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UNIVERSIDAD DE GRANADA

Programa de Bioquímica y Biología Molecular

TESIS DOCTORAL

NUEVOS AVANCES EN LA REPRODUCCIÓN

ASISTIDA, MEJORA DE LA CALIDAD

OVOCITARIA Y DE LA RECEPTIVIDAD

UTERINA.

RAQUEL MENDOZA TESARIK

Editor: Universidad de Granada. Tesis Doctorales

Autor: Raquel Mendoza Tesarik

ISBN: 978-84-1306-253-2 URI: http://hdl.handle.net/10481/56473

Le dedico esta tesis a mis padres, mi marido,

mis hijos y a todas esas mujeres que ponen en

nuestras manos su mayor sueño.

ÍNDICE

AGRADECIMIENTOS

INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………………………… 1

1. CICLO OVÁRICO ……………………………………………………………………… 4

1.1. Etapa gonadal indiferenciada ……………………………………………………….. 7

1.2. Etapa de diferenciación ……………………………………………………………... 7

1.3. Etapa de multiplicación de ovogonias y formación del ovocito ……………………. 7

1.4. Etapa de formación del folículo …………………………………………………….. 8

2. FASES DEL CICLO OVÁRICO ………………………………………………………. 9

2.1. Fase folicular ………………………………………………………………………... 10

2.1.1. Folículo primordial ………………………………………………………… 10

2.1.2. Folículo preantral …………………………………………………………... 10

2.1.3. Folículo antral ……………………………………………………………… 13

2.1.4. Folículo preovulatorio ……………………………………………………… 13

2.2. Sistema cíclico de la fase folicular …………………………………………………. 15

2.2.1. Reclutamiento ……………………………………………………………… 15

2.2.2. Selección …………………………………………………………………… 15

2.2.3. Dominancia ………………………………………………………………… 16

2.3. Fase ovulatoria ……………………………………………………………………… 16

2.4. Fase lútea …………………………………………………………………….……... 17

3. ESTIMULACIÓN OVÁRICA ………………………………………………………….. 21

3.1. Selección de las pautas de tratamiento ……………………………………………… 23

4. GONADOTROPINAS ……………………………………………………...…………… 25

4.1. Papel de la FSH ……………………………………………………………………... 25

4.2. Papel de la LH ………………………………………………………………………. 26

4.3. Factores que influyen en la estimulación óptima …………………………………… 26

4.3.1. Aumento y extensión del crecimiento interciclo de la FSH en la fase inicial

de la estimulación y bloqueo hipofisario en la fase final de la estimulación ……... 26

4.3.2. Superación del valor “umbral” y del periodo “ventana” de la FSH ………... 28

4.3.3. Mantenimiento de los niveles plasmáticos adecuados de LH ……………… 29

5. HORMONA DEL CRECIMIENTO………………………………………………... 30

6. MODELO DE PROTOCOLO DE ESTIMULACIÓN OVÁRICA …………………... 31

7. PUNCION FOLICULAR Y RECOGIDA OVOCITARIA …………………………… 33

7.1. Calidad del citoplasma ……………………………………………………………… 34

7.2. Calidad del extracitoplasma ………………………………………………………… 34

7.3. Calidad del complejo Cúmulus-corona radiata-ovocito ……………………………. 35

8. REPRODUCCIÓN ASISTIDA …………………………………………………………. 36

9. CALIDAD EMBRIONARIA ……………………………………………………………. 37

9.1. Día 1 ………………………………………………………………………………… 37

9.2. Día 2 y día 3 ………………………………………………………………………… 39

9.3. Día 4, día 5 y día 6 ………………………………………………………………….. 43

10. TRANSFERENCIA EMBRIONARIA ………………………………………………... 46

11. SOPORTE DE LA FASE LÚTEA …………………………………………………….. 47

12. OBJETIVOS ……………………………………………………………………………. 48

MATERIAL Y MÉTODOS ……………………………………………………………………. 49

1. PARTICIPANTES EN LOS ESTUDIOS ………………………………………………. 50

1.1. Estudio sobre el efecto de la hormona de crecimiento (GH) sobre la calidad

ovocitaria y embrionaria ………………………………………………………………… 50

1.2. Estudio del efecto de la hormona de crecimiento (GH) sobre la receptividad uterina 52

1.3. Estudio sobre el efecto del agonista de la GnRH sobre la receptividad uterina .…… 54

2. PROTOCOLOS DE ESTIMULACIÓN OVÁRICA ………………………………….. 57

2.1. Protocolo largo con agonista de la GnRH …………………………………………... 57

2.2. Protocolo con antagonista de la GnRH ……………………………………………... 57

3. PUNCIÓN FOLICULAR ……………………………………………………………….. 59

3.1. Preparación del material ……………………………………………………………. 60

3.2. Proceso de obtención y lavado de ovocitos ………………………………………… 60

4. MICROINYECCIÓN INTRACITOPLÁSMATICA DEL ESPERMATOZOIDE …. 62

4.1. Preparación de la muestra de esperma ……………………………………………… 62

4.2. Preparación de los ovocitos ………………………………………………………… 63

4.3. Preparación del sistema y proceso de microinyección ……………………...……… 64

5. MARCADORES DE CALIDAD OVOCITARIA ……………………………………... 67

5.1. Tamaño y forma del ovocito ………………………………………………………... 68

5.2. Citoplasma ………………………………………………………………………….. 70

5.3. Primer corpúsculo polar …………………………………………………………….. 72

5.4. Zona pelúcida ……………………………………………………………………….. 74

5.5. Espacio perivitelino ………………………………………………………………… 76

5.6. Retículo endoplamático …………………………………………………………….. 78

5.7. Membrana plasmática ………………………………………………………………. 79

5.8. Recepción del espermatozoide ……………………………………………………… 80

5.9. Cono de inyección …………………………………………………………………... 81

6. MARCADORES DE CALIDAD EN EL CIGOTO (Día 1 del desarrollo) …………... 84

6.1. Pronúcleos …………………………………………………………………………... 84

6.2. Corpúsculos polares ………………………………………………………………… 86

7. MARCADORES DE CALIDAD DE LOS EMBRIONES (Día 3 del desarrollo) ……. 87

8. CULTIVO EMBRIONARIO ……………………………………………………...……. 90

9. SELECCIÓN DE LOS EMBRIONES PARA LA TRANSFERENCIA ……...……… 91

10. ADMINISTRACIÓN DE SUPLEMENTOS DE LA FASE LÚTEA ……………….. 92

11. DETERMINACIONES HORMONALES ………………………………………….… 93

12. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ……………………………………………………………. 95

RESULTADOS ………………………………………………………………………………….. 97

1. Efecto de la hormona de crecimiento sobre la calidad de los ovocitos y los embriones ….. 98

2. Efecto de la hormona de crecimiento sobre la receptividad uterina ………………………. 103

3. Efecto del agonista de la GnRH sobre la receptividad uterina ……………………………. 108

DISCUSIÓN …………………………………………………………………………………….. 111

1. El efecto de la GnRH sobre la calidad ovocitaria y la receptividad uterina ………………. 113

2. Mejora de la fase lútea mediante la administración de un agonista de la GnRH …………. 115

CONCLUSIONES ………………………………………………………………………………. 121

BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………………………………... 123

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecerle de manera especial a mi madre, Carmen Mendoza Oltras, su

perseverancia, tenacidad y dedicación. Por todo lo que me ha enseñado y porque sin ella,

esta tesis no hubiera sido posible.

A mi padre, Jan Tesarik, mi maestro, siempre ayudándome y enseñándome lo bonito

que es la investigación y esta profesión.

A mis Directores de tesis Esperanza Ortega Sánchez y Nicolás Mendoza Ladrón de

Guevara por acogerme bajo su tutela y darme la oportunidad de presentar esta tesis.

A mi compañera Maribel Galán Lázaro que siempre está a mi lado acompañándome

en todo lo que necesito.

A Cristina Conde López, la nueva incorporación de la empresa, por su inestimable

ayuda y apoyo moral.

A mis compañeros de la Clínica MAR&GEN, Tamara Pérez, Rocío Guiral, Almudena

Cara, Mariella Secchi, Piero Di Cesare, Torcuato Porcel, por ser un magnífico equipo y

animarme siempre.

Raquel Mendoza Tesarik

1

INTRODUCCIÓN

Nuevos avances en Reproducción Asistida.

Mejora de la calidad ovocitaria y de la receptividad uterina

2

En España, existe alrededor de un 17% de parejas infértiles, lo que significa que no es

que sean incapaces de concebir un hijo sino que tienen problemas de fertilidad, bien

porque durante un tiempo razonable no hayan conseguido un embarazo de forma natural o

porque aunque lo logran, no llega a término. Según los datos existentes, alrededor de un

40% de parejas infértiles es por causa masculina, otro 40 % por causa femenina y un 20%

por causas desconocidas o mixtas, afectando a ambos componentes de la pareja.

Las causas pueden ser muy variadas pero en el hombre la más importante es la baja

calidad del espermatozoide en cuanto a morfología se refiere. También es relevante la

cantidad y la movilidad, pero son parámetros más estables dentro de la población, mientras

que la morfología ha ido en claro descenso desde hace relativamente pocos años (Carlsen

E y col 1999; Andolz P y col. 1999). La fragmentación del ADN, eyaculación retrógrada y

azoospermia obstructiva o secretora, son igualmente causas de infertilidad masculina

(Borini A y col. 2006; Cohen-Bacrei P y col. 2009; Evenson DP y col 1999; Zhao M y col.

2004; Semiao L y col. 2010).

En la mujer, ovarios poliquísticos, fallos en la ovulación, obstrucción o ausencia de

trompas, endometriosis, mala calidad o baja respuesta ovocitaria, fase lútea deficiente y la

edad, son las principales causas (Urman B y col. 2004; Kollmann M y col. 2016; Surrey ES

2013; De Ziegler D y col. 2018; Broekmans F 2009; Padma R 2016; Tse Yeun Tan M y

col. 2014; Abbas A y col. 2011), observándose que a partir de los 35 años disminuye

considerablemente la calidad ovocitaria y a partir de los 42 es casi muy difícil alcanzar en

un embarazo (Gougeon A 1993; De Brucker M y col. 2013; Hourvitz A y col. 2009).

La pareja infértil, debe ser estudiada para poder emitir un diagnóstico adecuado y así

establecer un tratamiento totalmente personalizado. Se les realiza a ambos componentes de

la pareja, análisis hormonales, bioquímicos e inmunológicos. A la mujer, citología, control

ecográfico para analizar el tamaño de los ovarios, número y tamaño de los folículos,

tamaño del útero y endometrio. Y al hombre un espermiograma, espermiocitograma, test

de fragmentación y marcadores testiculares, prostáticos y vesiculares, si fuera necesario.

Raquel Mendoza Tesarik 3

Una vez establecido el diagnóstico de infertilidad se procede a su tratamiento para lo

cual la mujer va a tener que ser sometida a una estimulación ovárica. Pero antes, para

entender dicho proceso vamos a comenzar por exponer el ciclo ovárico.



4

1. CICLO OVARICO

Alcanzada la madurez sexual en la mujer, el ovario experimenta periódicamente

cambios fisiológicos que constituyen el ciclo ovárico (Fig. 1), y que persiguen dos

finalidades interdependientes y perfectamente coordinadas, como son:

Liberar ovocitos maduros.

Producir hormonas esteroideas, responsables entre otras, de la formación del

cuerpo lúteo y de la preparación del endometrio.

El proceso de la Ovogénesis (Fig. 2) se define como cambios madurativos que

tienen lugar en las células germinales desde la etapa fetal hasta la vida adulta y que dan

como resultado la existencia de células aptas para la fecundación.

La evolución del folículo ovárico, constituido por el ovocito y las células de la

granulosa, comienza desde la simplicidad del folículo primordial hasta llegar a la

complejidad morfológica y funcional del folículo antral, con la existencia de un ovocito

maduro y una serie de capas celulares encargadas de la síntesis y de la secreción hormonal.

Según Rabinovici J y Atwood AK en 1990, se diferencian 4 etapas o fases del desarrollo del

ovario fetal.


Fig. 1 Fases del ciclo ovárico



6

Fig. 2 Transformación de ovogonias a ovocitos: Ovogénesis


1.1 Etapa de gónada indiferenciada

Hacia el final de la 3ª semana de gestación ya es posible identificar, en el endodermo

primitivo, las células germinales que más tarde, y como consecuencia del propio

movimiento y del crecimiento embrionario, se desplazarán hasta su localización gonadal

primitiva. En la 6ª semana, las células empiezan a proliferar por mitosis hasta llegar a unas

10.000.

1.2 Etapa de diferenciación

Entre la 6ª y 8ª semana, la gónada se diferencia en sentido femenino y las células

germinales dan lugar a las ovogonias. Los primeros signos de diferenciación ovárica se

manifiestan con una rápida multiplicación mitótica de las células germinales, alcanzando

un número que oscila de entre 6 a 8 millones en la 16ª – 20ª semana de gestación.

1.3 Etapa de multiplicación de ovogonias y formación del ovocito

Las ovogonias se transforman en ovocitos con la primera división meiótica que se

detiene en la profase I.

El desarrollo posterior del ovocito queda detenido hasta la pubertad, momento en el

que encontramos de 300.000 – 500.000, de los que sólo 400 – 500 serán los seleccionados

para alcanzar la ovulación. En estos ovocitos, la meiosis I se completa dando lugar al

primer corpúsculo polar y al ovocito de segundo orden. Justo después se inicia la meiosis

II que se detiene antes de la ovulación en metafase.

Durante la gestación se produce una pérdida significativa del contenido de células

germinales, no llegando todas a convertirse en ovocitos, razón por la que en el nacimiento

su número oscila sólo entre 1 – 2 millones (Fig.2).



8

1.4 Etapa de formación del folículo

En la 18ª – 20ª semana de gestación, la corteza del ovario es invadida por canales

vasculares procedentes de la zona medular del ovario, lo que indica la formación de

folículos. Esos vasos facilitan la llegada de células de origen mesenquimal y epitelial que

rodean al ovocito. El resultado es el folículo primordial, constituido por un ovocito en

profase I de la meiosis, cubierto por una hilera de células de la granulosa y una membrana

basal.


2. FASES DEL CICLO OVARICO

Se distinguen tres fases en el ciclo ovárico: Fase Folicular, Fase Ovulatoria y Fase

Lútea (Fig. 3) (Williams CJ y Erickson GF 2012).

Fig. 3 Fases de ciclo ovárico



10

2.1 Fase Folicular

La fase folicular se inicia el día 1 al 14 del ciclo, dando como resultado el folículo

maduro desde la fase primordial, pasando por la fase preantral y antral hasta llegar a la fase

preovulatoria. Los folículos primordiales están constituidos por ovocitos inmaduros que

deben completar su maduración (Balasch J y col. 1992).

La concentración de la hormona folículo estimulante (FSH), es alta al inicio de esta

fase estimulando a varios folículos primordiales, de los que uno de ellos crecerá, se

desarrollará y será el destinado a ovular y el resto sufrirán un proceso de atresia, en

paralelo con la bajada continua de la FSH durante el resto del ciclo.

2.1.1 Folículo primordial.

Inicia el ciclo y está formado por un ovocito en estado de diplotene de la profase I de la

meiosis, y una única capa de células de la granulosa con aspecto escamoso. El número de

folículos primordiales que crecen cada ciclo parece ser dependiente de un “pool” residual

de folículos inactivos. Se cree que el folículo destinado a crecer es seleccionado desde los

primeros días del ciclo y es rescatado por la acción de la FSH, (Balasch J y col. 1992;

Gougeon A 1996).

2.1.2 Folículo preantral.

También llamado folículo primario, contiene un ovocito que ha aumentado de tamaño,

seguido de la transformación de las células de la granulosa a forma cuboidal y de la

multiplicación de esas células que empiezan a formar varias capas alrededor del ovocito.

En este estadio aparecen, en las células de la granulosa de algunos de los folículos

preantrales, los receptores a la hormona FSH. Este momento marca el inicio de la fase

hormono-dependiente de la foliculogénesis. El folículo con más receptores para la FSH

empieza a crecer antes de los demás y produce la hormona inhibina B que, en su turno,

inhibe la secreción de la FSH y así frena el crecimiento hormono-dependiente de los demás

folículos preantrales, lo que posteriormente llevará a su degeneración (atresia) (Shander D

y col. 1980). Este mecanismo es responsable del fenómeno de la reciente “dominancia” del


folículo el más avanzado y de la ovulación generalmente monoovular en las mujeres

(McGee EA y Hsuch AJ 2000; Richards JS 2001).

A nivel celular, en respuesta al aumento de la FSH se forman puentes de unión entre las

células de la granulosa y el ovocito que permiten el paso de nutrientes (gap juntions). El

ovocito es rodeado por la zona pelúcida. La capa de granulosa sufre un proceso de

multiplicación de las células que pasan a tener una disposición multicapas, quedando

separadas del estroma por la lámina basal. El folículo adquiere un mayor tamaño y pasa de

la zona cortical del ovario a la zona medular, con una mayor vascularización y donde las

células que rodean a la membrana basal se diferencian en capas concéntricas, la teca

interna y la externa. Este crecimiento y diferenciación es dependiente de las

gonadotropinas que tienen un efecto directo sobre las esteroidogénesis, (Gougeon A 1996).

Las células de la granulosa producen fundamentalmente estrógenos, aunque también

son capaces de producir andrógenos y progesterona. La producción de estrógenos, emplea

un sistema de dos tipos de células. La primera fase consiste en la formación de andrógenos

a partir de colesterol en las células de la teca interna. La segunda fase, la propia producción

de estrógenos, depende de la llegada de andrógenos sintetizados en la teca interna a través

de la lámina basal, (Kobayashi M y col. 1990). (Fig.4).



