Área: ingeniería ambiental
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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA QUÍMICA E
INDUSTRIAS EXTRACTIVAS
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
““EELLIIMMIINNAACCIIÓÓNN DDEE CCLLOORROOFFEENNOOLLEESS MMEEDDIIAANNTTEE LLAA CCOOMMBBIINNAACCIIÓÓNN DDEE OOZZOONNAACCIIÓÓNN PPRREEVVIIAA YY
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TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS EN INGENIERÍA QUÍMICA
PRESENTA: PAMELA GUERRA BLANCO
DIRECTOR DE TESIS: DRA. TATIANA TIMOSHINA LUKIANOVA
MÉXICO, D.F. JUNIO 2010
CONTENIDO CONTENIDO RESUMEN ABSTRACT ÍNDICE DE TABLAS ÍNDICE DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS INTRODUCCIÓN CAPÍTULO 1 GENERALIDADES....................................................................... 1
1.1 Clorofenoles como contaminantes del agua .............................................. 1 1.1.1. Propiedades físicas y químicas ......................................................... 2 1.1.2. Toxicidad de los clorofenoles ............................................................. 3 1.1.3. Normatividad respectiva a los fenoles ............................................... 4
1.2 Procesos de tratamiento de agua para eliminar clorofenoles .................... 6 1.2.1. Procesos de tratamiento no destructivos (Recuperación) .................. 6 1.2.2. Procesos de tratamiento destructivos ................................................ 7
1.3 Ozonación ................................................................................................. 8 1.3.1. Propiedades oxidativas del ozono ..................................................... 8 1.3.2. Ventajas y desventajas del ozono aplicado a tratamiento de agua ... 9
1.4 Procesos de Oxidación Avanzada (POAs) .............................................. 10 1.4.1. Definición de POAs .......................................................................... 10 1.4.2. POAs no fotoquímicos ..................................................................... 11 1.4.3. POAs fotoquímicos .......................................................................... 13
1.5. Ozonación y Procesos de Oxidación Avanzada aplicados en la descomposición de fenoles ........................................................................... 14 1.6 Biodegradación ....................................................................................... 18
1.6.1. Definición de biodegradación ........................................................... 18 1.6.2. Ventajas y desventajas de la biodegradación en el tratamiento de agua ........................................................................................................... 20
1.7. Biodegradación de clorofenoles ............................................................. 20 1.8. Combinación de tratamientos químicos y biológicos para la eliminación de contaminantes .......................................................................................... 24
CAPÍTULO 2 DESARROLLO EXPERIMENTAL...............................................29 2.1 Materias primas ....................................................................................... 29 2.2 Esquema experimental a nivel laboratorio............................................... 29
2.2.1 Proceso de ozonación ...................................................................... 31 2.2.2 Proceso de Biodegradación .............................................................. 33 2.2.3. Métodos analíticos ........................................................................... 38
CAPÍTULO 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................41 3.1 Ozonación previa de clorofenoles ........................................................... 41
3.1.1 Saturación de ozono en agua .......................................................... 42 3.1.2 Descomposición del 4-Clorofenol con ozono ................................... 43
3.1.3 Descomposición del 2,4-Diclorofenol con ozono ............................. 52 3.2 Biodegradación de clorofenoles sin pre-tratamiento químico .................. 62
3.2.1 Aclimatación de microorganismos a fuentes de carbono no ozonadas ................................................................................................................... 62 3.2.1 Biodegradación del 4-Clorofenol ....................................................... 63 3.2.2 Biodegradación del 2,4-Diclorofenol ................................................. 64 3.2.3 Biodegradación de los principales intermediarios del proceso de ozonación de clorofenoles ......................................................................... 66
3.3 Selección de las condiciones de ozonación para el tratamiento acoplado (químico-biológico) ........................................................................................ 70
3.3.1 Selección de los tiempos para suspender la ozonación previo a la biodegradación .......................................................................................... 70 3.3.2 Aclimatación de los microorganismos a clorofenoles ozonados ...... 76
3.4 Biodegradación de los clorofenoles pre-ozonados. ............................... 84 3.4.1 Biodegradación del 4-clorofenol previamente ozonado bajo pH 7. .. 85 3.4.2 Biodegradación del 4-clorofenol previamente ozonado bajo pH 12. 94 3.4.3 Biodegradación del 2,4-diclorofenol previamente ozonado bajo pH 7 ................................................................................................................... 96 3.4.4 Biodegradación del 2,4-diclorofenol previamente ozonado bajo pH 12. ............................................................................................................ 100
CONCLUSIONES ............................................................................................105 RECOMENDACIONES ....................................................................................107 BIBLIOGRAFÍA ...............................................................................................108 ANEXOS ..........................................................................................................114
ANEXO A. CURVAS DE CALIBRACIÓN DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS .............................................................................................................. 114 ANEXO B CURVAS DE CALIBRACIÓN DEL HPLC ................................... 116 ANEXO C. DISTRIBUCIÓN DE PRODUCTOS DE LA OZONACIÓN DE CLOROFENOLES NO IDENTIFICADOS. ................................................... 121 ANEXO D. DINÁMICAS DE LA BIODEGRADACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Y ÁCIDOS ORGÁNICOS FORMADOS EN LA OZONACIÓN DE LOS CLOROFENOLES. .............................................................................. 125
RESUMEN
En el presente trabajo se estudió la combinación de ozonación y
biodegradación aerobia como esquema de tratamiento para soluciones modelo
contaminadas con dos clorofenoles: el 4-Clorofenol (4CF) y el 2,4-Diclorofenol
(24DCF).
La ozonación se llevó a cabo en un sistema semi-batch, esta reacción se
estudió bajo dos valores de pH: 7 y 12; para el subsecuente proceso de
biodegradación se empleó un consorcio microbiano previamente aclimatado a la
fuente de carbono a degradar. Es estudio se compone de dos etapas
principales, en la primera se estudiaron ambos tratamientos individualmente,
con el fin de obtener criterios para el acoplamiento de ambos tratamientos en
una segunda etapa.
El estudio de la ozonación de los clorofenoles comprendió la identificación de
subproductos de reacción por la técnica de Cromatografía de Líquidos de Alta
Resolución (HPLC), así como la determinación de las dinámicas (variación de la
concentración con respecto al tiempo) de descomposición de los contaminantes
y las de acumulación y/o descomposición de los eventuales subproductos; en
función de estas dinámicas se eligieron tiempos para suspender la ozonación y
acoplar el proceso de biodegradación.
Una parte importante de este trabajo fue la aclimatación de los
microorganismos a las diferentes fuentes de carbono que se pretendía
degradar. Se aclimató un consorcio para cada fuente de carbono específica, es
decir, cada uno de los clorofenoles sin ozonar, así como los productos de
ozonación de éstos (bajo los diferentes valores de pH de trabajo) en los tiempos
elegidos para suspender la ozonación y acoplar el proceso biológico.
Una vez que se llevó a cabo el proceso combinado, se determinaron mediante
HPLC las dinámicas de descomposición de los productos de ozonación en el
bioproceso. Así mismo, se utilizó la técnica de UV-Vis para obtener información
cualitativa de la degradación obtenida en ambos procesos.
Las mejores condiciones de ozonación para aumentar la eficiencia del
tratamiento biológico se obtuvieron cuando la descomposición del compuesto
inicial fue total (>99%) y cuando las concentraciones de los compuestos
fenólicos formados en la ozonación fue mayor al 60%; bajo estas condiciones el
tratamiento conjunto arrojó mayores niveles de eliminación.
ABSTRACT
In this wok the aerobic bioremediation of pre-ozonated artificially aqueous
solutions involving two chlorophenols: 4-clorophenol (4-CPh) and 2,4-
dichlorophenol (2,4-DCPh) was studied. Ozonation was carried out in a semi
batch reactor at the pH 7 and 12; for biotreatment, a microbial consortium
previously acclimated (to the specific carbon source) was used.
Both treatments were separately studied in a first investigation step. When
enough knowledge of each one was achieved, chlorophenols previous
ozonation and biodegradation were combined.
Ozonation by-products identification was made by HPLC. Chlorophenols
decomposition as well as by-products formation/decomposition dynamics during
chemical oxidation were determined. Those dynamics were used for choosing
the ozonation times to stop chemical oxidation before biological treatment.
Microbial acclimation was a key step in this work. It was really necessary to
ensure the substrates degradation and to reduce biological treatment times.
After combined treatment the assimilation of ozonation by-products during
biotreatment was measured by HPLC. UV-Vis was also used to obtain
qualitative information.
Best results were achieved when total decomposition of chlorophenols was
developed during ozonation process and when phenolic compounds
concentrations were low.
ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1.1 Concentraciones típicas de fenoles en efluentes industriales ............ 2 Tabla 1.2. Propiedades físicas y químicas de los clorofenoles de estudio ......... 3 Tabla 1.3. Límites máximos permisibles para aguas de consumo humano y uso doméstico que únicamente requieran desinfección ............................................ 5 Tabla 1.4. Criterios de calidad admisibles para la preservación de la flora y fauna en aguas dulces, frías o cálidas, y en aguas marinas y de estuario. ........ 6 Tabla 1.5. Potenciales redox (E0) de algunos agentes oxidantes (21) ............... 11 Tabla 2.1. Reactivos utilizados en la experimentación ..................................... 29 Tabla 2.2 Condiciones de ozonación de los clorofenoles. ................................ 33 Tabla 2.3. Composición del medio de cultivo .................................................... 35 Tabla 2.4. Consorcios adaptados a compuestos sin ozonar ............................. 36 Tabla 2.5. Longitudes de onda características de los compuestos estudiados. 39 Tabla 3.1 Constantes de reacción de la ozonación de los clorofenoles ........... 41 Tabla 3.2 Concentración máxima de los compuestos identificados en la ozonación del 4-Clorofenol ............................................................................... 51 Tabla 3.3 Concentración máxima de los compuestos identificados en la ozonación del 2,4-Diclorofenol .......................................................................... 59 Tabla 3.4 Concentrado de los compuestos formados a lo largo de la ozonación que no fueron identificados. .............................................................................. 60 Tabla 3.5 Tiempos de ozonación donde se presentan las concentraciones máximas y mínimas de los compuestos no identificados .................................. 61 Tabla 3.6 Compuestos capaces de degradar por los consorcios adaptados a fuentes de carbono sin ozonar .......................................................................... 63 Tabla 3.7 Tiempos de ozonación previa a la biodegradación ........................... 72 Tabla 3.8. Concentración de los productos de ozonación identificados antes del proceso de biodegradación ............................................................................... 74 Tabla 3.9. Concentración relativa (normalizada) de los compuestos fenólicos no identificados, presentes en los clorofenoles ozonados ..................................... 74 Tabla 3.10. Concentración relativa (normalizada) de los ácidos orgánicos no identificados, presentes en los clorofenoles ozonados ..................................... 75 Tabla 3.11. Fuentes de inóculo para la adaptación de los consorcios a los clorofenoles ozonados ...................................................................................... 78 Tabla 3.12. Consorcios adaptados a fuentes de carbono ozonadas ................ 78
ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.1. Estructuras químicas del 4-Clorofenol (1) y 2,4-Diclorofenol (2). ..... 2 Figura 1.2. Mecanismos de reacción del ozono en solución acuosa (18) ............. 9 Figura 1.3. Esquema de reacción propuesto en la literatura para clorofenoles con ozono. ........................................................................................................ 15 Figura 2.1. Tratamientos empleados para las soluciones problema. ................ 30 Figura 2.2. Diagrama del desarrollo experimental. ........................................... 31 Figura 2.3. Diagrama esquemático del sistema de ozonación: (R) reactor, (T) tanque de oxígeno, (G) generador de ozono, (EV1, EV2 EV3) by-pass con electroválvulas, (S) analizador de ozono, (M) sistema de adquisición de datos (C) PC. .............................................................................................................. 32 Figura 2.4. Diagrama del proceso de biodegradación a nivel laboratorio. ........ 34 Figura 2.5. Diagrama del proceso de adaptación de los microorganismos (fill-and-draw). ......................................................................................................... 37 Figura 3.1. Comportamiento del ozono a la salida del reactor durante su saturación en agua bajo pH 7 y 12. .................................................................. 43 Figura 3.2. Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 4-clorofenol (120 ppm), pH 7. .............................................................................. 44 Figura 3.3. Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 4-clorofenol (120 ppm), pH 12. ............................................................................ 45 Figura 3.4 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 7). ............................................................ 46 Figura 3.5 Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 7). ............................................................ 46 Figura 3.6 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 7). .......................................................................... 47 Figura 3.7 Distribución de orgánicos no identificados a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 7) ................................................................................ 48 Figura 3.8 Distribución de compuestos fenólicos a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 12). ............................................................................. 49 Figura 3.9 Distribución de compuestos ácidos orgánicos a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 12). ........................................................................ 50 Figura 3.10 Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 2,4-diclorofenol (120 ppm) a pH 7. .......................................................................... 52 Figura 3.11 Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 2,4-diclorofenol (120 ppm) a pH 12. ........................................................................ 53 Figura 3.12 Comparación de los ozonogramas de ambos clorofenoles (pH 7). 54 Figura 3.13 Comparación del los ozonogramas de ambos clorofenoles (pH 12). .......................................................................................................................... 54 Figura 3.14 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 7). ....................................................... 55
Figura 3.15 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 7). .................................................................... 56 Figura 3.16 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12). ..................................................... 57 Figura 3.17 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12). .................................................................. 58 Figura 3.18 Perfil de biodegradación del 4-clorofenol (120 ppm)...................... 64 Figura 3.19 Perfil de biodegradación del 2,4-Diclorofenol (120 ppm). .............. 65 Figura 3.20 Perfil de biodegradación de compuestos fenólicos formados en la ozonación. ........................................................................................................ 67 Figura 3.21 Perfil de biodegradación de ácidos orgánicos formados en la ozonación. ........................................................................................................ 68 Figura 3.22 Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_10. .......................................................................................................................... 79 Figura 3.23. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_15. .......................................................................................................................... 80 Figura 3.24. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_30. .......................................................................................................................... 80 Figura 3.25. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_12_5. .......................................................................................................................... 81 Figura 3.26. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_7_05. .......................................................................................................................... 82 Figura 3.27 Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_7_08. .......................................................................................................................... 82 Figura 3.28. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_12_5. .......................................................................................................................... 83 Figura 3.29 Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 10 min). .................................................................. 86 Figura 3.30. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 10 min). ................................................................................... 86 Figura 3.31. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 10 min). ..................................... 88 Figura 3.32. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-CF ozonado 10 min (pH 7). ............................................................................... 89 Figura 3.33. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 15 min). ..................................... 90 Figura 3.34 Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-CF ozonado 15 min (pH 7). .................................................................................... 91 Figura 3.35. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 30 min). ..................................... 92 Figura 3.36. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-CF ozonado 30 min (pH 7). ............................................................................... 93 Figura 3.37. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 12, 5 min). ..................................... 94 Figura 3.38. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-CF ozonado 5 min (pH 12). ............................................................................... 95
Figura 3.39. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 7, 5 min) .................................. 97 Figura 3.40. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-DCF ozonado 5 min (pH 7). .............................................................................. 98 Figura 3.41. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 7, 8 min). ................................. 99 Figura 3.42. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-DCF ozonado 8 min (pH 7). ............................................................................ 100 Figura 3.43. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 12, 5 min). ............................. 101 Figura 3.44. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-DCF ozonado 5 min (pH 12). .......................................................................... 102 Figura 3.45. Áreas cromatográficas obtenidas al final del bioproceso. ........... 103 Figura A0.1. Curva de calibración para el 4-Clorofenol (279.9 nm). .............. 114 Figura A0.2. Curva de calibración para el 2,4-Diclorofenol (284.4 nm) ........... 115 Figura B0.3. Curva de calibración (HPLC) para 4-clorofenol. ......................... 116 Figura B0.4. Curva de calibración (HPLC) para 2,4-diclorofenol. ................... 117 Figura B0.5. Curva de calibración (HPLC) para el fenol. ................................ 117 Figura B0.6. Curva de calibración (HPLC) para el catecol. ............................. 118 Figura B0.7. Curva de calibración (HPLC) para la hidroquinona. ................... 118 Figura B0.8. Curva de calibración para el ácido oxálico. ................................ 119 Figura B0.9. Curva de calibración para el ácido fórmico. ................................ 119 Figura B0.10. Curva de calibración para el ácido fumárico. ............................ 120 Figura B0.11. Curvas de calibración para el ácido maleico. ........................... 120 Figura C0.1. Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 12). .................................................. 121 Figura D0.2. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 15 min). ................................................................................. 125 Figura D0.3. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 30 min). ................................................................ 126 Figura D0.4. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 30 min). ................................................................................. 126 Figura D0.5. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 12, 5 min). ................................................................ 127 Figura D0.6. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 12, 5 min). ................................................................................. 127 Figura D0.7. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 5 min). ............................................................. 128 Figura D0.8. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 5 min). .............................................................................. 128 Figura D0.9. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 8 min). ............................................................. 129 Figura D0.10. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 8 min). ............................................................. 129 Figura D0.11. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 12, 5 min). ........................................................... 130
Figura D0.12. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 12, 5 min). ........................................................... 130
LISTA DE ABREVIATURAS
24DCF 2,4-diclorofenol 4-CF 4-clorofenol
CA2_12_5 Consorcio adaptado al 2,4-diclorofenol ozonado 5 minutos (pH 12) CA2_7_05 Consorcio adaptado al 2,4-diclorofenol ozonado 5 minutos (pH 7) CA2_7_08 Consorcio adaptado al 2,4-diclorofenol ozonado 8 minutos (pH 7) CA24DCF Consorcio Adaptado a 2,4-diclorofenol CA4_12_5 Consorcio adaptado al 4-clorofenol ozonado 5 minutos (pH 12) CA4_7_10 Consorcio adaptado al 4-clorofenol ozonado 10 minutos (pH 7) CA4_7_15 Consorcio adaptado al 4-clorofenol ozonado 15 minutos (pH 7) CA4_7_30 Consorcio adaptado al 4-clorofenol ozonado 30 minutos (pH 7)
CA4CF Consorcio Adaptado a 4-clorofenol CAA Consorcio Adaptado a Ácidos Oxálico y Fórmico CAF Consorcio Adaptado a Fenol COT Carbón Orgánico Total DBO Demanda Bioquímica de Oxígeno
DHHS Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU DO600 Densidad Óptica (absorbancia) a λ = 600 nm DQO Demanda Química de Oxígeno EPA Agencia de Protección del Medio Ambiente de EE. UU.
HPLC Cromatografía de Líquidos de Alta Eficiencia HTR Tiempo de Retención Hidraúlico
NIOSH Instituto Nacional de Salud y Seguridad Ocupacional de EE. UU. OSHA Administración de Seguridad y Salud Ocupacional de EE. UU. POAs Procesos de Oxidación Avanzada UPIBI Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología WHO Organización Mundial de la Salud
INTRODUCCIÓN
Los clorofenoles son contaminantes altamente tóxicos que se encuentran en las
aguas residuales de la industria papelera, cafetalera, refinerías, entre otras. La
mayoría se usan como pesticidas, biocidas o antisépticos. Dada la toxicidad de
estos compuestos, representan un riesgo para la salud y es necesario darles
tratamiento para eliminarlos de las aguas residuales.
Los tratamientos destructivos, tales como la oxidación química se destacan por
su alta eficiencia en la remoción de contaminantes, sin embargo, la aplicación
de los mismos puede resultar relativamente costosa. Por otro lado, los procesos
biológicos son de las alternativas más económicas para el tratamiento de
aguas, sin embargo, éstos presentan básicamente 2 inconvenientes: requieren
largos periodos de tiempo y cuando están presentes compuestos altamente
tóxicos en concentraciones relativamente altas, se inhibe el proceso, por lo que
estos métodos (por sí solos) no son efectivos para aguas residuales con altas
concentraciones de xenobióticos.
El ozono es un oxidante muy fuerte y es altamente efectivo en la degradación
de una gran variedad de compuestos orgánicos, si se aplica como etapa previa
a la biodegradación se pueden obtener mejores resultados en la degradación
de altas concentraciones de xenobióticos al oxidarlos parcialmente y
convertirlos en compuestos más fáciles de eliminar en un tratamiento biológico.
