prueba de susceptibilidad a

NUEVO SANATORIO DURANGO S.A. DE C.V.MANUAL DE POLITICAS Y PROCEDIMIENTOS CLAVE

PRT-NSD-LAB-37

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD MICROBIANAF. de elaboración:

F. de revisión:

No. De revisión:

LABORATORIO Hoja: 1 de 8SISTEMA DE GESTIÓN DE CALIDAD ISO-9001-2008/NMX-CC-9001-IMNC-2008

PROCEDIMIENTO: Prueba de Susceptibilidad Microbiana

NOMBRE / PUESTO / FIRMAELABORÓ:

Dra. Rosa Elena Hi AlarcónJefe Técnico de Laboratorio

REVISÓ:

Ing. Ma. Elena Aguilar JohnCoordinador de Procesos

AUTORIZÓ:

Dra. Irene Borges CarreteDirector Médico


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F. de revisión:

No. De revisión:


OBJETIVO :

Dar al medico los elementos necesarios para dar tratamiento a infecciones causadas por agentes microbianos de importancia médica.

ALCANCE:Estos discos se utilizan para pruebas semicuantitativas de sensibilidad in Vitro de patógenos bacterianos comunes de crecimiento rápido y de ciertos patógenos bacterianos exigentes, por medio del procedimiento de prueba de difusión de discos en agar. Entre ellos se incluyen Enterobacteriaceae , Staphylococcus spp., Acinetobacter spp., Enterococcus spp., Vibrio cholerae y mediante procedimientos modificados, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y otros estreptococos.

REFERENCIAS:

a) “Microbiología Maédica”, Jawetz E. y col. El manual moderno S.A. DE C.V. México, D.F. 1987.

b) “Diagnostico Microbiologicos” Koneman E.W. Allen S.A. Dowll V.R Jonda W.M. Sommers H.M. Winn W.C. Editorial Médica Panamericana. 3ª Edición, Buenos Aires 1992.

RESPONSABILIDADES:

Del Jefe de Laboratorio:

Supervisar el procesamiento de los especímenes biológicos en todas sus fases; Preanatítica, Analítica y

Postanalítica. Proveer de los insumos necesarios para el adecuado procesamiento de la prueba de

exudado uretral.

Del Químico y del Técnico Laboratorista

Procesar y reportar en tiempo y forma los resultados preeliminares y finales del cultivo bacteriológico de

secreciones.

Procesar y validar el control de calidad interno y cuando aplique el control de calidad externo

Del Flebotomista

Realizar la toma de muestra de forma eficiente



REVISÓ:


AUTORIZÓ:



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F. de revisión:

No. De revisión:


Identificar correctamente las muestras

Transportar las muestras al área de microbiología lo antes posible y entregar la hoja de trabajo;

colocar las muestras en el área respectiva según lo indique el encargado del área.

PROCEDIMIENTO:

INSTRUMENTACION:

Materiales subministrados.- Discos Sensi-DIsc para el análisis de las sensibilidades indicadas en las etiquetas.

Materiales necesarios pero no subministrados.Medios de cultivo auxiliares, reactivos, organismos de control de calidad y equipos de laboratorios necesarios para realizar la prueba de sensibilidad de difusión en disco según el procedimiento normalizado.

FUNDAMENTO:

En la década de 1940 se desarrollaron métodos de difusión en agar utilizando discos de papel de filtro seco impregnados de concentraciones específicas de agentes antimicrobianos. Con el fin de eliminar o minimizar la variabilidad de este análisis, Bauer y cols. Desarrollaron un procedimiento normalizado para el cual se eligió el agar de Mueller Hinton como medio para el análisis.

Varias agencias reguladoras y organizaciones normativas publicaron más tarde procedimientos de referncia normalizados basados en el método de Bauer- Kirby. Entre los primeros procedimientos normalizados con mayor aceptación se incluyen los publicados por la U.S. Food and Drug Administration (FDA) y la Organización Mundial de la Salud (WHO). Los procedimientos fueron adoptados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, antes NCCLS) como norma de aceptación general y se actualizan periódicamente.

Los discos, que contienen una gran variedad de agentes antimicrobianos, se colocan en la superficie de las placas de agar de Mueller Hinton (o de agar de medio de prueba Haemophilus para H. influenzae,, agar GC II con enriquecimiento IsoVitalex para N. gonorrhoeae o agar de Muller Hinton con 5% de sangre dde carnero para S. pneumoniae y para estreptococos β-hemolíticos y del grupo viridans) que han sido inoculadas con cultivos puros de aislados clínicos. Después de la incubación, se examinan las placas y se miden y comparan las zonas de inhibición que rodean los discos con los límites de tamaños de zona establecidos para agentes antimicrobianos individuales a fin de determinar el agente o agentes más convenientes en la terapia antimicrobiana.

PREPARACION DEL PACIENTE:

Es importante instruir al paciente para que se haga un aseo de genitales externos y evitar la apli-cación de algún tipo de tratamiento local o sistémico; asi como lavado vaginal y abstenerse de efectuar el



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F. de revisión:

No. De revisión:


coito por lo menjos tres días antes de la toma de muestra. No deben utilizarse en los días previos a la re-cogida de la muestra, soluciones antisépticas vaginales, óvulos ni pomadas.