12

LH

FSH

COLESTEROL

Androstendiona TestosteronaAndrostendiona Testosterona

ESTRONA ESTRADIOL

Androstendiona TestosteronaAndrostendiona Testosterona

CÉLULA DE LA TECA

CÉLULA DE LA GRANULOSA

AMPcAMPc

AMPcAMPc AROMATIZACIÓN

Fig. 4 Producción de estrógenos


Dentro de las células de la granulosa, los estrógenos sufren aromatización activada por

la FSH, cuya unión con el receptor produce la activación del sistema adenilato ciclasa

(AC) que es seguida de la expresión de múltiples ARNm que codifican las proteínas

responsables de la proliferación, diferenciación y función de las células, sobre todo de la

enzima aromatasa que convierte los andrógenos en los estrógenos. La misma FSH aumenta

y disminuye la concentración de sus propios receptores en las células de la granulosa,

acción modulada por factores de crecimiento.

Las células de la teca y de la granulosa actúan de forma sincronizada y reguladas por

las gonadotropinas. En los folículos, las células de la teca son las únicas que expresan

receptores de la hormona luteinizante (LH) desde el inicio de la fase hormonodependiente

de la foliculogénesis, mientras que las de la granulosa expresan receptores para la FSH. La

LH estimularía en la teca la producción de andrógenos a partir del colesterol, mientras que

la FSH estimularía la producción de estrógenos a partir de andrógenos. Este sistema no es

completamente funcional hasta etapas posteriores, (Kobayashi M y col. 1990).

2.1.3 Folículo antral.

El desarrollo folicular prosigue con la acción conjunta de los estrógenos y la FSH. Se

produce una acumulación de líquido entre las células de la granulosa hasta formarse un

autentica cavidad, llamada antro folicular. El líquido folicular crea un medio endocrino

para la nutrición del ovocito y de las células de la granulosa. El ovocito se sitúa de forma

excéntrica rodeado por varias capas de células de la granulosa llamado cumulus oophorus.

El desarrollo final del folículo ocurre cuando alcanza un tamaño de unos 20 mm de

diámetro (McGee EA y Hsuch AJ 2000).

2.1.4 Folículo preovulatorio.

Consta de células de la granulosa que aumentan su tamaño y se rellenan de inclusiones

lipídicas. En la teca aparecen vacuolas y gran cantidad de vasos sanguíneos. En este punto

se alcanzan las tasas más altas de síntesis de estrógenos, alcanzando su pico más alto 24-36

horas antes de la ovulación. Estos altos niveles de estradiol desencadenan el pico de LH.



14

La FSH induce, en las células de la granulosa, la aparición de receptores de LH y la

producción de esteroides, que aumentan bruscamente en la mitad del ciclo produciendo un

efecto de retroalimentación positiva y desencadenando el pico de LH (Fritz MA y col.

1992). La LH promueve la luteinización de las células de la granulosa, lo que hace que se

produzca progesterona.

La progesterona, cuando hay una preparación previa con estrógenos, facilita la

retroalimentación positiva por activación sobre la hipófisis. De igual forma, la

progesterona es la responsable en gran medida del pico de FSH que acompaña al de LH en

la ovulación. Este pico contribuye a la expulsión del ovocito e induce la formación de un

número adecuado de receptores en las células de la granulosa.

Los primeros cambios en el desarrollo folicular, desde el folículo primordial hasta que

inicia su estado activo y comienza su desarrollo, son independientes de la estimulación

gonadotropa. Sin embargo, en la etapa antral el folículo se vuelve extraordinariamente

sensible y dependiente de la acción de las gonadotropinas.

De forma cíclica, muchos folículos abandonan su fase de reposo pero sólo uno

madurará y establecerá la atresia de los demás. Este sistema cíclico se divide en 3 fases:

reclutamiento, selección y dominancia.


2.2 Sistema cíclico de la fase folicular

2.2.1 Reclutamiento.

Este proceso comienza al final de la fase lútea del ciclo ovárico anterior, y continúa

hasta el 5º – 7º día del ciclo ovárico en análisis.

Después, durante la mayor parte del ciclo menstrual normal, las concentraciones de

gonadotropinas se mantienen bajas para estimular el desarrollo monofolicular.

Cuando no hay concepción las concentraciones de estradiol y progesterona

disminuyen, lo que produce un efecto de retroalimentación sobre el eje hipotálamo -

hipófisis y una elevación transitoria de las gonadotropinas que favorece la activación de

algunos folículos (Di Zerega GS y Hodgen GD 1981), cuyo grupo se denomina cohorte.

2.2.2 Selección.

Sólo un folículo logrará ovular. Su selección sucede entre los días 5º – 7º del ciclo

ovárico y pone fin a la fase de reclutamiento. Este proceso resulta de dos acciones

estrogénicas: la interacción de estrógeno-FSH dentro del folículo, y el efecto de los

estrógenos sobre la secreción hipofisaria de FSH, (Fritz MA y col. 1992).

Los estrógenos inciden sobre el folículo en un doble sentido: positivamente sobre el

folículo en vías de maduración y negativamente sobre la hipófisis, produciendo una

retroalimentación negativa que retira el apoyo gonadotropo a los demás folículos que se

atresian.

Los elementos que determinan que el folículo dominante siga desarrollándose pese a los

niveles bajos de FSH y escape a la supresión gonadotropa son los siguientes:

De un lado la mayor vascularización que presenta el folículo dominante.

De otro, la mayor cantidad de receptores de la FSH derivada del mayor

desarrollo de la capa de células de la granulosa (Suzuki T y col. 1998), lo

que provoca una acumulación mayor de estrógenos.



16

También interviene la aparición de receptores de LH en las células de

granulosa, así que LH puede sustituir parcialmente a FSH para promover el

desarrollo folicular (Filicori M y col. 2003).

2.2.3 Dominancia.

Es el crecimiento folicular que precede a la ovulación. El folículo dominante controla

su crecimiento, el medio endocrino, las vías reproductoras y el eje hipotálamo-hipófisis

para la ovulación.

2.3 Fase ovulatoria

Desde el punto de vista morfológico, la ovulación se caracteriza por la aceleración del

crecimiento del folículo, que se va aproximando a la zona cortical del ovario. Las células

de la granulosa presentan un aumento de volumen y abundantes vacuolas lipídicas,

mientras que la teca tiene un aspecto muy vascularizado.

Justo antes de la rotura folicular, en el polo más cercano a la parte más superficial del

ovario se produce una mayor vascularización que protruye la superficie del folículo. Este

es el punto de rotura (Adashi AY 1997) . La expulsión del líquido folicular es lenta y

progresiva. La liberación del ovocito tiene dos hipótesis:

Los cambios en la composición del líquido folicular provocados por la variación del

contenido hormonal y la presión osmótica.

La síntesis de sustancias proteolíticas que digieren el colágeno de la pared folicular.

Desde el punto de vista endocrino, el propio folículo es el que desencadena la

ovulación a través de una síntesis creciente de estradiol. Cuando el estradiol alcanza

determinados niveles, produce un efecto de retroalimentación que estimula la segregación

de gonadotropinas hasta llegar al pico de ovulatorio característico. La ovulación ocurre

entre las 10-12 horas después del pico de LH; unas 34-36 (generalmente se supone que

esto ocurre unas 38 h después del comienzo del pico) horas desde el comienzo del pico

responsable último de la ovulación (Balasch J y Fabregues F 2002; Vanegas H 1995).


El pico de LH (Soede NM y col. 1994) es el responsable de:

La reanudación de la meiosis en el ovocito.

La luteinización de las células de la granulosa.

La estimulación de la actividad proteolítica y la síntesis de prostanglandinas para la

rotura del folículo.

El pico de FSH (Taya K y col. 1991) es el responsable de:

El aumento de la producción de plasminógeno.

La secreción de ácido hialurónico por parte de las células del cúmulus para facilitar

la expansión y dispersión del las células del cúmulus y que éstas floten libremente

en el líquido folicular antes de la rotura.

Garantizar un número adecuado de receptores de LH en la granulosa para facilitar

una función lútea adecuada.

2.4 Fase lútea

Durante la fase lútea, y una vez expulsado el ovocito, se producen una serie de cambios

en el folículo tanto desde el punto de vista morfológico como endocrino. Ya antes de

terminar la ovulación las células de la granulosa empiezan a aumentar de tamaño y a tener

una apariencia vacuolar con depósito de pigmento amarillo (luteína).

También proliferan los fibroblastos y capilares sanguíneos, lo que permite la llegada de

sustratos necesarios para la síntesis hormonal al cuerpo lúteo, fundamentalmente para que

el colesterol llegue a las células de la granulosa en cantidad suficiente para sintetizar

progesterona.

El cuerpo lúteo es fuente principal de esteroides sexuales después de la ovulación. En

ausencia de embarazo su capacidad funcional y vida media depende de la secreción de LH,

mientras que con embarazo su mantenimiento dependerá de la hormona gonadotrófica

coriónica (hCG). En ausencia de embarazo la vida media del cuerpo lúteo es de dos



18

semanas, tras las cuales se produce una regresión y se convierte en cuerpo albicans. La

fase lútea debe durar, si todo el desarrollo folicular y hormonal ha sido normal, entre 11 y

17 días (Lenton EA y col. 1984).

Existen casos de mujeres donde se ha observado una deficiencia de la fase lútea (DFL)

causada por una función alterada del cuerpo lúteo (CL) resultante de una anormal

producción de estradiol y progesterona y acortamiento de la fase lútea, que puede originar

un sangrado menstrual irregular (Fritz MA 2012; Practice Committee of American Society

for Reproductive Medicine 2012), infertilidad y pérdida temprana del embarazo (Ginsburg

KA 1992).

El conocimiento de un criterio válido para el diagnóstico de la deficiencia de la fase

lútea, es aún una cuestión a debate. La determinación de progesterona sérica en la fase

lútea, como diagnóstico de la DFL, es una herramienta útil aunque no perfecta, ya que la

liberación de progesterona del CL tiene un carácter pulsátil reflejando la liberación

pulsátil de LH de la pituitaria (Ginsburg KA 1992).

Sin embargo, niveles de progesterona sérica por debajo de 10 ng / ml (31.8 nmol / ml),

medidos en la mitad de la fase lútea, se considera como un indicador relativamente fiable

de DFL (Filicori M y col. 1984). En estudios realizados por nuestro equipo, consideramos

que el nivel bajo de progesterona en suero es clínicamente relevante cuando se asocia con

un fallo inexplicable de la FIV.

Se observa que los tratamientos de infertilidad mediante fertilización in vitro (FIV)

aumentan el riesgo de DFL, a pesar del desarrollo de múltiples folículos preovulatorios, al

perder cada folículo una parte de sus células de la granulosa, durante la aspiración de los

ovocitos, con el consiguiente empobrecimiento de la CL resultante (Filicori M y col.

1984). Por lo tanto, se suelen utilizar diferentes pautas de tratamiento como soporte de la

fase lútea, con gonadotropina coriónica humana (hCG), estradiol o progesterona, durante

algún tiempo, después de la transferencia de los embriones (Jordan J y col. 1994; Garcia J

y col. 1981).


El efecto beneficioso del agonista de GnRH como agente de soporte de la fase lútea se

demostró por primera vez en 2004 (Tesarik J y col. 2004). Desde que se administró

agonistas de la GnRH a mujeres con ovulación bloqueada que recibieron embriones

resultantes de ovocitos donados, se concluyó que el agonista de GnRH ejerce un efecto

directo sobre los embriones implantados (Tesarik J y col. 2006). Sin embargo, estudios

adicionales mostraron un efecto beneficioso similar del agonista luteal de GnRH en ambos

tipos de protocolos utilizados actualmente en ciclos de estimulación ovárica controlados

por agonistas y antagonistas, respectivamente (Pirard C y col. 2015; Bar-Hava I y col.

2016), lo que sugiere que el agonista de GnRH puede también ejercer un efecto directo

sobre la función del CL. Este supuesto fue corroborado por la observación de que el

agonista de GnRH puede rescatar la función del CL en ciclos de estimulación ovárica

controlados por antagonistas de GnRH y desencadenados con agonistas de GnRH (Leth-

Moyer K y col. 2014). Estos protocolos de estimulación ovárica disminuyen la probabilidad

de hiperestimulación en mujeres con un alto riesgo pero sin un soporte adecuado de la fase

lútea producen un efecto luteolítico que reduce significativamente las tasas de embarazo

(Bar-Hava I y col. 2016).

Sobre la base de las observaciones anteriores, se ha planteado la hipótesis de que el

soporte de la fase lútea con el agonista de GnRH puede ser de ayuda para todas las mujeres

tratadas por reproducción asistida que muestran niveles bajos de progesterona en suero en

la fase lútea, e incluso en aquellos con deficiencia de CL en los ciclos de concepción

natural (Tesarik J y col. 2016). En nuestro programa de fecundación in vitro, la

determinación de la concentración de progesterona sérica se realiza en todas las mujeres a

los 7 días y 14 días, tras la transferencia de los embriones. Algunas pacientes muestran

niveles de progesterona anormalmente bajos en estos días, a pesar de altas dosis de

progesterona administrada por vía vaginal, y la mayoría de ellas no logran alcanzar el

embarazo.

Una vez estudiado el ciclo ovárico completo, desde su comienzo de desarrollo en el

feto, el breve periodo de letargo en la infancia y el resurgir en la pubertad, donde comienza

el tiempo fértil de la mujer, vamos a analizar su gran importancia en reproducción asistida.



20

Anteriormente hemos hablado de que una vez diagnosticada la pareja infértil se

procede a realizar un tratamiento personalizado de la misma que, para la mujer, irá

destinado a la estimulación ovárica con el fin de poder obtener un número adecuado de

ovocitos de buena calidad.


3. ESTIMULACION OVARICA

Una óptima estimulación ovárica es una parte esencial de la reproducción asistida. En

la gran mayoría de los centros, el primer tipo de protocolo a seguir es el coito programado

con o sin estimulación ovárica, pero si este protocolo falla, o no es adecuado debido a

diferentes anomalías del sistema reproductor masculino o femenino, se realizará la

inseminación artificial ya sea con semen de la propia pareja o de donante. La expectativa

es de conseguir un folículo maduro y por lo tanto un óvulo maduro, aunque en muchas

ocasiones resultan embarazos múltiples, debido a la ovulación bifolicular o multifolicular.

En el caso de que estos procesos no sean los idóneos se puede recurrir a la fecundación

in vitro donde se va a proceder a una estimulación ovárica algo más fuerte con el fin de

proporcionar un desarrollo folicular múltiple (Fig. 5), obtener un mayor número de

ovocitos maduros y así aumentar las posibilidades de embarazo. (Oehninger S y Hodgen

GD 1990; Fauser D y Devroey P 2003).



22

Fig. 5 Crecimiento de múltiples folículos antrales en el ovario como consecuencia de

la estimulación ovárica


3.1 Selección de las pautas de tratamiento

Aunque varias clínicas practican protocolos de estimulación más o menos

uniformizados, en nuestra clínica se elaboran protocolos de estimulación totalmente

individualizados, teniendo en cuenta edad de la paciente, reserva ovárica, endocrinología y

tipo de tratamiento biomédico (coito programado, inseminación artificial, fecundación in

vitro, ovodonación…), siempre intentando reducir al máximo los riesgos e intentando

obtener el mayor número posible de ovocitos maduros, embriones de buena calidad, y por

supuesto gestación a término.

Antes de disponer de un tratamiento adecuado se debe catalogar a la paciente como,

normo-, híper- o hipo-respondedora. Existen varias pruebas a determinar como FSH, LH y

17 beta-estradiol (entre los 3 primeros días del ciclo). La hormona antimulleriana (AMH),

secretada por las células de la granulosa de los folículos preantrales y antrales pequeños,

parece ser, junto con el recuento de pequeños folículos antrales en ambos ovarios en los

primeros días del ciclo menstrual, el marcador más fiable de la reserva ovárica. A

diferencia de las otras 3 hormonas, que varían a lo largo del ciclo menstrual, La AMH

queda inalterada, por lo que puede hacerse la determinación en cualquier momento del

ciclo en estudio (Feyenisen A y col. 2006). Según algunos autores la edad de la mujer es

otro parámetro con gran valor predictivo del éxito del ciclo (Hendricks D y col. 2005).

Las pacientes normo-respondedoras: son aquellas cuya valoración clínica,

endocrinológica y ecográfica nos muestran valores normales. En regla general, su tipo de

tratamiento para la estimulación ovárica será fundado en la combinación personalizada de

preparaciones con la actividad de FSH y LH en un protocolo largo con agonista de la

hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) o con un antagonista de GnRH (para reducir

el coste del tratamiento). La dosis de FSH y LH podría ser fija durante los primeros días

de la estimulación pero se tiene que adaptar posteriormente a la respuesta individual de los

ovarios de cada paciente determinada mediante varios controles durante el tratamiento.



24

Las pacientes con baja respuesta: son aquellas que no responden lo suficientemente a

la estimulación convencional. En ocasiones tienen los niveles hormonales basales

alterados, pero en otras, la respuesta es inesperada y ocurre después de un intento fallido.

Algunos autores consideran un desarrollo folicular mínimo aquel que garantiza un número

de cuatro ovocitos y por lo menos 2 embriones viables para transferir (Bancsi LF y col.

2002; Klinkert ER y col. 2004). Los protocolos a utilizar en estos casos no están bien

definidos, aunque la mayoría exige el uso de protocolos cortos con agonistas de GnRH

(“flare-up”) o protocolos utilizando antagonistas de GnRH y aumentando las dosis de

gonadotropinas.

Las pacientes hiper-respondedoras: son aquellas en las que se hace más importante la

prevención de complicaciones resultantes de una estimulación demasiado fuerte (síndrome

de hiperestimulación ovárica). En líneas generales se trata de pacientes que necesitan la

utilización de dosis más bajas de gonadotropinas al inicio de la estimulación. En caso de

una amenaza seria de la hiperestimulación se pueden utilizar métodos alternativos de la

desencadenación de la ovulación, interrumpir la estimulación durante algún día o

criopreservar todos los embriones evitando su transferencia en ese ciclo.


