¿Qué significa LD50?

LD son las siglas de "Dosis letal". LD50 es la cantidad de un material determinado completo de una sola vez, que provoca la muerte del 50% (una mitad) de un grupo de animales de prueba. El LD50 es una forma de medir el envenenamiento potencial a corto plazo (toxicidad aguda) de un material.

Los toxicólogos pueden utilizar muchas clases de animales pero muy a menudo las pruebas se hacen con ratas y ratones. Usualmente se expresa con una cantidad de químico administrado (miligramos) por 100 gramos (o kilogramos) del peso corporal del animal. EL LD50 se puede encontrar por cualquier vía de entrada o administración pero los métodos de administración dermal (aplicado en la piel) y oral (administrado por la boca) son los más comunes.

¿Qué significa LC50?

LC son las siglas de "Concentración Letal". Los valores LC usualmente se refieren a la concentración de un químico pero en estudios ambientales también puede significar la concentración de un químico en agua.

Para experimentos de inhalación, la concentración del químico en el aire que mata el 50% de los animales de ensayo en un tiempo determinado (usualmente 4 horas) es el valor de LC50.

¿Por qué se estudia el LD50?

Los químicos pueden tener un alto rango de efectos en nuestra salud. Dependiendo de cómo se utilizará el químico, se pueden requerir muchas clases de pruebas de toxicidad. Puesto que diferentes químicos provocan diferentes efectos tóxicos, comparar la toxicidad de uno con otro es difícil. Se puede medir la cantidad de un químico que provoca daño al riñón, por ejemplo, pero no todos los químicos dañarán al riñón. Se puede decir que el daño a los nervios se observa cuando se administran 10 gramos de químico A, y el daño del riñón se observa cuando se administran 10 gramos del químico B. Sin embargo, ésta información no dice si A o B es más tóxico porque no se sabe cúal daño es más crítico o nocivo.

Por lo tanto, para comparar la potencia tóxica o intensidad de diferentes químicos, los investigadores deben medir el mismo efecto. Una forma de realizar pruebas de letalidad (las pruebas LD50) es midiendo qué tanto de un químico se necesita para provocar muerte. Este tipo de prueba se conoce también como prueba "cuantal" porque mide un efecto que "ocurre" o "no ocurre".

¿Quién inventó la idea de un LD50?

En 1927, J.W. Trevan intentó encontrar una fórmula para estimar la relativa potencia de envenenamiento de drogas y medicinas usadas en esa época. Desarrolló la prueba LD50 porque el uso de muerte como "meta" permite comparaciones en químicos que envenenan al cuerpo en muchas formas diferentes. A partir del trabajo temprano de Trevan, otros científicos han desarrollado diferentes enfoques para métodos más directos y rápidos de obtener el LD50.

¿Cuáles son otros términos de dosis de toxicidad de uso común?

LD01 Dosis letal para 1% de la población animal de ensayo

LD100 Dosis letal para 100% de la población animal de ensayo

LDLO La dosis más baja que provoca letalidad

TDLO La dosis más baja que provoca un efecto tóxico.

¿Por qué los valores LD50 y LC50 son una medida de toxicidad aguda?

La toxicidad aguda es la habilidad de un químico de provocar efectos adversos relativamente pronto luego de una administración oral o una exposición de 4 horas a un químico en el aire. "Relativamente pronto" se define usualmente como un período de minutos, horas (hasta 24) o días (hasta cerca de dos semanas) pero rara vez más allá de esto.

¿Cómo se realizan las pruebas LD/LC50?

En casi todos los casos, las pruebas LD50 se realizan utilizando una forma pura del químico. Rara vez se estudian las mezclas.

El químico se puede dar a los animales por la boca (oral); aplicándolo en la piel (dermal); por inyección en sitios como venas arteriales (intravenosa), en los músculos (ej., intramuscular) o en la cavidad abdominal (i.v. - intraperitoneal).

El valor LD50 obtenido al final del experimento se identifica como el LD50 (oral), LD50 (piel), LD50 (i.v.), etc., según corresponda. Los investigadores pueden hacer la prueba con cualquier especie animal pero usan ratas o ratones comúnmente. Otras especies incluyen perros, hámsters, gatos, conejillos de indias, conejos y monos. En todo caso, el valor LD50 se expresa como el peso del químico administrado por kilogramo de peso corporal al animal y establece la prueba animal utilizada y la ruta de exposición o administración; LD50 (oral, rata)-5 mg/kg, LD50 (piel, conejo) ¿5 g/kg. Por lo tanto, el ejemplo, "LD50 (oral, rata) 5mg/kg significa que 5 miligramos de ese químico por cada kilogramo de peso corporal de la rata, cuando se administra en una dosis bucal, provoca la muerte del 50% del grupo de ensayo.

