proyecto no. 09-01 diversidad genética dentro de la
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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA CONCYT
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA FONACYT
LlNEA FODECYT
Proyecto No. 09-01
Diversidad genética dentro de la estrategia de manejo y conservacidn de rodales de pino blanco (Pinus ayacahuite
Ehren berg) en Totonicapan
I l Unidad Ejecutora:
I Banco de Gennoplasma del Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas, ICTA.
Equipo de Investigación:
Investigador Principal: Silvana Maselli de Sánchez, Ph.D. Asistente de Campo: Ing. Agrónomo Federico Saquimux Asistente de Laboratorio: Sara Bamos de León
Duración del proyecto: octubre 2002-noviembre 2003
Guatemala, mayo 2004
INDICE DE CONTENIDO
Contenido lndice de contenido lndice de cuadros lndice de figuras 1. Introducción 2. Antecedentes
2.1 Recursos genéticos forestales de Guatemala 2.1.2. Conservación de los recursos genéticos forestales, planes y
estrategias a nivel internacional 2.1.3. Ordenación de áreas protegidas y conservación in situ de los
recursos genéticos forestales 2.2. marcadores genéticos para el estudio de la diversidad genética
3. Objetivos 4. Metodología
4.2 Descripción y geografía del área de estudio 4.2 Descripción de la especie 4.3 Colecta de conos 4.3.1. Descripción de sitios y características de individuos
muestreados 4.3.2. Manejo de conos y obtención de semillas 4.4. Obtención de gametofito y embrión para la electroforesis 4.5. Métodos para la determinación de isoenzimas. 4.5.1. Descripción de las enzimas ensayadas y su función biológica 4.5.2. Carga de muestras, electroforesis y condiciones de corrida 4.5.3. Corte y tinción de los geles 4.6 Interpretación y evaluación estadística de las isoenzimas 4.6.1. Análisis estadístico de las relaciones: altura, edad y número
de semillas por cono 5. Resultados y discusión
5.1. Relación de altura y edad de los árboles muestreados 5.2. Manejo de conos y obtención de semillas 5.3. Plagas encontradas en los conos de pino blanco 5.4. Interpretación y evaluación estadística de las isoenzimas 5.4.1. Interpretación de las isoenzimas 5.4.2. Análisis estadistico para los gametofitos 5.4.3 lndices de polimorfismo y parámetros de diversidad genética
para gametofitos 5.4.4. Análisis estadístico para los embriones 5.4.5. lndices de polimorfismo y parámetros de diversidad genética
para em briones 6. Conclusiones 7. Recomendaciones
7.1 Para la conservación de los recursos genéticos del P. a yacahuite
7.2 Para la obtención de semilla para reforestación y mejora genética
8. Bibliografía ii
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INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Ordenación de los recursos genéticos de los árboles y arbustos por categorías de uso de la tierra.
Cuadro 2. Código, sitio de muestreo, número de individuos, latitud, longitud y elevación en seis localidades donde se obtuvieron conos de P. ayacahuite (Ehren.)
Cuadro 3. Enzimas y sistemas de buffer ensayados en este estudio Cuadro 4. Enzimas ensayadas, código de identificación y su función
dentro de la célula Cuadro 5. Promedio de altura y edad de los árboles muestreados en los
seis sitios de colecta Cuadro 6. Sitios de muestreo, número de árboles por sitio, número
de conos colectados y promedio de semillas por cono. Cuadro 7. Frecuencias alélicas observadas para ocho isoenzimas en los
gametofitos de pino blanco (P. ayacahuite) en las seis localidades muestreadas y nivel de significancia de la prueba x2 para la heterogeneidad de las mismas (pc0.05)
Cuadro 8. Diversidad genetica (He) de gametofitos de pino blanco y valores medios de la heterocigosis esperada en las seis localidades muestreadas
Cuadro 9. Parámetros de diversidad genética estudiados para 8 isoenzimas en gametofitos de pino blanco en las seis localidades muestreadas
Cuadro 10. Frecuencias alélicas observadas para seis isoenzimas en los embriones de pino blanco (P. ayacahuite) en las seis localidades muestreadas y nivel de signifancia de la prueba x2 para la heterogeneidad de las mismas (p<0.05)
Cuadro 11. Diversidad genética (He) de embriones de pino blanco y valores medios de la heterocigosis esperada en las seis localidades muestreadas
Cuadro 12. Parámetros de diversidad genética estudiados para 8 isoenzimas en embriones de pino blanco en las seis localidades muestreadas.
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INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Vivero municipal en el Bosque Comunal Figura 2a. Colecta de conos Figura 2b. Colecta de conos Figura 3a. Toma de datos de altitud y coordenadas con GPS de los sitios
de colecta Figura 3b. Toma de datos de altura de los árboles con clinómetro Figura 4a. Arboles de pino blanco a la orilla del camino Figura 4b. Alta perturbación por presencia humana y tala de árboles Figura 4c. Avance de la frontera agrícola Figura 5a. Pocos individuos de pino blanco creciendo junto a Pinus rudis Figura 5b. Area poco perturbada, con mucho viento y temperaturas
bajas Figura 6a. Pinabete junto al pino blanco Figura 6b. Sotobosque, perturbación moderada Figura 7a. Factor de perturbación moderado Figura 7b. Pino blanco junto al camino Figura 8a. Condensación de agua en hojas Figura 8b. Presencia de sotobosque, alta humedad Figura 9a. Area sin sotobosque Figura 9b. Area con sotobosque Figura loa. Secado de conos en las camas Figura 10b. Conos verdes y secos Figura 1 Oc. Semillas Figura 11 a. Semilla sin germinar, semilla germinada, detalle del
gametofito y el embrión Figura 11 b. Absorción de extractos de gametofito y embrión en papel
filtro Figura 11 c. Papeles con extractos dentro del gel Figura 12a. Corte de geles Figura 12b. Tinción de los geles en bandejas Figura 13. Adultos de Henricus melanoleucus, obtenidos de las larvas
Encontradas en los conos de pino blanco colectados Figura 14. Zimograma de la enzima MDH. Figura 15. Zimograma de la enzima SKDH Figura 16. Zimograma de la enzima 6-PGD Figura 17. Zimograma de la enzima IDH
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Los estudios de diversidad genética constituyen una valiosa herramienta en la estrategia de planificación para la conservación de las especies. La diversidad genética es necesaria para asegurar que las especies evolucionen y se adapten a la dinámica de cambio de las condiciones ambientales. Y como Palmer-Lerche y Hald (2000) mencionan en su informe para la FAO, la diversidad genética es también necesaria para mantener el potencial para la mejora y para llenar las cambiantes necesidades del ser humano. El bienestar de los árboles y bosques y la continuidad en la producción de bienes y servicios que ofrecen, dependen del mantenimiento y el manejo de su diversidad genética (FA0 2001); así como de un plan de conservación de sus recursos genéticos.
Las estrategias y planes de acción sobre recursos genéticos forestales deben sustentarse, no sólo en la conservación y el uso sostenible, sino además fonnar parte de los cimientos para el desarrollo local y nacional. Todo esto dentro de un marco más amplio, que considere el progreso económico y social, la seguridad alimentaria y la mitigación de la pobreza (FA0 2001). Los esfuerzos que se hagan para asegurar la conservación y uso sostenible de estos recursos deben ser urgentes en comunidades, donde el bosque juega directamente, un papel relevante en la conservación del agua de la región.
Este es el caso del Bosque Comunal de Totonicapán, donde existe una interesante relación: conservación del recurso agua, directamente relacionado a dos especies forestales. Una, el P. ayacahuite (pino blanco), dentro de la categona de amenazada y dos el Abies guatemalensis (pinabete), dentro de la categoría de especie en extinción (Apéndice I de la Convención Internacional para el Tráfico de Especies Amenazadas, CITES). La disponibilidad y acumulación de agua en el Bosque Comunal, que surte a 54 Comités de Agua, alrededor de Totonicapán, proviene de la condensación que ocurre dentro del bosque de pino blanco, donde también crece el pinabete.
La conservación de las especies comprende tres niveles: nivel de poblaciones, individuos y genes. Los tres niveles deben ser considerados cuando se desarrollan las estrategias de conservación. Para el bosque Comunal de Totonicapán, entonces, la conservación a nivel de genes es, además de prioritaria, una opción ya disponible para futuros planes de manejo, reforestación y mejora genética.
Con este proyecto se desarrolló el primer estudio sobre diversidad genética del P. ayacahuite, empleando marcadores bioquímicos (isoenzimas) en Guatemala. Nos petmitió generar información básica de la estructura genética del de P. ayacahuite en el Bosque Comunal de Totonicapán y a través de parámetros de diversidad genética, determinar cuánta diversidad tiene el bosque y cómo está distribuida altitudinalmente. Esta información básica nos permitió generar recomendaciones sobre: dónde se aconseja que se colecte la semilla, para cubrir aspectos de conservación de los recursos genéticos y para emplearse en reforestación y mejora genética.
La información que se generó puede también emplearse por los usuarios o instituciones interesadas para: priorizar áreas de conservación, ordenar los recursos genéticos forestales en Guatemala, desarrollar estrategias de manejo y conservación.
Este estudio constituye un ejemplo de cómo los resultados de la investigación pueden ser aplicados directamente y de forma inmediata para dar respuesta a las necesidades de las Comunidades, que dependan de los bosques para su substistencia. Y como FA0 (2000) propone, convertir los principios generales de la estructura genética de un bosque, en recomendaciones prácticas para un programa nacional de conservación. Donde la selección de semilla para el mejoramiento genético, reforestación, conservación y uso sostenible de los recursos genéticos del pino blanco en Guatemala, puedan sustentarse en base a evidencia científica
2. ANTECEDENTES:
En las cercanías de las comunidades de Totonicapán no existen cursos fluviales importantes, por lo que el agua puede ser escasa. Ante el riesgo de quedarse sin suministro suficiente para todos, en 1994 se formaron los Comités para la conservación del agua, a g ~ p a d 0 ~ en una sola asociación, que se dedica a la conservación del Bosque Comunal y de los bienes comunales. Esta medida ha permitido defender el bosque de la depredación y de la tala ilegal (Trópico Verde 2000).
En 1990 se creó una organización llamada 'UleuChe'Jan, que significa Tierra, Agua y Bosque, que ha venido tmbajando para que el Bosque Comunal y su reserva de agua se mantengan lo mejor conservado posible (Trópico Verde 2000). Este grupo también forma parte del Comité para la conservación del agua.
La iniciativa local de conservacidn del Bosque Comunal de Totonicapán por parte de los habitantes del área es digna de admiración. Sin embargo no todas las comunidades alrededor del Bosque Comunal han tenido el mismo cuidado de sus bosques. Entre ellas los cantones Chimente, Pachóc y Camixnán que presentan bosques de pino blanco con mayor deforestación. Estos cantones están también relacionados directamente con el Bosque Comunal de Totonicapán para obtener agua y Ida.