4. GONADOTROPINAS

Son hormonas sintetizadas por la glándula pituitaria o por la placenta durante el

embarazo. Las preparaciones de gonadotropinas utilizadas para la estimulación ovárica se

utilizan preparaciones de gonadotropinas aisladas y purificadas a partir de la orina de

mujeres postmenopáusicas o bien sintetizadas de forma recombinante, siendo esta ultima la

más novedosa. La diferencia entre las preparaciones disponibles en el mercado reside en el

contenido proteínico, ajeno a la hormona. Entre las procedentes de la orina, según la

cantidad de estas proteínas contaminantes, se distinguen preparaciones purificadas o

altamente purificadas. Las recombinantes no tienen ese contenido proteínico ajeno. La

ventaja más importante de las altamente purificadas y las recombinantes es su fácil manejo

por la paciente pues las inyecciones son subcutáneas, mientras que las purificadas que son

por inyección intramusculares.

Antes de fijar los parámetros para una buena inducción ovárica debemos recordar la

importancia del papel de la FSH y LH.

4.1 Papel de la FSH

El crecimiento folicular depende de la acción tónica de la FSH hasta que el folículo

alcanza un diámetro de unos 5mm. Los folículos que alcanzan este estadio se pueden

considerar en disposición de entrar en la fase final de maduración.

Una vez se inicia la involución del cuerpo lúteo se produce la disminución de la

producción de estrógenos, progesterona e inhibina, mientras que en el ciclo menstrual

humano, los niveles de FSH se elevan al final de la fase lútea. Esta elevación se denomina

interciclo de la FSH y esta sincronizada con la ovulación, produciéndose el aumento

interciclo 12 días después del pico de LH (Hall JE y col. 2000).



26

La elevación de la FSH interciclo está íntimamente relacionada con la capacidad de

reclutamiento folicular. Por ello podemos incluir dos nuevos conceptos: “umbral de FSH”

que sería aquel nivel plasmático de FSH capaz de iniciar el reclutamiento. Y “ventana

FSH” que se refiere al número de días que los niveles de FSH se mantienen por encima del

nivel del umbral citado.

4.2 Papel de la LH

La exposición tónica a la LH promueve la capacidad de respuesta folicular a la FSH

durante el reclutamiento y selección folicular. La LH promueve la síntesis de andrógenos

a nivel de la teca del folículo seleccionado, que sirvan de sustrato para sintetizar los

estrógenos a nivel de las células de la granulosa y así permitir un descenso en los niveles

de FSH, que provoca la atresia de los folículos no seleccionados. La LH es también

fundamental en la segunda mitad de la fase folicular, para la maduración folicular y

ovocitaria. No obstante, los folículos expuestos a altos niveles de LH en la fase folicular

avanzada entran en atresia o se luteinizan prematuramente (Hillier SG 1993). Por ello,

debemos pensar que los folículos tienen unas necesidades específicas de LH por encima de

las cuales cesa su desarrollo normal, esto es conocido como “techo de la LH”.

4.3 Factores que influyen en la estimulación óptima

Es de aceptación general que para obtener una buena estimulación hay que tener en cuenta:

4.3.1 Aumento y extensión del crecimiento interciclo de la FSH en la fase inicial de

la estimulación y bloqueo hipofisario en la fase final de la estimulación.

En el año 1971 Schally AV y col. aislaron y determinaron la estructura del GnRH. Es un

decapéptido secretado por el hipotálamo y que, liberado de forma intermitente, estimula la

síntesis y secreción de FSH y LH. Reemplazando uno o dos aminoácidos de su estructura

se consiguen los análogos agonistas de la GnRH, que si se administran de forma

continuada provocan un inicial aumento de los niveles plasmáticos de FSH y LH y que de

forma posterior consiguen una desensibilización hipofisaria debido a la ocupación masiva

e internalización de los receptores hipofisarios de la GnRH (Guillemin R y col. 1971).


Otras modificaciones de la GnRH han permitido obtener los análogos antagonistas de

la GnRH. Estos, a diferencia de los agonistas, provocan un bloqueo inmediato de los

receptores de la GnRH, que dan como resultado una inhibición rápida y reversible de la

inhibición de las gonadotropinas (Fauser B y Devroey P 2005). La utilización, primero de

los agonistas y después de los antagonistas de la GnRH, ha reducido casi completamente la

ovulación y luteinización prematura.

Los análogos agonistas de la GnRH se pueden utilizar con dos pautas diferentes:

Protocolo largo, que comienza el análogo en fase lútea media del ciclo precedente

al de la estimulación y manteniéndolo hasta la administración de la hCG. La

administración del análogo dura 1-2 semanas y de esta manera se inicia la

estimulación con gonadotropinas una vez se ha conseguido la quiescencia folicular.

Protocolo corto, que consiste en comenzar con el análogo en la fase menstrual e

iniciar la estimulación con gonadotropinas inmediatamente después, aprovechando

el incremento de la FSH y LH provocado al inicio del tratamiento con el agonista.

Se ha podido demostrar que el protocolo largo da mejores resultados a nivel de la

calidad de ovocitos y de gestaciones, aunque es necesario el uso de mayor cantidad de

gonadotropinas (Daya S 2000).

Los análogos antagonistas se utilizan con el objeto fundamental de realizar protocolos

más cortos, ya que se administran cuando la estimulación gonadotrófica ya se ha iniciado y

su único fin es el de impedir los picos de LH que provocan la luteinización.

Los antagonistas se utilizan como pauta única (3 mg de ganirelix o cetrorelix) entre el

8º y 9º día de la estimulación (Olivennes F y col. 1998) o como pautas múltiples (0,25 mg/

día) a iniciar el 6º día de estimulación y manteniéndolo hasta el día de la HCG. Hay dos

formas de usar el análogo antagonista con dosis múltiples, la que inicia en el día 6º y la que

se demora a la aparición del primer folículo de 14 mm.



28

4.3.2 Superación del valor “umbral” y del periodo “ventana” de FSH.

El nivel de FSH interciclo es el que establece el reclutamiento del número de folículos

que conformaran la cohorte (entre 10 - 20 folículos y entre 2 – 5mm). La selección y

dominancia de uno de ellos es debida a una mayor sensibilidad de las células de la

granulosa a la FSH y la síntesis de estradiol en este folículo es el responsable de la atresia

del resto. El desarrollo folicular está más relacionado con el tiempo de exposición a la FSH

(ventana) que con la dosis utilizada (umbral). Por tanto el reclutamiento folicular múltiple

es proporcional al acumulo de FSH independientemente de los niveles plasmáticos con

seguidos con niveles iniciales elevados (Fauser BC y col. 1993; Fauser BC 1994).

Las dosis iniciales de gonadotropinas varían entre 100 y 300 UI/d y son ajustadas, de

forma individual, a las pacientes. No se ha demostrado que dosis más altas den mejores

resultados, incluso en mujeres de edad avanzada, ya que el tratamiento gonadotrófico solo

actúa en los folículos de la cohorte, no promueven el desarrollo de nuevos.

Los diferentes estudios no dan evidencias suficientes para pensar que la FSH

recombinante tenga mejores resultados a nivel de gestaciones que la FSH urinaria o la

HMG (Al Inany H y col. 2003). Pero el uso de la recombinante es más seguro, tiene una

mayor tolerancia (Albano C y col. 1996) y un riesgo menor de la transmisión de priones

(Shaked GM y col. 2001).


4.3.3 Mantenimiento de los niveles plasmáticos adecuados de LH.

Los niveles de LH deben mantenerse dentro de unos límites que cuando no se alcanzan

o se superan provocan problemas trascendentes para el ciclo.

Existe un gran debate de la conveniencia de utilizar o no preparaciones con actividad

LH. Se ha publicado que una excesiva supresión podría ser nociva para la posibilidad de

gestación como para su continuidad (Westergaard LG y col. 2000; Fleming R y col. 2000).

Pero niveles inferiores a 0,5 UI/L en la fase folicular media podría acompañar resultados

peores. Otros estudios argumentan que los niveles de LH no influyen en los resultados del

ciclo (Peñarrubia J y col. 2003; Merviel P y col. 2004) y solamente el nivel de supresión

hipofisiaria, sobre todo con preparados de absorción retardada, podría acompañarse de

niveles más bajos de LH, cuando de utilizan preparados de FSH, lo que aumentaría la

duración del ciclo pero que no influye en los resultados (Balasch J y col. 2003). Los

criterios de la utilidad de la actividad LH durante la estimulación depende de los valores

actuales de LH en el suero, del ritmo de crecimiento de diferentes folículos en respuesta a

la estimulación (Tesarik J y Mendoza C 2002) y del fin que queremos alcanzar (desarrollo

mono- o paucifolicular en casos de inseminación intrauterina versus el desarrollo del

mayor número de folículos posible en casos de la FIV).



30

5. HORMONA DE CRECIMIENTO

La hormona de crecimiento (GH) o somatotropina es una hormona peptídica segregada

por la pituitaria, que originariamente, estimula el crecimiento, reproducción celular y la

regeneración en humanos y otros animales, aunque se ha podido comprobar que es una

hormona muy compleja que puede estar implicada en otras muchas funciones que aún se

desconocen (Powers M 2005).

El ciclo folicular de los primates depende en gran manera de factores autocrinos/

paracrinos. Debido al papel crítico del factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-I)

rápidamente se vio que añadir GH, que estimula la producción de este factor,

(habitualmente en dosis de 24 UI por vía intramuscular administrada en días alternos),

podía facilitar la inducción de la ovulación con gonadotropinas en pacientes malas

respondedoras o con ovarios poliquísticos, aunque la GH puede afectar el desarrollo

folicular mediante sus receptores específicos presentes en el ovario, independiente del IGF-

I (Tesarik J y col. 2005).

Los primeros análisis dieron buenos resultados, pero se limitan a mujeres con ovarios

poliquísticos (Ibrahim Z y col. 1991; Owen EJ y col. 1991). En mujeres de respuesta

normal ni mejoraban la respuesta ni disminuían la cantidad de gonadotropinas (Hughes SM

y col. 1992). En ellas la GH y la IGF-I están operando al máximo rendimiento.

En las mujeres bajo respondedoras, es decir que no producen suficientes folículos en

sus ovarios, el tratamiento con GH puede disminuir el uso de las gonadotropinas, acortar el

tratamiento y aumentar las posibilidades de éxito (Levy T y col. 1993). Algunos autores no

han encontrado pruebas de que la GH ayude a mejorar las tasas de natalidad en mujeres

con buena respuesta a la FIV. Sin embargo, existen algunas pruebas de un aumento en las

tasas de embarazo y natalidad en mujeres con antecedentes de respuesta deficiente a la

FIV. Dichos resultados fueron apenas significativos ya que se obtuvieron en tres ensayos

con un número pequeño de pacientes (Harper K y col. 2003).


6. MODELO DE PROTOCOLO DE ESTIMULACIÓN

OVÁRICA

Han sido muchos y variados los protocolos de estimulación ovárica desde que en el

1978 tuviera éxito la FIV gracias a R Edwards y P Steptoe, en Manchester (Gran Bretaña),

aunque este primer éxito fue alcanzado en un ciclo natural, sin ningún tipo de estimulación

ovárica (Steptoe PC y Edwards RG 1978). La estimulación ovárica fue utilizada por la

primera vez 17 años antes del primero éxito de FIV para facilitar la reproducción natural

en mujeres con ciclos anovulatorios (Greenblatt RB y col. 1961).

Después del primer éxito de la FIV, se empezó rápidamente a extender el uso de la

estimulación ovárica para estos tratamientos, siendo pioneros un grupo australiano:

Trounson AO y col. 1981 y un grupo británico: Edwards RG y Steptoe PC 1983). A lo

largo de los más de 40 años de la evolución de la FIV, se han diseñado diferentes métodos

de estimulación ovárica (Tesarik J. 2017) y la elección personalizada del método el más

adecuado para cada caso concreto tiene una gran importancia para el éxito del tratamiento,

sobre todo en los casos difíciles (Mendoza-Tesarik R y Tesarik J 2018).

En este trabajo, vamos a exponer uno de los que mayor éxito tiene y por ello el de

mejor aplicación.

La estimulación ovárica se origina a los 7-14 días de la administración continuada de

gonadotropinas. La variación en las dosis dependerá de los resultados del estradiol

circulante y de la cantidad y tamaño de los folículos.

Según el tipo de la respuesta de cada paciente a la estimulación (normo-respondedoras,

hipo-respondedoras o hiper-respondedoras), puede ser más útil empezar la estimulación

con las dosis más altas de gonadotropinas y bajar progresivamente o al revés.

El clínico responsable tomará la decisión de la cantidad de medicación diaria con

relación a las analíticas de estradiol circulante y las ecografías relativas al tamaño de los

folículos. Cuando algunos de los folículos adquieren un tamaño similar a 16-18 mm, y la

mayorías de los demás supera el tamaño de 12-15 mm, es el momento de administrar la



32

HCG, que provocará directamente la maduración de los ovocitos, o un bolo de agonista de

GnRH que inducirá un pico de LH produciendo el mismo efecto. Unas 36 horas después de

la administración de la HCG se procederá a la punción folicular, con el objeto de obtener

los ovocitos maduros.

Determinaciones hormonales y controles ecográficos durante el protocolo de

estimulación ovárica.

El nivel óptimo de estradiol al séptimo día de tratamiento estará entre 1000 -1500

pg/ml (Haning RV y col. 1979). El riesgo de hiperestimulación aumenta significativamente

si el valor se encuentra entre 1500 – 2000 pg/ml y no se debe administrar mucho más

medicación si supera este valor de 2000 pg/ml (Haning RV y col. 1984).

La evaluación mediante ecografía nos permite determinar el grado de maduración de

los folículos (Ritchie W 1985), por lo que realizar varios controles a lo largo de la

estimulación proporciona una mejor aproximación para ajustar el momento de la

administración de la HCG.

Además del crecimiento folicular, las ecografías indican la modificación endometrial a

lo largo del tratamiento. Las mejores tasas de embarazo muestran valores de entre 9-10

mm, con un mínimo de 7 mm, del grosor del endometrio.

La calidad de la estimulación se puede afinar incluyendo controles de LH. Si los

niveles de LH son bajos (1.0 U/l), conviene añadir una preparación de HMG (de actividad

LH) o de la LH recombinante a la FSH pura.


7. PUNCION FOLICULAR Y RECOGIDA OVOCITARIA

La punción folicular consiste en la recuperación de los ovocitos, vía vaginal, mediante

un sistema de aspiración guiada ecográficamente y bajo sedación (Dellenbach P y col.

1985).

La punción folicular deberá llevarse a cabo justo antes de que se produzca la ovulación

y para poder planificarla, la ovulación se induce artificialmente mediante una inyección de

HCG o del agonista de GnRH, aproximadamente 36 horas antes del tiempo previsto para la

punción folicular que es cuando se supone que la mayoría de los ovocitos se encuentran

maduros, en Metafase II (Bosdou JK y col. 2015; Wei W y col. 2011).

La calidad del ovocito es muy importante para obtener buenos resultados tanto de

fecundación como de embarazo. Y en dicha calidad ovocitaria van a intervenir diferentes

factores como puede ser la edad de la paciente, reserva ovárica, índice de masa corporal, la

eventual presencia de diferentes enfermedades que afectan directamente o indirectamente a

los ovarios (ej. Endometriosis, síndrome de ovario poliquístico, diabetes) y por supuesto el

protocolo de estimulación.

Obtener un ovocito maduro y de óptima calidad es crucial para el éxito del protocolo.

Hay muchas teorías sobre la relación entre calidad del ovocito y sus diferentes

características morfológicas y se han establecido diferentes clasificaciones, teniendo en

cuenta 3 características principales: la calidad del citoplasma, la calidad del exocitoplasma,

y la calidad del complejo cúmulus-corona radiata-ovocito.



34

7.1 Calidad del citoplasma.

Agrupaciones de orgánulos en el centro del ovocito: es una alteración frecuente que

se observa en el microscopio óptico como una masa individual y oscura con

excesivo contenido de gránulos, generalmente en la porción media del ovocito.

(Kahraman S y col. 2000; Meriano JS y col. 2001; Van Blerkom J y Henry G

1992).

También se ha descrito la vesicularización de la totalidad del citoplasma (Meriano

JS y col. 2004; Van Blerkom J y Henry G 1992).

Agregación de retículo endoplasmático liso: es un tipo de inclusión citoplasmática

elíptica y del tamaño de un pronúcleo resultado de una acumulación masiva se

sáculos del retículo endoplasmático. (Otsuki J y col. 2004).

Vacuolas: son inclusiones citoplasmáticas rodeadas de membrana y llenas de

fluido. (Otsuki J y col. 2004; Van Blerkom J 1990).

Inclusiones citoplasmáticas: son consideradas pequeñas zonas de necrosis

compuestas de lípidos y gránulos densos que pueden agruparse o quedarse

dispersos (Serhal PF y col. 1997; Suzuki K y col. 2004).

7.2 Calidad del extracitoplasma.

Exudados en el espacio perivitelino: la presencia de esta granulación en el espacio

perivitelino está relacionada con un deterioro de la zona pelúcida interna. Una gran

cantidad puede suponer un descenso importante en la fecundidad (Veeck LL 1999),

aunque otros estudios no han confirmado esta afirmación. La presencia de estos

detritus puede ser signo de una “sobredosis” de las gonadotropinas utilizadas en las

estimulaciones. Aunque su presencia no parece alterar la calidad embrionaria,

fecundación, tasas de división o embarazo…. (Hassan-Ali H y col. 1998). Por tanto

este fenómeno podría estar relacionado con la maduración fisiológica del ovocito

(Balaban B y Urman B 2006).


Anomalías de la zona pelúcida: la zona pelúcida pasa por diversas apariencias y

grosores a lo largo de su desarrollo. Las anomalías más comunes son aquellas que

transforman la zona pelúcida, con alteraciones de su forma circular y la formación

de abultamientos y septos (Sauerbrun-Cutler MT y col. 2015).

Espacio perivitelino aumentado: es una característica claramente visible y se

observa como un espacio entre el citoplasma y la zona pelúcida muy dilatado,

quedando el citoplasma como flotando. Es una característica asociada a una baja

calidad ovocitaria (Xia P 1997).