TOMA DE MUESTRAS:

a. TÉCNICA.

1. Preparación del inoculo con cultivos de control y de prueba.a. Realice una tinción de Gram. Utilizar únicamente cultivos puros.b. Seleccione de 3 a 5 colonias parecidas y trasládelas con una aguja o asa de inoculación a

4-5ml de caldo adecuado, como caldo de soja Trypticase (o caldo de Muller Hinton para microorganismos de crecimiento exigente).

c. Incube los cultivos de caldo a 35ºC durante 2-6 h, si es necesario, para desarrollar una tur-bidez equivalente al patrón de turbidez 0,5 de MacFarland (aproximadamente de 1 a 2x 108 UFC7ml). También puede preparar una suspensión directa en caldo o solución salina de colonias seleccionadas de una placa de agar que haya sido incubada una noche (se debe utilizar un medio no selectivo para H. influenzae y N. gonorrhoeae, tal como el agar sangre o el agar chocolate). Se prefiere el método de suspensión directa de colonias para Staphylococcus spp., S pneumoniae y otros estreptococos, Haemophilus spp. y N. gono-rrhoeae.

d. Diluya, si es preciso, para obtener una turbidez equivalente a la referencia de turbidez 0.5 de McFarland. Utilice caldo o solución salina estéril como diluyente. Otra opción es norma-lizar el inóculo fotométricamente; para facilitar el ajuste del inóculo de organismos de cre-cimiento rápido, puede utilizarse el sistema de inoculación Prompt (dispositivo volumétrico para la preparación del inóculo).

Los caldos de cultivo preparados el día anterior no se deben utilizar como inóculo.2. Inoculación.

a. En el plazo de 15 minutos , sumerja una torunda de algodón estéril en el inóculo ajustado correctamente y gírela varias veces contra la porción superior de la pared interna del tubo para exprimir el exceso de líquido.

b. Siembre 3 veces toda la superficie de una placa de agar de Mueller Hinton (u otro agar apropiado) girando la placa a 60º después de cada siembra para obtener una inoculación uniforme.

c. La tapa puede dejarse entreabierta entre 3-5 min., pero no más de 15 min., para permitir que se absorba toda la humedad de la superficie antes de que se apliquen los discos im-pregnados con el fármaco.

3. Seleccione los discos apropiados.4. Aplique los discos mediante un dispensador BBL, empleando condiciones asépticas. Depositar los

discos de modo que los centros queden a no menos de 24 mm de distancia. Es preferible deposi-tar los discos de penicilina y cefalosporina de manera que no queden a menos de 10mm del borde de la placa de petri y sus centros estén a no menos de 30mm de distancia. Evite colocar este tipo de discos adyacentes. Para H. influenzae, N. gonorrhoeae y S. pneumoniae no utilice más de 9 discos por placa de 150mm o 4 discos por placa de 100mm. Si los discos se han colocado en el agar con dispensadores que no sean de autoapisonamiento, presiónelos contra la superficie con una aguja o una pinza estériles.



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5. A los 15 min., coloque las placas de agar boca arriba en una estufa de incubación a 35 ± 2 ºC (para Staphylococcus spp., el análisis a temperaturas superiores a 35ºC puede no detectar estafi-lococos resistentes a la meticilina (SRM); para N. gonorrhoeae, incube a 36 ± 1ºC [sin superar los 37ºC]). S e deben incubar las Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, S. pneumoniae y otros estrepto-cocos en una atmósfera enriquecida con CO2 al 5%.

MANEJO DE MUESTRAS:

La selección y la recolección de muestras clínicas tienen como objetivo fundamental la obtención de material que sea representativo del proceso infeccioso y que mantenga la integridad y la viabilidad de los agentes infecciosos involucrados. Aunque posteriormente se discuten aspectos específicos con la recolección de los diferentes tipos de muestras clínicas, los siguientes aspectos generales deben ser siempre considerados para la selección y recolección de muestras clínicas:

Siempre que sea posible, la muestra clínica debe ser recolectada antes de iniciar la terapia con agentes antimicrobianos.

Se debe evitar la contaminación con flora normal para asegurar que la muestra clínica sea representativa del proceso infeccioso.

Cuadro 1. Fuentes de contaminación con flora normal Sitio de infección Fuente de contaminación

Endometrio Vagina

Fístula Tracto gastrointestinal

Infecciones subcutáneas y heridas superficiales Piel y membranas mucosas

Oído medio Canal del oído externo

Sangre Sitio de venipunción

Senos nasales Nasofaringe

Vejiga Uretra y perineo Se debe seleccionar el sitio anatómico correcto del cual obtener la muestra clínica y utilizar las

técnicas y los materiales apropiados para la recolección de las muestras clínicas. Los materiales, instrumentos y equipos deben estar estériles.

