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DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL

Dirección del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria

Área de Desarrollo y Validación de Protocolos

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PROTOCOLO PARA LA DETECCIÓN DEL

UMBRAVIRUS ASOCIADO A PAPAYA MELEIRA

Autorizó:

Dr. José Abel López Buenfil

Director del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria

Revisó:

M.C. José Gustavo Torres Martínez

Jefe de Departamento de Roedores, Aves y Malezas

M.C. José Manuel Cambrón Crisantos

Coordinador del Área de Desarrollo y Validación de Protocolos

Elaboró:

M.C. José Luis Cruz Jaramillo

Diseño y edición:

Ing. José Alejandro Cotoc Roldán

Versión: 0.1

Abril, 2017




i

TABLA DE CONTENIDO

TABLA DE CONTENIDO........................................................................................................................................ I

ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................................. II

ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................................................III

INTRODUCCIÓN .........................................................................................................................................1

SINTOMATOLOGÍA ............................................................................................................................................. 1

CARACTERÍSTICAS GENERALES de PMev-2............................................................................................. 3

VECTORES .............................................................................................................................................................. 4

PROTOCOLO DE DIAGNÓSTICO ............................................................................................................5

Flujo de trabajo .................................................................................................................................................... 5

Toma y envío de la muestra ............................................................................................................................ 6

Recepción, almacenamiento y preparación de las muestras .............................................................. 8

Extracción de RNA TOTAL ............................................................................................................................. 10

Cuantificación y Verificación de la calidad del RNA ............................................................................. 11

Método de diagnóstico molecular ............................................................................................................... 11

Confirmación de resultados .......................................................................................................................... 21

Destrucción de la muestra ............................................................................................................................. 21

Recomendaciones de trabajo ........................................................................................................................ 22

LITERATURA CITADA ........................................................................................................................... 23

ANEXOS ...................................................................................................................................................... 25




ii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Sintomatología de Papaya Meleira. A) Exudado en frutos de papaya en un árbol de

papaya infectado, B) Manchas necróticas en borde de hojas jóvenes, C) Manchas cafés en

frutos de papaya. D) Presencia de látex en cavidad de semilla. ............................................................ 2

Figura 2. Relaciones filogénicas entre PMeV-1 y PMeV-2 entre las familias Totiviridae y

Tombusviridae (Sá-Antunes et al., 2016). ..................................................................................................... 3

Figura 3. Asociación de los géneros Umbravirus - Luteovirus. A) Inoculación de N. bentamiana

con suero (Control Neg.) B) Inoculación de componente genómico del Umbravirus. C)

Inoculación de los componentes genómicos de Umbravirus y Luteovirus. Visualización de

síntomas 14 días post-inoculación. (Adaptado de Demler et al., 1996) ............................................. 4

Figura 4. Mosquita blanca adulta de Bemisia tabaci .................................................................................. 5

Figura 5. Flujo de diagnóstico de la enfermedad por técnicas moleculares. .................................... 5

Figura 6. Resultado de la validación de cDNA por control endógeno. Carril 1: MPM 1Kb plus

(Thermo Scientific), 2: Control NTC, 3: Control Positivo, 4–7: Muestras de producto

amplificable de 18S. Las muestras M1 – M3 cumplen con el criterio de fragmento amplificable

de 18S, por lo que el cDNA es válido para preparar la reacción de PCR de diagnóstico. Sin

embargo, la Muestra M4 requiere ser corroborada nuevamente. ...................................................... 14

Figura 7. Resultado de Electroforesis (Gel Recortado a la región). Carril 1: MPM 100 pb 2 (/):

Carril Vacío, 3: Control NTC (-), 4-6: Amplificaciones de 370 pb de muestras positivas a PMeV.