Alteraciones del primer corpúsculo polar: la morfología del primer corpúsculo polar

varía dependiendo de la duración del cultivo del ovocito in vitro antes de ser

fecundado (Balaban B y col. 1998). De hecho se ha detectado una correlación

positiva entre el porcentaje de fragmentación y el tiempo trascurrido en la

desnudación y la ICSI (Ciotti PM y col. 2004); así como también un incremento de

la fragmentación del corpúsculo polar a lo largo del tiempo (Verlinsky Y y col.

2003). Algunos autores han sugerido que la morfología del corpúsculo polar está

relacionada con las tasas de embarazo e implantación (Ebner T y col. 1999, 2000,

2002). La variación del tamaño del corpúsculo polar también es determinante en la

calidad, pues está relacionada con la posición del huso meiótico en la periferia del

ovocito. Ovocitos con un corpúsculo polar anormalmente pequeño o grande tienen

más probabilidad de albergar diferentes alteraciones cromosómicas en comparación

con los ovocitos con el corpúsculo polar de un tamaño normal (Veeck LL 1999).

7.3 Calidad del complejo cúmulus-corona radiata-ovocito

El grado de madurez del complejo ha sido utilizado como indicador de la madurez

ovocitaria, aunque la sincronía entre ambos es cuestionable, sobre todo en ciclos

estimulados (Hartshorne G y col. 1999; Tarin JJ y Pellicer A 1992).

Esto puede ser debido a diferencias de sensibilidad de las células del complejo cumulo-

corona y del núcleo ovocitario, a la maduración inducida (Balaban B y Urman B 2006).



36

8. REPRODUCCION ASISTIDA

Se entiende por Reproducción Asistida (RA) al conjunto de técnicas y tratamientos

a los que se somete a los pacientes para conseguir el fin de obtener una gestación evolutiva

y el nacimiento posterior de un niño.

Se puede consideran tres grupos:

Existen diferentes técnicas de RA y las más empleadas son:

Inseminación artificial (IA): que consiste en introducir la muestra de semen, una

vez preparada, en el interior de la vagina o útero de la paciente.

Fecundación In Vitro:

Fecundación in vitro convencional (FIVc), que trata de poner en contacto

los ovocitos, obtenidos mediante punción folicular, con una concentración

adecuada de espermatozoides, en un medio de cultivo.

Microinyección intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI), es una

técnica de RA similar a la FIVc, con la diferencia de que la inseminación de los

óvulos se realiza al introducir un espermatozoide en el interior del óvulo

mediante una microaguja.

http://www.reproduccionasistida.org/microinyeccion-intracitoplasmica-de-espermatozoides-icsi/


9. CALIDAD EMBRIONARIA

La calidad del embrión depende de diferentes factores: calidad del ovocito, calidad del

espermatozoide que lo ha fecundado, método utilizado para su fecundación, destreza del

embriólogo en la práctica de la técnica utilizada, medio de cultivo utilizado y varios

factores relacionados con el cultivo in vitro (estabilidad de la temperatura, composición y

estabilidad de la fase gaseosa % CO2 y % O

2,, dentro del incubador, la pureza del aire en el

laboratorio, la frecuencia de las observaciones de los embriones fuera del incubador y la

duración de cada una etc.).

9.1 Día 1

El día después de la punción folicular se denomina Día 1 (D+1). Es en este día, entre

las 16-20 horas posteriores a la FIVc o a la ICSI, es cuando se observa si se ha producido o

no fecundación. El embrión con fecundación normal consta de 2 Pronúcleos y 2

Corpúsculos polares (Fig. 6), observándose:

Fig. 6 Un ovocito fecundado (cigoto) con 2 pronúcleos, uno del origen ovocitario y el

otro proveniente del espermatozoide



38

Número de corpúsculos polares: en la fecundación normal el embrión tiene 2

corpúsculos polares.

Apariencia de los corpúsculos polares: la apariencia de los corpúsculos polares

hace referencia a su tamaño y fragmentación.

Número de pronúcleos: la observación de los pronúcleos y los corpúsculos polares

conjuntamente es la forma tradicional de decidir la buena morfología en D+1. La

forma óptima es 2 corpúsculos polares de tamaño la mitad de un pronúcleo y sin

fragmentaciones, y 2 pronúcleos de igual tamaño y unidos.

Apariencia de los pronúcleos: hay dos ejemplos de gradación pronuclear en función

de la apariencia y distribución de los pronucleolos. (Tesarik J y Greco E 1999; Scott

L 2000). Otras características muy importantes son por ejemplo el numero de

pronúcleos: lo normal son 2, la disposición de los pronúcleos: juntos y el tamaño de

los pronúcleos: iguales.

Halo citoplasmático: es una zona cortical más clara en parte o en todo el citoplasma.

Los autores coinciden en que es un rasgo positivo siempre que no sea excesivo. Los

cigotos con halo darán embriones con mejor calidad (60,9%) mientras que los que no

lo tienen darán embriones con una calidad peor (52,2%) (Balaban B y Urman B

2006; Payne D y col. 1997; Salumets A y col. 2001; Zollner U y col. 2002).

División temprana: hay muchos estudios que analizan los embriones entre las 25 y

27 horas después de la ICSI, siempre combinando este parámetro junto con la

morfología del cigoto (Chen S y Kattera S 2006), la mononucleación en D+2 (Ciray

HN y col. 2005) o los parámetros de la morfología en D+3 (Neuber E y col. 2003).

Estos estudios correlacionan esta división temprana con la morfología embrionaria en

D+2 y D+3 (Ciray HN y col. 2006; Lundin K y col. 2001), con el desarrollo hasta

blastocisto (Neuber E y col. 2003), con la viabilidad (Salumets A y col. 2003; Shoukir

Y y col. 1997), con la tasa de implantación (Ciray HN y col. 2006; Rienzi L y col.

2005) o con la tasa de aborto (Van Montfoor AP y col. 2004). La conclusión general

es que la división temprana debe utilizarse a la hora de decidir entre embriones de

calidad aparentemente igual.


9.2 Día 2 y Día 3

El Día 2 (D+2) (Fig. 7) y el Día 3 (D+3) (Fig. 8) se refiere a las 44-47 horas y 67-71

horas, respectivamente, tras la punción. Aquí es donde se valoran los embriones

normalmente a la hora de elegir el embrión a transferir. Aunque existe un consenso de lo

que es un buen y un mal embrión, con los de calidad intermedia siempre hay multitud de

opiniones. Los parámetros medidos en D+2 y D+3 son:

Fig. 7 Embrión a 4 células en día 2 de su desarrollo



40

Fig. 8 Embriones a 8 células en su día 3 de desarrollo


Número de células y ritmo de la división: en una transferencia en D+2 los

embriones de 4 células son los que tienen mejor pronóstico mientras que los de 2 ó

5, 3 ó 6 y 1 o más de 6 células serían de peor calidad. En D+3 el mejor embrión que

podríamos transferir es de 8 células. (Ziebe S y col. 1997; De Placido G y col. 2002;

Van Royen E y col. 1999; Fish JD y col. 2001; Lavarge H y col. 2001; Munné S y

Cohen J 1998).

Porcentaje de fragmentación celular: la presencia de algunos fragmentos no es

indicativo de un pronóstico, hasta un 20% de fragmentación la implantación no está

comprometida (Hardarson T y col. 2001; Van Royen E y col. 1999; Ziebe S y col.

1997; Alikani M y col. 2000; Racowsky C y col. 2003).

Es importante distinguir un blástomero de un fragmento celular. Se establecen como

fragmentos aquellos que tiene de tamaño de 65 a 70 micras en D+2 y de 55 a 60

micras en D+3 (Johanson M y col. 2003).

Igualdad entre las blastómeros: cuando el cigoto se divide no siempre lo hace de

forma simétrica y sincrónicamente. Generalmente una desigualdad en las células

sugiere una calidad más baja (De Placido G y col. 2002; Hnida C y col. 2004; Steer

CV y col. 1992; Van Blerkom J y col. 2000; Veeck LL 1999a). En ocasiones los

embriones tienen un número impar de células y es porque coexisten células con

ciclos celulares asíncronos, por ello es fácil pensar porque puedan tener diferente

tamaño.

Visualización de núcleos y grado de multinucleación: la existencia de la

multinucleación, así como de micronúcleos es directamente proporcional a las

anomalías cromosómicas (Hardarson T y col. 2001). Estos embriones tienen una baja

tasa de implantación y un alto porcentaje de aborto, aunque se han descrito

nacimientos de niños sanos procedentes de embriones multinucleados (Jackson y

col. 1998: Meriano y col. 2004; Pelinck y col. 1998; Van Royen y col. 2003). De

hecho, la multinucleación parece ser una herramienta de autocorrección, utilizada por

embriones mosaicos (con algunas células euploides y otras aneuploides) para

deshacerse de las aneuploides y convertirse en un embrión genéticamente normal

(Tesarik J 2018).



42

Anillo citoplasmático: aparece en el blastómero como un retraimiento del

citoplasma, se relaciona con un proceso de lisis celular (Veeck LL 1999b).

Presencia de vacuolas: las vacuolas son inclusiones citoplasmáticas unidas a la

membrana y llenas de líquido. Su presencia tanto en ovocitos como en embriones

está asociado con una disminución del potencial de implantación. La bibliografía no

indica que numero, tamaño o disposición deben tener para disminuir la implantación,

pero se sabe que las menores de 5 μm de diámetro no comprometen al embrión (Van

Blerkom J 1990; Ebner T y col. 2005).

Zona pelúcida: las anormalidades en la zona pelúcida se relacionan con una baja tasa

de implantación, puede que por la falta de eclosión. Así, una zona pelúcida normal es

aquella que tiene unos 17 μm de grosor, es homogénea, no tiene abultamientos, ni

doble tabicación y es traslucida. (Gabrielsen A y col. 2001; Goyanes VJ y col. 1990;

Veeck LL 1999b).

Grado de compactación: la compactación es signo de actividad embrionaria, se

forman uniones intracelulares y una polarización embrionaria (Gadner RL 1989;

Veeck LL 1999c). Existen dos grados de compactación: uno es el inicio de adhesión,

en el que se pueden todavía ver las células y contarlas fácilmente y la compactación

propiamente dicha en la que es difícil distinguir los blastómeros. Este último se

visualiza en el estado de mórula en D+4.

Pitting o moteado: que se presenta como pequeñas y numerosas motas de

aproximadamente 1.5 µm. Indica una activación citoplasmática y ocurre en día 3. La

aparición de esta granulosidad pare ce estar relacionada con una mejor formación del

blastocisto, aunque no tiene gran valor predictivo del pronóstico de la calidad del

embrión (Rienzi L y col. 2003) o del embarazo (Desai NN y col. 2000). Otro estudios

han demostrado que las condiciones de cultivo pueden inducir a su aparición

(Biggers JD y Racowsky C 2002; Ebner T y col. 2005a) en casos extremos aumentan

el riesgo de abortos tempranos (Ebner T y col. 2005b).


9.3 Día 4, Día 5 y Día 6

La calidad embrionaria se observa también en los Día 4 (D+4), Día 5 (D+5) y Día 6

(D+6), y se realiza a las 94-98 horas, 112-120 horas y 136-140 horas, respectivamente El

estadio de blastocisto alcanzado sobre todo en el día 5 es el ideal para transferir (Fig. 9), ya

que en algunos casos permite una mejor elección de los embriones.

Fig. 9 Embrión en estadio de blastocisto en el 5º día de su desarrollo



44

Y los parámetros medidos en D+4, D+5 y D+6 son:

Compactación en mórula: es el estadio en el que es muy complicado diferenciar los

blastómeros entre sí. Se observa una masa de células compacta en la que sí que se

diferencian los numerosos núcleos. Normalmente comienza en D+4 y debe iniciarse

en embriones como mínimo de 8 células. En este paso las células dejan de ser

totipotentes y ya es un embrión especializado (Balaban B y col. 2000). La

compactación conlleva un aumento de la adhesión intercelular y el inicio de la

polarización embrionaria (Gardner RL 1989; Veeck LL 1999; Alikani M 2005;

Cockbum K y Rossant J 2010). Por lo tanto, encontrar esta compactación en D+4 es

pronóstico de un buen desarrollo embrionario.

Según el grado de compactación existen 3 modelos:

1. La compactación total es la que afecta todas las células del embrión.

2. La compactación incompleta cuando todas las células están en compactación

pero en diferentes estadios.

3. Y la compactación parcial cuando solamente algunas células del embrión se

compactan y otras mantienen su forma definida de blastómeros.

Evolución del embrión a blastocisto: al estadio de blastocisto se llega en D+5 o

D+6, aquellos que llegan en día 7 u 8 tienen un peor pronóstico (Khorram O y col.

2000; Shapiro BS y col. 2001).

Grado de expansión del blastocele: el blastocele es la cavidad rellena de líquido que

se forma en la evolución del blastocisto. El progresivo aumento de volumen del

blastocele es un parámetro de difícil catalogación, ya que depende del tiempo en el

que se observa porque el embrión pasa por algunas fases de colapso y recuperación.

La expansión blastocélica está relacionada con buenas tasas de implantación (Shoukir

Y y col. 1998).

Zona pelúcida: sufre muchos cambios a lo largo del desarrollo del blastocisto. Con

su expansión se afina muchísimo y en la eclosión se rompe, siendo esto indicativo de


buen pronóstico (Balaban B y col. 2000; Racowsky C y col. 2003; Yoon HJ y col.

2001).

Trofoectodermo: es una mono capa de células que rodea al blastocisto por toda su

pared y delimitando el blastocele. El trofoectodermo óptimo es aquel que tiene gran

número de células elípticas y regulares. Los trofoectodermos con calidad baja

también pueden dar buena implantación siempre que su masa celular interna tenga

una morfología normal (Kovacic B y col. 2004).

Masa celular interna (MCI): es el conjunto de células que dan lugar al disco

embrionario y finalmente al feto. Su evaluación es el parámetro más importante de

observación respecto a su viabilidad. Un blastocisto tras 112-120 horas post

inseminación debe mostrar una masa celular interna ovalada y con las células

compactadas, su tamaño varía entre 1900 y 3800 μm2. Los tamaños inferiores

denotan baja posibilidad de implantación (Ritcher KS y col. 2001).

Grado de fragmentación celular: es el volumen de espacio periplásmico ocupado

con fragmentos citoplásmicos. Se mide como una proporción del volumen total y sus

grados elevados pueden comprometer la viabilidad del embrión (Giorgett C y col.

1995).

La fragmentación condiciona en sobremanera la calidad embrionaria estableciéndose

que la tasa de implantación baja si se transfieren embriones con más de un 10-20%

del espacio ocupado por fragmentos. (Staessen C y col.1992; Giorgetti C y col. 1995;

Ziebe S y col.1997).

Los embriones con mucha fragmentación presentan una mayor tasa de anomalías

cromosómicas, principalmente mosaicismos (Munné S y Cohen J 1998).



46

10. TRANSFERENCIA EMBRIONARIA

La transferencia embrionaria es el último paso de todo el proceso de reproducción

asistida en el laboratorio y puede realizarse en cualquier momento tras la división

embrionaria, normalmente es en D+3.

La transferencia se realiza vía vaginal y guiada ecográficamente por vía abdominal. No

requiere anestesia por lo que la paciente está consciente en todo momento y no debe sentir

dolor alguno.

En el laboratorio, en el interior de una cabina de flujo laminar y a la temperatura de

37ºC, previamente se dispone de un campo estéril donde se prepara el catéter de

transferencia embrionaria indicado para esta paciente en concreto. (Fig.10)

Fig. 10 Transferencia embrionaria


11. SOPORTE DE LA FASE LÚTEA

El ciclo de la mujer, como hemos visto anteriormente, consta de diferentes fases y es

después de la ovulación cuando comienza la fase lútea, también llamada luteínica, que dura

hasta el momento de la menstruación. Recibe el nombre de lútea, debido al cuerpo amarillo

o lúteo formado por los restos del óvulo expulsado del ovario y que produce diferentes

hormonas, entre ellas la progesterona. Esta hormona es la responsable de la transformación

del endometrio de la fase proliferativa a la fase secretora, necesaria para la implantación

del embrión.

Con respecto a esta transformación obligatoria, se conoce que cuando las mujeres

participan en un programa de FIV, en el acto de la punción folicular, la aspiración de las

células de la granulosa que rodean al ovocito y el uso de agonistas de la hormona

liberadora de gonadotropina (GnRh) puede interferir en la producción de progesterona

durante la fase lútea, haciendo que los niveles de dicha hormona disminuyan

considerablemente (García J y col. 1981). Este descenso de progesterona se traduce en

una menor probabilidad de implantación embrionaria y por lo tanto de embarazo (Ginsburg

KA 1992).

Otros estudios demuestran que cualquier protocolo de la estimulación ovárica, por sí

mismo, compromete el proceso de luteinización de los folículos ováricos, y por lo tanto

también la transformación adecuada del endometrio, independientemente de la aspiración

de los folículos (Beckers NG y col. 2003; Fauser BC y Devroey P 2003)

Consecuentemente, en tratamientos que utilizan la estimulación ovárica hay que

proporcionar suplementos hormonales durante la fase lútea para reemplazar las hormonas

naturales que les faltan. Dicho apoyo de la fase lútea se puede realizar administrando

gonadotropina coriónica humana (hCG) o más común, con progesterona, vía vaginal y/o

oral y/o intramuscular y/o transdermal (Daya S y Gunby J 1992).



48

12. OBJETIVOS

1.- Estudiar el efecto de la hormona de crecimiento (GH), administrada en la fase

folicular, en la calidad ovocitaria utilizando diferentes marcadores morfológicos, así como

la de los embriones resultantes de su fecundación con espermatozoides normales.

2.- Estudiar el efecto de la hormona de crecimiento (GH), administrada en la fase

proliferativa o folicular del desarrollo endometrial, para tratar de mejorar la implantación

embrionaria, utilizando un modelo fundado en el análisis de casos raros de fracasos

repetidos en el programa de ovodonación.

3.- Estudiar el efecto del agonista de la GnRH, administrado en la fase secretora o

lútea, para mejorar la receptividad uterina y por consiguiente la anidación del embrión.