Si los efectos letales por respirar un compuesto se están probando, el químico (usualmente un gas o vapor) se mezcla primero en una concentración conocida en una cámara de aire especial en donde se colocan los animales de prueba. Esta concentración usualmente se

cotiza como partes por millón (ppm) o miligramos por metro cúbico (mg/m3). En este experimento, la concentración que mata el 50% de los animales se llama un LC50 (Concentración Letal 50) en vez de un LD50. Cuando se reporta un valor LC50, también se debe establecer el tipo de prueba animal estudiado y la duración de la exposición, ejemplo, LC50 (rata) - 1000 ppm/ 4 hr o LC50 (ratón) - 5mg/m3/ 2hr.

¿Cuál información LD50 es la más importante para efectos de seguridad y salud ocupacional?

La inhalación y la absorción por la piel son las rutas más comunes por las que los químicos en el lugar de trabajo entran al cuerpo. Por lo tanto, lo más relevante desde el punto de vista de exposición ocupacional son las pruebas de inhalación y de aplicación por piel. A pesar de este hecho, el estudio de letalidad realizado más frecuentemente es el LD50 oral. Esta diferencia ocurre porque dar químicos a los animales por la boca es mucho más fácil y menos costoso que otras técnicas. Sin embargo, los resultados de los estudios orales son importantes para drogas, intoxicación por alimentos, e intoxicación doméstica accidental. Las intoxicaciones orales ocupacionales pueden darse por contaminación de los alimentos o cigarrillos por manos sucias, y por ingestión accidental.

¿Cómo se compara un valor LD50 con otro y qué significa para los humanos?

En general, entre más bajo sea el valor LD50, más tóxico es el químico. Lo opuesto es también cierto: entre más alto el valor LD50, más baja la toxicidad.

El LD50 da una medida de la toxicidad aguda o inmediata de un químico en un grupo de cepa, sexo y edad de una especie animal en particular que se está probando. El cambiar cualquiera de éstas variables (ejemplo, tipo de animal o edad) puede resultar en un valor LD50 diferente. La prueba LD50 no se diseñó ni se pretende para dar información sobre los efectos de exposición a largo plazo de un químico.

Una vez que se tiene un valor LD50, se puede comparar con otros valores utilizando la escala de toxicidad. A veces ocurre confusión porque están en uso diferentes escalas de toxicidad. Las dos escalas más comúnmente usadas son la "Escala Hodge y Sterner" y la "Escala Gosselin, Smith y Hodge". Estas tablas difieren en la categorización numérica dada a cada clase y en los términos utilizados para describir cada clase. Por ejemplo, un químico con un valor oral LD50 de 2 mg/kg, se clasificará como "1" y "altamente tóxico" de acuerdo con la escala Hodge y Sterner (ver tabla 1) pero se clasificarán "6" y "super tóxico" de acuerdo con la escala Gosselin, Smith y Hodge (ver tabla 2). Es importante hacer referencia a la escala que se está utilizando cuando está clasificando un compuesto.

Tambien es importante saber que el valor real LD50 puede ser diferente para un químico dado dependiendo de la ruta de exposición (por ejemplo, oral, dermal, inhalación). Por ejemplo, algunos LD50 para diclorvos, un insecticida comúnmente utilizado en bandas de pesticidas domésticos, se detallan a continuación:

TITULACION de VIRUS

1.- Introducción

"Titular" una preparación de ácido, base, anticuerpo, antígeno, significa determinar la cantidad del elemento en cuestión que esa preparación contiene. Lo mismo se aplica en el caso de las preparaciones virales.

Para preparar los sustratos celulares infectados para inmunofluorescencia, ELISA, inmunoperoxidasa o hibridización es necesario conocer la cantidad de virus conque se trabaja, es decir el "título" de la suspensión viral. Esto es así porque para que una infección viral sea eficiente se debe trabajar con determinada "multiplicidad de infección" (m.i.), que se define como la cantidad de virus inoculado por célula del cultivo celular. La obtención de resultados reproducibles depende del control de todos los elementos que intervienen en el ensayo, y la m.i. es uno de ellos, que debe definirse para cada procedimiento.

