la realización del trabajo el autor recibió una beca académica del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT-299514) y del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A. C.  Este trabajo de investigación fue financiado por el proyecto de Ciencia Básica SEP-CONACYT-181809 “Comunidades sulfatorreductoras de ambientes extremos: estructura y función a pH ácido” asignado a la Dra. María de Lourdes Berenice Celis García.

5 

Dedicatorias   

A mis padres por todo su amor y apoyo incondicional.  

  

A mis hermanos, por su paciencia, cariño y compañía. A mis sobrinos, que me

contagian su alegría e inquietud.

 Gracias por estar conmigo en todo momento y formar parte de mi vida. Ustedes

son mi fuerza y motivación para lograr mis propósitos en la vida.

 A mi gatito hermoso, por esos dulces momentos.

6 

Agradecimiento  

  

Agradezco a la Dra. Berenice Celis de manera especial por darme la oportunidad

de trabajar bajo su dirección y desde luego por compartir su conocimiento y

experiencia. A mi comité tutoral la Dra. Nadia Martínez Villegas, Dr. Luis Felipe

Cházaro Ruíz y Dr. Roberto Briones Gallardo les agradezco por su tiempo valioso

y dedicación, por sus aportaciones y sus críticas constructivas. Trabajar con

ustedes fue bastante enriquecedor.

  

Agradezco al IPICYT por la infraestructura y facilidades para realizar mi maestría.

Agradezco a CONACYT por la beca otorgada.

Agradezco a la M. en C. Elizabeth Cortés Cedillo, a la M. en C. Dulce Partida, al  

M. en C. Guillermo Vidriales, al M. en C. Juan Pablo Rodas Ortíz, a la I.Q. María

del Carmen Rocha Medina y a la Dra. Angélica Aguilar Aguilar por su apoyo

técnico y por sus acertadas sugerencias.

  

Gracias a Christian por su apoyo durante toda la maestría y motivación en la

preparación de este documento. Gracias a mis amigos por tantos buenos

momentos compartidos en el transcurso de estos años.

  

Finalmente, y con énfasis, agradezco a toda mi familia, por sus consejos,

sacrificios, disposición para ayudarme y todo el amor que me brindan.

Contenido

Constancia de aprobación de la tesis .................................................................. ii

Créditos Institucionales ........................................................................................ iii

Acta de Examen ..................................................................................................... iv

Dedicatorias ........................................................................................................... v

Índice de tablas ..................................................................................................... x

Índice de figuras .................................................................................................. xii

Índice de Anexos ................................................................................................. xv

Abreviaturas ....................................................................................................... xvi

Glosario .............................................................................................................. xvii

Resumen ........................................................................................................... xviii

Abstract ............................................................................................................... xix

1. Introducción ................................................................................................... 1

2. Marco referencial ............................................................................................ 4

2.1 Incidencia, movilización e impacto del arsénico en el medio ambiente .... 4 2.1.1 Química general ................................................................................ 4 2.1.2 Distribución en el ambiente ............................................................... 4 2.1.3 Fuentes y usos .................................................................................. 5 2.1.4 Legislación ambiental ....................................................................... 5 2.1.5 Toxicidad ........................................................................................... 6 2.1.6 Transformaciones en agua y sedimentos ......................................... 6

2.2 Arsénico, caso de estudio ........................................................................ 7 2.3 Incidencia, movilización e impacto del azufre en el medio ambiente ....... 9 2.4 Procesos microbianos de reducción de As(V) y sulfato ......................... 10

2.4.1 Reducción de arsénico ................................................................... 10 2.4.2 Reducción de sulfato ...................................................................... 14 2.4.3 Bio-mineralización de arsénico ....................................................... 15

2.5 Comunidades bacterianas en sedimentos ............................................. 17 2.6 Rol de la materia orgánica en la movilización de arsénico y azufre en sedimentos ....................................................................................................... 18

3. Justificación, hipótesis y objetivos ............................................................ 20

3.1 Justificación ........................................................................................... 20 3.2 Hipótesis ................................................................................................ 21 3.3 Objetivos ................................................................................................ 22

3.3.1 Objetivo General ............................................................................. 22 3.3.2 Objetivos específicos ...................................................................... 22

4. Materiales y métodos ................................................................................... 23

4.1 Materiales .............................................................................................. 23 4.1.1 Fuente de inóculo ........................................................................... 23

vii

 

4.1.2 Muestreo de sedimentos, agua de poro y columna de agua ........... 23 4.1.3 Reactivos ........................................................................................ 24 4.1.4 Medios de cultivo ............................................................................ 24

4.2 Estrategia experimental .......................................................................... 25 4.3 Métodos ................................................................................................. 27

4.3.1 Caracterización fisicoquímica de sedimentos, agua de poro y columna de agua ........................................................................................... 27 4.3.2 Ensayos en lote .............................................................................. 28

4.3.2.1 Valoración de la actividad sulfato-reductora de los sedimentos ..... 28

4.3.2.2 Valoración de actividad microbiana sulfato-reductora y arseniato- reductora ................................................................................... 28

4.3.3 Recuperación y preparación de precipitados minerales .................. 29 4.3.4 Determinación de As(III) y As(V) ..................................................... 29 4.3.5 Determinación del número más probable ....................................... 31

4.4 Análisis químicos ................................................................................... 32 4.4.1 Cuantificación analítica de elementos en sedimentos y muestras de cultivo 32 4.4.2 Microanálisis morfológico y elemental ............................................. 32 4.4.3 Mineralogía de precipitados biogénicos y sedimento ...................... 32 4.4.4 Cuantificación de la concentración de arsénico total ...................... 33 4.4.5 Cuantificación de la concentración de sulfato, lactato y acetato ..... 33 4.4.6 Cuantificación de carbono orgánico, inorgánico y total ................... 33 4.4.7 Cuantificación del sulfuro por el método Cord-Ruwisch .................. 34 4.4.8 pH ................................................................................................... 34 4.4.9 Potencial óxido-reducción ............................................................... 34 4.4.10 Determinación de sólidos totales, fijos y volátiles ........................... 35 4.4.11 Medición de alcalinidad en columna de agua ................................. 35

4.5 Cálculos ................................................................................................. 36 4.5.1 Balance general de electrones ........................................................ 36

5. Resultados y discusión .............................................................................. 38

5.1 Caracterización fisicoquímica de sedimentos, agua de poro y columna de agua 38 5.2 Evaluación de la capacidad sulfato-reductora de la biota microbiana nativa presente en los sedimentos .................................................................... 45 5.3 Ensayos en lote para evaluar la actividad reductora de sulfato en presencia de As(V) ........................................................................................... 50

5.3.1 Remoción de arsénico disuelto ....................................................... 55 5.4 Velocidades de reducción de sulfato ..................................................... 56 5.5 Procesos biológicos de sulfato/arseniato-reducción .............................. 59

5.5.1 Cinéticas de especiación de arsénico con sedimento Cerrito Blanco 59

5.5.2 Cinética de especiación de arsénico con sedimento Club de Tiro ... 64 5.5.3 Velocidades de reducción de As(V) ................................................ 69 5.5.4 Balance general de electrones ........................................................ 72

5.6 Caracterización de precipitados biogénicos formados en los cultivos en lote ............................................................................................................... 74

 

5.6.1 Mineralogía de precipitados biogénicos ........................................... 80 5.6.2 Análisis de la morfología y la composición elemental ...................... 83

5.7 Caracterización microbiológica de los sedimentos .................................. 86 5.7.1 Estimación del número más probable de bacterias arseniato reductoras. ..................................................................................................... 86 5.7.2 Morfología celular ............................................................................ 88 5.7.3 Comparación del precipitado favorecido por actividad microbiana y el obtenido en la prueba de NMP ....................................................................... 89

6. Conclusiones y perspectivas ...................................................................... 91

6.1 Conclusiones .......................................................................................... 91 6.2 Perspectivas ............................................................................................ 93

7. Referencias bibliográficas ........................................................................... 94

Anexos ............................................................................................................... 105

101

   

Índice de tablas   Tabla 2.1 Reacciones de ionización y valores de pKa del ácido arsénico y el ácido

arsenioso (Cornelis et al., 2005). ..................................................................... 4  Tabla 2.2 Procesos microbianos que influencían la movilización de arsénico

(Huang, 2014b). ............................................................................................. 11  Tabla 2.3 Estequiometría de la reacción de arseniato-reducción tomando como

compuestos orgánicos representativos acetato y lactato (Newman et al., 1997a; Macy et al., 2000; Ohtsuka et al., 2013) ............................................. 13

 Tabla 2.4 Estequiometría de la reacción de sulfato-reducción utilizando como

compuestos orgánicos representativos acetato y lactato (Sánchez-Andrea et al., 2014). ....................................................................................................... 15

 Tabla 4.1. Ensayos en lote para evaluar la actividad microbiana sulfato-reductora

de los sedimentos. ......................................................................................... 26  Tabla 4.2 Componentes de los ensayos en lote para evaluar la reducción 2-

microbiana de SO4 en presencia de As(V). ................................................. 26

Tabla 4.3 Componentes de los ensayos en lote para evaluar la reducción 2- microbiana de SO4 en combinación con la reducción de As(V). ................. 26

Tabla 4.4. Pruebas de especiación de arsénico por cromatografía aniónica. ..... 30

Tabla 5.1 Parámetros fisicoquímicos ensayados en los sedimentos que se usaron como inóculo. Se muestran los valores promedio (a n = 3 y b n=2) y la desviación estándar (±). ....................................................................................................................... 42

Tabla 5.2 Parámetros fisicoquímicos del agua de poro de los sedimentos y de la columna de agua. Se muestran los valores promedio (n=2) y la desviación estándar (±). Únicamente la alcalinidad se determinó in situ ....................................................................................................................... 44

Tabla 5.3 Potenciales redox de los ensayos en lote determinados al final de los experimentos (30 días de incubación) para en sayos inoculados con CB y CT (sección 5.3). ....................................................................................................................... 54

Tabla 5.4 Velocidades máximas de reducción de sulfato de ensayos en lote con muestras de sedimento de Cerrito Blanco y Club de Tiro ....................................................................................................................... 57

111   

Tabla 5.5 Efecto del molibdato en la concentración de sulfato liberado del sedimento Cerrito Blanco a la fase líquida ....................................................................................................................... 62

121

   

Tabla. 5.6 Velocidades máximas de reducción de As(V) y sulfato en ensayos con sedimento CB. ............................................................................................... 70

Tabla. 5.7 Velocidades máximas de reducción de As(V) y sulfato en ensayos con sedimento CT ................................................................................................ 70

 Tabla 5.8. Balance de miliequivalentes de electrones (meqv e-) de ensayos en

lote para evaluar capacidad reductora de sulfato y arseniato en sedimento CB. ....................................................................................................................... 72

 Tabla 5.9. Balance de miliequivalentes de electrones (meqv e-) de ensayos en

lote para evaluar capacidad reductora de sulfato y arseniato en sedimento CT. ....................................................................................................................... 73

xii 

Índice de figuras

Figura 2.1 Modelo biogeoquímico de las transformaciones de arsénico en los sedimentos Cerrito Blanco y Club de Tiro. CH2O: materia orgánica. ......................................................................................................................... 9

Figura 2.2 Representación esquemática del ciclo biogeoquímico del arsénico y su interacción con los procesos microbianos de oxidación de sulfuro y reducción de sulfato y de hierro; (ads)=adsorbido; (pct)=precipitado (Modificado de Reisinger et al., 2005).*Mediado por microorganismos. ....................................................................................................................... 10

Figura 2.3. Esquema representativo de un microorganismo y los diferentes mecanismos de interacción con los compuestos de arsénico (modificado de Huang et al., 2014). ....................................................................................................................... 12

Figura 2.4. Esquema representativo de un microorganismo y los diferentes mecanismos de interacción con los compuestos de azufre (modificado de Rabus et al., 2006). ....................................................................................................................... 14

Figura 2.5 Oxidantes dominantes para la mineralización en sedimentos en relación al potencial redox (tomado de Gorny et al., 2015) ....................................................................................................................... 18

Figura 4.1 Esquema simplificado de la estrategia experimental. ........................ 27

Figura 5.1 Composición mineralógica de los sedimentos: a) Cerrito Blanco, b) Club de Tiro. C: calcita; Q: cuarzo; Gy: yeso.* picos de difracción de mayor intensidad ...................................................................................................... 38

Figura 5.2 Micrografía electrónica de barrido y análisis EDS del sedimento Cerrito Blanco (CB) ....................................................................................................................... 39

Figura 5.3 Micrografía electrónica de barrido y análisis EDS del sedimento Club de Tiro (CT). ....................................................................................................................... 40

Figura 5.4. Análisis de la composición elemental de columna de agua, sedimentos y aguade poro por ICP-OES ....................................................................................................................... 41

Figura 5.5. Perfiles de a) Producción de sulfuro, b) Consumo de sulfato, c) Consumo de lactato, d) Producción de acetato y e) pH, obtenidos en los ensayos en lote para evaluar la actividad sulfato-reductora utilizando como

xii 

inóculo sedimento CB, la leyenda inferior muestra los reactantes suplementados en cada caso ....................................................................................................................... 46

Figura 5.6. Perfiles de a) Producción de sulfuro, b) Consumo de sulfato, c) Consumo de lactato, d) Producción de acetato y e) pH, obtenidos en los ensayos en lote para evaluar la actividad sulfato-reductora utilizando como

13 

inóculo sedimento CT, la leyenda muestra los reactantes suplementados en cada caso ...................................................................................................... 48

Figura 5.7. Perfiles de a) Producción de sulfuro, b) Consumo de sulfato, c) Consumo de lactato, d) Producción de acetato y e) pH, obtenidos en los ensayos en lote para evaluar la actividad sulfato-reductora en presencia de As(V) utilizando como inóculo sedimento CB, la leyenda muestra los reactantes suplementados en cada caso ....................................................................................................................... 51

Figura 5.8. Perfiles de a) Producción de sulfuro, b) Consumo de sulfato, c) Consumo de lactato, d) Producción de acetato y e) pH, obtenidos en los ensayos en lote para evaluar la actividad sulfato-reductora en presencia de As(V) utilizando como inóculo sedimento CT, la leyenda muestra los reactantes suplementados en cada caso ....................................................................................................................... 52

Figura 5.9 Concentración de arsénico, sulfato, lactato y acetato en los ensayos bióticos (a y c ) comparados con los ensayos esterilizados (b y d) con los sedimentos de CB y CT. Muestras tomadas al día 1 y 15 de incubación para CB y al día 1 y 30 para CT ....................................................................................................................... 56

Figura 5.10. Ensayos en lote para evaluar los procesos arseniato/sulfato respiratorios utilizando como inóculo sedimento CB: a) Consumo de sulfato, b) Producción de sulfuro, c) Consumo de As(V), d) Producción de As (III). La leyenda superior muestra los reactantes suplementados en cada caso ....................................................................................................................... 60

Figura 5.11. Perfiles de consumo de lactato (a) y producción de acetato (b), en cultivos en lote utilizando como inoculo sedimento CB. ....................................................................................................................... 63

Figura 5.12. Ensayos en lote para evaluar los procesos arseniato/sulfato respiratorios utilizando como inóculo sedimento CT: a) Redución de sulfato, b) Producción de sulfuro, c) Consumo de As(V), d) Reducción de As (III). La leyenda superior muestra los reactantes suplementados en cada caso ....................................................................................................................... 65

Figura 5.13. Perfiles de consumo de lactato (a) y producción de acetato (b) en cultivos en lote utilizando como inoculo sedimento CT ....................................................................................................................... 66

Figura 5.14 Efecto de distintas concentraciones de donador y aceptor de electrones en los procesos de sulfato/arseniato reducción con sedimento CT: 2- a) Tratamiento con lactato 10 mM, As(V) 10 mM y SO4 2- 10 mM, b) Tratamiento con lactato 15 mM, As(V) 2.5 mM y SO4 10 mM ..................... 68

14 

Figura 5.15. Evidencia de la formación de precipitados en ensayos inoculados con sedimento CT. ............................................................................................... 75

Figura 5.16 Composición elemental de los precipitados minerales recuperados de los cultivos en lote. Concentraciones determinadas en ICP-OES ................. 77

14 

4

4

Figura 5.17. Porcentaje de remoción de arsénico disuelto en función del tiempo para sedimentos CB y CT a partir del ensayo con lactato 10 mM, As(V) 10 mM 2- y SO4 10 mM ............................................................................................... 79

Figura 5.18. Patrones de difracción de rayos X de precipitados de los cultivos en lote con sedimento CB: a) ensayo con lactato (10 mM), As(V) (10 mM) y SO 2-

2- (10 mM); b) ensayo con lactato (15 mM), As(V) (10 mM) y SO4 (10 mM). Muestras tomadas después de 30 días de incubación. C: calcita; Q: cuarzo; Gy: yeso; O: oropimente. * Picos de difracción de mayor intensidad ............. 81

Figura 5.19. Patrones de difracción de rayos X de precipitados de los cultivos en lote con sedimento CT: a) ensayo con lactato (10 mM), AsV (10 mM) y SO 2-

(10 mM); b) ensayo con lactato (10 mM). Muestras tomadas después de 30 días de incubación. C: calcita; Q: cuarzo; Gy: yeso. * Picos de difracción de mayor intensidad ............................................................................................ 82

Figura 5.20. Análisis EDS-MEB de precipitados recuperados de la cinética de sulfato-arseniato reducción con sedimento CB: Ensayo con lactato (10 mM), 2- As(V) (10 mM) y SO4 (10 mM). ................................................................... 84

Figura 5.21 Análisis EDS-MEB de precipitados recuperados de la cinética de sulfato-arseniato reducción con sedimento CB: Ensayo con lactato (15 mM), 2- As(V) (10 mM) y SO4 (10 mM). ................................................................... 84

Figura 5.22 Análisis EDS-MEB de precipitados recuperados de cinética de sulfato- arseniato reducción con sedimento CT: Ensayo con lactato (10 mM), As(V) 2- (10 mM) y SO4 (10 mM). ............................................................................. 85

Figura 5.23 Análisis EDS-MEB de precipitados recuperados de cinética de sulfato- arseniato reducción con sedimento CT: Ensayo con lactato (10 mM) ....................................................................................................................... 85

Figura 5.24. Determinación de NMP. a) Aspecto de las botellas en las que se detectó reducción de arsénico, b) Aspecto de las botellas donde no hubo crecimiento o presencia de microorganismos reductores de arsénico ....................................................................................................................... 87

Figura 5.25. Micrografías de frotis con tinción Gram de un cultivo correspondiente a una dilución de 1x10-6 de sedimento CB: a) Cultivo en medio NMP b) Cultivo 2- con medio basal, lactato, As(V) y SO4 10mM. Imagen obtenida con un microscopio óptico ZEISS Axiostar Plus, con un lente de inmersión Neofluar 60x y una cámara Zeiss Axion-MR3. .............................................................. 89

Figura 5.26 Análisis EDS-MED de precipitados recuperados de cultivos de sedimento CB: a) Precipitado cuya síntesis fue inducida por la adición de sulfuro en una concentración final de 1-1.5 mM, b) Precipitado favorecido por 2- actividad microbiana reductora de As(V) y SO4 . .......................................... 90

15 

Índice de Anexos

Anexo 1. Solución mineral Wolfe’s ................................................................... 105

Anexo 2. Precipitados biogénicos recuperados de ensayos en lote para evaluar capacidad reductora de sulfato en presencia de As(V) ............................... 106

Anexo 3. Cristales de precipitado amarillo formado en cultivos NMP por adición de sulfuro ~1.5 mM ..................................................................................... 109

Anexo 4. Mineralogía de los sedimentos mezclados con el precipitado biogénico formado en los cultivos microbianos: a) CB y b) CT .................................... 110

16 

Abreviaturas   

BSR bacterias sulfato-reductoras

CB Cerrito Blanco

COT carbono orgánico total

CT Club de Tiro

EAA espectroscopía de absorción atómica

EDS detector de electrones dispersivos

ICP siglas en Inglés de Plasma de Acoplamiento Inductivo

keV kilo electrón volts

kPa kilopascal

MEB microscopio electrónico de barrido

meqv e- miliequivalente de electrones

mM milimolar nm nanómetros

pH potencial de hidrógeno

pKa logaritmo negativo de la constante de disociación ácida

rpm revoluciones por minuto

SFT sólidos fijos totales

SVT sólidos volátiles totales

µm micrometros

ORP potencial óxido reducción

xvii 

Glosario  

Actividad endógena. Actividad propia del sitio, sin intervención de factores externos, en sedimentos se refiere a que no se adicionan ni aceptores ni donadores de electrones externos.

Bio-mineralización. Proceso mediante el cual los microorganismos propician o aceleran las condiciones para la formación de fases minerales.

Biogénico. Producido por la acción de un organismo vivo. Biodisponible. Se refiere a que los microorganismos pueden aprovechar

determinado compuesto ya que no existe una barrera físico-química que limite el bioproceso.

Aclimatación. Proceso por el cual un organismo se adapta fisiológicamente a distintos cambios en el medio en que se desarrolla.

18 

Resumen  Ríos Valenciana Erika Elizabeth (2015). Reducción biológica de As(V) y sulfato en sedimentos de un sistema hidráulico contaminado con arsénico. Tesis de Maestría. Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica. México.  El arsénico (As) es un contaminante prioritario por su gran potencial ecotoxicológico. La creciente problemática global de acuíferos contaminados con As hace necesario el estudio de los procesos químicos y biológicos involucrados en las transformaciones de dicho metaloide. La movilidad y toxicidad del As dependen de reacciones redox, adsorción-desorción, precipitación-disolución y actividad biológica, esta última interviene ampliamente en el ciclo biogeoquímico del As en sedimentos de acuíferos. En los sistemas sedimentarios se presentan zonas óxicas y anóxicas aunado a la disponibilidad de materia orgánica lo que promueve el metabolismo microbiano. En este contexto, la arseniato-reducción, es un metabolismo microbiano no deseable ya que incrementa la toxicidad y movilidad del As al reducir el As(V) a As(III) que es una especie más tóxica y móvil. Para contrarrestar el efecto negativo de la arseniato-reducción ésta se puede asociar al proceso de sulfato-reducción, con lo que se promueve la bio- mineralización de As(III) al formarse sulfuros de As, retirándolo de la fase acuosa e inmovilizándolo en fases minerales. El objetivo del presente trabajo fue realizar un estudio microbiológico con sedimentos enriquecidos con As, para evaluar, en microcosmos, la reducción microbiana de As(V) y su efecto en la especiación de arsénico en presencia de materia orgánica y condiciones propicias para el proceso de sulfato-reducción. Se realizaron ensayos en lote utilizando como inóculo dos sedimentos con características distintas, Cerrito Blanco (CB) y Club de Tiro (CT) para estudiar las reacciones de sulfato/arseniato reducción. En el transcurso de los experimentos se siguió la producción de sulfuro, consumo de sustrato y sulfato, producción de acetato y las especies de As(III) y As(V). Los resultados indicaron que en presencia de As(V) y sulfato la biota microbiana de los sedimentos tiene preferencia por el proceso de arseniato-reducción, no obstante, si hay una fuente de carbono también se efectúa la sulfato-reducción. Cuando existen concentraciones bajas de sulfuro disuelto (<3 mM) ocurre la bio-mineralización de sulfuros de arsénico, cuya formación está ligada a la actividad microbiana. Con la formación de precipitados se remueve arsénico de la fase liquida. Después de que los cultivos se incubaron 30 días se alcanzó una remoción de 90% en ensayos con sedimento CB y de 52% en ensayos con sedimento CT, de una concentración inicial del 10 mM de As(V). Se obtuvieron velocidades de reducción de 0.10-0.15 mmol de As(V)/L·h para CB y para CT de 0.24-0.31 mmol de As(V)/L·h dichas velocidades fueron en promedio 3 y 8 veces mayores que las velocidades de sulfato-reducción. Esta investigación demostró que la comunidad bacteriana nativa presente en los sedimentos puede efectuar los procesos de arseniato y sulfato reducción sin un previo enriquecimiento. Esto se puede aprovechar para favorecer la bio-mineralización de As si se proveen concentraciones apropiadas de donador y aceptores de electrones, eventualmente se puede aplicar como una tecnología de bio-remediación en sistemas anaerobios.

19 

Abstract  

Ríos Valenciana Erika Elizabeth (2015). Biological As(V)- and sulfate- reduction in sediments of a hydraulic system contaminated with arsenic. Master Thesis. Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica. México.  Arsenic (As) is a priority pollutant due to its great ecotoxicological potential. Arsenic-contaminated aquifers are a widespread worldwide problem; therefore, the study of chemical and biological processes involved in the transformation of this metalloid is highly relevant. The fate, mobility, and toxicity of arsenic, are mainly controlled by redox reactions, adsorption-desorption, precipitation-dissolution, and biological activity. The latter, is recognized by playing a critical role in biogeochemical cycling of arsenic in aquifer sediments. Sedimentary systems possess oxic, and anoxic zones, these characteristics along with the availability of organic matter, promote reducing microbial mechanisms such as the arsenate- reducing process. This metabolic function is undesirable because it increases the toxicity and mobility of As (by reducing it from the oxidation state V to III). To counteract the negative effect of arsenate-reduction, this process can be associated with the sulfate-reduction process because the availability of As (III) and sulfide can promote the bio-mineralization of As by removing it from the aqueous phase by its immobilization as As-bearing sulfide minerals. The aim of this work was to perform a microbiological study using arsenic enriched sediments to assess the microbial reduction of As(V), and its effect on arsenic speciation. Two scenarios were evaluated: the presence of organic matter, and favorable conditions for the sulfate-reduction process. Batch experiments were conducted using two sediments as inoculum with different characteristics: Cerrito Blanco (CB) and Club de Tiro (CT). Microcosms were periodically sampled to follow sulfide production, consumption of substrate and sulfate, acetate production and arsenic species (III and V), in order to evaluate the cultures performance. The results indicate that in the presence of As(V) and sulfate, the microbial community of the sediment has preference for the arsenate reduction process; however, if a carbon source is available, it also performs sulfate-reduction. When low concentrations of sulfide (<3 mM) are present, the arsenic bio-mineralization linked to microbial activity occurs, and besides the disappearance of As from the aqueous phase there is also formation of precipitates containing arsenic and sulfur. After incubating the cultures for 30 days 90% of arsenic removal was reached in assays with the CB sediment, and 52% with the CT sediment. The arsenic reduction rates achieved for CB assays was 0.10-0.15 mmol of As(V) L-1 h-1, and for CT assays was 0.24 to 0.31 mmol of As(V) L-1 h-1. The rates of As(V) reduction were on average 3 and 8 times higher than the rates of sulfate-reduction obtained with CB y CT, respectively. This research demonstrated that the indigenous bacterial community present in the sediment could perform the process of arsenate- and sulfate-reduction without previous enrichment. These activities can be harnessed for the bio-mineralization of arsenic if provided appropriate concentrations of donor and electron acceptors. Such process can be applied as a bioremediation technology in anaerobic systems.

