QUIMICA ANALITICA E INTRUMENTAL

Espectrometra molecular por luminiscencia

Espectroscopia de fluorescencia.

Espectroscopia de fosforescencia.

Quimioluminiscencia.Evelyn Atehortua.

Danilo Olaya Bernal.

1

La fluorescencia y fosforescencia se parecen en que laexcitacin se consigue mediante la absorcin de fotones ypor eso se alude a ellas como fotoluminiscencia.

La quimioluminiscencia se basa en la radiacin que emiteuna especie excitada que se forma en el curso de unareaccin qumica.

La medicin de la intensidad de la fotoluminiscenciafacilita la determinacin cuantitativa de un conjunto deespecies inorgnicas y orgnicas importantes cuandoestn presentes en cantidades de trazas.

2

Espectroscopia de fluorescencia.

Tambin es llamada fluorometra o espectrofluorimetra.

La fluorescencia es un proceso de emisin en el cual lasmolculas son excitadas por la absorcin de radiacinelectromagntica y al relajarse al estado basal liberan elexceso de energa en forma de fotones.

Una de las caractersticas ms atractivas de los mtodos defluorescencia es su sensibilidad, pero estos mtodos seaplican muy poco debido al nmero relativamente limitadode sistemas qumicos que se pueden hacer fluorescer.

3

La fluorescencia molecular se mide excitando una muestra auna longitud de onda de absorcin y midiendo la emisin auna longitud de onda mayor llamada longitud de onda deemisin o de fluorescencia.

Por ejemplo, la forma reducida de la coenzimadinucletido de nicontinamida y adenina absorberadiacin a 340 nm, y la molcula emite radiacin enforma de fotoluminiscencia con un mximo de emisin de465 nm.

4

Despus los electrones vuelven al estadofundamental emitiendo radiacin de estas dosmismas longitudes de onda en todas lasdirecciones, este tipo de fluorescencia, en lacual la radiacin absorbida se vuelve a emitir sincambio de frecuencia se le conoce comofluorescencia de resonancia.

5

Espectroscopia de fosforescencia.

La fosforescencia es un fenmeno por el cual ciertas sustancias tienen la propiedad de absorber energa y almacenarla para poder trasmitirla posteriormente.

6

En este mtodo al igual que el de espectroscopia porfluorescencia, las molculas de analito se excitan para dar unaespecie cuyo espectro de emisin suministra informacin para elanlisis cualitativo y cuantitativo.

La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitacinse consigue mediante la absorcin de fotones. Comoconsecuencia, con frecuencia se alude a los dos fenmenos con eltrmino ms general de fotoluminiscencia.

7

La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que lastransiciones electrnicas responsables de la fluorescencia noconllevan un cambio en el espn del electrn. Comoconsecuencia, la fluorescencia presenta una vida cortacesando la luminiscencia casi inmediatamente (10-5S).

Por el contrario, las emisiones de fosforescencia estnacompaadas por un cambio en el espn del electrn, quehace que la radiacin se mantenga durante un tiempodespus de haber acabado la irradiacin, a menudo variossegundos e incluso minutos.

(ver video.)

8

Teora de la fluorescencia y fosforescencia.

La fluorescencia tiene lugar en sistemas qumicos gaseosos,lquidos y solidos, tanto sencillos como complejos.

Muchas especies moleculares tambin presentanfluorescencia de resonancia, pero lo mas frecuente esencontrar bandas de fluorescencia o de fosforescenciamolecular centradas en longitudes de onda mas largas que lalnea de resonancia.

9

10

Variables que afectan la fluorescencia y la fosforescencia.

Tanto la estructura molecular como el entorno qumicodeterminan que una sustancia sea o no luminiscente. Estosfactores tambin determinan la intensidad de emisincuando tiene lugar la luminiscencia. Adems de otrosfactores.

