Universidad de ChileFacultad de MedicinaDepartamento de NutriciónUnidad de Investigación I

INCORPORACIÓN DE EXTRACTO DE MAQUI EN LA ELABORACIÓN DE PAN PARA AUMENTAR SU ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE

Autores: Bastián Hepp DekovićPaula Molina MorenoCamilo Muñoz Farías

Tutor: Catalina Carrasco Cotutor: Martín Gotteland

Área temática: Nutrición

Curso: Unidad de Investigación I 2015 Facultad de Medicina. Universidad de Chile

Introducción Estrés Oxidativo

Los agentes oxidantes son moléculas extremadamente inestables, que pueden reaccionar con una cantidad considerable de otras moléculas, modificando químicamente desde ácidos grasos y proteínas hasta el ADN mismo, afectando directamente su función biológica [Estrés oxidativo, 2015]. Son producidos fisiológicamente en la cadena transportadora de electrones, peroxisomas, lisosomas, citoplasma y membrana plasmática; esta producción de manera controlada juega un papel fundamental en el equilibrio homeostático, participando en la defensa contra agentes patógenos, como virus y bacterias [Avello y cols., 2006]. La célula tiene un mecanismo para controlar la cantidad de estos agentes oxidantes en el organismo, que son los antioxidantes. En ciertas condiciones patológicas los agentes oxidantes (radicales libres) sobrepasan a los antioxidantes y comienzan a afectar las funciones biológicas de biomoléculas. Este proceso de aumento en la relación radicales libres/antioxidantes se conoce como estrés oxidativo [Gawlik-Dziki y cols., 2014].

Los agentes oxidantes no sólo se adquieren de forma endógena, sino que también se producen por contaminantes externos, como la contaminación atmosférica, el humo de los cigarrillos, entre otros. El consumo de aceites vegetales hidrogenados, tales como la margarina, y el consumo de ácidos grasos trans, como los de las grasas de la carne y de la leche, también contribuyen al aumento de los radicales libres [Avello y cols., 2006].El estrés oxidativo al alterar la funcionalidad celular favorece el envejecimiento y el desarrollo de enfermedades crónicas no transmisibles, como diabetes Mellitus, enfermedades cardiovasculares, cáncer, hipertensión arterial, cirrosis e insuficiencia hepática, entre otras. [Elejalde, 2006] Antioxidantes

Un antioxidante se puede entender como cualquier molécula capaz de prevenir o retardar la oxidación, entendida como la pérdida de electrones, o incluso revertir el daño oxidativo; reduciendo así el riesgo a desarrollar las enfermedades crónicas no transmisibles mencionadas anteriormente. Desde el punto de vista de su origen, podemos clasificarlos en los biosintetizados por el organismo y los adquiridos mediante la dieta. En los primeros destacan los enzimáticos, como la superóxido dismutasa, y no enzimáticos, como el glutatión; los cuales también pueden ser incorporados mediante la dieta. Respecto a los que sólo ingresan mediante su ingesta están las vitaminas antioxidantes (como el ácido ascórbico), los carotenoides (como luteína), los polifenoles (flavonoides y no flavonoides) y otros que no caen dentro de estos tres grupos (como los glucosinolatos).[Araya y cols., 2006]

La nutrición juega un rol clave en la mantención del balance del medio interno. Las frutas y verduras son alimentos que, además de su importancia nutricional, muestran un efecto

protector de la salud, precisamente por poseer diversos nutrientes y fitoquímicos con actividad antioxidante, dentro de los cuales destacan los polifenoles.[Araya y cols., 2006]

PolifenolesLos polifenoles son moléculas sintetizadas por plantas, frutas y verduras, que se

caracterizan por presentar actividad antioxidante, debido a que poseen en su estructura por lo menos un grupo fenólico (grupo hidroxilo unido a un anillo aromático), lo cual les otorga la capacidad de ceder átomos de hidrógeno o electrones a los radicales libres, reduciéndolos.

