UNIVERSIDAD NACIONAL DANIEL ALCIDES CARRION

FILIAL LA MERCED

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

E. F. P. EN INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

22CATEDRATICO : ING ANTONIO OTAROLA

ALUMNO : VARGAS CORONEL YOEL

SEMESTRE : “VIII”

LA MERCED – CHANCHAMAYO

RECONOCIMIENTO DE LA ACTIVIDAD BIOCATALITICA DE ENZIMAS

I. INTRODUCCION

En la actualidad los alimentos juegan un papel muy importante en nuestra vida cotidiana, es por eso que el ingeniero alimentario debe de conocer la importancia y la forma de cómo actúan las enzimas en los alimentos. Las enzimas son sustancias proteínicas que producen las células vivas y que actúa como catalizador de los procesos metabólicos.

Los enzimas, a diferencia de los catalizadores inorgánicos catalizan reacciones específicas. Sin embargo hay distintos grados de especificidad. El enzima sacarasa es muy específico: rompe el enlace b-glucosídico de la sacarosa o de compuestos muy similares. Así, para el enzima sacarasa, la sacarosa es su sustrato natural, mientras que la maltosa y la isomaltosa son sustratos análogos. El enzima actúa con máxima eficacia sobre el sustrato natural y con menor eficacia sobre los sustratos análogos. Entre los enzimas poco específicos están las proteasas digestivas como la quimotripsina

Las enzimas que actúan en estas reacciones se encuentran concentrados en cantidades muy pequeñas y no resultan modificados por ellas. Dichas reacciones son activadas por las enzimas gracias a su estructura que les permite fijarse a un sustrato. Dentro de los que estudiaremos están las: La alfa-amilasa, la biopectinasa, la papaína.

II. OBJETIVOS

Evaluar la actividad biocatalítica de las enzimas de interés en los

procesos agroindustriales

Reconocer la especificidad amilolítica, pectinolítica y proteolítica de

enzimas comerciales

III. REVISION DE LITERATURA

I.1.Enzimas

Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones bioquímicas. Su importancia como catalizadores biológicos.Un catalizador es una sustancia que disminuye la energía de activación de una reacción química. Al disminuir la energía de activación, se incrementa la velocidad de la reacción.Las enzimas se consumen en gran cantidad a través de todos los alimentos frescos como frutas, ensaladas frescas, leche, mantequilla, queso, carne, pescado y huevo.

I.2.Cinética Enzimática

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética y de la dinámica química de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas.

Mecanismo para una reacción catalizada por una enzima con un único sustrato. La enzima (E) une un sustrato (S) y genera un producto (P).La cinética enzimática es el estudio de cómo las enzimas se unen a sus sustratos y los transforman en productos. Los datos de equilibrios utilizados en los estudios cinéticos son obtenidos mediante ensayos enzimáticos.

I.3. Clasificación de las enzimas Óxido-reductasas (Reacciones de oxido-reduccion) Transferasas (Transferencia de grupos funcionales) Hidrolasas (Reacciones de hidrólisis) Liasas (Adición a los dobles enlaces) Isomerasas (Reacciones de isomerizacion) Ligasas (Formación de enlaces, con aporte de ATP)

1.4. Función de las enzimas

En su estructura globular, se entrelazan y se pliegan una o más cadenas polipeptídicas, que aportan un pequeño grupo de aminoácidos para formar el sitio activo, o lugar donde se adhiere el sustrato, y donde se realiza la reacción.Una enzima y un sustrato no llegan a adherirse si sus formas no encajan con exactitud. Este hecho asegura que la enzima no participa en reacciones equivocadas.La enzima misma no se ve afectada por la reacción. Cuando los productos se liberan, la enzima vuelve a unirse con un nuevo sustrato.

1.5. Fuente de enzimas

Las fuentes de enzimas pueden ser de tipo vegetal, animal y microbiana.

Las enzimas de tipo vegetal, se encuentran las porteasas, carbohidrasas ( las cuales descomponen residuos de azúcares de carbohidratos superiores, a-amilasas y b-amilasa

Entre las enzimas de tipo animal están las esterasa ( Lipasa se produce en la mucosa gástrica, el páncreas y las semillas de ricino, fosfotasas: Se obtiene de tejidos animales óseo, muscular, tripsina y quimotripsina se produce en el páncreas y , pectasas )

Las enzimas del tipo microbiano provienen de. Bacterias, hongos.