Es necesario especial cuidado en la recolección de muestras clínicas para cultivos por bacterias anaerobias. En general, las muestras de escogencia son las biopsias y los aspirados, mientras que el material infeccioso recolectado por torunda es indeseable. Las muestras clínicas para cultivo por bacterias anaerobias deben ser mantenidas a temperatura ambiente y no deben ser refrigeradas.

Es esencial recolectar un volumen de muestra adecuado, por cuanto un material en cantidad insuficiente puede provocar resultados falsos-negativos.

Se deben utilizar solamente recipientes estériles para la recolección de las muestras clínicas, preferentemente de boca ancha, con tapa de rosca para muestras de orina, otros fluidos corporales, esputo y tejidos. Con pocas excepciones, no se deben utilizar placas de Petri para el transporte de muestras clínicas. Los contenedores o recipientes deben ser de un material adecuado, diseñado para promover la sobrevivencia de los agentes bacterianos y para eliminar



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No. De revisión:


riesgos de derrame y de bioseguridad.

Cuadro 2. Aceptabilidad de las muestras clínicas para cultivo por bacterias anaerobias Muestras aceptables Muestras Inaceptables

Aspirado (por aguja o jeringa) Aspirado de traqueostomía

Aspirados de senos Aspirado endotraqueal

Aspirado endometrial (útero) Esputo expectorado

Aspirado suprapúbico (orina) Esputo inducido

Aspirados transtraquales Fluido seminal o prostático

Bilis Heces o muestras rectales

Cepillado bronquial (broncoscopía) Lavado broncoalveolar

DIU1 para Actinomyces spp. Loquios

Glándula de Bartholin Orina obtenida por cateterización

Heces para Clostridium spp.2 Orina obtenida por micción

Médula ósea Torunda cervical

Ovario Torunda endocervical

Placenta obtenida por cesárea Torunda faríngea

Torundas y tejidos obtenidos por cirugía

Torunda nasofaríngea

Trompas de falopio Torunda perineal

Torunda vulval

1 DIU, dispositivo intrauterino. 2 Excepciones: botulismo infantil, infecciones por C. perfringens o por C. difficile

Idealmente, todos los recipientes conteniendo muestras clínicas deben ser transportados en bolsas plásticas sellables, con dos compartimientos separados, uno para el recipiente y otro para la documentación.

La mayoría de las muestras clínicas recolectadas con torundas y que se han secado durante el transporte son inaceptables para su procesamiento.

En el caso que sea necesario utilizar torundas, se debe hacer una selección adecuada del tipo de material:

Material CaracterísticasAlgodón Los ácidos grasos residuales presentes en algunos tipos de algodón

pueden inhibir algunas bacterias, particularmente Chlamydia



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No. De revisión:


Dacron Adecuado para la recuperación de Streptococcus pyogenesAlginato de calcio Adecuado para la recuperación de Chlamydia, pero puede ser tóxico

para algunas cepas de Neisseria gonorrhoeae, Ureaplasma urealyticum.

Si la muestra es recolectada a través de piel intacta (por ejemplo, hemocultivos), se debe lavar la piel con agua y jabón, luego se debe desinfectar en forma centrífuga con etanol al 70% y finalmente de la misma manera con una solución yodada (tintura de yodo al 1-2%).

Cada muestra clínica debe estar rotulada con el nombre del paciente, número de identificación, el tipo o la descripción de la muestra, el sitio especifico de recolección, la fecha y la hora de la recolección y las iniciales del recolector.

La muestra clínica debe estar acompañada de una solicitud de análisis, la cual debe incluir la siguiente información:

1. Nombre completo y número de identificación del paciente. 2. Localización del paciente (servicio, salón, piso, etc.). 3. Descripción de la muestra, indicando el sitio de recolección según corresponda.4. Fecha y hora de la recolección de la muestra. 5. Diagnóstico -presuntivo o definitivo- del paciente.6. Indicación si el paciente está recibiendo o no tratamiento con antimicrobianos. 7. Otra información pertinente (si la muestra forma parte de una serie de muestras, evaluación de tratamiento, etc.). 8. Nombre completo, código y número de teléfono del médico tratante. 9. Firma del médico tratante.

CONTROL DE CALIDAD:

Para realizar un control de calidad para esta tinción es necesario contar con una cepa de Género Mycobacterium que son (BAAR) Bacilos ácido alcohol resistentes que al microscopio serás observados como bacilos teñidos de color rojo, pleomórficas (curva y/o rectas). Como control negativo se utilizan cepas de Staphylococcus aureus.

Los medios más adecuados para obtener el desarrollo y conservación de las micobacterias son: Lowenstein Jensen (que contiene verde de malaquita), el ATS (American Toraxic Society), el Cohen Midelebrook 7HIV y HVII. Deberán realizarse resiembras para tener como control BAAR jóvenes.

RESULTADOS:

. El resultado deberá ser reportado, en caso de contener bacilos ácido alcohol resistente como positivo a

estos en 100 campos observados. En caso contrario; no se observaron bacilos ácido alcohol resistentes

en 100 campos observados.



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