Existen dos grandes subgrupos: no flavonoides y flavonoides. Dentro del subgrupo de los no flavonoides [Figura 1 (Ver en anexos)] encontramos principalmente alcoholes mono fenólicos, ácidos fenólicos y estilbenos. [Portal Antioxidantes, 2015] Los flavonoides están formados de dos anillos aromáticos que se encuentran en un heterociclo de tres carbonos y un oxígeno [Figura 2 (Ver en anexos)]. Estos últimos tienen una mayor actividad antioxidante, ya que al actuar como quelantes, reaccionan con cobre y hierro, lo cual evita la formación de radicales libres hidroxilo y superóxido, especies altamente reactivas involucradas en el estrés oxidativo. [Martínez, 2002] En la naturaleza se encuentran como compuestos conjugados, es decir, unidos a distintos azúcares (como glucosa o fructosa) o como compuestos libres (llamados agliconas). Los compuestos conjugados son más hidrosolubles, y por lo tanto menos absorbibles y menos biodisponibles, ejerciendo su función principalmente en el lumen intestinal. [Portal Antioxidantes, 2015] Está comprobado que los polifenoles no solo presentan actividad antioxidante, sino que algunos de estos también presentan actividad antiinflamatoria, antiagregante plaquetario, antibacteriano, estrogénico y modulador de enzimas [Portal Antioxidantes, 2015]

Maqui (Aristotelia chilensis) - Alimentos ricos en polifenoles/antioxidantes

Diversos estudios se han realizado con el fin de cuantificar el contenido de polifenoles presentes en una gran variedad de alimentos, siendo los berries un grupo de frutos con mayor contenido de este fitoquímico [Portal Antioxidantes, 2015][Portal Antioxidantes, 2015] [Figura 3 (Ver en anexos)]

El maqui es un berry propio de Chile y Argentina, del cual se ha descrito una alta actividad antioxidante, dada principalmente por su elevado contenido de antocianinas (polifenol de tipo flavonoide)[Escribano, 2006]. Se han realizado estudios que muestran que el maqui protege contra la oxidación de la Lipoproteína de Baja Densidad (LDL) [Martínez, 2002][Rottmann y cols., 2002], y por consiguiente, contra la inflamación del epitelio vascular, evitando la formación de placas de ateromas y disminuyendo el riesgo de adquirir afecciones cardiovasculares.

Dadas sus propiedades beneficiosas para la salud, la demanda ha crecido exponencialmente en los últimos años, traducido en que creció un 7.000% desde 733 Kg. al año en 2006 a 50 toneladas en 2011; y aun así los sistemas de recolección se limitan al trabajo por parte de pequeños productores, dejando como posibilidad aumentar todavía más su producción al

modernizar los sistemas de recolección y así también lograr homogeneizar las cosechas[ODEPA, 2013].

Un factor importante para definir la actividad antioxidante de un alimento, además de su cantidad de polifenoles totales, es la capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC, por sus siglas en inglés), pues como se mencionó anteriormente existen distintos tipos de polifenoles, unos con mayor o menor capacidad antioxidante, por lo que se usa esta medición como forma de objetivación y comparación entre alimentos; como es el caso del maqui en comparación a la murta, en donde el primero contiene 6.554 mg EAG/100g de polifenoles totales y una ORAC de 57.680 umol TE/100g; y el segundo contiene 6.832 mg EAG/100g de polifenoles totales pero una ORAC de 29.180 mg EAG/100g, con lo que se evidencia la poca precisión de usar la cantidad de polifenoles totales como única medida de capacidad antioxidante[Nativ for life, 2015].

Situación en Chile y estudios en la actualidad

De acuerdo a los datos presentados por la OMS en el informe sobre la salud en el mundo 2002 [OMS, 2002], podrían salvarse cerca de 1,7 millones de vidas cada año, si se consumiera la cantidad mínima recomendada de frutas y verduras, la cual corresponde a 400 gr de éstos alimentos. Si bien en Chile ha habido un aumento en el consumo de frutas y verduras los últimos años, actualmente la ingesta de éstos no supera los 100 g al día por persona [OMS, 2013]; lo cual podría estar influyendo en la cantidad de muertes por cáncer gastrointestinal, cardiopatías isquémicas y accidentes cardiovasculares.

A raíz de lo anterior, una posible solución sería incorporar los componentes beneficiosos para la salud que poseen frutas y verduras en otros alimentos que no los posean, pero que tengan una mayor demanda por la población. Podemos apreciar que en Chile existe un alto consumo de pan, siendo éste de 86,5 kilos promedio por persona en un año [ODEPA, 2012], cantidad que se ha mantenido desde que alcanzó esta cifra en la década de los ochentas [Mardones, 1987]; y es consumido por individuos de todos los niveles socioeconómicos.