Además, en ciertos casos de aislamiento viral puede resultar importante conocer cuál es la cantidad de virus aislada.

2.- Conteo de partículas virales

Para determinar la cantidad de virus en un material puede recurrirse al conteo directo de partículas virales aplicando técnicas de microscopía electrónica. Este método es técnicamente complejo y tiene la grave desventaja de no considerar la actividad biológica de las partículas virales.

Qué significa ésto? Un virus es una partícula macromolecular que se detecta debido a su actividad biológica, que se manifiesta cuando la partícula infecta un huésped susceptible. La visualización de esa actividad puede consistir en la observación de efecto citopático (ECP), o formación de sincicios o tumores en un cultivo celular, formación de pústulas en la membrana corioalantoidea o muerte de un embrión de pollo, muerte o enfermedad de un animal de experimentación. Desde el punto de vista biológico lo que interesa es la expresión de la actividad biológica (o infectiva) de la partícula viral, ya que existen partículas virales que por defectos en su material genético u otro tipo de alteraciones en su estructura no son infectivas, es decir no tienen actividad biológica. Estas partículas están presentes en todas las preparaciones virales, en cantidades variables (1).

Para fines diagnósticos propiamente dichos, o para la preparación de reactivos para diagnóstico, lo que interesa cuantificar es la capacidad infectiva del virus, para lo cual no es adecuado el conteo de partículas por microscopía electrónica. Debe observarse el efecto que el virus produce en el huésped inoculado. Si se observa un solo “ejemplar” de huésped, el efecto o respuesta es de "todo o nada", es una respuesta negativa o positiva. Por ej.: hay efecto citopático o no lo hay; el animal de experimentación muere o sobrevive, aparecen pústulas en el embrión de pollo o no. Para poder hacer una cuantificación deben utilizarse varias réplicas del huésped elegido (cultivos celulares, animales, huevos embrionados). Cada réplica se denomina "unidad de prueba". Cuanto mayor es el número de unidades de prueba, más precisa resulta la determinación

3.- Método de Titulación por el Punto Final

3.1.- Curva Dosis-Respuesta

Si se grafica "Efecto viral" versus "cantidad de virus" se obtiene una curva sigmoidea, "Dosis- Respuesta" clásica (Fig. 1). Por esta razón la forma habitual y más sencilla de expresar títulos virales es según el número de dosis presentes en la muestra. La "respuesta" se mide como "porcentaje de efecto", siendo el efecto cualquiera de los mencionados anteriormente, según el virus y el huésped. La "Dosis" se expresa como dilución de la muestra viral. En general se usan diluciones al décimo, y se trabaja con el log10 de las diluciones.

Puede expresarse el título como Dosis Infecciosa Máxima o Dosis Infecciosa Mínima. En los casos en que la infectividad se evidencia por la muerte de animales de laboratorio la denominación es Dosis Letal Máxima o Mínima respectivamente.

Observando en la Fig. 1 la forma de la curva "Dosis-Respuesta"-- en nuestros términos "Porcentaje de Efecto-Dilución de muestra" -- vemos que en las zonas de efecto máximo y mínimo no puede asignarse unívocamente un "Porcentaje de Efecto" a una determinada "Dosis o Dilución". Para una determinación precisa debe trabajarse en una zona de diluciones tal que a una pequeña variación en la dilución le corresponda una variación claramente detectable en la respuesta. Por esta razón se elije la zona correspondiente al 50% de efecto, y el título de la muestra se expresa como número de "Dosis Infecciosas 50%" (DI50), que representa la dosis (dilución de muestra) que produce efecto (muerte o enfermedad del animal o embrión, efecto citopático en cultivos celulares) en el 50% de las unidades de prueba. Según el tipo de efecto buscado la DI50 puede expresarse como Dosis Letal 50%, Dosis Infectante de Cultivo de Tejidos 50%, Dosis Infectante de Embriones 50% (DL50, DICT50, DIE50, respectivamente).

3.2.- Método de Reed y Muench

Normalmente el 50% del efecto buscado no corresponde exactamente a una de las diluciones de trabajo, por lo que es necesario hacer una interpolación matemática para definirla. El método más empleado para este fin es el de Reed y Muench . Se basa en la suposición de que el número de unidades de prueba afectadas varía proporcionalmente al log10 de la dilución, es decir que a diluciones menores (mayor concentración de virus) el porcentaje de efecto será mayor que a diluciones mayores (menor concentración de virus). Además, se supone que en la zona cercana al 50% de Efecto éste varía linealmente con la dosis. Es muy importante no omitir ninguna dilución intermedia.