11

Rendimiento cuntico

Es simplemente la relacin entre el nmero de molculas queemiten luminiscencia respecto al nmero total de molculasexcitadas.

Para molculas altamente fluorescentes, la eficacia cuntica,bajo determinadas condiciones, se aproxima a la unidad. Lasespecies qumicas que no presentan una fluorescenciaapreciable tienen eficacias que se aproximan a cero.

12

Fluorescencia y estructura.

La fluorescencia mas intensa y la mas til es la de loscompuestos que contienen grupos funcionales aromticos contransiciones de baja energa. Los compuestos que contienengrupos carbonilo en estructuras alifticas y alicclicas oestructuras con dobles enlaces altamente conjugados, lamayora de los hidrocarburos aromticos no sustituidos sonfluorescentes en solucin; la eficacia cuntica aumenta deordinario en relacin con la cantidad de anillos y con su gradode condensacin.

13

Efectos de la temperatura y del disolvente

La fluorescencia disminuye en la mayora de las molculas alaumentar la temperatura ya que cuando la temperatura es elevadaaumenta la probabilidad de desactivacin por conversin externa.Una disminucin en la viscosidad del disolvente tambin aumentala probabilidad de la conversin externa y conduce al mismoresultado.

La fluorescencia de una molcula se reduce en presencia dedisolventes que contienen tomos pesados o de solutos condichos tomos en su estructura cuando se desea resaltar lafosforescencia, se incorporan a los disolventes compuestos quecontienen tomos pesados.

14

Efecto del pH en la fluorescencia.

La fluorescencia de un compuesto aromtico consustituyentes cidos o bsicos en el anillo depende del pH. Esprobable que tanto la longitud de onda como la intensidad deemisin sean diferentes en las formas protonadas y noprotonadas del compuesto.

Los cambios en la emisin de los compuestos de este tiposurgen del distinto nmero de especies resonantes asociadascon las formas acidas y bsicas de las molculas.

15

Por ejemplo, la anilina tiene varias formas resonantes, pero el ion anilinio solo tiene una. Es decir, Las formas resonantes adicionales ocasionan un primer estado excitado mas estable; la consecuencia es una fluorescencia en la regin ultravioleta.

16

Efecto del oxgeno disuelto

La presencia de oxgeno disuelto suele reducir la intensidad defluorescencia de una disolucin. Este efecto puede ser elresultado de una oxidacin de las especies fluorescentes.

17

Instrumentos para medir fluorescencia y fosforescencia.

Los componentes de los instrumentos para medir lafotoluminiscencia son similares a los de los fotmetros oespectrofotmetros ultravioleta/visible.

Casi todos los instrumentos para la medicin de lafluorescencia utilizan equipo ptico de doble haz, paracompensar las fluctuaciones en la potencia radiante.

18

Otros son los Fluormetros de filtro; Utilizan filtros paraaislar la luz incidente y la luz fluorescente.

19

Espectrofluormetros. Usan monocromadores de retculode difraccin para aislar la luz incidente y la luzfluorescente.

20

Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema:

La fluorescencia se mide ms a menudo en un ngulo de 90 enrelacin a la luz de excitacin. Esta geometra se utiliza en lugarde colocar el sensor en la lnea de la luz de excitacin en unngulo de 180 a fin de evitar la interferencia de la luz deexcitacin transmitida.

21

Algunos instrumentos son hbridos porque usan un filtropara seleccionar la longitud de onda de excitacin y unmonocromador para elegir la longitud de onda de emisin;a menudo se les llama todava Espectrofluormetros.

Los verdaderos Espectrofluormetros facilitan la produccinde un espectro de excitacin de la fluorescencia o unespectro de emisin de fluorescencia.

22

Componentes de los Fluormetros y de los Espectrofluormetros.

Fuentes la magnitud de la seal de salida en las medicionesde luminiscencia es directamente proporcional a la potenciade la fuente radiante. Por esta razn, se usan fuentes masintensas en los mtodos luminiscentes, y ya no las lmparasde tungsteno o deuterio que se emplean en las medicionesde absorcin.