La aparición de fragmentos de menor tamaño se debe a cuestiones de dímeros o hibridaciones

incompletas en el procedimiento. ................................................................................................................... 16

Figura 8. Resultados de RT-PCR cuantitativa a partir de CDNA. A) Curva de amplificación y B)

Curva de Fusión. Los productos positivos a PMeV cumplen con las dos condiciones: Cq < 36 y

MT = 87 °C. Los dímeros generalmente tienen un MT = 80°C. El fluoróforo SYBR Green I a una

dilución 1:15000 en la reacción de qPCR puede llegar hasta los 3000 RFU. ................................. 19




iii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Oligonucleótidos iniciadores para diagnóstico ........................................................................... 11

Tabla 2. Preincubación de RNA .................................................................................................................. 12

Tabla 3. Mezcla de Reacción de RT (Consultar No. Cat. en el Anexo A) ................................................... 12

Tabla 4. Programa de Reacción de RT ........................................................................................................ 12

Tabla 5. Mezcla de Reacción de PCR (18S) ................................................................................................ 13

Tabla 6. Programa de Reacción de PCR (18S) ........................................................................................... 13

Tabla 7. Mezcla de Reacción de PCR (PMeV) ............................................................................................. 15

Tabla 8. Programa de Reacción de PCR (PMeV) ........................................................................................ 15

Tabla 9. Mezcla de Reacción de One Step RT-PCR (PMeV) ....................................................................... 17

Tabla 10. Programa de Reacción de One Step RT-PCR (PMeV) ............................................................... 17

Tabla 11. Mezcla de Reacción de qPCR – SYBR Green I 1:15000 ............................................................. 18

Tabla 12. Programa de qPCR (PMeV) ......................................................................................................... 18

Tabla 13. Mezcla de Reacción de qPCR (PMeV) – SYBR Green I 1:15000 ............................................... 20

Tabla 14. Programa de Reacción de RT-qPCR OneStep (PMeV) .............................................................. 20




1

INTRODUCCIÓN

El cultivo de papaya (Carica papaya) es una actividad productiva de Centro y Sudamérica.

México, es uno de los principales productores y exportadores de papaya, ocupando el sexto

lugar a nivel mundial y tercer lugar en producción del continente americano, y es el primer

exportador de Estados Unidos (Madrigal et al. 2013). Adicionalmente, la papaya es un

producto de consumo doméstico, siendo los cultivares del país: Maradol roja, Criolla,

Amarilla y Hawaiana (Tipo Solo). Los principales estados productores son Veracruz, Chiapas,

Oaxaca, Michoacán, Tabasco y Yucatán con un 71% de la producción neta durante el año 2008

(SIAP, 2010).

Una de las enfermedades que afectan la producción del cultivo es la Enfermedad de Látex de

Papaya, también conocida como Enfermedad Pegajosa del Papayo, Meleira del Papayo, o

simplemente como Meleira. La presencia de esta enfermedad se ha reportado en Brasil y en

México e infecta indistintamente a cualquier variedad cultivada de C. papaya. Esta

enfermedad afecta tanto la forma como la consistencia del fruto (López-Ochoa, Comunicación

Personal), provocando pérdidas económicas para los productores afectados (SINAVEF,

2009).

El agente causal de la enfermedad es un complejo de dos virus propuestos como Papaya

meleira virus 1 y Papaya meleira virus 2, que tiene la capacidad de propagarse sistémicamente

al árbol entero (Sá-Antunes, et al., 2016). Desde su reconocimiento como un posible

complejo, la presencia de PMeV-1 es asintomática y la observación de Meleira es con la

presencia de PMeV-2. Con base en lo anterior, el presente documento tiene como objetivo

establecer el método de detección molecular, por técnicas basadas en las técnicas de PCR y

qPCR, para la identificación de la variante Umbravirus PMeV-2.

SINTOMATOLOGÍA

Meleira se caracteriza principalmente por una exudación anormal de látex en el fruto. El

exudado, de aspecto acuoso y de baja viscosidad, es oxidado por el ambiente y provoca la

aparición de manchas obscuras en los frutos y en los bordes de las hojas, además de generar

una sensación pegajosa en el fruto. La base química del látex corresponde a una emulsión

compleja de biomoléculas que coagulan en exposición al aire. A nivel celular, la coagulación

promueve la acumulación de especies reactivas de oxígeno y provoca la modificación de los

niveles basales de potasio (K+), ocasionando lisis celular (Abreu et al., 2015a).




2

En estados avanzados de la enfermedad, los frutos presentan áreas irregulares de color verde

claro en la superficie, síntoma similar al presentado por las deficiencias en Calcio y Boro.

Otros síntomas menos comunes incluyen pequeñas pústulas internas en la pulpa de la fruta

y presencia de látex en la cavidad de las semillas. (Abreu et al., 2015a).