En el presente trabajo se estudió el tratamiento combinado de ozonación y
biodegradación (usando las células libres de un consorcio microbiano) aplicado
a soluciones modelo contaminadas con dos clorofenoles: 4-clorofenol (4-CF) y
2,4-diclorofenol (2,4-DCF). En los tratamientos biológicos se incluyó la etapa
previa de aclimatación del consorcio a la fuente de carbono a degradar
(clorofenoles con o sin ozonación previa).
Este trabajo se dividió en tres partes principales. En el capítulo 1 se presenta la
recopilación de la investigación bibliográfica acerca de las propiedades de los
clorofenoles estudiados, así como la toxicidad de los mismos. Posteriormente
se presenta información sobre la ozonación y los procesos de oxidación
avanzada y un resumen del tratamiento de fenoles en fase acuosa con este tipo
de procesos. También se presenta información sobre biodegradación y su
aplicación en la eliminación de fenoles, así mismo se escribe acerca de la
combinación de tratamientos químicos con tratamientos biológicos y la
efectividad conjunta que han demostrado tener para degradar contaminantes.
En el capítulo 2 se hace una descripción de los materiales y métodos usados a
lo largo de la investigación en las 3 partes que conformaron el desarrollo
experimental: ozonación de los clorofenoles bajo condiciones controladas,
biodegradación de los mismos sin ozonación previa; así como la combinación
de ambos tratamientos.
En el capítulo 3 se describen los resultados obtenidos de las tres partes antes
mencionadas; en el estudio de ozonación se hizo la determinación de
subproductos acumulados a lo largo del proceso; posteriormente en la sección
de biodegradación se demuestra que éste no es un tratamiento efectivo para los
clorofenoles; el 2,4-DCF sólo se logró remover un 60% en 10 días, mientras que
del 4-CF no se observó una remoción significativa; por otro lado, se realizó la
biodegradación de los principales compuestos identificados en la ozonación y
éstos sí pudieron ser eliminados en el bioproceso en el rango de uno a tres
días.
Una vez realizados estos tratamientos, se analizaron los resultados obtenidos
en ambos y se eligieron condiciones de ozonación para suspenderla y acoplar
el tratamiento biológico subsecuente. En cuanto al tratamiento combinado, se
dio seguimiento a la descomposición de los productos formados en la
ozonación a lo largo del bioproceso y se encontró que las mejores condiciones
de ozonación para aumentar la eficiencia del tratamiento biológico
corresponden a la descomposición total del compuesto (>99%) y cuando las
concentraciones de los compuestos fenólicos formados en la ozonación sea
mayor al 60%; bajo estas condiciones el tratamiento conjunto arrojó mayores
niveles de eliminación. Finalmente se presentan las conclusiones, así como las
recomendaciones respectivas para la continuación de un trabajo futuro.
1
CAPÍTULO 1. GENERALIDADES Desde los inicios del siglo XX, las actividades humanas han causado
importantes problemas de contaminación en el agua. De acuerdo a la
Organización Mundial de la Salud (WHO, por sus siglas en inglés) la escasez
de agua afecta a más del 40 % de la población mundial debido a razones
políticas, económicas, climatológicas, etc. Además, más del 25% de la
población mundial sufre de problemas de salud e higiene debido al agua
contaminada.(1)
1.1 Clorofenoles como contaminantes del agua
Los clorofenoles constituyen un grupo particular de contaminantes prioritarios
enlistados por la Agencia de Protección del Medio Ambiente de E.U.A. (EPA,
por sus siglas en inglés) (2,3) ya que son compuestos tóxicos y es difícil
removerlos del ambiente. Por ejemplo, la vida media del pentaclorofenol en
ambientes acuosos (aerobios) puede llegar a 3.5 meses, y puede perdurar
durante años en sedimentos orgánicos.(4)
Los clorofenoles son un grupo de sustancias químicas que se producen
añadiendo cloro al fenol. La mayoría son sólidos a temperatura ambiente.
Tienen un fuerte sabor y olor a medicamento. Se usan como preservadores de
madera, pesticidas, herbicidas, biocidas, colorantes ó como antisépticos. Así
mismo, se producen en el blanqueamiento de la pulpa de madera con cloro, en
la producción de papel, ó bien en la cloración del agua potable, si es que ésta
se encuentra contaminada con fenol. (5)
Debido a los múltiples orígenes de los clorofenoles, se pueden encontrar en
aguas subterráneas, superficiales y suelos. Producen olor y sabor desagradable
2
en el agua en concentraciones por debajo de 0.1 mg/L. (6) Éstos se han
encontrado en por lo menos 166 de los 1,467 sitios de la Lista de Prioridades
Nacionales (de Estados Unidos) identificados por la EPA. (5) Las
concentraciones de compuestos fenólicos en desechos industriales varían
según el tipo de actividad proveniente, lo cual se especifica en la tabla 1.1.
Tabla 1.1 Concentraciones típicas de fenoles en efluentes industriales (7)
Actividad industrial Concentración de compuestos
fenólicos (mg/L)
Producción de resinas fenólicas 400
Refinerías 50
Producción de ácido naftalénico 12
En la literatura se han reportado ambientes naturales contaminados con
clorofenoles en rangos de concentraciones que van desde 150 µg/L(8) hasta
100-200 mg/L. (9) Así mismo, las aguas residuales pueden contener hasta 190
mg/L de estos compuestos. (10,11)
1.1.1. Propiedades físicas y químicas
En la tabla 1.2 se presentan las propiedades físicas y químicas de los
compuestos estudiados. Las estructuras químicas del 4-Clorofenol y 2,4-
Diclorofenol se muestran en la figura 1.1.
Figura 1.1. Estructuras químicas del 4-Clorofenol (1) y 2,4-Diclorofenol (2).
3
1.1.2. Toxicidad de los clorofenoles
Los clorofenoles se absorben rápidamente a través de la piel en cantidades
tóxicas; irritan lo ojos y la piel, además, el polvo que producen es muy irritante
para el tracto respiratorio. La exposición a altos niveles de clorofenoles puede
causar daño al hígado y al sistema inmunitario.
Tabla 1.2. Propiedades físicas y químicas de los clorofenoles de estudio(7)
Propiedad Compuesto
4-Clorofenol 2,4-Diclorofenol
Fórmula Química C6H5ClO C6H4Cl2O
Peso Molecular 128.56 163.00
Color Cristal blanco ó rosa Blanco
Estado físico Sólido Sólido
Punto de fusión 43.1 – 43.7°C 45.0 °C
Punto de ebullición 220.0 °C 210.0 °C
Densidad relativa @
20°C 1.2238 1.383
Umbral de olor en el
agua 0.33 µg/L 0.35 µg/L
Umbral de olor en el aire 0.0189 mg/m3 1.4 mg/m3
Solubilidad en agua @
25°C 27 g / L 4.5 g / L
Solubilidad en otros
solventes
Muy soluble en
etanol, cloroformo,
éter, glicerol y
benceno
Etanol, éter
etílico, benceno
y cloroformo
Presión de vapor @ 25°C 0.23 mm Hg 0.14 mm Hg
Hay evidencia que sugiere que hay una tasa mayor de cáncer en gente
expuesta a clorofenoles por largo tiempo, sin embargo, las personas estudiadas
4
también estuvieron expuestas a otras sustancias químicas. El Departamento de
Salud y Servicios Humanos de EE. UU. (DHHS, por sus siglas en inglés) ha
determinado que es razonable predecir que el 2,4,6-triclorofenol es
carcinogénico. (6)
Todos los clorofenoles poseen actividad bactericida, fitotoxicidad, así como la
capacidad de bioacumularse en organismos vivos, lo cual se incrementa
conforme aumenta la cloración y la sustitución se aleja de la posición orto. Este
aumento en la toxicidad puede ser debido a un incremento en la lipofilicidad
(afinidad con las grasas), lo cual facilita que se introduzcan en el organismo. El
orden de toxicidad según la posición del cloro (con respecto al grupo OH) es
para>meta>orto. Por otro lado, la toxicidad depende de qué tan disociada se
encuentre la molécula de clorofenol; las formas no-disociadas de mayor
toxicidad predominan a menor pH, entonces, cuando el pH disminuye hay un
incremento en la toxicidad. (12)
1.1.3. Normatividad respectiva a los fenoles
La EPA recomienda un límite (advertencia de salud) de 2 mg/L para fenol en
agua potable y que el nivel de fenol en aguas superficiales (lagos, arroyos) no
exceda 3.5 mg/L para evitar consumir agua o peces contaminados. Para
proteger a los trabajadores, la Administración de Seguridad y Salud
Ocupacional de EE. UU. (OSHA, por sus siglas en inglés) ha establecido un
límite de 5 ppm para fenol en el aire del trabajo durante una jornada diaria de 8
horas. Por otro lado, el Instituto Nacional de Salud y Seguridad Ocupacional de
EE. UU. (NIOSH) recomienda un límite de 5 mg/L para fenol en el aire del
trabajo durante una jornada de 10 horas diarias y un límite de 16 mg/L durante
un período de no más de 15 minutos. (13)
5
Así mismo, la EPA recomienda que el agua potable no contenga más de 0.04
mg/L de 2-Clorofenol para adultos expuestos de por vida, y 0.05 mg/L para
exposiciones de 1 a 10 días o más en niños. Para el 2,4-Diclorofenol la EPA
recomienda que el agua potable no contenga más de 0.03 mg/L para
exposiciones de 1 a 10 días o más en niños. (12)
La normatividad mexicana con respecto a los compuestos fenólicos está
dispuesta de la siguiente manera:
La NOM-CCA-031-ECOL/1993 establece que el límite máximo permisible de
fenoles para descargas de aguas residuales provenientes de la industria,
actividades agroindustriales y de servicios, que se pueden desechar a los
sistemas de drenaje y alcantarillado urbano o municipal es de 5 mg/L (promedio
diario); mientras que para agua potable, la NOM-127-SSA1-1994 establece que
el contenido de compuestos fenólicos presentes no debe sobrepasar los 0.3
mg/L.
Por otro lado, la “Norma de calidad ambiental y de descarga de efluentes:
“Recurso Agua" establece límites para este tipo de compuestos en aguas para
consumo humano, aguas dulces (frías o cálidas), así como en aguas marinas y
de estuario. Lo anterior se puede observar en las tablas 1.3 y 1.4.
Tabla 1.3. Límites máximos permisibles para aguas de consumo humano y uso doméstico que únicamente requieran desinfección
Parámetros
Expresado
Como Unidad Límite Máximo
Permisible
Compuestos fenólicos Fenol mg/L 0,002
6
Tabla 1.4. Criterios de calidad admisibles para la preservación de la flora y fauna en aguas dulces, frías o cálidas, y en aguas marinas y de estuario.
Parámetros Expresados
como Unidad
Límite máximo permisible
Agua fría dulce
Agua cálida dulce
Agua marina y
de estuario
Clorofenoles - mg/L 0,5 0,5 0,5
Fenoles
monohídricos Fenol mg/L 0,001 0,001 0,001
1.2 Procesos de tratamiento de agua para eliminar clorofenoles
Ya que, a pesar de su alta toxicidad, los compuestos fenólicos están presentes
en una gran diversidad de efluentes industriales, se han desarrollado diferentes
métodos de tratamiento para eliminarlos del agua, ya sea recuperando el
contaminante, o bien destruyéndolo. A continuación se describen estos
métodos de tratamiento.
1.2.1. Procesos de tratamiento no destructivos (Recuperación)
Extracción líquido-líquido
Se utiliza industrialmente para efluentes con concentraciones elevadas de
contaminantes. La ventaja de estos procesos es que se recuperan los
compuestos, sin embargo, requiere la utilización de disolventes para aumentar
el coeficiente de partición con una cinética de extracción rápida. (14)
Adsorción
Utilizan materiales porosos, como el carbón activado o resinas poliméricas, con
una alta área superficial que tengan gran tendencia a retener los compuestos
7
deseados. El problema de este método es el elevado costo de regeneración del
adsorbente. Por ejemplo, el carbón activado tiene una capacidad de adsorción
de entre 0.09 y 0.4 g de fenol/g de adsorbente, y una vez saturado se regenera
mediante un lavado con sosa, tratamiento con disolventes o bien con un
tratamiento térmico. (14)
1.2.2. Procesos de tratamiento destructivos Incineración
Es un proceso utilizado para tratar efluentes con elevadas concentraciones de
contaminantes, los cuales se oxidan con un exceso de aire a elevada
temperatura hasta obtener CO2 , agua y compuestos inorgánicos. Cuando se
utiliza este proceso para la eliminación de clorofenoles se pueden generar
dibenzofuranos y dibenzodioxinas.(15) Además que algunos factores como el
costo energético del proceso, los problemas de corrosión y la negativa
percepción ecológica del sistema hacen que éste no sea un método atractivo de
tratamiento.
Oxidación química
La oxidación química destruye los contaminantes con diversos agentes
oxidantes como peróxido de hidrógeno, persulfato de potasio, permanganato de
potasio, cloro, ozono, reactivo de Fenton, entre otros. Estos procesos son
altamente efectivos para eliminar compuestos orgánicos, pero si se busca la
mineralización de los mismos, es necesario emplear grandes dosis del oxidante,
lo que eventualmente aumenta el costo de aplicación de los mismos.
Oxidación biológica (Biodegradación)
Consiste en el uso de microorganismos para descomponer o degradar
compuestos peligrosos en sustancias de carácter menos tóxico o bien, inocuas
para el medio ambiente y la salud humana. Estos métodos son relativamente
8
económicos y ampliamente usados, pero cuando la toxicidad de los
contaminantes a tratar es muy alta, el proceso se ve inhibido y la calidad del
efluente no es satisfactoria, además de que la duración de los tratamientos es
alta (entre días y meses).
1.3 Ozonación
1.3.1. Propiedades oxidativas del ozono
En los últimos años, se ha incrementado el interés de utilizar el ozono para dar
tratamiento a efluentes contaminados. El ozono es un oxidante muy poderoso,
el cual puede participar en un gran número de reacciones con compuestos
orgánicos e inorgánicos en agua, tales como pesticidas, fenoles, aminas, etc.
En solución acuosa, se pueden considerar 2 posibles mecanismos de reacción
del ozono: la reacción directa con ozono molecular, y la reacción con los
radicales hidroxilo generados en la descomposición del ozono. La combinación
de estos mecanismos para la remoción de diferentes compuestos depende de
factores tales como: naturaleza de los compuestos en cuestión, tipo de
impurezas presentes en los compuestos, pH del medio, temperatura, dosis de
ozono y carácter iónico de la solución (16-18). En la Figura 1.2 se muestran estos
mecanismos.
9
Figura 1.2. Mecanismos de reacción del ozono en solución acuosa (18)
1.3.2. Ventajas y desventajas del ozono aplicado a tratamiento de agua
Las principales ventajas del uso del ozono son: (16, 19)
• Es uno de los agentes oxidantes y desinfectantes más fuerte disponibles.
• No se producen residuos en su descomposición, el oxígeno es el único
producto de su degradación.
• Es usado en Procesos de Oxidación Avanzado (POAs) para la
generación de especies más oxidantes.
• Es capaz de disminuir los costos globales de los procesos si se utiliza en
las primeras etapas del proceso.
Las principales desventajas del ozono son:
• Es inestable, y su solubilidad en agua es baja.
Reacción directa
Reacción con los radicales OH
10
• El costo de producción por kg de ozono es más alto que el de otros
oxidantes ó desinfectantes.
• Los equipos y sistemas que utilizan ozono se deben diseñar con
materiales resistentes, al igual que los equipos de seguridad para los
operadores expuestos al ozono.
1.4 Procesos de Oxidación Avanzada (POAs)
1.4.1. Definición de POAs
Los procesos de oxidación avanzada se definen como procesos que “involucran
la generación de radicales hidroxilo en cantidad suficiente para llevar a cabo la
purificación de agua”. Estos radicales no son selectivos y rápidamente atacan
de manera agresiva a los compuestos orgánicos. Estos radicales se pueden
generar por medios fotoquímicos (incluida la luz solar) o por otras formas de
energía. (20) Los POAs han demostrado ser altamente eficientes en la remoción
de contaminantes tanto en agua como en suelo, debido a que el potencial de
reducción del radical hidroxilo es muy alto, tal como se puede observar en la
tabla 1.5.
11
Tabla 1.5. Potenciales redox (E0) de algunos agentes oxidantes (21)
Especie
E0 (V)
25C) Flúor (F2) 3.03
Radical hidroxilo (∙OH) 2.80 Oxígeno atómico 2.42 Ozono (O3) 2.07 Peróxido de hidrógeno (H2O2) 1.77 Permanganato de potasio
(KMnO4)
1.67 Ácido hipobromoso (HBrO) 1.59 Dióxido de cloro (ClO2) 1.50 Ácido hipocloroso (HClO) 1.49 Cloro (Cl2) 1.36 Bromo (Br2) 1.09
Los radicales hidroxilo son capaces de oxidar a casi todos los compuestos
orgánicos a CO2 y H2O, salvo algunos de los compuestos orgánicos más
simples como lo son los ácidos acético y oxálico, así como la acetona ó bien,
compuestos clorados derivados del cloroformo. (20)
1.4.2. POAs no fotoquímicos Estos POAs originan especies reactivas potentes, principalmente el radical
hidroxilo, a través de la transformación de especies químicas o mediante la
utilización de distintas formas de energía, con excepción de la irradiación
luminosa.
Ozonación en medio alcalino
Conforme se incrementa el pH de la solución acuosa, se genera un aumento en
la descomposición de ozono en agua, debido a que el ion hidroxilo actúa como
un iniciador en el mecanismo de descomposición. Bajo estas condiciones, el
ozono reacciona en forma directa con un sustrato orgánico a través de una
12
reacción lenta y selectiva, en combinación con una reacción rápida y no
selectiva vía radicales (radicales hidroxilo) (Figura 1.2).
El camino indirecto es menos selectivo, ya que las especies formadas tienen
gran capacidad oxidante. Debe tenerse cuidado de no elevar excesivamente el
pH, debido a la acción atrapadora de HO• competitiva de los iones bicarbonato
y carbonato (esta competencia ocurrirá en todo POA cada vez que se formen
HO• en soluciones carbonatadas). (19, 23)
Combinación de ozono/H2O2
El uso de dos o más oxidantes combinados permite aprovechar los posibles
efectos sinérgicos entre ellos, lo que produce una destrucción adicional de la
carga orgánica. Sin embargo, como existe una gran dosis de empirismo en el
uso de mezclas oxidantes, es difícil prever el rendimiento.
La ozonación transforma los contaminantes en compuestos más simples. Se
logra una mejoría cuando se le agrega agua oxigenada. El H2O2 es un ácido
débil, poderoso oxidante y un compuesto inestable. Entre las posibles mezclas
de agentes oxidantes, la combinación O3/H2O2 es una de las más usadas. El
proceso pretende combinar la oxidación directa (y selectiva) del ozono con la
reacción rápida y poco selectiva de los radicales HO• con los compuestos
orgánicos. El proceso es caro pero rápido, y puede tratar contaminantes
orgánicos presentes en muy altas concentraciones (<5000 ppm). (23)
Reactivo de Fenton
Desde finales del siglo XIX, los conocidos ensayos de Fenton demostraron que
las soluciones de peróxido de hidrógeno y sales ferrosas eran capaces de
oxidar los ácidos tartárico y málico, y otros compuestos orgánicos. El proceso
Fenton se lleva a cabo por la reacción:
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + HO- + HO•
13
Las sales de hierro actúan como catalizador para la descomposición del
peróxido de hidrógeno. El proceso es potencialmente útil para destruir
contaminantes, ya que es muy efectivo para la generación de HO•, (19.23) sin
embargo, durante este tratamiento se produce lodo que contiene complejos de
hierro con compuestos orgánicos.
1.4.3. POAs fotoquímicos Los procesos fotoquímicos involucran radiación UV; la excelente capacidad del
radical hidroxilo de oxidar compuestos orgánicos sugiere explorar su generación
fotoquímica. El sistema UV/oxidante involucra una excitación directa de un
sustrato debido a la radiación con una posterior reacción de oxidación.