23

Lmparas La mas comn para los Fluormetros de filtro es lalmpara de vapor de mercurio a baja presin equipada con unaventana de slice fundida. Esta fuente emite lneas tiles paraproducir la fluorescencia a 254, 302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm.

Para los Espectrofluormetros, en los que se requiere una fuente deradiacin continua, se utiliza normalmente una lmpara de arco dexenn de alta presin, de 75 a 450 W. Estas requieren una fuente dealimentacin potente, capaz de producir corrientes continuas de 5 a20 A y de 15 a 30 V. El espectro de una lmpara de arco de xenn escontinuo desde alrededor de 300 a 1300 nm.

24

Filtros y monocromadores.

Los filtros de interferencia y de absorcin se utilizan en losFluormetros para seleccionar la longitud de onda tanto del haz deexcitacin como de la radiacin fluorescente resultante.

Los Espectrofluormetros estn equipados con al menos uno y aveces dos monocromadores de red.

(Ver imagen)

25

Detectores.

Las seales de emisin de luminiscencia son de baja intensidad. Portanto, se requieren transductores o detectores sensibles.

Los tubos fotomultiplicadores son los transductores que mas seutilizan en instrumentos de fluorescencia sensibles. Con frecuenciafuncionan en la modalidad de recuento de fotones para mejorar larelacin seal-ruido con este mismo fin, a veces los transductores serefrigeran.

26

Celdas y compartimientos para las celdas.

Para mediciones de fluorescencia se utilizan celdas ocubetas tanto cilndricas como rectangulares, fabricadas convidrio o con slice. Se debe tener cuidado en el diseo delcompartimiento de la celda para reducir la cantidad deradiacin dispersada que llega hasta el detector.

A menudo se introducen deflectores en el compartimientocon este propsito. Mas importante aun que en las medidasde absorbancia es evitar dejar huellas dactilares en lascubetas, ya que la grasa de la piel con frecuencia manifiestafluorescencia.

27

Calibracin del instrumento.

Debido a las variaciones de la intensidad de la fuente, lasensibilidad y otras variables instrumentales, es imposibleobtener exactamente las mismas lecturas con un Fluormetro oun espectrofotmetro para una solucin o un conjunto desoluciones. Por esta razn, es una practica habitual calibrar elinstrumento a un nivel de sensibilidad reproducible. Lacalibracin se efecta casi siempre con una solucin patrn deun fluoroforo estable.

El reactivo mas comn para este cometido es una disolucinpatrn de sulfato de quinina cuya concentracin sea casi 105 M.Por lo general se excita con una radiacin de 350 nm y emiteradiacin a 450 nm.

28

Aplicaciones de los mtodos fotoluminiscentes:

La espectrometra de fluorescencia se utiliza en anlisisbioqumicos, mdicos, qumicos y de investigacin decompuestos orgnicos. Tambin se ha utilizado paradiferenciar los tumores malignos de piel de los benignos.

La fluorescencia tambin puede utilizarse para reorientarlos fotones.

29

QUIMIOLUMINISCENCIA

La aplicacin de la quimioluminiscencia a la qumicaanaltica es reciente. Las reacciones qumicas que producenquimioluminiscencia son pocas, lo que limita elprocedimiento a un numero relativamente pequeo deespecies.

30

La quimioluminiscencia se produce cuando una reaccinqumica genera una especie electrnicamente excitada queemite luz cuando vuelve al estado fundamental.

Las reacciones quimioluminiscentes se producen en variossistemas biolgicos, en los que el proceso se sueledenominar bioluminiscencia. Entre los ejemplos de especiesque presentan bioluminiscencia estn las lucirnagas,ciertas medusas, bacterias, protozoos y crustceos.

31

GRACIAS.

32