1.6. Algunas enzimas

La alfa-amilasa: cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca producción de maltosa. Por su acción, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima es resistente al calor, pues a 70°C conserva un 70% de su actividad. Actúa sobre almidones crudos y gelatinizados.

La biopectinasa: es una enzima de origen fungico, producidas por Aspergillus oryzae transformada con el gen de A. aculeatus. Esta enzima permite la clarificación de jugos concentrados al degradar las pectinas provenientes de restos de semillas.

La papaína: La papaína se consigue por la extracción del látex, que es un líquido blanco obtenido mediante cortes en los frutos inmaduros. Luego, en laboratorio, se separa la enzima y se purifica hasta alcanzar un nivel óptimo de calidad para la comercialización y uso. La enzima se usa en estado líquido y tiene una duración mínima de seis meses estando refrigerada. La cualidad principal es el uso como mejorador de las carnes, y el aclaramiento y evitación de sedimentación en las cervezas por su acción en los enlaces de las proteínas.

IV. MATERIALES Y METODOS

IV.1 MATERIALES Enzimas comercia de origen microbiano: alfa-amilasa de bacillus

subtilis. Enzimas de origen fúngico: pectinasa de aspergillus Níger. Enzima de origen vegetal : papaína de carica papaya ( extracto de látex

fresco) Fécula de yuca , papa o camote Gluten de trigo Pectina comercial Termómetro Olla mediana Cocinilla Gradilla Fiolas de 50ml Hidróxido de sodio Glucosa anhidra Baño maría Tubos de ensayo Agua destilada Acido 3.5- dinitrosalisilico Tartrato de sodio y potasio

V. RESULTADOS Y DISCUSIONESV.1METODOLOGIA EXPERIMENTAL

a) Preparación de las enzimas Preparar una solución de alfa amilasa al 1 % en volumen de 50 ml

Preparar una solución de biopeptinasa al 1 % en volumen de 50 ml

Preparar una solución de papaína al 5 % en volumen de 50 ml

b) Preparación de los sustratos A partir de 500 gr de harina de trigo, extraer el gluten mediante lavados

sucesivos del almidón, anotar sus rendimientos

Preparar una solución de fécula al 10% en un volumen de 100 ml

Preparar una solución de pectina comercial al 11 % en volumen de 100

ml

c) Despolimerización del almidón Colocar en tubos de ensayo 5 ml 6 (tubos) de solución de fécula o

almidon y colocar en una gradilla

Introducir la gradilla en baño Maria a 70 ºC

Llegado a dicha temperatura adicionar 1 ml de solución de enzima alfa-

amilaza, y mantener durante 0, 2, 4, 8, 15 y 20 minutos

Cumplido el tiempo de reacción, inactivar cada muestra de los tubos a

ebullición durante 5 min

Enfriar los tubos y registrar los grados brix

A continuación adicionar 2 ml de agua destilada y 2 ml de la solución

coloreada de ácido 3,5-dinitrosalisilico y hacer reaccionar durante 5 min

Realizar la comparación de la variación del color entre las muestras.

d) Despolimerización del gluten de trigo Pesar cantidades iguales de gluten y colocar en placas petri Adicionar 10 ml de la solución de papaína, incluyendo un testigo sin la

enzima Registrar los cambios físicos realizados (textura, ablandamiento, etc)

para comprobar si existe o no actividad proteolítica

e) Despolimerización de la pectina Colocar 10 gr de la solución de pectina (gelificada) en vasos de 50 ml

Adicionar la enzima biopectinasa en las concentraciones de 2, 4, 8, 10 ml

y hacer reaccionar durante 5 min

Llevar a baño María a la temperatura de 40 ‘C con agitación constante y

lenta

Comprobar el grado de despolimerización (viscosidad, textura,

apariencia) comprobando con el testigo sin enzima.

V.2 RESULTADOS

En esta práctica se hizo la preparación de gluten y almidón debiéndose observar la despolimerización o la acción de las enzimas sobre los sustratos.

A. Preparación de las enzimas:Se preparó solución de alfa amilasa al 1% (0.5 gr. de alfa-amilasa en ml.

de agua) y la otra de papaína gotitas (2.5 ml. de papaína en ml. de agua).