Introducción 

 1. Introducción

  

El arsénico encabeza la lista de contaminantes prioritarios por su gran potencial

ecotoxicológico, ya que puede bioacumularse y movilizarse a través de la cadena

trófica además de ser un agente carcinogénico reconocido (EPA-US, 2006; IARC,

2004). Actualmente la contaminación de acuíferos por arsénico es una

problemática creciente que afecta a una gran proporción de la población mundial.

Se han identificado áreas con alto contenido de arsénico en aguas subterráneas (>

50 µg/L) en Argentina, Chile, México, China, Hungría, India, Bangladesh y Vietnam

(Smedley & Kinniburgh, 2002). En México los ambientes hidrogeológicos donde se

ha detectado presencia de arsénico en aguas subterráneas son principalmente

acuíferos aluviales (centro y norte del país), áreas de actividad minera y aguas

geotermales. Específicamente en el estado de San Luis Potosí, México, casos

representativos de una elevada concentración de arsénico en agua se localizan en

el distrito minero Santa María de la Paz y Matehuala; para efectos de este trabajo

se hace referencia concretamente al complejo hidráulico “Cerrito Blanco” y a una

emanación de agua en el club de tiro privado “Los Halcones” situados en el

municipio de Matehuala, con base en reportes previos que consideran la

distribución espacial y temporal en el complejo Cerrito Blanco la concentración de

arsénico oscila entre 6 y 16 mg/L y en el Club de tiro desde 44 hasta 155 mg/L

(Martínez-Villegas et al., 2013). Dichas concentraciones sobrepasan

considerablemente los niveles señalados por la normatividad mexicana, la cual

establece que el límite máximo permisible de arsénico en agua para consumo

humano es de 0.025 mg/L y para aguas destinadas a actividades recreacionales o

riego, como en el caso de los sitios referidos, es de 0.4 mg/L (NOM-127-SSA1-

1994; NOM-001-SEMARNAT-1996).

La incidencia y movilización de arsénico en un sistema hidráulico depende

principalmente de la hidrología, de la composición geológica, de la química del

agua y de los procesos biológicos (Lièvremont et al., 2009; Saalfield & Bostick,

2009); estos últimos tienen una intervención significativa en las distintas

transformaciones de arsénico por lo que motivaron esta investigación. Para

relacionar los procesos biológicos y el ciclo de arsénico es importante mencionar

 

1

Introducción

2

 

 

 que la especiación de este metaloide está determinada por reacciones óxido-

reducción, de disolución, adsorción y precipitación; los microorganismos pueden

interactuar con el ciclo del arsénico a través de estos mecanismos teniendo

efectos positivos o negativos en su estabilización (Cheng et al., 2009).

En ambientes sedimentarios tienen lugar múltiples interacciones

biogeoquímicas debido a su gran diversidad microbiana, disponibilidad de materia

orgánica y estratificación redox (McArthur et al., 2004; Castelle et al., 2013;). En

sedimentos ricos en hierro el predominio de óxidos y oxihidróxidos de hierro

controla la movilización de arsénico. Por ejemplo, la disolución reductiva de

oxihidróxidos de hierro se ha reportado como uno de los mecanismos más

importantes que causa la desorción y liberación de arsénico hacia la fase acuosa y

es consecuencia de la reducción microbiana de Fe(III) (Mirza et al., 2014; Muehe

et al., 2013; Neidhardt et al., 2014). Sin embargo, existen ambientes pobres en

hierro y ricos en azufre, siendo este el caso de los sitios donde se colectaron los

sedimentos para este estudio, por lo que es importante considerar la interrelación

entre el ciclo del azufre y el ciclo arsénico debido a que procesos como la

reducción microbiana de sulfato desempeñan un papel primordial en la

especiación del arsénico (Burton et al., 2013). Existen evidencias de la

movilización biogénica de arsénico y azufre en sedimentos de lagos, ríos y

acuíferos (Oremland et al., 2000; Guo et al., 2011, Jiang et al., 2014;), dicho

proceso va a depender de la composición geoquímica y mineralógica del

sedimento y desde luego la disponibilidad de materia orgánica, ya que ésta

estimula a la comunidad microbiana nativa desencadenando una serie de

procesos biológicos que afectan la composición química del agua (Neidhardt et al.,

2014).

La integración y comprensión de todos los aspectos mencionados

anteriormente es fundamental en la bio-remediación de sitios contaminados.

Partiendo de que la movilización e inmovilización de arsénico es una interacción

compleja de reacciones mediadas por microorganismos y procesos geoquímicos

es evidente la importancia de estudiar los procesos implicados en la distribución y

especiación de arsénico así como su relación con otros ciclos biogeoquímicos

Introducción

3

 

 

 afines, tal es el caso del ciclo de azufre. Entre los factores clave para lograr el

objetivo anterior se encuentra el estudio de la biota microbiana asociada a las

transformaciones de especies de arsénico y azufre como una aproximación para

comprender mejor los procesos biogeoquímicos que ocurren en el sitio particular

de estudio y a su vez contribuir al planteamiento de estrategias de remediación y

prevención de contaminación, así como de atenuación de riesgos.

El presente trabajo tuvo como propósito estudiar en microcosmos la

contribución de la comunidad microbiana proveniente de sedimentos

contaminados con arsénico sobre los procesos de especiación y estabilización de

este contaminante de interés global.

Marco referencial 

4 3

4 4

3 3

 2. Marco referencial

 

2.1 Incidencia, movilización e impacto del arsénico en el medio ambiente  

 

2.1.1 Química general  

 

El arsénico es un metaloide, por lo que no se encuentra como cationes

individuales, reacciona rápidamente para formar oxianiones y sus sales

correspondientes, puede formar parte de compuestos químicos orgánicos e

inorgánicos; los estados de oxidación en que predomina son As(V) y As(III) con

menor frecuencia encontramos el As(-III) y el As(0) (Gorny et al., 2015). El

arseniato o As(V) predomina en condiciones oxidantes, mientras que el arsenito o

As(III) predomina cuando las condiciones son reductoras (Cheng et al., 2009). En

la Tabla 2.1 se muestran las principales reacciones de ionización de los

oxianiones de As(V) y As(III) así como el pKa al que se llevan a cabo.

  

Tabla 2.1 Reacciones de ionización y valores de pKa del ácido arsénico y el ácido arsenioso (Cornelis et al., 2005).

   

As(V) Reacción pKa

Ácido arsénico (H3AsO4) H3AsO4 + H2O H2AsO - + H O+ 2.20

H2AsO -

2- + H2O HAsO 2-

3-

+ H3O+

+ 6.97

 As(III)

HAsO4 + H2O AsO4 + H3O  - +

11.53

Ácido arsenioso (H3AsO3) H3AsO3 + H2O H2AsO3 + H3O 9.22 H2AsO -

2-

+ H2O HAsO 2-

3- + H3O+

+

12.13 HAsO4 + H2O AsO3 + H3O 13.4

   

2.1.2 Distribución en el ambiente  

 

El arsénico es el veinteavo elemento más abundante en la corteza terrestre (Ma et

al., 2010). En la naturaleza pueden existir más de 300 minerales con arsénico, de

estos 60% son algún tipo de arseniato, ~20% son sulfuros y sulfosales, 10% son

óxidos y el resto son arsenitos, arseniuros, arsénico nativo y aleaciones metálicas

(Bowell & Parshley, 2001). Las mayores concentraciones de arsénico las

     

4

Marco referencial

5

 

 

 encontramos en los sulfuros (pirita, galena), óxidos y oxihidróxidos de hierro,

manganesos y aluminio (Cheng et al., 2009).

La incidencia de arsénico en los cuerpos de agua naturales está

determinada por complejas interacciones de la geología, hidrología, química del

agua, y los procesos biológicos y por consiguiente está relacionada con el pH, el

potencial redox (Eh), el estado de oxidación de las especies químicas, y las

reacciones de adsorción, intercambio iónico y precipitación (Cheng et al., 2009).

 2.1.3 Fuentes y usos

 

 

El arsénico ingresa y se moviliza en el medio ambiente por procesos geológicos

naturales como reacciones de meteorización, emisiones volcánicas, actividad

biológica y por actividades antropogénicas. Estas últimas incluyen su uso industrial

como agente de aleación en procesos mineros, procesamiento de vidrio,

pigmentos, textiles, papel, adhesivos metálicos, protectores de la madera y

municiones. El arsénico también se emplea en los procesos de curtido de pieles y

en la fabricación de plaguicidas, aditivos para piensos y productos farmacéuticos

(Jong & Parry, 2005).

El As(III) y As(V) son los productos finales habituales de liberación de

arsénico al medio ambiente por procesos mineros, de meteorización y oxidación

(Moriarty et al., 2014). Cabe destacar que el arsénico es único entre los metales

tóxicos y elementos que forman oxianiones por su alta sensibilidad de movilización

a valores de pH típicos de aguas subterráneas (6.5-8.5), ya sea bajo condiciones

oxidadas o reducidas. Es importante considerar que la mayoría de los problemas

de contaminación por arsénico son causadas por arsénico inorgánico natural

(Oremland & Stolz, 2003).

 2.1.4 Legislación ambiental

 

 

Los niveles máximos permisibles de arsénico en agua para consumo humano han

sido reducidos en muchos países debido a los efectos adversos que ha tenido la

contaminación por arsénico de agua subterránea para consumo humano. El

arsénico es una de las 10 sustancias químicas que la organización mundial de la

Marco referencial

6

 

 

 salud (OMS) considera más preocupante para la salud pública por lo que ha

reducido el límite máximo permisible en agua potable de 50 a 10 µg/L, lo mismo

que las directrices de la agencia de protección ambiental de Estados Unidos

(USEPA), que además tiene como objetivo llevar el límite permisible a cero (Ma et

al., 2010). La norma mexicana (NOM-127-SSA1-1994) disminuyó el límite

permisible de 50 a 25 µg/L en agua potable, y para cuerpos de agua usados para

riego, actividades recreativas o protección de ecosistemas acuáticos el límite

permisible establecido es 0.4 mg/L (NOM-001-SEMARNAT-1996).

El intervalo de concentraciones de arsénico reportados en las aguas

subterráneas a nivel mundial comprende desde 0.5 µg/L hasta más de 5000 µg/L

(Smedley & Kinniburgh, 2002).

 2.1.5 Toxicidad

 Según la OMS la mayor amenaza del arsénico para la salud pública reside en la

utilización de agua contaminada para beber, preparar alimentos y regar cultivos

alimentarios. La exposición prolongada al arsénico a través del consumo de agua

y alimentos contaminados puede causar cáncer y lesiones cutáneas. También se

ha asociado a problemas de desarrollo, enfermedades cardiovasculares,

neurotoxicidad, enfermedades gastrointestinales y diabetes. En humanos el

arsénico ingerido se excreta principalmente por la vía renal. Sin embargo, este

elemento es bioacumulable en huesos, piel, cabello y uñas (Ma et al., 2014).

 

2.1.6 Transformaciones en agua y sedimentos  

 

Las especies de arsénico tienden a ser inestables en aguas naturales. La

inestabilidad depende fuertemente de las condiciones redox del medio, pH,

presencia de agentes precipitantes como Ca2+, Fe2+ y Fe3+, materia orgánica y

actividad microbiana (Litter et al.,2009).

Los sedimentos constituyen un factor muy importante del sistema acuático, por

su participación en el equilibrio de los contaminantes solubles/insolubles y por su

mayor permanencia en el cuerpo de agua. Existen reportes de distintos

mecanismos para explicar la liberación de arsénico de los sedimentos al agua de

Marco referencial

7

 

 

 los cuales, se puede resaltar la disolución reductiva de minerales con alto

contenido de arsénico, desorción de arsénico de óxidos de hierro y manganeso, y

la oxidación microbiana de materia orgánica (Smedley & Kinniburgh, 2002,

Saafield et al., 2009). Cabe mencionar que el arsénico puede inmovilizarse in situ

por procesos de adsorción y precipitación, principalmente si existen óxidos de

hierro, es decir, si prevalece una relación alta de Fe/As. Sin embargo, hay

ambientes sedimentarios que no son ricos en hierro, donde habrá una marcada

intervención de otros cationes abundantes tal es el caso de Ca2+ y aniones como  

el sulfato (Martínez-Villegas et al., 2013).  

 

2.2 Arsénico, caso de estudio  

 

El estudio del arsénico se ha abordado desde diferentes perspectivas, entre las

más importantes se pueden destacar las siguientes:

  

Toxicidad en seres vivos, se consideran las propiedades químicas y físicas de

arsénico en el amplio contexto de la toxicidad en humanos, plantas, animales y

microorganismos. Se evalúan las consecuencias de la exposición crónica,

rutas de exposición, respuesta biológica, concentraciones, por ejemplo, el nivel

de riesgo mínimo de exposición oral y dosis letal (DL50) (Hettick et al., 2015).

Especiación y detección de arsénico, básicamente comprende el estudio de

ventajas y desventajas de tecnologías analíticas, límites de detección,

preparación y preservación de muestras y desde luego incorpora la

implementación de nuevas metodologías (Ma et al., 2014).

Contaminación por arsénico y tecnologías de remediación, remoción de

arsénico de ambientes contaminados ya sea por tratamientos químicos o

biológicos (Fazi et al., 2015; Singh et al., 2015).

Biotransformación de especies de arsénico, se abordan los procesos

biológicos, rutas metabólicas y energéticas además, reacciones oxido-

reducción mediadas por microorganismos que involucran la transformación de

diferentes especies químicas de arsénico (Oremland & Stolz, 2003).

Marco referencial

8

 

 

  Procesos geoquímicos e hidrogeoquímicos implicados en las transformaciones

de arsénico, estudios in situ o ex situ ya sea de acuíferos, ríos, lagos y los

sedimentos de dichos ambientes relacionando la geología local con las altas o

bajas concentraciones de arsénico. Además se evalúan procesos químicos que

potencialmente impactan la estabilización de arsénico tal es el caso de la

disolución y precipitación de minerales con arsénico o procesos de

adsorción/desorción (Smedley & Kinniburgh, 2002; Drahota & Filippi, 2009).

Procesos biogeoquímicos, estudian las transformaciones de arsénico,

considerando, además de los procesos químicos, los procesos biológicos, esto

debido a que la movilización geogénica de arsénico en cuerpos de agua

involucra procesos geológicos, hidrológicos, físico-químicos y biológicos

(Lièvremont et al., 2009). Haciendo énfasis en los procesos biológicos el

principal escenario es la interface agua-sólido, incluye diversos metabolismos

microbianos y su participación en ciclo biogeoquímico del arsénico; considera

aspectos como la resistencia microbiana a altas concentraciones de arsénico,

reacciones redox catalizadas por microorganismos, caracterización molecular

de comunidades microbianas y sus mecanismos de captación de arsénico. En

este sentido los microorganismos anaerobios juegan un importante rol en la

liberación de arsénico en sedimentos, dentro de los procesos microbianos que

tienen mayor impacto se puede resaltar la reducción microbiana de hierro, de

sulfato y desde luego de arsénico (Huang, 2014). El presente trabajo se enfoca

en la actividad biológica específicamente en el estudio de dos procesos

microbianos la sulfato-reducción y arseniato-reducción, ya que dichos procesos

impactan la movilización e inmovilización de arsénico en sedimentos

contaminados que en este estudio son la fuente de microorganismos, cabe

destacar que en sistemas sedimentarios es de vital importancia considerar la

relación de la composición química de los sedimentos y procesos microbianos.

En la Figura 2.1 se ilustran los posibles procesos de especiación de arsénico

que se ven influenciados por la disponibilidad de materia orgánica y actividad

microbiana en los sedimentos de los sitios de muestreo.

Marco referencial

9

 

 

 

                              

Figura 2.1 Modelo biogeoquímico de las transformaciones de arsénico en los sedimentos Cerrito Blanco y Club de Tiro. CH2O: materia orgánica.

   

2.3 Incidencia, movilización e impacto del azufre en el medio ambiente  

 

El azufre forma parte de los elementos más abundantes en la Tierra. Los mayores

depósitos de azufre se encuentran en sedimentos y rocas (7800 x 1018 g) en forma

de sulfuros de hierro, principalmente la pirita (FeS2), yeso (CaSO4·2H2O) o como

sulfato en agua de mar (1280 x 1018 g). El azufre se presenta en diferentes

estados de oxidación (-II a +VI) y formas químicas (cisteína, sulfuro, sulfato, etc.)

(Sánchez-Andrea et al., 2014). Este elemento se libera al medio ambiente por

fuentes naturales (erupciones volcánicas) y actividades antropogénicas. El ciclo

del azufre en los sedimentos implica procesos bioquímicos tanto reductivos como

oxidativos (Kijjanapanich et al., 2014).

Las reacciones de azufre con arsénico son importantes en ambientes

sedimentarios ya que determinan en gran medida la movilidad y toxicidad del

arsénico. Dentro de un marco biogeoquímico, se ha documentado la interferencia

del ciclo del azufre en la movilización de arsénico en acuíferos debido a la

Marco referencial

10

 

 

 oxidación de minerales de sulfuro ricos en arsénico o a la reducción del sulfato

(Corkhill & Vaughan, 2009). En la siguiente sección se describen en detalle los

procesos biológicos que involucran arsénico y azufre.

 

2.4 Procesos microbianos de reducción de As(V) y sulfato  2.4.1 Reducción de arsénico

 

 

Debido a que la movilidad del arsénico depende ampliamente de las formas

químicas de azufre, hierro y del mismo arsénico, y a su vez la especiación química

de estos elementos se ve impactada por transformaciones microbianas entonces,

las biotransformaciones representan uno de los principales factores que influyen

en el ciclo biogeoquímico del arsénico. En la Figura 2.2 se resume el ciclo

biogeoquímico del arsénico y su relación con especies de azufre y hierro.

                          

 Figura 2.2 Representación esquemática del ciclo biogeoquímico del arsénico y su interacción con los procesos microbianos de oxidación de sulfuro y reducción de sulfato y de hierro; (ads): adsorbido; (pct): precipitado. *Mediado por microorganismos (Modificado de Reisinger et al., 2005).

 Las biotransformaciones referidas anteriormente incluyen procesos

microbianos de reducción, oxidación, metilación y desmetilación, en la Tabla 2.2

Marco referencial

11

 

 

 se desglosa el efecto de los procesos mencionados en la movilización de arsénico,

tomando como base la interface agua-mineral (Huang, 2014).  

 Tabla 2.2 Procesos microbianos que influencían la movilización de arsénico (Huang, 2014b).

 

 

Procesos Características Movilización Reducción de As(V) a As(III) El As(III) es más móvil que el As(V)

Metilación de arsénico El arsénico metilado (gas) es más móvil que el arsénico inorgánico

Inmovilización Oxidación de As(III) a As(V) El As(V) es menos móvil que el As(III)

Desmetilación El arsénico metilado (gas) es más móvil que el arsénico inorgánico

Biomineralización Formación de minerales con arsénico

Biosorción Secuestro extracelular

Bioacumulación Secuestro intracelular

Oxidación de hierro Formación de hidróxidos de hierro que adsorben arsénico

Movilización e Inmovilización Reducción de hierro Movilización: disolución reductiva de hidróxidos de

hierro Inmovilización: secuestro mineral secundario.

Sulfuración Movilización: formación de complejos disueltos de As-S Inmovilización: formación de precipitados de sulfuro

Biolixiviación Movilización: disolución oxidativa Inmovilización: secuestro mineral secundario

 

 

La reducción microbiana de As(V) se puede llevar a cabo por dos

mecanismos, el primer mecanismo es de desintoxicación (tolerancia a

concentraciones elevadas de arsénico) y el segundo es la obtención de energía

(respiración anaerobia) (Huang et al., 2014; Osborne et al., 2015). La

desintoxicación es un mecanismo de resistencia al arsénico que ocurre cuando el

As(V) entra al interior de la célula (al citoplasma) es reducido y exportado como

As(III) por un sistema de excreción (E-flujo). Este proceso requiere inversión de 3-

energía. La similitud en tamaño iónico y carga entre PO4 disuelto y los oxianiones

Marco referencial

12

 

 

 de As(V) le permite a este último entrar en la célula a través de vías de transporte

de fosfato. La presencia de arsénico en la célula afecta su operación debido a que

el As(V) desacopla la fosforilación oxidativa y el As(III) se une a grupos sulfhidrilo

de las proteínas, la célula presenta un sistema de excreción de As(III) (Kruger &

Bertin., 2013). En cambio, la respiración de arsénico es catalizada por la enzima

arseniato reductasa (Arr), una enzima de la familia dimetil-sulfóxido que forma

parte de las enzimas molibdeno. La enzima Arr se encuentra fuera del citoplasma

ya sea unido a la membrana citoplasmática (en las bacterias Gram-positivas) o en

el periplasma (en las bacterias Gram-negativas) (Osborne et al., 2015). En la

Figura 2.3 se ilustran las posibles interacciones del ársenico con una célula

microbiana.

                     

 Figura 2.3. Esquema representativo de un microorganismo y los diferentes mecanismos de interacción con los compuestos de arsénico (modificado de Huang et al., 2014).

 La respiración de arsénico se lleva a cabo por bacterias arseniato-reductoras

(BAR) que utilizan As(V) como aceptor terminal de electrones dando como

resultado la formación de As (III). Esta reacción es energéticamente favorable

cuando se acopla a la oxidación de materia orgánica, ya que el potencial redox de

la pareja As(V)/As(III) es de +135 mV (Niggemyer et al., 2001a; Oremland & Stolz,

2003). En la Tabla 2.3 se muestran las reacciones de reducción de arsénico

usando como donadores de electrones el acetato y lactato.

Marco referencial

13

 

 

 

Tabla 2.3 Estequiometría de la reacción de arseniato-reducción tomando como compuestos orgánicos representativos acetato y lactato (Newman et al., 1997a; Macy et al., 2000; Ohtsuka et al., 2013).

 

Fuente de carbono

 

Reacción ∆G°’ pH=7

- 2- - +

Acetato C2H3O2 + 2 HAsO4 + 2 H2AsO4 -

+ 5 H -252.6 (kJ/mol) Reacción

4 H3AsO3 + 2 HCO3 2.1 - + 2- -

Lactato C3H5O3 + 2 H + HAsO4 -

+ H2AsO4 -

-172 (kJ/mol) Reacción

2 H3AsO3 + HCO3 + C2H3O2 2.2  

 Las bacterias arseniato-reductoras han sido aisladas de distintos ambientes

como sedimentos, lagos, complejos mineros, superficies de acuíferos, etc. Estos

microorganismos pueden utilizar una amplia variedad de donadores de electrones

como acetato, lactato, piruvato, citrato, glucosa e incluso se ha encontrado que

pueden degradar moléculas aromáticas complejas ya que son filogenéticamente

diversas, incluyen miembros del género Firmicutes (Bacillus), Gamma, Delta, y

Epsilon-Proteobacteria (Oremaland & Stoltz, 2003).

Las especies bacterianas capaces de realizar la reducción de As(V) pueden

tener un impacto negativo en el ambiente, debido a que el As(III) es una especie

más tóxica y más susceptible a movilizarse ya que se presenta como una especie

sin carga en un rango de pH neutro por lo que tiene menor afinidad por superficies

minerales. Las bacterias arseniato-reductoras desempeñan un papel significativo

en la liberación de arsénico en forma de As(III) de sedimentos subóxicos y

anóxicos, debido a que pueden efectuar la reducción directa de arseniato

adsorbido en los óxidos y oxihidróxidos de hierro o manganeso, ya que estos

compuestos son inestables en condiciones reducidas, el arsénico unido a ellos es

susceptible a desorberse lo que se resume en una mayor movilidad y toxicidad

(Niggemyer et al., 2001; Al Lawati et al., 2013; Moriarty et al., 2014; Neidhardt et

al., 2014;).

Marco referencial

14

 

 

 2.4.2 Reducción de sulfato

 

 

Los procesos microbianos desempeñan un papel esencial en el ciclo del

azufre catalizando las reacciones de oxidación y reducción, estas reacciones

incluyen la reducción no asimilativa de sulfato (conservación de energía y

crecimiento microbiano), la reducción no asimilativa de azufre, la reducción

asimilativa de sulfato (el sulfuro reducido se asimila en biomasa, proteínas y

aminoácidos), oxidación de sulfuro y dismutación que se refiere a la oxidación y la

reducción acoplada de compuestos de azufre (tiosulfato, sulfito y azufre) a sulfato

y sulfuro (Sánchez-Andrea et al., 2014). En la Figura 2.4 se muestran los

mecanismos de reducción asimilativa y no asimilativa de sulfato y azufre elemental

así como la oxidación de sulfuro en una célula microbiana.