La Municipalidad de Totonicapán tiene una oficina forestal; que tiene a su cargo todo lo relacionado al Bosque Comunal. Una de las actividades de esta oficina ha sido el establecimiento de un vivero de pino blanco y pinabete (Figura 1). Las plantas que se obtienen en este vivero, son empleadas para la venta y no para la reforestación del mismo bosque.
Figura 1. Viero Municipal en el Bosque Comunal
Entre el Instituto Nacional de Bosques INAB y la Oficina Forestal de la Municipalidad, aún no se coordinan actividades, por lo que no han desarrollado un plan para el ordenamiento, la conservación, manejo y uso sostenible de los recursos genéticos del P. ayacahuíte (Ehren.) en el Bosque Comunal de Totonicaphn. Tampoco se ha tomado en cuenta su diversidad genética, dentro de la planificación de las actuales actividades; aún cuando este bosque constituye el principal captor y reserva de agua para 54 Comités de agua en el h a .
l . RECURSOS GENETICOS FORESTALES DE GUATEMALA
La política forestal de Guatemala está definida como el conjunto de principios, objetivos, marco legal e institucional, líneas de política, instrumentos y situación deseada, que el Estado declara, con el propósito de garantizar la provisión de bienes y servicios de los bosques (naturales o cultivados) para el bienestar social y económico de sus pobladores. Adicionalmente establece las orientaciones de comportamiento y actuación, que con el propósito de alcanzar los objetivos o situación deseada, deben observar los diferentes actores del sector forestal (Melgar 2003).
Los aspectos forestales en Guatemala están contemplados en la Ley Foreslal, donde en el Decreto Legislativo 101-96 se crea el Instituto Nacional de Bosques -1NAB-, quién es el órgano de dirección y autoridad competente del Sector Público Agrícola, en materia forestal. Dentro de las atribuciones del INAB estAn las de desarrollar programas y proyectos para la conservación de los Bosques y colaborar con entidades que así lo requieran (Melgar 2003).
Los aspectos forestales en las áreas protegidas de Guatemala están contemplados en la Ley de Areas Protegidas, administradas por el Consejo Nacional de Areas Protegidas, CONAP (Decreto 4-89 del Congreso de la República y sus reformas en los Decretos 18-89 y 110-96). El CONAP tiene entre sus objetivos: lograr la conservación de la diversidad genética de flora y fauna silvestre del país y alcanzar la capacidad de una utilización sostenida de las especies y ecosistemas en todo el territorio nacional (Melgar 2003).
Existen otras leyes y normas relacionadas a los recursos genéticos forestales y reservas naturales protegidas, entre ellas:
Ley de protección y mejoramiento del medio ambiente Lista roja de flora silvestre para Guatemala (Resol. No. ALC O2812001 del CONAP) Ley de Reserva de Biosfera Maya (Decreto Legislativo 5-90) Convención sobre Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Flora y Fauna Silvestre (1973). Según Resol. 22/90 se autorizan las enmiendas a los apéndices I y II de la Convención (2416192) (Decreto Legislativo 63-79) Convenio para la Conservación de la Biodiversidad y Protección de Areas Silvestres Prioritarias de América Central (Decreto Legislativo 5-95). Estrategia Nacional para la conservación y el uso sostenible de la biodiversidad y plan de acción Guatemala (CONAP 2001).
En el documento de trabajo sobre recursos genéticos forestales titulado "Estado de la diversidad biológica de los árboles y bosques de Guatemala, Melgar (2003) menciona entre sus conclusiones:
Los recursos genéticos forestales de Guatemala necesitan de un mayor estudio e investigación para generar información básica y aplicada que permita hacer un uso integral y sostenido de los mismos para el desarrollo socio económico del pais.
No existe actualmente en el pais una Estrategia Nacional de Conservación y Ordenamiento de los Recursos Genéticos Forestales que involucre a las diversas instancias estatales y privadas; para que se orienten acciones con la finalidad de salvaguardar el potencial evolutivo de las especies y de los ecosistemas dinámicos. Una estrategia de este tipo, permitiría asegurar la utilización sostenible de la variación genética existente, para satisfacer las necesidades humanas presentes y futuras.
Dentro de las recomendaciones que Melgar (2003) propone en este documento se mencionan:
l . Vincular las actividades de conservación y utilización de los recursos geneticos forestales con los planes de desarrollo del país, considerándolos como elementos estratégicos del desarrollo económico y social del país.
2. Utilizar métodos biotecnológicos para facilitar los programas de conservación y manejo de los recursos genéticos forestales, así como la caracterización molewlar de las entradas de una colección.
3. Realizar estudios e investigaciones sobre especies, poblaciones y ecosistemas forestales que ayuden a la conservación y ordenamiento de los recursos genéticos forestales.
Con este estudio se estaría dando respuesta a las recomendaciones de desarrollar investigación que contribuya a la conservación y ordenamiento de los recursos geneticos forestales. Así mismo a la de caracterización, en nuestro caso bioquímica, para facilitar la elaboración de planes de manejo, ordenamiento y conservación del pino blanco, no solamente en Totonicapán, como lo sugiere el titulo de este proyecto, sino tambien al resto de Guatemala.
2.1.2. CONSERVACION DE LOS RECURSOS GENETICOS FORESTALES, PLANES Y ESTRATEGIAS A NIVEL INTERNACIONAL
A continuación se presentan una recopilación de recomendaciones, estrategias y pasos a seguir en lo referente a la conservación y el ordenamiento de los recursos genéticos forestales, recabados de fuentes de información allegadas a la Dirección de Recursos Forestales de la FA0 (2001).
La finalidad del manejo genetico es el de salvaguardar el potencial evolutivo de los ecosistemas y especies, y asegurar que se aumente la utilización sostenible de la variación genética disponible, para cubrir las necesidades humanas presentes y futuras. Los objetivos específicos del manejo genético cambiarán respecto del tiempo, mientras las condiciones ambientales, económicas, sociales y de requerimientos están tambien continuamente sujetas a cambio. Debe prestarse, entonces, atención no sólo a las especies de árboles, poblaciones y rutas geneticas que son de uso considerable hoy, pero también a aquellas que tienen un valor potencial económico, social y ambiental para el futuro (Palmberg-Lerche 2000).
Desde que es posible conservar un ecosistema y aún perder especies especificas; o conservar una especie y perder poblaciones genéticamente distintas, esto es los genes o complejos de genes que puedan ser de valor en el futuro, es muy importante especificar claramente, desde un principio en la planificación de la conservación, el nivel o niveles de las metas que quieran alcanzarse (Palmberg-Lerche 2000)
Las decisiones sobre estrategias, metodologias de conservación y manejo genético, dependerán no sólo de las características biológicas, variación genética y patrones de variación de una especie dada, pero tambien en el grado de conocimiento disponible sobre su silvicultura, su manejo, su uso actual, importancia y singularidad, amenazas sobre la especie, y muy importante, las capacidades institucionales en los países directamente involucrados, incluyendo infraestructura y disposición de financiamiento a mediano y largo plazo (Palmberg-Lerche 1997).
Generalmente la producción de bienes y servicios ambientales es compatible con la conservación de los recursos genéticos, a condíción de que se apliquen algunos principios científicos básicos. En la práctica, esto significa ajustar las prescripciones referentes a la ordenación forestal (Cuadro l), para prestar la debida atención a los aspectos silvícolas y a la conservación genética. Análogamente, una estrategia de mejoramiento bien fundamentada científicamente puede mantener e incrementar la utilidad de los recursos genéticos disponibles, mediante la potenciación de la variación genética entre las poblaciones arbóreas y dentro de ellas (FA0 2001).
Cuadro 1. Ordenacián de los recursos genéticos de los árboles y arbustos por categorías - -
de uso de la tierra. 1 PRINCIPAL ACTIVIDAD DE APOYO A LA 1
( Mejoramiento Mejoramiento genético de los árboles 1 Mejoramiento
CATEGORIA DE ORDENACION Areas protegidas - Bosques naturales sujetos a ordenación
Plantaciones, árboles plantados
(incluye las colecciones ex situ) 1 ~onsetvación Fuente: (FA0 2001)
ORDENACION DE LOS RECURSOS GENETICOS FORESTALES - Conservación Utilización sostenible Conservación Utilización sostenible
Los bosques ordenados pueden y deben ayudar también a conservar recursos genéticos que pueden no estar representados en la red de áreas protegidas. Se hace hincapié en que ninguna de estas categorías (Cuadro 1) puede por si sola asegurar la conservación de todos los recursos genéticos forestales, porque hay bienes y poblaciones que requerirán una atención especial e inmediata (Yanchuk 2001).
2.1.3. ORDENACION DE AREAS PROTEGIDAS Y CONSERVACIÓN /N SITU DE LOS RECURSOS GENETICOS FORESTALES
A continuacidn se exponen algunos de los pasos para lograr la ordenación de áreas protegidas y conservación in situ de recursos genéticos forestales:
Armonizar la ordenación de las áreas protegidas y las necesidades humanas Ampliar la variedad de categorías de áreas protegidas Ampliar el número de socios interesados Dar una mayor consideración a la conservación de los recursos genéticos forestales. Mejorar los vínculos y la coordinación entre los diversos departamentos gubernamentales Realizar inventarios de especies de árboles forestales en áreas protegidas Establecer medidas de conservación eficaces. Ordenar eficazmente los recursos geneticos forestales. Restaurar las zonas degradas dentro de las áreas protegidas y en las de amortiguación. Desarrollar y aplicar un plan integral de conservación bio-regional. Establecer áreas protegidas adicionales en categorías ordenadas. Asegurar la permanencia de recursos genéticos forestales dentro de las áreas protegidas disponibles para posibles investigaciones científicas. Determinar las prioridades nacionales e internacionales de conservación Asegurar la sostenibilidad de las áreas protegidas.
Además de los pasos mencionados, existe una necesidad concreta de mejorar nuestro conocimiento de las especies y su ecología, porque la información biológica fundamental puede ayudamos a desarrollar mejores planes de ordenación (Yanchuk 2001).
La información sobre la distribución de la diversidad genética es un prerrequisito para una selección sólida dentro de programas de mejoramiento y conservación de los bosques. La diversidad genética puede determinarse midiendo caracteres cuantitativos o morfológicos en el campo, o mediante el empleo de marcadores moleculares en el laboratorio (FA0 2001).
2.2 MARCADORES GENETICOS PARA EL ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENETICA
Los marcadores bioquímicos, como las isoenzimas, se han empleado en especies forestales para: estudiar la variación genética dentro y entre poblaciones, conocer la estructura de la población y su filogenia, y para elucidar patrones de cruzas entre poblaciones naturales, así como en poblaciones experimentales (Namkoong y Koshy 2002). Las isoenzimas como marcadores genéticos han sido empleados por muchas décadas, como una de las herramientas más eficientes y seguras para la estimación de la heterocigosidad.
