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Toxicología Experimental Animales de Experimentación: Código de

ética Métodos alternativos Animales transgenicos

Msc. Leon Villegas Vilchez. Departamento de Ciencias Celulares y Moleculares

Sección Ciencias Farmacéuticas Facultad de Ciencias y Filosofía

Universidad Peruana Cayetano Heredia

TOXICOLOGIA EXPERIMENTAL

• Campos de aplicación principales:

-Pesticidas.

-Medicamentos.

-Aditivos Alimentarios.

-Cosméticos (poco) casi nunca se usan solo en productos nuevos.

ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

• Estabulación y manejo Prácticas correctas de laboratorio (GLPs): – Ratones. – Ratas. – Hámsters. – Conejillos de índias. – Conejo. – Perro Beagle. – Pájaros. – Anfibios. – Gatos. – Cerdos. – Cabras. – Ovejas. – Monos. – Hay razas preparadas.

OBSERVACIONES DE LOS ANIMALES

• Cada uno tiene su protocolo.

• Aspecto físico (diariamente).

– Posiciones extrañas.

– Posición de la cola, orejas y extremidades...

• Pruebas de comportamiento.

• Exámenes físicos.

• Hematología.

• Clínica química.

• Análisis de orina.

• Patología.

TOXICOLOGIA EXPERIMENTAL • Tests reducidos de toxicidad aguda, subaguda o

subcrónica, adaptados a las necesidades del usuario, incluyendo hematología, bioquímica sérica y histopatología.

• Tolerancia local dérmica, ocular, en mucosa oral, vaginal o rectal, intramuscular e intravenosa.

• Estudio histopatológico (confección de las preparaciones y diagnóstico), en un contexto de toxicología experimental, de toxicología ambiental o bien de control sanitario.

• Test de genotoxicidad in vivo (tests de los micronúcleos, en sangre circulando o en médula ósea, y electroforesis en gel de células individuales (SCGE o Comet Test), en linfocitos, en tejidos o en celomocitos de lumbrícidos.

• Pruebas de letalidad y de reproducción en lumbrícidos (Elisenia foetida y especies autóctonas).

• El concepto actual de drug discovery ha introducido nuevos aspectos en la problemática relacionada con la gestación y el desarrollo de fármacos.

• Las nuevas tecnologías han multiplicado la capacidad para generar un número inicialmente muy elevado de moléculas, que constituyen el fondo a partir del cual hace falta elegir, en última instancia, las candidatas para la fase de desarrollo.

• Como consecuencia, la fase de screening ha adquirido una especial relevancia, tanto desde un punto de vista cuantitativo como también cualitativo.

• En efecto, disponer de métodos de selección rápidos, económicos y fiables puede marcar una diferencia decisiva.

• Mientras que en la fase de desarrollo los ensayos a realizar están perfectamente definidos en las normativas internacionales (en las cuales, además, se detallan estrictamente los protocolos que hace falta emplear), la etapa de selección se caracteriza por una mayor flexibilidad, que abre las puertas a la introducción de metodologías innovadoras.

VENTAJAS DE LOS MODELOS ANIMALES

1. Sistemas más simples

2. Aislan acciones específicas

3. Llevan a cabo procedimientos

que no son posibles en humanos

4. Tiempos de generación más

cortos

5. Ciclos de vida más cortos

¿CÓMO SABER SI HEMOS TENIDO ÉXITO?

¿El modelo animal refleja:

1. El comportamiento humano?

2. La fisiología humana?

3. La bioquímica humana?

4. La genética humana?

5. ¿Los hallazgos en animales predicen

efectos en humanos?

Estudio de Preferencia

Determinación de Sensibilidad a Dosis Altas de Etanol

Ratón en la barra estacionaria

Foto de Animales en la Rueda Rotatoria

Foto de un Animal en el Plano Inclinado

Rata en la Cinta Corredora

Experimentación animal y alternativas

• Los métodos utilizados en la investigación, en el ensayo (evaluación de la seguridad / toxicidad) y en la enseñanza están en continuo progreso ya que los científicos están en permanente búsqueda de posibles alternativas que mejoren la calidad de su trabajo.

• Ello es debido, en parte, a la lógica evolución de los conocimientos científicos y de sus aplicaciones tecnológicas, y en parte, a consideraciones éticas, logísticas, económicas, sociopolíticas y legales.

