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AL PERSONAL DEL INSTITUTO TECNOLOGICO
Villa de Álvarez, Col., junio de 2013
Proyecto
Diseño de estrategias secuenciales
óptimas de utilización de
antibióticos.
Sandra Gpe. Mayoral Álvarez.
Ingeniería Bioquímica.
Asesor:
Dra. Felipa Andrade Urzúa.
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MI AGRADECIMMIENTO:
A MIS MAESTROS QUE CONTIBUYERON A MI FORMACION ACADEMICA
DEL ITC.
A MI ASESORA INTERNA LA DRA. FELIPA ANDRADE URZUA,
AL CENTRO DE CIENCIAS GENOMICAS, UNAM. EN ESPECIAL AL DR.
RAFAEL PEÑA MILLER, AL PERMITIRME COLABORAR EN EL PROYECTO
“DISEÑO DE ESTRATEGIAS SECUENCIALES ÓPTIMAS DE UTILIZACION DE
ANTIBIOTICOS”, QUE ME AMPLIO EL PANORAMA COMPARTIENDO CONMIGO
SUS CONOCIMIENTOS Y EXPERIENCIA,
A MI FAMILIA POR SU APOYO INCONDICIONAL.
A TODOS ELLOS MI ETERNA GRATAITUD Y RECONOCIMIENTO.
3
INDICE.
Introducción………………………………………………………………………………………………………………… 4
Justificación………………………………………………………………………………………………………………... 5
Objetivos.
General……………………………………………………………………………………………………………. 5
Específico…………………………………………………………………………………………………………. 5
Problemas a resolver…………………………………………………………………………………………………... 6
Fundamento teórico.
Lector de placas de microtitulación………………………………………………………………….. 6
Curva de crecimiento bacteriano……………………………………………………………………… 7
Procedimiento.
Materiales……………………………………………………………………………………………………….. 9
Experimento con densidad óptica final.
Curva dosis-respuesta…………………………………………………………………………. 10
Experimento evolutivo………………………………………………………………………… 10
Algoritmo heurístico……………………………………………………………………………. 11
Modelo matemático……………………………………………………………………………. 11
Experimento con tasas de crecimiento.
Cultivo overnight………………………………………………………………………………... 13
Curva dosis-respuesta…………………………………………………………………………. 13
Experimento evolutivo……………………………………………………………………….. 14
Algoritmo heurístico……………………………………………………………………………. 14
Calibración del lector de placas…………………………………………………………... 15
Hacer el experimento………………………………………………………………………….. 18
Resultados.
Experimento con densidad óptica final………………………………………………………….. 19
Experimento con tasas de crecimiento…………………………………………………………… 25
Conclusiones y recomendaciones………………………………………………………………………………. 33
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Competencias desarrolladas y/o aplicadas………………………………………………………………… 33
Referencias……………………………………………………………………………………………………………….. 34
Anexos.
Anexo A…………………………………………………………………………………………………………. 35
Anexo B…………………………………………………………………………………………………………. 36
Anexo C………………………………………….……………………………………………………………... 37
Anexo D……………………………………………………………………………………………………….... 38
Anexo E………………………………………………………………………………………………………….. 39
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INTRODUCCIÓN.
En el siglo XX el descubrimiento de los antibióticos se convirtió en la solución a las
múltiples enfermedades producidas por agentes infecciosos. Las bacterias como todos los seres
vivos exhiben mecanismos biológicos, que las facultan para adecuarse a diversas presiones
ambientales [13].
Los antibióticos están dirigidos a inhibir el crecimiento bacteriano ya sea a nivel de la
replicación del DNA, la transcripción del RNA, síntesis de proteínas o pared celular. Esto es posible
mediante la inhibición específica en ciertas enzimas o estructuras bacterianas involucradas en
estos procesos. Las tetraciclinas, que son análogos de naftacenocarboxamida policíclica, actúan en
los ribosomas suspendiendo la síntesis de proteínas [12].
Debido al uso de los diferentes grupos de antibióticos se han seleccionado bacterias
resistentes a éstos pudiendo deberse a cuatro principales causas:
1) Modificación del antibiótico, ya sea en forma química (acetilación, fosforilación y
adenilación) o hidrolizándolo (β-lactamasas).
2) Modificación del sitio blanco mediante mutaciones espontáneas en los genes que
codifican para éstos (RNA polimerasa, mutaciones en el RNA ribosomal 23S).
3) Cambio en la permeabilidad de la bacteria debido a la modificación de las proteínas de
membrana externa “porinas” (OmpF y OmpC).
4) Expulsión del antibiótico mediante la sobreproducción de bombas de eflujo (Mex AB,
OprD) lo cual impide el acceso del antibiótico al sitio blanco de la bacteria.