En un estudio realizado para determinar el beneficio de añadir extracto de brócoli en la preparación de pan, se demostró que se puede mejorar la actividad antioxidante en general de éste cuando se incluía un 5% de polvo de brócoli, sin embargo en algunos casos como la actividad antirradicalaria no sobrepasa la actividad del pan control. Por otro lado, parámetros como el poder quelante y el poder reductor se veía aumentado desde la incorporación de 1% de polvo de brócoli en adelante. Estos resultados varían en cada caso según donde se analice, si es en el pan listo, en una muestra de digestión intestinal o si es en la cantidad absorbida, por esto los resultados recién dados son un caso general que no necesariamente se aplica en cada ocasión.[Gawlik-Dziki y cols., 2014]

En este proyecto nos proponemos usar esencias de maqui como fuente de antioxidantes, pues contiene un gran contenido de polifenoles [Nativ for life, 2015], y agregarlas al pan durante su elaboración, con el objetivo de comprobar que al añadir estas esencias, éste aumentará su actividad antioxidante.

HipótesisIncluir extracto de maqui en el pan aumenta su actividad antioxidante.

Objetivo General-Elaborar un pan enriquecido con polifenoles que tenga una alta actividad antioxidante. Objetivos Específicos-Determinar el contenido de polifenoles en tres tipos de pan.-Determinar la actividad antioxidante en tres tipos de pan.-Evaluar la aceptabilidad que tendría el pan con extracto de maqui.

Materiales y método1. Preparación de pan

Se prepararán dos recetas de pan: básico y francés. Para cada receta se preparará un pan control (sin maqui) y un pan “experimental” (con maqui). Cada uno de estos ensayos se realizarán tres veces.

Se prepararán dos tipos de pan: básico y francés, a los cuales se les añadirá cierta cantidad de extracto de maqui Nativ for Life, alcanzando junto a la incorporación de éste 750 g de mezcla, en máquina Moulinex con proceso estandarizado. Se realizará un ensayo preliminar para determinar la cantidad de maqui que sea óptima para que no haya alteración de la estructura normal del pan. Las cantidades de maqui a evaluar son 1% m/m, 2% m/m y 5% m/m.

Pan básico rápido:Tiempo de

Mezcla y Reposo: 1:16 hrs.Cocción: 0:53 hrs.

Ingredientes250 ml de agua1 1/2 cucharada sopera de aceite1 cucharada de café de sal3 cucharada de café de azúcar1 1/2 cucharada sopera de leche en polvo455 g de harina T551 cucharada de café de levadura

Pan francés:Tiempo de

Mezcla y Reposo: 2:16 hrs.

Cocción: 0:53 hrs.Ingredientes

275 ml de agua1 ½ cucharada de café de sal465 g de harina T551 cucharada de café de levadura

2. Obtención de muestra.Se obtendrá una muestra en cada etapa de la elaboración de pan: tras mezclar los

ingredientes, luego de que haya leudado y posterior al horneado, la cual se analizará en triplicado. Esto se realizará en cada receta aplicada.

Para obtener una muestra se pesarán 60 g de la preparación, la cual se dividirá en tres para realizar el análisis tres veces. A cada 20 g de preparación se agregarán 150 ml de mezcla (acetona 70%, agua 29,5% y Ac. acético 0,5%). Se mezclará todo en una juguera, se pondrá el producto en una botella de 250 ml y se dejará macerar por 40 min a 23°C. Luego se tomará 1 ml de sobrenadante y se centrifugará a 3500 G (RCF), por 10 min a 23°C; la muestra de sobrenadante obtenido se pasará a un eppendorf, ésta será la muestra utilizada para medir FRAP y PFT- Se harán las siguientes diluciones:

-Directa-1:4 (100 ul muestra + 400 ul H2O), factor de dilución (FD): 5-1:9 (100 ul muestra + 900 ul H2O) FD: 10

3. Determinación contenido de polifenoles totales.-Procedimiento de Análisis. Para realizar el llenado de placa se deberá:

1) Agregar a todos los pocillos 200 μl de Folín Ciocalteau diluido.2) Agregar 15 μl de muestra diluida a los pocillos que llevarán muestra.3) Agregar 15 μl de AG en pocillos de curva estándar 0 - 14 uM.4) Agregar a todos los pocillos 40 μl de NaCO3 20%.5) Incubar 30 min a 37°C en el multilector y medir a longitud de onda 765 nm. La lectura se realiza con programa Gen5.