Los marcadores moleculares que emplean ADN pueden emplearse en especies forestales para: i) cuantificar la diversidad genética entre poblaciones y árboles individuales; ii) identificar genotipos en estudios taxonómicos, estudios biológicos y de "identificación genética"; y iii) localizar genes que determinan características cuantitativas económicamente importantes. Los marcadores pueden proporcionar información importante sobre los patrones migratorios, la cantidad de flujo génico y los sistemas de reproducción, por lo que constituyen instrumentos Útiles para la formulación y seguimiento de programas de conservación de árboles forestales (Butcher 1999)
En los últimos años se ha observado un mayor número de estudios que emplean el ADN para determinar la diversidad genetica, sin embargo cuando los fondos y el tiempo son limitados, las isoenzimas seguirán siendo la primera opción (Namkoong y Koshy 2002).
La electroforesis de isoenzimas es una técnica que pemite medir comparativamente la variación genética dentro y entre poblaciones (Brown y Weir 1983). Las aloenzimas son f0m7as diferentes de una enzima especificada por alelos altemos en un locus en un gen. Las aloenzimas se heredan de forma codominante, lo que permite cuantificar las frecuencias alélicas par una poblaci6n (Crawíord 1983). Esto a trav6s de conocer la riqueza alélica y el número total de alelos distintos en un mismo locus en una población (Frankel 1995). Las bandas obtenidas en una electroforesis de isoenzimas representan los alelos presentes en la población, permitiendo identificar individuos homocigotos y heterocigotos. Los resultados obtenidos pueden luego analizarse a través de parámetros de diversidad genética tales como: riqueza alélica (A), porcentaje de loci polimórficos (P), heterocigosidad media (He), diversidad genética total (Ht), identidad genética intra poblacional (Js), diversidad genética inter poblacional (Dst), coeficiente de diferenciación entre poblaciones (Gst) y distancias genéticas de Nei (Nei 1972).
3. OBJETIVOS
GENERAL
Estudiar la diversidad genética del Pinus ayacahuite en Totonicapán, empleando electroforesis en geles de almidón.
1. Determinar cuánta diversidad genética existe y cómo está distribuida en los principales rodales de Pinus ayacahuite Ehrenberg de Totonicapán.
2. Hacer recomendaciones sobre conservación, que puedan apoyar el desarrollo de una estrategia de manejo y conservación de los rodales de Pinus ayacahuite Ehrenberg estudiados.
3. Hacer recomendaciones de selección de gennoplasma para mejoramiento genético.
4.1 DESCRIPCIÓN Y GEOGRAF~A DEL ÁREA DE ESTUDIO
Se hizo un viaje a la cabecem Departamental de Totonicapán para dar a conocer el tipo de estudio que se quería desarrollar y establecer relaciones de cooperación entre los sectores interesados. Nos entrevistamos con miembros de las Juntas Directivas de las siguientes parcialidades: Paquí, Caxaj y Tax, así como la ONG Cdro y autoridades de la Municipalidad de Totonicapán para solicitar autorización para llevar a cabo el muestre0 de conos de pino blanco en SUS bosques. Se obtuvo autorización para ingresar a muestrear a la ONG Cdro y al Bosque Comunal de Totonicapán a cargo de la Municipalidad
El bosque Comunal de Totonicapán está localizado a 3000 m SNM en la Sierra Madre, llamada sierra Mana Tecún en el Altiplano de Guatemala. El Bosque tiene una extensión de 211.73 Km2. El Departamento de Totonicapán tiene 1061 h2 de extensión con 204,419 habitantes, uno de los más poblados del país. Las temperaturas medias anuales varían entre 15- 20 "C, con temperaturas noctums de hasta -4"C, durante los meses de diciembre a marzo. La precipitación media anual vana de 900-1000 mm (Fundación Paz Verde 1997).
La vegetación de estas montañas era originalmente bosque templado, pero actualmente ésta sólo puede verse en el Bosque Comunal ya que en el resto del departamento ha sido transformada por la agricultura y los asentamientos humanos. En el bosque comunal pueden distinguirse dos pisos altitudinales: montano y subalpino. El piso montano está compuesto por latifoliadas mixtas, dominando los robles, que han sido paulatinamente sustituidos por matorrales, y pinos que se han adaptado a las condiciones poco profundas del terreno (Fundación Paz Verde 1997).
Los suelos de las laderas de la montaña son de origen volcánico y tienen una capa orgánica muy delgada con composición arcillosa y estructura compacta (Fundación Paz Verde 1 997).
El Departamento de Totonicapán tiene la siguiente cobertura forestal: 18 621 ~ r n ~ de bosques de coníferas y 26 808 ~ r n ~ de bosque mixto (Melgar 2003).
Sobre el uso que se le da a la madera de los bosques en el Departamento, en 1981 Romero reportó que en el municipio de San Francisco el Alto, Totonicapán, el uso más frecuente es como combustible en forma de leña; que sirve tanto para la cocción de los alimentos como para la calefacción del hogar. En este municipio el 81.85% de la leña consumida proviene de los pinos, de los cuales el 64.49% son extraidos del Bosque Comunal, mientras que Únicamente el 18.48% proviene de los bosques propios y el 17.2% de bosques aledaños a la población. Esto hace evidente la importancia del Bosque Comunal en la economía familiar de los habitantes de este municipio (Romero 1981).
4.2 DESCRlPClON DE LA ESPECIE
El pino ayacahuite (Pino Blanco Mexicano, Pinabete o Acalocote) pertenece al género Pínus, subgénero Haploxylon (pinos de madera suave), sección Cembra (Perry 1991). En Guatemala se le conoce con el nombre común de pino blanco.
Presenta hojas en fascículas de 5, raramente de 6, en ramilletes densos y laxos que llegan hasta el final de las últimas ramas, persistiendo durante 2 ó 3 años (Farjon y Styles 1997). Las agujas son color verde azulado, de sección triangular, aserradas, de 10 a 20 cm de largo por 0.8 a 0.9 de mm de espesor. En fascículas jóvenes se pueden encontrar vainas deciduas de 1.8 a 2 cm de longitud. Los conos masculinos coronan la terminación proximal de los retoños, siendo ovoides
o cilíndricos, de 7 a 10 mm de largo, de color que va desde amarillo hasta anaranjado (Farjon y Styles 1997). Los conos femeninos se encuentran repartidos en el ramaje, solitarios, en pares o tríos, deciduos, colgantes, son casi rectos o curvados de fonna oblongo-elongada, de 10 a 45 cm de longitud por 7 a 11 cm de diámetro, su color va desde amarillo pálido hasta castaño rojizo, muy resinosos; con escamas de 4.2 a 5.3 cm de longitud por 1.9 a 2.2 cm de ancho (Aguilar 1961), con pedúnculos leñosos que usualmente caen con el cono. Los conos inmaduros son elípticos o cilíndricos, rectos o curvos, morados y se encuentran en la punta de las ramas nuevas. Las semillas se encuentran en pares en la base de las escamas. Son ovales y ligeramente comprimidas lateralmente de 8-15 X 6-9 mm, usualmente de color café con manchas negras (Farjon y Styles 1997) las alas de las semillas son largas y oblicuas con un lado curvo, de color café claro con estriaciones obscuras o café obscuro, con 11-13 cotiledones; aunque en Guatemala presentan 7 cotiledones (Aguilar 1961; Peny 1991). La dispersión y genninación de semillas del pino blanco ocurre durante los meses de octubre y noviembre.
La especie se encuentra en el sur de México, Guatemala, El Salvador y Honduras a elevaciones de 1800 a 3200 m SNM; pero se encuentra con mayor frecuencia entre los 2100 y 3000 m SNM. El rango geográfico de este taxón está desde los 14O hasta los 21" latitud Norte y 86" a 101" latitud Oeste . (Donahue et al. 1991).
En Guatemala se puede encontrar en los departamentos de Huehuetenango, Totonicapán, Quiché, San Marcos, Quetzaltenango, Jalapa, El Progreso y Zacapa . Esta especie está restringida a climas fríos y húmedos, requiere de un promedio de 1200 mm anuales de lluvia y en muchos sitios recibe humedad adicional de la niebla y rocío durante la época seca. Requiere de suelos fértiles y bien drenados (Donahue et al. 1991).
El P. ayacahuite crece en Guatemala en asociación con otras coníferas como: Abies guatemalensis Rehder (pinabete), Cup~ssus lusitanica Mill., (ciprés), P. pseudostmbous, P. mdis (pino colorado) y P. tecunumaníi . (Donahue et al. 1991).
Donahue (1991) reporta entre las propiedades de la madera del P. ayacahuite una gravedad específica de 0.340 a 0.380 en poblaciones naturales. Además que un uso excellente para esta madera incluye: fabricación de molduras para interiores de oficinas y casas; fabricación de muebles de baja calidad, como se usa principalmente en Guatemala y México. Por sus propiedades mecánicas favorables, facilita el empleo de clavos y grapas. La madera no está sujeta a encogimiento excesivo o a alabe.
4.3 Colecta de conos
Para colectar los conos de los árboles y por razones de acceso y comodidad para el personal que llevó a cabo la colecta, dividimos los sitios de colecta dentro del Bosque Comunal de la siguiente manera: designamos según nuestra división técnica, pero no geográfica dos rodales. Al Rodal 1 pertenecen las localidades S4 Chojolóm y L2 Chiupachec. Al Rodal 2 pertenecen las localidades L3 Trojales, S1 Salvachán, S2 Pacajá y S3 Chuijolóm. Para el Rodal 1 se colectaron conos de un total de 40 individuos y para el Rodal 2, 41 individuos. De acuerdo a El-Kassaby (1991) se necesitan muestras de 40-60 individuos para obtener estimados confiables en las frecuencias alélicas a nivel de poblaciones. El detalle de los individuos colectados por sitio de muestre0 se detalla en el Cuadro 2.
Cuadro 2. Código, sitio de muestreo, número de individuos, latitud, longitud y elevación en seis
En cada localidad y dependiendo de la disponibilidad y accesibilidad de los conos en los árboles, se muestrearon individuos al azar que estuvieran separados entre 100-200 m, según lo recomendado para coníferas (Puglisi ef al. 1999, , Schiller ef al. 1 999, Vendramin 1998, Thomson 1995). Los conos verdes (3-4 por árbol) se colectaron por personal contratado específicamente para esta actividad (Figura 2a y 2b).
localidades donde se obtuvieron conos de Pinus ayacahuite (Ehren.) -
1 : Figums2ay2b. .. - Colecta de conos 1 . I .