Las investigaciones iniciales sobre resistencia a antibióticos no trataban el microrganismo
como tal, sino que, se encargaban de la prevención de enfermedades nosocomiales que iban en
aumento. Una de las razones por las que existe una falla terapéutica al emplear antibióticos para
tratar pacientes con infecciones bacterianas es el surgimiento de bacterias resistentes a estos
fármacos. Los factores que predisponen a la resistencia son numerosos, pero las investigaciones
anteriores han demostrado que algunas enfermedades causadas por bacterias gram-negativas
resistentes pueden ser una consecuencia del mal uso de antibióticos [11]. De aquí la importancia
del uso prudente de los antibióticos y la necesidad de generar nuevos tratamientos. Muchos
investigadores tal como Niederman [11] en 1997 fue uno de los primeros en hablar sobre nuevos
tratamientos, surgiendo la pregunta de si la rotación, combinación o alternancia de antibióticos
6
era la solución para el problema de resistencia. También hubo quien se opuso a dichos
tratamientos como Berk [15], que decía, que el uso de la terapia empírica de amplio espectro
extendido sólo serviría para aumentar el problema de la resistencia. Pero las investigaciones
continuaron y se ha demostrado que si bien, no se elimina completamente el problema de
resistencia si se reduce notablemente. El presente trabajo es un esfuerzo más por encontrar un
tratamiento que reduzca al mínimo o elimine la resistencia bacteriana.
JUSTIFICACIÓN.
La resistencia a antibióticos representa un problema muy grave de salud pública a nivel
mundial [1]. En las bacterias patógenas la tasa de adquisición de mutaciones que les confieren
resistencia a múltiples antibióticos es en órdenes de magnitud mayor que nuestra tasa de
descubrimiento de nuevos fármacos [2]. Por esta razón, uno de los problemas fundamentales a
los que se enfrentan las comunidades médicas y científicas es encontrar estrategias óptimas de
utilización de los fármacos que tenemos actualmente a nuestra disposición [3]. En particular,
resultados teóricos [4-5] y empíricos [6-7] recientes sugieren que tratamientos secuenciales (en
donde dos o más fármacos son alternados temporalmente) pueden ser efectivos para disminuir la
densidad de bacterias sin aumentar la frecuencia de resistencia. Cabe señalar que es posible
demostrar matemáticamente que, a pesar de que el tratamiento óptimo tiene que ser secuencial,
también lo es el peor tratamiento posible [8]. Por lo tanto, identificar las características que
tienen los tratamientos secuenciales óptimos es un problema muy relevante el cual, por la
naturaleza interdisciplinaria del problema, tiene que ser abordado desde una perspectiva
interdisciplinaria que incluya la modelación matemática y la experimentación in vitro.
OBJETIVOS.
General: El objetivo de este proyecto es utilizar principios matemáticos y computacionales
combinados con técnicas de microbiología experimental para abordar la siguiente pregunta
fundamental: ¿Cuál es el tratamiento secuencial óptimo que minimiza la densidad de una
población de bacterias?
Específicos:
1. Postulación del modelo matemático.
2. Análisis cualitativo del modelo matemático.
3. Adquisición de datos y análisis estadístico.
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4. Calibración de los parámetros del modelo matemático.
5. Validación experimental de las predicciones teóricas.
PROBLEMAS A RESOLVER.
Los problemas que se pretenden resolver con la presente investigación es:
La falta de tratamientos adecuados que prevengan o eliminen la resistencia de bacterias a
antibiotibióticos, reduciendo la población bacteriana.
La resistencia a antibióticos presentada por la mayoría de las bacterias, encontrando el
tratamiento secuencial adecuado podría disminuirse la resistencia bacteriana.
El incremento de la tasa de mutaciones adquiridas por bacterias que se hacen resistentes
a antibióticos.
FUNDAMENTO TEÓRICO.
El crecimiento de una población o cultivo bacteriano se puede expresar en función del
aumento de la masa del cultivo o aumento del número de células. Ambos tipos de expresiones son
equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento balanceado (en el que todos los
componentes aumentan una misma proporción por unidad de tiempo) [14].
Lector de placas de microtitulación.
El lector de placas (Fig. 1) nos permite realizar el seguimiento del crecimiento microbiano
midiendo la turbidez del cultivo en los pocillos de una microplaca. La lectura de la densidad óptica
del cultivo se realiza automáticamente en los tiempos indicados por el operador, durante todo el
tiempo de incubación sin necesidad de tomar muestras a los tiempos correspondientes. Este
aparato es de uso habitual. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia.