MATERIAL Y METODOS



50

1. PARTICIPANTES

1.1. Estudio sobre el efecto de la hormona de crecimiento (GH) sobre

la calidad ovocitaria y embrionaria.

Estudio en 98 mujeres con problemas de fertilidad (Fig. 11).

Se establecieron dos grupos:

A) Un grupo de 52 mujeres con tratamiento complementario de GH durante la

estimulación ovárica.

B) Otro grupo de 46 mujeres sin tratamiento complementario de GH durante la

estimulación ovárica, como grupo control.

Características comunes a los grupos:

Mujeres entre 30 y 39 años, con índice de masa corporal, tiempo de esterilidad

recuento de folículos antrales, y niveles de AMH similares (Tabla 1).

Protocolos anteriores con fallo de implantación.

Técnica de FIV, microinyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI).

Morfología espermática dentro de los parámetros de la normalidad.

Criterios de exclusión:

Quedaron excluidas aquellas que sus parejas tenían azoospermia que requería

biopsia testicular.


Fig. 11 Diseño del estudio del efecto de la GH sobre la calidad ovocitaria: 98 mujeres

distribuidas entre dos grupos, A: 52 de ellas tratadas con GH y B: 46 sin GH como

grupo control

Pacientes

para evaluar

(n=104)

Excluidos (n=6)

Sin los criterios de exclusión (n=0).

Rehusaron participar (n=6)

Otras razones (n=0)

Aleatorio (n=98)

Asignados para el protocolo (n=52)

Recibieron protocolo (n=52).

No recibieron protocolo (n=0)

Asignados para el protocolo (n=46)

Recibieron protocolo (n=46).

No recibieron protocolo (n=0)

Sin llevar a cabo (n=0).

Protocolo discontinuo (n=0)

Sin llevar a cabo (n=0).

Protocolo discontinuo (n=0)

Analizados (n=52).

Excluidos del análisis (n=0)

Analizados (n=46).

Excluidos del análisis (n=0)

A

Con GH B

Control



52

1.2. Estudio del efecto de la hormona de crecimiento (GH) sobre la

receptividad uterina.

Estudio en 105 mujeres infértiles con programa de donación de ovocitos (Fig. 12).

Se establecieron dos grupos:

A) Un grupo de 70 mujeres con fallos repetidos de implantación (RIF). Dos

subgrupos de 35 mujeres tratadas con hormona de crecimiento (GH) y otras 35

sin GH.

B) Otro grupo de 35 mujeres como control positivo, siendo este su primer intento

con donación de ovocitos y sin antecedentes de RIF.


Mujeres con protocolo de donación de óvulos.

Receptoras de óvulos con edad entre 30 y 51 años.

Donantes de óvulos con edades inferiores a 25 años.

Donantes estimuladas con protocolos largos con agonistas.

Mujeres con dos fallos previos de implantación.

Dos grupos comparten características demográficas parecidas.


Transferencias de embriones en fresco.


Transferencias de embriones congelados.


Fig. 12 Diseño del estudio del efecto de la GH sobre la receptividad uterina: 105

mujeres distribuidas entre 2 grupos, A: 70 en dos subgrupos de 35 y 35, siendo uno de

los grupos tratados con GH y el otro sin GH y B: 35 sin GH como grupo control

Mujeres

infértiles

incluidas en el

estudio (n=105)

Mujeres con fracasos

repetidos de implantación

(n=70)

Mujeres con primer

intento de

ovodonación (n=35)

Grupo con GH

(n=35)

Grupo sin GH

(n=35) Grupo control

positivo (n=35)

Tratamientos de

FIV completados

(n=35)

Tratamientos de

FIV completados

(n=35)

Tratamientos de

FIV completados

(n=35)

Incluidos en el

análisis

(n=35)

Incluidos en el

análisis

(n=35)

Incluidos en el

análisis

(n=35)

Rec

luta

mie

nto

A

sig

nac

ión

Seg

uim

ien

to

An

ális

is

A B



54

1.3 Estudio sobre el efecto del agonista de la GnRH sobre la

receptividad uterina.

Estudio en 50 mujeres sometidas a una estimulación ovárica controlada por un antagonista

de GnRH y desencadenadas con la HCG (Fig. 13).

Se establecieron 2 grupos:

A) Grupo de 25 mujeres a las que se les somete a un ciclo de FIV con la

administración de no solo la progesterona (600 mg diarios) como en el

primer ciclo sino también con la administración de inyecciones diarias de

0.1mg de Triptorelina (Decapeptyl, Ipsen Pharma) durante 14 días desde el

día de la transferencia embrionaria.

B) Grupo de 25 mujeres a las que se les repite el mismo protocolo de soporte

de la fase lútea (600 mg diarios) como en el ciclo precedente pero sin usar

el agonista de la GnRH en la fase lútea.


Mujeres con edades comprendidas entre 25 y 40 años de edad.

Con valores hormonales dentro de la normalidad.

Todas las sometidas al estudio compartían un primer intento fallido de FIV por

mostrar bajos niveles de progesterona en el día 14 después de la transferencia

embrionaria, a pesar de tener un soporte de la fase lútea de 600 mg diarios

desde el mismo día de la transferencia.


Se utilizaron los mismos protocolos de estimulación ovárica, fecundación in

vitro y transferencia de los embriones.

En este estudio se han utilizado muestras de semen en fresco.


Todos los embriones transferidos son en fresco, tres días después de la punción

ovocitaria.


Parejas con factor masculino severo o con azoospermia obstructiva que

requirieran la recuperación de espermatozoides mediante biopsia testicular.

Contraindicaciones para la técnica de FIV, hiperprolactinemia, diabetes,

síndrome de Cushing, índice de masa corporal superior 30, enfermedad

tiroidea, endometriosis severa, presencia de pólipos uterinos, síndrome de

ovario poliquístico, adenomiosis, bajas respondedoras, mujeres de edad mayor

de 40 años.

Muestras de esperma congelado.

Ciclos con transferencia en estadio de blastocisto.



56

Fig. 13 Diseño del estudio del efecto del agonista de la GnRH sobre la receptividad

uterina. 50 mujeres en dos grupos, 25 con agonista de la GnRH y 25 de ellas sin el

apoyo de la fase lútea.

Casos sin agonista de la

GnRH (n=25)

Tratamientos de FIV completados

(n=25)

Incluidas en el

análisis (n=25)

Casos con agonista de la

GnRH (n=25)

Tratamientos de

FIV completados

(n=25)

Incluidas en el

análisis (n=25)

Mujeres incluidas

en el estudio

(n=50)

A B


2. PROTOCOLOS DE ESTIMULACIÓN OVÁRICA

Se han seguido dos tipos diferentes de estimulación ovárica, una usando los agonistas

de la GnRH empezando en la fase lútea y con una previa regulación negativa de la

pituitaria, y otra usando los antagonistas de la GnRH para prevenir un incremento

prematuro de la LH.

2.1 Protocolo largo con agonista de la GnRH

La baja regulación hipofisaria se logró con el uso diario de inyecciones de 0,1 mg. de

triptorelin (Decapeptyl 0,1 mg.; Ipsen Pharma, Barcelona, España) a partir de la fase lútea

del ciclo anterior al de la estimulación ovárica y se redujo a 0,05 mg. al día.

La dosis a partir del primer día de la regla. La gonadotrofina se inició 2-7 días después

del comienzo del sangrado. Esta terapia se llevó a cabo con el uso de FSH recombinante

(Puregon, Organon, Oss, Holanda o GONAL F; Serono, Roma, Italia) y HMG (Menopur;

Ferring Pharmaceuticals, Langley, Berkshire, Reino Unido). La dosis de FSH y HMG se

fueron continuamente adaptando en función de las concentraciones séricas de E2 y LH y la

dinámica del crecimiento folicular ovárico, tal como se describe (Tesarik J y Mendoza C

2002 con el objetivo de mantener la concentración sérica de LH en el rango de 0.5-1.5 UI l-

1 en todo el período de estimulación. La ovulación se indujo con 250 μg de HCG

recombinante cuando al menos tres folículos un diámetro medio de 18 mm. El tratamiento

con triptorelin se detuvo el día de la administración de la HCG.

2.2 Protocolo con antagonista de la GnRH

La administración de FSH recombinante y de la HMG se inició en día 2 de sangrado

menstrual tras la retirada de la píldora anticonceptiva (Tri-Minulet; Wyeth Lederle,

Madrid, España), administrada durante el mes anterior al ciclo de estimulación ovárica. La

dosis de FSH y HMG se adapta continuamente en función de las concentraciones séricas

de E 2 y LH y de la dinámica del crecimiento folicular ovárico. Se desarrolla de la misma

manera que en el protocolo largo de la agonista de la GnRH (anteriormente descrito).



58

Con antagonistas de la GnRH (Orgalutran; Organon o Cetrotide, Serono) se inició el

día 5 con una dosis diaria de 0,25 mg, hasta un mínimo de tres folículos un diámetro de

18 mm. Entonces se indujo la ovulación con 250 μg de HCG recombinante (Ovitrelle).


3. PUNCIÓN FOLICULAR

Alrededor de 36 horas tras la administración de hCG, se realiza la punción folicular

tras la sedación de la paciente.

El protocolo de laboratorio comienza el día previo a la punción, con el cultivo a 37º y

CO2 al 6% de los medios específicos para la recogida, eliminación de las células del

cúmulus oophorus y corona radiata (desnudación), tratamiento y cultivo de los ovocitos y

embriones. Se realiza en el quirófano en condiciones de esterilidad.

El material utilizado en quirófano es:

Una bomba de vacío. (Labotect 4014).

Set de punción (Labotect ref. 13438) unido a la bomba constituido un tapón de

silicona que tiene dos cánulas, una es la de la aguja de aspiración y otra es la que se

posiciona en la bomba. El tapón se introduce en un tubo estéril para hacer el vacío,

y es en él donde se transportan los líquidos foliculares hasta el laboratorio.

Equipo ecográfico (Hitachi EUB 525) porque la intervención se realiza vía vaginal

y guiada por el mismo.

Lo ideal es contar con un laboratorio que diste lo mínimo posible con el quirófano,

si no es el caso debemos tener un bloque térmico para garantizar el mantenimiento

de la temperatura en los líquidos foliculares y la revisión en campana estéril y bajo

la lupa.

El material utilizado en laboratorio es:

Cabina de flujo laminar con superficie calefactada. (K- System, L-126D).

Lupa binocular (Olympus SZX12).

Tubos de punción estériles. (Falcon, ref. 35 2001).

Placas petri de 100 x 20 mm. (Falcon, ref. 35 1005).



60

Placas petri de 4 pocillos.(Nunc, ref. 144444).

Micropipeta. (Piperman).

Puntas estériles. (Sarstedt, ref.70.760.202).

Medios de la placa Nunc: G-IVF plus, Gmops plus, (Vitrolife)

3.1 Preparación del material

Las placas petri de 4 pocillos con los medios de cultivo se preparan el día anterior a la

punción, una placa por paciente (si tiene gran cantidad de folículos se pueden preveer otras

placas.) y se colocan en un incubador de CO2 al 6% y 37ºC de temperatura.

La cabina de flujo debe tener una temperatura de 37ºC y en ella dispondremos los

demás materiales.

3.2 Proceso de obtención y lavado de los ovocitos

Se disponen en el interior de la cabina de flujo laminar el material que vamos a utilizar

en la punción para que tenga una temperatura similar a 37ºC.

Debajo de la lupa colocamos la placa petri de 100 x 20 mm e iremos vertiendo los

líquidos foliculares obtenidos en la punción. (Fig. 14)

Los ovocitos con su cumulus son perfectamente visibles a simple vista como una masa

refringente, aun así hay que verificar con la lupa que efectivamente se trata de un ovocito.

Inmediatamente localizado y verificado se introduce intentando transportar la menor

cantidad posible de sangre al medio de cultivo de lavado.

Una vez terminado el chequeo del contenido de todos los tubos, los ovocitos

inicialmente transferidos en el medio de lavado, se pasarán uno a uno a otro medio de

cultivo que los mantiene equilibrados y donde estarán hasta su desnudación.


Los ovocitos maduros (metafase II) fueron incubados a 37 ° C (entre 3 y 6 horas) en

medio de cultivo G-IVF (Vitrolife) equilibrado con un 6% de CO2 en el aire.

Posteriormente se desnudaron las células del cumulus oophorus y la corona radiata, como

se describe (Tesarik J y Mendoza C 2002) Y se incubaron en medio G1 (Vitrolife) con el

mismo % de CO2.

Fig. 14 Búsqueda de los ovocitos en los líquidos foliculares durante la punción

folicular



62

4. MICROINYECIÓN INTRACITOPLASMÁTICA DEL

ESPERMATOZOIDE

La técnica utilizada de fecundación en el laboratorio fue la microinyección

intracitoplasmática del espermatozoide o ICSI. Es la técnica de Reproducción Asistida en

la que se introduce un espermatozoide mediante una técnica de micromanipulación en cada

uno de los ovocitos de la paciente.

4.1 Preparación de la muestra de esperma.

El material utilizado es:

Tubos estériles. (Falcon, ref. 35 2095).

Pipetas Pasteur (Falcon, ref. 35 7575).

Medio de cultivo para lavar (GAMETE, Vitrolife).

Centrifuga (Sigma 2-5).

La muestra de semen del paciente debe estar licuada totalmente para poder ser tratada,

es decir alrededor de 20 minutos después de ser obtenida. Inmediatamente se lava con

medio de cultivo adecuado de varias maneras. El método más utilizado es el de SWIN-UP

que consiste en introducir en un tubo estéril alrededor de 1 ml de muestra y diluirla con 9

ml de medio de lavado. Se agita bien el tubo y se centrifuga a 1500 rpm durante 5 min. Se

desprecia el sobrenadante y encima del precipitado se coloca, con mucho cuidado de no

alterar el precipitado, una pequeña cantidad de medio de cultivo (alrededor de 0,5 ml), y

que forma una capa superficial a la que nadarán los espermatozoides más fuertes. Es una

manera rápida y sencilla de selección de los mejores espermatozoides.


4.2 Preparación de los ovocitos.


Hialuronidasa (Hyase, Vitrolife).

Medio de dilución de la Hialuronidasa (Gmops, Vitrolife).

Pipeta de desnudación (Stripper, Mid-Atlantics Diagnostics, Inc.).

Capilares para el stripper (Strippers Tips #MXL3-135μm, Mid-Atlantics

Diagnostics, Inc.).

Micropipeta (Piperman).

Puntas estériles. (Sarstedt, ref.70.760.202).

Incubador (Labotect C-200).

Los ovocitos deben desnudarse antes de la microinyección. La desnudación consiste en

la eliminación de las células del cumulus oophorus que los rodea. Para ello se utiliza

hialuronidasa que las disgrega. La corona radiata desaparece cuando se hace pasar por un

capilar de diámetro parecido al del ovocito (135µm).

Este proceso es delicado y puede ocurrir la fracturación de la zona pelúcida (FZP), que

nos indica una baja calidad ovocitaria (Mendoza C y Testart J 1986).

Una vez los ovocitos desnudados se puede observar su estado de calidad y madurez,

desde (vesícula germinativa, metafase I, metafase II, atrésico, FZP, anómalo…). Los

ovocitos desnudados deben permanecer un corto tiempo en el incubador para recuperarse,

lo suficiente para preparar las agujas y la placa de microinyección.



64

4.3 Preparación del sistema y proceso de microinyección.


Microscopio invertido, (Olympus IX71).

Microinyector (Narishige, IM-9B).

Pletina calefactada (Tokai, MATS-U55R30).

Microagujas (ICSI MIC 35-30 y HOLDING SMP- SM – 30, Humagen).

Placa petri (Falcon, 35 1008).

Gotas de Polyvinylpirrolidona (PVP) para espermatozoides (ICSI, Vitrolife).

Gotas para ovocitos (Gmops, Vitrolife).

Aceite (Ovoil, Vitrolife).

La ICSI se realiza en un microscopio invertido en una mesa antivibratoria, con un

sistema hidráulico de jeringas (microinyector), una de sujeción y otra de inyección. Se

debe mantener en todo momento una temperatura de 37ºC que se consigue gracias a una

pletina calentada.

Las microagujas son individuales para cada paciente y se colocan de la manera

siguiente: a la izquierda la de HOLDING (sujeción del ovocito) y a la derecha la de ICSI

(inyección del espermatozoide), quedando en el mismo plano, enfrentadas en línea recta.

Para la placa de ICSI se utiliza la parte superior de la placa petri pequeña de 35 x 10

mm. En ella, se realizan varias microgotas: dos de Polyvinylpirrolidona (PVP) que es una

sustancia viscosa que mantiene a los espermatozoides en un estado menos móvil, la

primera es donde se coloca una ínfima parte del la muestra y la segunda se utilizará para

cortar la cola del espermatozoide y montarlo en la micropipeta para la inyección. Las

demás gotas serán de Gmops un medio específico para el mantenimiento de los ovocitos


durante la inyección. La cantidad de gotas variará dependiendo del número de ovocito a

inyectar.

El conjunto de todas las gotas se cubre con aceite hasta el borde de la placa, para evitar

la desecación. Una vez se ha preparado la placa dispondremos en ella los ovocitos y la

colocaremos en el inyector.

Proceso de inyección espermática:

Las agujas se colocan en el mismo plano donde están los ovocitos y los

espermatozoides.

El espermatozoide se aspira en la pipeta de inyección toma el espermatozoide y se pasa

a la gota de PVP donde se deposita y se le pisa la cola con la misma aguja con un

movimiento rápido hacia los lados.

Esta técnica de inmovilización del espermatozoide es imprescindible para que haya una

eficiente fertilización del óvulo. La inmovilización provoca en el espermatozoide la rotura

de su membrana plasmática y liberación de factores que inducen en el ovocito las

oscilaciones de Ca2+

, es decir, la activación del mismo. Por otro lado, la inmovilización

provoca también una activación citosólica en el espermatozoide que permite la exposición

del centriolo proximal al ovocito para la consecuente distribución cromosómica en el

embrión.

