DISEO DE UN METODO QUIMIOLUMINISCENTE PARA LA DETECCIN DE CONTAMINANTES HIDROXIAROMATICOS EN MEDIO ACUOSO Y ORGANICO

Juan E. Mauricio Benavides, Anna Ilyin, J. Rodrguez Martnez.

Departamento de Biotecnologa de la Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad Autnoma de Coahuila, Blvd. V. Carranza e Ing. J. Crdenas V., Saltillo, A.P.935, C.P. 25000, Coah., Tel (8) 415-57-52, Ext. 22, Fax: (8) 415-95-34 E-mail: alina@alpha1.sal.uadec.mx

RESUMEN

En el presente trabajo se desarroll un mtodo quimioluminiscente para la deteccin de compuestos fenlico en medios orgnico y acuoso. El fundamento de mtodo propuesto consiste en el uso del efecto inhibitorio de estos contaminantes sobre la actividad de la peroxidasa de rbano picante (HRP). En medios hidrofbicos se emple el sistema solvente orgnico (octano)-fase acuosa-surfactante (Tritn X-100 o AOT) para solubilizar el preparado enzimtico. Despus de definir las condiciones ptimas del sistema (cantidad de fase acuosa, concentracin de surfactante y sustrato de reaccin) se concluy que el sistema de inters no se describe con conceptos de un sistema de micelas inversas comn, por contener baja concentracin de surfactante demostrando un valor de W0 ptimo igual a 2,700. El sistema estudiado se aplic para la obtencin de las curvas de calibracin en rango tanto para deteccin de fenoles disueltos en solventes orgnicos, como para los presentes en aguas residuales.1

INTRODUCCION

Tomando en cuenta el grave problema que en la actualidad representa la contaminacin y polucin ambiental, es de suma importancia la creacin de sistemas efectivos para mantener un monitoreo operacional de la calidad de las aguas industriales durante los diversos procesos tecnolgicos y, por supuesto, en aguas residuales. Esto se logra con la oportuna deteccin y valoracin del nivel de contaminacin (Arvila A. y col., 1997). Respondiendo a dicha necesidad, en las ltimas dos dcadas, se ha observado un avance considerable en la instrumentacin, creacin de procesos y metodologas para el monitoreo y control de la calidad del agua, aunado a la microelectrnica, estrategias y tcnicas biotecnolgicas para una deteccin mucho ms exitosa, sensible y redituable (Galindo E., 1996). Los procedimientos que se han establecido para la determinacin de la concentracin de componentes aromticos en una muestra de aguas residuales, se han limitado a la utilizacin de los mtodos electroqumicos, espectrofotomtricos y fluoromtricos, que presentan una sensibilidad de 10-6 M, 10-8 M y 10-11 M lmites de la

respectivamente, sin embargo, los mtodos quimioluminiscentes alcanzan

deteccin de 10-16 M, por lo tanto, la utilizacin de estos ltimos puede permitir

deteccin de cantidades ms pequeas de contaminantes aromticos, como los fenlicos, por ejemplo. La utilizacin de un luminmetro, abre la posibilidad para la aplicacin de mtodos quimioluminiscentes porttiles. Actualmente existe una gran variedad de luminmetros en el mercado, algunos de los cuales estn acoplados a computadoras y otros son prcticos y porttiles, por lo que su uso se extiende a diferentes reas de la ciencia y la tecnologa (Egorov A.M. y col., 1993). Cabe tambin mencionar, que la mayora de los mtodos conocidos de control y monitoreo de aguas industriales y residuales requieren varias etapas para la extraccin de las sustancias contaminantes y equipos sofisticados que no permiten su aplicacin in situ o poseen baja sensibilidad detectando solo niveles relativamente altos de contaminantes, as como la utilizacin de medios acuosos primordilmente para su deteccin, dejando a un lado a los contaminantes encontrados en medios orgnicos, en los cuales tales2