Ejemplo: Supongamos que se inoculan 6 ratones por dilución y que el efecto buscado es la muerte de los ratones. Se confecciona la siguiente tabla con los resultados (adaptada de (1)):

El análisis del control metabólico (ACM o MCA en inglés) o Teoría del Control Metabólico (TCM o MCT en inglés) es un desarrollo matemático para la descripción de vías metabólicas, de señalización y genéticas. ACM cuantifica cómo las variables, cómo los flujos o las concentraciones de metabolitos, dependen de los parámetros de la red en que está inmersa. En particular, es capaz de describir cómo las propiedades que dependen de la red (descritos por los coeficientes de control) dependen de las propiedades locales (descritos por los coeficientes de elasticidad) [Kacser & Burns 1973; Heinrich & Rapoport 1974; Kacser 1983; Fell & Sauro 1985. Por lo tanto, en estudios del ACM se estudia el control relativo ejercido por cada uno de los pasos (reacciones enzimáticas) en las variables del sistema (flujos y las concentraciones de metabolitos). Este control se mide mediante la aplicación de una perturbación mientras se mide o estudia el efecto en la variable de interés despés de que el sistema ha alcanzado un nuevo estado estacionario.

El problema inverso, es decir el cálculo de los coeficientes de elasticidad como función de los coeficientes de control, ha sido también estudiado como parte de una disciplina denominada Diseño del Control Metabólico (DCM) [Acerenza 1993]. Este tipo de disciplinas (tanto el ACM como el DCM) están inmersos en la disciplina denominada biología de sistemas.

El coeficiente de elasticidad: es un constructo matemático adimensional que cuantifica la capacidad de respuesta de una reacción enzimática a cambios en un parámetro (e.g. concentración de sustrato, producto, efectores, temperatura, etc.) mientras los demás parámetros permanecen constantes. Operativamente se define como el cociente entre el cambio relativo en la velocidad enzimática (v) y el cambio relativo en el parámetro (P). El valor del coeficiente de elasticidad nos proporciona, por lo tanto, una idea de la capacidad de respuesta de una reacción enzimática al cambio en un determinado parámetro. De manera más explícita, un valor alto nos dice que el sistema posee una mayor sensibilidad y una baja sensibilidad en caso contrario.

El coeficiente de control: mide el cambio relativo en estado estacionario en un sistema variable (e.g. flujos o concentraciones) en respuesta a un cambio relativo en un parámetro (e.g. actividad enzimática). Los dos principales coeficientes de control son los de flujo y concentración. Es fácil demostrar que existe una relación entre el coeficiente de elasticidad, el coeficiente de control y el coeficiente de respuesta. Los coeficientes de respuesta nos dicen qué tan sensible es un flujo o la concentración de un metabolito a cambios de un efector de carácter externo (I) y se define como el cociente entre el cambio relativo en el flujo (o concentración de metabolito) y el cambio relativo del parámetro externo.

Uno de los resultados fundamentales del ACM son los llamados teorema de suma-ción (Kacser & Burns, 1979). Estos teoremas demuestran que el control es, en principio, compartido por todas las reacciones en el sistema. Cuando el coeficiente de control con respecto a una reacción cambia, al menos el valor de otro coeficiente de control debe cambiar para compensar ese cambio. Matemáticamente estos teoremas muestra que la suma de los coeficientes de control para un flujo determinado suman uno y para un me-tabolito cero.

Se define como reacción (o enzima) limitante, a aquella reacción (enzima) cuyo co-eficiente de control de flujo es igual a la unidad. Encontrar la enzima limitante de una vía implica encontrar aquella enzima o paso que controla toda la vía convirtiéndola en un ob-jetivo ideal para el aumento de su flujo. Los teoremas de sumación indican algunas dificultades a la hora de diseñar un fármaco que altere alguna variable metabólica, ya que en principio, implican un reparto del control. El coeficiente de control de flujo medio es el inverso de la cantidad de

reacciones del sistema lo que sugiere que, para sistemas grandes, la mayor parte de los coeficientes de control de flujo serán pequeños. Una droga actuando sobre una reacción elegida al azar, tendrá baja probabilidad de producir un efecto marcado sobre el flujo de interés. Debido a la normalmente baja sensibilidad del flujo al cambio en las velocidades, para el aumento de un flujo, podría ser necesario el aumento simultáneo de más de una actividad enzimá-tica. Este tipo de modulación múltiple es la que se encuentra en la base del método uni-versal (Kacser & Acerenza, 1993).