En la gota del ovocito se introduce la pipeta de HOLDING que sujeta el ovocito

siempre en una posición particular para no interceder con el huso acromático.

Las agujas entonces deben quedar enfrentadas perfectamente en línea recta y con la

misma inclinación. En la aguja de inyección se lleva el espermatozoide hasta la misma

punta y entonces se presiona sobre la zona pelúcida hasta que puede superarla e introducir

la punta en el citoplasma. Para poder romper la membrana plasmática se absorbe con la

pipeta de inyección hasta notar que se relaja y entonces se introduce la aguja hasta más o

menos la mitad del citoplasma donde se irá expulsando el citoplasma, cuando se va

acercando la cabeza del espermatozoide se introducirá la aguja hasta casi tocar el extremo



66

distal del ovocito y es ahí donde se alojará (Fig. 15). Se retira la microaguja lentamente

para no arrastrar el espermatozoide y se inicia de nuevo todo el proceso con los demás

ovocitos.

Fig. 15 Microinyección intracitoplasmática del espermatozoide.


5. MARCADORES DE CALIDAD OVOCITARIA

Una fase importante en las técnicas de reproducción asistida es la elección de los

ovocitos de buena calidad con el fin de poder obtener embriones con un óptimo desarrollo.

Generalmente, los ovocitos son evaluados, por toda la comunidad científica, basándose

en 6 parámetros como son, tamaño y forma del ovocito (Ebner T y col, 2008; Balakier H y

col, 2002), calidad del citoplasma (Esfandiari N y col, 2006; Wallbutton S y Kasraie J

2010; Fancsovits P y col. 2011), estructura del espacio perivitelino (Farhi J y col. 2002),

zona pelúcida (Balakier H y col. 2012) y morfología del corpúsculo polar (Ciotti PM y col.

2004; Navarro PA y col. 2009). Nosotros hemos añadido otros parámetros como, presencia

del retículo endoplasmático, calidad de la membrana plasmática, recepción del

espermatozoide en el citoplasma del ovocito y cono de inyección. Al incluir dichos

parámetros, en total 9, hemos observado diferencias significativas que nos han dado a

entender que la posterior elección de los embriones para la transferencia uterina, era más

idónea para poder obtener un embarazo evolutivo. Dichos resultados no están incluidos en

este trabajo de tesis ya que aún no están publicados.



68

5.1 Tamaño y forma del ovocito

El diámetro de los ovocitos se ha valorado según su proximidad a las 1500 micras, que

corresponden a un ovocito maduro y forma ovoide (Fig. 16 y 17).

Fig. 16 Ovocito con tamaño y forma normal


Fig. 17 Ovocito con tamaño y forma anormal



70

5.2 Citoplasma

Esta variable se ha puntuado teniendo en cuenta la homogeneidad granular del mismo,

así como la presencia de inclusiones y vacuolas (Fig. 18 y 19).

Fig. 18 Ovocito con citoplasma normal


Fig. 19 Ovocito con citoplasma con inclusiones



72

5.3 Primer Corpúsculo polar

Se ha valorado según tamaño y forma adecuados y sin fragmentación (Fig. 20 y 21).

Fig. 20 Ovocito con único y bien formado primer corpúsculo polar


Fig. 21 Ovocito con primer corpúsculo polar fragmentado



74

5.4 Zona pelúcida

Este marcador se ha valorado según su tamaño, densidad y presencia de septos (Fig. 22

y 23).

Fig. 22 Ovocito con zona pelúcida con tamaño y densidad normal


Fig. 23 Ovocito con zona pelúcida con presencia de septo



76

5.5 Espacio perivitelino

En esta variable se ha tenido en cuenta un tamaño adecuado y sin inclusiones (Fig. 24 y

25).

Fig. 24 Ovocito con espacio perivitelino correcto


Fig. 25 Ovocito con espacio perivitelino ampliado



78

5.6 Retículo endoplasmático

Se ha valorado según su presencia (Fig. 26).

Fig. 26 Ovocito con presencia de retículo endoplasmático


5.7 Membrana plasmática

En este marcador se ha observado la elasticidad que presenta el ovocito en el momento

de introducir la aguja de microinyección (Fig. 27).

Fig. 27 ICSI, acercamiento del espermatozoide al extremo de la aguja y comienzo de

la maniobra de rotura de la membrana plasmática



80

5.8 Recepción del espermatozoide

Dicho marcador se ha valorado dependiendo de la capacidad de inclusión del

espermatozoide en el momento en que es depositado en el interior del citoplasma mediante

la microinyección del mismo. Se da el valor más alto a aquel en el que el desplazamiento

del espermatozoide es menor al dejarlo en el interior del citoplasma ovocitario (Fig. 28).

Fig. 28 ICSI, retirada de la aguja, se observa la recepción del espermatozoide en la

zona opuesta a la de inyección.


5.9 Cono de inyección

Esta variable se refiere a la impresión que queda en el ovocito después de retirar la

aguja de microinyección y se da el valor más alto al que presenta un cono mayor lo que se

traduce en una mayor resistencia (Fig. 29 y 30).

Fig. 29 Ovocito con cono de inyección correcto



82

Fig. 30 Ovocito con pequeño cono de inyección


Cada uno de estos marcadores han sido valorados como: 1 si es positivo, 0 si es

intermedio y -1 si es negativo, por lo que al tener 9 marcadores tendremos un intervalo

entre +9 a -9.

Por ello hemos creado una clasificación acumulativa basada en cada uno de estos

marcadores y catalogado a los ovocitos de la siguiente forma:

Ovocito tipo A: valor desde + 9 a +5

Ovocito tipo B: valor desde +4 a 0

Ovocito tipo C: valor desde -1 a -5

Ovocito tipo D: valor desde -6 a -9



84

6. MARCADORES DE CALIDAD EN EL CIGOTO

(Día 1 del desarrollo)

Para establecer la calidad de los cigotos es importante tener en cuenta los pronúcleos y

los corpúsculos polares.

6.1 Pronúcleos

Los pronúcleos deben ser dos, estar situados juntos y ser del mismo tamaño.

Los zigotos se evaluaron de acuerdo a los criterios basados en el número y la

distribución de los nucléolos en el pronúcleos, según Tesarik J y Greco E 1999). (Fig. 31)

El patrón pronuclear de los zigotos se consideró el más importante para elegir los

embriones más viables, de acuerdo con los datos publicados previamente (Tesarik J y

Greco E 1999; Tesarik J y col. 2000; Balaban B y col. 2004).

Este patrón determina los rangos normales de la variabilidad de los pronúcleos,

definido por el análisis de los zigotos que han sido transferidos y que tienen un 100% de

implantación (modelo 0). El bloqueo de los embriones procedentes del modelo 0 es tan

sólo del 8.5% en comparación con el 31.6, 21.9, 30, 20.5, y 24.1 % de los modelos del 1 al

5 respectivamente. La tasa de embarazo clínico en el modelo 0 llega al 50% en relación

con el 9% en los demás ciclos donde se ha transferido embriones de los otros modelos.

El sistema de puntuación se ha simplificado agrupando todos los patrones anormales

(Tesarik J y col. 2000), por lo que todos los embriones fueron asignados a uno de los dos

grupos: embriones de buena morfología y embriones de mala morfología.


Fig. 31 Modelo de gradación pronuclear propuesto de Tesarik J y Greco E 1999.



86

6.2 Corpúsculos polares

Los corpúsculos polares deben ser dos, pueden estar juntos o separados y no deben

estar fragmentados (Fig. 32).

Fig. 32 Embrión en día 1 de desarrollo con dos pronúcleos y dos corpúsculos polares.


7. MARCADORES DE CALIDAD DE LOS EMBRIONES

(Día 3 del desarrollo)

Los embriones han sido catalogados según el esquema de gradación de ASEBIR

(Asociación para el estudio de la biología de la reproducción) (Fig. 33).

Fig. 33 Esquema de gradación embrionaria de D+2 y D+3 ASEBIR.

(1) “EE” = Estadio-específico.

(2) “bn” = Binucleada. Excepción a la regla: cualquier multinucleación conlleva

clasificar como D.

(3) Por ejemplo: anillo acitoplasmático muy evidente en D+3. Las vacuolas no se

valoran. Excepción a la regla de no penalización por combinación de varias

características negativas.



88

Ejemplos de embriones en D+3 clasificados con ASEBIR:

Embriones Tipo A

Embrión Tipo B


Embrión Tipo C

Embrión Tipo D



90

8. CULTIVO EMBRIONARIO


Medio de cultivo embrionario hasta el día 3, G1 plus (Vitrolife).

Medio de cultivo embrionario a partir del día 3 (más de 8 células), G2 plus

(Vitrolife).

Medio de cultivo para la transferencia, G2 plus (Vitrolife).

Catéter de transferencia embrionaria, Cook ref. K-JETS-7019-SIVF .

La fecundación se evaluó 16-18 h después de ICSI, distinguiendo los embriones de

buena y de mala calidad (véase la sección “Selección de embrión para la transferencia “).

Después de cambiarlos de medio el día de la fecundación, los embriones se cultivaron

en este medio y en el día 2 o primer día de la división se vuelve a cambiar a medio nuevo

hasta el día 3 después de la ICSI. En el momento del cambio de medio (día 2), se vuelve a

evaluar la calidad del embrión (véase la sección “Selección de embrión para la

transferencia”). La transferencia de embriones se realizó 3 días después de la ICSI con el

uso del catéter de transferencia embrionaria y con un seguimiento de ecografía

transabdominal. Se transfirieron de uno a tres embriones en cada ciclo. En los casos en los

que fue conveniente, los embriones no transferidos, se congelaron para su posterior

transferencia. Este estudio, sin embargo, sólo se refiere a las transferencias de embriones

frescos.


9. SELECION DE LOS EMBRIONES PARA LA

TRANSFERENCIA

La selección de los embriones se realiza en el momento previo a la transferencia

estableciendo una comunicación con la paciente y quedando fijada la cantidad de estos a

transferir, según cada caso particular.

Para elegir los embriones de la mejor calidad posible se efectuaron 3 evaluaciones

sucesivas para cada uno de ellos: la calidad del ovocito correspondiente (según indicamos

en la sección 5 de Material y Métodos), la calidad del cigoto resultante de su fecundación

(según mostramos en la sección 6 de Material y Métodos), y la calidad del embrión el día

de la transferencia (según criterios mostrados en la sección 7 de Material y Métodos).

La calidad embrionaria fue evaluada en dos ocasiones, primero en el momento del

cambio de medio, 2 días después de la ICSI y el segundo 10-30 min. antes de la

transferencia al útero, 3 días después de la ICSI.

Los embriones que tenían más de 3 células en día 2 y más de 6 células en día 3, y que

mostraron <10% de fragmentación celular se consideraron de buena calidad y fueron

seleccionados para la transferencia.

En una parte de este estudio (Efecto de GH sobre la calidad embrionaria) se utilizó

también un análisis morfocinético de la división embrionaria, realizado en un incubador

cinematográfico capaz de grabar imágenes sucesivas de embriones en intervalos variables

de tiempo (Primovision Vitrolife) (Fig.34)

Antes de la transferencia se realiza una ecografía vaginal para medir la distancia desde

la entrada en el cuello del útero hasta su destino, con el objeto de depositar los embriones

en la zona donde el espesor del endometrio sea mejor.



92

Fig. 34 Sistema de monitorización time lapse de la evolución embrionaria.


10. ADMINISTRACIÓN DE SUPLEMENTOS DE LA

FASE LÚTEA

Independientemente de si se utilizó un agonista de la GnRH como apoyo o no de la

fase lútea, a todas las mujeres se les dio 4 mg/día de Estradiol (Progynova; Schering) y

400 mg/día de progesterona vía vaginal (Utrogestan; Laboratoires Besins-Iscovesco)

diarios a partir del día de la punción ovocitaria y durante 17 días. Además, todas las

mujeres recibieron una inyección de 250 μg de HCG Recombinante (Ovitrelle) el día de la

transferencia de los embriones.



94

11. DETERMINACIONES HORMONALES

A todas las pacientes se les realizan varias determinaciones hormonales, en el día de la

transferencia embrionaria, a los 7 y a los 14 días posteriores.

Las concentraciones séricas de 17β-E2, progesterona y β-HCG se determinaron con el

uso de kits comerciales de inmunoensayo enzimático (Diagnostic Product Corporation,

Los Angeles, CA, EE.UU.).

Los coeficientes de variación (CV) intraensayo e interensayo fueron, respectivamente,

3,8 y 5,6% para E2, 3,7 y 4,0% para la progesterona, y el 3,5 y el 4,1% para β-HCG.

Todas las mediciones se tomaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.


12. ANALISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS

En el efecto de GH durante la estimulación sobre la calidad de ovocitos, cigotos y

embriones, incluyendo las tasas de embarazo clínico, parto, implantación clínica y

nacimiento.

El análisis se hizo con el programa SPS, versión 16.0, para Microsoft Office (SPSS

Inc., Chicago, IL, USA). Los valores cuantitativos se presentaron como media ± deviación

estándar (SD). Los valores cualitativos están expresados como porcentajes.

Diferencia entre diferentes grupos se analizaron por el test-t de Student, en cuanto a los

valores cuantitativos, y por el test X2, en cuanto a los valores cualitativos

(porcentajes).Todos las pruebas fueron de dos colas. Los valores de P<0.05 se

consideraron como estadísticamente significantes.

En el efecto de GH sobre receptividad uterina.

Los análisis estadísticos se realizaron en SPSS 20 para Macintosh (IBM, Chicago, IL).

La mayoría de las variables continuas (por ejemplo, la edad de los pacientes y el número

total de embriones) se distribuyeron normalmente. Esas variables continuas que no se

distribuyeron normalmente (por ejemplo, el grosor del endometrio) se modificaron. El

análisis de varianza de una vía se utilizó para explorar las diferencias en la distribución de

las características de línea de base y ciclo entre los grupos. En caso de diferencias

significativas entre los grupos, se utilizó la prueba post hoc de Tukey para explorar las

diferencias entre los subgrupos.

Se realizó una regresión logística para analizar las diferencias en las medidas del

resultado entre los pacientes con GH y los controles, en los que la edad del paciente, la

edad de la pareja, y el número de embriones transferidos se ingresaron como factores de

confusión.

Se utilizó la regresión logística binaria para determinar los odds ratios (OR) y los

intervalos de confianza del 95% (C.I.) de tener mejores resultados en el grupo de pacientes



96

con GH en comparación con el grupo sin GH. Estos análisis se ajustaron a la edad del

paciente (modelo 1) y, además, a la edad de la pareja y al número de embriones

transferidos (modelo 2).

En todos los análisis, el valor de p, 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

En el efecto del agonista de la GnRH sobre la fase lútea

Las variables continuas se presentaron como medias ± desviaciones estándar (DE) y se

compararon mediante la prueba U de Mann-Whitney o la prueba de suma de rangos de

pares combinados de Wilcoxon. Los valores proporcionales se compararon mediante chi-

cuadrado de Pearson o chi-cuadrado de McNemar. P <0.05 fue considerado

estadísticamente significativo.


RESULTADOS



98

1. EFECTO DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO SOBRE LA

CALIDAD DE LOS OVOCITOS Y EMBRIONES.

Los dos grupos del estudio no muestran diferencias significativas entre ellos respecto a

las edades de las mujeres, índice de masa corporal, tiempo y causa de infertilidad, número

de folículos antrales y valor de la hormona antimulleriana (AMH) (Tabla 1).

En la Tabla 2 se observa que la administración de la hormona de crecimiento (GH)

recombinante durante la estimulación ovárica sobre la calidad ovocitaria, no influye en la

obtención del número total ovocitos maduros (Metafase II) en mujeres tratadas y no

tratadas, aunque si existe un mayor porcentaje de los ovocitos de buena calidad tipo A

(p<0.05) y reducción de los de mala calidad tipo D (p<0.01), aumentando el tipo B y

disminuyendo el tipo C, pero no significativamente.

Del mismo modo, se han analizado el efecto de la GH sobre la calidad de los cigotos

obtenidos tras la fecundación de los ovocitos anteriores (Tabla 3). Después de la

fecundación con espermatozoides normales, se observan un mayor número de cigotos

provenientes de la estimulación con GH (p<0.05), en comparación con el grupo control y

sobretodo un mayor número de cigotos con un patrón normal de distribución de nucléolos

en el interior de los pronúcleos (p<0.01).

Además, el análisis morfocinético del desarrollo embrionario entre el día de la

fecundación y el día de la transferencia de los embriones en el útero, también demuestra

que se obtienen más embriones provenientes de las estimulaciones con la adicción de GH

que sin ella (5,9 versus 4,7)(p<0.05), y un aumento significativo de los embriones de Tipo

A (3,2 versus 1,4) (<0.01), mientras que disminuyen el porcentaje de embriones Tipo C y

D , en comparación con embriones del grupo control (p<0.05) (Tabla 4).

El efecto del tratamiento con GH durante la estimulación ovárica sobre la calidad de

los embriones transferidos se muestra en la Tabla 5. Se observa que no hay diferencias

significativas en cuanto al número de embriones transferidos por paciente, pero si existen


diferencias significativas (p<0.05) en cuanto a la calidad de los embriones transferidos,

siendo mayor el número de embriones Tipo A transferidos en el grupo tratado con GH,

respecto al grupo control (1.8 versus 1.0) (p<0.05). Los embriones transferidos Tipo B y C

son significativamente menores (p<0.01), en las pacientes tratadas con GH.

La Tabla 6 muestra el efecto del tratamiento con GH sobre la tasa de embarazos

clínicos (número de embarazos clínicos o saco con embrión con actividad cardiaca

dividido por el número de transferencias embrionarias) y tasa de partos, siendo ambos

porcentajes más elevados significativamente (p<0.01) en el grupo de mujeres tratadas con

GH.

En la Tabla 7 se muestra el efecto del tratamiento con la GH sobre la implantación

clínica y de nacimientos. Los resultados muestran mayores porcentajes de implantación

clínica y de nacimientos (p<0.01), en mujeres tratadas con GH respecto a las no tratadas.