Fotólisis del agua en el ultravioleta de vacío (UVV)
El uso más importante de la radiación UVV es la fotólisis del agua (en presencia
de luz), que produce radicales hidroxilo y átomos de hidrógeno. La técnica se
utiliza para la degradación de contaminantes en aguas y en corriente de aire
con alto contenido de humedad, para la obtención de agua pura. El proceso
posee alta eficiencia, sin embargo requiere el suministro de oxígeno, el uso de
material de cuarzo y la provisión de alta potencia. (18, 23)
Combinación de UV/H2O2
La fotólisis del H2O2 se realiza casi siempre utilizando lámparas de vapor de
mercurio de baja o media presión. Cerca del 50% del consumo energético se
pierde en forma de calor. Generalmente se usan lámparas de 254 nm. El uso de
UV/peróxido ofrece grandes ventajas: el oxidante muy accesible, es
térmicamente estable y puede almacenarse; como posee solubilidad infinita en
agua, no existen problemas de transferencia de masa asociados a gases. En
contraposición, dada la baja sección eficaz de absorción de H2O2 a 254 nm, se
necesitan altas concentraciones del oxidante. (17, 23)
14
Combinación de UV/O3
La irradiación del ozono en agua produce H2O2 en forma cuantitativa. El
peróxido de hidrógeno así generado da lugar a radicales hidroxilo por medio de
fotólisis, y reacciona con el exceso de ozono, generando también estos
radicales. En realidad, se trata de una combinación de UV/H2O2 y O3/H2O2. La
eficiencia es superior a la de O3 o UV directa. Adicionalmente, puede utilizarse
la combinación UV/H2O2/O3. La adición de luz al proceso H2O2/O3 produce un
aumento neto de la eficiencia. (17)
Foto-Fenton
El proceso Fenton es fuertemente acelerado por irradiación con luz UV-VIS, por
lo que se presenta un aumento en la velocidad de degradación de
contaminantes orgánicos. El método es eficiente, pero tiene la desventaja de
que debe agregarse H2O2 continuamente y mantener condiciones ácidas. (23)
Fotocatálisis heterogénea
La fotocatálisis heterogénea es un proceso que se basa en la absorción directa
o indirecta de energía radiante (visible o UV) por un sólido. Esta oxidación se
realiza en presencia de un catalizador (semiconductor) y radiación UV, que
fotoexita al mismo, usando oxígeno. En la región interfacial entre sólido excitado
y la solución tienen lugar las reacciones de destrucción o de remoción de los
contaminantes, sin que el catalizador sufra cambios químicos. (18,23)
1.5. Ozonación y Procesos de Oxidación Avanzada aplicados en la descomposición de fenoles
La descomposición de compuestos fenólicos por métodos químicos ha sido
ampliamente estudiada. Ya sea ozonación simple, ó combinada con otros
POAs, diversos estudios han demostrado que este tipo de procesos son muy
eficientes, ya que es posible descomponer rápidamente compuestos fenólicos y
15
dar lugar a productos menos tóxicos como los ácidos orgánicos. (16, 24-41) El
esquema de reacción reportado en la literatura del fenol y clorofenoles con
ozono (16,24, 25-30) sugieren el esquema de reacción mostrado en la figura 1.3.
Figura 1.3. Esquema de reacción propuesto en la literatura para clorofenoles con ozono.
Como se puede observar en la figura 1.3, el primer ataque del ozono se
produce sobre los cloros de los clorofenoles (1), hasta producir fenol (2),
después continúa con la introducción de un grupo OH ya sea en posición orto ó
para, lo que deriva en la formación de catecol (3) e hidroquinona (4).
Posteriormente se rompe el anillo aromático y se pierden carbonos, que
involucran a los ácidos mucónico (5), fumárico y maléico (6), hasta obtener los
productos finales que son los ácidos oxálico (7) y fórmico (8).
Diferentes estudios acerca de la oxidación química de este tipo de compuestos
muestran que uno de los parámetros más importantes que influyen en la
descomposición de éstos con ozono, es el pH, (16, 23, 26-29) afectando tanto la
velocidad de degradación de los contaminantes, como en los productos
intermediarios y finales que se presentan. Estos trabajos revelan que si la
reacción se lleva a cabo bajo pH neutro ó ácido predomina la reacción directa
con ozono molecular. Por otro lado, si se trabaja bajo pH básico se presenta
una combinación de mecanismos, es decir, vía ozono molecular y vía radicales
hidroxilo, por lo que la velocidad de degradación de estos compuestos es más
16
alta (ya que el poder oxidante del radical hidroxilo es mayor que el del ozono;
ver tabla 1.5) y en consecuencia, el tiempo requerido para la descomposición
de los mismos es menor que si la reacción se lleva a cabo a pH neutro ó ácido.
(16,24,28,29)
En la literatura se encuentran diversos estudios referentes al tratamiento
químico de aguas contaminadas con clorofenoles. A continuación se describen
algunos de los trabajos más relevantes donde participa el ozono como oxidante.
Canton y col.(31) estudiaron la descomposición de fenol (100 mg/L) en diferentes
sistemas, O3, O3/Fe3+, O3/UV, O3/UV/Fe3+. El mejor sistema fue
O3/UV/Fe3+(pH3), a pesar de que la degradación del fenol fue más rápida con
ozonación simple, con el sistema antes mencionado se logra un 97% de
remoción de COT (Carbón Orgánico Total). La combinación del ozono con
UV/Fe3+ favorece la formación de radicales hidroxilo que da lugar a ese nivel
tan importante de mineralización.
Gimeno y col.(32) estudiaron la descomposición de fenol, 4-Nitrofenol y 4-
Clorofenol (200 mg/L) bajo diferentes sistemas como : O3, UV, O3/UV, TiO2/UV,
O3/UV/TiO2 y O3/TiO2. Las mejores combinaciones para la eliminación de los
tres fenoles fueron O3/UV y O3/UV/TiO2. La presencia del TiO2 favoreció la
eliminación de COT y DQO.
Kidak e Ince (33) estudiaron la descomposición de fenol (235 mg/L) bajo
diferentes sistemas UV, US, O3 (diferentes valores de pH), US/UV, O3/US,
O3/UV, O3/UV/US; la mejor combinación fue O3/UV/US independiente del pH
de ozonación. Para O3, simple se logran los mejores resultados a pH básico.
La sonólisis favorece la producción de radicales hidroxilo, por lo que se acelera
la degradación del fenol.
17
Hua Xiao y col. (34) estudiaron la ozonación catalítica (Mn2+) del 2,4-Diclorofenol;
la adición de Mn2+, incluso en trazas acelera la mineralización del 2,4-DCF
(10mg/L), la remoción de COT aumenta del 40% (sin Mn2+) al 80% (con Mn2+).
El producto final de la ozonación sin catalizador fue ácido oxálico, mientras que
con el Mn2+, se llegó a CO2.
Chaudhary y Grimes (35) estudiaron la descomposición del fenol y del 4-
Clorofenol (50 mg/L) en varios sistemas: UV, electrólisis, UV/electrólisis (en
presencia y ausencia de Cu2+ y TiO2); el mejor sistema fue UV/electrólisis,
utilizando un cátodo de carbón activado para concentrar carbón. Con este
sistema de logra recuperar un 99% del cobre y la destrucción de los fenoles en
8h.
Amat et. al. (36) estudiaron la ozonación de una mezcla de ácidos fenólicos
(1mM de cada uno); la pre-ozonación de la mezcla inicial favoreció la
biodegradabilidad de la misma en función de la reducción del valor de DQO
(Demanda Química de Oxígeno). Se encontró que entre 3 y 5 min de ozonación
es el tiempo en que se alcanza el valor máximo para la relación DBO5/DQO.
De acuerdo a estos trabajos se puede observar el ozono es eficaz para la
remoción de compuestos fenólicos, así mismo favorece el aumento en la
biodegradabilidad expresada en términos de DBO5/DQO, sin embargo, en
términos de mineralización, la aplicación de ozono por sí solo resulta
insuficiente. Cuando se logran altos niveles de remoción de COT es porque en
el proceso se inducen las condiciones para la generación de los radicales
hidroxilo, es decir se cuenta con el reactivo de Fenton, catalizadores, luz UV o
ultrasonido. Cuando se hacen diferentes combinaciones entre éstos y el ozono,
se genera suficiente cantidad de especies oxidantes que dan lugar a grados
importantes de mineralización.
18
Tomando en cuenta la información presentada en esta sección, es evidente que
cuando se aplica la ozonación sin la combinación con otro agente químico ó
fotoquímico que induzca fuertemente la generación de radicales hidroxilo, es
difícil oxidar los compuestos orgánicos hasta CO2, ya que a lo largo de la
reacción se van formando compuestos cuyas constantes de reacción con ozono
son muy bajas y tienden a acumularse, tales como los ácidos orgánicos; oxidar
estos ácidos hasta CO2 implicaría tiempos de tratamiento muy grandes que
inminentemente se verían reflejados en un aumento significativo de los costos
operativos. (20,22)
El esquema de reacción de los clorofenoles con el ozono (Figura 1.3) puede
darle una idea al lector de cuáles son los compuestos que se encuentran
presentes después de la ozonación de los clorofenoles estudiados en este
trabajo, y tal como fue descrito en la introducción, después de la oxidación
química fueron sometidos al proceso de biodegradación.
1.6 Biodegradación
Los métodos biológicos han sido altamente estudiados para la descomposición
de contaminantes debido a que su aplicación resulta menos costosa en
comparación con los tratamientos químicos.
1.6.1. Definición de biodegradación
Las medidas biocorrectivas o los sistemas de biorremediación consisten
principalmente en el uso de microorganismos (levaduras, hongos o bacterias)
existentes en el medio, para descomponer o degradar sustancias peligrosas en
sustancias de carácter menos tóxico o bien inocuas para el medio ambiente y la
salud humana. La biodegradación se refiere al proceso natural mediante el cual
19
bacterias u otros microorganismos alteran y convierten moléculas orgánicas en
otras sustancias, como ácidos grasos y CO2. (37, 38)
La satisfactoria eliminación de los xenobióticos (compuestos químicos
altamente tóxicos) por métodos biológicos requiere una comprensión detallada
de los factores que afectan la biodegradación. Los factores ambientales, claves
para que se produzca la biodegradación de estos compuestos son:
1. La concentración del xenobiótico – si ésta es muy alta, pueden existir
problemas de toxicidad, que pueden inhibir el proceso.
2. El pH del ambiente y la temperatura del mismo, ya que los dos
factores afectan al crecimiento y al metabolismo.
3. La disponibilidad de agua, de forma que se equilibre el potencial
osmótico en el interior y exterior celular.
4. La disponibilidad de otros nutrientes necesarios para el crecimiento
(sales inorgánicas u otros co-metabolitos).
5. La presencia de otro material orgánico.
El medio ambiente ideal es aquel en el que las condiciones son constantes o, al
menos, predecibles y, por lo tanto, permiten el crecimiento y metabolismo de los
microorganismos. Esta situación facilita la realización de estudios a nivel de
laboratorio para poder determinar el régimen de tratamiento óptimo para la
destrucción de los xenobióticos.
Una situación con estas condiciones definidas y constantes ocurre rara vez en
la naturaleza, pero puede darse fácilmente en el caso del tratamiento de
20
efluentes industriales, en cuyo proceso se pueden controlar las condiciones
físicas y ambientales. (37-39)
1.6.2. Ventajas y desventajas de la biodegradación en el tratamiento de agua
Algunas de las ventajas y desventajas de la biodegradación aplicada en
tratamiento de aguas residuales son:
Ventajas:
• Son más económicos que los tratamientos químicos
• Generan pocos subproductos
• Es posible llegar a la mineralización total de los contaminantes (hasta
CO2 y H2O).
Desventajas:
• Se presenta inhibición por altas concentraciones y/o acumulación de
metabolitos tóxicos para los microorganismos.
• Se requieren tiempos considerablemente mayores (de días a meses) a
los requeridos por otro tipo de tratamientos, como los químicos.
• Se generan lodos derivados del crecimiento microbiano.
1.7. Biodegradación de clorofenoles Se ha reportado la eliminación de clorofenoles por métodos biológicos, pero
debido a su toxicidad, el tratamiento de altas concentraciones de estos
contaminantes se vuelve difícil, y en general los tiempos que se requieren para
21
lograr la degradación, son muy grandes. Diversos autores han reportado que
las células inmovilizadas y cultivos de hongos de la “pudrición blanca”
inmovilizados resultan más estables para el tratamiento de fenoles comparado
con células dispersas libres. (40, 41)
El mecanismo general de desestabilización del anillo aromático desarrollado por
los microorganismos aerobios implica una oxidación progresiva de la estructura
resonante. Actualmente se tiene un gran conocimiento de algunas rutas
catabólicas microbianas de compuestos aromáticos, especialmente de las
pertenecientes al género Pseudomonas. Estas rutas metabólicas indican que el
primer paso consiste en la incorporación de dos grupos hidroxilo en el anillo
aromático, para lo cual los microorganismos han desarrollado una serie de rutas
periféricas de oxidación, deshalogenación, desnitración, ó desulfuración, que
dan lugar a un intermediario susceptible a la acción de dioxigenansas (enzimas)
específicas que provocarán la apertura del anillo. Estos derivados dihidroxilados
pueden ser canalizados por la ruta del catecol, en la que los intermediarios
catecólicos pueden ser metabolizados a su vez mediante la ruta meta ó bien la
ruta orto, dependiendo de la posición en que se efectúe la apertura del anillo.
Los metabolitos finales de esta ruta entran directamente en el metabolismo
intermediario de la célula. (42)
En general, los compuestos aromáticos alifáticos son degradados por la ruta
meta, en contraposición a los compuestos aromáticos clorados que,
normalmente, son metabolizados por la ruta orto. (42) La degradación de estos
sustratos en mezcla es común que se vea inhibida por la acumulación de
metabolitos letales como son: clorocatecoles y semialdehídos hidroximucónicos
clorados. (43,44) La acumulación de estos metabolitos tóxicos para los
microorganismos es en gran medida responsable de que los clorofenoles
resulten difíciles de eliminar por biodegradación.
22
Los tratamientos de biodegradación se pueden llevar a cabo ya sea con cepas
puras, o bien utilizando cultivos mezclados (consorcios microbianos), es decir
que varios tipos de especies se cultivan simultáneamente. Éstos se dividen en
tipos indefinidos y definidos. Los primeros se ven claramente ejemplificados por
los lodos activados. En este caso, no se tiene totalmente identificado al tipo de
microorganismos que coexisten, pero por pruebas y un tratamiento de
aclimatación previo se sabe que descomponen los contaminantes deseados. (45)
En la biodegradación de xenobióticos con cultivos puros se ha reportado la
acumulación de metabolitos tóxicos porque un microorganismo sólo no tiene la
capacidad de mineralizar el contaminante. (46) Una de las ventajas de usar
consorcios microbianos es que la interacción entre las especies presentes
puede favorecer el proceso. Adicionalmente, la capacidad de biodegradación se
puede mejorar si previamente se adaptan los microorganismos a la fuente de
carbono que se desea degradar.
Se han realizado diversos trabajos referentes a la biodegradación de los
clorofenoles en agua, en las siguientes líneas se describen algunos de ellos.
Bollag y col.(47) estudiaron la biodegradación de tres clorofenoles: 4-Clorofenol,
2,4-Diclorofenol y 2,4,6-Triclorofenol tanto individuales como en mezcla. Para el
biotratamiento se empleó la enzima laccase proveniente del hongo Trametes
villosa; se observó que la enzima en cuestión fue capaz de degradar los
clorofenoles individuales (0.5mM en 24h.) bajo el siguiente orden de facilidad:
2,4-DCF(96%)>2,4,6-TCF(85%)>4-CF(59%). Las mezclas binarias y ternarias
fueron más difíciles de degradar y se presentó inhibición a menores
concentraciones. El 4-CF (0.5mM) individual ó en mezcla no pudo ser
degradado más allá del 60%.
Stoilova y col. (40) estudiaron la biodegradación del fenol, catecol, 2,4-
Diclorofenol y el 2,6-Dimetoxifenol con la cepa fúngica Aspergillus awamori;
23
Este hongo fue capaz de mineralizar todos los compuestos individuales (1g/L),
bajo el siguiente orden de facilidad: catecol, 2,4-DCF, fenol, 2,6-DMF en 82h, 5
días, 7 días y 8 días, respectivamente.
Salmerón-Alcocer et. al. (48) estudiaron la biodegradación de los siguientes
compuestos fenólicos: fenol, 4-Clorofenol, 2,4-Diclorofenol, 2,6-Diclorofenol,
2,4,6-Triclorofenol usando las cepas puras: Burkholderia, Microbacterium
phyllosphaerae y Candida tropicalis, así como la mezcla de ellas. En este
estudio se usó el fenol (300mg/L) como sustrato y los clorofenoles como
cosustratos en un biorreactor continuo. Bajo estas condiciones el consorcio fue
capaz de degradar los clorofenoles (50mg/L), así como el fenol. Para todos los
casos el consorcio mostró mejores resultados que las cepas puras.
Sahinkaya y Dilek (49) estudiaron la biodegradación del 4-Clorofenol y del 2,4-
Diclorofenol de forma individual y en mezcla usando un consorcio microbiano
previamente aclimatado a estas fuentes de carbono. En este trabajo se logró la
degradación total del 2,4-DCF (104mg/L) en 20h usando el consorcio que
previamente se adaptó a una mezcla de 2,4-DCF y 4-CF; por otro lado, con el
consorcio adaptado sólo a 2,4-DCF, se presentó inhibición del proceso.
Sahinkaya y Dilek (2007b) (50) estudiaron la biodegradación del 4-clorofenol y el
2,4-diclorofenol en reactores batch y SBRs. Cuando la reacción se llevó a cabo
en el sistema batch en ambos contaminantes se presentaron problemas de
inhibición a 53 y 25 mg/L, respectivamente. En la operación del SBRs (tiempo
de residencia de 10 días), la fuente de carbono preferida por los
microorganismos fue el 2,4-diclorofenol con respecto al 4-clorofenol, bajo esta
configuración de reactor se logró la completa remoción de los contaminantes y
se demostró que los parámetros de operación que más influyen para una buena
remoción son el tiempo de alimentación de los sustratos y la presencia de un
sustrato biogénico (peptona).
24
De la revisión bibliográfica concerniente a la biodegradación de clorofenoles
destacan algunos aspectos como la toxicidad de los clorofenoles que se ve
evidenciada en la inhibición de los procesos biológicos. Tal problema ha sido
atacado modificando algunos factores del bioproceso a realizar, entre La
medidas se encuentra el realizar la degradación de los clorofenoles por
cometabolismo con sustancias biogénicas (glucosa o peptona) o especies
menos tóxicas y químicamente similares como el fenol. Otro factor es el uso de
consorcios microbianos en lugar de cultivos puros, ya que los diferentes
microorganismos interactúan entre sí y se obtienen mayores tasas de
degradación de compuestos xenobióticos.
Así mismo, la aclimatación previa a la fuente de carbono específica a degradar,
se ha demostrado que es un factor es de suma importancia para reducir los
problemas de inhibición por toxicidad del sustrato. Por otro lado, el uso de
microorganismos inmovilizados en diferentes configuraciones de reactores con
diferentes tipos de soportes microbianos, donde se aumente el tiempo de
residencia y se mejore el contacto entre el influente contaminado y los
microorganismos es un factor que mejora los resultados obtenidos en un
bioproceso.
Como se pudo verificar en la revisión bibliográfica, la aplicación de estos
factores (individualmente o combinados) se ven reflejados en una inminente
mejoría de los procesos biológicos.
1.8. Combinación de tratamientos químicos y biológicos para la eliminación de contaminantes Recientemente, la combinación de oxidación química con biodegradación, como
método de tratamiento del agua residual, ha concentrado el interés de algunos
25
investigadores. (35-37) La combinación de la oxidación química seguida de
biodegradación ha demostrado ser efectiva para la eliminación de
contaminantes en agua, ya que compuestos xenobióticos pueden ser
convertidos en especies más fáciles de degradar por métodos biológicos. Así
mismo, se ha reportado en la literatura que la oxidación química seguida de
biodegradación es una opción viable en casos tales como:
1) El efluente es biorecalcitrante, o bien no-biodegradable por la enzimas
intracelulares. La oxidación química parcial puede mejorar la biodegradabilidad
de estos efluentes transformando a los compuestos iniciales en especies más
fáciles de biodegradadar. (51)
2) Los compuestos a tratar son insolubles. Weng y colaboradores (52)
demostraron que el benzo[a]pireno (insoluble en agua y cancerígeno) se puede
tratar con ozono para oxidarlo parcialmente y producir productos más solubles
en agua, de menor peso molecular, que resultaron más biodegradables
4) De manera similar, si el peso molecular de compuestos poliméricos, por
ejemplo, dificulta el tratamiento biológico de éstos, se puede mejorar con un
pretratamiento químico. Mantzavionos y colaboradores (53) demostraron que la
oxidación catalítica con aire y temperatura del polietilenglicol (PM= 10,000) da
como resultado subproductos sustancialmente más biodegradables.