En cada sitio de muestreo se tomaron datos de altitud y coordenadas del árbol muestreado empleando un GPS. M a m Gannin GPS 11, plus. Software Versión 2.01 de 1998 (Figura 3a). La temperatura a la hora de la colecta se tomó con un termómetro de laboratorio. La altitud de cada árbol se tomó empleando un hipsómetro marca Suunto, modelo 106012 de la Compañía Suunto Helsinki, Finlandia (Figura 3b). La edad de los árboles fue tomada haciendo una relación de acuerdo al número de anillos que fueron contados en un árbol cortado que se encontró en el lugar y comparándola con el grosor que ese número de anillos representaba. Este grosor se comparaba luego con el del árbol muestreado para deteminar su edad aproximada. Para determinar la edad también se tomó en cuenta el número de nudos formado por las ramas. El dato de la edad es aproximado para todos los árboles (Cuadro 4). Los conos se guardaron y etiquetaron en bolsas plásticas y fueron llevados al banco de gennoplasma del ICTA para su manejo, análisis y toma de datos.
Código
S 1 S2 S3 S4 L2 L3
TOTAL " Rodales 1 y 2 respedivamente
Longitud
91'18' 91'17' - 91'18' 91°18'-91019' 91 '1 9' 91 '19' - 91 "20' 91'16'-91'17'
Aitidud (m)
30003100 31 50-3250 31 66-3250 30753200 28 1 52900 31 87-3300
Sitio de muestmo SalvachánD
PacajáD ChuijolomD Chojoloma
Chuipacheca TrojalesD
No. of individuos Muestreados
1 O 9 1 O 11 29 12 81
Latitud (N)
14'54' 14'54' 14'54' 14'54' - 14'55' 14O54' - 14'55' 14O53'- 14'54' 14'54'
I . - & Figura 3a. Toma de datos de altitud Figura 36. Toma de datos de altura de l& ákoles .¶
y coordenadas con GPS de los con clinómetro sitios de colecta 1 '
I Los datos de altura, edad y cantidad de semillas por cono se compararon en bs seis sitios
muestreados a través de un análisis de varianza con el programa SAS (Rohlf 1989). Estos datos fueron tarnbien empleados para elaborar las recomendaciones sobre sitios ideales para colecta de semilla. I-
Sitio: L2, Chuipachec Rodal 1
Los individuos U-1 al LZ-19, fueron colectados en las laderas de la montaña, junto al camino (Figura 4a). Esta fue el área que presentó mayor perturbación por la presencia de actividad humana. Hasta acá llegan ranchos y siembras de maíz de los habitantes, introduciéndose en el I
bosque de pino blanco que ha sido talado para dar lugar a las siembras de maíz Figuras 4b y 4c). : - El sueb presenta desgaste y degradación. La temperatura media máxima durante el afio oscila en el día entre 1822°C y puede bajar en la noche durante los meses de diciembre-febrero a 4°C. 1 - - . En este lado de la montaña, el pino blanco crece junto al ciprés (Cupressus lusitánka) en una 1 proporción 50-50%. Los individuos L2-20 y U-21, fueron colectados muy cerca del vivero de la '
Municipalidad (Figura 1).
Figura 4a. árboles de pino blanco a la orilla del camino
1
-
humana y tala de árboles
Los individuos LZ-22 al U-26 fueron colectados dentro de la ONG Cdro. h s individuos dentro de este bosque, tienen manejo y crecen junto al cipres (C. LusitBnica). No son parte de un bosque silvestre. La corteza de estos árboles era más lisa que el resto de individuos colectados en el resto de sitios y además la postura de las hojas en la rama era hacia aniba y no hacia abajo como en el resto de individuos. Se desconoce de dónde provino originalmente esta semilla. Se colectaron tres individuos más en la montaña, inmediatamente después de la salida de la ONG, junto al camino L2-27, 28 y 29. .. 1 . . Sitio: L3, Trojales, Rodal 2
Los individuos L3-1 al 8 fueron colectados en lo más alto de la montaña, hasta donde llegaba el pino blanco y empezaba a crecer el pino colorodado (Pinus rudis) (Figuras 5a y 5b). La relación en este lugar era de 90% de pino colorado y 10% de pino blanco. El área era la menos perturbada por la presencia humana o actividad humana. El lugar es bastante frío y con viento. Al medio día la temperatura era de 7°C. Los árboles aquí eran más bajos, entre 10-18 m, con edades !
aproximadas de 40-70 años, el individuo 5 con 70 años fue la excepción con una altura de 30 m aproximadamente.
El individuo L3-9 fue colectado bajando la montaña, donde el pino blanco era más; _- abundante en una relación 95% blanco, 5% pino colorado. Los individuos L3-10 al 13 también 1 - '
fueron colectados montaña abajo, donde el pino blanco se encontraba en una relación del 100% y se observaba sotobosque.
Figura 5b. Area poco perturbada, con mucho creciendo junto a Pinus mdis viento y temperaturas bajas
Sitio: SI, Salvachán, Rodal 2 1 lndividuos S1:l-1 l. En esta área el pino blanco crece en asociación con el pinabete (Abies
guatemlensis) (Figura 6a). El factor de pertuhación es moderado. Se colectó en una colina, área boscosa con presencia de sotobosque (Figura 6b). La forma de las ramas variaba en algunos individuos. La temperatura al momento de colecta era de 10°C. I
Figura 6b. Sotobosque, perturbarción moderada
Figura 6a. Pinabete junto al pino blanco
Sitio: S2, Paca@, Rodal 2 lndividuos S2:l-11. En esta área crece mayormente el pino blanco, con muy escasos
individuos de Abies guatemlensis. El factor de perturbación es moderado y es debido al pastoreo de ovejas. La temperatura al momento de colecta era de 9°C (Figuras 7a y 7b)
Figura 7a. Factor de perturbación moderado Figura 7b. Pino blanco junto al camino. 1 i - 1
Sitio: S3, Chuijolóm, Rodal 2 1
Individuos S3:l-10. Esta área fue la más húmeda de los sitios de colecta. Allí condensaba l
el agua en las hojas de los pinos por la presencia de niebla (Figura 8a). El pino blanco crece junto I
a arbustos, alisos (Alnus junrllensis) y helechos abundantes, así como musgos (Figura 8b). Se 1
observaron algunos individuos de Abies, uno por cada 100 m2 y algunos de pino colorado. La 4
temperatura al momento de colecta era de 9°C. El factor de pehrbación era moderado.
Figura 8a. Condensación de agua en hojas Figura 8b. Presencia de sotobosque, alta humedad
Sitio: S4, Chojolom, Rodal 1 Individuos colectados: S4:l hasta S41 1. Este sitio abarca el bosque desde el vivero
Municipal, hasta la zona más humeda, donde se condensa el agua en las hojas e inicia el Rodal 2. El sitio no presentaba sotobosque (Figura 9a), hasta llegar cerca del área húmeda (Figura Qb), donde empiezan a crecer los helechos. En este sitio de muestre0 el pino blanco crece junto a escasos individuos de pinabete (Abies guatemalensis).
Figura 9b. Area con sotobosque
4.3.2. Manejo de conos y obtención de semilla 1 '4
Los conos se colocaron en las camas de los invernaderos del lnstiiuto de Ciencia y , " 1 Tecnología Agrícolas (ICTA) para que se secaran (Figura 10 a) . Los conos secos se abren solos, al golpearlos suavemente se desprenden, con facilidad las semillas (Figuras 10b 10c)
Figura 10a. secado de conos en las camas. Figuras 10b y 10c. conos verdes, secos y semillas y:
Se contó cuántas semillas se obtuvieron de cada cono para cada individuo. Las semillasi. , e!
fueron colocadas en frascos de vidrio etiquetados, luego se le bajó la humedad hasta un 7% en ' 1 I
cámaras desecadoras con gel de sílice y se almacenaron a 5°C en la cámara fría del Banco da Gennoplasma del ICTA para su posterior empleo.
4.4 Obtención del gametofi y embrión para la electroforesis
Se empleó como base el protocolo de Conckle (1 982) para coníferas para la preparación da la semilla, obtención de extractos y electroforesis de isoenzhas. Sin embargo se hicieron algunasi modificaciones, las cuales aparecen en la sección de resultados.
De cada árbol se tomaron dos semillas de conos diferentes. A cada semilla se le removió la cubierta dura y con h ayuda de un estereoscopio (marca Baush and Lomb, modelo ASZ45L3) se le separó el tejido café que cubre el gametofito, luego se partió el gametofito y se removió el embrión (Figura 1 la). El tejido del gametofito y del embrión fueron colocados en cajas Petn con papel filtro (Whatman no. 3) humedecido en agua destilada (3 ml) y colocados en un refrigerador a 4°C durante la noche previa a la corrida.
Figua 1 la. Semilla sin germinar, semilla germinada, detalle del gametofito (tejido blanco) y el embrión (tejido verde)
Para la electmforesis de isoenzimas, el embrión y gametofito de cada semilla se colocaron 1 en morteros de porcelana, que estaban a su vez en hielo. A cada gametofdo se le agmgó 20 pI de buffer de extracción (fosfato 0.2 M, pH 7.5 reportado por Conckle 1982) y 10 pI al embrión. Toda la extracción se llevó a cabo en frío, para evitar la desnaturalización de las enzimas.
El tejido embrionario y gametofítico se maceró empleando un tubo de centrífuga y los extractos obtenidos se absorbieron en papelitos de papel filtro Whatman No. 3 de 120 x 4 mm. que eran luego colocados dentro del gel de ahnidón (Figura 1 l a y 11 b).
Figura 1 la. Absorción de extractos de gametofito Y embrión en papel filtro
4.5 Mbtodos para la determinación de isoenzimas.
Figura 1 1 b. Papeles con extractos dentro del gel.
Se siguió el protocob de Conckle (1 982) para ensayar ocho diferentes enzimas y sus respectivos sistemas de solución de buffer para la preparación del gel y para las cubetas de la cámara de electroforesis. Los sistemas ensayados se detallan en el cuadro 3.
Cuadro 3. Enzimas y sistemas de buffer ensayados en este estudio Sistema de extracción 1 Sistema de buffer 1 Enzimas I Concentración del 1
1 Lio-borato PH 8.3 Buffer fosfato 02 M pH 7.5" 1 Tris-citrato pH 6.0 + 1 ADH, ACO, 6-PGD, MDH, 1
Gel + Cdmara
1 Tris-citrato pH 6.5 1 IDH, SKDH, PGM, PGI Buffer fosfato 02 M pH 7.5" 1 Tris-citrato pH 7.0 + 1 ADH, ACO, 6-PGD, MDH, 1
Ensayadas
Buffer fosfato 02 M pH 7.5D
Buffer fosfato 0 2 M DH 7.5"
Almidón Buffer fosfato 02 M DH 7.5D 1 Tii-borato DH 8.3 + 1 ADH. IDH. PGM . PGI
Las enzímas ADH, MDH y ACO se resolvieron mejor con el sistema Tris-citrato pH 6.5, las enzimas &PGD, IDH, SKDH resolvieron mejor con el sistema Tris-citrato pH 7.5. Estos sistemas fueron los empleados para correr los extractos de los embriones y gametofitos de las semillas de pino blanco para todo el estudio.