100

Tabla 1. Características de base de las pacientes tratadas y no tratadas con GH 1.

Tratamiento Edad

(Años)

IMC

(kg/m2)

Tiempo de

infertilidad

(Años)

NFA AMH suero

(ng/ml)

Sin GH 34.5±4.9 21.9±4.2 3.9±1.8 6.8±4.1 2.3±1.4

Con GH 34.8±4.1 22.2±4.3 4.1±2.1 6.4±4.0 2.2±1.5

Valor de P >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05

1 Valores numéricos son Media ± SD.

NFA: número de folículos antrales.

Tabla 2. Efecto del tratamiento con la GH durante la estimulación ovárica sobre la

calidad de los ovocitos.

Ovocitos Metafase II recuperados por paciente 1

Tratamiento Total Tipo A Tipo B Tipo C Tipo D

Sin GH 6.5±3.2 (100) 2.9±2.7 (45) 1.6 ±1.4 (25) 1.0±1.3 (15) 1.0±1.3 (15)

Con GH 6.9±2.9 (100) 4.1±2.9 (59) 1.7±1.7 (25) 0.8±0.9 (12) 0.3±0.6 (4)

Valor de P >0.05 <0.05 >0.05 >0.05 <0.01


Tabla 3. Efecto del tratamiento con GH durante la estimulación ovárica sobre la

calidad de la fecundación de los cigotos.

Cigotos con patrón pronuclear normal y anormal alcanzado por paciente 1

Tratamiento Total Patrón normal Patrón anormal

Sin GH 4.6±2.5 (100) 0.6±0.8 (13) 4.0±2.0 (87)

Con GH 5.8±2.5 (100) 1.4±1.2 (24) 4.4±2.4 (76)

Valor de P <0.05 <0.01 >0.05




calidad de los embriones.

Embriones conseguidos por paciente 1

Tratamiento Total %Tipo A %Tipo B %Tipo C %Tipo D

Sin GH 4.7±2.5 (100) 1.4±1.2 (30) 1.7±1.6 (36) 1.0±0.8 (21) 0.6±0.8 (13)

Con GH 5.9±2.4 (100) 3.2±2.1 (54) 1.9±1.4 (32) 0.6±0.8 (10) 0.3±1.6 (4)

Valor de P <0.05 <0.01 >0.05 <0.05 <0.05



calidad de los embriones transferidos.

Embriones transferidos por paciente 1

Tratamiento Total Tipo A Tipo B Tipo C

Sin GH 2.4±0.6 (100) 1.0±1.1 (42) 0.9±0.7 (37) 0.5±0.7 (21)

Con GH 2.2±0.6 (100) 1.8±0.8 (82) 0.3±0.6 (14) 0.1±0.1 (4)

Valor de P >0.05 <0.05 <0.01 <0.01


Tabla 6. Efecto del tratamiento con la GH sobre la tasa de embarazos clínicos y de

partos.

Tratamiento

Nº de

transferencias

de embriones

Embarazos

clínicos Partos

Tasa de

embarazos

clínicos

Tasa de

Partos

Sin GH 46 5 3 10.9% 6.5%

Con GH 52 22 18 42.3% 34.6%

Valor de P <0.01 <0.01



102

Tabla 7. Efecto del tratamiento con la GH sobre la implantación clínica y de

nacimientos.

Tratamiento Embriones

transferidos

Sacos

gestacionales

con latido

cardiaco

positivo

Niños

nacidos

Tasa de

implantación

clínica

Tasa de

nacimientos

Sin GH 110 5 3 4.5% 2.7%

Con GH 104 22 18 21.2% 17.3%

Valor de P <0.01 <0.01


2. EFECTO DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO SOBRE LA

RECEPTIVIDAD UTERINA

En la Tabla 8, se observa que los tres grupos del estudio no muestran diferencias

significativas entre ellos respecto a las edades de las mujeres y de sus parejas masculinas.

Las mujeres del grupo con GH tienen una edades de 42.2 ± 4.7 años, mientras que las del

grupo sin GH tienen un rango de edad de 42.4 ± 3.7 años, el grupo control tiene edades de

43.8 ± 2.5 años. Los maridos tienen 44.7 ± 7.4 años en el grupo con GH, 45.1 ± 5.4 años

en el grupo sin GH y 47.1 ± 5 años en el grupo control. Los tres grupos son homogéneos

en relación a la duración y causa de su infertilidad, así como en el índice de masa corporal

y el porcentaje de fumadores (Tabla 8). Ningún paciente abandonó el estudio ni hubo que

excluirlo.

En la Tabla 9, se observa que las mujeres tratadas con GH desarrollaban un

endometrio significativamente más espeso comparado con las del grupo que no recibieron

GH (p<0.05). De hecho, este grupo tiene valores similares comparándolos con el grupo

control positivo (9.3 ± 1.5 mm y 9.4 ± 1.7 mm, respectivamente). El grupo que no recibió

la GH tuvieron un espesor del endometrio inferior 8.6 ± 1 mm.

Del mismo modo, se observa en las pacientes tratadas con GH un aumento

significativo (p<0.001), en las tasas de embarazo y de nacimiento en comparación con el

grupo de mujeres sin GH, recibiendo el mismo número de embriones provenientes de los

ovocitos donados de la misma calidad y cuyo útero fue preparado mediante los mismos

protocolos excepto la omisión de GH. (Tabla 9).

Al analizar los tres grupos también encontramos diferencias significativas (p<0.001),

en los porcentajes de embarazo, de partos y de niños nacidos vivos, según se muestra en la

Tabla 9. El análisis pediátrico neonatal no ha detectado ninguna anomalía en los niños

nacidos.

En la Tabla 10 se expone un resumen de las tasas de éxito del tratamiento en los tres

grupos: pacientes con RIF sin GH, pacientes con RIF y con GH y pacientes control sin RIF



104

y sin GH. Se puede observar que las pacientes del grupo con RIF en los que no se usó GH

tuvieron tasas de éxito del tratamiento inferiores los otros dos grupos, en términos

generales, es decir en tasa de embarazo, tasa de implantación, tasa de embarazo en curso,

tasa de implantación en curso, tasa de nacimientos vivos y tasa de bebés nacidos.

Al comparar las posibilidades de éxito del tratamiento entre mujeres infértiles con GH

frente a las mujeres sin GH, existe una mayor tasa de βHCG positiva (p< 0.001), latido

cardiaco positivo (p< 0.002) y nacimientos vivos (p< 0.002), en mujeres tratadas con GH

(p< 0.001) (Tabla 11 y Fig.35).

Estas mejoras en los resultados de los tratamientos con GH deben ser posibles gracias

a la administración de la GH ya que se utilizaron solo ovocitos de donante en las que no se

había usado la GH.

Sin embargo, como se esperaba las tasas de éxito en el grupo de RIF con GH fueron

algo menores en comparación al control positivo que era el grupo que se sometía a su

primer tratamiento de donación de óvulos (Tabla 10). No se detectó ninguna anomalía en

los niños recién nacidos, ni durante su primer año de vida.


Fig. 35 Tasas de un mejor resultado del tratamiento después de la administración de

GH. Las pacientes sin GH se establecieron como grupo de referencia en los análisis y

se representan gráficamente mediante la línea discontinua. Las mujeres con RIF

tratadas con GH en el programa de ovocitos donados demuestran 5 veces más

probabilidades de obtener una prueba de embarazo positiva y un parto vivo que las

mujeres en el grupo sin GH.

Modelo 1: edad de la paciente Modelo 2: edad del paciente y

embriones transferidos

Sin GH Con GH Sin GH Con GH

Ta

sa d

e β

HC

G p

osi

tiv

a e

n c

urs

o

Ta

sa d

e n

aci

do

s v

ivo

s en

cu

rso



106

Tabla 8. Características de base de las pacientes tratadas, no tratadas con GH y

grupo control sobre la receptividad uterina1.

Tratamiento Edad (Años) IMC (kg/m2)

Tiempo de infertilidad

(Años)

Sin GH 42.4±3.7 22.1±3.2 4.9±2.8

Con GH 42.2±4.7 21.8±4.4 4.8±3.1

Control

positivo 43.8±2.5 22.0±3.1 4.7±2.9

Valor de P >0.05 >0.05 >0.05


Tabla 9. Características clínicas de los tres grupos de estudio (n= 35

en cada grupo) en ciclos de ovodonación.

aDiferencias significativas entre pacientes sin GH vs. Control positivo en una comparación múltiple

en el test post hoc.

bDiferencias significativas entre pacientes sin GH vs. Pacientes con GH en una comparación

múltiple en el test post hoc.

Pacientes

con GH

Pacientes Sin

GH

Control

positivo

Valor P

Media del espesor

endometrial (mm)

9.3 (1.5) 8.6 (1.0) 9.4 (1.7) <0.05b

Nº Embriones

obtenidos

7.9 (2.2) 8.2 (1.5) 8.3 (1.3) 0.643

% Embriones

transferidos

<0.05 a

1 2 (5.7%) 0 (0%) 5 (14.3%)

2 26 (74.3%) 27 (77.1%) 27 (77.1%)

3 7 (20%) 8 (22.9%) 3 (8.6%)

% βHCG positiva 19 (54.3%) 6 (17.1%) 26 (74.3%) <0.001 a,b

% Latido cardiaco

positivo

18 (51.4%) 6 (17.1%) 25 (71.4%) <0.001 a,b

% Nº de sacos <0.001 a,b

1 13 (37.1%) 4 (11.4%) 17 (48.6%)

2 6 (7.1%) 2 (5.7%) 9 (25.7%)

% Partos 18 (51.4%) 6 (17.1%) 24 (68.6%) <0.001 a,b

% Bebes nacidos <0.001 a,b

1 14 (40.0%) 5 (14.3%) 16 (45.7%)

2 4 (11.4%) 1 (2.9%) 8 (22.9%)


Tabla 10. Resumen de las tasas de éxito del tratamiento en los grupos

estudiados. Pacientes sin GH

(n=35)

Pacientes con

GH (n=35)

Control

positivo (n=35)

Tasa de embarazo

(nº de mujeres con βhCG

positiva

17.1% 54.3% 74.3%

Tasa de implantación

(nº sacos embrionarios) 10.3% 33.3% 51.5%

Tasa de embarazo en curso

(nº embarazos con actividad

cardiaca positiva)

17.1% 51.4% 71.4%

Tasa de implantación en

curso

(nº fetos vivos – 20 semanas)

7.7% 24.0% 36.8%

Tasa de aborto (nº de

abortos) 0% (0) 5.3% 3.8%

Tasa de nacimientos vivos

(nº de nacimientos vivos) 17.1% 51.4% 68.6%

Tasa de bebes nacidos

(nº de bebes nacidos) 9.0% 29.3% 47.1%

Tabla 11. Las posibilidades de éxito del tratamiento entre mujeres infértiles con

administración de GH durante el tratamiento de FIV frente a mujeres sin la

administración de la GH.

Valor de P Odds Ratio

Intervalo de

confianza

βhCG positiva 0.001 6.9 2.2 a 22.5

Latido cardiaco

positivo

0.002 6.4 2.0 a 20.9

Nacimientos vivos 0.002 6.4 2.0 a 20.9

Controlado /Ajustado según la edad de la paciente, edad del marido y número de embriones transferidos.



108

3. EFECTO DE LA GnRH SOBRE LA RECEPTIVIDAD UTERINA

En este estudio de los dos grupos, se han comparado casos y controles adecuadamente

pareados. Las pacientes tratadas con protocolos de estimulación con agonista de la GnRH

en la fase lútea y las no tratadas no difieren en sus características demográficas básicas ni

en sus ciclos de estimulación de la ovulación.

En la Tabla 12 se muestran la comparación entre la cantidad de ovocitos recuperados,

fertilizados y desarrollo embrionario en dos tentativas sucesivas de FIV con agonista de la

GnRH (25 pacientes) y sin agonista de la GnRH (25 pacientes), no existiendo diferencias

significativas en ambos grupos, en ninguno de los parámetros medidos.

Las concentraciones de progesterona en sangre, medidas el día de la transferencia de

embriones, no fueron significativamente diferentes entre las pacientes de los dos grupos

(Tabla 13). Sin embargo, 14 días después de la transferencia de embriones, las

concentraciones de progesterona fueron claramente mayores en el grupo tratado con el

agonista de la GnRH en la fase lútea (p<0.001) (Tabla 13).

Por otra parte, aunque la diferencia de la concentración de progesterona entre las

pacientes tratadas y aquellas no tratadas con el agonista de GnRH fue más notable en

aquellas pacientes que quedaron embarazadas (p<0.002), la concentración de la

progesterona después de la administración del agonista de GnRH fue significativamente

mayor incluso en las pacientes que no quedaron embarazadas (p<0.007) (Tabla 14).

A pesar de que en las dos tentativas consecutivas de FIV se obtuvieron un número

similar de embriones para transferir (Tabla 15) y de calidades similares (Tabla 12),

encontramos diferencias entre los porcentajes de embarazo (βGCH positiva) (p<0.001) y

embarazo clínico (embarazo evolutivo) (p<0.001) (Tabla 15), de tal forma que las tasas de

embarazo en las pacientes tratadas con el agonista de la GnRH aumentaron

significativamente en relación a las que no tuvieron ese soporte (Tabla 15).

Todos los embarazos clínicos dieron lugar al nacimiento de bebes sanos.


Tabla 12. Comparación entre cantidad de ovocitos recuperados, fertilizados y

desarrollo embrionario en dos tentativas sucesivas de FIV con agonista de la GnRH

(25 pacientes) y sin agonista de la GnRH (25 pacientes).

Agonista

GnRH

Total de

ovocitos a

Ovocitos

inyectados a

Cigotos

normales a

Total

embriones a

Embriones

de calidad a

No 9.8 ± 3.7 8.2 ± 2.9 6.9 ± 2.2 6.4 ± 2.0 4.0 ± 1.2

Si 10.0 ± 3.7 8.5 ± 2.9 7.0 ± 2.5 6.6 ± 2.1 4.2 ± 1.2

Valor p b NS NS NS NS NS

a Valores por desviación estándar.

b Los valores de p mayores de 0.05 se consideraran no significativos, NS.

Tabla 13. Comparación de los niveles de progesterona en las dos tentativas sucesivas

de FIV con agonista de la GnRH y sin agonista de la GnRH como soporte de la fase

lútea, realizado en 25 pacientes.

Agonista de la GnRH Progesterona en suero (ng/ml) a

Día de la transferencia

embrionaria b

Día 14 de la transferencia

embrionaria b

No 11.5 ± 2.7 13.3 ± 1.9

Si 12.0 ± 2.4 38.2 ± 14.6

Valor de p b NS <0.001


b Los valores de p mayores de 0.05 se consideraran no significativos, NS.



110

Tabla 14. Comparación de los niveles de progesterona en las dos tentativas sucesivas

de FIV con agonista de la GnRH y sin agonista de la GnRH como soporte de la fase

lútea, realizado en pacientes (n=12) en los que se había conseguido embarazo con el

agonista de la GnRH (n=12) y sin el agonista (n=10). Las 3 pacientes en las que se

consiguió embarazo en las dos tentativas no se han incluido.

Agonista de la GnRH Progesterona en suero del día 14 de la transferencia

embrionaria (ng/ml) a

Pacientes embarazadas Pacientes no embarazadas

No 14.0 ± 1.8 12.4 ± 1.6

Si 45.4 ± 12.0 25.9 ± 7.7

Valor de p <0.002 <0.007


Tabla 15. Comparación de porcentajes de los embarazos y embarazos clínicos en las

dos tentativas sucesivas de FIV con agonista de la GnRH y sin agonista de la GnRH

como soporte de la fase lútea, realizado en 25 pacientes.

Agonista de la

GnRH

Embriones

transferidos por

tentativa a

Embarazos b

βHCG positiva Embarazo evolutivo

No 2.1 ± 0.5 3 (12%) 0 (0%)

Si 2.2 ± 0.4 15 (60%) 12 (48%)

Valor de p c NS <0.001 <0.001


b Número (%) de casos.

c Los valores de p mayores de 0.05 se consideraran no significativos, NS.


DISCUSIÓN



112

Desde el primer éxito de la fecundación in vitro (FIV) (Steptoe PC y Edwars RG 1978)

han pasado más de 40 años. Durante este tiempo, la FIV ha pasado de ser una indicación

marginal, reservada a un limitado grupo de mujeres afectada por una obstrucción de las

trompas uterinas, a convertirse en una herramienta utilizada en la mayoría de los casos de

infertilidad, tanto del origen femenino como masculino (Tesarik J 2017).

A pesar de esta espectacular expansión, existen varios aspectos de la FIV que no han

recibido la atención suficiente (Gleicher N y Barad DH 2019). La aplicación, a veces

demasiado precipitada, de nuevas modificaciones de diferentes métodos utilizados en la

FIV, tanto en su parte clínica como en la del laboratorio, ha creado varias incógnitas en

cuanto al impacto de dichas modificaciones sobre la calidad de los embriones y la

receptividad del útero para su anidación.

Consecuentemente, resulta algunas veces difícil explicar fracasos repetidos de las

tentativas de FIV. Aún peor, varios estudios, realizados con grandes números de casos,

muestran que la FIV está asociada con un aumento significativo, aunque mínimo, de la

frecuencia de varias anomalías del embarazo, como pre-eclampsia o anomalías de la

placenta (Rahu K y col. 2019), y de la descendencia, como anomalías cromosómicas

(Tesarik J 1995), prematuridad de los bebés nacidos (Dunietz GL y col. 2015) o

deficiencias intelectuales (Hansen M y col. 2018).

Aunque algunas de estas irregularidades están relacionadas con la edad elevada y las

anomalías de los gametos de los padres, así como la frecuencia relativamente alta de

embarazos múltiples, existen datos que implican directamente varios factores de las

mismas técnicas (Menezo Y y col. 2019). Si un factor negativo es demasiado intenso, para

que los mecanismos de autocorrección embrionaria puedan reparar sus consecuencias,

resulta un fracaso de implantación o un aborto espontáneo. Por otro lado, si la

autocorrección salva al embrión pero no llega a reparar los daños producidos de una

manera completa, puede resultar un feto y niño con diferentes anomalías.