La combinación de tratamientos químicos con procesos biológicos para
degradar contaminantes se ha estudiado tanto para compuestos individuales
como para sistemas reales, a continuación se presentan algunos de estos
trabajos.
Contreras y col. (54) estudiaron el sistema O3/biodegradación aerobia con lodos
activados para la degradación del 2,4-Diclorofenol (10mg/L); el contaminante
no pudo ser degradado sólo por el tratamiento biológico, pero con pre-
26
ozonación se logró un 70% de remoción del COT en un biorreactor continuo con
un HTR (Tiempo de Retención Hidraúlico) entre 12 y 48h.
Essam T., y col., 2006 (55) estudiaron la combinación de radiación UV (durante
40 h) y biodegradación (28 días) para dar tratamiento a una mezcla de
clorofenoles, encontraron que la combinación de ambos tratamientos reduce la
toxicidad de la mezcla (la mayor degradación se logra en el pretratamiento
químico), así mismo, la actividad microbiana aumenta con la pre-irradiación,
pero no hay información clara sobre los subproductos de la irradiación y cuál es
su dinámica durante el bioproceso.
Essam T., y col., 2007 (56) estudiaron la descomposición de la misma mezcla de
clorofenoles descrita en el párrafo anterior, pero con tres diferentes sistemas de
combinación que incluían radiación UV, TiO2, H2O2 y biodegradación en
diferentes arreglos: radiación UV (40h)/TiO2 más biodegradación (28 días), así
como UV (40h)/H2O2 más biodegradación (28 días) y UV (40h)/H2O2/TiO2 más
biodegradación (28 días). El sistema más efectivo fue UV/H2O2/TiO2 más
biodegradación; los autores mencionan que algunos de los productos formados
durante la fotodegradación son tóxicos y podrían ser causantes de la inhibición
microbiana que observan en su trabajo. Sin embargo, en éste no se hace un
estudio detallado sobre qué productos se forman en este tratamiento químico y
el efecto que tienen sobre biotratamiento.
Sangave, y col., 2007 (57) estudiaron el sistema O3/biodegradación aerobia
(cepa pura aislada de una plata de tratamiento de aguas) para dar tratamiento a
el agua residual proveniente de una licorera. La pre-ozonación favoreció la
biodegradación, después del pretratamiento químico se pudo observar
crecimiento celular, así como una disminución del DQO. Para esta mezcla
específica no es recomendable ozonar más de 1h.
27
El-Gohary, y col., 2008 (58) estudiaron en sistema Fenton/biodegradación
aerobia para el tratamiento de un agua residual proveniente de la producción de
aceite de oliva. Se adicionó el reactivo de Fenton durante 2h en un reactor
CSTR y se continuó el mezclado otras 2h. Posteriormente el efluente se
alimentó a una batería de dos biorreactores con un HTR de 24h para cada uno.
El efluente del pretratamiento Fenton pudo ser degradado en el biorreactor con
altas eficiencias de remoción de DQO y compuestos de control como fenol y
lignina.
La combinación de tratamientos químicos y biológicos ha dado buenos
resultados para degradar diferentes contaminantes en fase acuosa ya que es
posible obtener mayores eliminaciones de compuestos tóxicos. Sin embargo los
estudios realizados no son muy precisos en cuanto a la formación de
subproductos en el pretratamiento químico, así como su respectiva
descomposición en la subsecuente etapa biológica. Por otro lado, en los
trabajos revisados no se toma en cuenta la adaptación de los microorganismos
a las respectivas mezclas de compuestos formadas en el pretratamiento
químico ni se presentan criterios para decidir en qué momento es adecuado
cortar el tratamiento químico y acoplar el biológico.
De la información recabada en la investigación bibliográfica presentada
previamente, se puede observar que los tratamientos químicos son muy
eficientes para la remoción de compuestos tóxicos (más no para llegar a la
mineralización de los mismos), mientras que los tratamientos biológicos no son
tan efectivos porque dependiendo de la concentración del contaminante se
presenta la inhibición del proceso. Para contrarrestar este efecto se pueden
usar consorcios microbianos (sobre todo si el agua a tratar tiene más de un
contaminante) y adicionalmente someter a estos microorganismos a una etapa
previa de adaptación.
28
En función de lo anterior, en el presente trabajo se pretende combinar la pre-
ozonación de clorofenoles (4-Clorofenol, 2,4-Diclorofenol) en solución acuosa
con biodegradación aerobia utilizando un consorcio microbiano previamente
adaptado (células libres), para mejorar la eficiencia de biodegradación de estos
compuestos, bajo la premisa de que los productos de ozonación de estos
compuestos son más fáciles de biodegradar que los compuestos iniciales.
29
CAPÍTULO 2. DESARROLLO EXPERIMENTAL
2.1 Materias primas Las Materias Primas utilizadas en el desarrollo experimental fueron reactivos
analíticos adquiridos en diferentes casas comerciales, tal como se puede
apreciar en la tabla 2.1.
Tabla 2.1. Reactivos utilizados en la experimentación
Reactivo MM (g/gmol)
Pureza (%) Compañía
Fenol fundido 94.1 98 J. T. Baker 4 – Clorofenol 128.6 99 Sigma Chemical Co. 2.4 – Diclorofenol 163.0 98 Sigma Chemical Co. Catecol 110.1 99 Sigma Chemical Co. Hidroquinona 110.1 99 Sigma Chemical Co. Ácido Oxálico 90.0 99 Aldrich Chemical Co. Inc. Ácido Fórmico 46.0 88 J. T. Baker Ácido trans-Mucónico 142.1 97 Fluka Chemika Ácido Fumárico 116.1 99 Aldrich Chemical Co. Inc. Ácido Maléico 116.1 99 Aldrich Chemical Co. Inc. Sulfato de amonio 132.1 99 Teqsiquim Fosfato de potasio monobásico 136.1 99 Teqsiquim Fosfato de potasio dibásico 174.2 98 Teqsiquim Sulfato de magnesio 246.5 98 Teqsiquim Sulfato de Calcio 136.1 98 Teqsiquim Sulfato ferroso 278.0 99 Teqsiquim Acetonitrilo 41.0 99.97 Teqsiquim Ácido Fosfórico 98.0 85 J. T. Baker
2.2 Esquema experimental a nivel laboratorio
El desarrollo de este trabajo se dividió en tres partes principales: se realizaron
individualmente los tratamientos de ozonación y biodegradación así como la
30
combinación de ambos tratamientos para la degradación de dos clorofenoles: 4-
Clorofenol (4-CF) y 2,4-Diclorofenol (2,4-DCF), éstos se estudiaron de manera
individual, en solución acuosa a una concentración inicial de 120 mg/L (Figura
2.1).
Figura 2.1. Tratamientos empleados para las soluciones problema.
En la figura 2.2 se presenta de manera esquemática y general el camino a
seguir a lo largo de la experimentación. En la sección de ozonación individual
se incluyó la identificación de subproductos por Cromatografía de Líquidos
(HPLC). En la secciones de biodegradación de los compuestos individuales se
antepuso la etapa de adaptación del consorcio microbiano a la fuente de
carbono a degradar, además de la biodegradación de los clorofenoles, se
realizó la biodegradación de los principales productos identificados en la
ozonación. Cuando se terminaron estas secciones se hizo un análisis de los
resultados obtenidos en ambas y en función de éstos se eligieron las
condiciones de ozonación para realizar el tratamiento combinado. Se realizó la
ozonación y se aclimataron consorcios acorde a las condiciones de ozonación y
se realizó el tratamiento biológico.
31
Figura 2.2. Diagrama del desarrollo experimental. En todos los casos, el pH fue ajustado con una solución de NaOH 0.05N ó
H3PO4 0.05N, según lo ameritara el caso.
2.2.1 Proceso de ozonación Los experimentos se llevaron a cabo a presión y temperatura ambiente
(23±3°C) en un reactor de tipo semi-continuo con una capacidad de 1.5L. En la
parte inferior del reactor se encuentra una placa de cerámica porosa (difusor),
32
así mismo cuenta con una toma de muestras, para extraer alícuotas y una
salida en la parte superior, para monitorear el ozono que sale del reactor.
2.2.1.1 Descripción del proceso
El ozono es generado a partir de oxígeno seco con una pureza del 99.5%
proveniente de un tanque (T), por medio de un generador de ozono “AZCO” (G). Las condiciones de trabajo fueron: concentración inicial de ozono: 28±2 mg/L, a
un flujo de: 0.5mLl/min (el diagrama de la ozonación se muestra en la figura
2.3).
Figura 2.3. Diagrama esquemático del sistema de ozonación: (R) reactor, (T) tanque de oxígeno, (G) generador de ozono, (EV1, EV2 EV3) by-pass con electroválvulas, (S) analizador de ozono, (M) sistema de adquisición de datos (C) PC.
33
La mezcla ozono/oxígeno proveniente del generador es introducido al reactor
(R) por la parte inferior, y es distribuido uniformemente en la solución acuosa
por medio del difusor. En la parte superior del reactor se encuentra una salida
que se conecta a un analizador de ozono en fase gaseosa BMT-930 (S)
conectado a un equipo de cómputo (C) que recibe los datos procesados para
ser en “MATLAB”, mediante un módulo de adquisición de datos National
Instruments Modelo USB 6008 (M), y genera una gráfica de la concentración de
ozono a la salida del reactor contra tiempo (ozonograma). El sistema cuenta
con tres electroválvulas (EV1, EV2, EV2), por medio de este arreglo es posible
medir la concentración inicial de ozono antes de ser introducido al reactor.
La selección de las condiciones del proceso se hizo tomando como referencia
los resultados obtenidos en trabajos previos (16) y se presentan en la tabla 2.4.
La ozonación se llevó a cabo bajo dos condiciones de pH inicial (7 y 12), el cual
no se controló durante la reacción.
Tabla 2.2 Condiciones de ozonación de los clorofenoles.
Compuesto Concentración (mg/L)
pH de solución
4-Clorofenol 120
7 12
2,4-Diclorofenol 7 12
2.2.2 Proceso de Biodegradación
2.2.2.1 Descripción del proceso Para los tratamientos biológicos se llevaron a cabo cultivos en lote; se
colocaron 50 mL de solución a tratar en matraces de 250 mL y se inocularon al
10%v (5 mL) con el cultivo correspondiente, acto seguido se incubaron a
34
temperatura ambiente y agitación controlada (120 rpm). A lo largo del tiempo se
tomaron muestras que posteriormente fueron sometidas a los análisis
correspondientes. El diagrama experimental del proceso de biodegradación a
nivel laboratorio se presenta en Figura 2.4.
Figura 2.4. Diagrama del proceso de biodegradación a nivel laboratorio.
Microorganismos utilizados.
La fuente de microorganismos usados en este trabajo fue un consorcio
microbiano proveniente de una planta de tratamiento de aguas industriales, el
cual fue adaptado durante tres meses al fenol como única fuente de carbón y
energía en los laboratorios de Biotecnología Ambiental de la (Unidad
Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología) UPIBI. Después de ese periodo
de adaptación dicho consorcio fue proporcionado para esta investigación. Los
microorganismos se encontraban suspendidos en medio de cultivo apropiado
para su crecimiento, el cual fue preparado con agua destilada y diferentes sales
inorgánicas con la concentración indicada en la tabla 2.3.
Antes de llevar a cabo los tratamientos biológicos, el pH de las soluciones
problema se ajustó a 7±0.5 y se añadieron las respectivas sales del medio de
cultivo.
35
Tabla 2.3. Composición del medio de cultivo
Compuesto Concentración (g / L)
(NH4)2SO4 3.0
KH2PO4 0.6
K2HPO4 2.4
MgSO4 .7H20 1.5
CaSO4 .2H20 0.15
FeSO4 .7H20 0.03
Como se puede observar en la figura 2.2, los tratamientos biológicos se llevaron
a cabo tanto para los clorofenoles sin ozonar como para los productos
resultantes de la ozonación de los mismos. Es importante mencionar que para
cada proceso de biodegradación se cultivó un consorcio específicamente
adaptado a la fuente de carbono a degradar; todos éstos se derivaron a partir
del consorcio adaptado a fenol (CAF).
Se utilizó el CAF como fuente de microorganismos para contar con diversidad
microbiana que fuera capaz de consumir los diferentes sustratos suministrados
en este trabajo. Cabe resaltar que el hecho de que el consorcio inicial fuera
capaz de consumir fenol facilitó que los consorcios derivados se pudieran
adaptar a compuestos fenólicos (clorofenoles) y derivados resultantes del
proceso de ozonación, ya que algunos de éstos compuestos se encuentran
dentro de la ruta metabólica seguida por los microorganismos para degradar
fenol.
Aclimatación de los microorganismos a fuentes de carbono no ozonadas
36
Con el fin de cultivar y adaptar los consorcios para degradar los compuestos sin
ozonar se tomaron 50 mL del CAF (suspendido en medio de cultivo), se
contaminaron con el compuesto de interés de tal forma que éste constituyera su
única fuente de carbono y energía y se incubaron a 120 rpm. Se dio
seguimiento periódico a la concentración de sustratos en los diferentes medios
contaminados hasta que se verificó que éstos eran consumidos por los
consorcios respectivos, lo cual confirmó que los microorganismos se habían
adaptado y era viable utilizarlos en el bioproceso deseado.
En la tabla 2.4 se muestran los consorcios que se cultivaron con fuentes de
carbono no ozonadas, así como la concentración de éstas en el consorcio
correspondiente.
Tabla 2.4. Consorcios adaptados a compuestos sin ozonar
Consorcio Fuente de carbono adaptada Concentración (mg/L)
CAF Fenol 200
CA4CF 4-Clorofenol 40
CA24DCF 2,4-Diclorofenol 40
CAA Mezcla de ácidos oxálico y fórmico 100 (cada ácido)
Debido a la alta toxicidad de los Clorofenoles, la concentración con que se
adaptó al CA4CF y al CA24DFC fue baja con respecto a las usadas en el CAF y
CAA, que son compuestos de menor toxicidad.
Aclimatación de los microorganismos a fuentes de carbono previamente
ozonadas
La adaptación del consorcio a fuentes de carbono previamente ozonadas se
llevó a cabo por el método fill-and-draw(59), el cual consiste en poner en
contacto a los microorganismos con el sustrato a concentraciones crecientes en
37
ciclos semi-continuos diarios, es decir, a 50 mL de solución (efluente del reactor
de ozonación) se le ajusta el pH a 7 y se añaden las sales del medio de cultivo,
se inocula al principio del ciclo y se incuba a 200 rpm y 25°C durante 23 horas,
posteriormente la solución se deja sedimentando por 45 min y se elimina el
sobrenadante.
El objetivo de este método de adaptación es aumentar gradualmente la
concentración de sustratos a los cuáles se pretende aclimatar al consorcio; ya
que la fuente de carbono la constituye el efluente de ozonación, se hicieron
diluciones de éste de tal forma que se tuviera en solución del 10%-100% de la
concentración de los productos de ozonación. En el primer ciclo del proceso se
utiliza la solución que contiene 10% de sustrato (productos de ozonación),
cuando se elimina el sobrenadante correspondiente, en el sedimento se
encuentran contenidos los microorganismos, a los cuáles se les agrega
nuevamente 50 mL de solución, pero a una mayor concentración a la previa
(20%-100% de sustrato) y así sucesivamente (Figura 2.5).
Figura 2.5. Diagrama del proceso de adaptación de los microorganismos (fill-and-draw).
38
Los inóculos para los consorcios adaptados a los clorofenoles ozonados bajo
diferentes condiciones se constituyeron por mezclas de CA4CF, CA24DCF,
CAF y CAA, con el fin de tener en el medio microorganismos capaces de
degradar tanto los clorofenoles, así como compuestos fenólicos y ácidos
orgánicos que forman parte de los productos de reacción de los clorofenoles
con el ozono, lo cual se discutirá más a fondo en el siguiente capítulo.
Mantenimiento de los cultivos
Los microorganismos se mantuvieron suspendidos en el medio de cultivo antes
descrito con agitación permanente, a temperatura ambiente. Periódicamente se
realizaron labores de mantenimiento de los consorcios, tales como el
resembrado, es decir, tomar una parte del consorcio y añadir solución
contaminada con los compuestos a los cuáles se encontraba adaptado el
consorcio e incubar.
Por otro lado, para evitar el agotamiento de los nutrientes, así como la oxidación
celular, periódicamente se cambió el medio de cultivo en los cultivos. Éstos se
filtraron con membranas de 0.45 micras de tamaño de poro; los sólidos (que
contienen las células) se suspendieron en medio de cultivo fresco contaminado
con los compuestos de interés.
Los tiempos de resembrado y cambio de medio de cultivo dependen de los
ciclos de consumo de sustrato y crecimiento de cada consorcio en particular.
2.2.3. Métodos analíticos
Espectrofotometría UV-Vis
39
Esta técnica se utilizó para obtener las dinámicas de descomposición de los
clorofenoles sin ozonar. Las muestras se filtraron con acrodiscos de 0.2 micras
y posteriormente fueron analizadas con un equipo UV-VIS de Perkin Elmer
Lambda 2S; se hizo el barrido en el rango de 190-320 nm.
La cuantificación se realizó a las longitudes de onda características de los
compuestos de estudio, como se observa en la tabla 2.5.
Tabla 2.5. Longitudes de onda características de los compuestos estudiados.
Compuesto λmáx
4-Clorofenol 279.9
2,4-Diclorofenol 284.4
También, se utilizó esta técnica para el monitoreo de la formación de biomasa
en el proceso de biodegradación. Se tomaron muestras del bioproceso, las
cuales no se filtraron y se midió su Densidad Óptica (absorbancia) a una λ =
600 nm (DO600) con el mismo equipo UV-VIS.
Cromatografía de los líquidos de alta eficiencia (HPLC)
Esta técnica se utilizó para la identificación de los subproductos formados, así
como la cuantificación de la descomposición y/o acumulación de los mismos,
para ello se utilizó un Cromatógrafo de Líquidos de Alta Eficiencia (HPLC) Serie
2000 de Perkin Elmer; la identificación se hizo por comparación de tiempos de
retención de los compuestos observados y estándares de referencia. Se
utilizaron dos condiciones de análisis, según el tipo de compuestos a identificar
(tabla 2.6).
40
Tabla 2.6 Condiciones de análisis por HPLC
Condiciones de operación
Tipo de compuestos
Fenólicos Ácidos orgánicos
Columna Platinum C-18 (Marca
Alltech), 250 x 4.6mm
Prevail Organic Acid (Marca
Grace), 150 x 4.6mm
Fase móvil
60:40
(H2O:Metanol)
Solución KH2PO4 25 mMol
(pH =2.5)
λ (nm) 210
Flujo 1mL / min
Volumen de
Inyección 30 µL
De aquí en adelante, se considerarán compuestos fenólicos, aquellos que
fueron observados a partir de la separación lograda con la columna C-18, por
otro lado, se considerarán ácidos orgánicos aquellos observados a partir de la
separación obtenida con el otro método, ambos especificados en la tabla 2.6.
Lo anterior, por la afinidad de los compuestos en cuestión con las fases móviles
usadas.
41
CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Ozonación previa de clorofenoles
Se realizó la ozonación de los clorofenoles con el fin de obtener las dinámicas
de descomposición de los clorofenoles con el ozono, así como la de
acumulación y/o descomposición de los respectivos intermediarios formados en
el proceso para seleccionar las condiciones del acoplamiento posterior con los
tratamientos biológicos. De aquí en adelante el término dinámica referirá a la
variación de la concentración del compuesto en cuestión con respecto al
tiempo.
Las condiciones experimentales (concentración inicial y flujo volumétrico de
ozono, pH de la reacción) se eligieron tomando como referencia los resultados
previos (16). Las constantes de reacción de la ozonación de los clorofenoles
fueron determinadas por Poznyak y col. (29) y se presentan en la tabla 3.1
Tabla 3.1 Constantes de reacción de la ozonación de los clorofenoles
Compuesto pH ozonación k, L/mol s
4-Clorofenol 7 3.091 x 103 12 8.474 x 103
2,4-Diclorofenol 7 6.173 x 103 12 17.032 x 103
A pesar de contar en bibliografía con estudios tan sólidos acerca de la
ozonación de estos compuestos fue necesario hacer un estudio particular de la
misma para confirmar lo reportado en la literatura y para recabar toda la
42
información requerida para seleccionar las condiciones, bajo las cuales llevar a
cabo la ozonación en el tratamiento combinado propuesto en este trabajo.