¿Qué son los métodos alternativos?

• Los tres principios básicos que según Russell y Burch (1959) identifican el amplio concepto de métodos alternativos, también conocidos por las letras iniciales, las "tres erres“.

• Estas son: • Reemplazo de los procedimientos que emplean animales por

otros que no los precisen

• Reducción en el número de animales utilizados

• Refinamiento de los métodos usados para mejorar su eficacia o disminuir el dolor o sufrimiento infligido.

¿Qué alternativas existen en la práctica?

• El gran abanico de procedimientos alternativos posible incluye las mejoras en el almacenamiento, uso e intercambio de la información con el objetivo de evitar la repetición innecesaria de ensayos

• Las mejoras en el diseño de los experimentos para aumentar su validez y disminuir el sufrimiento y el número de animales empleados

• El uso de modelos matemáticos que relacionan la estructura química y la actividad farmacológica y tóxica de los compuestos químicos (QSAR)

• Los sistemas audiovisuales, modelos mecánicos o las simulaciones por ordenador, de particular importancia en enseñanza

• Los estudios humanos, que incluyen los epidemiológicos, la toxicovigilancia tras la introducción de los productos en el mercado y el empleo de voluntarios

• Las técnicas in vitro, que evitan el uso de animales superiores íntegros y comprenden el empleo de organismos inferiores, como bacterias, algas y hongos

• Las fracciones subcelulares o incluso material no biológico

• Cortes de tejidos, órganos perfundidos, y cultivos celulares.

Las posibles alternativas comprenden:

• Evitar la repetición innecesaria de experimentos in vivo e in vitro: Protocolos y estudios previos: Disponibilidad de la información, intercambio. Flexibilidad. Estrategias integradas.

• Modelos Matemáticos de Predicción: Cinética ambiental de compuestos químicos Farmaco-toxicocinética (PB-PK) Relación Cuantitativa Estructura-Actividad (QSAR)

• Mejoras en el diseño de estudios animales: Reducción: número de animales usados Refinamiento: minimización del dolor y distres; nuevos modelos

• Uso de organismos inferiores no protegidos: Bacterias, hongos, protozoos, algas, plantas, animales invertebrados

• Vertebrados en etapas iniciales de desarrollo: Peces, anfibios, reptiles, pájaros, mamíferos

• Métodos In vitro: Organos: baños, perfusión, cultivo, cortes, órganos reconstituidos Explantes, reagregados celulares, micromasas, cocultivos Cultivo primario de células dispersadas Lineas celulares / transgénesis Sistemas libres de células

• Otros: Estudios en humanos: Voluntarios, epidemiológicos, vigilancia Modelos en la enseñanza y formación: Modelos mecánicos, sistemas audiovisuales, y simulaciones por ordenador y de realidad virtual

¿Qué son los métodos in vitro?

• Los métodos in vitro son los procedimientos que se desarrollan en un recipiente fuera cuerpo del animal.

• Aunque inicialmente los recipientes usados eran de vidrio, cada vez más frecuentemente se emplean los de plástico.

• En ocasiones se emplea material procedente directamente de animales o humanos, y otras veces se emplean células que se han adaptado a crecer indefinidamente in vitro.

• Aunque coloquialmente suelan identificarse los métodos alternativos con las técnicas in vitro, no son términos sinónimos. Por ejemplo:

1. La mejora de un procedimiento que emplee animales supone un procedimiento alternativo al usado previamente.

2. Los estudios de predicción con sistemas computarizados son alternativas a la experimentación animal, pero no son procedimientos experimentales in vitro.

3. Existen diversos procedimientos in vitro que no pueden considerarse alternativas ya que son procedimientos de primera elección. Sería mucho más difícil obtener la misma información con estudios con animales.

Protocolo Etico para el Cuidado y Uso de los Animales

• Se deben considerar los siguientes puntos para la elaboración y revisión de los protocolos para el cuidado y uso de los animales.

• Razón y objetivos propuestos para el uso de los animales.

• Justificación de la especie y número de animales requeridos. Siempre que sea posible, el número de animales que se requieren deberá justificarse estadísticamente.