9-12%a
Tns-cibato pH 6.0 Tris-citrato pH 6.2 + Tris-citrato pH 6.2 Trii-citrato DH 6.5 +
Buffer fosfato 02 M pH 7.5"
4.5.1. Descripción de las enzimas ensayadas y su función biológica
IDH, SKDH, PGM, PGI ADH, ACO, 6-PGD, MDH, IDH, SKDH, PGM, PGI ADH. ACO. 6PGD. MDH.
"Se probaron los rangos de concentración de almidón entre 9-12%. Con 9% se obtuvo mejor resolución
Tns-citrato pH 7.0 Tris-citrato pH 7.5 + Tris-citrato pH 7.5
mitocondrias y rnicr~or~anelos. Intervienen en el ciclo de Krebs, en la fotorespiración y en la fotoslntesis de plantas C-4
9%
9%
IDH, SKDH, PGM, PGI ADH, ACO, 6-PGD, MDH, IDH, SKDH, PGM, PGI
Cuadro 4. Enzimas ensayadas, código de identificación y su función dentro de la célula.
1 (Kephart 1 990) Alcohol deshidrogenasa 1 ADH (EC 1.1.1.1) ( Enzima dimérico, presente en el citosol y
I que interviene en procesos de fermentación. Su actividad está asociada
FUNCION ENZIMA
1 1 1 en alaunos casos con estrés anaeróbico 1
Malato deshidro~enasa 1 MDH (EC 1.1.1.37) 1 Enzima dimérico, presente en el citoso, CODIGO
1 ( ~ e ~ h a r t 1990). Aconitasa 1 ACO (EC 4.2.1.3) ) Enzima
1 1 1 v rnitocondnas. interviene en el ciclo del /
El buffer Tris-citrato pH 6.5 se preparó con 54 g de trizma base y 36.3 g de ácido cítrico en un litro de agua destilada. El pH se ajust6 con NaOH 4 N.
Sikimato deshidrogenada
lsocitrato deshidrogenada
6-fosfogluconato deshidrogenada
Para elaborar el gel se tomaban 8.9 ml de buffer en 435 ml de agua destilada. 90 ml de esta solución se utilizaban para disohrer 38 g de almidón (9%) marca Sigma lote 072K7039.
SKDH (EC 1.1 25)
IDH (EC 1.1.1.42)
6-PGD (EC 1.1.1.44)
kcgo cítrico (Kephart 1990). Enzima rnonoménca, presente en el citosol y plastidios, interviene en la slntesis de compuestos aromáticos (Kephart 1990). Enzima dimerica presente en el citosol y plastidios. lnterviene en el ciclo del ácido cítrico, mediante la oxidación del ácido isocítrico (Kephart 1990). Enzima dirnérica presente en el citosol y plastidios. Intewiene en la ruta de la fosfatopentosa (Kephart 1990).
El resto de la solución se llevaba a ebullición y se unía al almidón ya disuelto, formando una suspensión homogénea que se desgasiftcaba con una bomba de vacío. Para que el gel solidificara, la suspensión se vertía en el molde de la cámara de electroforesis y se dejaba a temperatura ambiente toda la noche, cubierto con una hoja plástica para acetatos.
. / 4.5.2. Carga de muestras, electroforesis y condiciones de corrida I
Para cargar el gel de almidón con las muestras, se hacía un corte a 3 cm del origen en dirección perpendicular a la marcha del campo eléctrico. En esta ranura se colocaban los papelitos de papel filtro Whatman No.3 (4 mm x 1 cm), impregnados con el extracto resultante de macerar los embriones y gametofitos. En los bordes izquierdo y derecho se colocaban papelitos impregnados con azul de bromofenol, para poder observar el frente de corrida. Una vez que se. ,i colocaban todos los papeles dentro del gel se procedía a correr la electroforesis. i
J
La electroforesis se llevó a cabo dentro de una refrigeradora a 4OC. La cámara de '
electroforesis marca Fischer modelo F 5 S L i ü 2 5 , contenía en los tanques buffer de cámara (Tris- citrato pH 6.5 o 7.5) en una relación 250 ml de buffer con 750 ml de agua destilada. Las condiciones de corrida, empleando una fuente de poder Fischer Scientific FB-1000, fueron de: entre 65-75 mili amperios por 3 horas promedio. Esta fuente de poder tuvo fallos eléctricos en el Último mes de trabajo, por lo que se finalizaron las conidas, empleando una fuente de poder marca EC-Apparatus Corporation, modelo CE-2060. i 4.5.3. Cotte y tinción de los geles
i
1
Al finalizar la electroforesis, los geles se desmontaron del molde y se colocaron sobre el cortador de geles (Figura 12a) . Se obtuvieron capas de 1 mm. de grosor que fueron colocadas en bandejas de pl8stico. A cada bandeja se le agregaban los reactivos de tinción que correspondían a la enzima a resolver (ADH, IDH, MDH, 6-PGD, ACO, SKDH), siguiendo el protocolo de Conckle (1982) (Figura 12b). Las bandejas se colocaban luego en un horno marca Lab Line modelo 1
Imperial V durante tres a cuatro horas, esperando la aparición de bandas.
Figura 12 a. Corte de geles Figura 12 b. Tinción de los geles en bandejas. 4 d
1
4.6 Interpretación y evaluación estadística de las isoenzimas:
Con los zimogramas obtenidos en los geles se identificaron los alelos, siguiendo los criterios de: O'Malley (1979), Goncharenko (1993) para Pinus y de Maselli (1996, 1999). Al locus más catódico se le asignó el número 1; al alelo más catódico, también se le asignó el número 1. El
numero 2 correspondió a la altura por encima del alelo 1 y así sucesivamente. Los zimogramas fueron documentados por medio de dibujos y fotos empleando una cámara Sony Cyber -shot DSC-P1 O.
Para analizar las diferentes isoenzimas se tomó en cuenta la estructura molewlar de cada enzima (monomérica, dimérica, etc.) y el posible número de loci a esperarse, así como el estado de los alelos (en homocigosis o heterocigosis). Para todo ello se consideraron los diferentes estudios con isoenzimas en el genero Pinus y en otras especies (Korol, 2002, Ledig 2001, Schiller 1999, Puglisi 1999, Aguinagalde 1993, 1996, Gibson 1990, Schiller 1999).
Las frecuencias génicas de los gametofitos y embriones de cada semilla se calcularon en base a los resultados fenotipicos observados en los zimogramas. Las frecuencias alélicas obtenida
1 para las diferentes enzimas fueron introducidas al programa estadístico GeneStat-PC 3.3 (Lewis 1993), especialmente diseñado para analizar índices de polimorfismo: Porcentaje de loci polimórfico (P), heterocigosis esperada (He) y parámetros de diversidad genética: diversidad intrapoblacional (Hs), identidad intrapoblacional (Js), diversidad genética en el total de poblaciones (Ht), identidad genética en el total de las poblaciones (Jt), diversidad genética interpoblacional (Dst).
Los niveles de significancia entre las frecuencias alélicas de las muestras se obtuvieron a partir de la prueba de x2 del programa SAS (Rohlf 1989). Los niveles de significancia entre valores
? medios de He se hicieron con un análisis de varianza del programa SAS (Rohlf 1989).
4.6.1. Aniílisis estadístico de las relaciones: altura, edad y número de semilla por cono.
Los datos de altura, edad y número de semillas por cono, fueron comparados con un análisis de varianza GLM (modelos lineales generales) del programa SAS (Rohlf 1989).
5. RESULTADOS Y DlSCUSlON C
5.1. Relación de altura y edad de los arboles muestreados
En el cuadro 5. se detalla el promedio de altura y edad de los 81 árboles muestreados en los seis sitios de estudio. El análisis de varianza, a través del procedimiento del modelo linear general, del Programa SAS (Rolf 1999) agrupó los resultados de los sitios SI, S2, S3, S4 y L2 con el superíndice a, y al sitio L3 con el superíndice b. Este procedimiento permite evaluar los promedios, sin que los valores se vean afectados por el N (numero total de individuos) de la muestra. La diferencia del promedio de altura por sitio obtenida fue significativa al 5% entre los
C árboles de Trojales y el resto de sitios muestreados.
Cuadro 5. Promedio de altura y edad de los árboles muestreados en los seis sitios de colecta 1 No. de árboles 1 Promedio de altura de b s I No. de arboles
b
' Este valor fue inferior, para el mismo sitio, de 5 individuos muestreados menores de 50 afios
La diferencia en alturas podría explicarse en base al efecto del ambiente sobre el genotipo. Trojales fue el sitio con mayor altitud donde se muestreó (3300 m SNM) y hasta donde se observó la distribución del pino blanco en el Bosque Comunal. A esa altura empezaba a crecer el Pinus
t
18
mdis (pino colorado), con una densidad interesante de 90% pino colorado y 10% de pino blanco. Fue el área muestreada menos perturbada por la presencia o actividad humana. El lugar es bastante frío, al medio día la temperatura era de 7°C en el mes de noviembre y había mucho viento. Estas condiciones de viento, frío y altitud, que no se encontraron en el resto de sitios de muestreo, pueden ser los factores ambientales, que estén ejerciendo presión, específicamente, en la altura de los árboles de Trojales, respecto al resto de sitios.
Respecto a la edad de los árboles, en el cuadro 4. se presentan los datos obtenidos para la categoría que presentaba el mayor número de individuos. Las categorías evaluadas fueron: < 50 años, entre 50-100, 100-150, 150-200. Todos los sitios presentaron un mayor número de individuos en la categoría entre 50-100 aAos, excepto el sitio S4, que presentó 5 individuos para la categoría <50 y 4 para la de 50-100.
La presencia de conos con semillas está entonces asociada a la categoría de 50-100 años. Este dato es congruente con los observado en la Parcialidad Paquí, que no se incluyó en este estudio, pero que fue visitada durante el viaje de reconocimiento, llevado a cabo en noviembre del 2002. En este bosque los árboles, por su altura y grosor, parecían tener entre 200-300 años; presentaban muy pocos conos y de muy difícil acceso por su altura. No se observaron árboles jóvenes o que se estuviera dando una regeneración natural.
5.2. Manejo de conos y obtenci6n de semillas.
En el Cuadro 6. se detalla la cantidad de semillas colectadas por cono en los seis sitios de muestreo. El análisis de varianza, a través del procedimiento del modelo linear general, del Programa SAS (Rolf 1999) agrupó los resultados de los sitios S I , S3 y L2 con el superíndice a, y a los sitios S2, S4 y L3 con el superíndice c. Este procedimiento pemite evaluar los promedios, sin que los valores se vean afectados por el N (número total de individuos) de la muestra. La diferencia del promedio de semillas obtenidas por cono entre los dos grupos (superíndices a y c) resultó significativa al nivel del 5%.