Se llevó a cabo la ozonación (en un sistema semi-continuo) del 4-clorofenol y
del 2,4-diclorofenol individualmente (ambos a una concentración inicial de 120
mg/L), el pH inicial de trabajo fue de 7 y 12 para cada compuesto. Las
condiciones de operación se llevaron a cabo de acuerdo a lo expuesto en el
capítulo 2.
A lo largo del proceso se tomaron muestras para obtener las dinámicas de
descomposición de los contaminantes y las de formación y/o descomposición
de los productos de reacción, la identificación de éstos se realizó por HPLC.
Cabe mencionar que se observaron algunos compuestos que no fue posible
identificar por esta técnica, sin embargo se presentan sus dinámicas
(normalizadas con respecto a la concentración máxima) a lo largo del proceso
de ozonación.
A continuación se muestran los ozonogramas respectivos (variación de la
concentración de ozono a la salida del reactor con respecto al tiempo), así
como las dinámicas de los compuestos involucrados a lo largo de la ozonación.
Los primeros segundos del ozonograma corresponden a la concentración inicial
de ozono, la caída súbita corresponde a la alimentación del ozono al reactor.
3.1.1 Saturación de ozono en agua
Antes de llevar a cabo la ozonación de los contaminantes se determinó la
descomposición de ozono en medio acuoso bajo las condiciones de trabajo.
Como se explicó en el capítulo 1, el ozono en solución acuosa puede
descomponerse en radicales OH, los cuales tienen un poder oxidante mayor al
primero; esta descomposición se favorece en medio alcalina.
43
Para verificar este efecto, se llevó a cabo la ozonación del agua sin
contaminante bajo pH 7 y 12, en ambos casos se verificó la saturación (cuando
la concentración de ozono a la salida del reactor es constante), así como la
descomposición de ozono (diferencia entre la concentración de entrada y salida
del reactor). Esta información se presenta en la figura 3.1, donde se puede
apreciar que a pH neutro no se presenta una descomposición significativa del
ozono; ya que la concentración de éste a salida del reactor se iguala con la de
entrada una vez alcanzada la saturación del agua. Mientras que bajo
condiciones básicas, la concentración de ozono a la salida del reactor no se
iguala a la de entrada ya que parte del ozono que entra al reactor se
descompone en radicales OH, obteniéndose una diferencia de concentraciones
de ozono (a la entrada y salida) del 26%.
Figura 3.1. Comportamiento del ozono a la salida del reactor durante su
saturación en agua bajo pH 7 y 12.
3.1.2 Descomposición del 4-Clorofenol con ozono
44
En las figuras 3.2 y 3.3 se presentan los ozonogramas del 4-Clorofenol bajo pH
7 y 12. En cada caso se presentan dos curvas, la primera corresponde a la
saturación de ozono en agua bajo el pH de trabajo y la segunda describe el
comportamiento del ozono en la reacción con el 4-Clorofenol bajo las
condiciones descritas. La diferencia entre ambas curvas es proporcional al
consumo de ozono en cada reacción.
Figura 3.2. Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 4-clorofenol (120 ppm), pH 7.
45
Figura 3.3. Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 4-
clorofenol (120 ppm), pH 12. Se puede observar que a pH 7 la concentración de salida iguala a la de entrada
hasta después de 4500 segundos (75 minutos), mientras que cuando la
reacción se lleva bajo pH 12, a los 1400 segundos (23 minutos) la
concentración de salida se iguala con la saturación de ozono en agua (ausencia
de contaminante).
3.1.2.1 Dinámica de descomposición del 4-clorofenol en el proceso de ozonación bajo pH 7 y distribución de productos de reacción En las figuras 3.4 – 3.7 se muestra la dinámica de descomposición del
4-clorofenol a lo largo del proceso de ozonación (bajo pH 7), así como las
dinámicas de formación y/o descomposición de los compuestos fenólicos y
ácidos orgánicos observados por HPLC. Se muestran por separado las
dinámicas de los compuestos identificados, así como las respectivas tendencias
resultantes de la normalización (con respecto al valor máximo) de la altura de
los picos observados en los cromatogramas correspondientes a los compuestos
no identificados. En dichas figuras se indican con flechas los tiempos de
46
descomposición y/o acumulación máximas de los compuestos involucrados en
la reacción, lo cual se explica posteriormente.
Figura 3.4 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del
proceso de ozonación del 4-CF (pH 7).
Figura 3.5 Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo del
proceso de ozonación del 4-CF (pH 7).
47
De acuerdo a las figura 3.4 se puede observar que el tiempo de
descomposición (mayor al 99%) del 4-clorofenol bajo esas condiciones es de 15
minutos, tiempo que coincide con la máxima acumulación de hidroquinona (8
mg/L) que es el compuesto fenólico identificado que se acumula en mayor
cantidad a lo largo del proceso, ésta se descompone totalmente a los 30
minutos. También se observan trazas de fenol y catecol.
Así mismo se aprecia en la figura 3.5 que se forman algunos otros compuestos
que no se identificaron los cuáles tienen un máximo de acumulación a los 10
minutos, a partir de ese tiempo, su tendencia es a descomponerse, cuando han
transcurrido 30 minutos, la mayoría de estos compuestos han sido
descompuestos en su totalidad, o bien, de manera significativa (más del 60%
con respecto a la cantidad máxima acumulada).
Figura 3.6 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso
de ozonación del 4-CF (pH 7).
48
Figura 3.7 Distribución de orgánicos no identificados a lo largo del proceso de
ozonación del 4-CF (pH 7)
En la figura 3.6 se observa que el ácido oxálico es el producto final de la
reacción, ya que es el que mantiene una tendencia de acumulación a lo largo
del proceso (se alcanzan 64 mg/L), por otro lado, el ácido fórmico se acumula
en concentraciones importantes; a los 10 minutos alcanza su concentración
máxima (154 mg/L) y posteriormente tiende a descomponerse.
También se forman pequeñas cantidades de ácidos como el maleico y el
fumárico, sin embargo, las concentraciones de éstos siempre se mantienen en
el nivel de trazas (menos de 0.3 mg/L). Recordando el esquema de reacción de
los clorofenoles con ozono presentado en el capítulo 1 (figura 1.3), los
productos finales de la reacción (ácido oxálico y fórmico) se forman a partir de
los ácidos fumárico y maleico, pero la reacción de éstos últimos con ozono es
muy rápida, razón por la cual no se acumulan en cantidades significativas en la
reacción.
Con respecto a los ácidos orgánicos no identificados (figura 3.7) se puede
apreciar que su tendencia es muy similar a la de los compuestos fenólicos no
49
identificados, presentando un máximo en los 10 minutos y después de los 30
minutos la mayoría se han descompuesto completamente o bien, de manera
significativa (más del 60% con respecto a la cantidad máxima acumulada).
El análisis detallado de los subproductos identificados y no identificados se
realizó para todas las condiciones diferentes de ozonación planteadas en el
capítulo 2 (tabla 2.4). Por cuestiones de espacio, en adelante se omitirán las
figuras correspondientes a los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos no
identificados, éstas pueden ser consultadas en el Anexo C. Sin embargo, más
adelante se presenta un resumen de los tiempos de acumulación y/o
descomposición de los compuestos involucrados en la ozonación bajo las
diferentes condiciones presentadas.
3.1.2.2 Dinámica de descomposición del 4-clorofenol en el proceso de ozonación bajo pH 12 y distribución de productos de reacción En las figuras 3.8 y 3.9 se muestran las dinámicas del 4-Clorofenol a lo largo del
proceso de ozonación (bajo pH 12), así como las dinámicas de formación y/o
acumulación de los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos identificados.
Figura 3.8 Distribución de compuestos fenólicos a lo largo del proceso de
ozonación del 4-CF (pH 12).
50
De acuerdo a las figuras 3.8 se puede apreciar que cuando la ozonación se
lleva a cabo bajo pH 12 la descomposición del 4-clorofenol es más rápida que
en el caso anterior. Se requieren de 8 minutos para degradar más del 99% del
contaminante (contra 15 que se requieren para descomponerlo bajo pH 7). En
cuanto a los productos fenólicos, el compuesto que se acumula
mayoritariamente, al igual que bajo pH 7, es la hidroquinona, sólo que bajo
estas condiciones se acumula en concentraciones menores (máximo 1 mg/L),
así mismo, no se observa catecol y la acumulación de fenol también se
mantiene a nivel de trazas (menos de 0.3 mg/L).
Figura 3.9 Distribución de compuestos ácidos orgánicos a lo largo del proceso
de ozonación del 4-CF (pH 12).
Tomando en cuenta la figura 3.9, se observa que el compuesto que tiende a
acumularse es el ácido oxálico, al igual que cuando la reacción se lleva a cabo
bajo pH 7. Así mismo, la acumulación de éste es mayor (151 mg/L). Al principio
del proceso también se acumula el ácido fórmico, sin embargo a los 10 minutos
llega a su máximo (71 mg/L) y tiende a descomponerse hasta los 30 minutos.
Se observan algunas trazas (menos de 0.3 mg/L) de los ácidos fumárico y
maleico.
51
Conclusiones previas de la ozonación del 4-clorofenol bajo pH 7 y 12
Cuando la ozonación se lleva a cabo bajo pH 12 se observa una menor
cantidad de subproductos (tanto fenólicos como ácidos orgánicos), así mismo
las concentraciones de éstos son más pequeñas. En ambos casos, el producto
final de la reacción es el ácido oxálico, sin embargo, la formación de éste se
favorece más cuando la reacción se lleva bajo pH 12. Bajo estas condiciones se
forman 151 mg/L de este ácido, mientras que cuando se lleva a cabo bajo pH 7,
se acumulan hasta 64 mg/L. Así mismo, en ambos casos se acumulan
cantidades significativas de ácido fórmico y su tendencia en ambos procesos es
similar (se acumula desde el principio y luego se descompone). De manera
opuesta al ácido oxálico, la formación de éste se favorece bajo pH neutro y se
llega acumular hasta 154 mg/L, mientras que bajo pH 12 se acumulan hasta 71
mg/L.
En la tabla 3.2 se muestra de las concentraciones máximas de los productos de
ozonación identificados que se acumularon a lo largo del proceso.
Tabla 3.2 Concentración máxima de los compuestos identificados en la
ozonación del 4-Clorofenol
Intermediario Concentración (mg/L) según el pH
de ozonación 7 12
Catecol Trazas ND
Hidroquinona 8 1
Fenol Trazas Trazas
Ácido Fumárico Trazas Trazas
Ácido Maléico Trazas Trazas
Ácido Oxálico 60.0 160.0
Ácido Fórmico 154.0 71.0 */ND=No se detectó
52
3.1.3 Descomposición del 2,4-Diclorofenol con ozono
En las figuras 3.10 y 3.11 se presentan los ozonogramas del 2,4-diclorofenol
bajo pH 7 y 12. De manera similar a lo presentado para el 4-clorofenol, se
muestran las curvas de saturación de ozono en agua y la del comportamiento
del ozono en la reacción con el 2,4-diclorofenol bajo las condiciones de
operación. La diferencia entre ambas curvas es proporcional al consumo de
ozono en cada reacción.
Figura 3.10 Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 2,4-diclorofenol (120 ppm) a pH 7.
53
Figura 3.11 Comportamiento del ozono a la salida del reactor para el 2,4-diclorofenol (120 ppm) a pH 12.
De acuerdo a las figuras 3.10 y 3.11, para la ozonación del 2,4-diclorofenol bajo
pH 7, la concentración de salida es igual a la de entrada hasta después de 3000
segundos (50 minutos), mientras que cuando la reacción se lleva bajo pH 12, a
los 1400 segundos (23 minutos) la concentración de salida se iguala con la
saturación de ozono en agua (ausencia de contaminante).
Se puede apreciar que el perfil de ozonación para ambos clorofenoles es
similar (Figuras 3.12 y 3.13), de acuerdo a lo observado en sus respectivos
ozonogramas. El regreso de la concentración final al valor inicial (pH 7) es más
rápido en el 2,4-Diclorofenol (50 minutos) que en el 4-clorofenol (75 minutos),
sin embargo para el caso de la ozonación bajo pH 12, en ambos clorofenoles se
iguala la concentración de salida con la de saturación de ozono en agua a los
23 minutos. La comparación entre los ozonogramas de cada clorofenol bajo las
condiciones de trabajo se presenta en las figuras 3.12 y 3.13.
54
Figura 3.12 Comparación de los ozonogramas de ambos clorofenoles (pH 7).
Figura 3.13 Comparación del los ozonogramas de ambos clorofenoles (pH 12). A pesar de que el comportamiento de los ozonogramas de ambos clorofenoles
es similar, cualitativamente se puede observar que con el 2,4-diclorofenol es
menor el ozono consumido durante la reacción (bajo ambos pH), ya que el área
comprendida entre el ozonograma de la saturación y el de la reacción es
visualmente menor que la representada por el 4-clorofenol.
55
3.1.3.1 Dinámica de descomposición del 2,4-diclorofenol en el proceso de ozonación bajo pH 7 y distribución de productos de reacción
A continuación se presentan las dinámicas del 2,4-diclorofenol en el proceso de
ozonación (bajo pH 7), así como las dinámicas de formación y/o acumulación
de los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos identificados a lo largo de la
reacción (figuras 3.14 y 3.15).
Figura 3.14 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del
proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 7).
En la figura 3.14 se puede observar que el tiempo de descomposición (mayor al
99%) del 2,4-diclorofenol bajo esas condiciones es de 8 minutos (menor tiempo
que el 4-clorofenol ozonado bajo las mismas condiciones), tiempo que coincide
con la máxima acumulación de hidroquinona (2.8 mg /L), lo cual se observa
también en el 4-clorofenol. Además de la hidroquinona (que es el compuesto
fenólico identificado que se acumula en mayor cantidad), se observan algunas
trazas de catecol, fenol, así como 4-clorofenol.
56
Figura 3.15 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso
de ozonación del 2,4-DCF (pH 7).
En la figura 3.15, al igual que en el 4-clorofenol (ozonado bajo pH7), se
observa que el ácido oxálico es el producto final de la reacción, ya que
mantiene una tendencia de acumulación, alcanzando los 38 mg/L. Por otro lado,
el ácido fórmico también se acumula en concentraciones importantes: a los 10
minutos alcanza su concentración máxima (52 mg/L), la cual es
significativamente menor a la alcanzada con el 4-Clorofenol (154 mg/L),
después de esto, de manera similar, tiende a descomponerse. Cabe resaltar
que las dinámicas de estos ácidos en ambos compuestos son muy similares. En
este caso, también se observan trazas de ácidos fumárico y maleico.
3.1.3.2 Dinámica de descomposición del 2,4-diclorofenol en el proceso de ozonación bajo pH 12 y distribución de productos de reacción
De manera similar a las secciones anteriores, en las figuras 3.16 y 3.17 se
muestran las dinámicas del 2,4-Diclorofenol a lo largo del proceso de ozonación
57
(bajo pH 12), así como las dinámicas de formación y/o acumulación de los
compuestos fenólicos y ácidos orgánicos identificados.
Figura 3.16 Distribución de compuestos fenólicos identificados a lo largo del
proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12).
Cuando la ozonación del 2,4-diclorofenol se lleva a cabo bajo pH 12, se observa
que la reacción es más rápida, en este caso se requieren 5 min para
descomponer más del 99% del contaminante, contra 8 minutos que se
requieren para hacerlo bajo pH 7. Al igual que todos los anteriores, el
compuesto fenólico que se acumula mayoritariamente es la hidroquinona (3
mg/L). Adicionalmente, se acumulan algunas trazas de fenol y 4-Clorofenol
(menos de 0.5 mg/L).
58
Figura 3.17 Distribución de ácidos orgánicos identificados a lo largo del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12).
En la figura 3.17, se observa que el ácido oxálico también es el producto que
tiende a acumularse a lo largo del proceso. Bajo estas condiciones se alcanza
una concentración de 128 mg/L. Por otro lado, el comportamiento del ácido
fórmico es similar al observado bajo pH 7, sin embargo, la dinámica de éste es
más rápida, en los primeros cinco minutos se acumula la máxima concentración
(54 mg/L) y a los 30 minutos ha sido descompuesto casi en su totalidad.
También se observan trazas de ácido fumárico y maleico (menos de 1 mg/L).
Conclusiones previas de la ozonación del 2,4-diclorofenol bajo pH 7 y 12
Cuando la ozonación del 2,4-Diclorofenol se lleva a cabo bajo pH alcalino, la
cantidad de productos de reacción (fenólicos y ácidos orgánicos) es menor, que
bajo pH neutro. Así mismo, bajo ambas condiciones de reacción, el ácido
oxálico es el compuesto que tiende a acumularse hasta el final del proceso, sólo
que bajo pH 12 se acumula en mayor cantidad (128 mg/L), mientras que bajo
pH 7 se acumulan 38 mg/L. En ambas condiciones de reacción se acumulan
59
trazas de ácidos fumárico y maleico, que de acuerdo al esquema de reacción
de los clorofenoles con ozono presentado en el capítulo 1, son los predecesores
de los productos finales, que son los ácidos oxálico y fórmico.
En la tabla 3.3 se muestra un resumen de las concentraciones máximas de los
productos de ozonación identificados que se acumularon a lo largo del proceso.
Tabla 3.3 Concentración máxima de los compuestos identificados en la ozonación del 2,4-Diclorofenol
Intermediario Concentración (mg/L) según el pH
de ozonación 7 12
Catecol 0.5 ND
Hidroquinona 3.0 3.0
Fenol Trazas Trazas
4-clorofenol Trazas Trazas
Ácido Fumárico Trazas Trazas
Ácido Maléico Trazas Trazas
Ácido Oxálico 38.0 128.0
Ácido Fórmico 53.0 54.0 */ND=No se detectó
Comparación de la ozonación de ambos clorofenoles
Tal como se puede apreciar en la tabla 3.1, el 2,4-Diclorofenol es más reactivo
con ozono, lo cual se ve reflejado en su constante de reacción que es mayor
que la del 4-Clorofenol, es por ello que el tiempo de descomposición del 2,4-
Diclorofenol es menor. Así mismo, en ambos casos las constantes de reacción
son mayores bajo pH 12 que bajo pH 7, lo cual se ve reflejado en una inminente
disminución de los tiempos de descomposición en cada caso.
60
En la tabla 3.4 se muestra un resumen de los compuestos no identificados que
se observaron en la ozonación de ambos clorofenoles, 4-Clorofenol (4-CF) y
2,4-Diclorofenol (2,4-DCF), bajo las condiciones estudiadas (pH 7 y 12). Estos
compuesto se clasifican según las condiciones cromatográficas bajo las cuales
fueron identificados (compuestos fenólicos o ácidos orgánicos). En dicha tabla
se presentan todos los compuestos, la “x” indica que el compuesto fue
observado en el caso marcado.
Tabla 3.4 Concentrado de los compuestos formados a lo largo de la ozonación que no fueron identificados.
Compuesto/ Tiempo de Retención
(min)
Tipo de compuestos
Condiciones de ozonación
4-CF, pH 7
4-CF, pH 12
2,4-DCF, pH 7
2,4-DCF, pH 12
AF / 2.0
Fenólicos
x x x x BF / 2.3 x x x x CF / 2.5 x x DF / 2.8 x x EF / 3.0 x x FF / 3.6 x GF / 7.3 x x HF / 1.7 x x IF / 4.3 x
KF / 15.8 x AA /1.7
Ácidos Orgánicos
x x BA / 2.7 x x x x CA / 3.1 x x x x DA / 3.3 x x x x EA / 3.6 x x x FA / 4.7 x x JA / 8.2 x x KA / 8.4 x LA / 10.3 x MA / 14.6 x x HA / 5.5 x IA / 7.1 x
61
Tal como se puede apreciar en la tabla 3.4, hay compuestos que se forman en
los cuatro casos de ozonación estudiados: AF, BF, BA, CA, DA. Así mismo, es
muy claro que bajo condiciones alcalinas se forman menos compuestos. Como
se mencionó previamente, las tendencias de éstos compuestos a lo largo de la
ozonación es similar; se comienzan a formar en los primeros minutos de la
ozonación y se acumulan hasta llegar a un máximo. A partir de ese punto su
abundancia en el medio comienza a disminuir hasta ser descompuestos
completamente o bien perdurar en una concentración constante (menor a la
máxima).