                      

Figura 2.4. Esquema representativo de un microorganismo y los diferentes mecanismos de interacción con los compuestos de azufre (modificado de Rabus et al., 2006).

  

Para nuestro propósito nos enfocaremos en la reducción no asimilativa de

sulfato. Las bacterias sulfato sulfato-reductoras (BSR) son microorganismos 2-

anaerobios que utilizan el sulfato (SO4 ) como aceptor final de electrones durante

la oxidación de una fuente de carbono, usualmente compuestos orgánicos, dando

como resultado la producción de sulfuro (H2S), el potencial redox (Eh) de la pareja 2-

SO4 /H2S es -222 mV. En la Tabla 2.4 se ejemplifican dos reacciones de sulfato-  

reducción en donde se aprecia que la energía libre de Gibbs que se produce es

Marco referencial

15

 

 

3

3

 menor a la que se produce si el aceptor final de electrones fuera el As(V) en lugar

de sulfato (Tabla 2.3).

  

Tabla 2.4 Estequiometría de la reacción de sulfato-reducción utilizando como compuestos orgánicos representativos acetato y lactato (Sánchez-Andrea et al., 2014).

 

 Fuente de carbono Reacción ∆G°’ pH=7

  - 2- - -

Acetato C2H3O2 + SO4 2 HCO3 + HS -48 (kJ/mol) Reacción  

2.3   - 2- -

Lactato 2 C3H5O3 + SO4 2 C2H3O2 + -89 (kJ/mol) Reacción

2 HCO - + 0.5 HS-

+ 0.5 H2S+ 0.5 H+

 

2.4  

 Las BSR pueden utilizar distintos aceptores de electrones en su

metabolismo energético además del sulfato estos pueden ser sulfito, tiosulfato,

azufre elemental (S0), fumarato, nitrato (NO -), Mn (IV), Fe(III) e incluso As(V). Las

BSR utilizan como sustratos compuestos de bajo peso molecular (acetato, lactato)

(Liamleam & Annachhatre, 2007). La reducción de sulfato requiere en primer lugar

la activación del sulfato por medio de la enzima ATP sulfurilasa la cual une el

sulfato a un fosfato del ATP para formar adenosina fosfosulfato (APS), la cual se -2

incorpora a la célula y posteriormente puede reducirse a sulfito (SO3 + AMP) por  

la actividad de la enzima APS reductasa y por último el sulfito se reduce al sulfuro

(H2S) por la acción de la enzima sulfito reductasa (Rabus et al., 2006; Aguilar-

Barajas et al., 2011).

 

2.4.3 Bio-mineralización de arsénico  

Algunos de los miembros de la comunidad sulfato-reductora también tienen la

capacidad de utilizar As(V) como aceptor terminal de electrones:

Desulfotomaculum auripigmentum, Desulfomicrobium, Desulfosporosinus,

Desulfitobacterium frappieri, entre otros (Newman et al., 1997a; Niggemyer et al.,

2001; Liu et al., 2004; Macy et al., 2000a;). Dado que el sulfato es el aceptor

terminal de electrones por excelencia para las BSR, resulta interesante saber si

éstas pueden usar ambos aceptores cuando el arsénico también está presente. En

este sentido, Newman y colaboradores (1997a) reportaron que la reducción de

Marco referencial

16

 

 

 sulfato únicamente ocurre cuando todo el arseniato presente en el medio es

reducido a arsenito, por su parte Macy y colaboradores (2000) afirman que ambos

procesos de reducción se pueden efectuar simultáneamente. De lo que no queda

duda es que existen bacterias sulfato-reductoras capaces de emplear As(V) como

aceptor final de electrones.

La importancia de tener bacterias arseniato y sulfato reductoras radica en   2-

que al acoplar el proceso de reducción de As(V) al de reducción de SO4 , se  

obtiene As (III) y H2S, respectivamente, los cuales en concentraciones apropiadas

aunado a un potencial redox alrededor de -200 mV dan lugar a la formación de

fases minerales de sulfuro y una vez que se exceda la solubilidad de estos

minerales (As2S3 5x10-4 g/L en agua 25 °C) puede ocurrir la bio-mineralización de

arsénico. El oropimente As2S3 y el rejalgar AsS son los principales productos en

dicho proceso, incluso estos minerales se forman o existen naturalmente en

sedimentos ricos en azufre; en la literatura se reporta que la formación de

oropimente, rejalgar o sus polimorfos pararejalgar y alacranita (AsS o As4S4) en

sedimentos naturales es consecuencia principalmente de la actividad

microbiológica (O’Day et al., 2004). A continuación se muestra la estequiometría

de las reacciones respectivamente (Peng Lu & Chen Zhu., 2011):

 

2 H3AsO3 + 3 HS- +3 H+ As2S3(s) + 6 H2O Reacción 2.5

H3AsO3 + HS- + 2 H+ + e- AsS(s) + 3 H2O Reacción 2.6

 Los sulfuros de arsénico son conocidos por ser una fuente de

contaminación a causa de los procesos de meteorización que causan su

disolución y con ello la liberación de arsénico a la fase acuosa. No obstante, hay

reportes que sustentan que la actividad microbiana puede favorecer en gran

medida la formación de dichos sulfuros de arsénico lo cual es deseable pues

conduce a la estabilización de este contaminante (Newman et al., 1997a; Macy et

al., 2000a).

El proceso de bio-mineralización puede contribuir a la remoción de arsénico

de la fase acuosa y al secuestro de éste en fase sólida; si se considera que los

sulfuros son fases estables, bajo condiciones reducidas, el desarrollo de estos

Marco referencial

17

 

 

 minerales puede fungir como un mecanismo de control de la movilización de

arsénico en sistemas hídricos que presenten zonas subóxicas y anóxicas

(Demergasso et al., 2007; Rodriguez-Freire et al., 2014).

 

2.5 Comunidades bacterianas en sedimentos  

 

Los sedimentos son sede de una gran parte de la biomasa viva en la tierra. En el

medio ambiente terrestre, los sedimentos proporcionan la estructura para los

sistemas hídricos y para los microorganismos, dentro de ellos está controlada la

incidencia de carbón orgánico, influyen en la especiación y por lo tanto el destino y

el transporte de los metales y metaloides, al alterar la forma química de

contaminantes como arsénico (Castelle et al., 2013). Aunque se ha reportado la

presencia de una gran variedad de especies que forman parte de las comunidades

bacterianas en los sedimentos, debido a su gran diversidad se conoce

relativamente poco de la microbiología de estos ambientes. Los miembros más

representativos se encuentran entre las clases Proteobacteria, Gamma-, Delta- y

Alpha-proteobacteria, Euryarchaeota, Spirochetes, Planctomycetes, Nitrospirae,

Actinobacteria, Bacteroidetes/Chlorobi, Thaumarchaeota, Elusimicrobia y

Acidobacteria (Castelle et al., 2013).

Para entender los mecanismos de movilización de arsénico, mediados por

microorganismos de los sedimentos hacia la fase acuosa, resulta de suma

importancia la distribución vertical de las poblaciones de bacterias en los

sedimentos (Jiang et al., 2014). Un ambiente sedimentario permite que se lleven a

cabo múltiples procesos microbianos por la existencia de diferentes condiciones

redox y aceptores de electrones intrínsecos. En la Figura 2.5 se muestra una

distribución vertical de los procesos microbianos, en relación al Eh y la

concentración de oxígeno, que pueden tener lugar en sedimentos cuando se oxida

la materia orgánica o se llevan a cabo procesos quimiolitotroficos (Gorny et al.,

2015).

En sedimentos existen microorganismos enzimáticamente activos capaces de

sobrevivir en ambientes ricos en arsénico, ya sea con un pH alto o bajo y en

condiciones de oxidación o reducción. Al mismo tiempo, son capaces de obtener

Marco referencial

18

 

 

 su energía de un fluido donde ocurren reacciones de disolución que contiene

minerales, a través de la oxidación de arsenito o respiración de arseniato (Islam et

al., 2013). Por otro lado, el proceso de disolución de minerales que contienen

arsénico puede ser acelerada por la producción bacteriana de sustancias

poliméricas extracelulares lo que conlleva a la extracción de elementos vitales de

la red cristalina de los minerales (Lukasz et al., 2014).  

                           

Figura 2.5 Oxidantes dominantes para la mineralización en sedimentos en relación al potencial redox (tomado de Gorny et al., 2015)

 

 2.6 Rol de la materia orgánica en la movilización de arsénico y azufre en

sedimentos  

La disponibilidad de carbono orgánico en cuerpos de agua, ya sea como materia

orgánica sedimentaria o bien en la forma de carbono orgánico disuelto, se

considera un factor limitante para reacciones redox mediadas por

microorganismos (McArthur et al., 2004; Radloff et al., 2008, Lièvremont et al.,

2009). En la zona con mayor concentración de oxígeno la descomposición de la

materia orgánica procede por la respiración aerobia. Sin embargo, en la zona

Marco referencial

19

 

 

 anaeróbica subyacente, la descomposición se produce principalmente a través de

los procesos anaerobios, como la reducción del sulfato (Kijjanapanich et al., 2014).

El metabolismo microbiano de la materia orgánica resulta en un ambiente

con condiciones reductoras o diferentes zonas de estratificación redox (McArthur

et al., 2004). La materia orgánica fresca y la difusión lenta de O2 a través del

sedimento fomentan condiciones reducidas en la interfase agua-sedimento, a su

vez favorecen la reducción de As(V) y también la desorción de As(V) de óxidos de

hierro y manganeso, así como la disolución reductiva de estos minerales ya que

son inestables bajo condiciones anóxicas (Neidhardt et al., 2014; Smedley &

Kinniburgh, 2002).

Se cree que la reducción microbiana de arsénico ocurre principalmente en

la sub-superficie donde se encuentra disponible una fuente de carbono, el

mencionado proceso de reducción puede ser sustentado con una baja

disponibilidad de sustrato (p. ej. decaimiento microbiano) (Rodriguez-Freire et al.,

2014). Las poblaciones bacterianas son abundantes en sedimentos superficiales,

lo que se refleja en las altas tasas de mineralización que disminuyen

exponencialmente con la profundidad del sedimento (Li et al., 1996; Neidhardt et

al., 2014; Kijjanapanich et al., 2014). La frontera óxica-subóxica es la zona donde

se desarrolla la diagénesis, es decir, la oxidación de la materia orgánica

empleando los oxidantes presentes en los sedimentos. En resumen se puede

decir que en los sedimentos la liberación o retención de arsénico está

estrechamente ligada con la descomposición de materia orgánica.

Justificación, hipótesis y objetivos 

 3. Justificación, hipótesis y objetivos

 3.1 Justificación

 

 

La calidad del agua subterránea y la predisposición de un sistema hidráulico a

problemas de contaminación depende de las características del sistema en

cuestión, dado que los acuíferos difieren entre sí ya sea por las condiciones

climáticas, propiedades del ambiente hidrogeológico (profundidad, composición

del acuífero, interacciones agua-minerales, contenido de metales etc.) y las

comunidades microbianas nativas (Lièvremont et al., 2009; Alarcón-Herrera,

2012). De aquí se desprende la importancia de la identificación y caracterización

de acuíferos contaminados así como el estudio de los mecanismos implicados en

la movilización e inmovilización de metales y metaloides potencialmente tóxicos

como el arsénico.

A nivel nacional se han efectuado estudios detallados de aspectos

hidrogeoquímicos de la contaminación de acuíferos por arsénico (Castro-

Larragoitia et al., 1997; Carrillo-Chávez et al., 2000; Armienta et al., 2001; Romero

et al., 2004; Razo et al., 2004; Alarcón-Herrera et al., 2012; Reyes-Gómez et al.,

2013; Martínez-Villegas et al., 2013). Sin embargo, no existen estudios al respecto

que impliquen la caracterización biogeoquímica, es decir, que incluyan los

procesos biológicos; lo cual es relevante si se considera que la actividad

microbiana desempeña un rol importante en los ciclos biogeoquímicos de

elementos como azufre y arsénico y es responsable en gran medida de la

movilización e inmovilización de este último (Hoeft et al., 2004; Burton et al.,

2013a;). Por lo anterior, estudiar los procesos biológicos que eventualmente se

pueden llevar a cabo de ambientes que presentan altas concentraciones de azufre

(en forma de sulfato) y arsénico puede ser una herramienta útil para comprender

los mecanismos biogeoquímicos de movilización y transformación de especies

químicas. Una vez entendidos los procesos biológicos que podrían ocurrir se

podrían plantear estrategias de remediación adecuadas para los sitios

contaminados. Otro aspecto que impulsa el desarrollo de este trabajo es que en la

literatura hay poca información de la actividad biológica en acuíferos someros con

  

 

20

Justificación, hipótesis y objetivos

21

 

 

 bajo contenido de hierro y alto contenido de especies de azufre y arsénico; en

México una proporción considerable de acuíferos pertenece a este grupo.

 

3.2 Hipótesis  

 

En los sedimentos de un sistema hidraúlico que presenta una elevada

concentración de arsénico existen comunidades bacterianas capaces de

reducir sulfato y arseniato, dichas comunidades contribuyen con la

transformación y retención de especies de arsénico mediante las

reacciones óxido-reducción que catalizan.

Los procesos microbianos de sulfato-reducción y arseniato-reducción

ligados a la oxidación de materia orgánica propiciarán la mineralización de

arsénico en forma de sulfuros de arsénico. No obstante, el proceso de

mineralización dependerá de la concentración de As(V) y sulfato en el

medio así como de la disponibilidad de una fuente de carbono.

Justificación, hipótesis y objetivos

22

 

 

 3.3 Objetivos

 3.3.1 Objetivo General

 

 

Realizar un estudio microbiológico con sedimentos de un sistema hidráulico

contaminado con arsénico, para evaluar en microcosmos la aportación de

actividad microbiana en la reducción de As(V) e inmovilización de As(III),

considerando el efecto de la materia orgánica y el proceso de sulfato-reducción.

   

3.3.2 Objetivos específicos  

 

a) Obtener y caracterizar fisicoquímicamente los sedimentos para definir las

concentraciones de arsénico, azufre y materia orgánica.

b) Llevar a cabo ensayos de microcosmos, para evaluar la capacidad

reductora de sulfato y As(V) de la biota microbiana nativa.

c) Realizar ensayos en lote para valorar el efecto de la materia orgánica y el

proceso de sulfato-reducción en la transformación de especies de arsénico.

d) Recuperar los minerales biogénicos precipitados en los cultivos microbianos

para su identificación morfológica, estructural y elemental.

e) Analizar cuantitativa y morfológicamente la comunidad bacteriana mediante

estimación por número más probable y por técnicas de tinción diferencial.

Materiales y métodos 

 4. Materiales y métodos

 4.1 Materiales

 4.1.1 Fuente de inóculo

 

 

Para inocular los ensayos biológicos se utilizaron sedimentos recuperados de dos

sitios de muestreo, un punto del canal “Cerrito Blanco” (CB) (100º36’41” longitud O

y 23º40’23” latitud N) y el segundo sitio en un afloramiento de agua en el interior

del club de tiro privado Los halcones (CT) (100º38´22” longitud O y 23º38’22”

latitud N), ambos se localizan en el municipio de Matehuala, San Luis Potosí,

México. Dichos sitios son cercanos al distrito minero de Santa María de la Paz, en

Matehuala, San Luis Potosí, donde han sido extraídos sulfuros polimetálicos tipo

skarn (Pb-Zn-Ag-Cu-Au) por más de 200 años, estos minerales generalmente

están asociados con impurezas de arsénico. Previamente se ha reportado un alto

grado de contaminación por arsénico atribuido a la dispersión fluvial de desechos

de la mina a través de arroyos, a la dispersión eólica de relaves y las emisiones de

partículas de una antigua fundidora (Castro, 1995; Castro et al., 1997; Razo et al.,

2004; Martínez-Villegas et al., 2013). Además se propuso que en la columna de

agua de los sitios CB y CT la movilidad del arsénico está controlada por la

precipitación y disolución de arseniatos de calcio (Martínez-Villegas et al., 2013).

Cabe destacar que en el área de estudio la abundancia de arsénico también

podría deberse a la meteorización de minerales presentes naturalmente (Razo et

al., 2004).

 

4.1.2 Muestreo de sedimentos, agua de poro y columna de agua  

 

Los sedimentos CB y CT se homogenizaron y se tamizaron (malla 1.7 mm) dentro

de una cámara de anaerobiosis. El agua de poro de los sedimentos fue extraída a

partir de la centrifugación de 200 g de sedimento a 10500 g durante 30 minutos, el

líquido que se obtuvo se filtró empleando filtros Millipore de 0.22 μm y se acidificó

con HNO3 0.1N hasta alcanzar un pH = 4.0. También se tomaron muestras de

agua superficial de los dos sitios de muestreo (un total de 1 a 2 L), en frascos de

polipropileno o frascos de vidrio ámbar de 200 mL con tapa recubierta con teflón

   

23

Materiales y métodos

24

 

 

 según se requería para cada análisis, los contenedores fueron previamente

lavados con HNO3 (10% v/v). Para el análisis de la composición elemental las

muestras fueron acidificadas con HNO3 (pH <2). Se realizó la caracterización

fisicoquímica del sedimento, el agua intersticial y la columna de agua de ambos

sitios de muestreo, los análisis se desglosan en la sección 4.4.

 

4.1.3 Reactivos  

 

Para los experimentos se utilizaron como aceptores de electrones arseniato de

sodio heptahidratado (Na2HAsO4·7H2O, 99.9%, Sigma Aldrich, CAS: 10048-95-0)

y sulfato de sodio (Na2SO4, 99.2%, Fermont, CAS: 7757-82-6). Como donador de

electrones y fuente de carbono se usó ácido láctico 85% grado reactivo (Baker

Analyzed, CAS: 50-21-5).

Otros reactivos importantes que se usaron durante la etapa experimental

fueron: ácido acético glacial (ACS 99.8%, Fermont CAS: 64-19-7), sulfuro de sodio

(NaS·9H2O 99.2%, Fermont CAS: 1313-84-4) y Trióxido de arsenito As2O3 (Sigma

Aldrich, CAS: 1327-53-3).

 

4.1.4 Medios de cultivo  

 

Para todos los ensayos en lote de reducción microbiana de arsénico (V) y sulfato

se utilizó un medio basal representativo de agua subterránea (modificado de

Burton et al., 2013) que contenía: KCl 1 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 anhidro 1 mM,

NH4Cl 1 mM, KH2PO4 0.08 mM, se adicionó 0.1 mL/L de solución mineral de

Wolfe's (Anexo 1). Para ajustar el pH a 7.0 y 6.5 se utilizó de NaHCO3 (~24 y ~22

mM respectivamente). Dependiendo del ensayo se agregó además lactato como

fuente de carbono, sulfato de sodio y/o arseniato de sodio.

Para llevar a cabo la cuantificación del número más probable (NMP) de

bacterias reductoras de arseniato se usó un medio de cultivo con la siguiente

composición (modificado de Kuai et al., 2001): KH2PO4 1 mM, NH4Cl 4.7 mM, KCl

6.7 mM, CaCl2·2H2O 1 mM, NaCl 17 mM, MgCl2·6H2O 3 mM; el pH se ajustó a 6.8  

mediante la adición de NaHCO3 ~23 mM. Además se adicionó 0.1 mL/L de

solución mineral de Wolfe's (Anexo 1) y 0.025 g/L de extracto de levadura. Se

Materiales y métodos

25

 

 

 utilizó acetato 10 mM y lactato 5 mM como fuentes de carbono y arseniato 5 mM

como el aceptor de electrones.

   

4.2 Estrategia experimental  

En primer lugar se caracterizaron los sedimentos, el agua de poro y columna de

agua del sitio de muestreo. En segundo lugar se llevaron a cabo los ensayos en

lote o microcosmos para evaluar si la biota microbiana nativa presente en los 2-

sedimentos efectuaba reducción de SO4 al proporcionar sulfato y materia  

orgánica al medio (Tabla 4.1). Posteriormente se realizaron ensayos para evaluar   2-

la actividad sulfato-reductora en presencia tanto de SO4 como de As(V), con el  

objetivo de observar la competencia entre el sulfato y As(V) como aceptores de

electrones (Tabla 4.2). También se efectuaron ensayos en lote para determinar la

actividad microbiana sulfato-reductora y arseniato-reductora de cada uno de los

sedimentos (Tabla 4.3).

En las tablas se muestran los componentes de cada ensayo y sus

respectivos controles, se determinó la actividad endógena de los sedimentos, es

decir, la actividad microbiana sin la adición de un aceptor o donador de electrones

externo. Todos los ensayos se realizaron por triplicado en medio de cultivo basal.

Los detalles de preparación de cultivos se muestran en la sección 4.3.3.

Cabe aclarar que las condiciones bajo la cuales se realizaron los

experimentos en ningún momento pretendían reproducir las condiciones originales

de los sitios de muestreo. Estos ensayos se realizaron bajo condiciones

anaerobias las cuales son propicias para poder observar las actividades biológicas

de interés: sulfato-reducción y arseniato-reducción.

Materiales y métodos

26

 

 

4

4

 

Tabla 4.1. Ensayos en lote para evaluar la actividad microbiana sulfato-reductora de los sedimentos.

 Ensayo Sedimento Lactato SO 2-

 

Sulfato-reducción Aceptor de electrones endógeno - Donador de electrones endógeno - Control endógeno - - Control estéril (Abiótico)

Adicionado, - no adicionado  

Tabla 4.2 Componentes de los ensayos en lote para evaluar la reducción microbiana de 2-

SO4 en presencia de As(V).  

Ensayo Sedimento Lactato As(V) SO 2-

Reducción de arseniato y sulfato Sulfato-reducción - Donador de electrones endógeno - Donador de electrones endógeno 2- - - (c/ SO4 ) Control estéril (Abiótico)

Adicionado, - no adicionado  

 Tabla 4.3 Componentes de los ensayos en lote para evaluar la reducción microbiana de 2-

SO4 en combinación con la reducción de As(V).  

Ensayo Sedimento Lactato As(V) SO 2-

4

Reducción de arseniato y sulfato Aceptor de electrones endógeno - - Donador de electrones endógeno - Inhibición de sulfato-reducción (c/MoO 2- 25 mM) 4 Control endógeno

 

 

-

 

-

 

- Control estéril (Abiótico) Control químico -

Adicionado, - no adicionado  

  

Finalmente se caracterizaron los precipitados biogénicos formados en los

cultivos y se realizó la estimación del número más probable de bacterias

reductoras de arsénico en los sedimentos. En la Figura 4.1 se muestra un

resumen del diseño experimental.

Materiales y métodos

27

 

 

4

    

Obtención y

E caracterización de

t sedimentos a p a Valoración de la 1

actividad reductora microbiana

Análisis fisicoquímico de sedimentos, agua de poro y columna de agua

   

Actividad reductora de SO 2-

Actividad reductora de As(V)

      

E Evaluación del efecto de la t

a materia orgánica y sulfato- p reducción en la a especiación de arsénico 2

Ensayos en lote con o sin adición de un donador de electrones externo.

   

Ensayos en lote con o sin adición de un aceptor de electrones 2- externo (As(V) y/o SO4 )

    

   

E Recuperación de t precipitados minerales y a análisis microbiológico de p la comunidad microbiana a 3

Caracterización de minerales biogénicos EDS-MEB Difracción de rayos X

  

Análisis de la comunidad microbiana Determinación de número

más probable Morfología celular

 

  

Figura 4.1 Esquema simplificado de la estrategia experimental.  

   

4.3 Métodos   

4.3.1 Caracterización fisicoquímica de sedimentos, agua de poro y columna de agua

 La caracterización consistió en la medición de pH, potencial redox, carbono

orgánico total (COT), sólidos volátiles, fijos y totales, concentración de sulfato,

Materiales y métodos

28

 

 

 concentración de arsénico total, determinación de la composición elemental y

determinación de fases cristalinas presentes en el sedimento (los métodos se

detallan en la sección 4.4).

 4.3.2 Ensayos en lote  

En todos los ensayos en lote se usaron botellas serológicas de 125 mL cuyo

volumen de trabajo se ajustó a 120 mL con inóculo (sedimento 10% p/v) y con

medio basal, de esta forma en cada botella solo quedó libre un espacio de cabeza

mínimo (~5 mL). Dependiendo del ensayo el medio basal se suplementó con el

donador de electrones (lactato) y los aceptores de electrones correspondientes

(sulfato y/o arseniato). Las botellas se sellaron con tapones de goma y anillos de

aluminio. Todo el proceso se efectuó dentro de una cámara de anaerobiosis

(atmósfera N2/H2 95/5 v/v; 14,500 Coy), una vez concluida la preparación de

botellas se intercambió la atmósfera de cada una con N2/CO2 (80/20 v/v) para

garantizar condiciones anóxicas. Posteriormente, las botellas se incuban a 30 ±2

°C en la obscuridad y sin agitación.   

4.3.2.1 oración de la actividad sulfato-reductora de los sedimentos   

Dependiendo del experimento (Tabla 4.1), la actividad sulfato-reductora de los

sedimentos se determinó adicionando a los ensayos 10 mM de lactato y/o 10 mM

de sulfato (Saalfield & Bostick, 2009); el pH inicial en estos ensayos se ajustó a

7.5. Cada 5 días se tomaban 2 mL de muestra para hacer las determinaciones de

sulfato, lactato y acetato. De igual forma cada 5 días se determinaba la

concentración de sulfuro disuelto en los ensayos.