B. Preparación de los sustratos: Se preparó los sustratos, de 100 gr. de gluten se le adiciono agua hasta formar una masa elástica con la adición de ml. de agua.Se preparó la solución de papaina

C. Despolimerización del gluten de trigo: A cantidad determinada de gluten y se colocó en placa petri, luego se adiciono solución de papaína a una placa petri y se registró los cambios producidos (textura, ablandamiento) por la actividad proteolítica de la enzima papaína

En esta reacción actúa la enzima proteasa pasado los minutos el gluten no se desintegra; dejándolo más min. el gluten empieza a desintegrarse levementente. Cuanto más tiempo permanece pierde elasticidad

V.3DISCUSIÓN

Según Primo 1997 afirma que: El almidón está formado por la fracción amilosa de cadena recta de moléculas de glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,4; en tanto que la fracción amilopectina, además de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosídicos 1,6. La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca producción de maltosa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a ph 3,3 o a ph menor a 0 ºC por 15 minutos. El ph óptimo de acción está dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancreática. La enzima es resistente al calor, pues a 70°C conserva un 70% de su actividad. Actúa sobre almidones crudos y gelatinizados.

Según Rolstan 2001 comenta que: La alfa-amilasa de origen bacteriano es más estable al calor que la de hongos y de cereales, de manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador. Por este motivo, su adición debe ser bastante cuidadosa para evitar una sobreproducción de dextrina residual y con ello una miga gomosa y pegajosa. Por otra parte, una actividad residual del alfa-amilasa bacteriana en el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservación, al restringir durante el almacenamiento del pan la retrogradación de su almidón, causante del envejecimiento. Al sustituir la adición, de la amilasa por extracto, jarabe o harina malteados, debe tenerse presente la relativa termo-resistencia de su alfa-amilana y su considerable actividad proteolítica.

En la práctica realizada se observó que el almidon que se

encontraba en los tubos pueden transformarse en azucares, por la

medición de grados brix puede aumentar si los tubos se

encuentran más tiempo a las temperaturas requeridas

Según Fennema 1995 afirma que: Las proteasas actúan de un modo

diferente, dado que hidrolizan enlaces peptídicos de gluten. Esto también

reduce el grado de contracción de las piezas de masa y produce unos

tamaños más regulares de productos de panificación. Sin embargo, la

acción de estas proteasas depende del tiempo. Este es el mayor factor

limitador del uso de proteasas en las masas, dado que los fabricantes de

bollos necesitan cierto grado de libertad con respecto al tiempo de reposo

de las masas. Esto es posible con el rápido efecto de los agentes

reductores como los sulfitos, pero no es fácil de conseguir con la acción

continua de las proteasas

Según Lorient. 1989 comenta que: Mediante el uso de una proteasa que sólo puede estar activa al comienzo de la preparación de la masa, se puede reducir la contracción de la masa y se pueden obtener productos horneados, con tamaños más regulares. La acción de la proteasa se puede reducir sustancialmente cuando la concentración del agente oxidante o los agentes oxidantes alcanza un nivel particular (de inactivación). Por consiguiente, la cantidad requerida de enzima necesaria para la producción de suficiente agente oxidante puede depender de la estabilidad de oxidación de la proteasa, la cantidad de proteasa presente, la eficacia del agente oxidante y el tiempo deseado después del cual la actividad de proteasa se deba reducir a un nivel deseado

Cuando se realizó la práctica con harina este fue sometido en dos

placas petrix, uno contenía papaína y el otro no. Se observó de

inmediato que el gluten que contenía papaína se fue desasiéndose

rápidamente en transcurso de minutos.

En cuanto a despolimerización se puede o no comprobar siempre en cuando el poder activo de la enzima.

En cuanto a despolimerización en los tubos se pudo observar precipitaciones de almidón color blanco liquido flotante de color amarillo. Así también se pudo observar separación de fases en otro tubo como blanco; en fin hay separación de fases en solución flotante.

VI. CONCLUSIONES

En la práctica realizada se logró evaluar las actividades biocataliticas de

las enzimas alfa amilasa que tuvo la función de transformar el almidon

de la harina en sacarosa, teniendo como prueba a 6 tubos con sus

respectivos grados brix , también de la enzima , la papaína que reaccionó

rápidamente ante el gluten incluso llegando a reducir su tamaño y ruptura

de su estructura

VII. RECOMENDACIONES

Es necesario acelerar las reacciones que ocurren, donde intervienen las enzimas que juegan un papel muy importante, por lo tanto debemos de conocer sus características que esta presentan.