En la tabla 3.4 se muestran los tiempos de ozonación (bajo las diferentes
condiciones de operación estudiadas), en los cuales se acumulan las
concentraciones máximas de los compuestos no identificados, así como los
tiempos correspondientes a la descomposición máxima de éstos que se logra
en la ozonación.
Tabla 3.5 Tiempos de ozonación donde se presentan las concentraciones máximas y mínimas de los compuestos no identificados
Los tiempos especificados en la tabla 3.3 son de gran importancia para la
selección de las condiciones de ozonación, bajo las cuales se llevará a cabo
tratamiento combinado propuesto en este trabajo. A pesar de que no todos los
productos de ozonación fueron identificados se puede inferir el efecto de su
presencia en el efluente de ozonación a lo largo del tratamiento combinado, y
Compuesto pH
Tiempos de ozonación observados (min) Descomposición Acumulación máxima
Clorofenol inicial
(>99%)
Compuestos no identificados
Compuestos no identificados
Ácidos orgánicos Fenólicos Ácidos
orgánicos Fenólicos
4-CF 7 15 30 30 10 10 12 8 30 30 5 5
2,4-DCF 7 8 30 30 8 5 12 5 20 15 5 5
62
así encontrar las condiciones que favorezcan mayoritariamente el tratamiento
biológico. Así mismo, se sabe por bibliografía que los clorofenoles son
altamente tóxicos y potencialmente inhibitorios de los procesos biológicos, por
lo que es necesario conocer el tiempo necesario para su descomposición total
(>99%) para considerarlo al momento del tratamiento combinado posterior.
3.2 Biodegradación de clorofenoles sin pre-tratamiento químico
Así como se realizó la ozonación de ambos clorofenoles, se llevó a cabo
individualmente la biodegradación de cada uno de los compuestos de estudio. A
continuación se presentan los resultados concernientes a la oxidación biológica
de los clorofenoles.
3.2.1 Aclimatación de microorganismos a fuentes de carbono no ozonadas
Tal como se explicó en el capítulo 2, al principio del trabajo se contaba sólo con
un consorcio aclimatado a fenol (CAF) y a partir de éste se prepararon otros
consorcios capaces de degradar tanto a los compuestos iniciales como a los
principales productos resultantes de la ozonación.
En la sección anterior se verificó que los principales intermediarios formados en
la ozonación de los clorofenoles estaban divididos en dos grupos: compuestos
fenólicos, dentro de los cuales se encuentran principalmente fenol, catecol e
hidroquinona, así como ácidos orgánicos tales como el fórmico y el oxálico que
para todas las condiciones de ozonación estudiadas constituyó el producto final
que se acumuló a lo largo de toda la reacción.
Se hicieron pruebas de biodegradación con el CAF para verificar los
compuestos que era capaces de degradar (tanto los clorofenoles iniciales como
63
los principales intermediarios identificados en la ozonación). Se encontró que
éste era capaz de degradar fenol, catecol e hidroquinona, sin embargo no se
observó degradación para ninguno de los clorofenoles ni para los ácidos oxálico
y fórmico, por lo que, a partir del CAF se prepararon otros tres consorcios, a los
cuáles se les aclimató a estos compuestos. La metodología se explica en el
capítulo 2. La tabla 3.1 muestra los consorcios adaptados a las diferentes
fuentes de carbono sin ozonar.
Tabla 3.6 Compuestos capaces de degradar por los consorcios adaptados a fuentes de carbono sin ozonar
Fuente de carbono
adaptada Abreviatura Compuestos capaces de degradar
Fenol CAF Fenol
Catecol Hidroquinona
Mezcla de ácidos oxálico y fórmico CAA Ácido Oxálico
Ácido Fórmico
4-Clorofenol CA4CF 4-Clorofenol
2,4-Diclorofenol CA24DCF 2,4-Diclorofenol
En función de lo anterior, estos compuestos fueron sometidos al proceso de
biodegradación en cultivos en lote con el consorcio correspondiente, acorde a la
tabla 3.6, para estudiar su comportamiento en el proceso de biodegradación.
Las pruebas de biodegradación se realizaron después de verificar que cada
consorcio era capaz de degradar los sustratos a los que se estaba aclimatando
3.2.1 Biodegradación del 4-Clorofenol Se realizaron cultivos en lote usando el consorcio adaptado al 4-clorofenol
(CA4CF) en medio mineral. A lo largo del proceso se realizó la medición de la
concentración del 4-clorofenol para verificar la evolución del proceso. La figura
64
3.18 muestra la descomposición del sustrato en cuestión por efecto del
tratamiento biológico.
Figura 3.18 Perfil de biodegradación del 4-clorofenol (120 ppm).
De acuerdo a la figura 3.1 se puede observar el efecto de la toxicidad del 4-
Clorofenol. A pesar de que el consorcio utilizado se aclimató previamente a este
compuesto a una concentración de 40 mg/L, cuando el mismo se pone en un
medio con una concentración de 120 mg/L, el proceso se inhibe debido a la
toxicidad provocada por la alta concentración del sustrato y no se observa una
degradación significativa.
3.2.2 Biodegradación del 2,4-Diclorofenol
Al igual que en el caso anterior, se realizaron cultivos en lote donde se
proporcionó el 2,4-Diclorofenol como única fuente de carbón y energía de los
microorganismos constituyentes del consorcio previamente adaptado a éste
(CA24DCF). De igual manera, a lo largo del tiempo se realizaron mediciones de
la concentración del contaminante en cuestión para monitorear el proceso; en la
figura 3.19 se puede apreciar el consumo de sustrato por los microorganismos.
65
Figura 3.19 Perfil de biodegradación del 2,4-Diclorofenol (120 ppm).
En este caso se puede observar que la toxicidad del 2,4-Diclorofenol es menor
con respecto a la del 4-Clorofenol, ya que el primero puede ser utilizado por los
microorganismos y después de 10 días se observa una descomposición del
60%, mientras que el caso anterior se observó la inhibición del proceso. A pesar
de que ambos consorcios fueron aclimatados bajo las mismas condiciones y a
las mismas concentraciones del clorofenol correspondiente (40 mg/L).
Lo anterior coincide con estudios que han encontrado un efecto inhibitorio
provocado por el 4-Clorofenol a concentraciones menores al 2,4-Diclorofenol,(50)
lo cual está relacionado con los metabolitos formados en el proceso de
biodegradación; los cuales pueden ser más tóxicos que los compuestos
originales, tales como los clorocatecoles que, dependiendo de la posición del
cloro con respecto a los grupos OH, pueden ser letales para los
microorganismos y por consiguiente, provocar inhibición del proceso (43,44).
Estos resultados muestran que para los clorofenoles el proceso de
biodegradación por sí solo resulta insuficiente, ya que después de 10 días de
tratamiento biológico no es posible eliminar más del 60% de este tipo de
sustratos, a pesar de incluir la etapa de aclimatación a cada sustrato antes del
biotratamiento, que por bibliografía se sabe que es un factor de suma
66
importancia para reducir los tiempos de degradación y evitar la inhibición de la
misma (46).
Los resultados expuestos hasta el momento ponen en evidencia los
inconvenientes de aplicar solamente tratamientos biológicos para la eliminación
de este tipo de compuestos, que implica grandes tiempos de tratamiento
traducidos a grandes volúmenes de reactores, así como los respectivos
inconvenientes derivados de éstos. Por otro lado, la aplicación de un proceso
químico como etapa previa del biológico en el caso específico estudiado
(tratamiento de clorofenoles en fase acuosa) representa ventajas tales como
descomposición rápida de los contaminantes, así como la formación de
productos menos tóxicos. En función de lo anterior (recordando que en el
presente trabajo se pretende acoplar el proceso de ozonación como etapa
previa al de biodegradación), es necesario verificar si es factible la
biodegradación de los intermediarios formados en el proceso de ozonación.
3.2.3 Biodegradación de los principales intermediarios del proceso de ozonación de clorofenoles
Se realizaron cultivos en lote de los principales intermediarios identificados en la
ozonación de los clorofenoles para comprobar que fuera factible eliminarlos por
biodegradación. Como se explicó en la tabla 3.6, para los compuestos fenólicos
el CAF fue capaz de utilizar fenol, catecol como la hidroquinona (ambos a una
concentración inicial de 120 mg/l) como fuentes de carbono y energía, por ser
estos últimos de estructura muy similar al fenol y carecer de cloros que pudieran
dar lugar a metabolitos tóxicos que inhibieran el proceso.
Para los ácidos orgánicos se utilizó el consorcio adaptado a éstos (CAA). Se
realizaron los cultivos en lote donde los ácidos oxálico y fórmico (ambos a una
67
concentración inicial de 100 mg/l) constituyeron la única fuente de carbón y
energía.
Las figuras 3.20 y 3.21 muestran la variación de la concentración normalizada
de cada compuesto con respecto al tiempo, por efecto de la biodegradación.
Figura 3.20 Perfil de biodegradación de compuestos fenólicos formados en la ozonación.
Como se puede observar, tanto el fenol, catecol e hidroquinona pueden ser
consumidos por el CAF, los tiempos requeridos para este fin son 14 h, 19 h y 6
días, respectivamente. Es evidente que el tiempo para degradar los compuestos
dihidroxilados es mayor al requerido para la degradación del fenol ya que el
consorcio originalmente estaba adaptado al fenol. Adicionalmente, el fenol es
degradado por los microorganismos por la ruta del catecol, donde éste es el
primer intermediario formado para la asimilación del fenol(30), por lo que no es
de extrañarse que sea tan similar el comportamiento de ambos sustratos con el
mismo consorcio.
68
Por otro lado, aunque la hidroquinona requiere tiempos relativamente largos
para su descomposición, cabe resaltar que durante la ozonación se acumulan
cantidades menores a 10 mg/L (tablas 3.2 y 3.3). Con estos resultados,
solamente se comprobó que los intermediarios fenólicos pudieran ser utilizados
por el CAF como fuente de carbono y energía.
Figura 3.21 Perfil de biodegradación de ácidos orgánicos formados en la ozonación.
De acuerdo a la figura 3.21 se puede apreciar que los ácidos oxálico y fórmico
son compuestos de fácil eliminación por bioproceso después del periodo de
aclimatación del consorcio, en alrededor de dos días de tratamiento.
Con la presencia de dos sustratos en el medio, claramente se puede observar
la competencia que existe entre ambos. Al principio del proceso, el ácido
oxálico es asimilado más rápido que el ácido fórmico, al ser el sustrato preferido
por los microorganismos, conforme la disponibilidad en el medio de este
sustrato disminuye, se observa el consumo del segundo sustrato (ácido
fórmico), el cual una vez que el ácido oxálico ha sido eliminado en su totalidad
69
(después de 29 horas) es consumido de manera acelerada, observándose el
mayor consumo de ácido fórmico a partir de este punto (entre 29 y 32 horas).
Conclusiones previas de la biodegradación de los clorofenoles sin ozonar
y los principales intermediarios identificados en la ozonación
En base a los resultados presentados se puede concluir que la biodegradación
de los clorofenoles mostró no ser efectiva porque se presenta la inhibición del
proceso (en el caso del 4-Clorofenol) así como una eliminación muy lenta (10
días para eliminar 60% del 2,4-Diclorofenol), a pesar de que se contaba con
consorcios específicamente aclimatados a cada compuesto.
Por otro lado, cuenta con consorcios que son capaces de metabolizar a los
principales compuestos que se encuentran presentes después de la ozonación
de los clorofenoles en cuestión: 2,4-Diclorofenol, 4-Clorofenol, fenol, catecol,
hidroquinona, ácido oxálico y ácido fórmico (tabla 3.6).
Contrario a lo observado con los clorofenoles, los productos de la ozonación
mostraron un buen desempeño en el tratamiento biológico, desde los
compuestos fenólicos que se acumulan en cantidades relativamente bajas
hasta los ácidos orgánicos, que son los que tienden a acumularse hasta el final
del proceso, como es el caso del ácido oxálico (tablas 3.2 y 3.3).
De acuerdo a los resultados obtenidos hasta esta etapa del trabajo existe un
gran interés en utilizar la ozonación como etapa previa al proceso de
biodegradación y descomponer (parcial ó totalmente) a los contaminantes en
cuestión y dar lugar a productos que sea posible eliminar en el bioproceso.
70
3.3 Selección de las condiciones de ozonación para el tratamiento acoplado (químico-biológico)
Tomando en cuenta la información presentada en las secciones anteriores se
hizo un análisis de los resultados obtenidos en ambos procesos (ozonación y
biodegradación) llevados a cabo de manera individual, con el objetivo de
disminuir en el tratamiento combinado las desventajas de ambos. Se eligieron
diferentes condiciones para estudiar la combinación de tratamientos y evaluar la
influencia de factores como la abundancia de los diferentes compuestos
involucrados de la ozonación al momento de acoplar el bioproceso
correspondiente.
3.3.1 Selección de los tiempos para suspender la ozonación previo a la biodegradación
Como se explicó previamente, los clorofenoles son altamente tóxicos, por lo que
su degradación por métodos puramente biológicos no es una tarea sencilla, lo
cual se traduce en largos tiempos de tratamiento y bajas eficiencias. En este
trabajo después de 10 días de biotratamiento no se observó degradación del 4-
Clorofenol, debido a su alta toxicidad, mientras para el 2,4-Diclorofenol se logró
eliminar en un 60% a lo largo de ese tiempo (figuras 3.18 y 3.19).
Por bibliografía se verificó que la aclimatación previa de los microorganismos a
la fuente de carbono es una etapa clave para reducir los problemas de
inhibición que generalmente se presentan en la biodegradación de compuestos
recalcitrantes.
Por otro lado, la eliminación de ambos clorofenoles por medio de la ozonación
se puede hacer en cuestión de minutos (tabla 3.5), dependiendo del pH, bajo el
cual se lleve a cabo la reacción, ya que éste factor ejerce una fuerte influencia
en la constante de reacción de estos compuestos con el ozono (tabla 3.1).
71
A pesar de que con la ozonación es posible eliminar estos compuestos en
cuestión de minutos, se pudo observar que a lo largo del proceso se forman
diferentes productos, cuyas tendencias y abundancias dependen del pH de la
reacción. Algunos de éstos se identificaron y cuantificaron, mientras que los que
no fue posible identificar se monitoreó su dinámica a lo largo del proceso
(Anexo C).
Con respecto a los productos de la ozonación que sí se identificaron, se pudo
observar que los compuestos que se acumularon en cantidades más
significativas fueron los ácidos fórmico y oxálico; en todos los casos se observó
una tendencia similar. El ácido fórmico tiende a acumularse desde el inicio del
proceso para después descomponerse en su totalidad, mientras que el ácido
oxálico es el compuesto que mantiene la tendencia de acumulación a lo largo
de toda la reacción. Adicionalmente, se acumularon pequeñas cantidades de
hidroquinona (< 10 mg/L) y trazas (< 1 mg/L) de catecol y ácidos fumárico y
maleico. La distribución de estos compuestos estuvo, por supuesto, en función
de las condiciones de ozonación.
Toda la información recabada de las secciones anteriores se tomó en cuenta
para establecer los criterios de selección de los tiempos de ozonación, en los
cuáles suspender ésta y acoplar el biotratamiento subsecuente. Cabe resaltar,
en función de lo antes expuesto, que dada la toxicidad de los clorofenoles se
buscaron tiempos donde la concentración de éstos fuera pequeña. Así mismo,
se tomaron en cuenta las dinámicas de formación y/o descomposición de los
productos de ozonación en cada uno de los casos previamente presentados.
Para estudiar el efecto en la biodegradación de los compuestos no identificados
durante la ozonación, se escogieron tiempos donde la acumulación de éstos
fuera la máxima.
72
En la tabla 3.7 se presentan los tiempos en los que se suspendió la ozonación
para acoplar el proceso biológico, los cuales constituyeron los casos de estudio
de biodegradación de clorofenoles preozonados.
Tabla 3.7 Tiempos de ozonación previa a la biodegradación
Compuesto pH
ozonación t (min)
4-Clorofenol 7 10, 15, 30
12 5
2,4-Diclorofenol 7 5, 8
12 5
A continuación se presentan los criterios tomados en cuenta para la selección
de los tiempos especificados en la tabla 3.7, de acuerdo a cada caso de
estudio.
3.3.1.1 Criterios tomados en cuenta para suspender la ozonación del 4-clorofenol previo a la biodegradación
Criterios (pH 7):
• 10 min:
• Eliminación del contaminante mayor al 90%.
• Acumulación máxima de los compuestos fenólicos no
identificados.
• Acumulación máxima de los ácidos orgánicos no
identificados
• Acumulación máxima del ácido fórmico
• 15 min:
• Degradación del 4-CF mayor al 99%
• Acumulación máxima de la hidroquinona
73
• 30 min:
• Descomposición del 70% de la hidroquinona formada.
• Descomposición del 80% del ácido fórmico formado.
• Descomposición total ó nivel mínimo de la mayoría de las
especies no identificadas.
Criterios (pH 12):
• 5 min:
• Descomposición del 85% del compuesto inicial.
• Máxima concentración de compuestos no identificados
3.3.1.2 Criterios tomados en cuenta para suspender la ozonación del 2,4-diclorofenol previo a la biodegradación:
Criterios (pH 7):
• 5 min:
• Degradación del 84% del 2,4-DCF.
• Máxima acumulación de compuestos fenólicos no
identificados
• 8 min:
• Degradación del 2,4-DCF mayor al 99%
• Acumulación máxima de la hidroquinona
• Máxima acumulación de ácidos orgánicos no identificados
Criterios (pH 12):
• 5 min:
• Degradación del 2,4-DCF mayor al 99%
• Máxima acumulación del ácido fórmico
• Máxima concentración de compuestos no identificados
Las tablas 3.8 - 3.10 muestran la descripción del efluente de la ozonación (que
corresponde al influente de biodegradación) en cada uno de los casos de
estudio para los tratamientos combinados (tabla 3.7). Por un lado se muestran
las concentraciones (sólo aquellas que son ≥ 1 mg/L) de los compuestos
identificados (tabla 3.7). Por otro lado, se muestran las concentraciones
74
relativas (normalizadas con respecto al máximo) de los compuestos fenólicos y
ácidos orgánicos que se observaron y no fue posible identificar, (tablas 3.8 y
3.9, respectivamente).
Tabla 3.8. Concentración de los productos de ozonación identificados antes del proceso de biodegradación
Compuesto/ Tiempo de
Retención (min)
Concentración de los compuestos después de ozonar (mg/L)
Tiempo de ozonación (min)
4-CF 2,4-DCF
pH7 pH 12 pH 7 pH 12
10 15 30 5 5 8 5 4-Clorofenol 8.8 - - 18.4 - - -
2,4-Diclorofenol - - - - 17.8 - - Hidroquinona 6.4 7.9 2.6 - 2.2 2.8 2.3 Ácido Oxálico 9.7 15.1 26.8 30.0 6.3 9.4 47.6 Ácido Fórmico 153.8 137.1 42.6 39.0 36.3 50.5 54.0 Ácido Maleico - - - - 1.5 1.5 1.0
Tabla 3.9. Concentración relativa (normalizada) de los compuestos fenólicos no identificados, presentes en los clorofenoles ozonados
Compuesto/ Tiempo de Retención
(min)
Concentración relativa de los compuestos después de ozonar
Tiempo de ozonación (min)
4-CF 2,4-DCF
pH7 pH 12 pH 7 pH 12
10 15 30 5 5 8 5 AF / 2.0 1.00 0.64 0.31 1.00 0.90 1.00 1.00 BF / 2.3 0.81 0.52 0.32 1.00 1.00 0.81 1.00 CF / 2.5 0.99 - - - 0.68 0.88 - DF / 2.8 0.87 1.00 0.34 - 0.60 0.95 - EF / 3.0 1.00 0.90 0.25 - 0.72 0.94 - FF / 3.6 1.00 0.84 - - - - - GF / 7.3 0.13 - - - 0.61 0.18 - HF / 1.7 - - - 0.83 - - 1.00 IF / 4.3 - - - 1.00 0.73 -
KF / 15.8 - - - - 1.00 0.22 -
75
Tabla 3.10. Concentración relativa (normalizada) de los ácidos orgánicos no identificados, presentes en los clorofenoles ozonados
Compuesto/ Tiempo de Retención
(min)
Concentración relativa de los compuestos después de ozonar
Tiempo de ozonación (min)
4-CF 2,4-DCF
pH7 pH 12 pH 7 pH 12
10 15 30 5 5 8 5 AA /1.7 0.72 1.00 - - 1.00 0.00 - BA / 2.7 0.86 0.55 0.09 1.00 0.85 1.00 1.00 CA / 3.1 1.00 0.94 0.64 0.81 0.77 1.00 1.00 DA / 3.3 1.00 0.96 0.64 0.71 0.71 0.90 0.64 EA / 3.6 1.00 0.85 0.30 - 0.60 0.85 0.91 FA / 4.7 0.90 0.38 - 1.00 - - - JA / 8.2 0.70 - - - 0.90 1.00 - KA / 8.4 1.00 0.79 0.23 - - - - LA / 10.3 0.34 0.09 - - - - - MA / 14.6 - 0.40 - - 0.86 1.00 - HA / 5.5 - - - 1.00 - - - IA / 7.1 - - - 1.00 - - -
Las tablas 3.8 – 3.10 muestran las condiciones iniciales del bioproceso descrito
a continuación. En el proceso conjunto (ozonación-biodegradación) se desea
conocer el efecto de la presencia y abundancia de los diferentes compuestos
formados en el pretratamiento químico durante el bioproceso posterior, ya que
estos factores pueden controlarse de acuerdo a las condiciones de operación
del tratamiento químico. Los factores a estudiar fueron los siguientes:
1. Presencia de los contaminantes después de la ozonación. Se eligieron
condiciones de ozonación previa donde hubiera:
• Descomposición parcial del contaminante: 4CF (pH 7) 10 min, 4CF
(pH 12) 5 min, 2,4-DCF (pH 7) 5 min
• Descomposición total (mayor al 99%) del mismo: 4CF (pH 7) 15 min,
2,4-DCF (pH 7) 8 min, 2,4-DCF (pH 12) 5 min.