𝐷. 𝑂. = 𝐴 =− log 𝑇
100
Donde T= transmitancia.
8
La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y
la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta a longitudes de onda cortas. La
proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >107céls/ml.
Curva de crecimiento bacteriano.
Cuando se trabaja con crecimiento bacteriano, podemos encontrar que cada
microorganismo tiene una curva de crecimiento (Fig. 2), que lo diferencia. Sin embargo todas
cuentan con las mismas fases:
Fase lag o de adaptación. Durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a
las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo). En esta
fase no hay incremento en el número de células, pero hay gran actividad metabólica, aumento en
el tamaño individual de las células, en el contenido proteico, ADN y peso seco de las células.
Fase exponencial o logarítmica. En ella la velocidad de crecimiento es máxima (tasa de
crecimiento) y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a
velocidad máxima los nutrientes del medio. La evolución del número de células durante esta fase
se explica con los modelos matemáticos descritos más adelante.
Fig.1. Lector de placas de microtitulación.
9
Fase estacionaria. En ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros
parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al
de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos
secundarios. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente
esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase
exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano. La fase estacionaria
tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado
metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales.
Fase de muerte. Si la incubación continúa después de que una población microbiana
alcanza la fase estacionaria, las células pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero va a
comenzar una disminución progresiva en el número de células viables y cuando esto ocurre se dice
que la población ha entrado en fase de muerte [14].
Fig. 2. Curva de crecimiento bacteriano, donde se observan las fases por las que pasa el M.O: 1)
Latencia, 2) Exponencial, 3) Estacionaria y 4) Muerte.
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2
3
4
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PROCEDIMIENTO.
Materiales.
Se utilizó Escherichia coli MG1655 y medio mínimo M9 (0.2% de glucosa y 0.1% de
casaminoácidos). Las soluciones stock de doxiciclina (DOX) y eritromicina (ERY), se realizaron
desde las existencias en polvo (Sigma-Aldrich) a 5 mg/ml en agua para DOX y 100 mg/ml en etanol
para ERY y se almacenaron a -20º C. Todas las diluciones posteriores (soluciones de trabajo “WS”)
por sus siglas en inglés, se hicieron de las soluciones stock y se mantuvieron a 4º C.
Experimento con DO final.
a) Curva Dosis-Respuesta.
Para la realización de la curva dosis-respuesta se trabajó con dos antibióticos ERY y DOX,
con los cuales se elaboró un gradiente de concentraciones para cada fármaco (Fig. 14).
b) Experimento evolutivo.
En el experimento se utilizó un total de cinco tratamientos controles: dos monoterapias (E
y D), dos combinados, es decir, intercambiando los antibióticos día a día comenzando por ERY
(ED) e iniciando por DOX (DE) y sin ningún antibiótico (C). Mientras que para los tratamientos
Fig. 3. Tratamientos usados en el
experimento de evolución. Se
estudiaron dos antibióticos ERY (verde)
y DOX (azul), dos tratamientos
combinados, un control sin antibiótico
(amarillo) y cuatro tratamientos
secuenciales.
En tubos de ensayo se vertió medio mínimo M9 (la
cantidad calculada para cada concentración), en los
cuales posteriormente se adiciono la cantidad de
antibiótico según el gradiente a utilizar. Se inoculó cada
uno de los tubos con 10 µL de la bacteria, agitando para
que se distribuyera uniformemente. Finalmente se
colocaron los tubos inoculados en una incubadora con
agitación continua a 30ºC por 24 h. Al día siguiente se
midió la densidad óptica (DO), de cada una de las
muestras en un lector de placas de microtitulación.
Finalmente se hizo el análisis estadístico, con lo
que se obtuvo la curva dosis-respuesta (Fig. 15), y con
esto se definió la concentración de antibiótico a usar a lo
largo de todo el experimento evolutivo (Fig. 3). Todas las
diluciones se hicieron por triplicado.
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Sin importar con que antibiótico se trabajó, en un tubo se puso ERY y
en el otro DOX como se explica anteriormente y se realizó la transferencia
de la bacteria a todos los tubos, se dejó en la incubadora con agitación
continua a 30º C, al pasar las 24 h de incubación se leyó la DO para eliminar
los dos tubos con mayor crecimiento y se repitió el tratamiento para el día
siguiente.
secuenciales fueron cuatro, dos de ellos partieron de ERY y el primero se transfirió a DOX (SED),
el segundo a ERY (SEE), mientras que los restantes partieron de DOX e igualmente uno se
transfirió a DOX (SDD) y el siguiente a ERY (SDE) (Fig. 3).