Los estudios presentados en esta tesis están enfocados en dos factores importantes que

determinan el desarrollo normal del embarazo: la calidad ovocitaria y la receptividad

uterina para la anidación de los embriones. En cuanto a la calidad ovocitaria se ha


estudiado el efecto de la GH. En lo que concierne la receptividad uterina, y se analizaron

los efectos de la GH, administrada en la fase proliferativa del desarrollo del endometrio así

como del agonista de GnRH administrado en la fase secretora.

1. EL EFECTO DE LA GH SOBRE LA CALIDAD OVOCITARIA Y

LA RECEPTIVIDAD UTERINA

Se sospechaba la existencia de un efecto de la GH sobre la calidad ovocitaria, desde

que un estudio demostró una relación positiva entre la concentración de GH en el líquido

folicular, aspirado mediante la punción folicular, y la calidad de los embriones generados

por los respectivos folículos (Mendoza C y col. 2002).

Posteriormente se ha descubierto que la concentración de GH disminuye

considerablemente en el líquido folicular de mujeres de más de 40 años de edad y que la

administración de la GH, durante la estimulación ovárica, mejora las tasas de parto y de

nacimiento en este grupo de mujeres (Tesarik J y col. 2005).

En cuanto a las mujeres más jóvenes con una mala respuesta a la estimulación ovárica,

los resultados publicados en diferentes estudios son contradictorios. Algunos autores han

encontrado una mejora de resultados clínicos de FIV en pacientes entre 30 y 40 años

estimuladas con la GH durante la estimulación con gonadotropinas (Homburg R y col.

1988; Owen EJ y col. 1991; Blumenfeld Z y col. 1991; Shoham Z y col. 1992; Blumenfeld,

Z y Amit T 1995; Blumenfeld Z y Amit T 1996), mientras que otros no han observado

ninguna diferencia en comparación con las mujeres estimuladas sin la adición de la GH

(Dor J y col. 1995; Suikkari A y col. 1996).

En el trabajo presente hemos comparado los marcadores de la calidad ovocitaria y

embrionaria en un grupo de mujeres con 2 previos fracasos de FIV/ICSI y con edad entre

30 y 39 años. Además del supuesto efecto sobre la calidad de los ovocitos, otros resultados

sugieren que los efectos de GH sobre las tasas de implantación y nacimiento puede ser

también debidos a una mejora de la receptividad uterina por esta hormona (Hull KL y

Harvey S 2014; Moreira F y col. 2002; Xue-Mei W y col. 2016). Los resultados

presentados en esta tesis demuestran que la GH actúa sobre ambos niveles.



114

El análisis de la calidad morfológica de los ovocitos de mujeres entre 30 y 39 años de

edad tratadas con la GH, durante la estimulación ovárica, demuestran una clara

superioridad en comparación con las mujeres de la misma edad, cuya estimulación se llevó

a cabo sin añadir la GH. A parte de este efecto sobre la calidad de los ovocitos, la GH

también actúa al nivel del útero aumentando la receptividad del endometrio para la

implantación de los embriones.

Nuestros resultados demuestran claramente que ambos efectos son independientes. De

hecho, la mejora de la receptividad uterina para los embriones se alcanzó en mujeres

receptoras de ovocitos en un programa de ovodonación. La GH se utilizó solamente en las

mujeres receptoras y no en las mujeres donantes. Por lo tanto, queda claro que la hormona

de crecimiento, aparte de mejorar la calidad de los ovocitos, ejerce efectos independientes

sobre la receptividad uterina.

Queda por determinar cuáles son los mecanismos del efecto de la GH sobre los dos

niveles. La GH es un agente polifacético y puede ejercer sus efectos mediante diferentes

mecanismos, que son básicamente de dos tipos:

1. Un efecto directo mediante receptores específicos localizados sobre la superficie da

las células diana.

2. Mediante la estimulación de la síntesis, en diferentes tejidos, del factor de

crecimiento insulínico tipo 1, también conocido como somatomedina C o IGF-1.

Ambos mecanismos parecen estar involucrados en los efectos de la GH en el

sistema reproductor femenino, aunque la importancia de cada uno en los efectos,

observados en este estudio, quedan por determinar. Se ha puesto en marcha un

estudio multicéntrico para aclarar los mecanismos de los efectos de GH sobre

diferentes aspectos de la fertilidad femenina y su potencial para corregir problemas

a diferentes niveles de este complejo proceso.


2. MEJORA DE LA FASE LÚTEA MEDIANTE LA

ADMINISTRACIÓN DE UN AGONISTA DE LA GnRH

Existen claras evidencias que sugieren la existencia de una deficiente fase lútea

después de la transferencia de embriones, en ciclos estimulados con la HMG o FSH,

independientemente de si es con un agonista de GnRH (Macklon NS y Fauser BC 2000;

Pritts EA y Atwood AK 2002) o con un antagonista de la GnRH (Beckers NG y col. 2003;

Kolibianakis EM y col. 2003), que se utilizan para la prevención de un aumento prematuro

de LH.

Para resolver este problema, la mayoría de las clínicas utilizan algún tipo de soporte de

la fase lútea, después de la transferencia de los embriones. Esto puede hacerse estimulando

la secreción de progesterona por el cuerpo lúteo, con administración de HCG exógena o

por suplementación directa de progesterona exógena (Pritts EA y Atwood AK 2002).

Los efectos de la administración del agonista de la GnRH en la fase lútea fueron

evaluados en el contexto de la estimulación ovárica controlada por un antagonista de

GnRH y utilizando la HCG para desencadenar la ovulación. Estos resultados apuntan a un

efecto del agonista de GnRH sobre la producción de la progesterona por el cuerpo lúteo.

Los resultados concernientes a los resultados clínicos de la ICSI, es decir, tasas de

implantación clínica y de natalidad, confirman nuestras observaciones previas que

demostraron un efecto directo del agonista de GnRH sobre los embriones. Conclusiones

obtenidas en un protocolo de donación de ovocitos, dónde los efectos sobre el cuerpo lúteo

no fueron posibles a razón de la inhibición completa de la propia actividad ovárica de las

pacientes receptoras de los óvulos donados (Tesarik J y col. 2004).

Consecuentemente, ambos mecanismos (efectos sobre el cuerpo lúteo y sobre el

embrión) coinciden para aumentar la tasa de implantación clínica en pacientes tratados con

los agonistas de la GnRH en la fase lútea. Esta situación conlleva un incremento del riesgo

de embarazos múltiples en pacientes tratadas con administración de suplementos en esta

fase lútea. Por lo tanto, podría ser interesante combinar la administración de agonistas de la

GnRH en la fase lútea con la transferencia de un único embrión.



116

Además, en un estudio anterior (Tesarik J y col. 2006) hemos comparado los pacientes

tratados con los dos protocolos de estimulación (protocolo largo con agonista de la GnRH

y antagonistas de la GnRH) y recibiendo ambos el agonista de la GnRH en la fase lútea,

con los del grupo control, obteniendo, en ambos tipos de estimulación, una mayor tasa de

implantación embrionaria y de embarazo clínico en comparación con el correspondiente

grupo de placebo. Además, comparando los pacientes tratados con los dos protocolos de

estimulación (protocolo largo con agonista de la GnRH y antagonistas de la GnRH) y

recibiendo ambos el agonista de la GnRH en la fase lútea, con los del grupo control, hubo

un mejor resultado en los dos primero casos y se demostró una tendencia hacia una mayor

tasa de embarazo clínico en comparación con el correspondiente grupo control. No está

clara la relación entre el protocolo de estimulación ovárica y el consecuente efecto de la

administración de agonistas de la GnRH en la fase lútea, y sigue siendo un intrigante

desafío para una mayor investigación, en el contexto de los continuos esfuerzos en la

optimización del uso de antagonistas de GnRH en la estimulación ovárica (Fauser B y

Devroey P 2005).

Los efectos beneficiosos de los agonistas de la GnRH en la fase lútea en estas

variables, se alcanzó con un soporte extra de la fase lútea con esta hormona, además del

tratamiento convencional con HCG, progesterona y E2, apoyados en la hipótesis de que los

agonistas de GnRH ejercen un efecto beneficioso y directo sobre la implantación del

embrión (Tesarik J y col. 2004). La hipótesis de la acción directa de los agonistas de la

GnRH en el embrión (Tesarik J y col. 2004) se ve corroborada por la observación de

niveles más altos de β-HCG en suero, en el grupo de pacientes que logró un embarazo

(excluyendo los embarazos múltiples del análisis), después de la administración del

agonista de la GnRH en la fase lútea, en comparación con el grupo control.

Existen estudios en los que destacaban que la GnRH incrementaba la HCG sérica en

mujeres embarazadas (Iwashita M y col. 1993), presumiblemente por la acción de

receptores placentarios de la GnRH (Lin L y col. 1995), y los resultados vinculantes en los

casos de exceso de GnRH circulante por una sustancia indefinida GnRH -vinculante,

posiblemente anticuerpos en pacientes con pérdidas precoces de embarazo (Siler-Khodr

TM y col. 1997).


Sin embargo, los argumentos a favor de un efecto directo del agonista de la GnRH en

el embrión no excluyen otros mecanismos de acción actuando en paralelo. El objetivo del

estudio presentado en esta tesis, en comparación al modelo de la donación de ovocitos, ha

sido el cuerpo lúteo y consecuente posibilidad de la acción del agonista de la GnRH en el

mismo. De hecho, ya en el estudio publicado anteriormente (Tesarik J y col. 2006) se ha

observado un aumento en las concentraciones séricas de E2 y de progesterona en la fase

lútea, en los pacientes que recibieron una sola inyección del agonista de GnRH, 6 días

después de ICSI, en comparación con los pacientes que recibieron control. Estos resultados

se obtuvieron con ambos tipos de estimulación ovárica, agonistas y antagonistas de la

GnRH (Tesarik J y col. 2006).

El mecanismo de acción de los agonistas de la GnRH en el cuerpo lúteo sigue siendo

una cuestión controvertida. Los primeros estudios sugirieron que el tratamiento con

agonistas de la GnRH, en la fase lútea (una o dos administraciones de 500 μg de

buserelina), podría actuar como un agente luteolítico con fines anticonceptivos (Lemay A y

col. 1982, 1983), supuestamente debido a la desensibilización del receptor de la GnRH en

las células gonadotropas. De hecho, esto puede ser cierto para algunas dosis de agonista de

GnRH, aunque la hipótesis de que la acción de los agonistas de la GnRH como

anticonceptivo nunca ha sido confirmada definitivamente, y los intentos de inducir abortos

tempranos con enormes dosis de un agonista de la GnRH superactivo han dado lugar a

fracasos (Skarin G y col. 1982).

Recientemente, se realizaron una serie de estudios clínicos e informaron de las posibles

consecuencias de una indiscriminada administración de agonistas de la GnRH en la fase

lútea, con una sola excepción (Herman A y col. 1992), todos estaban de acuerdo en que la

administración del agonista de la GnRH en la fase lútea no pusiera en peligro la

continuación del embarazo resultante de los intentos en reproducción asistida, sino más

bien para apoyar la implantación (Golan A y col. 1990; Isherwood PJ y col. 1990; Ron-El

R y col. 1990; Smitz J y col. 1991; Jackson AE y col. 1992; Balasch J y col. 1993; Elefant

E y col. 1993; Har-Toov J y col. 1993; Weissman A y Shoham Z, 1993; Wilshire GB y col.

1993; Young DC y col. 1993; Gartner B y col. 1997).



118

Cabe recordar que la utilidad del soporte de la fase lútea, en diferentes tipos de

protocolo de estimulación ovárica es individual, más importante en ciertas mujeres que en

otras. Como hemos publicado recientemente, una deficiencia de la fase lútea ocurre en

algunas mujeres incluso en naturales y puede ser la causa principal de la infertilidad y de

abortos espontáneos (Tesarik J y col. 2019). Lógicamente, estas mujeres están más

propensas a problemas funcionales del cuerpo lúteo, en tratamientos FIV, que debilitan aún

más el cuerpo lúteo, tanto por la misma estimulación ovárica como por la punción de los

folículos para obtener ovocitos (Mendoza-Tesarik R y col. 2019) .

Por otra parte, un pequeño estudio aleatorio sugirió que dosis bajas de agonistas de la

GnRH (100 μ g de buserelina) podían ejercer un efecto estimulante sobre el cuerpo lúteo

(Pirard C y col. 2005). Los datos actuales apoyan firmemente esta hipótesis. No se conoce

si el aumento en la síntesis de E2 y progesterona en pacientes que recibieron agonistas de

GnRH, en la fase lútea, está mediada por hormonas hipofisarias o es el resultado de una

acción directa del agonista de la GnRH en el ovario. El fracaso para detectar un aumento

cuantificable de la concentración sérica de LH, el primer día después de la administración

de los agonistas de la GnRH, no es compatible con el papel de la hipófisis en estos casos,

pero hay que recordar que un breve pico de LH, es suficiente para producir este efecto, y

no puede ser detectado con este estudio.

Si el agonista de la GnRH estimula la producción placentaria de HCG, que es conocida

por promover la secreción del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el

principal implicado en el síndrome de hiperestimulación ovárica (McClure N y col. 1994;

Neulen J y col. 1995; Krasnow JS y col. 1996), se plantea una cuestión acerca de la

seguridad de la administración del agonista de la GnRH en la fase lútea, en pacientes con

alto riesgo de hiperestimulación ovárica. Sorprendentemente, sin embargo, un estudio

reciente realizado en ratas, ha demostrado que la administración de agonistas de GnRH,

durante la fase lútea, reduce la expresión de VEGF y los receptores de VEGF, tanto en

mRNA como en los niveles de proteína y disminuye la permeabilidad vascular en la

hiperestimulación ovárica (Kitajima Y y col. 2004).

Por otra parte, la continuación en la administración de agonistas de la GnRH, en ciclos

de reproducción asistida con bajas dosis de agonistas de la GnRH, han demostrado que


previenen el desarrollo del principio del síndrome de hiperestimulación en los pacientes en

riesgo y en los que no se realizaría la transferencia de embriones sino que se

criopreservarían (Endo T y col. 2002). El agonista de GnRH induce un aumento de la

producción de HCG en el embrión en las primeras etapas de implantación que es

probablemente demasiado baja para afectar significativamente a la síntesis de VEGF

(Kitajima Y y col. 2004), que puede estar relacionado por la acción agonista de GnRH en

el eje hipófisis-ovario, independiente de su efecto sobre el embrión temprano.

En este estudio, no hemos observado ningún caso de hiperestimulación grave que

necesitara hospitalización. No hay pues, a priori, motivo por el que el agonista de GnRH se

deba evitar como apoyo de la fase lútea en esta categoría de pacientes, aunque se

recomienda precaución hasta tener una información más completa de cómo los efectos de

los agonistas de la GnRH, en la fase lútea, afectan a los diferentes niveles del sistema

reproductivo.

Por otra parte, se inmunolocalizó un receptor de GnRH en el endometrio murino

(Murdoch WJ 1995), y también se detectó un receptor de la LH funcional en el útero

humano (Reshef E y col. 1990). Una acción directa de los agonistas de la GnRH o de los

agonistas de la GnRH inducidos por la LH en el tejido uterino puede ser el responsable de

los efectos observados en la fase lútea.

Resumiendo, los resultados de este estudio prospectivo y aleatorio busca, en principio,

los beneficios de la administración de los agonistas de la GnRH en la fase lútea para

aumentar el potencial de implantación del embrión obtenido en el programa de donación

de ovocitos, con protocolos de estimulación ovárica usando tanto agonistas como

antagonistas de la GnRH, como prevención de la luteinización prematura. Este efecto fue

particularmente evidente en los ciclos de estimulación que usaron los antagonistas de la

GnRH. De este modo, estos datos corroboran la hipótesis de una acción directa del

agonista de la GnRH en la implantación del embrión, así como en la secreción de la βHCG,

que sugiere un efecto positivo directo o indirecto sobre la función del cuerpo lúteo.

Todas estas observaciones nos abren un camino más amplio en el uso de los agonistas

de la GnRH como el soporte de la fase lútea, posiblemente en combinación con las técnicas



120

convencionales, como el empleo de HCG, E2 y progesterona, especialmente en ciclos con

estimulaciones ováricas usando antagonistas de la GnRH. Sin embargo, hay que tener en

cuenta los efectos que produce sobre la salud. Los datos presentes apuntan a otros estudios

sobre este mecanismo de acción de los agonistas de la GnRH en la fase lútea. Serán

necesarios estudios clínicos que determinen las dosis óptimas, el tiempo y frecuencia de la

administración de los agonistas de la GnRH.


CONCLUSIONES



122

1. El uso de la hormona de crecimiento durante la estimulación ovárica de la

paciente produce un aumento significativo del número de ovocitos de tipo A

(calidad óptima).

2. Este porcentaje aumenta también en el número de cigotos con patrón normal de

fecundación.

3. Los embriones obtenidos son significativamente más alto los de tipo A tanto en

general, como en los transferidos a las pacientes.

4. El aumento de la tasa de embarazos y nacidos vivos, en comparación al grupo

al que no se le suministró la hormona es significativamente mayor.

5. En el uso de la hormona de crecimiento en mujeres sometidas a ovodonación

mejora la calidad del endometrio, incrementando la tasa de implantación.

6. Como consecuencia, aumenta significativamente la tasa de embarazos, de

ecografías con latido cardiaco positivo y de nacimientos.

7. El grupo de mujeres, sin problemas en el soporte de la fase lútea en los que se

utilizó una única dosis del agonista de la GnRH, presentaron un incremento de

los niveles de progesterona, un aumento de la secreción de β-HCG y mayor

tasa de implantación, embarazos y nacimientos.

8. En el grupo de mujeres con problemas en los niveles hormonales de

progesterona, durante la fase lútea se consiguió un aumento importante de las

tasas de implantación, secreción de β-HCG y de progesterona. Y como

consecuencia, se incrementan las tasas de embarazos, ecografías con latidos

positivos y nacimientos.


BIBLIOGRAFÍA



124

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