Un efector externo cambiará las concentraciones y los flujos del sistema. Sus efectos están caracterizados por un conjunto de coeficientes de control, denominados coeficientes de respuesta, que describen el cambio relativo en una variable del sistema causado por un cambio infinitesimal relativo en el efector. Primeramente, consideremos que el efector externo, A, afecta únicamente una de las enzimas del sistema, Ei, que cataliza la reacción vi. Entonces vi tendrá una elasticidad eviA, distinta de cero. Esta velocidad tendrá un cierto control sobre cierta variable del sistema de interés como por ejemplo, Jk, caracterizado por el coeficiente de control correspondiente:CJkvi. El efecto que produce A sobre la variable del sistema Jk puede ser calculado como el producto de ambos coeficientes y se denomina coeficiente de respuesta parcial (Kholodenko B. , 1988):

(_^(v_i))r_A^(J_k ) = C_(v_i)^(J_k ).ε_A^(v_i )

Kacser en 1973 define el coeficiente de respuesta de una variable Jk, del sistema a un parámetro externo, A y lo nota:

R_A^(J_k )=A/J_k .((∂J_k)/∂A)

Solamente en el caso en que A afecte a una sola reacción se cumple que:

En el caso en donde el efector altere varias reacciones, es demostrado por Kholodenko en 1988, que el coeficiente de respuesta a un parámetro externo es igual al promedio ponderado de los coeficientes de elasticidad con respecto al efector, donde los factores de ponderación son los coeficientes de control de las correspondientes enzimas:

Cabe remarcar, que este tipo de análisis solo se aplica a sistemas en estado esta-cionario en donde ocurren cambios infinitesimales o muy pequeños (casos tal vez no apli-cables al estudiar por ejemplo los efectos de una hormona o el “encendido y apagado” de un gen). Sin embargo, ciertos desarrollos teóricos han acortado esta brecha existente en-tre la teoría tradicional y sus extensiones a grandes cambios y regímenes no estacionarios. Por teoría para grandes cambios ver: (Acerenza, 2000; Acerenza & Ortega, 2007; Ainscow & Brand, 1999d; Ortega & Acerenza, 2002; Small & Kacser, 1993a) (1993b) y para sistemas alejados del estado estacionario o tiempo dependientes (Acerenza, Sauro, & Kacser, 1989; Cascante, Torres, Franco, Meléndez-Hevia, & Canela, 1991; Cascante, Meléndez-Hevia, Kholodenko, Scicilias, & Kacser, 1995; Heinrich & Reder, 1991; Meléndez-Hevia, Torres, Sicilia, & Kacser, 1990; Reijenga, Westerhoff, & Snoep, 2002

Coeficiente de regulación particional En general, cuando sobre un sistema se ejerce un cambio en un parámetro, este cambio generará una serie de cambios a lo largo de las distintas vías que terminaran repercutiendo sobre las distintas variables del sistema (flujos, concentraciones de intermediarios). En particular, si nos enfocamos sobre un paso, el cambio producido sobre éste, puede ser disecado y separado en las contribuciones que se produzcan a causa del efecto que tenga cada uno de los intermediarios metabólicos del sistema sobre él. En este sentido, el coeficiente de regulación particional (Sauro, 1990) o elasticidad condicional (Holzhutter, Jacobasch, & Bisdorff, 1985) nos dice que contribución ha tenido cada componente sobre cambio neto que se ha producido. De esta manera, las concentraciones a las que este paso sea sensible tendrán un coeficiente de regulación particional distinto de cero, y un valor igual a cero, para aquellas concentraciones que no estén afectando el paso en estudio. El coeficiente de regulación particional sobre el flujo Jj debido a Si cuando se modifica vk se define como el producto entre tres factores: el coeficiente de elasticidad de vk con respecto a Si, el coeficiente de control de Si con respecto a vk y el inverso del coeficiente de control del flujo Jj con respecto a la velocidad vk:

Sauro en su artículo de 1990, demuestra la suma de los coeficientes de regulación particional debe ser igual a uno, o lo que es igual:

Esta ecuación nos permite discernir en un análisis con coeficientes de regulación parti-cional obtenidos experimentalmente si estamos teniendo en cuenta todos los efectores internos o si estamos obviando alguno.