76
2. Abundancia máxima o mínima de los intermediarios no identificados.
• Se seleccionaron condiciones de ozonación donde la abundancia de
las especies no identificadas fuera máxima: 4CF (pH 7) 10 min, 4CF
(pH 12) 5, 2,4-DCF (pH 7) 5 min, 2,4-DCF (pH 7) 8 min, 2,4-DCF (pH
12) 5 min.
• Adicionalmente se estudió un caso donde además de descomponer
completamente al contaminante de interés, la ozonación se prolongó
para descomponer también a los intermediarios acumulados en el
proceso y llevarlos a un nivel mínimo de abundancia: 4CF (pH 7) 30
min.
3.3.2 Aclimatación de los microorganismos a clorofenoles ozonados
Una vez hecha la elección de los tiempos del pretratamiento químico, se
prosiguió a adaptar un consorcio para cada uno de las condiciones de
ozonación seleccionadas para el tratamiento combinado (tabla 3.7). Como se
puede observar en las tablas 3.8 – 3.10, en cada uno de los casos de estudio,
los compuestos presentes, así como su proporción es diferente, por lo que los
sustratos en cada proceso de biodegradación fueron diferentes, siendo
necesario contar con grupos de microorganismos aclimatados a las diferentes
fuentes de carbono específicas a degradar.
3.3.2.1 Preparación del inóculo. De acuerdo a los intermediarios identificados en la ozonación de los
clorofenoles (sección 3.1), antes de preparar los consorcios a utilizar en el
tratamiento combinado, se verificó que se dispusiera de consorcios microbianos
con la capacidad de degradar los compuestos que se sabía que estaban
77
presentes después de la ozonación de los mismos: 4-clorofenol, 2,4-
diclorofenol, fenol, catecol, hidroquinona, ácidos oxálico y fórmico. Los
consorcios en cuestión son: CAF, CAA, CA4CF, CA24DCF. Los primeros dos
son capaces de degradar compuestos fenólicos y ácidos orgánicos,
respectivamente, y los dos últimos a los contaminantes iniciales: 4-clorofenol y
2,4-diclorofenol, respectivamente, tal como se detalló en la tabla 3.6.
Para adaptar grupos de microorganismos a las fuentes de carbono ozonadas,
se prepararon cultivos mixtos a partir de los cuatro consorcios adaptados a las
fuentes de carbono no ozonadas, de tal forma que en cada consorcio se
contara con diversidad microbiana con la capacidad de metabolizar los
diferentes tipos de compuestos (aromáticos y alifáticos) que se encuentran
presentes después de la ozonación.
Se verificaron los compuestos que estaban presentes después de la ozonación
y se mezclaron proporciones iguales de los consorcios adaptados a fuentes de
carbono no ozonadas que tuvieran las capacidades de metabolizar a estos
compuestos. Para los casos del 4-clorofenol se mezclaron CAF, CAA, CA4CF y
para los del 2,4-diclorofenol se mezclaron CAF, CAA, CA4CF y CA24DCF,
como se muestra en tabla 3.11.
Durante el proceso de aclimatación, sólo se proporcionó el efluente de
ozonación en cuestión para inducir estrés en los microorganismos al tener
disponibles en el medio nuevos sustratos y que se generaran las enzimas
necesarias para la introducción de los mismos en su metabolismo, con la
intención de que las especies microbianas capaces de realizar sus funciones
metabólicas en el nuevo medio, proliferaran. En la tabla 3.12 se muestran los
consorcios que se aclimataron a las fuentes de carbono ozonadas.
78
Tabla 3.11. Fuentes de inóculo para la adaptación de los consorcios a los clorofenoles ozonados
Tabla 3.12. Consorcios adaptados a fuentes de carbono ozonadas
Fuente de carbono adaptada
Abreviatura Compuesto pH Ozonación
Tiempo de ozonación
(min)
4-Clorofenol 7
10 CA4_7_10
15 CA4_7_15
30 CA4_7_30
12 5 CA4_12_5
2,4-Diclorofenol 7
5 CA2_7_05
8 CA2_7_08
12 5 CA2_12_5
Como se describió en el capítulo 2, la aclimatación a las fuentes de carbono
ozonadas se hizo por el método fill-and-draw,(x) donde para cada consorcio se
prepararon soluciones con un contenido entre el 10% y el 100% del efluente de
ozonación (fuente de carbono) en cuestión. El suministro de sustrato se hizo en
orden creciente de concentración, haciendo el aumento de ésta en periodos de
tiempo comprendidos entre 1 y 3 días. Así, gradualmente (en intervalos de 10%
de sustrato inicial) fue aumentando la concentración en el medio de los
Compuesto preozonado
Consorcios mezclados para preparar el inóculo
4-CF CAF CAA
CA4CF
2,4-DCF
CAF CAA
CA4CF CA24DCF
79
compuestos a los cuáles se deseaba aclimatar a los microorganismos. A lo
largo de este proceso se verificó el crecimiento microbiano reflejado en la
densidad óptica (600nm), lo cual se muestra a continuación.
3.3.2.2 Aclimatación de los microorganismos al 4-Clorofenol preozonado.
En las figuras 3.22 - 3.25 se muestra el crecimiento microbiano de los
consorcios alcanzado por la adición del porcentaje de sustrato correspondiente,
durante el proceso de aclimatación al 4-Clorofenol ozonado bajo diferentes
condiciones.
Figura 3.22 Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_10.
80
Figura 3.23. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_15.
Figura 3.24. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_7_30.
81
Figura 3.25. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA4_12_5.
En las figuras 3.22 – 3.25 se puede observar que bajo las cuatro condiciones de
ozonación, cuando se suministra la fuente de carbono menos concentrada
(10%) no se alcanza un crecimiento significativo, lo cual es comprensible,
tomando en cuenta que los microorganismos se pusieron en contacto con
nuevos sustratos y deben generar las condiciones necesarias para incluirlos en
su metabolismo. Sin embargo, cuando la fuente de carbono contiene el 20% del
efluente, el crecimiento provocado por el sustrato es significativo en todos los
casos, el cual se sostiene conforme se añade más sustrato. Esto es un buen
indicio, ya que los microorganismos de cada nuevo consorcio son capaces de
incluir los productos de ozonación en su metabolismo y generar nuevas células
con la capacidad de sobrevivir en ese ambiente.
3.3.2.3 Aclimatación de los microorganismos al 2,4-Diclorofenol pre-ozonado.
De manera similar a los casos anteriores, en las figuras 3.26 - 3.28 se muestra
el crecimiento microbiano de los consorcios alcanzado por la adición del
82
porcentaje de sustrato correspondiente, durante el proceso de aclimatación al
2,4-Diclorofenol ozonado bajo diferentes condiciones.
Figura 3.26. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_7_05.
Figura 3.27 Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_7_08.
83
Figura 3.28. Aumento en la DO (600) a lo largo de la adaptación del CA2_12_5.
Los resultados observados en las figuras 3.26 – 3.28 mantienen una tendencia
similar a la observada en los casos referentes al 4-Clorofenol. La primera
adición de sustrato no produce un efecto significativo en el crecimiento de los
consorcios, ya que los consorcios se ponen en contacto con nuevas fuentes de
carbono, sin embargo, conforme se añade sustrato más concentrado, se
incrementa el crecimiento de los microorganismos. Para el caso de las
aclimataciones a los productos de ozonación bajo pH 7, se puede observar un
mayor crecimiento con los primeros porcentajes de sustrato que para el caso de
pH 12. Sin embargo, en los 3 casos se puede observar que los porcentajes más
altos de sustrato propician un crecimiento significativo de los microorganismos,
lo cual, de manera similar al 4-Clorofenol, indica que los microorganismos son
capaces de sobrevivir y generar nuevas células en el medio deseado.
En los 7 casos estudiados (4-Clorofenol y 2,4-Diclorofenol preozonados), se
pudo observar una tendencia de crecimiento microbiano en el proceso de
aclimatación a los compuestos deseados, sobre todo en los últimos días,
84
cuando los consorcios han estado en contacto por más tiempo con los nuevos
sustratos y por ende se observa que conforme aumentan paralelamente el
porcentaje de sustrato proporcionado y los días de adaptación, el crecimiento
hace lo propio de manera considerable. Este aumento en el crecimiento es
reflejo de que los microorganismos se han ido adaptando a la fuente de carbono
proporcionada en cada caso.
Cabe resaltar que después de este periodo de aclimatación, siguió un periodo
de 6 meses de mantenimiento de los consorcios donde sólo se proporcionaron
como sustratos las fuentes de carbono a las que éstos estaban aclimatados.
Para evitar el desgaste y eventual desactivación de las cepas, cada dos
semanas se hizo el resembrado de cada uno de los consorcios, para
asegurarse de que los microorganismos mantuvieran las capacidades
metabólicas desarrolladas. Después de esta etapa, al contar con consorcios
aclimatados a las fuentes de carbono específicas a tratar (productos de
ozonación), los consorcios se utilizaron en los procesos de biodegradación
descritos a continuación.
3.4 Biodegradación de los clorofenoles pre-ozonados. Una vez concluida la etapa de aclimatación de los consorcios, se procedió a
realizar los respectivos procesos de biodegradación para cada caso elegido,
usando el consorcio correspondiente en cada prueba (Tabla 3.12).
Se monitorearon las dinámicas de los compuestos formados en la ozonación
(Tablas 3.8 -3.10) durante cada bioproceso correspondiente. Cabe resaltar que
la señal analítica (arrojada por el HPLC) de algunos compuestos después de la
ozonación era pequeña, por lo que, debido a interferencias analíticas, no fue
posible darles seguimiento durante el bioproceso.
85
En las siguientes secciones se presentan las dinámicas (construidas a partir de
las alturas leídas en los cromatogramas, normalizadas con respecto a la señal
máxima) de los compuestos (identificados y no identificados) observados
durante el bioproceso seguido de la ozonación. Por otro lado, se presenta el
perfil de crecimiento microbiano para cada consorcio expresado como el
aumento normalizado de la densidad óptica (leída a 600nm).
Como una medida global de la descomposición de los productos de ozonación
a lo largo de los biotratamientos se cuantificó el área total de los
cromatogramas obtenidos en el HPLC (para las dos condiciones de análisis:
compuestos fenólicos y ácidos orgánicos) a lo largo de todo el proceso. Se
muestra la variación normalizada del área total obtenida en los cromatogramas
con respecto al tiempo de biodegradación. Por otro lado, de manera cualitativa
se muestra la variación en los espectros UV de las pruebas en cuestión,
después de ozonar y después del tratamiento combinado.
3.4.1 Biodegradación del 4-clorofenol previamente ozonado bajo pH 7. Descomposición parcial del contaminante – 10 min de ozonación.
De acuerdo a la tabla 3.8, para el 4-clorofenol ozonado 10 minutos bajo pH 7, la
descomposición del contaminante es parcial, después de la ozonación aun se
deben eliminar 8.8 mg/L de este compuesto durante el bioproceso. En las
figuras 3.29 y 3.30 se muestran las dinámicas a lo largo de la biodegradación
de los compuestos fenólicos, así como las de los respectivos ácidos orgánicos
formados en la ozonación bajo las condiciones previamente descritas.
86
Figura 3.29 Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la
ozonación del 4-CF (pH 7, 10 min).
Figura 3.30. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación
del 4-CF (pH 7, 10 min).
A partir de la figura 3.29 se puede observar que el 4-clorofenol residual de la
ozonación es asimilado por los microorganismos durante el primer día del
bioproceso. Situación que se ve acompañada por la producción de un
metabolito que se asimila en el día 2 (MFA), el cual tiene un tiempo de retención
cercano al 4-clorofenol, por lo que puede asumirse que su estructura es similar
87
a la del 4-clorofenol. Por otro lado, los intermediarios fenólicos acumulados
durante la ozonación tienen una tendencia a descomponerse a lo largo del
bioproceso. Se puede observar que a pesar de que todos los intermediaros
comienzan a ser asimilados desde el primer día, existe una preferencia por el
consumo de algunos compuestos como: hidroquinona, DF, EF, los cuales son
consumidos mayoritariamente durante los primeros dos días. Cuando la
abundancia de éstos en el medio disminuye considerablemente, o bien es
consumido por completo (como la hidroquinona), el consumo del compuesto GF
se acelera hasta el día 4, entre el día 4 y 5 no se presenta mayor actividad, sin
embargo, entre el día 5 y 7 se consumen completamente los compuestos DF,
EF y FF. Cabe resaltar que el consumo del compuesto FF comienza el día 5
que es el día en el que se deja de consumir el compuesto AF.
Con respecto a los ácidos orgánicos, debe resaltarse el comportamiento de los
ácidos oxálico y fórmico, recordando las condiciones iniciales (tabla 3.8), la
concentración del ácido fórmico es mucho mayor que la del oxálico y durante el
bioproceso se observa una preferencia de los microorganismos por consumir el
ácido fórmico con respecto al oxálico. Adicionalmente, estos ácidos son
excretados como metabolitos de la degradación de otros compuestos presentes
en el medio en los días finales del biotratamiento, o bien, podría ser como
producto de la lisis celular de algunas células.
Por otro lado, observando el comportamiento de los otros sustratos (ácidos
orgánicos), también se aprecian consumos en serie de las diferentes fuentes de
carbono presentes en el medio. En los primeros días se consumen los
compuestos que son preferidos por los microorganismos y conforme la
concentración de éstos disminuye, se acelera el consumo de los otros
compuestos presentes en el medio.
El efecto presentado de los consumos en serie de los diferentes sustratos es
atribuido a la aclimatación previa de los consorcios a todos los sustratos
disponibles. Ya que previamente se indujeron las condiciones de estrés
88
necesarias para hacer proliferar especies microbianas capaces de realizar sus
funciones metabólicas en el medio proporcionado. En el medio están presentes
microorganismos con la capacidad de degradar a todos los compuestos
existentes medio, por supuesto, que entre ellos hay algunos que son preferidos
por su riqueza energética y facilidad de degradación, pero cuando esas fuentes
de carbono llegan a concentraciones bajas, los microorganismos son capaces
de metabolizar a los otros compuestos.
Lo anterior se confirma con la figura 3.31, donde se presenta de manera
normalizada el incremento en la densidad óptica del medio que representa el
crecimiento microbiano. Así como el consumo se sustratos se hace en manera
escalonada, el crecimiento de los microorganismos hace lo propio. Se observan
diferentes etapas; entre el día 0 y 4, que es cuando se consumen
mayoritariamente los ácidos orgánicos y es la primera sección de consumo
importante de los compuestos fenólicos. Por otro lado, entre el día 4 y 5, casi no
hay consumo de compuestos fenólicos, pero sí de ácidos orgánicos que son los
que dan lugar a esta segunda etapa del crecimiento, lo cual continúa entre los
días 5 y 7, donde se consumen ambos tipos de compuestos.
Figura 3.31. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la
biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 10 min).
89
Como medida global de la eficiencia del bioproceso, se presenta en la figura
3.31 la disminución normalizada de las áreas totales observadas en los
cromatogramas de los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos,
respectivamente. Se puede observar que, aunque ambas tendencias son
similares al principio, después del día 2 se presenta una marcada preferencia
hacia el consumo de los ácidos orgánicos (90% de eliminación) sobre los
compuestos fenólicos (70% de eliminación). Finalmente, se presenta de manera
cualitativa el efecto global de la biodegradación en la eliminación de los
compuestos formados durante la ozonación bajo las condiciones previamente
especificadas (figura 3.32).
Figura 3.32. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-
CF ozonado 10 min (pH 7). En la figura 3.32 se muestran los espectros UV del 4-clorofenol después de
ozonar (0hb) (10 min, pH 7), así como el espectro obtenido después de 5 días
de bioproceso (5db). Cualitativamente se puede observar una disminución
significativa en la absorbancia, sobre todo en las regiones bajas de éste (200 –
220nm) que es donde mayoritariamente absorben los ácidos orgánicos.
Adicionalmente, se muestra como referencia el espectro UV del medio de
cultivo (Mmin); a pesar de tener una disminución importante de los diferentes
90
productos de ozonación, aún quedan presentes en el medio algunas especies
que producen mayor absorbancia que el medio de cultivo.
El análisis detallado que se presentó para el tratamiento combinado del 4-
clofofenol ozonado 10 minutos bajo pH 7 se realizó también para los otros
casos de estudio realizados, y se obtuvieron tendencias muy similares en la
biodegradación de los productos de ozonación, por lo que en esta sección se
omitirán las gráficas correspondientes a las dinámicas de la biodegradación de
los compuestos fenólicos, así como las de los respectivos ácidos orgánicos
formados en la ozonación, sin embargo, éstas pueden ser consultadas en el
Anexo D.
Descomposición total de contaminante - 15 minutos de ozonación Bajo estas condiciones de ozonación se obtiene una eliminación mayor al 99%
de este compuesto, por lo que en la biodegradación no se observa la aparición
de metabolitos relacionados con su consumo. En la figura 3.33 se presenta la
biodegradación global de los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos
(expresada en función del área normalizada de los cromatogramas), así como
el crecimiento microbiano a lo largo del proceso.
Figura 3.33. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la
biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 15 min).
91
Con respecto al crecimiento microbiano (Figura 3.33) se puede observar que
similarmente al consumo de sustratos, éste se da por etapas; comienza entre
los días uno y dos por efecto del consumo de los compuestos de fácil
degradación, mantiene una tendencia lenta entre los días dos y cuatro, y de ahí
al día 7 se acelera el crecimiento por efecto los sustratos mencionados con
anterioridad. También se puede observar, que durante los primeros dos días, el
consumo de compuestos fenólicos y ácidos orgánicos tiene una tendencia
similar, sin embargo, a partir del día dos se observa una preferencia por el
consumo de los ácidos orgánicos (81% de eliminación) sobre los compuestos
fenólicos (71% de eliminación).
En la figura 3.34 se muestra de manera cualitativa el efecto de la
biodegradación durante cinco días (5db) en el 4-clorofenol pre-ozonado 15
minutos (pH7) (0hb), el cual, también, es significativo, especialmente en la
región baja del espectro (200 – 220nm), sin embargo la absorbancia después
del bioproceso aun está alejada del espectro UV del medio de cultivo (Mmin),
que es la referencia sin contaminantes.
Figura 3.34 Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-
CF ozonado 15 min (pH 7).
92
Descomposición total de contaminante - 30 minutos de ozonación En la figuras 3.35 se muestran las dinámicas de biodegradación globales
(expresadas por el área normalizada de los cromatogramas) de los compuestos
fenólicos y ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-clorofenol bajo pH
7 durante 30 minutos. Cabe resaltar que la dinámica de los ácidos oxálico y
fórmico muestra un comportamiento opuesto al presentado en el primer caso
(10 min, pH 7). Se observa un consumo preferente del ácido oxálico sobre el
fórmico ya que a diferencia del primer caso, en este, las concentraciones del
ambos ácidos al inicio del bioproceso son similares (Anexo D).