 

4.3.2.2 Valoración de actividad microbiana sulfato-reductora y arseniato- reductora

 Para determinar la capacidad reductora de arseniato y sulfato de acuerdo a los

requerimientos del ensayo (Tabla 4.2 y Tabla 4.3) se adicionó al medio de cultivo

basal lactato (10 mM), As(V) (10 mM) y sulfato (10 mM) (Liu et al., 2004; Saalfield

& Bostick, 2009). Además con el objetivo de distinguir si la reducción de arsénico

Materiales y métodos

29

 

 

 se debía únicamente al sulfuro producto de la reacción de sulfato-reducción se

evaluó un tratamiento con lactato, As(V) y sulfato pero con adición de molibdato 2-

(MoO4 ) 25 mM, en este rango de concentración este último inhibe la actividad  

sulfato-reductora (Patidar & Tare, 2005). Adicionalmente, en este conjunto de

ensayos se llevó a cabo un control químico (sin inóculo) para descartar la

posibilidad de que la reducción de As(V) fuera debida solo a reacciones químicas.

Cada uno o dos días se colectaron 4 mL de muestra de las botellas, se midió el pH

y posteriormente las muestras se centrifugaron y filtraron para determinar la

concentración de lactato, acetato y sulfato; después de 10 días de incubación las

muestras se tomaban cada 5 días (Hoeft et al., 2004; Al Lawati et al., 2013). El

sulfuro disuelto se determinó inmediatamente después de tomar la muestra

directamente de la botella de acuerdo a la técnica descrita por Cord-Ruwisch

(1985). También se determinó el arsénico total y para las cinéticas de especiación

de arséncico se cuantificó la concentración de As(III) y As(V) (los métodos

analíticos se describen en la sección 4.4).

 

4.3.3 Recuperación y preparación de precipitados minerales  

 

Los cultivos con formación de precipitados se abrieron dentro de una cámara de

anaerobiosis (14,500 Coy) y a continuación con una pipeta Pasteur se extrajo una

mezcla de precipitado con medio de cultivo y se colocó en tubos eppendorf de 2

mL, los cuales se centrifugaron a 12,000 rpm durante 10 min; luego se sustituyó el

medio por agua desionizada libre de oxígeno se repitió el proceso de

centrifugación y finalmente el pellet se secó a 32 °C. La muestra seca se pulverizó

en un mortero de ágata para su posterior caracterización.

 

4.3.4 Determinación de As(III) y As(V)  

 

El seguimiento de las concentraciones de As(III) y As(V) presentes en los cultivos

en lote se efectuó por medio de cromatografía de intercambio aniónico utilizando

una resina aniónica Dowex base fuerte 1x8, con grupos Cl- y tamaño de malla

100–200 (Sigma Aldrich CAS: 69011-19-4). El As(III) y el As(V) se separan

cuando este último es retenido en la resina de intercambio aniónico, esto debido a

Materiales y métodos

30

 

 

 que las constantes de disociación (pKa1) para As(III) y As(V) son 9.22 y 2.20

respectivamente, por lo que el As(III) se presentará como especie neutra en un

rango de pH circumneutral (4-8), mientras las especies de As(V) tendrán carga

negativa en el mismo intervalo de pH (Higashidani et al., 2014).

En primera instancia 9.3 g de resina se acondicionaron con NaOH 1M y

después ésta se empacó en un tubo cromatográfico (PIREX de 30 cm de altura

por 1.4 cm de diámetro interno), a continuación se intercambiaron los grupos Cl-

de la resina por grupos acetato mediante la adición de 20.5 mL de CH3COOH 1 M.

Después de la adición de cada reactante la resina se lavó con agua desionizada

(~60 mL). Una vez preparada la resina, se adicionaron 20.5 mL de muestra

previamente filtrada (0.22 µm) y acidificada hasta pH 5, posteriormente se adicionó

agua desionizada libre de oxígeno (25 mL) para arrastrar el As(III), como eluyente

para recuperar el As(V) se adicionaron 41 mL de HCl 0.5 M (Ficklin, 1983; Escot-

Espinoza, 2014, Higashidani et al., 2014). Las muestras tratadas tanto de As(V)

como As(III) se aforaron a 50 mL y se acidificaron para determinar el contenido de

arsénico total. Estas fueron analizadas por duplicado.

Cabe destacar que previamente al análisis de muestras de cultivos se

efectuaron pruebas con soluciones estándar de As(III) y As(V) preparadas a

concentraciones conocidas (Tabla 4.4).

  

Tabla 4.4. Pruebas de especiación de arsénico por cromatografía aniónica.  

 

Muestra   Muestra I (mg/L) Muestra II (mg/L) Desviación estándar

Estándar de As(III) (10 ppm) As total   10.98 9.56 1.01 As(III)   11.17 9.02 1.52 As(V)   0.10 0.07 0.02 Estándar As(V) 12 ppm + As(III) 12 ppm    As total 24.22 22.92 0.92 As(III) 12.51 10.20 1.63 As(V) 12.83 12.57 0.18

Materiales y métodos

31

 

 

 4.3.5 Determinación del número más probable

 

 

La concentración de células viables puede estimarse por el número más probable

(NMP). Este método consiste en un protocolo de enumeración para bacterias con

una característica metabólica específica, a grandes rasgos se efectúan diluciones

sucesivas y replicadas de un cultivo en un medio de crecimiento y se hace un

conteo de la fracción de tubos que muestran resultado positivo.

Para determinar el NMP de bacterias reductoras de arsénico en los

sedimentos, primeramente se pesó 1g de sedimento y se diluyó en 9 mL de agua

reducida (libre de O2), a partir de esta mezcla se realizaron diluciones sucesivas

(10-2 a 10-10), colocando 1 mL de la dilución previa en 9 mL de agua reducida  

estéril contenida en botellas serológicas de 12 mL y con atmósfera de N2/CO2

(80/20). De cada una de las diluciones sucesivas se inoculó 1 mL, por triplicado,

en botellas serológicas de 12 mL que contenían 9 mL de medio para cuantificación

del NMP estéril (sección 4.1.4) y con atmósfera de N2/CO2 (80/20). Los cultivos

se incubaron por 30 días a 30 ± 2°C. Una vez trascurrido el tiempo de incubación

el procedimiento para determinar si había ocurrido o no la reducción de As(V) en

cada botella fue el siguiente: las botellas se acidificaron inyectando 100 µL de HCl

1N y posteriormente se les adicionó sulfuro (1 mL) de una solución stock 15 mM

para alcanzar una concentración de sulfuro en la botella de 1-1.5 mM. La

formación casi inmediata de un precipitado amarrillo se tomó como un resultado

positivo (Kuai et al., 2001). Se realizó un control negativo (medio NMP sin inóculo)

el cual también se sometió a la prueba. Para el cálculo del número más probable

de microorganismos se utilizaron las tablas proporcionadas en el reporte

Techniques of Water-Resources Investigations of the United States Geological

Survey (1989), Capítulo A4.

Materiales y métodos

32

 

 

 4.4 Análisis químicos

 4.4.1 Cuantificación analítica de elementos en sedimentos y muestras de

cultivo  

Los elementos presentes en sedimentos, precipitados minerales y muestras

líquidas se determinaron en un equipo de espectroscopia de plasma de

acoplamiento inductivo sincronizado con un espectrofotómetro de emisión óptico

ICP-OES (Varian 730-OES). Las muestras líquidas se filtran (0.22 µm) y acidifican

con HNO3 concentrado, los sedimentos y precipitados se someten previo al

análisis a digestión ácida con agua regia (HCl y HNO3 relación 3:1). Se determinó

la presencia de azufre, arsénico, calcio, sodio, hierro, potasio, magnesio,

manganeso, fosforo, molibdeno, níquel, plomo, silicio, litio, cadmio, zinc etc.

 

4.4.2 Microanálisis morfológico y elemental   

Para conocer la morfología superficial y composición elemental de los sedimentos

y minerales biogénicos, se efectuaron análisis por microscopía electrónica de

barrido (MEB, FEI-QUANTA 2000) acoplada a un sistema de espectroscopia de

energía dispersiva (EDS; EDAX, Mod. DX4).

Para el análisis EDS-MEB se utilizan pines de aluminio y sobre estos se

coloca cinta adhesiva de carbono (~0.5x0.5 cm) y esta se cubre con muestra

pulverizada, posteriormente la muestra montada se recubre con polvo de oro para

aumentar la conductividad (Recubridora-Au/Pt, Cressington Sputter Coater 108

auto).

 

4.4.3 Mineralogía de precipitados biogénicos y sedimento  

 

Las fases minerales presentes en el precipitado y sedimentos se determinaron

mediante un difractómetro de rayos X Bruker D8 Advance con una fuente de

radiación Kα de Cu, un barrido en el ángulo 2 theta de 10 a 80, aplicando un

tamaño de paso de 0.02°, un tiempo en cada paso de10 s. Aproximadamente 0.5

g de muestra previamente seca y pulverizada en un mortero de ágata se colocaron

en un porta muestras de aluminio sobre el cual se hace incidir el haz de radiación.

La identificación de fases se realizó comparando los difractogramas de cada

Materiales y métodos

33

 

 

 muestra con patrones estándar de fases minerales de la base de datos ICCD

(International Center for Diffraction Data).

 

4.4.4 Cuantificación de la concentración de arsénico total  

 

Se dio seguimiento a la concentración de arsénico en los cultivos a partir de

espectrometría de absorción atómica de flama (Varian Spectra Mod. AA 240FS),

la configuración del instrumento fue: longitud de onda 193.7 nm, anchura de

rendija 0.5 nm, corriente de lámpara 10.0 mA, corrección de fondo C. El tipo de

llama fue Aire/Acetileno (flujo de Aire: 13.50 L/min, flujo de acetileno: 2.45 L/min).

Para el análisis se utilizó un volumen de 25 o 50 mL de muestra la cual, se

preparó haciéndose pasar por un filtro de 0.45 µm y posteriormente se acidifico

con HCl 1 M.

 

4.4.5 Cuantificación de la concentración de sulfato, lactato y acetato   

El sulfato, lactato y acetato se cuantificaron mediante comparación con estándares

de alta pureza usando un equipo de electroforesis capilar Agilent 1600ª

(Waldbronn, Germany). El equipo cuenta con una columna capilar de sílica fundida

(Agilent, id =50 μm, L=80.5 cm, longitud efectiva =72 cm). El voltaje aplicado fue

de -25 kV y la temperatura en el capilar 20 °C. La solución de corrida fue un buffer

básico de aniones (Agilent, pH = 12.1). La determinación de analitos se realizó

mediante detección indirecta UV usando un detector de arreglo de diodos. La

señal de longitud de onda fue de 350 nm con una referencia a 230 nm. Las

muestras se centrifugaron (12,000 rpm por 5 minutos) y se filtraron en membrana

millipore de 0.22 μm.

 

4.4.6 Cuantificación de carbono orgánico, inorgánico y total  

 

El carbono se determinó en muestras de la columna de agua, agua intersticial y

sedimento. Para este análisis se empleó un analizador de carbono orgánico total

(TOC-VCSN/TMN-1, Shimadzu), el cual, para muestras líquidas utiliza un detector

de carbono total que emplea un método de oxidación catalítica a 680 °C y usa aire

como gas acarreador.

Materiales y métodos

34

 

 

 La muestra se filtró en membranas de nitrocelulosa Millipore de 0.22 μm y

se colocó en viales de vidrio de 24 mL. Para muestras sólidas se cuantificó el

carbono total para lo cual, se usó un módulo muestreador de sólidos SSM-5000A,

Shimadzu, en el cual la oxidación se realiza a una temperatura de 900 °C. Para tal

fin se colocaron 0.5 g de muestra previamente seca (105 ºC por 12 horas) en

cápsulas de porcelana.

 

4.4.7 Cuantificación del sulfuro por el método Cord-Ruwisch  

 

Se adicionaron 4 mL de una solución compuesta por sulfato de cobre (5 mM) y

HCl (50 mM) en tubos Hach, consecutivamente con una jeringa de 1 mL se

agregaron 0.1 mL de muestra y se agitaron en un vortex por 3 segundos,

enseguida se midió la absorbancia en un espectrofotómetro (Thermo Spectronic) a

una longitud de onda de 480 nm (Cord-Ruwisch, 1985). La curva de calibración se

efectuó con sulfuro de sodio en un intervalo de 0 a 20 mM. La concentración de

sulfuro se reportó en mmol/L.

 

4.4.8 pH  

 

Inmediatamente después del muestreo, en el laboratorio se determinó el pH en el

sedimento, agua de poro y columna de agua. Para realizar la medición de pH en

sedimento se colocaron 10 g de éste en 50 mL de agua desionizada y se pusieron

agitación, posteriormente la suspensión se dejó sedimentar por 30 minutos.

Durante el desarrollo de los ensayos en lote también se dio seguimiento al pH.

Las mediciones del pH se realizaron con un potenciómetro marca Thermo

ScientificTM OrionTM Versastar A211 equipado con un electrodo 8302BNUMD

ROSS Ultra Triode glass-body pH/ATC.

 4.4.9 Potencial óxido-reducción  

Las mediciones se efectuaron con un equipo Thermo ScientificTM OrionTM

Versastar A211 equipado con un electrodo (Redox/ORP Thermo Scientific), para

calibrar el electrodo se utilizó una solución estándar (ORP Estandar, Orion

Application solution, 967901, Thermo Electro corporation, 30 °C, +415 mV.

Materiales y métodos

35

 

 

 El ORP de los sedimentos y columna de agua se midió en el laboratorio

aproximadamente 4 horas después del muestreo, los recipientes que contenían la

muestra permanecieron herméticamente cerrados y la medición se efectuó en una

cámara de anaerobiosis.

 

4.4.10 Determinación de sólidos totales, fijos y volátiles   

La concentración de sólidos totales fijos y volátiles fue determinada en los

sedimentos y en la columna de agua. Los sólidos totales (ST) se determinaron

conforme el método gravimétrico de evaporación y secado de muestra a 105 ºC;

los sólidos volátiles (SV) hacen referencia a la cantidad de sólidos que se

volatilizan por el efecto de la calcinación a 550 °C. Estas determinaciones se

llevaron a cabo conforme a lo establecido en los métodos estándar (Standard

Methods for Examination of Water and Wastewater APHA, 1998).

 

4.4.11 Medición de alcalinidad en columna de agua   

La alcalinidad en la columna de agua de los sitios donde se colectó el sedimento

se determinó in situ con un kit portátil (titulador digital HACH 1690001). Para esto

se colocaron 25 mL de muestra en un matraz Erlenmeyer de 125 ml, la muestra se

tituló con HCl 1.6 N grado estándar incluido en el kit hasta que la solución cambió

de color transparente a color rosado. Para el cálculo del valor de alcalinidad se

utilizó la siguiente ecuación:

  

(Ec. 4.1)    

Dónde:  

A= mL de ácido estándar utilizados

N= normalidad del ácido

Materiales y métodos

36

 

 

4

4 4

 4.5 Cálculos

 4.5.1 Balance general de electrones

  

Para efectuar los balances de electrones se tomaron en cuenta las siguientes

consideraciones (Rittmann & McCarty, 2001):

  La estequiometría del metabolismo sulfato-reductor y arseniato-reductor

utilizando como donador el lactato obedece las siguientes reacciones

respectivamente (Newman et al., 1997, Liamleam & Annachhatre, 2007). - 2- - - - +

2 C3H5O3 + SO4 2 C2H3O2 + 2 HCO3 + 0.5 HS + 0.5 H2S+ 0.5 H Reacción 4.1 - 2- - + - -

C3H5O3 + HAsO4 + H2AsO4 + 2H 2H3AsO3 + HCO3 + C2H3O2

Reacción 4.2  

Un mol de lactato que se oxida completamente hasta dióxido de carbono rinde

12 equivalentes reductores. - - + -

C3H5O3 + 4 H2O 2 CO2 + HCO3 + 12 H + 12 e Reacción 4.3  

 

La oxidación incompleta de lactato hasta acetato dona 4 equivalentes

reductores. - - + -

C3H5O3 + H2O C2H3O2 + CO2 + 4 H + 4 e Reacción 4.4  

 

La oxidación completa de 1 mol de acetato resulta en 8 equivalentes

reductores. - - + -

C2H3O2 + 3 H2O CO2 + HCO3 + 8 H + 8 e Reacción 4.5   

La reducción de 1 mol de SO 2-

 

hasta H2S requiere 8 equivalentes reductores y 2- + - -

SO4 + 9.5 H + 8 e 0.5 HS + 0.5 H2S+ 4 H2O Reacción 4.6  

 

La reducción de 1 mol de As(V) a As(III) requiere 2 equivalentes reductores.  

0.5 HAsO 2-

 

+ 0.5 H2AsO -+ 3.5 H+

 

+ 2 e-

 

H3AsO3 + H2O Reacción 4.7

Materiales y métodos

37

 

 

4

 A continuación se presentan los cálculos realizados para estimar los

miliequivalentes de electrones (meqv. e-):

 1. Se calcularon los miliequivalentes de electrones (meqv e-) donados, estos

corresponden al lactato consumido durante el experimento (concentración mmol/L)

multiplicado por los 12 meqv e- que rinde la oxidación completa de 1 mmol de

lactato.

 

(Ec. 4.2)

2. Se calcularon los meqv e- recuperados a partir del acetato producido por la

oxidación incompleta de lactato.

(Ec. 4.3)   

3. Se calcularon los meqv e- recuperados por la reducción de As(V) a As(III) como

resultados de la arseniato-reducción.  

 

(Ec. 4.4)

4. Se calcularon los meqv. e- recuperados por la reducción de SO 2-

 

producto de la sulfato-reducción.

a H2S como

 

 

 

(Ec. 4.5)

 

 

Finalmente se sumaron los meqv e- recuperados o aceptados y se dividieron

entre el total de meqv e- donados y de esta forma se obtuvo la fracción de

recuperación de electrones, un valor de 1 indica la recuperación de 100% de los

electrones invertidos.

Resultados y discusión 

 5. Resultados y discusión

 

 

5.1 Caracterización fisicoquímica de sedimentos, agua de poro y columna de agua

 Los resultados de la caracterización de los sedimentos que se usaron como

inóculo se describen a continuación. En la Figura 5.1 se muestra la mineralogía de

los sedimentos, las principales fases cristalinas identificadas en el sedimento del

sitio identificado como Cerrito Blanco (CB) son calcita, yeso y cuarzo; mientras

que en la muestra del sedimento recuperado del sitio Club de Tiro (CT) se observa

solamente calcita y cuarzo. La composición mineralógica encontrada en CB es

consistente con lo reportado previamente para sedimentos de dicho sistema

hidráulico (Razo et al., 2004).

  

Figura 5.1 Composición mineralógica de los sedimentos: a) Cerrito Blanco, b) Club de Tiro. C: calcita; Q: cuarzo; Gy: yeso.* picos de difracción de mayor intensidad.

  

38

Resultados y discusión

39

 

 

 El difractograma del sedimento CB (Fig. 5.1a) muestra los picos de

difracción de mayor intensidad en los valores del ángulo 2 theta 20.92, 31.30 y

29.3. Para la muestra CT (Fig. 5.1b) los picos de reflexión de mayor intensidad se

localizan en 29.3 y 26.78 (los patrones de difracción fueron comparados con las

cartas cristalográficas: 21-0816, 72-0596 yeso, 75-0443 cuarzo, 27-0029 y 72-

4582 calcita.  

  

Por otra parte, el análisis morfológico y elemental a partir de EDS-MEB

mostró que en CB además de carbono y oxígeno también se encontró azufre y

calcio (Fig. 5.2), a diferencia de lo que se obtuvo para la muestra CT en donde los

elementos detectados fueron silicio y calcio (Fig. 5.3); ambos resultados son

consistentes con la mineralogía determinada por difracción de rayos X, que

consiste principalmente de yeso y calcita en CB (Fig. 5.1a) y calcita y cuarzo en

CT (Fig 5.1b). Cabe mencionar que en CT se detrminó la presencia de hierro.

  

 

 Figura 5.2 Micrografía electrónica de barrido y análisis EDS del sedimento Cerrito Blanco (CB).

Resultados y discusión

40

 

 

 

 

Figura 5.3 Micrografía electrónica de barrido y análisis EDS del sedimento Club de Tiro (CT).

 Con el objetivo de respaldar la información anterior y considerando que el análisis

EDS-MEB es cualitativo, los sedimentos de CB y CT se sometieron a digestión

ácida (HNO3/HCl 1:3) para realizar un análisis elemental por ICP-OES. En la

Figura 5.4 se puede observar que el elemento más abundante, sin considerar el

carbono y el oxígeno en ambos sedimentos fue calcio (6,185.3 ±381.6 y 6,759.0

±154.5 mg/kg de sedimento para CB y CT respectivamente), el segundo elemento

en orden de abundancia en la muestra de sedimento CB fue azufre (3,264.5 ± 10.5

mg/kg de sedimento), mientras que en CT fue el aluminio (4553.4 ± 302.7 mg/kg

de sedimento) seguido de hierro (2,610.1 ± 140.9 mg/kg de sedimento). El

sedimento CT presenta silicio tanto en el análisis de difracción de rayos X como en

el análisis EDS-MEB. De forma contradictoria, no se encontró silicio en el

sedimento por el análisis ICP-OES. Sin embargo, sí se encontró en la columna de

agua, en CB hubo una concentración de silicio de 116 mg/L y en CT de 188 mg/L;

mientras que en el agua de poro en CB hubo 33.55 mg/L y en CT 17.72 mg/L, la

presencia de silicio en la fase acuosa podría estar relacionada la disolución de

silicatos amorfos.

Resultados y discusión

41

 

 

 Adicionalmente en la Figura 5.4 se puede verificar que en menor proporción

(<700 mg/kg de sedimento) ambos sedimentos contienen arsénico, magnesio,

sodio y manganeso. De tal forma que en estos sedimentos especies oxidadas de

S, Fe, Mn y As podrían fungir como potenciales aceptores de electrones. El resto

de los elementos que se cuantificaron (P, Pb, K, Cd, Cr, Cu, Zn, Li, Ag, Ni, Sn)

presentaban concentraciones por debajo de los 100 mg/kg.

  

Figura 5.4. Análisis de la composición elemental de columna de agua, sedimentos y agua de poro por ICP-OES

 En la Figura 5.4 también se puede observar la composición elemental

determinada en la columna de agua y en el agua de poro o agua intersticial, la

composición de esta última es importante ya que representa la fracción de

elementos que eventualmente están más biodisponibles a los microorganismos,

debido a que contiene los componentes que eventualmente se están

disolviendode la fase sólida (Burton et al., 2013). Cabe destacar que la proporción

de calcio y sodio fue considerablemente mayor en la columna de agua que en el

agua de poro, por otro lado no se encontró hierro disuelto en la fase líquida lo que

Resultados y discusión

42

 

 

 coincide con reportes previos, los cuales destacan la pobre presencia de hierro en

en los sitios de muestreo (Martínez-Villegas et al., 2013).

En la Tabla 5.1 se desglosan otros parámetros fisicoquímicos determinados

en los sedimentos. Se puede constatar que la concentración de arsénico en el

sedimento CB fue de 105.09 ±5.45 mg/kg y en CT fue de 629.98 ±30.10 mg/kg; en

un estudio y muestreo del complejo hidráulico Cerrito Blanco, Razo y

colaboradores (2004) reportan concentraciones de arsénico en sedimentos desde

410 hasta 1,432 mg/kg, el valor encontrado en la muestra de CB fue inferior, no

obstante, puede haber fluctuaciones y cambios en la concentración dependiendo

del punto específico y la temporada de muestreo. Por su parte Castillo y

colaboradores (2015) determinaron concentraciones de arsénico en el sedimento

Club de Tiro en un intervalo de 261 a 1753 mg/kg, la concentración determinada

en este estudio está dentro de dicho intervalo.

  

Tabla 5.1 Parámetros fisicoquímicos ensayados en los sedimentos que se usaron como inóculo. Se muestran los valores promedio (a n = 3 y b n=2) y la desviación estándar (±).

 

 Parámetro Cerrito Blanco Club de Tiro pH 8.5 8.4 Eh (mV) -97.4 -81.4 Sólidos totales (ST %) 55.3 ± 0.77a 44.7 ±0.26a

Sólidos volátiles (SV %) 12.4 ±0.06a 6.5 ±0.05a

Sólidos fijos (SF %) 42.9 ±0.84a 38.2 ±0.22a

Carbono total (mg/g) 12.25 ±0.50a 31.83 ±3.67a

Arsénico total (mg/kg) 105.09 ±5.45b 629.98 ±30.11b

Azufre (mg/kg) 3264.16 ±10.51b 1221.27 ±166.33b

En la Tabla 5.1 también se puede observar que ambos sedimentos son

ligeramente alcalinos (pH 8.5 y 8.4), lo que era de esperarse ya que la geología

del sitio consiste de minerales con capacidad neutralizante (p.ej. calcita). Se

encontró una proporción alta de carbono total siendo mayor para el sedimento CT;

en contraste el porcentaje de sólidos volátiles que representa la materia orgánica

fue mayor para CB.

Resultados y discusión

43

 

 

4

En la Tabla 5.2 se enlistan los parámetros determinados en la columna de

agua y el agua de poro. En CB se encontró que la concentración de arsénico es

mayor en el agua de poro, lo que podría significar la liberación de arsénico de la

fase sólida por lo que se acumula en el agua de poro (Burton et al., 2013). Lo

anterior resulta factible ya que eventualmente podría ocurrir la disolución de

minerales que contienen arsénico, por ejemplo los arseniatos de calcio. Martínez-

Villegas y colaboradores (2013) realizaron un estudio del sistema hidráulico del

cual forman parte los sitios de donde se obtuvieron los sedimentos CB y CT y

concluyeron que el principal proceso que controla las concentraciones de arsénico

en la columna de agua es la precipitación y disolución de arseniatos de calcio, de

acuerdo a la siguiente reacción:

Ca5H2(AsO4)4 ·cH2O + 2 H+ 5 Ca2+ + 4 HAsO 2- + cH2O (Ksp 10 -13.63)

 

Reacción 5.1

Por otro lado en como ya se mencionó dentro de las fases minerales que

conforman el sedimento CB esta el yeso el cual es un mineral altamente soluble

cuya disolución podría contribuir a las altas concentraciones de arsénico en el

agua de poro a través de la disolución de arseniatos de calcio co-precipitados con

el yeso (p. ej. Farmacolita) (Rodríguez-Blanco et al., 2007). En el sedimento CT no

se observó el mismo efecto pues hay una concentración similar de arsénico tanto

en la columna de agua y el agua de poro (~48 mg/L), en CT se identificó calcita

con la cual púede estar asociado el arsénico en la fase sólida, y la calcita tiene

una menor solubilidad en comparación con el yeso (Romero et al., 2004;

Alexandratos et al., 2007).  