Cuadro 6. sitios de muestreo, número de árboles por sitio, numero de conos colectados y promedio de semillas por cono. m 1 No. de arboles 1 No. de conos 1 Promedio de
C6digo S1 S2 - S3 S4
L J 1 - 1 I
Valores medios afectados por el mismo superlndice no mostraron diferencias significativas al nivel 5%
Sitio de muestre0 Salvachán
Pacajá Chuiiolom
L3 TOTAL
Las semillas que se obtuvieron de los conos se disectaron para obtener los embriones y gametofitos para la electroforesis de isoenzimas. Durante la disección 77% de las semillas se encontraron vacías, sin ningún tipo de tejido. Este resultado es sumamente importante, porque significa que aunque un cono produzca un número alto de semillas, como se observó en el Cuadro 4 para los sitios S1, S3 y L2, no significa que todas las semillas estén viables. Lo que hace aún más importante la recomendación de los sitios ideales para colecta de semilla, tanto para conservación como para reforestación.
Chojolom 1 11
El resultado anterior explica el bajo porcentaje de genninación (25%) que se obtuvo, al intentar emplear embriones germinados para la electroforesis de isoenzimas. Este bajo porcentaje de geminación, aunado a la duración del ensayo de genninación (21 días) obligaron a cambiar la
muestteados 1 O 9 1 O
L2 I
rijal les 12 1 81
34
colectados 42 31 31
34.9" Chuioachec - -
4 1 272
semillas por cono 59.9" - 31.1' 53.5"
40.6" 59 6a 29 93
metodología y emplear semillas disectadas sin getminar para obtener el gametofito y embrión. Este método permitió establecer el 77% de semillas inviables arriba reportado. Se obtuvo también la cantidad de semillas por gramo, el valor medio obtenido fue de 22 semillas.
El porcentaje de getminación obtenido (25%) contrasta con el reportado por el INIFAP (1997) para P. ayacahuite en México de hasta 80%, en rodales con una polinización cruzada adecuada. Y en sitios con menores densidades de árboles reportan entre 40-70% de genninación. El bajo porcentaje de getminación obtenido (25%), así como el alto porcentaje (77%) de semillas vacías que se encontraron, resaltan la necesidad de profundizar m8s en este tema de estudio en el futuro.
5.3. Plagas encontradas en los conos de pino blanco
Durante el manejo y obtención de semillas se observó la presencia de larvas de lepidópteros. Las larvas se mantuvieron en frascos en el Banco de Getmoplasma del ICTA, hasta que empuparon y emergió el adulto. La identificación de los adultos se hizo en el Laboratorio de Entomologia Sistemática de la Universidad del Valle de Guatemala.
94 conos del total de 272 colectados estaban picados por la larva de Henricus melanoleucus . La literatura (Tovar 1995), menciona que las larvas barrenan las escamas de los conos. La resinación originada por el ataque ocasiona una fusión de las escamas, que impide la apertura del cono y la liberación normal de semillas, en ataques intensos puede ocasionar la muerte del cono. Está considerada la principal plaga del P. ayacahuite (Tovar 1995). El control de la plaga se justifica en las áreas semilleras mediante la aplicación de insecticidas sistémicos o de contacto.
Figua 13. Adultos de Henricus melanoleucus, obtenidos de las larvas encontradas en los conos pino blanco colectados
5.4. Interpretación y evaluación estadística de las isoenzimas
Se obtuvieron las frecuencias alélicas para 8 isoenzimas tanto para los tejidos ' gametofíticos, como para los embriones. Estos datos nos permitieron conocer los alelos presentes '
en las seis localidades, así como su distribución (Cuadros 6 y 7). Sin embargo para obtener los parámetros de diversidad genética (P, He, Ht, Js, etc.) se empleó una matriz, donde se eliminaron las frecuencias alélicas obtenidas para la enzima Adh-1 y Adh-2, para que según Nei (1987), el número tan bajo de individuos analizados para la enzima Adh, (1 en S2; 2 en SI; 3 en S4; 5 en S3, etc.) no interfiriera con los valores reales de P (número de loci polimórficos) de las seis localidades; ni en los valores reales de la diversidad genética total (Ht) presente en el Bosque ! r '
Comunal de Totonicapán.
Un locus es llamado polimórfm, cuando la frecuencia del alelo más común es igual o menor que 99%. Este parametro de referencia fue el empleado para los valores de P de los gametofdos y embriones estudiados. Nei (1987) menciona que sería recomendable emplear un
P=100%. Y que P da un importante aspecto de variación genética dentro de los poblaciones, mientras el número de locus y de individuos sea alto (no menor de 50), sin embargo nosotros empleamos el valor de P=99% de referencia por ser es el más ampliamente usado.
Nei (1978) también menciona que para reducir el error en la muestra de la heterocigosidad, se deben examinar un gran número de locus, en vez de un gran número de individuos por locus. En nuestro estudio este requisito no se cumple, sin embargo los resultados obtenidos nos brindan una base de referencia, que podna ser reiterativa en estudios posteriores, empleando un mayor número de individuos, o analizando un mayor número de loci. Además el número de la muestra (81 individuos) estudiado, nos permitió estudiar la variación protéica heredada (Mitton 1983) y medir la diversidad genética presente en el P. ayacahuite del Bosque Comunal de Totonicapán. La presencia de los alelos comunes y alelos raros y su distribución en las seis localidades, confirman que los valores obtenidos para la diversidad genética de la muestra son representativos de la especie para el Bosque Comunal de Totonicapán.
Los parámetros de diversidad genética empleados: diversidad genética intrapoblacional (Hs), identidad genética intrapoblacional (Js), diversidad genética total (Ht), identidad genética total (Jt), diversidad genética interpoblacional (Dst) y coeficiente de diferenciación entre poblaciones (Gst) permitieron medir la variación dentro y entre las poblaciones estudiadas, así como conocer su distribución cuando se comparan estas poblaciones. En nuestro estudio los parámetros que aplican a poblaciones, como el caso de Hs representan la diversidad genética entre las seis localidades. La distribución de la variación de aloenzimas entre poblaciones es el producto de la interacción de varios factores evolutivos. De importancia primaria están: la selección, un tamaño adecuado de la población y la habilidad de las especies para dispersar polen y semillas (Hamrick 1 989).
5.4.1. Interpretación de las isoenzimas :
Las seis enzimas analizadas, ACO, MDH, SKDH, IDH y 6-PGD mostraron zimogramas con una buena resolución. ADH fue la excepción, donde pocos individuos (solamente uno en S2) pudieron ser evaluados en las seis localidades. Las enzimas monoméricas (SKDH y ACO) presentan dos bandas para los individuos heterocigotos y una banda para los homocigotos. Las enzimas diméncas (MDH, IDH y 6-PGD) mostraron tres bandas para los individuos heterocigotas y una banda para los individuos homocigotos. Cada banda es la expresión de un alelo.
ACO Presentó en los gametofitos y embriones una zona de actividad. En gametofitos Aco-1
presentó tres alelos (1, 2 y 3) el alelo 1 se presentó con mayor frecuencia en las seis localidades Los alelos 1 y 2 parecen estar distribuidos en una forma homogénea en las seis localidades, mientras que el alelo 3 se presentó solamente en la localidad S3 en una frecuencia del 0.07. En embriones se presentaron dos alelos, siendo el 1 el de mayor frecuencia, con respecto del 2.
Sin embargo el nivel de sígnificancia de la prueba x2 para las frecuencias alélicas no mostró diferencias significativas en la distribución de los tres alelos (1, 2 y 3) en gametofitos y embriones en las seis localidades muestreadas (Cuadro 6).
ADH Presentó dos zonas de actividad, Adh-1 y Adh-2, ambas con dos alelos tanto en
gametofdos como embriones. El alelo 1 se presentó con mayor frecuencia en el locus 1, mientras que el 2, sólo se presentó en los sitios S3 y L2 en gametofitos. En el locus 2, la presencia y distribución de ambos alelos fue homogénea en los seis sitios de muestre0 tanto para gametofitos como para embriones. Para ambos loci la diferencia en la distribución de ambos alelos, no mostró diferencias estadísticamente significativas.
MDH Presentó dos zonas de actividad, Mdh-1 con dos alelos en gametofitos y embriones (1 y 2)
y Mdh-2 con un alelo en gametofitos y dos en embriones (1 y 3). En embriones en los dos locus, los alelos se presentaron con la misma frecuencia (50% cada uno), lo mismo ocumó en gametoftos para Mdh-l. Sin embargo para MdH-2, el Único alelo que se presentó fue el 2.
La presencia del alelo 3 en Mdh-1 en embriones y ausente en gametofitos, señalan la herencia patema del mismo.
SKDH:
Figura 14. Zmograma de la enzima MDH Los camles 1 y 3 muestran los patrones de bandas obtenidos para gametofitos hetemigotas. Todos los camles impares pertenecen a gametoñtos y los pares a embriones. Los camles 2 y 4 muestran los patrones de bandas de embriones heterocigotris
Presentó una zona de actividad. En gametofitos presentó tres alelos (1, 2 y 3), la presencia de los alelos 1 y 2 fue casi del 50% para cada uno, mientras que el alelo 3 se presentó en los sitios S4 y L2 en bajas frecuencias (0.09 y 0.06 respectivamente). En embriones se presentaron tres alelos (2, 3 y 4). El alelo 2 se presentó con mayor frecuencia y en todas las localidades, mientras que el alelo 3 al presentarse con una frecuencia 0.03 y en una sóla localidad L2, se considera un alelo raro según la descripción de Alden y Loopstra (1987). Alelos con una frecuencia igual o menor a 0.05, son consideraros raros. El alelo 4 también se presentó solamente en el sitio L3 con una baja frecuencia 0.07.
Nuevamente la presencia del alelo 4 en embriones y ausente en gametoffios, sugieren una herencia patema.
d& bandas son heterocigotos y bs de una homocigotos. El caml 9 muestra un embrión con el aleb 3, por encha de los alebs 1 y
Presentó una zona de actividad en gametofdos y embriones. Los alelos presentes en gametoftos fueron el 1 que se presentó en frecuencias 0.03 en S3 y S4 y de 0.01 en L2, lo constituyen en un alelo raro (Alden y Loopstra 1987). El alelo 2 se presentó en bajas frecuencias en S3, S4 y D., mientras que el alelo 3 se presentó con la mayor frecuencia y en todas las
localidades. El alelo 4 es un alelo ram que sólo se presentó en L2 y en una muy baja frewencia (0.2).