Figura 1. Sintomatología de Papaya Meleira. A) Exudado en frutos de papaya en un árbol de papaya infectado, B) Manchas necróticas en borde de hojas jóvenes, C) Manchas cafés en frutos de papaya. D) Presencia de látex en cavidad de semilla.

El fenotipo de síntomas ocasionados por PMeV en la planta de papaya se debe a la

transgresión de los productos de replicación viral sobre el mecanismo de división celular de

tejidos. Algunos de estos son:

Malformación de flores.

Ligero amarillamiento previo a la necrosis de hojas y ramales jóvenes.

Necrosis del borde de hojas en desarrollo.

Aparición de pústulas con coloración café sobre frutos inmaduros y/o deformación

del fruto.




3

Exudación desproporcionada de látex, principalmente sobre lesiones físicas en el

cuerpo del tallo o sobre pústulas generadas en áreas poco resistentes, como yemas

vegetativas o ramas.

Tallo pegajoso al tacto y brilloso a luz del día, debido a la oxidación del látex.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE PMeV-2

Tanto PMeV-1 y PMeV-2 no han sido clasificados formalmente por el Comité Internacional de

Taxonomía de Virus (ICTV). A través de estudios realizados, PMeV-1 es un virus de partícula

isométrica (Kitajima et al., 1993) y RNA de doble cadena (dsRNA), tiene un genoma viral de

un tamaño aproximado de 8 a 12 Kb y una cercanía filogenética a la familia Totiviridiae

(Abreu et al., 2015b) mientras que PMeV-2 corresponde a un virus de cadena sencilla de

sentido positivo (ssRNA+), con agrupación filogenética al género Umbravirus, con un genoma

viral estimado en 4.5 kb que comprende los marcos abiertos de lectura implicados en la

replicación viral y movimiento sistémico a través del hospedero, característicos de la propia

familia de Tombusviridae, a la que pertenecen (Maciel-Zambolim et al., 2003; Sá-Antunes et

al., 2016).

Figura 2. Relaciones filogénicas entre PMeV-1 y PMeV-2 entre las familias Totiviridae y Tombusviridae (Sá-Antunes et al., 2016).

PMeV-2 está propuesto como un patógeno viral parecido a Umbravirus (Umbra-like virus),

con aparición gradual de los síntomas conforme progresa la enfermedad. La clasificación

filogenética molecular lo asocia con secuencias asociadas al género de Umbravirus,

comprendido por virus patogénicos de plantas, al que también pertenecen Tobaco mottle

virus (TMoV), Cucumber mottle virus (CMoV), entre otros.




4

La particularidad del género Umbravirus, dentro de su clado filogenético, es la ausencia de

marcos abiertos de lectura (ORFs por sus siglas en inglés) que codifiquen a proteínas de

cápside, requiriendo de un virus auxiliar, en este caso PMeV-1 u otras cuasi especies de

Luteovirus, un género de virus satélites, para utilizar su cápside y encapsular el genoma viral.

Actualmente, se conoce la acción sinérgica de ambos géneros de virus en la consecuente

progresión de la enfermedad en la planta a través de la encapsidación del genoma de PMeV-

2 dentro de las proteínas estructurales de PMeV-1 (Sá-Antunes et al., 2016). Lo anterior,

había sido demostrado en los estudios realizados señalan que el virus auxiliar asociado es

necesario para la diseminación del Umbravirus mientras que éste último es el responsable de

la aparición de síntomas (Demler et al., 1996; Abreu et al., 2015b; Sá-Antunes et al., 2016).

Figura 3. Asociación de los géneros Umbravirus - Luteovirus. A) Inoculación de N. bentamiana con suero (Control Neg.) B) Inoculación de componente genómico del Umbravirus. C) Inoculación de los componentes genómicos de Umbravirus y Luteovirus. Visualización de síntomas 14 días post-inoculación. (Adaptado de Demler et al., 1996)

VECTORES

Hasta el momento se desconoce la existencia de algún vector natural confirmado, pero

estudios realizados por Picaço, et al. (2003) y Andrade, et al. (2003) encontraron que tanto

Bemisia tabaci tipo B como Trialeurodes variabilis podrían estar implicados en la transmisión

de dicho virus, en condiciones de invernadero. Actualmente, los grupos de investigadores de

México y Brasil llevan a cabo estudios para identificar el vector del virus y dilucidar el

mecanismo de transmisión (Abreu, et al., 2015a).