En ambos sedimentos se encontró una mayor proporción de carbono

orgánico total (COT) en el agua de poro. La mayor presencia de COT en el

sedimento y agua de poro se puede deber al metabolismo microbiano en el

sedimento, principalmente la descomposición de materia orgánica y biomasa

(Castelle et al., 2013).

Resultados y discusión

44

 

 

 

Tabla 5.2 Parámetros fisicoquímicos del agua de poro de los sedimentos y de la columna de agua. Se muestran los valores promedio (n=2) y la desviación estándar (±). Únicamente la alcalinidad se determinó in situ.

 

 Cerrito Blanco Club de Tiro

Parámetro Columna de Agua de Columna de Agua de agua poro agua poro pH 8.2 8.2 7.8 7.7 Eh (mV) -78.4 -80.3 -57.2 -46.8 Alcalinidad (mg CaCO3/L) ST (mg/L)

180 2495 ±42.4

- -

312 3048.5 ±19.09

- -

SVT (mg/L) 424 ±93.3 - 624 ±50.9 - SFT (mg/L) 286 ±156.9 - 2424.5 ±31.8 - COT (mg/L) 2.2 ±0.33 16.7 ±1.2 4.11 ±1.62 18.59 ±2.8 CI (mg/L) 0.99 ±0.50 2.7 ±0.03 1.5 ±0.69 2.0 ±0.30 CT (mg/L) 3.2 ±0.81 19.3 ±1.0 5.6 ±0.30 20.6 ±3.2 Sulfato disuelto (mg/L) 1594.7 ±18.4 1409.0 ±76.1 1718.4 ±13.3 1215.7 ±77.9Arsénico total (mg/L) 5.0 13.1 ±2.2 48.3 47.8 ±0.85

 

 

Pelallo-Martínez (2006) caracterizó los sitios Cerrito Blanco y Club de Tiro y

encontró para CB una concentración de arsénico en agua de poro en un intervalo

de 1.5 a 5.2 mg/L y en la columna de agua de 3.3 a 4.3 mg/L; para CT la

concentración de arsénico en el agua de poro fue de 21.3 a 60.2 mg/L y en la

columna de agua de 25 a 122.9 mg/L. Las concentraciones determinadas en el

presente estudio fueron ligeramente mayores para CB, en lo que concierne a CT

las concentraciones estuvieron dentro del intervalo reportado por los autores.

Los distintos sistemas geológicos contaminados con arsénico presentan

características bastante heterogéneas por lo que no es posible compararlos entre

sí. En estudios previos, se han reportado las características fisicoquímicas de

sedimentos contaminados con arsénico. Por mencionar un ejemplo, Drahota y

colaborares (2009) realizaron un estudio en una zona minera en República Checa,

tanto de la columna de agua, sedimento y agua de poro, las concentraciones de

arsénico fueron 32 a 449 mg/L (pH 8.2 y 7.7), 58 a 1193 mg/kg (pH 8.4 y 6.9) y 49

a 300 mg/L (pH 7.3 y 8.4), respectivamente; también determinaron

concentraciones de sulfato en la columna de agua que fueron de 87.7 a 141.9

mg/L (pH 7.6 y 7.7) y en agua de poro de 49.8 a 127.2 mg/L (pH 6.9 y 7.1).

Podemos apreciar que el intervalo de concentraciones de arsénico en los sitios

Resultados y discusión

45

 

 

 afectados varía ampliamente. De lo anterior se destaca la importancia de

considerar las características fisicoquímicas de los sitios cuando se realizan

estudios relacionados con procesos microbianos.

 5.2 Evaluación de la capacidad sulfato-reductora de la biota microbiana

nativa presente en los sedimentos   

Para corroborar la existencia de bacterias sulfato-reductoras en los sedimentos

estudiados y además comprender los aspectos que limitaban este proceso se

realizaron ensayos en microcosmos donde se cuantificó la producción de sulfuro,

consumo de sulfato, consumo de lactato, producción de acetato y pH. En la Figura

5.5 se muestran los resultados obtenidos en los ensayos donde se usó sedimento

CB como inoculo. En el panel a, destaca en primer lugar que se obtuvo mayor

producción de sulfuro cuando se adicionó una fuente de carbono externa (lactato

~10 mM), como era de esperarse. Además, se corroboró que había una fuente de

carbono endógena o propia del sitio ya que la producción de sulfuro no se

interrumpió cuando no se adicionó lactato (se produjeron 12.2 mM de H2S). Por

otra parte, la adición de sulfato no limitó el desempeño del proceso biológico de 2-

producción de sulfuro, ya que cuando éste se adicionó (ensayo con SO4 ) dicho  

proceso no se estimuló, comparando con el control endógeno (sin adición de

lactato y sin sulfato). Considerando la estequiometria de la reacción de sulfato-

reducción (reacción 2.4), sabemos que se produce 1 mol de sulfuro a partir de un

mol de sulfato consumido, en estos experimentos no se observó dicha

estequiometría, ya que en el tratamiento suplementado únicamente con lactato (10

mM) donde la concentración inicial de sulfato fue de 13.4 mM, se esperaba una

producción equivalente de sulfuro, sin embargo esto no se observó, ya que se

produjeron 21.8 mM de sulfuro y solo se registró el consumo de 7 mM de sulfato

(Figs. 5.5a y b). En el caso del ensayo con lactato y sulfato 10 mM se produjeron

20.1 mM de sulfuro y solo se verificó el consumo 15 mM de sulfato. Lo anterior se

podría explicar por la posible liberación de sulfato del sedimento hacia la fase

acuosa, esto debido a que el sedimento CB presentó una alta concentración de

azufre (3,264.16 ±10.5 mg/kg), además, la mineralogía de este sedimento consta

Resultados y discusión

46

 

 

 

a)

pH

S

ulf

uro

(m

M)

Lacta

to (

mM

)

Su

lfato

(m

M)

Aceta

to (

mM

)

 de yeso como uno de los principales componentes cuya disolución es factible ya

que tiene una alta solubilidad (2,600 mg/L en agua a 25 °C), e incluso en

sedimentos se ha encontrado que la producción de sulfuro a partir de yeso es

comparable con la producción por sales disueltas de sulfato (p. ej. Na2SO4); desde

luego se supone que la disolución de la fase sólida ocurre previo a la reacción de

sulfato-reducción, este proceso incluso se podría acelerar por la producción de

sustancias poliméricas extracelulares por los microorganismos (Kijjanapanich et

al., 2014).   

a) 27 b) 27

24 24 21 21 18 18 15 15 12 12

9 9 6 6 3 3 0 0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

            0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

c) 14

12

10

8

6

4

2

0

e) 8.0

 

7.8

           0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

d)14

12

10

8

6

4

2

0

           0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tiempo (d)  

2-

7.6 Lactato 10 mM +SO 4

10 mM

7.4 SO 2-10 mM (sin lactato)

4

7.2  

7.0  

6.8

   

 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tiempo (d)

Lactato 10 mM Control estéril Control endógeno

 

Figura 5.5. Perfiles de a) Producción de sulfuro, b) Consumo de sulfato, c) Consumo de lactato, d) Producción de acetato y e) pH, obtenidos en los ensayos en lote para evaluar la actividad sulfato-reductora utilizando como inóculo sedimento CB, la leyenda inferior muestra los reactantes suplementados en cada caso.

Resultados y discusión

47

 

 

3

3 3

3

 A partir de la oxidación total de un mol de lactato (12 equivalentes

reductores) se pueden obtener 1.5 moles de sulfuro (sulfato S6+ a sulfuro S2-), es

decir, con el consumo de 10 mM de lactato (Fig. 5.5c) podríamos tener como

máximo 15 mM de sulfuro. Sin embargo, por actividad endógena (control

endógeno) se obtuvo en promedio una concentración de 12 mM de H2S, entonces

es factible la obtención de concentraciones de sulfuro mayores a 20 mM cuando

se adiciona un sustrato externo, que es lo que se observó en los ensayos a los

que se les adicionó lactato (Fig. 5.5a). Aunque no se debe perder de vista que

gran parte de las bacterias sulfato-reductoras efectúan la oxidación incompleta de

lactato dando como resultado la producción de acetato, lo cual disminuye la

producción de sulfuro. En la Figura 5.5d, en los ensayos con lactato, se puede

apreciar un aumento en la concentración de acetato alrededor de 10 mM (día 5), el

acetato posteriormente disminuye hasta su consumo total, lo que apunta a la

existencia de bacterias oxidadoras de acetato. Cabe mencionar que múltiples

especies de bacterias sulfato-reductoras son metabólicamente incapaces de

utilizar el acetato, debido a que la reacción es poco favorable energéticamente,

este es el caso de la mayoría de las especies de Desulfobacterium (Liamleam &

Annachhatre, 2007).

Nótese que en todos los ensayos el pH disminuyó paulatinamente (Fig. 5.5e), aun

cuando la reacción de sulfato-reducción produce alcalinidad (HCO -). Como ya se

discutió en el sedimento CB hay disolución de yeso y la disolución de este mineral

puede causar la disminución del pH debido a que el Ca2+ liberado a la fase acuosa

reacciona con el bicarbonato (HCO -) y precipita como CaCO , liberando protones

que disminuyen el pH (Ca2+ + HCO - CaCO3 + H+) (Kijjanapanich et al., 2013).

 

 

A continuación se presentan los resultados de los ensayos inoculados con

sedimento CT. La Figura 5.6a demuestra que de forma contraria a los ensayos

con sedimento CB, los ensayos con sedimento CT no presentaron actividad

sulfato-reductora endógena y fue necesaria la adición de una fuente de carbono

para estimular la sulfato-reducción, aun cuando en este sedimento se encontró

una mayor proporción de carbono total (31.83 mg/g) posiblemente dicho carbono

Resultados y discusión

48

 

 

pH

S

ulf

uro

(m

M)

Lacta

to (

mM

)

Su

lfato

(m

M)

Aceta

to (

mM

)

 no se encuentra como una forma accesible a los microorganismos, ya que podría

estar en forma de sustancias húmicas que resultan complejas para biodegradarse

(Anawar et al., 2013). Por otro lado, considerando la alta concentración de

arsénico en CT los procesos microbianos de degradación de materia orgánica

compleja podrían estar inhibidos (Jackson et al., 2014), limitando con ello la

disponibilidad de sustratos simples para la comunidad sulfato-reductora (Liamleam

& Annachhatre, 2007). Adicionalmente es posible que el sulfato no esté en forma

accesible para los microorganismos.  

 

a) 16

14 12 10

8 6 4 2 0

 

           0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

 

b)16 14 12 10

8 6 4 2 0

 

           0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

c) 10 d) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

e) 8.0  

7.8  

7.6  

7.4  

7.2  

7.0  

6.8

 

         0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32           0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tiempo (d)

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tiempo (d)  

Lactato 10 mM + SO 2-

10 mM 4

SO 2-

10 mM (sin lactato) 4

Lactato 10 mM Control estéril Control endógeno

Figura 5.6. Perfiles de a) Producción de sulfuro, b) Consumo de sulfato, c) Consumo de lactato, d) Producción de acetato y e) pH, obtenidos en los ensayos en lote para evaluar la actividad sulfato-reductora utilizando como inóculo sedimento CT, la leyenda muestra los reactantes suplementados en cada caso.

Resultados y discusión

49

 

 

 En el ensayo suplementado sólo con lactato, sin adición de sulfato (Fig.

5.6a) se puede apreciar que se alcanzó una producción de sulfuro de 5.2 mM en

el día 5 con el aceptor de electrones endógeno, a diferencia de los ensayos en

donde se adicionó lactato y sulfato 10 mM que alcanzaron concentraciones de

sulfuro disuelto de hasta 14.2 mM a partir del día 20, en ambos casos la

producción de sulfuro fue aproximadamente equivalente al consumo de sulfato

(Fig. 5.6b), sin tomar en cuenta la concentración inicial de sulfuro que en promedio

fue de 2.1 mM. La eficiencia de remoción de sulfato disuelto medido al inicio del

experimento fue en promedio 82% para el ensayo con lactato y sulfato y de 100%

para el ensayo sólo con lactato. Entonces se puede decir que en el caso de los

ensayos inoculados con sedimentos CT la adición de sulfato resultó necesaria

para la comunidad sulfato-reductora. La poca disponibilidad de sulfato en el

sedimento CT se justifica si tomamos en cuenta que la concentración de azufre

(1221.3 ± 166.33 mg/kg) es ~3 veces menor que la concentración registrada en el

sedimento CB, lo que es consistente, ya que en CT no se encontró yeso dentro de

las fases minerales identificadas. No obstante, el yeso podría estar presente pero

en mucha menor proporción respecto a la calcita y el cuarzo que fueron las fases

identificadas en el sedimento CT. De igual manera que en CB en los ensayos que

mostraron actividad sulfato-reductora se registró el consumo total de lactato y

consumo del acetato producido (Figs. 5.6 c y d).

De lo observado en las Figuras 5.5 y 5.6 se puede concluir que el

sedimento CB tiene actividad sulfato-reductora endógena al tener una fuente de

carbono intrínseca biodisponible y abundante sulfato. En contraste, el sedimento

CT no presenta actividad endógena y requiere de la adición tanto del donador

como de aceptor de electrones para que la comunidad microbiana lleve a cabo el

proceso de sulfato-reducción. Reportes previos destacan la notable diferencia

entre la concentración de arsénico determinada en el sitio Cerrito Blanco respecto

al sitio Club de Tiro, ya que la concentración de arsénico en la columna de agua

del sitio Club de Tiro es en promedio ~7 veces mayor que en el sitio Cerrito

Blanco, aun cuando forman parte del mismo sistema hidráulico (Martínez-Villegas

et al., 2013), tal diferencia podría estar asociada a la actividad microbiana. Por

Resultados y discusión

50

 

 

 ejemplo, cuando las bacterias sulfato-reductoras están activas el sulfuro producido

puede precipitar con arsénico limitando la solubilidad de éste, y cuando dominan

procesos como la metanogénesis el arsénico se acumula en la solución (Kirk et

al., 2004).

Adicionalmente a estos resultados también se puede destacar el hecho de

que en los ensayos con sedimento CB, donde hay una concentración de arsénico

de 105.09 ± 5.45 mg/kg de sedimento, se observó una mayor actividad sulfato-

reductora que en los ensayos con sedimento CT, que tiene una concentración de

arsénico de 629.98 ± 30.11 mg/kg. Esto apunta a que posiblemente las bacterias

sulfato-reductoras del sedimento CT podrían estar inhibidas por las altas

concentraciones de arsénico.

 

5.3 Ensayos en lote para evaluar la actividad reductora de sulfato en presencia de As(V)

 Este grupo de experimentos tuvo como objetivo examinar el efecto de la

disponibilidad de As(V) como aceptor de electrones sobre el proceso de sulfato-

reducción ( ensayos Tabla 4.2). En la Figura 5.7 se muestran los resultados para

el sedimento CB y en la Figura 5.8 para sedimento CT.

En la Figura 5.7a, se puede confirmar que en los ensayos inoculados con

CB hubo producción de sulfuro apreciable únicamente cuando se adicionó lactato

y sulfato o en su defecto solo sulfato. Cuando se añadió As(V) no se detectó

sulfato-reducción. Sin embargo, podemos apreciar que en el ensayo con lactato, 2-

As(V) y SO4 también hubo consumo de lactato (Fig. 5.7c y d). Es más favorable  

la reducción de As(V) (Eh de As(V)/As(III)= +135 mV) que la reducción de sulfato   2-

(Eh de SO4 /H2S= -222 mV), en presencia de ambos aceptores se efectuaría  

primero la reducción de As(V) ( Niggemyer et al., 2001; Oremland & Stolz, 2003).

En el metabolismo sulfato-reductor por la oxidación incompleta de un mol de

lactato se produce un mol de acetato (reacción 2.4), esto también ocurre cuando

las bacterias sulfato-reductoras utilizan As(V) como aceptor final de electrones

(reacción 2.2) (Newman et al., 1997a). En la Figura 5.7c y d podemos corroborar

que hay consumo de lactato y producción de acetato en los tratamientos que

contienen lactato y sulfato o bien lactato, sulfato y arseniato. En la Figura 5.7d se

Resultados y discusión

51

 

 

4

c)

pH

L

acta

to (

mM

) S

ulf

uro

(m

M)

Su

lfat

o (

mM

) A

ceta

to (

mM

)

 

registró el consumo total de acetato producido en el ensayo con lactato y SO 2- a   2-

diferencia del ensayo con lactato, SO4 y As(V) que presentó acetato residual al  

final del experimento (día 30), en este mismo ensayo se observó un retraso en la

producción inicial de acetato respecto al consumo de lactato (día 5, Figs. 5.7c y d).

Fue hasta después del día 5, cuando ya se había consumido 7.4 mM de lactato,

que se verificó un incremento en la concentración de acetato. Una posible

explicación sería que el acetato haya sido consumido por otros microorganismos 2-

conforme se producía. Además nótese que en el ensayo con lactato y SO4 a  

partir del día 15 se empieza a consumir el acetato (Fig. 5.7d). Sin embargo, no se

observó un incremento en la producción de sulfuro (Fig. 5.7a), este hecho apunta

a que el acetato no fue consumido por bacterias sulfato-reductoras.  

 

a) 30 27 24 21 18 15 12

9 6 3 0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

 

b) 30

27 24 21 18 15 12 9 6 3 0

 

           0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

16 d) 16

14

12

10

8

6

4

2

0

e) 8.0  

7.8  

7.6  

7.4  

7.2  

7.0  

6.8

         0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32          0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tiempo (d)

14

12

10

8

6

4

2

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tiempo (d)  

Lactato 10 mM + As(V) 10 mM + SO 2-

10 mM 4

As(V) 10 mM + SO 2-

10 mM (sin lactato) 4

Lactato 10 mM + SO 2-

10 mM 4

Control estéril SO

2- 10 mM (sin lactato)

4

Figura 5.7. Perfiles de a) Producción de sulfuro, b) Consumo de sulfato, c) Consumo de lactato, d) Producción de acetato y e) pH, obtenidos en los ensayos en lote para evaluar la actividad sulfato-reductora en presencia de As(V) utilizando como inóculo sedimento CB, la leyenda muestra los reactantes suplementados en cada caso.

Resultados y discusión

52

 

 

pH

S

ulf

uro

(m

M)

Lac

tato

(m

M)

Su

lfat

o (

mM

) A

ceta

to (

mM

)

 A continuación en la Figura 5.8 se ilustran los resultados para CT, en los

paneles a y b de esta Figura, se puede verificar que en el ensayo con lactato y

sulfato se produjeron aproximadamente 11.8 mM de sulfuro y a su vez se

consumieron 12.6 mM de sulfato lo que cumple de forma cercana con la

estequiometria de la reacción de sulfato-reducción, nótese que en este mismo

ensayo para el día 5 se consumieron 9 mM de lactato y se alcanzó la máxima

producción de acetato (7.8 mM) (Figs. 5.8c y d). El consumo total de lactato fue de

10.6 mM que no corresponde exactamente con la producción de acetato esto se

puede deber a que ~3 mM de lactato se utilizaron en la síntesis celular (Macy et

al., 2000) además, en este ensayo se registró consumo de acetato.

  

a) 16

14

12

10

8

6

4

2

 b) 16

14

12

10

8

6

4

2

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

           0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

c) 12  

10  

8  

6  

4

d)12  

10  

8  

6  

4  

2  

0

e) 8.4 8.2

   0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

 

2  

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tiempo (d)  

8.0 Lactato 10mM + As(V) 10 mM + SO 2-

4

10 mM

7.8

7.6

7.4

7.2

7.0

6.8

     

 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tiempo (d)

As(V) 10 mM + SO 2-

10 mM (sin lactato) 4

Lactato 10mM + SO 2-

10 mM 4

Control estéril SO

2-10 mM (sin lactato)

4

 

Figura 5.8. Perfiles de a) Producción de sulfuro, b) Consumo de sulfato, c) Consumo de lactato, d) Producción de acetato y e) pH, obtenidos en los ensayos en lote para evaluar la actividad sulfato-reductora en presencia de As(V) utilizando como inóculo sedimento CT, la leyenda muestra los reactantes suplementados en cada caso.

Resultados y discusión

53

 

 

4

 De igual forma que en los ensayos con CB, en el ensayo CT con lactato,

sulfato y As(V) no hubo una producción de sulfuro significativa, no obstante, se

observó actividad microbiana lo cual se sustenta con el consumo de lactato y la

producción de acetato (Figs. 5.8c y d), solamente se consumieron 6 mM de lactato

y también se produjeron alrededor de 6 mM de acetato. En la Figura 5.8b se

puede corroborar además que para el ensayo con lactato, sulfato y As(V) hubo

una remoción de 49% de la concentración inicial de sulfato lo que posiblemente

significa que éste también se utilizó como aceptor de electrones y tuvieron lugar

tanto el proceso de arseniato-reducción como el proceso de sulfato-reducción. Sin

embargo, en este set de experimentos no se cuantificó la reducción de arsénico.

Con base en otros trabajos (Liu et al., 2004; Saalfield and Bostick, 2009),

para los ensayos anteriores se planteó una concentración de 10 mM de lactato, 10

mM de sulfato y 10 mM de arseniato, pensando en proveer una cantidad limitada

de electrones. Si se parte de que teóricamente por la oxidación de 1 mol de lactato

se obtiene un total de 12 equivalentes reductores, con 10 mM de lactato se

tendrían 120 miliequivalentes reductores (meqv e-), por su parte la producción de  

un mol de acetato requiere 8 equivalentes reductores entonces, cuando la

oxidación incompleta del lactato produce una concentración de 10 mM de acetato

se consumen 80 meqv e- (10 mM x 8 meqv e-). Para la reducción de 10 mM de

As(V) a As(III) (As5+ a As3+) se requieren 20 meqv e- (10 mM x 2 meq e-). 2-

Finalmente solo quedan disponibles 20 meqv e- para la reducción de SO4 a H2S

(S6+ a S2-), por lo que únicamente se podría reducir una concentración aproximada  

de 2.5 mM de SO 2-

 

(2.5 mM x 8 meqv e-) lo que redunda en la producción de 2.5  

mM de sulfuro (Rittmann & McCarty, 2001). En conclusión el número de

equivalentes reductores obtenidos de la oxidación de 10 mM de lactato no es 2-

suficiente para efectuar la reducción de 10 mM de As V y de 10 mM de SO4 , lo  

que explicaría que no se observó una producción significativa de sulfuro en los

microcosmos con ambos aceptores. Sin embargo en el ensayo con CT quedo un

remanente de lactato al final del experimento.

Por último cabe mencionar que en los controles estériles tanto con

sedimento CB como CT se registró un consumo de lactato y producción de

Resultados y discusión

54

 

 

4

4

 acetato, a este respecto se puede decir que en dichos experimentos solo se

realizó un ciclo de esterilización en autoclave y no se contempló la posibilidad de

que los sedimentos sirven como barrera de protección para los microorganismos

lo que les permite sobrevivir al proceso de esterilización por autoclave (20 min,

121 °C y 103 kPa). Además también podrían existir bacterias formadoras de

esporas en los sedimentos (Castelle et al., 2013; Aullo et al., 2013). Cuando se

trabaja con sedimentos se recomiendan dos o más ciclos de esterilización

(O’Sullivan et al., 2015).

Al finalizar los experimentos descritos anteriormente se determinó el

potencial redox de los cultivos, encontrando potenciales negativos en casi todos 2-

los casos, excepto para los tratamientos con SO4 y As(V) sin adición de lactato  

con ambos sedimentos (Tabla 5.3). Posiblemente esto se relacione con la menor

actividad microbiana, ya que el control estéril inoculado con CT también presenta

un potencia redox positivo. Es importante señalar que en el control estéril

inoculado con sedimento CB se obtuvo un potencial negativo, lo cual se puede

atribuir a que el sedimento CB tiene actividad sulfato-reductora endógena y el

sulfuro inicial (presente en el sedimento) pudo actuar como agente reductor. En la

Tabla 5.3 se puede notar que en los ensayos con sedimento CB se obtuvieron

potenciales menores, lo que concuerda con que también en CB se alcanzaron

mayores producciones de sulfuro y a diferencia de lo observado en CT, el ensayo

sin lactato (con sulfato) produjo sulfuro.

  

Tabla 5.3 Potenciales redox de los ensayos en lote determinados al final de los experimentos (30 días de incubación) para en sayos inoculados con CB y CT (sección 5.3).

 

 Ensayos Eh (mV)

CB CT

Lactato 10 mM + As(V) 10 mM + SO 2-

2- 10 mM -258.9 -57.3

Lactato 10 mM + SO4

As(V) 10 mM + SO 2-

2-

10 mM -196.6 -164.3 10 mM 48.8 60.5

SO4 10 mM -232.4 -42.7 Control estéril -89.9 64.4

Resultados y discusión

55

 

 

 Se ha reportado que los potenciales negativos se atribuyen a procesos de

reducción, por ejemplo la reducción de sulfato ocurre a valores de Eh de -200 mV

(pH 7, 25ºC) y la reducción de arseniato a valores de Eh menores a 60 mV ( Hoeft

et al., 2004; Sánchez-Andrea et al., 2014; Gorny et al., 2015).