• La disponibilidad o adecuación de la aplicación de procedimientos que causen el menor daño, otras especies, preparación de órganos aislados, cultivo de células o tejidos, o simulación computarizada

• La calidad del entrenamiento y experiencia del personal involucrado en los procedimientos usados

• Requisitos de crianza, alojamiento y manejo no usuales.

• Anestesia, analgesia y sedación apropiados, (las escalas de dolor y daño pueden ayudar en el diseño y revisión de los protocolos.

• La duplicación innecesaria de experimentos.

• La realización de varias intervenciones quirúrgicas mayores, en el mismo animal

• Criterios y mecanismos para la intervención oportuna, retiro de los animales del experimento o eutanasia, en caso de preveer la ocurrencia de dolor o estrés grave.

• Cuidados después del procedimiento

• Métodos de eutanasia y eliminación de los cadáveres.

• Ambiente laboral seguro para el personal.

Comité Institucional Para el Cuidado y Uso de los Animales

• Un médico veterinario certificado o que haya tenido capacitación o experiencia en ciencia y medicina de los animales de laboratorio o en el uso de las especies en cuestión.

• Por lo menos un científico en ejercicio con experiencia en investigación científica experimental en animales.

• Por lo menos un miembro de la sociedad, que represente los intereses de la comunidad en general en relación al cuidado y utilización apropiados de los animales.

• Este ultimo miembro no debe ser usuario de animales de laboratorio, ni estar afiliado a la institución, ni tampoco ser familiar en primer grado de alguna persona afiliada a la institución.

• A continuación se enlistan importantes lineamientos para la restricción de movimiento:

• Los aparatos de restricción no deben considerarse como métodos de alojamiento normales.

• Los aparatos de restricción no deben usarse por simple conveniencia al manipular o manejar animales.

• El lapso de restricción deberá ser el mínimo requerido para alcanzar los objetivos de la investigación.

• Deberán tomarse las previsiones para

observar al animal a intervalos apropiados

• Si se observan lesiones o enfermedades

asociadas con la restricción de movimiento

se debe brindar atención médico veterinaria.

• La presencia de lesiones, enfermedades o

cambios de conducta severos a menudo

necesitan la remoción, temporal o

permanente, del animal de la restricción.

• Las especies, variedad y raza de animales y sus características individuales tales como sexo, edad, tamaño, conducta, experiencia y salud.

• La habilidad de los animales para integrar grupos con sus semejantes, a través de la vista, olfato y posible contacto, ya sea que los animales se mantengan aislados o en grupos.

• El diseño y construcción del alojamiento.

• La disponibilidad y adecuación de elementos que enriquezcan el medio ambiente.

Para un adecuado ambiente físico y social, hospedaje, espacio y manejo se deben considerar

muchos factores entre ellos:

• Las metas del proyecto y el diseño experimental (ej.,

producción, crianza, investigación, pruebas de

laboratorio y educación).

• La intensidad de la manipulación animal y el grado de

daño que causen los procedimientos.

• La presencia de materiales peligrosos o que causen

enfermedad.

• La duración del período de permanencia de los

animales.

– Satisfacer las necesidades fisiológicas y de conducta de los animales incluyendo la micción y la defecación, el mantenimiento de la temperatura corporal, los movimientos normales y postura, y cuando esté indicado la reproducción.

– Las interacciones sociales entre individuos de la misma especie y el establecimiento de jerarquía dentro del encierro o entre encierros.

– Que los animales permanezcan limpios y secos (de acuerdo con los requerimientos de las especies).

– Una ventilación adecuada.

El encierro primario constituye los límites del ambiente inmediato del animal.

Los encierros primarios aceptables permiten:

– El acceso de los animales al agua y alimento, y

también brindar facilidades para el lleno, relleno,

cambio, servicio y limpieza de los utensilios con

los cuales se proporcione el agua y el alimento.

– Tener un medio ambiente seguro, que impida el

escape de los animales o el entrampamiento de

sus apéndices entre superficies opuestas o en

aberturas estructurales.

– La ausencia de bordes cortantes o proyecciones

que puedan causar lesiones a los animales.

– Permitir la observación de los animales con la

mínima molestia para ellos.