Una vez definida la concentración a usar, por medio de la curva dosis-respuesta. Se
transfirió 20 µL de la bacteria a cada uno de los tubos preparados con medio M9 y el tratamiento
descrito de antibióticos.
Se agitaron los tubos esperando tener una mezcla homogénea, y se introdujeron en la
incubadora con agitación continua a 30º C. Pasadas 24 h se leyó la DO en un lector de placas de
microtitulación y se realizó el análisis de los datos.
c) Algoritmo heurístico.
El algoritmo heurístico consiste en elegir día con día cual es el mejor antibiótico en base a
las densidades ópticas obtenidas, es decir, se desecha el que se muestra con una DO mayor que el
resto de las muestras. Este algoritmo solo se aplicó a los llamados tratamientos secuenciales.
Modelo matemático.
Una población bacteriana que se encuentra en un medio adecuado, con condiciones
nutricionales y ambientales constantes, tiende a crecer exponencialmente, lo cual indica que se
encuentra en equilibrio. Existen dos formas de calcular µ en una curva de crecimiento bacteriano:
a) Transformando la ecuación exponencial en una recta.
La tasa de crecimiento es el cambio en el número de células por minuto, que calculamos como el
cambio en DO por minuto. Pero el cambio instantáneo es una función del número de células que
están presentes en cualquier momento dado:
𝑑𝑁
𝑑𝑡= 𝜇𝑁 (1)
Fig. 4. Algoritmo heurístico.
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Donde N es el número de células en el tiempo t y µ es la tasa de crecimiento. Las unidades de
tiempo son recíprocas, así que si t esta dado en minutos, la tasa de crecimiento es min-1.
𝑑𝑁
𝑑𝑁= 𝜇𝑡 (2)
Integrando la ecuación, de un tiempo 0 a t, donde µ es la pendiente de ln 𝑁 , en función de t.
Entonces la relación es:
ln𝑁𝑡
𝑁0= 𝜇(𝑡 − 𝑡0) (3)
Sin embargo, µ = la pendiente de ln 𝐷𝑂, en función de t. Puesto que DO aumenta en función de
ln(𝐷𝑂), no de DO [9].
µ = ln
𝑁𝑡𝑁0
(𝑡− 𝑡0) (4)
b) Utilizando la Ec. de Monod.
En 1942, Monod propuso la siguiente ecuación para representar la variación de la velocidad
específica de crecimiento con la concentración de sustrato:
µ = µ𝑚𝑎𝑥𝑆
𝐾𝑆 + 𝑆 (5)
Donde µ es tasa de crecimiento específica; µ𝑚𝑎𝑥 es tasa máxima de crecimiento específica; S es la
concentración de substrato; 𝐾𝑆 es la constante de saturación. La relación del substrato con la
velocidad de crecimiento específica es de forma tal, que si la cantidad de substrato es muy grande,
la tasa específica se aproxima al valor máximo y si la concentración del substrato tiende a cero, se
aproxima a cero.
Experimento con tasas de crecimiento.
Con los datos arrojados por el experimento piloto, se decidió comenzar nuevamente, pero
en esta ocasión no medir solo la DO final de la población bacteriana, sino que, tomar varias
mediciones a lo largo del experimento ya que esto genera una curva de crecimiento donde los
puntos generados en la fase exponencial se utilizan para estimar la tasa de crecimiento. El
propósito de una medición de la tasa de crecimiento es determinar la tasa de cambio en el
13
número de células en un cultivo por unidad de tiempo [9]. Ya que se especula que, la tasa de
crecimiento es directamente proporcional al tiempo que tardaría una población bacteriana en
adquirir la resistencia.
En esta ocasión se inoculó en los pozos de placas de microtitulación, se posiciono la placa
en el lector y mediante la entrada de unos sencillos comandos, como más adelante se explica, se
pone a trabajar el equipo. Para finalmente obtener la tasa de crecimiento con el programa
GrowthRates [9] o el programa Fitlogistic diseñado en el laboratorio de Biología Sintética y de
Sistemas (Anexo 2).
a) Cultivo overnight.
Se inoculó una colonia de la cepa MG1655 de E. coli en 15 ml de medio mínimo M9, se incubó
a agitación constante durante 24 h a 30 °C. El medio mínimo M9 contiene solo los recursos
necesarios para el crecimiento de esta cepa en específico. Es importante mantener la fuente de
carbono ≤ 0.2%, ya que este tipo de cultivos crecen hasta la saturación. También es necesario
evitar cambios bruscos en la fuente de carbono utilizada, ya que esto ocasiona una fase de
latencia más larga [9].
b) Curva Dosis-Respuesta.