Utilizar la amilasa que degrada el almidón a azúcares más sencillos que pueden ser utilizados por las levadura en la fabricación del pan. También se emplean proteasas para romper la estructura del gluten y mejorar la plasticidad de la masa, principalmente en la fabricación de bizcochos

Las enzimas se encuentran en todos los seres vivos y son piezas esenciales en su funcionamiento. Desde el punto de vista bioquímico son proteínas que actúan como aceleradores de las reacciones químicas, de síntesis y degradación de compuestos. Una de las características más sobresalientes de las enzimas es su elevada especificidad. Esto quiere decir que cada tipo de enzima se une a un único tipo de sustancia, el sustrato, sobre el que actúa

Las enzimas tienen muchas aplicaciones en diversos tipos de industrias, entre las que se destaca la alimenticia. En algunos casos, como la obtención de yogur, o la producción de cerveza o de vino, el proceso de fermentación se debe a las enzimas presentes en los microorganismos que intervienen en el proceso de producción. Sin embargo, otros procesos de producción de alimentos, pueden realizarse mediante la acción de las enzimas aisladas, sin incluir a los microorganismos que las producen

El metodo de hidrolisis de almidon con una enzima de alfa-amilasa consiste en el tratamiento del almidon, a un ph entre 3,5 y 7,0 y temperatura comprendida entre 50c y 100c, con la enzima alfa-amilasa, durante un tiempo suficiente para producir una disolucion de hidrolizado de almidon

VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el principio del modo de acción del ácido 3,5-dinitrosalisilico?

Los grupos reductores liberados del almidón se miden por su propiedad de reducir el ácido 3,5-dinitrosalicilico.

2. Como se explica las fases de la cinetica enzimática durante su acción biocataliticaCinetica enzimatica

3. El proceso enzimático sigue las siguientes etapas:

En primer lugar el sustrato (S) y la enzima (E) se unen y forman un complejo enzima-sustrato (ES). Una vez formado el complejo ES, este o bien se disocia en enzima más el sustrato o se transforma el sustrato en producto formado el complejo enzima-producto (EP), que se disocia para dar enzima (E) más producto (P).El proceso fue modelizado por Michaelis y Menten y le permitio obtener una ecuación, ecuación de Michaelis-Mente en donde la velocidad de la acción de un enzima es función de la cantidad de sustrato presente, la cantidad de enzima y las características del enzima, la afinidad del enzima por el sustrato y el poder catalítico del enzima:

4. Explicar el mecanismo de acción biocatalitica de las enzimas en sus respectivos polimerosMecanismo de Acción:Como hemos visto las propiedades químicas de una enzima dependen casi enteramente de las cadenas laterales. La actividad catalítica de una enzima

resulta de la unión de la molécula de sustrato al sitio activo de la enzima por medio de interacciones generalmente débiles. Al parecer, las más significativas son las interacciones puente hidrógeno. También debemos recordar que esta unión es sumamente específica.

Ciclo catalítico de una enzimaUna vez que la enzima reconoce al sustrato y se ajusta a él, se forma un complejo que recibe el nombre de complejo enzima-sustrato. La ruptura y la formación de los enlaces se llevan a cabo por las interacciones entre las cadenas laterales de la enzima y los enlaces dentro del sustrato. Una vez que se han formado los productos obtenemos un complejo que recibe el nombre de complejo enzima–producto, finalmente los productos se separarán de la enzima recuperándose esta para reaccionar con otra molécula de sustrato, es decir que en el transcurso de la reacción la enzima no se modifica.

IX. BIBLIOGRAFIA

PRIMO, Y. E 1997. Química de alimentos. Editorial. Acribia.

Zaragoza. 1095p.

FENNEMA, O. 1995. Química de los alimentos.Editorial

Acribia.Zaragoza

JC CHEEFRELJL.CUQ-D LORIENT. 1989 Proteínas Alimentarías.

Editorial Acribia Primera Edición España Zaragoza

Rolstan Lawrie 2001“Avances de la ciencia de la leche” Edit.

Acribia, Zaragoza – España.

X. ANEXOS

Fig.01 Adición de agua a la harina y amasado para

obtención de gluten

Fig.07 tubos de ensayo para medir los grados brix

Fig.05 cambios que ocurren en la muestra dos

con papaína

Fig.04 Obtención de la enzima proteolítica

papaína

Fig.08 gluten con pectinasa en baño maria para luego ver los

cambios

Fig.10 tubos en baño María donde ocurren las

reacciones

Fig.12 adición de agua + 2 ml de acido 3.5- dinitrosalisilico