Un manejo exitoso de las instalaciones al aire libre esta basado

en las siguientes consideraciones:

• Cuando los animales son colocados por primera vez en alojamientos al aire libre se les debe brindar un período de aclimatación adecuado, previo al cambio de estacion.

• Entrenar a los animales para que cooperen con el personal de investigación, usar jaulas para restringir sus movimientos o para trasladarlos.

• Brindar un medio ambiente social apropiado para la especie.

• Agrupar animales compatibles.

• Ofrecer seguridad adecuada, mediante una reja perimetral o por otros medios.

Espacio Recomendado para Roedores de Laboratorio de Uso

Común, Alojados en Grupo

Animales

Peso Corporal

g

Area de Piso/Animal

cm2

Alturaa

cm

Ratones

<10

Hasta 15

Hasta 25

>25b

38.71

51.61

77.42

96.77

12.7

12.7

12.7

12.7

Ratas

<100

Hasta 200

Hasta 300

Hasta 400

Hasta 500

>500b

109.68

148.39

187.1

258.1

387.1

451.61

17.78

17.78

17.78

17.78

17.78

17.78

Hamsteres

<60

Hasta 80

Hasta 100

>100b

64.52

83.87

103.23

122.58

15.24

15.24

15.24

15.24

Cobayos

<350

>350b

387.1

651.6

17.78

17.78

a. De piso a techo de la jaula

b. Los animales más grandes pueden requerir mas espacio para

satisfacer los estándares de rendimiento

http://www.nal.usda.gov/awic/pubs/noawicpubs/





Temperatura y Humedad

• El mantenimiento de la temperatura corporal dentro de los límites de la variación normal es esencial para el bienestar de los homeotermos.

• Generalmente la exposición de los animales no adaptados a temperaturas superiores a los 29.4º C o por debajo de 4.4º C, sin que tengan acceso a protección en un refugio u otro mecanismo, pueden producir efectos clínicos, pueden poner en peligro la vida.

• Los animales se pueden adaptar a condiciones extremas mediante mecanismos morfológicos, fisiológicos y de conducta, pero tales adaptaciones llevan tiempo y pueden alterar los resultados experimentales o afectar los rendimientos .

Temperaturas de Bulbo Seco Recomendadas para los Animales de Laboratorio Comunes

Especie Animal

Temperatura de

Bulbo Seco ºC

Ratón, rata, hámster, gerbo, cuyes

conejos

Gato, perro y primates no-humanos

Animales de Granja y Aves

18-26

16-22

18-29

16-27

Ventilación

• Los propósitos de la ventilación son suministrar oxígeno adecuadamente

• Eliminar la carga térmica producto de la respiración animal, la iluminación y los aparatos

• Diluir los gases y partículas contaminantes; ajustar el contenido de humedad del aire del cuarto

• En donde sea apropiado crear diferencia de presión de aire entre espacios adyacentes.

• Sin embargo, el establecer un índice de ventilación en el cuarto no asegura la adecuación de la ventilación en el encierro primario del animal y por lo tanto no garantiza la calidad del microambiente.

• Los gases tóxicos o los que causan olores como el amoniaco, pueden mantenerse dentro de límites aceptables si son retirados por el sistema de ventilación y reemplazados con aire que no los contenga o que estén en bajas concentraciones.

• Puede ser eficaz el tratamiento del aire reciclado para eliminar estas sustancias mediante la absorción química o la extracción

• Es preferible el uso de aire no reciclado para ventilar las áreas de ocupación y de utilización animal.

• Se puede usar aire reciclado y filtrado con filtros HEPA, sin filtración de los gases (ej. con filtros de carbón activado) pero sus aplicaciones son limitadas y solamente en caso de: – El aire del cuarto se mezcla con por lo menos 50% de aire

nuevo (esto significa que el suministro total de aire no exceda el 50% con aire reciclado)

– Las prácticas de atención a los animales tales como el cambio de material de lecho, la frecuencia del lavado de jaula y la preparación del aire reciclado sean suficientes para disminuir al mínimo los gases tóxicos y los olores

– El aire reciclado se regrese al cuarto o al área en donde se originó, excepto si viene de espacios en donde no se alojen animales

– El aire reciclado sea acondicionado apropiadamente y mezclado con suficiente aire nuevo para cumplir con los requerimientos de temperatura y humedad de los animales en ese espacio.