Para la elaboración de esta curva se trabajó con el gradiente de concentraciones (Fig. 14),
usado en el experimento anterior, tales diluciones se prepararon en tubos de ensayo pero en esta
ocasión no se inocularon. Se utilizaron dos placas de microtitulación, en una placa para se
pusieron 150 µL de cada una de las diluciones para cada antibiótico, un control y un blanco, cada
uno de estos se hizo con cuatro replicas (Fig. 5). En otra placa de microtitulación se colocaron 150
µL de cultivo overnight en los pozos correspondientes a las diluciones de la primer placa y el
control. Con un replicador se inoculó la placa de microtitulación que contenía las diluciones.
Fig. 5. Posiciones de las diluciones en la placa de microtitulación con sus réplicas.
14
Se tuvo especial cuidado en no rayar la placa de microtitulación al hacer la transferencia,
puesto que eso provocaría errores en la lectura. Finalmente se cubrió la placa con una membrana
plástica, la cual fue perforada en el centro de cada pozo con una aguja hipodérmica en conector
Luer. Se introdujo en el lector de placas y con los resultados obtenidos por medio del programa
Fitlogistic en Rstudio (Anexo A), se realizó el cálculo de la tasa de crecimiento.
c) Experimento evolutivo.
Se trabajó bajo las mismas condiciones que el experimento evolutivo anterior, con la única
diferencia en la inoculación. Se usaron dos placas de microtitulación, la primera se preparó con el
antibiótico que correspondía al día dos y la concentración elegida de la curva dosis-respuesta,
posteriormente se preparó la segunda placa donde se acomodaron los inóculos de tal forma que
se inoculo la placa según el tratamiento correspondiente (Fig. 6) y por medio del replicador se
realiza la transferencia de una placa a otra (Fig. 7). Se introdujo la placa al lector, se regresó 24 hrs
después y el archivo .txt obtenido fue formateado (Anexo B) para calcular la tasa de crecimiento
por medio del programa GrowthRates [9].
d) Algoritmo heurístico.
El algoritmo heurístico se trabajó de la misma forma que con el primer experimento, solo que,
en este caso se calculó la tasa de crecimiento como ya se ha dicho y en base a esta se tomó la
decisión de que tratamiento se eliminaba y cual se transfería. Finalmente el archivo arrojado por
GrowthRates con la extensión .summary se corrió en el programa de análisis estadísticos (Anexo
C), el cual dio como resultado una tabla con los valores de cada uno de los tratamientos y la
indicación de cuál es el tratamiento a transferir.
Fig. 6. Posiciones de los tratamientos en la placa de microtitulación con sus réplicas.
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e) Calibración del lector de placas.
Se utilizó un lector estándar BioTek y el software Gen5 el cual podemos
encontrar en la pantalla de inicio (Fig. 8). Una vez seleccionado, se abrió una
ventana la cual te permite crear un nuevo protocolo de trabajo o trabajar con
uno existente. En este caso se creó un protocolo nuevo (Create New), con lo cual
se abrió una ventana nueva con la opción de procedimiento (Procedure) (Fig.9).
La siguiente ventana es muy
importante (Fig.10), sólo se hace una vez,
para calibrar el sistema. En esta ventana
se encuentran las opciones que definen
todo el experimento, por ejemplo, a que
temperatura se trabajara, si existirá
agitación continua, la longitud de onda a
la que se medirá o cual será el tiempo de
ejecución del experimento, etc.
Fig. 8. Icono del software Gen5.
Fig. 9. Ventanas arrojadas por el software Gen5, se
observa en círculos rojos las opciones elegidas.
Fig. 7. Diagrama de proceso. El inciso A indica que se trabaja con el gradiente de concentraciones para obtener la
curva dosis-respuesta. Mientras que el B, indica el comienzo del experimento evolutivo, tomando del gradiente
solo las dos concentraciones elegidas. Sin embargo, el proceso se realiza del mismo modo para ambos.
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Existen cuatro parámetros críticos que son necesarios establecer, puesto que son estos los
que afectan directamente el desarrollo de la población bacteriana:
1. Temperatura. La temperatura a la que se midió la tasa de crecimiento es de 30°C, la misma
temperatura de incubación del inoculo. En la ventana de procedimiento encontramos la
opción para establecer la temperatura (Set Temperature), y la seleccionamos (Fig. 11 a).
2. Agitación. La agitación sirve para dos propósitos: 1) para asegurar que las células se
suspenden de manera uniforme antes de la lectura de DO y 2) para mantener el cultivo
aireado y así proporcionar oxígeno adecuado para el crecimiento [9]. Con la opción de
agitación (Shake) de la ventana de procedimiento se eligió una intensidad de agitación
media con una duración de cuarenta segundos antes de la lectura (Fig.11 c).