-Los resultados serán expresados en: mg EAG/100g.

4. Determinación actividad antioxidante (FRAP).- Procedimiento de Análisis. Para realizar el llenado de placa se deberá:

1) Agregar a todos los pocillos 235 μl buffer acetato Na+ 310 mM.2) Agregar 25 μl FeCl3 20 mM sólo a los pocillos que llevarán muestra.3) Agregar a cada pocillo 25 μl de Triazina 10 mM.4) Agregar 15 μl de muestra diluida (en pocillos de muestra) o FeSO4 (en pocillos de curva estándar, de 0 a 30 uM).

5) Incubar todo 4 min a 37°C y medir a longitud de onda 593 nm. Medir luego a los 30 minutos. La lectura se realizará en multilector de placas con programa Gen5.

-Los resultados serán expresados en: umol TE/100g.

5. Panel aceptación.La finalidad será medir la aceptación que tendrá el pan elaborado con extracto de maqui,

esto se llevará a cabo a través de preguntas sobre apariencia, textura, sabor y cuánto estarían dispuestos a pagar por este producto. Para esto se dará a probar una muestra a 12 estudiantes de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile y paralelamente se realizará una encuesta para evaluar los parámetros mencionados anteriormente.

6. Análisis estadísticos.Las variables independientes a analizar serán la incorporación de extracto de maqui,

tiempo de cocción y receta con la que se elaborará el pan; y las variables dependientes serán la actividad antioxidantes y la cantidad de polifenoles totales.

Cada ensayo se realizará tres veces, y se tomará una muestra, que se analizará en triplicado, en cada una de las tres etapas de la elaboración indicadas anteriormente; con el objetivo de reducir el margen de error y así obtener un resultado más confiable. Estas muestras serán integradas en un análisis de varianza de 2 vías para muestra repetida, en donde una vía será la receta utilizada y la otra vía será la incorporación de extracto de maqui.

Para realizar el análisis estadístico se tendrá que evaluar como es la distribución de las muestras obtenidas a través del test de Shapiro Wilk. Si la distribución es normal los resultados se expresarán como promedio y desviación estándar o intervalo de confianza; si no, se expresarán como mediana y rango intercuartílico.

Resultados esperados y su fundamentación

Si el pan no sufriera ninguna reducción en la cantidad de polifenoles totales y en su actividad antioxidante luego de los procesos que conlleva su elaboración, se esperarían los resultados incluidos en la tabla 1, dependiendo de la cantidad de maqui a incluir en cada ensayo. Los valores utilizados para realizar dicha estimación fueron los indicados en el producto a utilizar (Maqui Nativ for life ®. Polifenoles Totales: 6.554 mg EAG/100g - ORAC = 57.680 umol TE/100g).

Se espera obtener un pan con actividad antioxidante y cantidad de polifenoles totales que no disminuya en un porcentaje mayor al 20% en relación a los resultados teóricos (tabla 1) después de pasar por los procesos de mezcla, leudación y cocción. Sin embargo, debido a las variables implicadas en estos mismos procesos la disminución podría ser mucho mayor al 20%. Si sucediera esto, daría paso a futuros estudios para determinar si la cantidad resultante de PFT y ORAC es suficientemente beneficiosa para la incorporación de extracto de maqui en la preparación de pan.

De la misma manera, estas mismas características de cada proceso afectarán a la actividad antioxidante y cantidad de polifenoles totales de diferente forma, pues por ejemplo, la fuerza mecánica utilizada para mezclar los ingredientes probablemente producirá una menor disminución de ambos parámetros que la energía calórica implicada durante la cocción. Si efectivamente cada proceso tuviese una distinta implicancia, abre la posibilidad de nuevos estudios para minimizar la disminución de los parámetros en cada etapa.

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Mardones, F. (1987). Tendencias en el consumo de pan en Chile. Revista Chilena de Nutrición. 15(1): 46-8. abr. 1987.ilus. Presentado en: Mesa Redonda: Sociedad Chilena de Nutrición, Santiago de Chile.

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Rottmann, M. et al. (2002). Juice and phenolic fractions of the berry Aristotelia chilensis inhibit LDL oxidation in vitro and protect human endothelial cells against oxidative stress. J Agric Food Chem.; 50(26):7542-7.

Anexos