El alelo 1 en embriones es un alelo raro, con frecuencias de 0.05, 0.04 y 0.01 y presente en los sitios S2, S3 y L2. El alelo 2 se presentó también en frecuencias bajas en cuatro de los sitios muestreados (S2, S3, S4 y E ) . El alelo 3 se presentó con la mayor frecuencia y distribuido en las seis localidades. I
r Figura 16. Zmograma de la enzima Wgd. El carril 11 pertenece a un gametofito en homocigosis (alelo 2, genotipo 22) y el caml 12 a un embrión en heterocigosis (alelos 1 y 3).
IDH
Presentó dos zonas de actividad en gametofitos y embriones, con dos alelos 1 y 2 en ambos tejidos. El alelo 1 se presentó en ambos con la mayor frecuencia, mientras que el 2 en gametoftos se presentó en bajas frecuencias en las localidades 52, S3 y L3 y en embriones, solamente en la localidad L2 en categoría de alelo raro (0.01 9).
Figura 17. Zimograma de la enzima IDH. El carril 16 muestra el alelo 2 en homocigosis en un gametofíto, por encima del alelo 1.
O 5.4.2. Anhlisis estadístico para los gametofrtos
El nivel de significancia de la prueba x2 para la frecuencias alélicas de los gametofitos con ploidia (n). (Cuadro 6) no mostró diferencias significativas en la distribución de los alelos para ninguna de las 8 isoenzimas analizadas en las seis localidades. Estos resultados indican que la presencia y distribución de todos los alelos estudiados en las seis localidades es homogénea y que se muestrearon los alelos comunes distribuidos localmente y los raros (Brown and Marshall 1995) del P. ayacahuíte del Bosque Comunal de Totonicapán.
6
La presencia y frecuencia (0.07) de los alelos 3 en Aco-1, presente solamente en la localidad S3 Chuijolóm; la frecuencia (0.09 y 0.06) del alelo 3 presente solamente en las localidades S4 Chojolóm y L2 Chuipachec respectivamente, indican que además de los alelos comunes, se incluyeron también en el muestre0 los alelos presentes en una baja frecuencia en las seis localidades. El mismo caso se observó para el alelo 2 de Idh-1, que se presentó en frecuencias de 0.05 para las localidades S3 y L3 y de 0.08 en S2.
localidades. El alelo 4 es un alelo raro que s61o se presentó en L2 y en una muy baja frecuencia (0.2).
El alelo 1 en embriones es un alelo raro, con frecuencias de 0.05, 0.04 y 0.01 y presente en los sitios S2, S3 y L2. El alelo 2 se presentó también en frecuencias bajas en cuatro de los sitios muestreados (S2, S3, S4 y L2). El alelo 3 se presentó con la mayor frecuencia y distribuido en las seis localidades.
Flgun 16. Zhograma de la enzha -d. El carril 11 pertenece e un gametoffto en homoclgoh (alelo 2, genoilpo 22) y el carrü 12 a un embrión en heterocigosis (alelos 1 y 3).
IDH
Presentó dos zonas de actividad en gametofitos y embriones, con dos alelos 1 y 2 en ambos tejidos. El alelo 1 se presentó en ambos con la mayor frecuencia, mientras que el 2 en
8 . . gametofdos se presentó en bajas frecuencias en las localidades S2, S3 y L3 y en embriones, . .- '.
solamente en la localidad L2 en categoría de alelo raro (0.019). t - . 8 .
o 5.4.2. Anilisis estadístico para los gametofitos
El nivel de significancia de la prueba 2 para la frecuencias alélicas de los gametofdos con i ploidia (n). (Cuadro 6) no mostró diferencias significativas en la distribución de los alelos para , ninguna de las 8 isoenzimas analizadas en las seis localidades. Estos resultados indican que la , presencia y distribución de todos los alelos estudiados en las seis localidades es hornogenea y que '
se muestrearon los alelos comunes distribuidos localmente y los raros (Brown and Marshall 1995) del P. ayacahuite del Bosque Comunal de Totonicapán.
La presencia y frecuencia (0.07) de los alelos 3 en Aco-1, presente solamente en la localidad S3 Chuijolóm; la frecuencia (0.09 y 0.06) del alelo 3 presente solamente en las. localidades S4 Chojolóm y L2 Chuipachec respectivamente, indican que ademas de los alelos . comunes, se incluyeron también en el muestre0 los alelos presentes en una baja frecuencia en las !r _ . seis localidades. El mismo caso se observe para el alelo 2 de Idh-1, que se presentó en frecuencias de 0.05 para las localidades S3 y L3 y de 0.08 en S2.
La presencia y frecuencia (0.02) del alelo 4 en 6-PGD-7, presente solamente en la localidad L2 y de 0.05 del alelo 2 de Idh-7 en S3 y L3 (Cuadro 7), considerados como alelos raros, segun la descripción de Alden y Loopstra (1987); indican que en el muestreo llevado a cabo para este estudio se colectaron los alelos tipo, o comunes, ampliamente distribuidos, los comunes, localmente distribuidos y los raros (Bmwn y Marshall 1995); por lo que el muestreo efectuado en las seis localidades es representativo de la diversidad genética del P. ayacahuite en el Bosque Comunal de Totonicapán.
Cuadro 7. Frecuencias alélicas obsenradas para ocho isoenzimas en los gametólitos de pino blanco (Pinus ayacahuite) en las seis localidades muestreadas y nivel de significancia de la prueba ~2 para la heterogeneidad de las mismas (pe 0.05).
S1 S2 S3
/ " P(99%) 50% 66.7% 83.3% 66.7% 66.7% 66.7% a: Valores de P calculados sin tomar en cuenta las frecuencias alélicas de la enzima Adh. ns: diferencias no significativas
5.4.3. lndices de polimorfismo y parámetros de diversidad genética para gametofitos
P= Porcentaje de loci polimórfico: Los valores de P representan la cantidad de variación genética presente en la población o
especie. La localidad S3, Chuijolom presentó el valor de P más alto (83.3%) de las seis localidades, mientras que S?, Salvachán presentó el valor más bajo (50%).
Sin embargo ambos valores son superiores al valor medio de 36.8% aceptado para las especies vegetales (Hamrick 1989). El valor de P con una media de 66.7% (Cuadro 7) para las seis localidades, producto de un análisis donde la muestra es representativa de la diversidad genética, puesto de manifiesto por la presencia de alelos raro y alelos tipo, indican que el P. ayacahuite del Bosque Comunal de Totonicapán tiene altos índices de polimorfismo. Estos resultados concuerdan con los esperados para coníferas con un P de 67.7% y reportados por Hamrick (1989). Valores similares son reportados para otras especies del género pinus (Gibson
1990, Aguinagalde 1996, Ledig et al. 2001) que al igual que el P. ayacahuite combinan características que aseguran la continuidad de la diversidad genética: poblaciones alógamas grandes y contínuas, con recomdos de largas distancias del polen y semillas (Hamrick 1992).
El valor medio para la heterocigosis esperada (diversidad genética = He) en los
gametofhos de las seis localidades estudiadas fue más alto (0.4153) en la localidad S3. El más bajo observado fue de 0.2068 en la localidad S1 (Cuadro 8). El análisis de varianza entre los valores medios de las seis localidades no mostró diferencias significativas al nivel 5%.
El valor medio aceptado para este parámetro en especies vegetales es de He=0.14 (Hamrick 1989 y Scaltosyiannes et al. 1993). Por lo que la diversidad genética en las seis localidades es superior al reportado por Hamrick (1989) y congruente con lo esperado para coníferas. Este resultado indica también una alta presencia de individuos heterocigotos y un buen flujo de genes.
Cuadro 8. Diversidad genhtica (He) de garnetoftos de pino blanco y valore medios de la heterocigosis esperada en las seis localidades rnuestreadas.
1 Isoen- I S1 1 s.e. l S2 l s.e. 1 S3 I s.e. 1 S4 I s.e. I L2 ( s.e. 1 L3 1 s.e.
Cuadro 9. Parárnetros de diversidad genhtica estudiados para 8 isoenzirnas en garnetófrtos de pino blanco en las seis localidades rnuestreadas
Hs: diversidad aenética intra~oblacional Js: identidad genhtica intrapoblacional Ht: diversidad genhtica total
I Jt: identidad genhtica total Dst: diversidad genhtica interpoblacional Gst: coeficiente de diferenciación entre poblaciones
El valor medio de la diversidad genética total (Ht) para los gametofitos fue de 0.2789, siendo muy similar al de la diversidad genética intrapoblacional Hs = 0.2666 (Cuadro 9). Los parámetros descritos a continuación permitieron conocer cómo está distribuida (dentro de las localidades o entre localidades) esa diversidad genética. En nuestro estudio Hs representa a la
6 diversidad genética entre las seis localidades. El valor bajo de la diversidad genética entre poblaciones Dst=0.0123 en relación a los valores altos de Ht y Hs son indicativos de que la diversidad está situada mayoritariamente en el interior de las seis localidades (99.6%) y que genéticamente sólo 0.4% (= valor de Gst) las diferencia o separa. Los resultados son congruentes con el tipo de muestre0 efectuado, ya que geográficamente las seis localidades forman parte del mismo bosque y su separación obedeció a factores como acceso y comodidad para colectar las semillas. Las localidades representan diferentes niveles altitudinales deritro del Bosque.
Esta misma separación es de utilidad para identificar las localidades que presentaron mayor diversidad genética para seleccionar semilla para conservación, reforestación o mejora genética.
La localidad S3 presentó los valores más altos para P (83.3%) y para He (0.4153). Si se toma en cuenta que estos valores fueron obtenidos con una muestra de 15 individuos, comparada con la muestra de 33 individuos para L2 con un P = 75% y He = 0.2529, los resultados indican que la localidad S3 (Chuijolóm) es altamente diversa. Ambas localidades presentaron los valores para P y He más altos de las seis estudiadas.
La localidad S3 (Figuras 8a y 8b) se caracterizó por ser un lugar muy húmedo, donde la neblina condensa, permitiendo que el agua que queda atrapada en las hojas pueda ser canalizada para su posterior distribución a las poblaciones alrededor del Bosque. Es un área donde abundan los helechos y musgos. La alta diversidad genética que presenta (0.4153), así como su importancia en la conservación de los recursos naturales del Bosque, la hacen un área prioritaria para conservación y para selección de semilla. Además las características ambientales del lugar, (humedad, temperatura, presencia de especies que crecen en ambientes muy húmedos), diferentes a las observadas en las otras cinco localidades, sugieren una influencia ambiental sobre la estructura genética del P. ayacahuite en Chuijolóm (S3).
5.4.4. Análisis estadístico para los embriones
Los embriones presentan una ploidía 2n por lo que reciben para cada genotipo identificado un alelo de cada uno de los progenitores.