3. Intervalos de lectura. Se establecieron intervalos de veinte minutos, ya que es el tiempo
que tarda una bacteria en duplicar su masa y material genético en condiciones adecuadas.
4. Tiempo de ejecución. Se ejecutó el experimento por 24 hrs, permitiendo así que el cultivo
alcanzara la fase estacionaria en la curva de crecimiento. En la ventana de procedimiento,
en la opción iniciar cinética (Start Kinetic) arroja otra ventana, la cual contiene las
opciones tiempo de ejecución (Run Time), intervalos de lectura (Interval) e indica de forma
automática el total de lecturas a realizar. (Fig. 11 b).
Fig. 10. Ventana de procedimiento (Procedure).
17
Otro parámetro controlado fue la longitud de onda para la lectura, típicamente, la DO se
determina a una longitud de onda de 600 nm. Para establecer la longitud de onda, en la ventana
de procedimiento seleccionamos (Read), que nos abrió otra ventana donde se eligió la longitud de
onda de 630 nm, y el tipo de lectura en absorbancia. (Fig. 11 d).
Al introducir todos los parámetros, se revisó para asegurar que se encontraran todos y
estuvieran en el orden correcto (Fig. 12). Se cerró la ventana, se cliqueo “validate” para validar el
protocolo.
Fig. 11. Ventana de procedimiento (Procedure), donde se realizó el protocolo del experimento. a) Selección de la temperatura de incubación por medio del menú “Set Temperature”. b) Elección del tiempo de ejecución e intervalos de lectura. c) Establecimiento de la intensidad y duración de la agitación para el experimento. d) Menú “Read”, para la determinación de la longitud de onda.
a) b)
c) d)
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f) Hacer el experimento.
Cuando se valida el protocolo, el software abre una ventana en donde se observa una matriz
en blanco, ahí se grafican los puntos conforme se van haciendo las lecturas (Fig. 13).
Se regresó veinticuatro horas después, la siguiente tarea fue exportar los datos en un
archivo “txt” (el software debe permitir la exportación de los resultados, ya sea como un texto o
como un archivo de Microsoft Excel [9]) y se realiza el análisis de los datos obtenidos como ya se
ha explicado.
Fig. 12. Protocolo terminado, con cada uno de los parámetros establecidos para el experimento.
Fig. 13. Matriz en blanco, se corre el experimento con “Play”, que se observa en la parte superior de la pantalla.
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RESULTADOS.
La curva dosis-respuesta partió de concentraciones establecidas por medio de
experimentos realizados con anterioridad. Con los resultados obtenidos se ajustó la curva hasta
obtener los valores que a continuación se presentan:
Experimento con DO final.
Para cada antibiótico usado se generó una tabla como las siguientes, donde se observa el
promedio de la densidad óptica de las tres réplicas de todas las diluciones, así como del control y
para cada una de estas el porcentaje de inhibición.
Para eritromicina (ERY) se usó la concentración de 8 µg/mL, con una densidad óptica final
de 0.12667 y un porcentaje de inhibición de 81.10%. Mientras que para doxiciclina (DOX) se utilizó
Fig. 14. Concentraciones de cada una de las diluciones empleadas.
20
una concentración de 0.4 µg/mL, con una densidad óptica final de 0.10167 y un porcentaje de
inhibición de 84.83%. La decisión se basó en el porcentaje de inhibición presentado, puesto que se
buscaba encontrar un equilibrio entre ambos antibióticos. Con los valores anteriores se graficó la
curva dosis-respuesta para cada antibiótico (Fig. 15).
Fig. 15. Curva dosis–respuesta. Se graficaron las concentraciones utilizadas de antibiótico
contra la DO final de cada una de las diluciones partiendo por el control.
21
El experimento se siguió durante trece días, al séptimo día se eliminaron los tratamiento
SDD y SDE, al ser los de mayor DO y en los tratamientos SED y SEE se observó una tendencia a
alternar los antibióticos “dos días DOX y dos días ERY” (Fig. 16).
Con estos datos se determinó que de los dos tratamientos secuenciales que llegaron al día
trece, SEE1B es el mejor, puesto que cuenta con una DO menor. Sin embargo, estos tratamientos
son muy semejantes entre si ya que todos comparten el mismo historial hasta el día siete que fue
donde ocurrió la primer diferenciación.
Al graficar la sumatoria de la DO, se comparó SEE1B con las monoterapias y con los
tratamientos combinados, se observó que no existe una diferencia realmente significativa, ya que
a excepción de “D” la DO del resto de los tratamientos se encuentra en un rango de 5.5 y 6.5,
todos muy cercanos entre sí (Fig. 17).