metodologas no son aplicables (Galindo E., 1996). En el presente trabajo se propuso una solucin en los retrasos ya mencionados que existen en los sistemas de monitoreo y control de aguas, as como el diseo de un mtodo eficaz para su aplicacin en medios orgnicos. MTODOS En este trabajo se emplearon reactivos de marca SIGMA (EUA) y un luminmetro porttil EMILITE EL 1003 (Rusia). La obtencin de curvas de calibracin de fenol en medio acuoso se llev a cabo empleando el siguiente procedimiento: en una celda de luminmetro se colocaron 0.8 ml de buffer Tris-HCl con EDTA 0.1M pH 8.0, 0.1 ml de luminol 0.2 mM, 0.1 ml de piodofenol 0.3 mM, 0.01 ml de H2O2 0.44 M. Despus de la agitacin se aadieron 0.02 ml de una mezcla de enzima: fenol (1:1). Esta mezcla fue preincubada previamente por 30 seg. (en el caso del blanco, se us agua desionizada). Se detect la intensidad quimioluminiscente registrando la Imax (mximo valor de sta). Para determinar la concentracin adecuada de surfactante y fase acuosa a utilizar en manejo de medio hidrofbico (Ilyina A. y col., 1999), en la celda se colocaron 1 ml de la solucin del surfactante dioctilo y sodio sulfoccinato (AOT) o Tritn X-100 en octano, 0.01 ml de enzima (11 U/ml) y 0.01 ml de H2O2. Se agit 30 seg. en Vortex y se repos otros 30 seg. Para iniciar la reaccin se agregaron 0.02 ml de la solucin de luminol-piodofenol. La mezcla se agit 7-10 segundos y se determin la Imax . Despus se agregaron 0.01 ml de buffer, el contenido se agit y se volvi a leer la Imax. Este procedimiento se realiz para variar la cantidad de la fase acuosa en el sistema AOTagua-octano y se repiti hasta no detectar quimioluminiscencia. Para obtener la curva de calibracin que puede ser empleada para deteccin de fenol en el agua con el uso de sistema orgnico se procedi a colocar 1 ml de la solucin del AOT en octano (0.001 M), 0.2 ml de la solucin de enzima: fenol preincubada por 30 seg., 0.01 ml de H2O2 a 0.022 M y 0.2 ml de buffer Tris-HCl 100 mM conteniendo EDTA a 0.1M, posteriormente se llev a cabo el procedimiento ya descrito.

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La deteccin de fenol en solvente orgnico se procedi de manera similar a la anteriormente descrita solo que evitando la preincubacin de enzima con fenol y utilizando las soluciones estndar de ste preparadas en el solvente orgnico.

RESULTADOS En el presente trabajo se propuso la determinacin de fenoles en aguas residuales por medio de la reaccin de oxidacin de luminol catalizada por la peroxidasa de rbano picante (HRP) que se basa en el efecto inhibitorio que tiene el fenol sobre la actividad de la enzima. Se ha reportado en previos trabajos de investigacin que el efecto sobre la actividad enzimtica detectada espectrofotmtricamente es directamente proporcional a la concentracin de fenol (Gazaryan I. 1994; Navas A. 1995; Lpez L. B. 1998). Al determinar las intensidades mximas de quimioluminiscencia en la reaccin efectuada en la solucin amortiguadora utilizando diferentes concentraciones de fenol, se observ un efecto que condujo a la construccin de 2 curvas de calibracin. Una de estas curvas presenta una tendencia creciente y funciona para concentraciones de fenol de 0.00025 a 0.003 mg/ml (Figura 1), mientras que la otra curva, presenta un comportamiento decreciente en la seal, y es efectiva para la determinacin de concentraciones de 0.006 a 0.128 mg/ml e incluso mayores, si se aumenta el rango de concentraciones de fenol (Figura 2). Para comprobar la eficacia del mtodo diseado, se procedi a analizar tres muestras proporcionadas por COMIMSA, las cuales contenan una concentracin de fenol determinada por el mtodo establecido en la Norma Oficial Mexicana (NOM-AA50-1981. 1998). Al aplicar el mtodo quimioluminiscente diseado, se obtuvieron concentraciones de fenol similares a las reportadas utilizando la metodologa de la NOM (Tabla 1). En el presente trabajo se propuso tambin demostrar la posibilidad de la aplicacin de la reaccin quimioluminiscente de oxidacin de luminol como herramienta analtica en la deteccin de fenoles en los medios hibrofbicos. Para esto se emple el sistema surfactante-agua-solvente orgnico.