5

Figura 4. Mosquita blanca adulta de Bemisia tabaci

PROTOCOLO DE DIAGNÓSTICO

FLUJO DE TRABAJO

Figura 5. Flujo de diagnóstico de la enfermedad por técnicas moleculares.




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El protocolo de diagnóstico consiste en la identificación de síntomas asociados a Meleira, la

extracción y purificación de RNA Total a partir de tejidos sintomáticos y asintomáticos, con

baja titulación del virus, y la aplicación de métodos de diagnóstico molecular basado en

técnicas de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) contra la secuencia de PMeV-2,

electroforesis y secuenciación Sanger (Cruz-Jaramillo et al., (en escritura)). Los resultados se

emiten a través de un dictamen de resultados.

TOMA Y ENVÍO DE LA MUESTRA

El técnico en campo tomará muestras de frutos o tejido de hojas que presenten síntomas

asociados a Meleira. El tejido que se toma, debe ser representativo de toda la muestra.

Dependiendo del tipo de muestra, se recomienda tomar:

A) MUESTREO EN CAMPO DE HOJAS

Más de 10 hojas localizadas en ramas con floración, en razón de que el periodo de mayor

replicación viral es en temporadas de floración. Guarde cada muestra vegetal en bolsas

herméticas de polietileno debidamente cerradas, cuidando sacar el aire de la bolsa y

marcándolas con los datos de identificación correspondientes. Retire la humedad excesiva,

con papel absorbente, de las bolsas si esta se presenta antes del envío. Evite enviar hojas

senescentes o con pudrición por saprofitos.

B) MUESTREO EN CAMPO DE FRUTOS

Identifique frutos, preferentemente en fase de maduración, de aproximadamente 15 cm de

longitud en adelante. Recupere del mismo ramal algunas muestras de hojas. Envuelva los

frutos con papel periódico u hojas de papel absorbente, evite maltratar el fruto y deposítelo

en bolsas herméticas de polietileno debidamente cerradas, cuidando sacar el aire de la bolsa

y marcándolas con los datos de identificación correctamente. Retire la humedad excesiva de

las bolsas si esta se presenta antes del envío. Evite enviar frutos muy jóvenes o con pudrición

por saprofitos.

C) MUESTREO EN CAMPO DE LÁTEX

Exudado de frutos en fase de maduración, de aproximadamente 15 cm de longitud en

adelante. No se recomienda recuperar látex en frutos jóvenes a menos que exuden una

cantidad por encima de 10 mL. El exudado de látex en fruto es un indicio de la presencia de

PMeV, asegúrese de enviar una cantidad por encima de 10 mL de cada fruto por analizar. Se

recomienda el almacenamiento de látex en frío con 0.1% v/v de β-Mercaptoetanol, mezclado




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homogéneamente hasta el envío (si es el caso, notificar con la leyenda). Utilice un tubo de

ensaye con rosca, o un tubo serológico con sello de goma, para colectar el látex y ciérrelo

herméticamente, o enrollando con película de papel parafilm, alrededor del tubo. No se

recomiendan tubos cónicos (Falcon) de 15 mL o algún otro tipo de frasco de plástico por

motivos de preservación del material.

D) MUESTREO EN CAMPO DE SEMILLAS

Procedentes de frutos en estado previo a la maduración y mayor a 30 días después de la

polinización. Se recomienda una cantidad suficiente de 50 a 100 semillas para su

procesamiento compuesto. Corte transversalmente el fruto y recupere las semillas en un

frasco estéril de vidrio de 50 mL. Anote el número de muestra en los frascos. No se

recomiendan tubos cónicos (Falcon) de 15 mL o algún otro tipo de frasco de plástico por

motivos de preservación del material.

E) MUESTREO EN CAMPO DE INSECTOS

Bemisia tabaci, conocida coloquialmente por «mosca blanca o mosquita blanca», es un

hemíptero presuntamente correlacionado con la transmisión de la enfermedad y Meleira es

detectable por métodos moleculares. En caso de observar incidencias en el cultivo, se

recomienda el envío de varios individuos preservados en etanol al 70%. Siempre que envíe

insectos para diagnóstico de Meleira, acompañe esta muestra junto con tejido vegetal o látex.