 

5.3.1 Remoción de arsénico disuelto  

 

Al evaluar la actividad sulfato-reductora en presencia de arsénico (sección 5.3), se   2-

encontró que los tratamientos con lactato, As(V) y SO4 inoculados ya fuera con  

sedimento CB o CT (ensayos bióticos) desarrollaron un precipitado amarillo. Se

tomó muestra tanto del precipitado como de la fase líquida después de 15 días de

incubación para los ensayos con sedimento CB y después de 30 días para los

ensayos que contenían sedimento CT. También se tomó muestra de los controles

estériles (ensayos abióticos) correspondientes a este grupo de ensayos (Tabla

4.2), estos tenían los mismos reactantes que los ensayos bióticos, en este caso

solo se muestreó la fase líquida ya que no presentaban formación de precipitados.

Se encontró que en los ensayos bióticos la concentración de arsénico total

disuelto disminuyó comparada con la concentración al inicio de experimento (~10

mM) (Fig. 5.9), la remoción fue de 64% para CB y de 65% para CT (Figs 5.9 a y c),

en cambio para los controles estériles fue de 12% y 15% respectivamente, (Figs.

5.9b y d). La remoción de arsénico en los controles estériles se podría explicar

debido a que pueden existir procesos de precipitación en el sedimento, y en

sedimentos que contienen concentraciones elevadas de calcio, como es el caso

(>6000 mg/kg), se puede remover una porción de As(V) de la solución debido a la

precipitación de arseniatos de calcio o inclusive el As(V) podría co-precipitar con el

yeso ( Rodríguez-Blanco et al., 2007; Martínez-Villegas et al., 2013; Zhang et al.,

2015).

En la Figura 5.9 también se puede observar que en los ensayos bióticos

hubo consumo de lactato y producción de acetato, lo cual como ya se mencionó

es una característica del metabolismo microbiano durante la oxidación incompleta

de lactato y la reducción de sulfato o arseniato (Niggemyer et al., 2001; Sánchez-

Andrea et al., 2014). Es importante precisar que en los controles estériles del

Resultados y discusión

56

 

 

 experimento discutido se registró consumo de sustrato, después de 30 días de

incubación se consumió 49% de lactato con sedimento CB y 36% con sedimento

CT respecto a la concentración inicial, lo que explica la producción de acetato (Fig.

5.9d).

 

Figura 5.9 Concentración de arsénico, sulfato, lactato y acetato en los ensayos bióticos (a y c) comparados con los ensayos esterilizados (b y d) con los sedimentos de CB y CT. Muestras tomadas al día 1 y 15 de incubación para CB y al día 1 y 30 para CT.

   

5.4 Velocidades de reducción de sulfato  

 

En la Tabla 5.4 se muestra un resumen de las velocidades de reducción de sulfato

obtenidas a partir de los experimentos en lote para evaluar la capacidad sulfato-

reductora de los sedimentos. Se comparan las velocidades obtenidas en el primer

set de experimentos para evaluar la actividad sulfato-reductora de los sedimentos

(sección 5.2) y en el segundo set que fue en presencia de arsénico (sección 5.3).

La velocidad de reducción de sulfato o sulfuro se obtuvo de la pendiente máxima 2-

de la gráfica de concentración de SO4 o de H2S contra el tiempo.

Resultados y discusión

57

 

 

Set 1 Set 2 Set 1 Set 2 0.09 0.07 0.03 0.04 0.05 0.03 N.D. N.D.

0.09 ENR 0.01 ENR

0.06 ENR N.D. ENR

4

 

Tabla 5.4 Velocidades máximas de reducción de sulfato de ensayos en lote con muestras de sedimento de Cerrito Blanco y Club de Tiro.

 

 Ensayos CB CT

*Velocidad de reducción 2- Velocidad de reducción 2- de SO4 (mmol/L·h) de SO4 (mmol/L·h)

 

Lactato 10 mM + SO 2-

2-

 

10 mM

SO4 10 mM

Lactato 10 mM

Control endógeno ENR: ensayo no realizado, N.D.: no se detectó reducción de sulfato

* calculada a partir de la producción de sulfuro   

Para los experimentos con sedimento CB, las velocidades de reducción de

sulfato se calcularon a partir de las velocidades de producción de sulfuro debido a

que, como se mencionó anteriormente, en los ensayos inoculados con CB, hay

liberación de sulfato del sedimento al medio de reacción, lo que hace difícil estimar

una tasa de reducción de sulfato correctamente. En el caso de los experimentos

con sedimento CT fue necesario el cálculo de las velocidades de reducción de

sulfato, ya que en este sedimento ocurre una rápida precipitación de sulfuro

(precipitado negro), debido a que presenta una concentración de hierro (2610.12

±140.9 mg/kg). De la estequiometría de la reacción de sulfato-reducción (Reacción

2.4) se sabe que para la producción de un mol de sulfuro se debe consumir un mol

de sulfato, por lo que las velocidades de reducción de sulfato son equivalentes a

las velocidades de producción de sulfuro reportadas en mmol/L·h.

A partir de los datos mostrados en la Tabla 5.4, se observa que en los

experimentos inoculados con CB en ausencia de arsénico (set 1), se obtuvo la

misma velocidad de reducción de sulfato en el ensayo con lactato cuando se 2-

adicionó sulfato y cuando no se adicionó, dicha velocidad fue 0.09 mmol SO4 /L·h.  

En contraste, los ensayos con sedimento CT sí mostraron diferencia, la velocidad   2-

de reducción de sulfato en el ensayo con lactato fue de 0.01 mmol de SO4 2-

/L·h y

en el ensayo con lactato y sulfato fue de 0.03 mmol de SO4 /L·h. Estos resultados  

respaldan que en los ensayos con sedimento CB no fue necesaria la adición

Resultados y discusión

58

 

 

 externa de sulfato para observar el proceso de sulfato-reducción, ya que el

sedimento contiene yeso (CaSO4·2 H2O).

Hasta donde se tiene conocimiento, este es el primer reporte que  

documenta la actividad biológica sulfato-reductora de sedimentos de los sitios

Cerrito Blanco y Club de Tiro. La importancia de dicha actividad biológica radica

en que muchas bacterias sulfato-reductoras tienen la capacidad de usar As(V)

como aceptor final de electrones (Macy et al., 2000). Como ha sido reportado en

los ambientes contaminados con arsénico que son pobres en hierro es importante

considerar la actividad sulfato-reductora, aunado a esto se sabe relativamente

poco del impacto de las trasformaciones microbianas en la movilización de

arsénico en sistemas dominados por sulfato (Burton et al., 2013b; Rodriguez-

Freire et al., 2014).

En otros sitios contaminados con arsénico se han reportado velocidades de

reducción de sulfato utilizando como inóculo sedimentos, por ejemplo en un

estudio con columnas inoculadas con sedimentos del lago hipersalino Mono en

California, que presenta una concentración de arsénico en la columna de agua de 2-

0.2 mM, se determinó una velocidad máxima de 0.06 mmol de SO4 2-

/L·h en el

control endógeno y de 0.18 mmol de SO4 /L·h cuando se adicionó lactato y  

sulfato 10 mM (Stam et al., 2010). La velocidad de sulfato-reducción endógena

reportada por dichos autores fue igual a la determinada en los ensayos con

sedimento CB, que presenta una concentración de arsénico en la columna de

agua de 0.06 mM; en CT no se detectó actividad sulfato-reductora en dicho

control, CT presentó una concentración de arsénico de 0.6 mM. La velocidad de

sulfato-reducción cuando se adicionó lactato y sulfato 10 mM resultó ser mayor

que las velocidades determinadas con los sedimentos CB y CT.

Resultados y discusión

59

 

 

 5.5 Procesos biológicos de sulfato/arseniato-reducción

 5.5.1 Cinéticas de especiación de arsénico con sedimento Cerrito Blanco

 

 

A continuación se muestran los resultados de los ensayos en lote para evaluar la

interacción entre los procesos de sulfato-reducción y arseniato-reducción, para

corroborar que efectivamente el As(V) se usaba como aceptor terminal de

electrones se dio seguimiento al arsénico total y a las especies de As(III) y As(V)

como se indicó en la sección 4.3.4.

En la Figura 5.10 se exponen los resultados obtenidos para CB. Nótese que

se registró producción de sulfuro únicamente en el tratamiento con lactato (10 mM)

que no contenía arsénico, aunado a esto se encontró que el sulfato en la fase

acuosa presenta fluctuaciones y no estuvo acoplado estequiométricamente a la

producción de sulfuro (Figs. 5.10 a y b), ya que como se mencionó anteriormente

el sulfato puede disolverse del sedimento si existen fases minerales como el yeso

(Kijjanapanich et al., 2014). Los tratamientos con lactato, As(V) y sulfato no

presentaron producción de sulfuro apreciable. Sin embargo, en dichos

tratamientos si se observó arseniato reducción (Figs. 5.10c y d). La reducción

completa de ~10 mM de As(V) ocurrió en 4 días, después de 5 días de incubación

se aprecia que la concentración de As(III) disminuye gradualmente hasta el final

del ensayo (Fig. 5.10d) y esto coincide con la formación de precipitados minerales

en los cultivos. Se ha reportado que la reducción biológica de As(V) ocurre en

periodos de tiempo relativamente cortos. Niggemyer y colaboradores (2001)

encontraron una reducción completa de 5 mM de As(V) en 40 horas (1.6 días) con

una cepa de Desulfitobacterium frappieri, usando formiato 4 mM como donador de

electrones. Por su parte Liu y colaboradores (2004) reportaron la reducción de 10

mM de As(V) en 14 días con cultivos inoculados con sedimento y usando como

donador lactato 10 mM.

Resultados y discusión

60

 

 

a

b)

4

Su

lfu

ro (

mM

) S

ulf

ato

(m

M)

As(

V)

(mM

) A

s(III

) (m

M)

 

 

Lactato 10 mM + As(V) 10 mM + SO 2-

10 mM 4

Lactato 15 mM + As(V) 10 mM + SO 2-

10 mM 4

Lactato 10 mM

40 c)12

 

35 10

30 8

25  

20 6  

15 4

10

5 2

 

0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

40 d)12  

35 10

30

25 8

 

20 6  

15 4

10

5 2  

0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Tiempo (d)

Inhibición de SR (c/MoO 2-

25 mM) c/As(V) 4

Control estéril Cotrol químico (sin sedimento)

            

 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22  

            0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Tiempo (d)  

Figura 5.10. Ensayos en lote para evaluar los procesos arseniato/sulfato respiratorios utilizando como inóculo sedimento CB: a) Consumo de sulfato, b) Producción de sulfuro, c) Consumo de As(V), d) Producción de As(III). La leyenda superior muestra los reactantes suplementados en cada caso.

  

En el panel d) de la Figura 5.10 también se puede observar que hubo

producción de As(III) en el control estéril (3.6 mM), esto se explica si se considera

que el sedimento presenta actividad sulfato-reductora endógena e inicialmente

contiene una concentración de sulfuro disuelto (2.4 mM) el cual químicamente

podría reducir el As(V) de acuerdo a la siguiente reacción: H2AsO - + H2S + H+

 

H3AsO3 + 1/8 S8 + H2O, el ∆G°rxn es de -100.5 kJ/mol, lo que indica que dicha

reacción es bastante favorable, no obstante, la reación se favorece a pHs ácidos

(pH 4) (Rochette et al., 2000). Otra posible explicación, es que existen bacterias

formadoras de esporas capaces de reducir As(V), como Bacillus arsenicoselenatis

y miembros del género Desulfotomaculum, estos microorganismos podrían

sobrevivir al proceso de esterilización. Se encontró que bacterias

Resultados y discusión

61

 

 

 Desulfotomaculum spp. Gram-positivas que esporulan pueden sobrevivir hasta

tres ciclos de autoclave. Dichas especies se encuentran comúnmente en

sedimentos (Aullo et al., 2013; Huang, 2014; O’Sullivan et al., 2015), por lo que no

se descarta la posibilidad de que el control estéril no era 100% abiótico, ya que

solo se sometió a dos ciclos de esterilización. Aunque no se observó consumo de

lactato (Fig. 5.11a), la reducción de As(V) pudo llevarse a cabo solo mediante el

consumo de donador endógeno como lo sugieren Rodriguez-Freire y

colaboradores (2014).

Pese a la actividad registrada en el control estéril (reducción de As(V) y

producción de As(III)) existe una diferencia significativa si se compara con los

tratamientos que contienen una fuente de carbono y presentan actividad

microbiana (consumo de lactato y producción de acetato, Fig. 5.11). En promedio

en los ensayos bióticos se obtuvo una remoción de As(V) de 9.6 mM y una

producción de As(III) de 9 mM. Mientras que en el ensayo estéril la remoción de

As(V) fue de 5.5 mM y la concentración de As(III) fue de 3.6 mM. Por otro lado la

reducción de As(V) en el control químico (sin microorganismos) fue mínima,

alrededor de 15% esto es cercano a reportes previos en donde en el control

abiótico (sin inóculo) detectaron una reducción de 12% de As(V) a cusa de las

condiciones reducidas en los microcosmos con atmosfera anaerobia (Rodriguez-

Freire et al., 2014).

Para descartar que la reducción de As(V) fuera meramente química, es

decir, producto del sulfuro originado por la reacción de sulfato-reducción se evaluó 2-

un tratamiento con lactato, As(V) y sulfato pero con adición de MoO4 (25 mM). El  

molibdato, a esa concentración, es un inhibidor específico de la actividad sulfato-

reductora ya que compite con el sistema de transporte de sulfato interfiriendo con

la formación de adenosin fosfosulfato (APS), de esta forma impide que el sulfato

se pueda utilizar como aceptor final de electrones (Patidar & Tare, 2005). En el

ensayo con molibdato se observó que aun cuando se suprimió la reacción de

sulfato-reducción se llevó a cabo la arseniato reducción mediada por

microorganismos, es decir, se utilizó As(V) como aceptor final de electrones (Fig.

Resultados y discusión

62

 

 

 5.10 y el comportamiento cinético fue similar al perfil de reducción de As(V)

  2- presentado por el tratamiento análogo sin adición de MoO4 .

 

En la Figura 5.10a también se puede ver que en el tratamiento con

molibdato 25 mM hubo un incremento considerable en la concentración de sulfato,

para explicarlo se realizaron pruebas incubando botellas serológicas con

sedimento y agua desionizada y botellas con sedimento, agua desionizada y

molibdato 25 mM. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 5.5, se encontró

que en presencia de molibdato hubo un aumento en la concentración de sulfato

disuelto del sedimento y que se cuantificó por electroforesis capilar.

Probablemente el molibdato influyó en la liberación de sulfato del sedimento al

medio líquido.

  

Tabla 5.5 Efecto del molibdato en la concentración de sulfato liberado del sedimento Cerrito Blanco a la fase líquida.

 

 Tratamiento Sulfato mM

Sedimento CB + agua + Molibdato 25 mM (día 1) 12.8 ±0.32 Sedimento CB + agua + Molibdato 25 mM (día 15) 27.85 ±1.13 Sedimento CB + agua (día 1) 12.44 ±0.46

Sedimento CB + agua (día 15) 13.16 ±0.09     

En cuanto a los perfiles de consumo de lactato y producción de acetato

(Fig. 5.11) es importante mencionar que en los ensayos adicionados con As(V) no

se encontró una relación equimolar entre el consumo de lactato y la producción de

acetato como lo señalan las reacciones de arseniato y sulfato reducción

(reacciones 2.2 y 2.4). Como ejemplo en los ensayos con 10 mM de lactato + 10 2-

mM As(V) + 10 mM SO4 se consumieron 6.5 mM de lactato y solo se  

cuantificaron 3 mM de acetato. Sin embargo la relación mol a mol de

lactato/acetato no necesariamente se cumple ya que hay inversión de donador en

la síntesis de material celular e inclusive puede haber consumo de acetato por

otros microorganismos (p. ej. Metanógenos) (Macy et al., 2000a; Sánchez-Andrea

et al., 2014).

Resultados y discusión

63

 

 

Aceta

to (

mM

) L

acta

to (

mM

)

 Lactato 10 mM + As (V) 10 mM + SO

2- 10 mM

4

Lactato 15 mM + As (V) 10 mM + SO 2-

10 mM 4

Lactato 10 mM

a) 14  

12  

10  

8  

6  

4  

2  

0

 

Inhibición de SR (c/MoO 2-

25 mM) c/As(V) 4

Control estéril Control químico (sin sedimento)

b) 14  

12  

10  

8  

6  

4  

2  

0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28             0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Tiempo (d)  

Figura 5.11. Perfiles de consumo de lactato a) y producción de acetato b), en cultivos en lote utilizando como inoculo sedimento CB.

  

Por otra parte en los ensayos con As(V) se observa lactato residual (Fig.

5.11a). Por lo que no se descarta que haya cierto grado de inhibición de la

reacción de sulfato-reducción al adicionar 10 mM de As(V) equivalente a 749.2

mg/L, ya que el remanente de lactato no se invirtió en la reducción microbiana de

sulfato aún cuando este último estaba disponible. Dowdle y colaboradores (1996)

observaron una inhibición completa de la actividad sulfato-reductora en cultivos a

partir de sedimentos anóxicos en presencia de As(III) y As(V) en un intervalo de 8

a 10 mM (entre 599.4 y 749.2 mg/L) que es una concentración muy cercana a la

que se usó en esta tesis (~10 mM). Sin embargo, Escot-Espinoza (2014) reportó

que conforme aumenta la concentración de As(III) en un intervalo entre 1 a 100

mM la producción de sulfuro fue notablemente disminuida, sin llegar a inhibir por

completo el proceso de sulfato-reducción; los experimentos se efectuaron con un

consorcio sulfato-reductor aislado de suelo contaminado con arsénico en

Matehuala, S.L.P. Por su parte Macy y colaboradores (2000) encontraron que

Resultados y discusión

64

 

 

 cepas de Desulfovibrio pueden crecer en 20 mM de sulfato y concentraciones de

arseniato de 10 a 30 mM. El tiempo de duplicación incrementa conforme aumenta

la concentración de As(V), pero la actividad sulfato-reductora no se suprime

completamente. Por ejemplo Desulfovibrio creció con un tiempo de duplicación de 2-

6 horas solo con SO4 20 mM, en cambio cuando se utilizó As(V) 9.2 mM y sulfato  

16.9 mM el tiempo de duplicación fue de 8 horas, los autores encontraron que al

cabo de 60 horas se consumieron 21 mM de lactato, 8.3 mM de sulfato y 3.1 mM

de As(V).

 

5.5.2 Cinética de especiación de arsénico con sedimento Club de Tiro  

 

En la Figura 5.12 se pueden observar los resultados obtenidos en los

experimentos de arseniato y sulfato reducción inoculados con sedimento CT. En el

tratamiento con lactato (Fig. 5.12b) se registró una producción casi nula de sulfuro

(0.9 mM) esto debido a que en ensayos con sedimento CT la adición de sulfato es

necesaria. Por otro lado, en el ensayo con lactato se observó la formación de un

precipitado negro alrededor de los 6 días de incubación, tras la formación del

precipitado el sulfuro en solución ya no incrementó su concentración (Fig. 5.12b),

aunque se observó el consumo total de sulfato (Fig. 5.12a). Recordemos que el

sedimento CT no presenta actividad endógena, es decir ni el carbono ni el sulfato

intrínsecos en el sedimento son suficientes para sustentar la reacción de sulfato-

reducción.

De igual manera que para los ensayos con sedimento CB, los tratamientos

adicionados con As(V) presentaron actividad arseniato-reductora (Figs. 5.12c y d)

acoplada al consumo de lactato y producción de acetato (Fig. 5.13); el ensayo 2-

donde se suprimió la actividad sulfato-reductora (con MoO4 ) también presentó  

arseniato-reducción. Se observó que aún cuando se inhibió la sulfato-reducción

pudo ocurrir la arseniato-reducción biológica. De hecho se puede observar que en

el ensayo con lactato, As(V) y sulfato 10 mM y en el ensayo con molibdato se

alcanzaron las mismas concentraciones de As(III), esto se debe a que ambos

ensayos tenían concentraciones similares de lactato y As(V) al inicio del

experimento. En el ensayo con lactato, As(V) y sulfato a partir del día 10 se

Resultados y discusión

65

 

 

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

          Tiempo (d)         Tiempo (d)  

)

Su

lfu

ro (

mM

) S

ulf

ato

(m

M)

As(

III)

(mM

) A

s(V

) (m

M)

10

 observó una notable disminución del As(III) disuelto (Fig. 5.12d), lo cual está

relacionado con la formación del precipitado amarillo, mientras que en el

tratamiento con molibdato no se aprecia tal disminución lo que es lógico ya que en

estos ensayos no presentaron ningún precipitado, entonces la formación de este

último involucra tanto la reacción de arseniato-reducción como la de sulfato-

reducción. Una vez más se detectó reducción de As(V) en el control estéril el cual

fue esterilizado 2 veces, como ya se mencionó muy posiblemente estos controles

abióticos no estaban completamente estériles.  

 

Lactato 10 mM + As(V) 10 mM + SO 2-

10 mM 4

Lactato 15 mM + As(V) 2.5 mM + SO 2-10 mM

4 Lactato 10 mM

a 14 c)10

12 9 8

10 7

8 6

5

6 4

4 3

2 2

1

0 0

 

Inhibición de SR (c/MoO 2-

25 mM) c/As(V) 4

Control estéril Control químico (sin sedimento)

b)14 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

d)

12 9 8

10 7

8 6

5

6 4

4 3

2 2

1

0 0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

  

Figura 5.12. Ensayos en lote para evaluar los procesos arseniato/sulfato respiratorios utilizando como inóculo sedimento CT: a) Redución de sulfato, b) Producción de sulfuro, c) Consumo de As(V), d) Reducción de As(III). La leyenda superior muestra los reactantes suplementados en cada caso.

  

Para determinar si los cultivos microbianos a partir de sedimentos tenían

capacidad de utilizar tanto As(V) como sulfato, en presencia de una fuente de

carbono disponible se evaluó un tratamiento en el cual se adicionó lactato 15 mM,

Resultados y discusión

66

 

 

Aceta

to (m

M)

Lacta

to (m

M)

 As(V) 2.5 mM y sulfato 10 mM, de esta forma los equivalentes reductores del

donador permitirían la reducción tanto de As(V) como de sulfato. La reducción

completa de 2.5 mM de As(V) ocurrió en 2 días y posteriormente se llevó a cabo la

reducción de sulfato alcanzándose una concentración de sulfuro de ~8 mM para el

día 25 (Figs. 5.12a y b). Esto sugiere que en presencia de los dos aceptores de

electrones, se lleva a cabo primero la arseniato reducción y posteriormente la

sulfato-reducción.

En la Figura 5.13 se presentan los perfiles de consumo de lactato y de

producción de acetato. De los tratamientos bióticos, únicamente el tratamiento con 2-

MoO4 presentó un remanente de lactato (2 mM), lo cual se debe a que el lactato  

se adicionó en exceso (8.5 mM), es decir, excedía 5 veces lo necesario para la

reducción completa de 9.2 mM de As(V). En la sección 5.4.3, se hace una

discusión más amplia al respecto.

  

Lactato 10 mM + As (V) 10 mM + SO 2-

10 mM 4

Lactato 15 mM + As (V) 2.5 mM + SO 2-

10 mM 4

Lactato 10 mM  

a) 16

14

12

10

8

6

4

2

0

Inbición de SR (c/MoO 2-

25 mM) c/As(V) 4

Control estéril Control químico (sin sedimento)

 

b) 16

14

12

10

8

6

4

2

0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28            0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Tiempo (d)  

Figura 5.13. Perfiles de consumo de lactato a) y producción de acetato b) en cultivos en lote utilizando como inoculo sedimento CT.

Resultados y discusión

67

 

 

 Nótese que el tratamiento con lactato a una concentración de 15 mM,

sulfato 10 mM y As(V) 2.5 mM no presentó remanente de sustrato (Fig. 5.13a), lo

que indica que se invirtieron los equivalentes reductores requeridos en el proceso

de arseniato-reducción y posteriormente los equivalentes restantes se utilizaron en

sulfato-reducción.

Múltiples estudios respaldan la existencia de bacterias fisiológicamente   2-

capaces de reducir As(V) y SO4 , por un lado discuten que son procesos  

separados, que ciertas especies pueden realizar arseniato-reducción (Geobacter,

Shewanella) y otras especies sulfato-reducción. Por otro lado argumentan que

existen especies que pueden utilizar ambos aceptores (Desulfotomaculum,

delsufomicrobium) (Huang, 2014), siguiendo los principios termodinámicos utilizan

en primer lugar al As(V) como aceptor de electrones en la respiración y una vez 2-

que lo agotan empiezan a utilizar SO4 (Macy et al., 2000; Newman et al., 1997b).  

Para discutir lo anterior, en la Figura 5.14 se hace una comparación del perfil de

actividad arseniato/sulfato reductora en el sedimento CT a partir del ensayo con 10 2-

mM de lactato + 10 mM As(V) + 10 mM SO4 2-

(Fig. 5.14a) y del ensayo con 15 mM

de lactato + 2.5 mM As(V) + 10 mM SO4 (Fig. 5.14b), con el propósito de analizar  

el efecto de las diferentes concentraciones de aceptor y donador de electrones. En

la Figura 5.14a, se puede corroborar que en el día 2 se alcanza la máxima

concentración de As(III) disuelto y a partir de este día comienza a disminuir

paulatinamente, lo que coincide con el desarrollo del precipitado amarillo.