Figura 3.35. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la
biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 7, 30 min).
En la figura 3.45 se pueden observar 3 etapas claramente identificables del
crecimiento microbiano. La primera comprende al día uno, donde casi no hay
crecimiento, la segunda comprendida entre los días uno y cuatro y la tercera
comprendida entre los días cuatro y siete. Estas tres etapas corresponden a los
consumos en serie de los sustratos presentes en el medio.
Observando la disminución de las áreas cromatográficas para cada tipo de
compuesto, se puede ver que el primer día se presenta la mayor disminución
93
para ambos tipos, y sus dinámicas son muy similares. Después de ese día,
como en todos los casos, se observa una preferencia de los ácidos orgánicos
(85% de eliminación) sobre los compuestos fenólicos (78% de eliminación).
Figura 3.36. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-
CF ozonado 30 min (pH 7).
En la figura 3.36 se puede observar el espectro después de 5 días de
biodegradación del 4-clorofenol ozonado 30 minutos bajo pH 7 (5db). La
diferencia con respecto al inicio del proceso (0db) es muy marcada, y al
comparar el primero con el espectro del medio de cultivo (Mmin), se puede
apreciar claramente la gran similitud entre ambos, por lo que, bajo estas
condiciones de preozonación, cuando se ha logrado una gran descomposición
de los intermediarios fenólicos no identificados por efecto del ozono, se logra
una apreciable disminución del espectro UV en el tratamiento combinado, lo
cual significa que hay menor cantidad de compuestos que producen
absorbancia.
94
3.4.2 Biodegradación del 4-clorofenol previamente ozonado bajo pH 12. Descomposición parcial del contaminante – 5 min de ozonación.
De acuerdo a la tabla 3.12, este es el único caso estudiado para el 4-clorofenol
ozonado bajo pH 12 y la descomposición del contaminante es del 85%. En el
primer día de biodegradación se asimila el 4-clorofenol residual de la ozonación
y se excreta el metabolito MFA que es asimilado en el día siguiente.
En la figura 3.37 se presenta de manera similar a las secciones anteriores el
consumo de los compuestos fenólicos y ácidos orgánicos durante el bioproceso,
así como el crecimiento microbiano. En dicha figura se puede observar la
dinámica global del proceso, durante el primer día se logra la mayor reducción
en el área cromatográfica, y se acentúa el consumo de ácidos orgánicos
(eliminación del 86%) por encima de los compuestos fenólicos (eliminación del
70%) así mismo, el crecimiento microbiano corresponde con el consumo de
sustratos en el medio.
Figura 3.37. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la
biodegradación del 4-CF pre-ozonado (pH 12, 5 min).
95
Por otro lado, en la figura 3.38 se puede apreciar de manera cualitativa la
disminución en el espectro UV por efecto de 5 días de biodegradación (5db). A
pesar de que no se alcanzan los niveles del reducción de espectro, aún existe
una amplia diferencia entre los espectros del medio de cultivo y el espectro
después de la biodegradación.
Figura 3.38. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 4-
CF ozonado 5 min (pH 12).
Conclusiones previas del tratamiento combinado (ozonación-
biodegradación del 4-clorofenol)
De acuerdo a lo presentado en esta sección, se observan varios aspectos a
destacar, como es el consumo en serie de los diferentes sustratos presentes en
el medio, lo cual es atribuido al efecto de la aclimatación previa de los
microorganismos a todos los compuestos del medio. Se observa una
preferencia por el consumo de algunas especies al principio del bioproceso,
pero cuando la concentración de éstas disminuye considerablemente, los
microorganismos del consorcio son capaces de utilizar los otros sustratos para
continuar la actividad metabólica que finalmente se ve reflejada en el
96
crecimiento microbiano el cual no detiene hasta el final del proceso. Este
crecimiento, al igual que el consumo de sustratos, se presenta por etapas.
Por otro lado, los ácidos oxálico y fórmico presentan un comportamiento
singular. En el primer caso de estudio (10 minutos, pH 7) el ácido fórmico está
en un gran exceso con respecto al oxálico y el consumo del primero es
preferido con respecto al segundo; conforme aumenta la concentración de ácido
oxálico y disminuye la de ácido fórmico (después de la ozonación) este papel se
invierte.
En general se obtienen altas tasas de disminución del área de los
cromatogramas de compuestos fenólicos y ácidos orgánicos, siendo más
abundante el consumo de los últimos por ser especies de más fácil asimilación
para los microorganismos. Se logran obtener entre un 80 y un 90% de
eliminación en las áreas cromatográficas de los ácidos orgánicos, después de
una semana de biotratamiento. Cabe resaltar que en los primeros días es
cuando se lleva a cabo la mayor eliminación de éstas. Así mismo, las especies
que perduran después del bioproceso, en todos los casos son AF, DF, DA y los
ácidos oxálico y fórmico que se excretan como metabolitos de la degradación
de otros sustratos, o bien producto de lisis de algunas células.
3.4.3 Biodegradación del 2,4-diclorofenol previamente ozonado bajo pH 7 Descomposición parcial del contaminante – 5 min de ozonación.
De acuerdo a la tabla 3.8, para el 2,4-diclorofenol pre-ozonado bajo pH 7, se
cuenta con un caso donde la descomposición del contaminante es parcial (5
min) y otro donde la descomposición del mismo es total, es decir, >99% (8 min).
A continuación se describe el primero.
97
En la figura 3.39 se puede observar el crecimiento microbiano acorde al
consumo de sustratos presentado, con respecto a la disminución de los
compuestos fenólicos y los ácidos orgánicos se observa una marcada
preferencia por el consumo de los ácidos orgánicos (74% de eliminación) con
respecto a los compuestos fenólicos (47% de eliminación). Bajo estas
condiciones, se logra la menor remoción de compuestos fenólicos, ya que éstos
se encuentran en su nivel máximo de concentración después de la ozonación.
Figura 3.39. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la
biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 7, 5 min)
98
Figura 3.40. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-
DCF ozonado 5 min (pH 7). En la figura 3.40 se muestra la comparación de los espectros UV del 2,4-
diclorofenol después de ozonar (0db) y después de 5 días de bioproceso (5db),
con la respectiva referencia del medio de cultivo (Mmin), en este caso no se
observa una disminución tan significativa del espectro ya que éste aún dista del
espectro del medio de cultivo.
Descomposición total de contaminante - 8 minutos de ozonación.
Cuando el 2,4-diclorofenol es ozonado bajo pH 7 durante 8 minutos, se logra
una remoción mayor al 99% de este compuesto. En la figura 3.41 se presenta el
consumo global de los compuestos fenólicos y los ácidos orgánicos en el
biotratamiento, así como el crecimiento microbiano.
99
Figura 3.41. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la
biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 7, 8 min).
La primera etapa, comprendida entre los días 1 y 4 corresponde al consumo
preferente de los ácidos los primeros días y la segunda etapa comprendida
entre los días 4 y 7 es propiciada por el metabolismo de los compuestos
fenólicos, así como algunos otros ácidos presentes en el medio. Así mismo, se
presenta la disminución de las áreas cromatográficas inherentes a los
compuestos involucrados. Los ácidos orgánicos son asimilados
preferentemente, haciendo una marcada diferencia desde el inicio del proceso,
en este caso se alcanza un 78% de eliminación de estos compuestos, mientras
que para los fenólicos se alcanza una disminución del 64%. Este caso es mejor
que el anterior, donde sólo se alcanza un 47% de eliminación de estos
compuestos.
En la figura 3.42 se muestra la comparación cualitativa de los espectros UV
antes (0db) y después de 5 días de bioproceso (5db), a pesar de observarse
una significativa reducción del espectro, este último dista bastante del espectro
del medio de cultivo (Mmin).
100
Figura 3.42. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-
DCF ozonado 8 min (pH 7).
3.4.4 Biodegradación del 2,4-diclorofenol previamente ozonado bajo pH 12. Descomposición total del contaminante – 5 min de ozonación.
De acuerdo a la tabla 3.8, este es el único caso estudiado para el 2,4-
diclorofenol ozonado bajo pH 12 y la descomposición del contaminante es
>99%.
En la figura 3.43 se puede observar l tendencia de las áreas cromatográficas, la
cual tiene un comportamiento parecido al observado en el 4 –clorofenol, al
principio las tendencias de los ácidos orgánicos y los compuestos fenólicos son
muy simlares, pero después del día dos, se hace notoria la preferencia por el
consumo de los ácidos orgánicos (80% de eliminación) sobre los compuestos
fenólicos (69% de eliminación) en el bioproceso. El perfil de crecimiento es
acorde al perfil de los sustratos; en los primeros dos días hay una etapa donde
se consumen mayoritariamente los ácidos; entre dos y tres días se consume el
compuesto EA, mientras que en los últimos dos días se presenta el
metabolismo de los compuestos residuales, que a su vez producen ácido
101
fórmico, el cual en esa etapa es excretado significativamente al medio (Anexo
D).
Finalmente, de manera cualitativa se presentan en la figura 3.62 los espectros
UV del 2,4-diclorofenol ozonado 5 minutos bajo pH 12, antes (0hb) y después
de 5 días de biotratamiento (5db). L disminución del espectro es significativa y
está más cerca del espectro del medio de cultivo (Mmin) que los dos casos
anteriores estudiados del 2,4-diclorofenol.
Figura 3.43. Consumo de sustratos y crecimiento microbiano en la
biodegradación del 2,4-DCF pre-ozonado (pH 12, 5 min).
102
Figura 3.44. Variación del espectro UV por efecto de la biodegradación del 2,4-
DCF ozonado 5 min (pH 12).
Comparación de las diferentes condiciones de ozonación en el proceso
combinado
En todas las condiciones estudiadas se puede apreciar una disminución de la
absorbancia por efecto del bioproceso seguido de la biodegradación, aunque
algunas son más significativas que otras. Por otro lado, en todos los casos se
presentan significativas disminuciones en las áreas cromatográficas tanto de los
compuestos fenólicos, como de los ácidos orgánicos; siendo estos últimos los
consumidos más significativamente.
Por otro lado, los consumos en serie de los diferentes sustratos, así como del
crecimiento microbiano son un indicio del efecto y por ende, la gran importancia
de la etapa de aclimatación para el proceso de biodegradación, lo cual fue una
observación general, independientemente del compuesto o las condiciones de
ozonación (pH y tiempo de reacción).
103
Así mismo, se verificó que los ácidos orgánicos son compuestos de más fácil
degradación, comparados con los compuestos fenólicos, ya que los primeros se
eliminan en mayor proporción que los segundos a lo largo del bioproceso. En
todos los casos se observó que los ácidos oxálico y fórmico fungieron no sólo
como fuente de carbono, sino que en diferentes etapas del bioproceso fueron
producidos como metabolitos de la degradación de otros compuestos sustratos,
o bien, por lisis celular.
En la figura 3.45 se muestra la gráfica comparativa de las áreas
cromatográficas obtenidas al inicio y al final del bioproceso, se muestran en
unidades de área (mV-s). Se puede observar que las áreas al final del
bioproceso son más pequeñas, conforme mayor sea el tiempo de ozonación.
Así mismo, son preferibles los tiempos de ozonación donde se tenga una mayor
descomposición de los intermediarios, especialmente los fenólicos, que son los
que tienden a perdurar a lo largo del proceso. Por otro lado, la descomposición
total del contaminante representa ventajas, ya que se obtiene menor área
cromatográfica al final del bioproceso que cuando no se remueve
completamente el compuesto inicial, por la inminente reducción de
intermediarios que implica descomponer el compuesto totalmente.
Figura 3.45. Áreas cromatográficas obtenidas al final del bioproceso.
104
El mejor resultado (menor área cromatográfica al final del tratamiento
combinado) se obtuvo con el 4-clorofenol ozonado 30 minutos bajo pH 7, ya
que en este tiempo se ha descompuesto el compuesto inicial y la mayoría de
los intermediarios (fenólicos y ácidos orgánicos) han llegado a sus niveles
mínimos de concentración durante la ozonación. Entonces a lo largo del
bioproceso están presentes especies de más fácil degradación (como los
ácidos orgánicos).
Las condiciones de preozonación donde se contaba con la mayor concentración
de compuestos fenólicos no identificados fueron los que arrojaron al final del
tratamiento combinado áreas más grandes: 4_7_10, 4_12_5, 2_7_05. Cabe
resaltar que estos tres casos corresponden a descomposiciones parciales del
contaminante, por lo que estos casos no son deseables. En los casos donde se
presentó la máxima acumulación sólo de los ácidos orgánicos no identificados
(2_7_08 y 2_12_05) se obtuvieron resultados intermedios que seguramente
podrían mejorarse aumentando el tiempo de ozonación (y descomponiendo, por
ende, estos ácidos), como es el caso del 4_7_30.
Así mismo, los ácidos oxálico y fórmico mostraron buenas tendencias de
descomposición desde el principio del proceso, por lo que en el pretratamiento
químico es deseable buscar la acumulación de éstos (sobre todo el ácido
oxálico que es el compuesto que tiende a acumularse en el proceso de
ozonación), y la descomposición de los compuestos fenólicos, se pueden
mejorar los resultados del tratamiento combinado.
105
CONCLUSIONES
Tomando en cuenta los resultados obtenidos en este trabajo se obtuvieron las
siguientes conclusiones:
1.- La biodegradación de clorofenoles no resultó un tratamiento efectivo:
después de 10 días de tratamiento no se observó una descomposición
significativa del 4-clorofenol y sólo se logró eliminar 60% del 2,4-diclorofenol.
Debido a la toxicidad mayor que presentó el primero con respecto al segundo
compuesto para los microorganismos utilizados.
2.- El tiempo de descomposición completa (>99%) de los clorofenoles en la
ozonación depende fuertemente del pH de la solución. Bajo pH básico la
descomposición es más rápida (por la generación de radicales hidroxilo) que
bajo pH neutro. Los tiempos de descomposición para el 4-clorofenol son 15 y 8
minutos bajo pH 12 y 7, respectivamente, y para el 2,4-diclorofenol son 8 y 5
minutos.
3.- Los productos principales de ozonación son los ácidos oxálico y fórmico, los
cuales tienen tendencia de acumulación desde el principio del proceso. Sin
embargo, el acido fórmico cambia su tendencia en tiempos cercanos a la
descomposición completa del clorofenol y se descompone completamente, lo
cual se puede interpretar como mineralización parcial.
4.- Durante la ozonación los compuestos no identificados tienden a acumularse
también desde el principio del proceso, alcanzan un máximo de su
concentración alrededor del tiempo de descomposición del contaminante inicial,
y después éstos tienden a descomponerse.
106
5.- En los tratamientos combinados, la tendencia de descomposición de los
ácidos orgánicos fue mejor que la de los compuestos fenólicos.
6.- Los compuestos fenólicos no identificados disminuyen la eficiencia de la
biodegradación cuando su concentración es la máxima (4-CF, pH 7, 10 min; 24-
DCF, pH 7, 5 min). Por el contrario, si la ozonación se suspende cuando estos
compuestos se descomponen (4-CF, pH 7, 30 min), la eficiencia de
biodegradación se ve favorecida. Éste último fue el mejor resultado en el
tratamiento combinado.
7.- Los ácidos oxálico y fórmico presentaron una buena dinámica de
descomposición a lo largo del bioproceso, por lo que, para favorecer el
tratamiento conjunto se deben seleccionar las condiciones de ozonación, las
cuales favorezcan la producción de estos ácidos.
8.- El consorcio se aclimató con diferentes sustratos y fue capaz de degradar
los diferentes compuestos formados durante la ozonación.
9.- Para mejorar los resultados del tratamiento combinado en el caso de
clorofenoles es importante cumplir con el siguiente criterio:
- Descomposición total del compuesto inicial y aproximadamente el 60%
de los compuestos fenólicos, los cuales resultaron tóxicos para el
consorcio microbiano. Cumpliendo esta condición, automáticamente se
favorece la formación del ácido oxálico.
107
RECOMENDACIONES
En función de lo expuesto anteriormente se recomienda:
1.- Probar la metodología desarrollada para el tratamiento de mezclas más
complicadas de clorofenoles, aplicando el criterio propuesto para mejorar el
tratamiento combinado.
2.- Probar diferentes tiempos de ozonación bajo pH 12, donde la concentración
relativa de los compuestos fenólicos disminuya y por consiguiente, aumente la
cantidad de ácido oxálico, el cual demostró una buena tendencia de
descomposición en el bioproceso.
3.- Hacer una caracterización de las especies microbianas que proliferan en
cada uno de los consorcios aclimatados a las diferentes fuentes de carbono
ozonadas.
4.- Continuar con el proceso de aclimatación (aproximadamente un año) del
consorcio obtenido con la mezcla de productos de ozonación como fuentes de
carbón y verificar si las velocidades de consumo de los diferentes sustratos
presentes en el medio, se modifican. Con el fin de reducir los tiempos de
biotratamiento.
108
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114
ANEXOS
ANEXO A. CURVAS DE CALIBRACIÓN DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS Se realizó la calibración del espectrofotómetro UV-Vis de Perkin Elmer Lamba
2s los 2 clorofenoles estudiados, a sus longitudes de onda características. En
las figuras A.1 Y A2 se muestran las curvas de calibración de estos
compuestos.
LEY DE BEER PARA 4-CLOROFENOL
Figura A0.1. Curva de calibración para el 4-Clorofenol (279.9 nm).
115
LEY DE BEER PARA 2,4-DiCLOROFENOL
Figura A0.2. Curva de calibración para el 2,4-Diclorofenol (284.4 nm)
116
ANEXO B CURVAS DE CALIBRACIÓN DEL HPLC
Se realizó la calibración de los compuestos por HPLC, tomando en
cuenta las alturas de los picos de los cromatogramas
correspondientes a los compuestos en cuestión. A continuación se
muestran las curvas de calibración de cada compuesto:
Figura B0.3. Curva de calibración (HPLC) para 4-clorofenol.
117
Figura B0.4. Curva de calibración (HPLC) para 2,4-diclorofenol.
Figura B0.5. Curva de calibración (HPLC) para el fenol.
118
Figura B0.6. Curva de calibración (HPLC) para el catecol.
Figura B0.7. Curva de calibración (HPLC) para la hidroquinona.
119
Figura B0.8. Curva de calibración para el ácido oxálico.
Figura B0.9. Curva de calibración para el ácido fórmico.
120
Figura B0.10. Curva de calibración para el ácido fumárico.
Figura B0.11. Curvas de calibración para el ácido maleico.
121
ANEXO C. DISTRIBUCIÓN DE PRODUCTOS DE LA OZONACIÓN DE CLOROFENOLES NO IDENTIFICADOS.
A continuación se presentan las dinámicas de acumulación y/o
descomposición de los compuestos que se observaron por HPLC,
pero que no fue posible identificar.
Figura C0.1. Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo
del proceso de ozonación del 4-CF (pH 12).
122
Figura C0.2. Distribución de compuestos ácidos orgánicos no identificados a lo
largo del proceso de ozonación del 4-CF (pH 12).
Figura C0.3. Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo
del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 7).
123
Figura C0.4. Distribución de ácidos orgánicos no identificados a lo largo del
proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 7).
Figura C0.5. Distribución de compuestos fenólicos no identificados a lo largo
del proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12).
124
Figura C0.6. Distribución de ácidos orgánicos no identificados a lo largo del
proceso de ozonación del 2,4-DCF (pH 12).
125
ANEXO D. DINÁMICAS DE LA BIODEGRADACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Y ÁCIDOS ORGÁNICOS FORMADOS EN LA OZONACIÓN DE LOS CLOROFENOLES.
Figura D0.1. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 15 min).
Figura D0.2. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 15 min).
126
Figura D0.3. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 30 min).
Figura D0.4. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 7, 30 min).
127
Figura D0.5. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 12, 5 min).
Figura D0.6. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 4-CF (pH 12, 5 min).
128
Figura D0.7. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 5 min).
Figura D0.8. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 5 min).
129
Figura D0.9. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 8 min).
Figura D0.10. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 7, 8 min).
130
Figura D0.11. Biodegradación de los compuestos fenólicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 12, 5 min).
Figura D0.12. Biodegradación de los ácidos orgánicos formados en la ozonación del 2,4-DCF (pH 12, 5 min).