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900

850

800

750

700 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Fig. 1 Curva de calibracin para la deteccin de fenol a concentraciones de 0.00025 a 0.003 mg/ml.

1000 900 800 700 600 500 400 0 20 40 60 80 100 120 140

Fig. 2. Curva de calibracin para la deteccin de fenol a concentraciones de 0.006 a 0.128 mg/ml.5

Tabla 1 Comparacin de concentraciones detectadas con el mtodo quimioluminiscente propuesto, con las concentraciones detectadas por el mtodo comn. Tipo de Muestra Mtodo comn Mtodo propuesto ( en medio acuoso ) Muestra I (destilado) Muestra II (destilado) Muestra III (destilado) 52.3 g/ ml 5.3 g/ml 7.3 g/ml 50.8 g/ml 6 g/ml 8.8 g/ml

Se procedi a la determinacin de la concentracin y el tipo de surfactante a utilizar. En el sistema de inters ste cumple el papel de agente emulsificante que facilita la solubilizacin de las porciones de fase acuosa que contiene la enzima, en la matriz del solvente orgnico (Kingzelts. 1966; Galindo E. 1996). En el sistema estudiado se observ que a las concentraciones de 0.01 M y ms elevadas se ejerce un efecto inhibitorio ya sea sobre la enzima o sobre algn componente reactivo involucrado en la produccin de la seal quimioluminiscente por lo que ste es nulo (Martinek K. y col. 1986; Galindo E. 1996). Por otra parte, si la concentracin de surfactante se encuentra muy baja se presenta una separacin de fases (Martinek K. y col. 1986). La concentracin del surfactante (AOT y Tritn X-100) escogida en este estudio como adecuada fue de 0.001M. En la Figura 3 se comparan las intensidades detectadas en sistemas con el AOT y Tritn X-100. Se puede apreciar que los valores de intensidad en presencia de AOT a bajos contenidos de agua lo que corresponde a menores valores de W0, son mayores en comparacin con los obtenidos con Tritn X-100. De tal manera que en estas condiciones el sistema es ms estable que en caso de alto contenido de agua, por esa razn se propuso utilizar el AOT como el surfactante adecuado para el empleo en diseo de este mtodo enzimtico.

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30 25

Imax. mv

20 15 10 5 0 2200 4200 6200 8200 10200 12200 14200 16200

WoAOT Triton X-100

Fig. 3. Comparacin de intensidad mxima en presencia de AOT y Tritn X-100 en funcin del grado de hidratacin del sistema (W0 = (moles de agua)/ moles de surfactante). As, como condiciones adecuadas, para este sistema, se escogieron las siguientes: utilizacin de AOT como surfactante a una concentracin de 0.001 M, el empleo de octano como solvente orgnico, la concentracin de perxido de 0.022 M y el volumen de fase acuosa de 0.05 ml (que corresponde a W0 ptimo de 2,700, ver Figura 3). Una vez establecidas las condiciones ptimas, se procedi a probar el sistema AOT-agua-octano en la deteccin de contaminantes hidroxiaromticos en medio acuoso, para establecer una metodologa que cumpla dicha funcin. Al realizar la curva de calibracin utilizando la solucin acuosa de fenol a diferentes concentraciones, se detect algo similar a lo descrito anteriormente para el sistema con el amortiguador. De igual manera, se observ que a concentraciones de 0.00025 hasta 0.003 mg/ml (Fig. 4) el fenol no ejerce un efecto inhibitorio de la reaccin quimioluminiscente mediada por la peroxidasa de rbano picante. Bajo estas condiciones la intensidad registrada se mantiene (o incrementa de manera no significativa) para cada concentracin de fenol. Por otro lado, en la Figura 5 se observa una inhibicin de la quimioluminiscencia, que demuestra la posibilidad de la deteccin de fenoles en medio acuoso en un rango de concentraciones de 0.006 mg/ml a 0.128 mg/ml. La interpolacin7

de los valores de quimioluminiscencia presentada por una muestra a analizar permite determinar la concentracin de fenol en una solucin acuosa.120 100 80 60 40 20 0 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3

Fig.4. Intensidad mxima de quimioluminiscencia en sistema AOT-agua-octano en funcin de concentraciones de fenol de 0.00025 a 0.003 mg/ml.