Adicionalmente, no se observó aumento en la concentración de sulfuro, este

permaneció más o menos constante (2.3 mM). En la Figura 5.14b, en donde se

usó más donador de electrones (15 mM de lactato) y menos As(V) (2.5 mM) se

observa que inicialmente ocurre la reducción de As(V), el As(III) presente en

solución disminuye (se empieza a apreciar la formación del precipitado amarillo),

posteriormente se acumula sulfuro disuelto (~8 mM de H2S) esto resulta en el

aumento gradual de As(III) en solución a partir del día 6 (el medio se observa

completamente negro). En dicho tratamiento se midió la concentración de arsénico

total en solución después de 30 días de incubación y se encontró que

correspondía a la concentración inicial (2.5 mM). Lo anterior sugiere que la

Resultados y discusión

68

 

 

6

Sulfuro

(mM

) S

ulfuro(m

M)

Ars

énic

o (m

M)

Ars

énic

o (m

M)

 acumulación de sulfuro inhibe el secuestro de arsénico por bio-precipitación. Por

ejemplo se ha reportado que el As2S3(amorfo) puede disolverse cuando existen altas

concentraciones de sulfuro de acuerdo con la reacción 5.2, dicha disolución se ha

observado a pH mayores a 5 (Altun et al., 2014):  

3/2 As2S3(am) + 3/2 H2S H2As3S - + H+

 

Reacción 5.2  

Newman y colaboradores (1997a) examinaron el crecimiento de D.   2-

auripigmentum con 1 mM de As(V), 10 mM de SO4 y 20 mM de lactato y no  

percibieron el efecto observado en esta tesis, ya que encontraron que el As(V) se

redujo a As(III), después observaron un ligero aumento en la concentración de

sulfuro y posteriormente su disminución con la formación de As2S3. Dichos autores

argumentan una baja velocidad de sulfato-reducción, lo que hace suponer que la

formación del precipitado no solo se ve impactada por la disponibilidad de sustrato

sino también por la velocidad de sulfato-reducción del cultivo en cuestión.

   

 a) 10

As total  

As(III) As(V) H S 2

5  

8 4  

6 3  

4 2  

2 1  

0

b) 5

 4

 3

 2

 1

 0

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

10  

8  

6  

4  

2  

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tiempo (d)  

Figura 5.14 Efecto de distintas concentraciones de donador y aceptor de electrones en los procesos de sulfato/arseniato reducción con sedimento CT: a) Tratamiento con lactato 2- 10 mM, As(V) 10 mM y SO4 2- 10 mM, b) Tratamiento con lactato 15 mM, As(V) 2.5 mM y SO4 10 mM.

Resultados y discusión

69

 

 

 Algunos estudios proponen que la estimulación de la sulfato-reducción

puede ser una estrategia de remediación de acuíferos contaminados con arsénico,

bajo condiciones reductoras (Kirk et al., 2004). No obstante, con base en los

resultados mostrados en la Figura 5.14 tal estrategia podría favorecer la

movilización de arsénico. Es decir, se tendrían que conocer y controlar

estrictamente las concentraciones de donadores y aceptores de electrones

disponibles en el sitio de interés, además evaluar la actividad microbiana.

Para implementar una tecnología de biorremediación en un sistema hidráulico es

necesaria la caracterización del sitio, ya que factores como la geología,

hidrogeología y procesos microbianos favorables determinarán el éxito de la

estrategia (Fazi et al., 2015). Por ejemplo en los sitios de muestreo una barrera

permeable reactiva con actividad sulfato-reductora no sería recomendable ya que,

en un inicio, si bien se podría favorecer la inmovilización de arsénico por la

formación de sulfuros, también cabría la posibilidad de que el proceso de

precipitación se revirtiera y ocurriera una disolución de los precipitados amorfos

liberando altas concentraciones de arsénico en un punto específico, esto debido a

un aumento de la actividad sulfato-reductora ya sea por disponibilidad de una

fuente de carbono o incluso por la disminución del arsénico en solución.

 

5.5.3 Velocidades de reducción de As(V)  

Las velocidades máximas de reducción de As(V) y reducción de sulfato para las

cinéticas de especiación de arsénico con sedimento CB y CT se muestran en la

Tabla 5.6 y 5.7, respectivamente. La tasa de reducción biológica de As(V) resultó

ser mayor en los ensayos con sedimento CT, que en los ensayos inoculados con

CB. Si recordamos, el sedimento CT posee una concentración mayor de arsénico

(630.0 ±30.1 mg/kg y en agua de poro 47.8 mg/mL) en comparación con el

sedimento CB (105.1 ±5.5 mg/kg y en agua de poro 13.1 mg/mL) por lo que es

lógico que la biota microbiana de CT tenga una mayor aclimatación a la presencia

de arsénico y por ende la capacidad de metabolizar de forma más acelerada el

As(V) ( Xiong et al., 2012; Liu et al., 2013). Se ha reportado que la reducción de

Resultados y discusión

70

 

 

 As(V) se registra en la fase exponencial y la tasa de crecimiento microbiano es es

proporcional a la tasa de reducción de As(V) (Lukasz et al., 2014).

 Tabla. 5.6 Velocidades máximas de reducción de As(V) y sulfato en ensayos con sedimento CB.

 

Ensayo Velocidad de reducción de As(V)

(mmol/L·h)

*Velocidad de reducción de SO 2-

4

(mmol/L·h) Lactato 10 mM + As(V) 10 mM+ 2- 0.10 - SO4 10 mM Lactato 15 mM + As(V) 10 mM + 2- 0.15 - SO4 10 mM Lactato 10 mM NA 0.04 Lactato 10 mM + As(V) 10 mM + SO42- 10 mM 2-

0.15 -

(c/ MoO4 25 mM) NA: no aplica, - no se detectó reducción de sulfato

* calculada a partir de la producción de sulfuro

Tabla. 5.7 Velocidades máximas de reducción de As(V) y sulfato en ensayos con sedimento CT

Ensayo Velocidad de reducción de As(V)

(mmol/L·h)

 Velocidad de

redución de SO 2- 4

(mmol/L·h) Lactato 10 mM + As(V) 10 mM 2- 0.26 - + SO4 10 mM Lactato 15 mM + As(V) 2.5 mM 2- 0.25 0.05 + SO4 10 mM Lactato 10 mM Na 0.02

Lactato 10 mM + As(V) 10 mM + SO42- 10 mM 2-

0.31 -

(c/ MoO4 25 mM) NA: no aplica, - no se detectó reducción de sulfato

   

Lukasz y colaboradores (2014) aislaron una cepa de Serratia sp.OM17 de

desechos de una mina de oro, con una concentración de 2.5 mM de As(V)

encontraron una velocidad máxima de reducción de As(V) de 7.81 mg As(V)/L·h

(0.10 mmol/L·h), la reducción completa ocurrió en 48 horas. Por su parte

Oremland y colaboradores (2000) en un estudio con aguas anóxicas del lago

Mono, California, en ensayos inoculados con Bacillus selenitireducens

determinaron una velocidad de reducción de As(V) de 0.64 mmol/L·h y una tasa

Resultados y discusión

71

 

 

 una tasa de presencia de As(III) en solución de 0.50 mmol/L·h cuando la

concentración inicial de As(V) fue 5 mM, la reducción completa de arsénico ocurrió

en un periodo de 21 horas. Los mismos autores encontraron que cuando la

concentración inicial de As(V) fue 0.2 mM la velocidad de reducción de As(V) fue

de 0.04 mmol/L·h y una tasa de presencia de As(III) en solución de 0.05 mmol/L·h,

la reducción total de As(V) se alcanzó en 18 h. Cabe mencionar que estas tasas

de reducción de As(V) se lograron en cultivos de alta densidad celular (108

 

células/mL). Das y colaboradores (2015), en un estudio con aguas subterráneas

enriquecidas con arsénico y siendo éstas la fuente de inóculo, determinaron tasas

de reducción de As(V) de 0.011 mmol/L·h sin adición de donador de electrones

(lactato) y de 0.020 mmol/L·h con adición de lactato (1 mM), ambos ensayos con

una concentración de As(V) 5 mM. En este mismo estudio encontraron que a

diferencia del lactato el uso acetato como donador de electrones no favorece las

velocidades de arseniato-reducción comparado con los tratamientos sin adición de

donador. En el presente estudio en los distintos tratamientos evaluados las

velocidades máximas de reducción de As(V) encontradas en los ensayos con CB

fueron de 0.10 a 0.15 mmol de As(V)/L·h y en CT de 0.25 a 0.31 mmol de

As(V)/L·h que corresponden a velocidades de producción de As(III) para CB de

0.11 a 0.14 mmol de As(III)/L·h y en CT de 0.26 a 0.27 mmol de As(III)/L·h, se

puede notar que las tasas de reducción de As(V) y producción de As(III) son más

o menos consistentes, lo que sugiere que no hay pérdidas de As(V) por procesos

de adsorción en sedimentos. Las mayores velocidades de reducción de As(V) se

obtuvieron en el ensayo adicionado con molibdato (25 mM), anteriormente se

reportó que el molibdato favorece la reducción de As(V) (Oremland et al., 2000).

Las velocidades obtenidas en este trabajo se encuentran dentro del mismo

orden de magnitud que las reportadas para cultivos puros, aunque en la literatura

existen estudios de reducción microbiana de As(V) a partir de sedimentos éstos no

reportan las velocidades de reducción de As(V).

Resultados y discusión

72

 

 

Ensayo meqv. e- donados

meqv. e- aceptados o recuperados

meqv. e- recuperados

Balance deelectronesa

    totales  CB Lactato Acetato As(III) H2S   Fracción

Lactato 10 mM + As(V) 2-

78.4 23.3 19.0 1.3 43.5 0.55  

Lactato 15 mM + As(V) 2-

 

111.7 45.6 16.7 2.4 64.7  

0.58  

Lactato 10 mM + As(V)  

67.0 21.7 17.4 0.0 39.2 

0.584

 5.5.4 Balance general de electrones

 

 

A continuación se presentan los resultados de los balances de electrones

obtenidos para los ensayos donde se evaluó la capacidad arseniato/sulfato

reductora ya sea para sedimento CB (Tabla 5.8) o sedimento CT (Tabla 5.9). En la

sección 4.5.1 se decriben a detalle las reacciones y cálculos considerados para

estos balances. Es importante mencionar que se utilizaron las concentraciones de

reactantes consumidos o producidos durante los experimentos en lote y se

promediaron los triplicados correspondientes a cada ensayo.

Analizando los datos presentados en la Tabla 5.8 se puede inferir que el

balance de electrones (electrones aceptados/electrones donados) en los ensayos

con sedimento CB es deficiente (55% a 58%), esto puede involucrar múltiples

factores. Por una parte, en los ensayos se observó que la relación lactato/acetato

no concuerda estequiométricamente, lo que puede se puede atribuir al consumo

de acetato por parte de otros microorganismos, que oxidan acetato pero no son

sulfato-reductores (Fig. 5.10). Es importante aclarar que en estos balances no se

consideró la formación de biomasa y así mismo hay que tener en cuenta que se

tendrán perdidas de sulfuro ya sea por precipitación y en menor medida por

equilibrio en fase gas. Se trata de un sistema complejo donde están involucrados 2-

dos aceptores de electrones (SO4 y As(V)), además existen procesos de  

precipitación por lo que resulta bastante difícil la cuantificación de los productos de

las reacciones biogeoquímicas involucradas.

 Tabla 5.8. Balance de miliequivalentes de electrones (meqv e-) de ensayos en lote para evaluar capacidad reductora de sulfato y arseniato en sedimento CB.

 

       

10 mM + SO4 10 mM  

10 mM + SO4 10 mM  

10 mM + SO 2-

2-

 10 mM

(c/ MoO4 25 Mm)  a) meqv. e- recuperados/meqv. e- donados

Resultados y discusión

73

 

 

4

 

Tabla 5.9. Balance de miliequivalentes de electrones (meqv e-) de ensayos en lote para evaluar capacidad reductora de sulfato y arseniato en sedimento CT.

 

Tratamiento meqv. e- donados

meqv. e- aceptados o recuperados

meqv. e- recuperados

totales

Balance de electronesa

CT Lactato Acetato As(III) H2S Fracción  

Lactato 10 mM + As(V) 2-

 

97.7 45.2 16.9 2.1 64.2 0.66 10 mM + SO4 10 mM Lactato 15 mM + As(V) 2- 160.9 106.2 4.4 44.0 154.5 0.96 2.5 mM + SO4 10 mM Lactato 10 mM + As(V)

2- 77.7 36.9 17.4 0.0 57.0 0.70

(c/ MoO 2-

 

25 Mm)   

a) meqv. e- recuperados/meqv. e- donados  

En el caso de CT la recuperación de electrones fue mayor (Tabla 5.9), para el

tratamiento que presentó arseniato y sulfato reducción (Lactato 15 mM + As(V) 2-

2.5 mM + SO4 10 mM) se obtuvo 96% de recuperación de miliequivalentes de  

electrones invertidos. Tal como se presentó en la Figura 5.13, el consumo de

lactato y producción de acetato en los ensayos con CT tuvo una relación

estequiométrica cercana y no hubo consumo aparente de acetato, esto coincide

con una mayor fracción de recuperación de electrones. Usando como ejemplo 2-

ilustrativo el ensayo con MoO4 25 mM, en primer lugar se partió de una  

concentración inicial de 8.5 mM lactato pero al final del experimento se consumió

solo 6.5 mM de sustrato y aparentemente se alcanzó una producción de 4.6 mM

de acetato al día 25 (Fig. 5.13), de acuerdo a la esteqiometría de la reacción de

arseniato-reducción solo ocurrió la oxidación incompleta de 4.6 mM de lactato,

partiendo de esto se tenían 55.2 meqv e- de los cuales se consumieron 36.8 meqv

e- en la producción de acetato (8 meqv e- x 4.6 mM) y quedaron disponibles 18.4  

meqv e- que son suficientes para reducir 9.2 mM de As(V), entonces de la

concentración de lactato inicial 1.9 mM pudo ser destinado a síntesis celular y por

tal razón los balances de electrones no cierran completamente (Macy et al., 2000).

Cabe mencionar que se determinó la concentración de arsénico total disuelto

en los controles endógenos para CB la concentración determinada fue de 0.7 mM

(52.4 mg/L) mientras que en CT dicha concentración fue de 0.6 mM (45 mg/L). En

el caso de CB la disolución de yeso (CaSO4·2H2O) puede arrastrar fases de

arseniatos de calcio que también se disolverán dando como resultado As(V) en

Resultados y discusión

74

 

 

4

 solución, el cual está disponible como aceptor de electrones. Cabe aclarar que no

se dio seguimiento a la reducción de arsénico en estos controles. Sin embargo, en

CB es factible que haya ocurrido la arseniato-reducción previo a la sulfato-

reducción observada, pues el sedimento contiene un donador de electrones

endógeno. Tentativamente, en los balances de electrones puede haber una

contribución por la reducción de As(V) endógeno (en CB 0.7 mM x 2 = 1.4 meqv e-

 

y en CT 0.6 mM x 2 e- = 1.2 meqv e-). Debido a que en los ensayos se adicionaron

concentraciones iniciales de As(V) muy altas (10 mM ó 749.2 mg/L) la aportación

de la arseniato-reducción endógena no parece tan importante, no obstante, si nos

trasladamos a los escenarios reales el impacto sería bastante importante.

 

5.6 Caracterización de precipitados biogénicos formados en los cultivos en lote

 

Los cultivos en lote con lactato, As(V) y SO 2-

 

10 mM tanto para sedimentos CB  

como CT presentaron la formación de un precipitado amarillo, la evidencia se

muestra en la Figura 5.15. En el ensayo con lactato 15 mM, As(V) 2.5 mM y

sulfato 10 mM se registró acumulación de sulfuro (7.8 mM) y aunado a esto no

hubo remoción de arsénico disuelto, ni se desarrolló el precipitado amarillo. Es

importante mencionar que la formación del precipitado amarillo está sujeta a la

disponibilidad de una fuente de carbono y a la actividad microbiana, en los 2-

tratamientos sin lactato aun en presencia de As(V) y SO4 no se observó dicho  

precipitado y tampoco en el control estéril y ni en el control químico (sin

sedimento). Por otra parte en el tratamiento con molibdato (donde se suprimió la

sulfato-reducción) no se encontró una disminución de arsénico total en la fase

acuosa, ni se observó precipitado alguno, esto respalda que en los presentes

ensayos tanto el proceso de arseniato-reducción como el proceso de sulfato-

reducción están ligados en la bio-mineralización de arsénico. Es decir, los

procesos biológicos responsables de la producción de As(III) y de la producción de

sulfuro favorecen las condiciones adecuadas (potencial redox y concentraciones

molares de As(III) y H2S) para que se lleve a cabo el proceso fisicoquímico de

precipitación. En otras palabras, la precipitación de arsénico con sulfuro está

condicionada biológicamente.

Resultados y discusión

75

 

 

                  

Figura 5.15. Evidencia de la formación de precipitados en ensayos inoculados con sedimento CT.

 La reducción microbiana de As(V) y sulfato puede promover la formación de

sulfuros de arsénico biogénicos como puede ser el oropimente y rejalgar, desde

luego dependiendo de las condiciones redox y la concentración As(III) y sulfuro.

Como se mencionó en el marco referencial la formación de oropimente (As2S3) y

rejalgar (AsS) obedece las estequiometrias de las reacciones 2.5 y 2.6,

respectivamente. De dichas reacciones puede decirse que la bio-mineralización

conduce al secuestro o retención de arsénico en forma de sulfuros de arsénico

(Newman et al., 1997a; Macy et al., 2000; Rodríguez-Freire et al., 2014).

En los ensayos con lactato, arsénico y sulfato no se detectó un aumento en

la concentración de sulfuro disuelto (Figs. 5.7a, 5.8a 5.10b, 5.12b) muy

probablemente debido a la precipitación inmediata de éste con el As(III) disuelto.

Tomando en consideración el planteamiento efectuado para los balances de

electrones (sección 5.5.4) con la oxidación incompleta de 10 mM de lactato se

podrían reducir 10 mM de As(V) y quedarían miliequivalentes reductores 2-

disponibles para reducir hasta 2.5 mM SO4 . Cabe resaltar que la mineralización  

de sulfuros de arsénico es factible únicamente a bajas concentraciones de H2S

disuelto. Por mencionar un intervalo de concentración, Newman y colaboradores

(1997b) proponen que si se tiene una concentración de 1 mM de As(III) la

concentración de H2S debe ser menor que 1 mM. Con base en reportes previos,

se ha observado que las concentraciones elevadas de sulfuro propician la rápida

tiolación de arsénico, que se refiere a formación de tioarsenitos que permanecen

Resultados y discusión

76

 

 

3 2

4 4

 en solución (Reacción 5.3) o como se mencionó anteriormente el As2S3(amorfo)

puede disolverse si existen concentraciones altas de sulfuro (Reacción 5.2) (Kirk

et al., 2010; Altun et al., 2014)

 

H3AsO3 + 3HS- + 2H+ H2AsS - + 3 H O (pH 7) Reacción 5.3     

Para identificar la composición de los precipitados y elucidar la presencia de

arsénico en ellos, de las cinéticas donde se determinaron las especies de As(III) y

As(V) se recuperaron tres muestras del precipitado amarillo después de 30 días

de incubación correspondientes a los ensayos de CB con lactato 10 y 15 mM +

As(V) 10 mM + SO 2- 10 mM, CT con lactato 10 mM + As(V) 10 mM + SO 2- 10

 

mM y una muestra del precipitado negro formado en el ensayo CT con lactato 10

mM. Las muestras de precipitados fueron sometidas a digestión ácida para

determinar su composición elemental por ICP-OES. Los elementos encontrados

en mayor proporción se pueden apreciar en la Figura 5.16, además en menor

cantidad se encontraron Al, Si, Cu, Li, K, Mg, Mn, P, Pb, Sb, Sn y Zn. En general

los precipitados obtenidos tienen un elevado contenido de calcio, esto puede ser

debido a la composición mineralógica del sedimento (calcita y yeso, sección 5.1).

Las muestras de precipitado formados en los ensayos con sedimento CB

presentan una mayor concentración de arsénico que las muestras de precipitados

formados en los ensayos con sedimento CT. Por ejemplo, en los ensayos con 2-

lactato 10 mM + As(V) 10 mM + SO4 10 mM la concentración de arsénico en el  

precipitado de CB fue 50.9 mg/g y para CT 18.84 mg/g. El ensayo con sedimento

CT en el que se suplementó solo con lactato, y en el que se formó un precipitado

negro, mostró como principales componentes calcio y hierro, pero también

contiene en menor concentración arsénico y azufre (2.5 y 5.1 mg/g de precipitado

respectivamente).

Resultados y discusión

77

 

 

 

 

Figura 5.16 Composición elemental de los precipitados minerales recuperados de los cultivos en lote. Concentraciones determinadas en ICP-OES.

 

  

Cuando se extrajeron los precipitados (después de 30 días de incubación)

se analizó el arsénico total en la fase acuosa; respecto a la concentración inicial

para los dos ensayos inoculados con CB adicionados con lactato 10 y 15 mM,

As(V) y sulfato 10 mM, se encontró una remoción de arsénico de 90% y 93%

respectivamente mientras que para el ensayo con sedimento CT con lactato, As(V)

y sulfato 10 mM se determinó una remoción de 52%, cabe destacar que en el

ensayo CT adicionado solo con lactato (precipitado negro) presentó una

concentración inicial de arsénico de 0.2 mM (15 mg/L), de la cual se removió

100% de la solución. Lo anterior explica porque en el análisis elemental (Fig. 5.16)

se obtuvieron concentraciones mayores de arsénico en los precipitados

recuperados de los ensayos con CB.

En el marco de lo anterior, la remoción de arsénico disuelto por

precipitación ha sido ampliamente reportada. Martínez-Villegas y colaboradores

(2013), en un estudio efectuado en el sistema hidráulico de donde se colectaron

los sedimentos CB y CT, reportan la precipitación de arseniatos de calcio, los

cuales controlan la solubilidad del arsénico en la columna de agua de dicho

sistema; recordemos que los sitios de muestreo además de arsénico presentan un

alta concentración de calcio disuelto (CB 738.7 mg/L y CT 1031.2 mg/L). Por otra

parte bajo condiciones anóxicas y potenciales redox negativos, que son las

condiciones bajo las que se realizaron los ensayos de esta tesis, se ha

Resultados y discusión

78

 

 

 documentado la precipitación de As(III) como sulfuros de arsénico biogénicos, este

proceso se favorece por la reducción microbiana de As(V) y sulfato. Bajo esta

premisa Rodríguez-Freire y colaboradores reportan una remoción de 100% de

arsénico en 9 días, a partir de una concentración inicial de As(V) de 0.5 mM y

usando como inóculo un lodo metanogénico. Demergasso y colaboradores (2007)

encontraron que el arsénico soluble disminuyó de 77.8 a 33.1 mg/L (1.04 mM a

0.44 mM) en solo tres días de incubación en cultivos enriquecidos, recuperados de

sedimentos de un salar. Es importante destacar que usualmente se reportan

remociones de concentraciones bajas de arsénico (<1 mM); a partir de los

sedimentos CB se consiguió una remoción de 9.2 mM de As(V) que equivale a

689.3 mg/L en un periodo no mayor a 30 días y a pesar de las concentraciones de

arsénico potencialmente inhibitorias la biota microbiana nativa no se inhibió.

Físicamente en los ensayos con sedimento CB se observó una mayor

cantidad de precipitado que en los ensayos con CT, y el precipitado fue visible en

un menor periodo de tiempo, una vez iniciada la incubación en CB se comenzó a

apreciar la formación del precipitado a partir del día 5 y en CT a partir del día 9. En

la Figura 5.17 se ilustra la cinética de remoción de arsénico en solución para CB y

CT y queda claro que la formación del precipitado ocurre de forma más rápida en

los ensayos con sedimento CB. Esto podría estar relacionado con que el

sedimento CB presentó una mayor concentración inicial de sulfuro y las tasas de

sulfato-reducción fueron también mayores, esto redunda en que el sistema

alcanzó potenciales redox negativos en un corto periodo de tiempo, lo que

favorece la precipitación de fases tipo sulfuros (Gorny et al., 2015). El ensayo con

sedimento CB mostró inclusive diferentes pendientes que implican diferentes

etapas de remoción de arsénico. En contraste los ensayos con sedimento CT

requierieron más tiempo para modificar las condiciones redox. El ensayo inoculado

con sedimento CT mostró una fase de latencia (de aproximadamente 6 días) antes

de que se observara la disminución de arsénico disuelto, lo cual puede estar

relacionado con la menor actividad sulfato-reductora. También puede estar

relacionado con la mayor concentración de arsénico que presenta dicho

sedimento, respecto a CB. Además, no hay que perder de vista la disponibilidad

Resultados y discusión

79

 

 

Po

rcen

taje

de

rem

oció

n d

e A

s

(%)

tota

l

Po

rcen

taje

de

rem

oció

n d

e A

s

(%

) to

tal

 de un donador de electrones endógeno en CB, que puede mantener activa la biota

microbiana nativa, mientras que el sedimento CT no presentó actividad endógena

por lo que es de esperarse que la biota microbiana presente una mayor fase de

latencia.  

 

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

 

CB  

           0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tiempo (d)

 100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

 

CT           

 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Tiempo (d)  

Figura 5.17. Porcentaje de remoción de arsénico disuelto en función del tiempo para 2-

sedimentos CB y CT a partir del ensayo con lactato 10 mM, As(V) 10 mM y SO4 10 mM.  