GENÉTICA DE LOS ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

variaciones

•Mutaciones

•Deriva génica

•Heterocigocidad residual

•Error Humano:

Métodos incorrectos de cría.

Contaminación Genética.

Animales genéticamente indefinidos

Animales genéticamente definidos


Animales genéticamente definidos

CEPAS CONSANGUINEAS ó ENDOCRIADAS

ó INBRED STRAINS

•Estables a largo plazo.

•Isogenicidad.

•Homocigocidad.

•Uniformidad fenotípica.

•Individualidad.

•Sensibilidad.

•Distribución internacional.

•Baja performance reproductiva.

•Varían por: mutaciones, heterocigosis residual,

manejo deficiente de la colonia.


Animales indefinidos genéticamente

STOCKS EXOCRIADOS ó OUTBRED STOCKS

•No son estables a largo plazo.

•Elevada heterocigosis.

•Modelos semejantes a poblaciones heterogéneas.

•Alta performance reproductiva.

•Económicos.

•Distribución retringida.

•Ausencia de marcadores genéticos.

•Varían por selección, endocría, contaminación genética,

deriva génica.


NOMENCLATURA

ENDOCRIA EXOCRIA

•Cepas

•Letras mayúsculas

y números o combinado.

•Existen abreviaturas.

•Subcepas:

cepa/símbolo subcepa

(números, código del Instit.,

iniciales de un apellido)

• C57BL/6J

•DBA/1

•C3H/N

•BALB/cJ

•Stocks

•Usar 2 - 6 letras en mayúsc.

y aclarar que son exocriados.

Ej.: SENCAR exocriados.

•Código del . Instit : nombre

del stock.

Ej.: Crl:CF1


USOS

CEPAS STOCKS

•Modelos animales

•Oncología.

•Inmunología.

•Genética.

•Estudios donde la

precisión estadística

es importante.

•Educación.

•Embriología.

•Farmacología.

•Toxicología.

•Fisiología

reproductiva


HIBRIDOS F1

•Genéticamente uniformes.

•Heterocigotas para los loci que difieran de los parentales.

•Vigor híbrido.

NOMENCLATURA

(C57BL/6 x DBA/2)F1

B6D2F1

USOS: Carcinogénesis, Teratogénesis de diversas sustancias


CEPA COISOGENICA

NOMENCLATURA

C3H7N-lpr

CEPA CONGENICA

NOMENCLATURA

BALB.NIH-nu

C.N-nu

USOS: Genética.

USOS: Genetica de histocompatibilidad tisular


CEPAS TRANSGENICAS

CEPAS KNOCKOUTS o portadores de inhibición

génica selectiva.

Inserción de un gen extraño •Microinyección

pronuclear •Infección retroviral

NOMENCLATURA: C57BL/6TgR(SOD1)J

USOS: Genética del desarrollo,

enfermedades genéticas humanas.

Microinyección de células embrionarias genéticamente

modificadas para alterar la expresión de determinado gen.


•Entrenamiento inadecuado del personal.

•Ausencia o deficiencia de barreras.

•Error de identificación (tarjetas).

•Mantenimiento de cepas de un mismo color

en la misma sala o en racks próximos.

•Falta de buenos registros.

•Cambios frecuentes de personal.

•Carencia de supervisión.

•Fallas para conducir un correcto programa

de monitoreo en bioterios de producción

para la detección temprana de contaminaciones

o divergencia de sublíneas.

Fuentes de contaminación genética


1- Entrenamiento del personal.

2- Pedigree de la colonia de fundación.

3- Pedigree de la colonia de expansión.

1- Marcadores Bioquímicos.

2- Marcadores Inmunológicos.

3- Ensayo de color de pelaje.

Métodos de monitoreo genético

Manejo adecuado de la colonia

Métodos que monitorean loci individuales

1- Injertos de piel.

2- Caracteres morfológicos.

3- Parámetros reproductivos.

4- Tipificación de ADN.

Métodos que monitorean varios loci simultáneamente

Modelos de animales

TRANSGÉNICOS

1º transgénico ratón (Palmiter et al, 1982, Nature)

Investigación básica y

médica

Efecto directo sobre

producción y sanidad

animal

TRANSGÉNICOS

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