Fig. 16. Árbol de tratamientos. Se observan cada una de las ramificaciones generadas y que
antibiótico fue usado o rechazado a lo largo de los trece días.
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Por lo anterior se especula que la DO final del cultivo no es importante porque
generalmente se encuentra en la fase estacionaria. Mientras tanto, se cree que la tasa de
crecimiento es significativa, ya que se observa el desarrollo de la población. Razón por la que se
obtuvo la tasa de crecimiento para cada tratamiento (Fig. 18 y Fig. 19).
Fig.17. Sumatoria de las DO por día, donde el grosor del escalón indica que tan
elevada fue la DO y el color, el antibiótico usado, DOX (azul) y ERY (verde).
Fig.18. Promedio de las tasas de crecimiento para cada tratamiento.
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Análisis Estadístico.
Hi: Existe diferencia estadística significativa en las tasas de adaptación de las poblaciones
bacterianas.
Ho: No existe diferencia estadística significativa en las tasas de adaptación de las
poblaciones bacterianas.
Tabla 1. T-Student.
En la Tabla 1, podemos ver el resultado del análisis T- Student donde se compara el
tratamiento SEE1B con las dos monoterapias (E y D) y los dos tratamientos combinados (DE y ED).
Se acepta la Hi, para “D”, “DE” y “ED”, puesto que el valor de p < 0.05 mientras que para “E” se
rechaza la Hi y se acepta la Ho, ya que el valor de p > 0.05.
Tabla 2. Análisis de varianza. De igual forma “E” no es estadísticamente significativa.
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Fig. 19. Curva de crecimiento formada con la DO final de cada día, a partir de los datos obtenidos. El
tratamiento SEE1B tiene una DO inferior de 0.4 para todas sus réplicas pasado el día cinco, mientras que el
resto de los tratamientos manifiestan una DO semejante, sin embargo la presentan con mayor rapidez.
Experimento con tasas de crecimiento.
En este caso se trabajaron las mismas concentraciones de antibiótico (Fig. 14) para la
curva dosis-respuesta, pero se calculó la tasa de crecimiento.
Para cada antibiótico usado se generó una tabla como las siguientes, donde se observa el
promedio de la tasa de crecimiento de las réplicas de todas las diluciones, así como del control y
para cada una de estas el porcentaje de inhibición.
Para eritromicina (ERY) se usó la concentración de 9 µg/mL, con una tasa de crecimiento
final de 0.22636 y un porcentaje de inhibición de 69.6924 %. Mientras que para doxiciclina (DOX)
se utilizó una concentración de 0.4 µg/mL, con una tasa de crecimiento final de 0.22595 y un
porcentaje de inhibición de 69.7467 %. La decisión se basó en el porcentaje de inhibición
presentado, puesto que se buscaba encontrar un equilibrio entre ambos antibióticos. Con los
valores anteriores se graficó la curva dosis-respuesta para cada antibiótico (Fig. 20).
De igual forma se realizó la curva dosis respuesta pero tomando las DO finales del mismo
experimento, en las siguientes tablas se observa que aun usando las mismas concentraciones, la
DO final cambia y su porcentaje de inhibición es muy diferente, e incluso la curva se observa
completamente desaliñada (Fig.21).
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Fig. 20. Curva dosis-respuesta midiendo las tasas de crecimiento.
27
El experimento se siguió durante trece días, en los cuales se eliminó el tratamiento con la
mayor tasa de crecimiento de cada rama, es decir, el tratamiento secuencial con la mayor tasa de
crecimiento para el que comienza por ERY y el de mayor tasa de crecimiento para el que empieza
por DOX (Fig. 22).
Fig. 21. Curva dosis-respuesta midiendo la DO final.
28
Con estos datos se determinó que de los dos tratamientos secuenciales que llegaron al día
trece, midiendo las tasas de crecimiento, SDE es el mejor, puesto que cuenta con una tasa de
crecimiento menor. Sin embargo, la diferencia entre ellos es mínima puesto que SDE cuenta con
una tasa de crecimiento de 0.68395 y la tasa de crecimiento para SEE es de 0.69733.
Se graficó la sumatoria tanto de las tasas de crecimiento calculadas como la DO final para
cada tratamiento y se comparó SDE y SEE con las monoterapias y con los tratamientos combinados
(Fig. 23 y 24).
Fig. 22. Árbol de tratamientos. Se observan cada una de las ramificaciones generadas y que
antibiótico fue usado o rechazado a lo largo de los trece días.
29
Fig.24. Sumatoria de la DO final por día, donde el grosor del escalón indica que tan elevada fue la
DO y el color, el antibiótico usado, DOX (azul) y ERY (verde).