El nivel de significancia de la prueba x2 para la frecuencias alélicas de los embriones (Cuadro 10) no mostró diferencias significativas en la distribución de los alelos para ninguna de las 8 isoenzimas analizadas en las seis localidades. Estos resultados indican que la presencia y distribución de todos los alelos estudiados en las seis localidades es homogénea y que se
P muestrearon los alelos comunes distribuidos localmente, así como los raros. Las frecuencias de los alelos raros se observaron en un 0.01 para el alelo 1 en 6-Pgd-1; 0.03 para el alelo 3 en Skdh- 1 y de 0.04 para el alelo 1, también en 6-Pgd-l. La presencia de alelos comunes y raros coincide con los resultados obtenidos para los gametofitos y confirman el muestre0 de la diversidad genética representativa del P. ayacahuite del Bosque Comunal de Totonicapán.
Se observaron alelos como el 4 en Skdh-1 que estaban presentes en los embriones pero no en los gametofitos, indicando que la procedencia de tal alelo proviene del polen. Resultados similares fueron observados para el alelo 2 en Adh-2 en las localidades SI , S2 y S4.
P Un resultado interesante lo constituye la presencia del alelo 1 en Skdh-1 en los gametofitos,
pero ausente en los embriones. Esto se explica en base a que el alelo 2 está en homocigosis para 4 de las seis localidades, por lo que el embrión recibió un alelo 2 del padre y otro de la madre, reiterando una posible segregación Mendeliana de 1:2:1.
Cuadro 10. Frecuencias alblicas observadas para seis isoenzimas en los embriones de pino blanco (Pinus ayacahuite) en las seis localidades muestreadas y nivel de significancia de la prueba ?para la heterogeneidad de las mismas (p< 0.05)
r S1 S2 S3 ACO-1 1 2 Adh-1 1 2 Adh-2 1 2 Mdh- 1 1 2 Mdh-2 1 3 Skdh-1 2 3 4 6-Pg&l 1 2 3 Idh-1
1 2 0.00 0.00 0.00 o .o0 0.01 9 0.00
P 99% 50% 66.67% 66.67% 66.67% 100% 66.67% " ( ) a: Valores de P calculados sin tomar en cuenta las frecuencias alélicas de la enzima Adh.
D ns: diferencias no significativas
5.4.5. lndices de polimorfismo y parámetros de diversidad genética para embriones
P= Porcentaje de loci polimórfico:
El mismo valor de P=66.67% se obtuvo en cuatro localidades S2, S3, S4 y L3, mientras que las localidades S1 y L2 mostraron valores para P = 62.5% y 100% respectivamente (Cuadro 10). Para todas las localidades los valores de P fueron muy superiores al reportado para especies
I vegetales por Hamrick (1989) del 36.8%. Estos valores coinciden nuevamente con los observados para los gametofitos y reiteran que el P. ayacahuite del Bosque Comunal de Totonicapán tiene altos índices de polimorfismo y que la muestra colectada contiene la diversidad genética representativa del P. ayacahauite en este Bosque.
El valor medio para la hetemcigosis esperada (diversidad genética = He) en los embriones de las seis localidades estudiadas fue más alto (0.2709) en la localidad S3. El más bajo observado fue de 0.2129 en la localidad L3 (Cuadro 9). El análisis de varianza entre los valores medios de las seis localidades no mostró diferencias significativas al nivel 5%. El valor medio aceptado para este
l8 parámetro en especies vegetales es de He=0.14 (Hamrick 1989 y Scaltosyiannes et al. 1993). Por lo que la diversidad genética en las seis localidades es superior al reportado por Hamrick (1989) y congruente con lo esperado para coníferas. Al igual que para los gametofitos no existen diferencias significativas en los valores de la diversidad genética entre localidades. La distribución de los individuos heterocigotos es homogénea en las seis localidades (Cuadm 11).
Cuadro 11. Diversidad genética (He) de embriones de pino blanco y valore medios de la heterocigosis esperada en las seis localidades muestreadas.
1 lsoen- 1 S1 1 s.e. 1 S2 1 s.e. 1 5 3 / s.e. ( 54 1 s.e. 1 L2 1 s.e. ( L3 1 s.e. 1
Cuadro 12. Parámetros de diversidad genética estudiados para 8 isoenzimas en embnones de pino blanco en las seis localidades muestreadas
Js: diversidad genética intrapoblacional Ht: diversidad genética total Jt: identidad genética total üst: divedrsidad genética interpoblacional Gst: coeficiente de diferenciación entre poblaciones
El valor medio de la diversidad genética total (Ht) para los embriones fue de 0.2431, siendo muy similar al de la diversidad genética intrapoblacional Hs = 0.2466. El valor de 0.0 obtenido para Dst en relación a los valores altos de Ht y Hs son nuevamente indicativos de que la diversidad está situada totalmente (100 %) en el interior de las seis localidades. ya que el valor de Gst fue también de 0.0 (Cuadro 12)
Js H t Jt Dst Gst 0.71 17
Isoenzima ACO-1
La localidad L2 presentó un 100% de polimorfismo (P) reiterando lo observado con los gametoffios, en cuanto a que las localidades L2 y S3 son las más diversas genéticamente y que para L2 esta alta diversidad genética, sobre las demás localidades, puede deberse al mayor número de individuos (29) que se colectaron para esa localidad. Sin embargo al tratarse de la localidad con mayor perturbación por presión humana (tala, pastoreo, avance de la frontera
d agrícola y suelos degradados) esta alta diversidad pudiera verse amenazada.
Hs --- 0.2883
Los altos niveles de polimorfismo y diversidad genética obtenidos, así como la homogénea distribución de la diversidad genética del P. ayacahuite del Bosque Comunal de Totonicapán en las seis localidades, sugieren un buen flujo de genes en este bosque.
Mdh-1 0.51 29 0.4871 0.5022 O .4978 0.0000 0.0000
6. Conclusiones:
Mdh-2
6-Pgd-1 Idh-1 MEDIA
# El valor medio de la diversidad genética (P=68%), promediado entre los embriones y gametofios es superior al reportado para coníferas P= 67% (Hamrick 1989); por lo que la diversidad genética del P. ayacahuite en el Bosque Comunal de Totonicapán es alta y está distribuida de forma homogénea en las seis localidades muestreadas.
0.5129 0.4871 0.5022 O .4978 0.0000 O .O000 --
0.1259 0.0064 0.2466
El valor medio de la heterocigosis esperada (He= 0.34), promediado entre los embriones y gametofios es superior al reportado para especies vegetales He=0.14 (Hamrick 1989); por lo que la presencia de individuos heterocigotos de P. ayacahuíte en el Bosque Comunal de Totonicapán
rl
Hs: diversidad genética intrapoblacional
es alta y está distribuida de forma homogénea en las seis localidades muestreadas; indicando un buen flujo de genes y ausencia de erosión genética.
Aunque los valores de P y He no presentaron diferencias significativas al nivel del 5% entre las seis localidades, indicando distribución homogénea de la diversidad genética, las localidades L2 y S3 presentaron niveles de polimorfismo y diversidad genética superiores (P=lOO% y 74.9%; Hez0.25 y 0.41 respectivamente) al resto de localidades. Este resultado es importante para priorizar estas dos localidades para conservación y sitios de colecta de semilla.
El valor medio de la diversidad genética total (Ht=0.26), promediado entre los embriones y gametofdos y que se emplea para comparar la diversidad entre poblaciones, en este estudio indica que casi el 100% de la diversidad genética está situada dentro de las seis localidades. Este resultado es congruente con el muestreo altitudinal de un mismo bosque que se empleó, debido a los fondos disponibles para el proyecto, no eran suficientes para ampliar el muestreo a otras áreas.
A nivel individual las enzimas, MDH y 6-PGD registraron los valores más altos con los parametros de diversidad genetica (Hs, Js, Ht, Jt), como consecuencia de un mayor número de heterocigotas, sin embargo MDH por su buena resolución es altamente recomendable para estudios de diversidad genética con isoenzimas para el P. ayacahuite.
La mayoría de los árboles muestreados (50 de 81 totales) se encuentran entre el rango de 50-100 años. A este rango pertenecen las localidades S I , S3 y L2 que presentaron un número superior de semillas por cono (59.9, 53.5 y 59.6 respectivamente); y estadísticamente significativo, respecto al resto de localidades.
Por su diversidad genética alta y por contener árboles jóvenes con niveles superiores de semillas por cono, las localidades Chuijolom (S3) y Chuipachec (L2) presentan cualidades ideales para la colecta de semillas para emplear en reforestación.
e 7. Recomendaciones.
7.1 Para la conservación de los recursos gen6ticos del P. ayacahuite
Se recomienda a las localidades de Chuijolom (S3) y Chuipachec (L2) como prioritarias para la conservación de los recursos genéticos del P. ayacahuite en el Bosque Comunal de Totonicapán. Entre estas dos localidades Chiupachec al ser la que presenta mayor perturbación por la tala y avance de la frontera agrícola, requiere de una mayor atención en su conservación para que la alta diversidad genética que contiene, no sufra erosión genética.
* Se recomienda colectar semillas prioritariamente de la localidad de Chiupachec, para asegurar la conservación de los alelos raros presentes en esta localidad y emplearlas en la reforestación del mismo bosque Comunal. Esta sena una medida preventiva que evitaría la erosión genética. Las semillas deberán colectarse primero en aquellos sitios donde los árboles estén cercanos al camino y pudieran estar sujetos a tala. Los árboles donde se colecte la semilla, deberán estar separados por 100-200 m entre ellos.
Se recomienda tomar en cuenta los resultados obtenidos en este estudio, cuando se O elabore la estrategia de manejo y conservación de los recursos genéticos del P. ayacahuite en
Guatemala.
7.2 Para la obtencián de semilla para reforestación y mejora genética
Se recomienda a las localidades de Sahrachán (SI), Chuijolom (S3) y Chuipachec ( E ) para la obtención de semilla para reforestación o venta. Deberá tomarse en cuenta que en este
estudio se encontd un 77% de semillas vacías. No profundizamos, porque en ese momento no teníamos el dato completo, si existía una correspondencia entre semillas vacías y localidad muestreada. Por lo que para asegurar que un alto número de semillas germinen, se recomienda obtener semilla de Salvachán, Chuijolom y Chuipachec, guardando la misma recomendación de dejar entre 100-200 m entre árboles.
Se recomienda continuar con el estudio de las semillas de P. ayacahuite para encontrar si existe una correlación entre número de semillas vacías y localidad dentro del Bosque Comunal.
Para la mejora genética se recomienda tomar en cuenta no solamente el fenotipo de la fuente semillera, sino desarrollar una estrategia, donde idealmente el lugar de colecta dentro de la fuente, coincida con una alta diversidad genética. Esta recomendación podría tomar un poco más de esfuerzo, pero se estanan cubriendo los aspectos de disponibilidad y de conservación de los fenotipos de interés para el mejorador en el presente y el futuro.
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