Como ya se mencionó anteriormente, en el sistema hidráulico del que se

obtuvieron los sedimentos se efectuó un estudio de modelación hidrogeoquímica

considerando una escala espacial (diferentes puntos) y temporal, para explicar las

altas concentraciones de arsénico en la columna de agua (hasta 158 mg/L). En

primer lugar se determinó una relación lineal entre el calcio y el arsénico disuelto y

se concluyó que la precipitación y disolución de arseniatos de calcio funge como

principal mecanismo de control de movilidad de arsénico, en ese caso bajo

condiciones óxicas (Martínez-Villegas et al., 2013). Haciendo una relación con

dicho reporte, en el punto que corresponde al sitio donde se colectó el sedimento

CT, los autores citados, encontraron la mayor concentración de arsénico en la

columna de agua (en promedio 91 mg/L). Se reportó también que dicha

concentración disminuye alrededor de 90% en el punto que corresponde al sitio de

donde se obtuvo el sedimento CB (en promedio 13 mg/L) (Martínez-Villegas et al.,

2013). En concordancia con el reporte citado, en la presente tesis se encontró una

mayor remoción de arsénico disuelto en los ensayos inoculados con sedimento CB

(90%) respecto a los ensayos con CT (52%). Los resultados sugieren que el

Resultados y discusión

80

 

 

 proceso microbiano de arseniato-reducción acoplado al de sulfato-reducción

puede desempeñar un papel importante en el control de la movilización de

arsénico bajo condiciones anóxicas. Aun cuando los ensayos en microcosmos no

simulan las condiciones de los sitios de muestreo, eventualmente en los

sedimentos in situ se podrían alcanzar condiciones anóxicas y los procesos

microbianos, discutidos, podrían ocurrir y tener un efecto significativo en la

distribución del arsénico; además dichos procesos podrían estar implicados en la

menor concentración de arsénico observada en el sitio CB.

 

 5.6.1 Mineralogía de precipitados biogénicos

 

 

Las muestras de precipitados descritas en la sección anterior se analizaron por

difracción de rayos X, para conocer la naturaleza mineral del precipitado. Los

resultados obtenidos se muestran en las Figuras 5.18 y 5.19 para los ensayos con

sedimentos CB y CT respectivamente, este análisis indica una mezcla dominante

de los minerales calcita, cuarzo y yeso que son parte primordial de la mineralogía

de los sedimentos (sección 5.1). Castillo y colaboradores (2015) realizaron un

estudio en muestras de sedimento del acuífero donde donde se colectaron los

sedimentos CB y CT para identificar arseniatos de calcio; por difracción de rayos X

no lograron identificar los arseniatos de calcio y al respecto discuten que se

encuentran en una matriz de calcita, yeso y cuarzo lo que impide detectar la señal

de los arseniatos. Cabe destacar que los análisis de difracción rayos X en

sincrotrón sí les permitieron identificar picos de fases de arseniatos de calcio. 2-

El difractograma del ensayo CB con 10 mM de lactato, As(V) y SO4 (Fig.  

5.21a) confirma la similitud con los patrones de difracción del sedimento CB puro

(Fig. 5.1a), eventualmente el precipitado se integra al sedimento por lo que

posiblemente la composición mineralógica de éste se enmascara con la

composición original del sedimento, debido a que la intensidad de la señal de las

fases cristalinas presentes en el sedimento es mucho mayor, en contraste con la

señal emitida por el precipitado. En este caso el patrón de difracción de rayos X

muestra los picos de reflexión de mayor intensidad en valores del ángulo 2 theta

alrededor de 20.98, 29.66 y 31.34 (el patrón de difracción fue comparado con las

Resultados y discusión

81

 

 

 cartas cristalográficas 21-0816 y 72-0596 yeso; 27-0029 y 72-4582 calcita y 75-

0443 cuarzo). Se pueden observar cuatro picos de intensidad mínima que podrían

estar relacionados con una fase cristalina de oropimente, los valores en el ángulo

2 theta son 15.52 y 18.0 (el patrón de difracción fue comparado con las cartas

cristalográficas 63-0359 oropimente, 27-0028 As2S3).

El difractograma de la Figura 5.18b, presenta calcita y en menor  

abundancia se observa yeso, en este caso es preciso indicar que el precipitado se

observaba como una mezcla color amarillo-negro, esta muestra provenía del 2-

ensayo con lactato 15 mM, As(V) y SO4 10 mM.  

Figura 5.18. Patrones de difracción de rayos X de precipitados de los cultivos en lote con 2- sedimento CB: a) ensayo con lactato (10 mM), As(V) (10 mM) y SO4 (10 mM); b) ensayo con lactato (15 mM), As(V) (10 mM) y SO4

2- (10 mM). Muestras tomadas después de 30 días de incubación. C: calcita; Q: cuarzo; Gy: yeso; O: oropimente. * Picos de difracción de mayor intensidad.

 En cuanto a los precipitados recuperados de los ensayos inoculados con

sedimento CT, en la Figura 5.19a se puede apreciar que el difractograma coincide

Resultados y discusión

82

 

 

 en gran medida con el que se obtuvo para el ensayo preparado de la misma forma

pero inoculado con sedimento CB. Los picos de reflexión de mayor intensidad se

encuentran en los valores del ángulo 2 theta de 21.0, 29.34 y 31.34. La

mineralogía del precipitado amarillo formado en ensayos con uno u otro sedimento

indica que tienen una composición similar. En el sedimento CT se pudieron

indentificar las señales correspondientes a calcita y cuarzo pero no se identificó

yeso (Fig. 5.1). Se ha reportado que si se tiene calcio y sulfato en solución, como

es el caso de estos ensayos, puede ocurrir la cristalización de yeso (Zhang et al.,

2015).

  

Figura 5.19. Patrones de difracción de rayos X de precipitados de los cultivos en lote con 2-

sedimento CT: a) ensayo con lactato (10 mM), AsV (10 mM) y SO4 (10 mM); b) ensayo con lactato (10 mM). Muestras tomadas después de 30 días de incubación. C: calcita; Q: cuarzo; Gy: yeso. * Picos de difracción de mayor intensidad.

 En la Figura 5.19b se presenta el análisis del precipitado negro (CT

únicamente con lactato 10 mM) se puede corroborar la existencia de calcita y

Resultados y discusión

83

 

 

 cuarzo, el difractograma coincide con el obtenido para el sedimento CT (Fig. 5.1),

lo que es lógico ya que en este ensayo únicamente se adicionó lactato.

Con el análisis de difracción de rayos X, efectuado para las muestras de los

precipitados, no fue posible identificar la presencia de fases minerales de sulfuros

de arsénico.

 

5.6.2 Análisis de la morfología y la composición elemental  

Los precipitados obtenidos en las cinéticas de especiación de arsénico y cuyo

análisis de difracción de rayos X se mostró anteriormente también (Figs. 5.18 y

5.19) fueron sometidos a un microanálisis químico por EDS-MEB para poder

identificar de forma más fina su composición elemental y corroborar la presencia

de arsénico y azufre en ellos. A continuación se presenta la morfología y la

distribución de los elementos que conforman los precipitados (Figs. 5.20, 5.21,

5.22 y 5.23).

En las Figuras 5.20 y 5.21 se desglosan los resultados de los precipitados

formados en los ensayos inoculados con CB. Primero se presenta el ensayo con 2-

lactato 10 mM, As(V) y SO4 10 mM (precipitado amarillo, Fig. 5.20) y segundo el  

precipitado con lactato 15 mM y arsénico y sulfato 10 mM (precipitado amarillo-

negro, Fig. 5.21). Sin considerar el carbono y el oxígeno el microanálisis revela

una mayor proporción másica porcentual (Pt%) de arsénico, azufre, calcio y silicio.

En general la composición elemental de los puntos analizados (a y b) está

relacionada con la naturaleza del sedimento.

En la micrografía se pueden visualizar la presencia abundante de

microorganismos rodeados por el precipitado mineral, esto muestra la asociación

entre los microorganismos y la formación del precipitado.

Resultados y discusión

84

 

 

 

 

Figura 5.20. Análisis EDS-MEB de precipitados recuperados de la cinética de sulfato- arseniato reducción con sedimento CB: Ensayo con lactato (10 mM), As(V) (10 mM) y 2-

SO4 (10 mM).  

 

Figura 5.21 Análisis EDS-MEB de precipitados recuperados de la cinética de sulfato- arseniato reducción con sedimento CB: Ensayo con lactato (15 mM), As(V) (10 mM) y 2- SO4 (10 mM).

 

A continuación se muestran los análisis de los precipitados recuperados de

los experimentos con sedimento CT. En la Figura 5.22 podemos notar que el

precipitado que se formó en el ensayo con 10 mM de lactato, As(V) y sulfato era

de color amarillo dorado y de acuerdo con el análisis EDS-MEB la distribución

elemental resultó bastante heterogénea en los puntos analizados (a y b), se

determinó que el precipitado contiene azufre, arsénico, calcio, silicio y aluminio, a

excepción del azufre y el arsénico los elementos encontrados también se

determinaron en el análisis del sedimento puro.

Resultados y discusión

85

 

 

 

 

Figura 5.22 Análisis EDS-MEB de precipitados recuperados de cinética de sulfato- arseniato reducción con sedimento CT: Ensayo con lactato (10 mM), As(V) (10 mM) y 2-

SO4 (10 mM).   

En la Figura 5.23, se muestra la composición del precipitado negro formado

en el tratamiento inoculado con sedimento CT, adicionado con lactato, sin As(V) y 2-

sin SO4 , este precipitado no tuvo lugar en el tratamiento preparado de la misma  

forma pero inoculado con sedimento CB, posiblemente debido a la menor

proporción de hierro comparado con CT. Recordemos que en el sedimento CT se

determinó una concentración de hierro de 2610.12 ±140.9 mg/kg, entonces la

presencia de hierro podría descompensar el balance atómico de As-S, y el

precipitado negro que se observó podría deberse a la formación de un sulfuro de

hierro.

 

Figura 5.23 Análisis EDS-MEB de precipitados recuperados de cinética de sulfato- arseniato reducción con sedimento CT: Ensayo con lactato (10 mM).

Resultados y discusión

86

 

 

 Los sulfuros de hierro precipitan a una mayor velocidad que los sulfuros de

arsénico debido a su menor solubilidad, por lo que altas concentraciones de hierro

evitan la precipitación de sulfuros de arsénico (O’Day et al., 2004). Se puede ver

que el análisis del Punto a no contiene arsénico, ni azufre. Sin embargo, el Punto

b sí presentó una proporción de arsénico y azufre (Fig. 5.23).

  

Se hizo el esfuerzo de identificar los precipitados amarillos formados en los

ensayos con lactato, As(V) y sulfato, y a cuya formación se atribuye la remoción

de arsénico disuelto. Sin embargo, los análisis de difracción de rayos X y EDS-

MEB mostraron que la composición del sedimento interfirió de forma importante.

Los difractogramas obtenidos por difracción de rayos X esencialmente

corresponden a fases minerales de yeso, calcita y cuarzo, las cuales son la matriz

principal de los sedimentos. Respecto a los análisis EDS-MED, efectivamente se

identificaron entre los componentes principales de los precipitados el arsénico y el

azufre. Sin embargo también se encontró calcio, silicio y en menor proporción

hierro, aluminio, sodio e incluso magnesio y potasio, todos estos elementos

forman parte de la composición elemental del sedimento (Sección 5.1). Estos

resultados no se esperaban ya que el sedimento y el precipitado no estaban

mezclados dentro de los microcosmos y aparentemente se recuperó solamente el

precipitado amarillo.

 

5.7 Caracterización microbiológica de los sedimentos  5.7.1 Estimación del número más probable de bacterias arseniato

reductoras  

El arsenito es un producto del metabolismo arseniato-reductor y puede ser

detectado fácilmente por la adición de sulfuro que conlleva a la formación de

trisulfuro de arsénico, el cual es un precipitado amarillo cuya cinética de formación

es inmediata en medios ácidos al estar disponible As(III) y sulfuro. La formación de

precipitado se consideró como un resultado positivo para poder cuantificar el

número más probable (NMP) de bacterias arseniato-reductoras en los sedimentos.

Es decir, la formación de un precipitado amarillo indicó la presencia de

Resultados y discusión

87

 

 

 microorganismos con capacidad reductora de As(V), cuando este último se

encontraba en el medio como único aceptor de electrones.

A partir de los cultivos de las diluciones seriadas de sedimento CB se

obtuvo un NMP de bacterias arseniato-reductoras de 4.3x107 células/g de

sedimento y en el caso de CT de 21x107 células/g de sedimento. El NMP de

microorganismos reductores de As(V) fue ligeramente mayor en el sedimento CT,

lo que coincide con que dicho sedimento presentó mayores velocidades de

reducción de As(V); aunque de acuerdo a los límites de confianza de las tablas

para NMP la diferencia en el NMP de ambos sedimentos no es estadísticamente

significativa. Tal como se mencionó en la sección 4.3.4 se evaluó un control

negativo (sin microorganismos) y en este no hubo formación del precipitado tras la

adición de sulfuro (~1.5 mM), como tampoco la hubo en los cultivos de las

diluciones mayores (10-8 - 10-10), los cuales dieron un resultado negativo. En la

Figura 5.24 se muestra la evidencia de la prueba.

  

Figura 5.24. Determinación de NMP: a) Aspecto de las botellas en las que se detectó reducción de arsénico, b) Aspecto de las botellas donde no hubo crecimiento o presencia de microorganismos reductores de arsénico.

Resultados y discusión

88

 

 

 La experimentos para estimar NMP se realizaron conforme a lo reportado

por Kuai y colaboradores (2001), estos autores evaluaron el NMP en sedimentos

de un estanque y en sedimentos de un humedal en sitios contaminados con

arsénico en Massachusetts, encontrando un NMP 7.6x103 y 7.6x104 células/g de

sedimento de estanque y 3.1x104 y 13.1x104 células/g de sedimento humedal. Los

resultados aquí obtenidos fueron mayores entre tres y cuatro órdenes de

magnitud, esto habla de que la comunidad arseniato reductora podría tener un rol

importante en los sedimentos estudiados. En el salar Ascotán, Chile, se determinó

un NMP 1.6x106 células/g en sedimentos que tenían concentración de arsénico

de 781 mg/kg, la cual es una concentración cercana a la cuantificada en el

sedimento CT (Demergasso et al., 2007).

 

5.7.2 Morfología celular  

De los cultivos preparados para la determinación del número más probable se

seleccionaron las diluciones mayores que dieron un resultado positivo en la

cuantificación de NMP y se prepararon frotis que se tiñeron para determinar el

Gram de los microorganismos. Posteriormente estos cultivos se transfirieron a 2-

medio basal con lactato, As(V) y SO4 en una concentración de 10 mM para de  

cierta manera seleccionar microorganismos arseniato-reductores y una vez que

los cultivos mostraron crecimiento también se prepararon frotis con tinción Gram.

Finalmente los frotis se observaron al microscopio. En la micrografía (Fig. 5.25) se

observa que la morfología celular corresponde principalmente a bacilos, se

presentan cocos en mucha menor abundancia y se trata de bacterias Gram

positivas ya que se tiñeron de color morado. Desulfotomaculum auripigmentum y

Desulfitobacterium frappieri son bacterias Gram positivas que se han reportado

con capacidad de reducir de forma no asimilativa arsénico y sulfato, como

aceptores finales de electrones. Dado que el As(V) se reduce extracelularmente se

podría observar un gradiente de formación de As(III) desde los microorganismos al

seno de la solución, permitiendo la precipitación extracelular de arsénico y sulfuro

(Newman et al., 1997b; Niggemyer et al., 2001).

Resultados y discusión

89

 

 

 

 

Figura 5.25. Micrografías de frotis con tinción Gram de un cultivo correspondiente a una dilución de 1x10-6 de sedimento CB: a) Cultivo en medio NMP b) Cultivo con medio basal, lactato, As(V) y SO4

2- 10mM. Imagen obtenida con un microscopio óptico ZEISS Axiostar Plus, con un lente de inmersión Neofluar 60x y una cámara Zeiss Axion-MR3.

 

 5.7.3 Comparación del precipitado favorecido por actividad microbiana y el

obtenido en la prueba de NMP   

Como se explicó anteriormente al determinar el número más probable se indujo la

formación de oropimente en los cultivos con la adición de sulfuro, el precipitado

obtenido (Fig. 5.26a) se comparó con una muestra de precipitado desarrollado en

por actividad biológica sulfato/arseniato reductora un cultivo correspondiente a una

dilución de 1x10-6 de sedimento CB (Fig. 5.26b). En la Figura 5.26a se puede

apreciar que la relación másica porcentual entre arsénico y azufre en del

precipitado sintético coincidió con una fase oropimente a mientras tanto en la

Figura 5.26b se puede advertir que relación másica del precipitado biogénico fue

más cercana a una fase tipo rejalgar. La apariencia física de uno y otro precipitado

muestra diferencias, la morfología superficial del precipitado biogénico (Fig. 5.26b)

Resultados y discusión

90

 

 

 deja ver que se trata de una fase amorfa, no se observan cristales definidos a

diferencia del precipitado sintético, inducido por adición de sulfuro, en el cual se

pudieron observar cristales (ver anexo 3).

Es importante mencionar que los precipitados biogénicos, cuya formación

está sujeta a actividad microbiana, normalmente presentan diferencias

comparados con los minerales sintetizados químicamente. Esto se debe a que los

primeros son de menor tamaño, menos cristalinos (se presentan como fases

amorfas), cuando precipitan arrastran consigo materia orgánica, exhiben gran área

superficial y presentan carga negativa a pH neutro (Muehe et al., 2013).

  

Figura 5.26 Análisis EDS-MED de precipitados recuperados de cultivos de sedimento CB: a) Precipitado cuya síntesis fue inducida por la adición de sulfuro en una concentración final de 1-1.5 mM, b) Precipitado favorecido por actividad microbiana 2-

reductora de As(V) y SO4 .

Conclusiones y perspectivas 

 6. Conclusiones y perspectivas

 

 

6.1 Conclusiones  

 

La caracterización de los sedimentos hizo patente que la composición química de

éstos es un factor primordial para los procesos microbianos, desde la

disponibilidad de carbono orgánico hasta la presencia de potenciales aceptores de

electrones. En este estudio se trabajó con el sedimento Cerrito Blanco y Club de

Tiro, los cuales mostraron diferencias fisicoquímicas entre sí que finalmente se

reflejaron en los procesos microbianos observados en los ensayos de

microcosmos.

Uno de los propósitos del trabajo fue establecer si la biota microbiana de los

sedimentos Cerrito Blanco y Club de Tiro tenía capacidad para realizar los

procesos de arseniato y sulfato reducción, y se encontró que las comunidades

presentes en ambos sedimentos son capaces de realizar estos dos procesos y no

requieren un periodo de aclimatación o enriquecimiento aun cuando se

adicionaron concentraciones de As(V) potencialmente inhibitorias para los

microorganismos (~750 mg/L). El proceso más favorecido en los ensayos de

microcosmos fue arseniato-reducción, esto se esperaba ya termodinámicamente

es más favorable. No obstante, si hay una fuente de carbono disponible, como

puede ser lactato también se realiza sulfato-reducción, aunque no se descarta que

exista cierto grado de inhibición sobre la reacción de sulfato-reducción en

presencia de altas concentraciones de As(III).

De acuerdo con los experimentos de especiación de arsénico en promedio

para Cerrito Blanco se alcanzaron velocidades máximas de reducción de 0.13

mmol de As(V)/L·h, siendo mayores las velocidades determinadas para Club de

Tiro en promedio 0.27 mmol de As(V)/L·h. En contraste las velocidades de

reducción de sulfato o producción de sulfuro fueron ligeramente mayores para

Cerrito Blanco de 0.04 a 0.09 mmol de H2S/L·h y para Club de Tiro de 0.02-05 2-

mmol SO4 /L·h. Los resultados son congruentes con la composición química de  

los sedimentos.  

     

91

Conclusiones y perspectivas

92

 

 

 La bio-precipitación de sulfuros de arsénico en sistemas anaerobios ocurre

a partir de especies de As(III) y H2S, es decir va ligada tanto al proceso de

arseniato-reducción como al de sulfato-reducción. En los experimentos en lote en

presencia de microorganismos, así como de una fuente de carbono y de aceptores 2-

de electrones en este caso As(V) y SO4 , se desarrollaron precipitados minerales  

de color amarillo. Una baja velocidad de sulfato-reducción pudo sustentar la bio-

mineralización de arsénico. En ensayos con sedimento CT cuando se tiene una

menor concentración de As(V) (2.5 mM) aunado a una mayor concentración de

lactato (~15 mM) se favorece la acumulación de sulfuro disuelto pues se alcanzan

mayores velocidades de reducción de sulfato y esto conduce a la inhibición del

proceso de mineralización de arsénico, manteniéndolo en solución.

Con base en el análisis elemental se determinó que el precipitado amarillo

contiene azufre y arsénico entre otros elementos característicos de la mineralogía

del sedimento. Las relaciones másicas entre azufre y arsénico de los precipitados

encontrados en los ensayos de microcosmos, sugieren que se podría tratar de

fases tipo rejalgar y oropimente. Sin embargo, no se confirmó la existencia de

estas fases minerales por difracción de rayos X.

Por último la estimación del número más probable de microorganismos

reductores de As(V) indicó que en los sedimentos CB y CT la comunidad

arseniato-reductora tiene una proporción importante y por ende potencial para

interferir en el ciclo biogeoquímico del arsénico.

Con base en lo observado en el control endógeno, la sulfato-reducción y

arseniato-reducción biológica podrían desempeñar un papel importante en la

movilización e inmovilización de arsénico en los sedimentos del sistema hidráulico

Matehuala-Cerrito Blanco, ya que dichos procesos microbianos potencialmente

interfieren en las condiciones redox del sistema así como en procesos de

disolución y precipitación.

Conclusiones y perspectivas

93

 

 

-

 6.2 Perspectivas

  

Para enriquecer los resultados obtenidos sería recomendable evaluar los

siguientes aspectos en trabajos futuros:

  Efectuar ensayos en lote donde se evalúen concentraciones diferentes del

donador de electrones así como de As(V) y sulfato para valorar su efecto en la

mineralización de arsénico. Por ejemplo la velocidad de sulfato-reducción limita

la bio-mineralización de arsénico cuando hay disponibilidad de carbono

entonces, examinar concentraciones de molibdato que no inhiban

completamente a las BSR puede ser una herramienta para controlar la

concentración de sulfuro en sistemas con bajas concentraciones de As y alto

contenido de carbono orgánico.

Otra alternativa interesante es el estudio de otros donadores (glucosa,

formiato) así como otros aceptores (NO3 , FeIII, MnIV)) de electrones para

evaluar su influencia en las velocidades de reducción de As(V) y en las

distintas transformaciones del arsénico. Un donador o aceptor puede inducir el

dominio de determinados géneros bacterianos, favorecer distintos procesos

microbianos por lo que a su vez tendrán un efecto significativo en la

especiación y estabilización del arsénico.

Identificar por técnicas de biología molecular los microorganismos presentes en

los sedimentos estudiados para determinar si se trata de microorganismos que

se han descrito con anterioridad y poder investigar de forma más precisa su

participación en el ciclo biogeoquímico del azufre y arsénico.

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 7. Referencias bibliográficas

  

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105

Anexos 

 

 Anexos

Anexo 1. Solución mineral Wolfe’s

 Solución mineral Wolfe’s (g/L): MgSO4·7H2O (3), Acido nitriloácetico (1.5), NaCl

(0.1), MnSO4·H2O (0.5), FeSO4·7H2O (0.1), CoCl·6H2O (0.1), CaCl2 (0.1),

ZnSO4·7H2O (0.1), CuSO4·5H2O (0.01), AlK(SO4)2·12 H2O (0.01), H3BO3 (0.01),  

Na2MoO4·2 H2O (0.01). Preparación: adicionar el ácido nitriloacético a 500 mL de

agua desionizada; disolver ajustando el pH con KOH; adicionar los componentes

restantes y aforar a 1 L.

106

Anexos 

 

 Anexo 2. Precipitados biogénicos recuperados de ensayos en lote para evaluar capacidad reductora de sulfato en presencia de As(V)

 Precipitado amarillo obtenido del ensayo con sedimento CB con 10 mM de cada

  2- uno: lactato, As(V) y SO4 después de 15 días de incubación.

 

  

107

Anexos 

 

 Precipitado amarillo obtenido del ensayo con sedimento CT con 10 mM de cada

  2- uno: lactato, As(V) y SO4 después de 30 días de incubación.

 

  

108

Anexos 

 

                     

                    

C K 22.43 33.1 O K 44.18 48.95 MgK 1.17 0.85 AlK 4.4 2.89 SiK 12.01 7.58 S K 0.99 0.55 K K 1.12 0.51 CaK 10.74 4.75 FeK 1.37 0.44

C K 14.91 23.61 O K 44.19 52.54 MgK 1.24 0.97 AsL 1.53 0.39 AlK 4.96 3.5 SiK 16.55 11.21 S K 0.91 0.54 K K 1.34 0.65 CaK 12.73 6.04

 Precipitado negro obtenido del ensayo con sedimento CT con 10 mM de lactato

después de 30 días de incubación.

   

SiK  

 OK

  

AlK

a)   

CaK

 

CK AsL  SK KK CaK

 FeK

 

 AsK

 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

Ke V Elemento Pt % At %

        

AsK 1.58 0.37  

SiK b)   

CaK OK

 AlK

  

AsL CK

 SK KK CaK  

FeK  

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

Elemento Pt % At %         

FeK 1.64 0.56

Ke V

109

Anexos 

 

 Anexo 3. Cristales de precipitado amarillo formado en cultivos NMP por adición de sulfuro ~1.5 mM

  

110

Anexos 

 

 Anexo 4. Mineralogía de los sedimentos mezclados con el precipitado biogénico formado en los cultivos microbianos: a) CB y b) CT