Fig.23. Sumatoria de las tasas de crecimiento por día, donde el grosor del escalón indica
que tan elevada fue la DO y el color, el antibiótico usado, DOX (azul) y ERY (verde).
K
30
Calculando las tasas de crecimiento se observa que SDE es mejor tratamiento que SED, sin
embargo, calculando la tasa de adaptación a partir de las DO finales de cada tratamiento se
especula que SEE, es mejor puesto que tiene una tasa de adaptación menor, solo superado por E y
ED (Fig. 26).
Fig.25. Promedio de las tasas de crecimiento para cada tratamiento, a partir de las tasas de crecimiento.
Fig.26. Promedio de las tasas de crecimiento para cada tratamiento, calculadas a
partir de la DO final.
Hi: Existe diferencia estadística significativa en las tasas de
adaptación de las poblaciones bacterianas. Lo que indica
Ho: No existe diferencia estadística significativa en las tasas de
31
Fig.27. Curva de crecimiento formada con las tasas de crecimiento de cada día, a partir de los datos
obtenidos. El tratamiento E tiene una K inferior de 0.4 para todas sus réplicas pasado el día cinco,
mientras que el resto de los tratamientos manifiestan una K semejante entre sí, es decir, no mayor a
0.13 sin embargo la presentan con mayor rapidez.
K K
K
K K
K
32
Fig.28. Curva de crecimiento formada con las densidades ópticas finales de cada día, a partir de
los datos obtenidos. El tratamiento SED tiene una DO inferior que el resto de los tratamientos,
solo seguida por el tratamiento ED que tiene DO ligeramente mayores y el tiempo de
adaptación es mayor comparado con SED.
33
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.
El diseño de tratamientos óptimos que nos permitan reducir la población bacteriana al
mínimo es un trabajo de suma importancia pero que por el poco tiempo que se destinó para la
elaboración de este proyecto no se ha logrado definir del todo. Sin embargo, se observan
resultados muy interesantes ya que se creía que la DO final no era importante para definir si un
tratamiento es aparentemente el mejor pero con esta se observan resultados más estables que
con la tasa de crecimiento.
Seguir este tipo de experimentos es recomendable probando a nivel experimental
diferentes algoritmos matemáticos que ayuden a disminuir la densidad bacteriana.
COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS.
Habilidad para buscar, procesar y analizar información de distintas fuentes, así como
adquirir conocimientos de programas como iPython y Rstudio.
Habilidades estadísticas e informáticas para el tratamiento de datos.
Habilidad para el manejo de material y equipo de laboratorio.
Habilidades analíticas, críticas y de síntesis en el campo de la investigación.
Capacidad para trabajar en equipo interdisciplinario.
Capacidad para el aprendizaje autónomo.
34
REFERENCIAS.
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antimicrobial drug development: implications for the future. Clin Infect Dis, 38(9), 1279–86.
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antibiotic resistance, in theory. Math Biosci Eng, 7(3), 527–552.
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35
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pneumonia. Chest. 108:891-892
ANEXOS.
ANEXO A. Fitlogistic. Script elaborado por el Dr. Rafael Peña Miller en la interfaz “RStudio”, con el
cual se calcula la tasa de crecimiento.
36
ANEXO B.
Formato_GR. Script elaborado en la interfaz “Python notebook”, por medio del cual se da el
formato deseado para ser introducido en el programa Growth Rates.
37
ANEXO C.
Estadístico. Script elaborado en la interfaz “Python notebook”, por medio del cual se da el
formato deseado para ser introducido en el programa Growth Rates.
38
ANEXO D.
Medio mínimo M9.
1. Se preparan las sales por separado y se esterilizan por autoclave.
2. Se añade el agua desionizada y previamente esterilizada por autoclave necesaria para
hacer la cantidad de medio requerido.
3. Se añade 20 mL/L de cada componente (Parte A y Parte B).
4. Se hace una solución de 2 gr/L Glucosa y 1 gr/L de casaminoácidos.
5. Se esteriliza pasando la solución por un filtro de 0.22 µm antes de introducirse al medio.
Sales.
Solución de trabajo “WS”.
De la solución stock de DOX (5 mg/mL), se toman 200 µL y se agregan a 19800 µL de medio
mínimo M9.
De la solución stock de ERY (50 mg/mL), se toman 200 µL y se agregan a 19800 µL de medio
mínimo M9.
Parte A (50x) -
350 g/L K2HPO4
100 g/L KH2PO4
Parte B (50x) -
29.4 g/L Trisodium citrate Na3C6H5O7
50 g/L (NH4)2 SO4
5 g/L MgSO4 ó 10.25 g/L MgSO4 7H2O
ANEXO E.
Cronograma de actividades.