120

100

80

60

40

0

20

40

60

80

100

120

140

Fig. 5. Curva de calibracin obtenida en el sistema AOT-agua-octano para la deteccin de fenol en la solucin acuosa.8

De igual manera, como en el mtodo con el sistema acuoso, se procedi a demostrar la eficacia de la metodologa planteada comparando los resultados con los registrados por la metodologa establecida en la Norma Oficial mencionada obteniendo en ambos casos los valores de la concentracin de fenol en aguas residuales muy similares. En este trabajo la reaccin quimioluminiscente catalizada por la peroxidasa fue tambin empleada para la construccin de una curva de calibracin para determinacin de fenol en medio orgnico. En este caso las soluciones patrn de fenol se prepararon en el octano. Al aplicar las condiciones ptimas definidas anteriormente para el sistema AOT-agua-octano, en presencia de soluciones patrn de fenol se observ que las intensidades mximas de quimioluminiscencia decrecen al incrementar la concentracin de fenol. Para observar mejor el proceso de inhibicin, se opt por presentar este efecto en dos curvas diferentes. En la Figura 6 se muestra la primera de estas curvas, que corresponde a los datos obtenidos con la utilizacin de las concentraciones de fenol disuelto en octano en un rango de 0.00025 hasta 0.003 g/ml. A su vez, en la Figura 7 se observa la curva complementaria de la anterior, donde se probaron las concentraciones mayores de fenol y se aunaron a los datos obtenidos en la curva anterior. De esta manera, siguiendo la reaccin de peroxidacin de luminol catalizada por la peroxidasa de rbano picante en un sistema con AOT y octano, se obtuvieron las curvas de calibracin que permiten la deteccin de concentraciones de fenol en medio orgnico dentro de un rango de 0.00025 mg/ml hasta 0.128 mg/ml (Figuras 6 y 7).

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35

30

25

20

15 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Fig. 6. Curva de calibracin para la deteccin de fenol en medio orgnico a concentraciones de 0.00025 a 0.003 mg/ml.

35 30 25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140

Fig. 7. Curva de calibracin para la deteccin de fenol en medio orgnico a concentraciones hasta de 128 mg/ml.

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CONCLUSIONES 1. Utilizando la reaccin de peroxidacin de luminol catalizada por la peroxidasa de rbano picante, se estableci un mtodo de microanlisis quimioluminiscente efectivo, sensible y sencillo para la deteccin de contaminantes fenlicos en medio acuoso. 2. Se demostr que en el medio acuoso el fenol a concentraciones menores de 3 g/ml acta como promotor de la reaccin quimioluminiscente. 3. En el sistema surfactante- agua -solvente orgnico, mayores intensidades de quimioluminiscencia se detectaron al aplicar como surfactante el AOT a una concentracin de 0.001 M en octano, 0.022 M de H2O 2 y 0.05 ml de fase acuosa que corresponde a un valor de W0 de 2700. 4. Se estableci una metodologa para la deteccin de contaminantes hidroxiaromticos en medio acuoso y medio orgnico utilizando un sistema AOT-agua- octano y la reaccin de peroxidacin de luminol catalizada por la peroxidasa de rbano picante.

AGRADECIMIENTOS Los autores del presente trabajo agradecen el apoyo financiero de CONACYTSIREYES 970406030, la asistencia tcnica brindada por Corporacin Mexicana de Investigacin en Materiales S.A. de C.V. y a la Dra. Consuelo de Jess Corts Penagos por su participacin en la discusin de los resultados.

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REFERENCIAS

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