RECOMENDACIONES

Se sugiere tener presentes las siguientes recomendaciones:

Esterilice los materiales cada vez que tome una muestra. Puede utilizar alcohol y

fuego.

Nunca deberá lavarse la muestra de tejido vegetal.

Envuelva el tejido en papel absorbente, con el propósito de absorber humedad

durante el envío.

Transportar las muestras a baja temperatura (lo más cercano a 4°C) en empaques

térmicos.

Las muestras deben estar en buen estado, sin deshidratación, pudrición o senescencia.

Si la muestra se compone de más de una variedad o lote, será necesario que esto se

señale en la solicitud de diagnóstico, debidamente identificado y separado.

Los datos de identificación requeridos para la solicitud son: coordenadas geográficas,

nombre del huerto, propietario, superficie, estado, municipio, localidad, etapa




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fenológica del cultivo, nombre del colector y fecha de colecta. Debe cerciorarse que los

datos son correctos antes de realizar el muestreo en campo.

RECEPCIÓN, ALMACENAMIENTO Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Dependiendo del tipo de tejido se deberá contener una leyenda asociada al número de orden

y número de muestra, para cada uno de los elementos para analizar. Para motivos de los

procedimientos, se puede designar temporalmente una clave, pero se deberá tener una

relación del ID completo de la muestra para futuras referencias. Comentarios adicionales:

En el caso de muestras asintomáticas es necesario realizar dos repeticiones por

muestra.

Mantenga debidamente identificada cada muestra y lote.

Todo material usado para limpieza y sanitización deberá ser desechado como Residuo

Peligroso Biológico–Infeccioso (RPBI), para evitar contaminación cruzada entre

muestras y como medida preventiva en futuros procedimientos.

Cambie de guantes cada vez que manipule una muestra de látex para evitar

contaminación cruzada entre las muestras. Se recomienda utilizar tubos cónicos de

50 mL para la manipulación de látex.

Limpie su área de trabajo con Etanol al 70% v/v o con DNAzap/RNAzap antes de

trabajar con las muestras. Mantenga condiciones asépticas durante la preparación de

las muestras.

Utilice un mortero estéril y una navaja nueva o estéril por cada muestra.

Dividir en alícuotas la elución de RNA Total obtenidos al final de la extracción.

A) PREPARACIÓN DE HOJAS

Corte con bisturí o una navaja estéril 200 mg (para disruptor mecánico) o 2 g (para

disrupción en mortero) de hojas provenientes de una sola muestra. De preferencia a las zonas

sintomáticas con tejido vascular (nervaduras centrales y secundarias). Evite mezclar todas

las muestras. Una vez realizada la selección del material a muestrear, proceda con la

extracción de RNA total.

B) PREPARACIÓN DE FRUTO

Prepare una navaja estéril y un contenedor de tubos cónicos de 50 mL (Falcon). Tempere el

fruto durante 30 min sobre papel absorbente. Retire posible tierra del fruto. Realice de 3 a 5

cortes longitudinales, poco profundos, a lo largo del fruto y recupere 5 mL de látex como




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mínimo. Si recupera una mayor cantidad de látex, divida en submuestras de 5 mL y anote los

números de muestra. Conserve el látex restante en congelación a -20 °C. El látex y semillas

recolectados en este punto se deben tratar de igual forma que los provenientes directamente

del muestreo en campo

Retire el látex restante con Cloro asperjado en papel absorbente. Corte transversalmente el

fruto y recupere de 50 a 100 semillas en otro tubo cónico de 50 mL. Anote el número de

muestras en los tubos cónicos. Deseche el fruto restante como RPBI.

C) PREPARACIÓN DE LÁTEX

Caliente el látex por 15 minutos en baño maría a 45°C. En este periodo, el látex tomará una

consistencia líquida y podrá ser manipulado con más facilidad. Utilice una punta chata de

1000 µL para homogeneizar la muestra. Subdivida el látex en fracciones de 5 mL, si no se ha

hecho anteriormente, y almacénelo en tubos cónicos de 50 mL. Tome 750 µL de látex por

réplica (Si son duplicados se usarán 1.5 mL por cada 5 mL de látex calentado) para ser

depositado en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL. En muestras asintomáticas se debe

hacer el procedimiento de extracción por duplicado. Antes de proceder con la extracción de

RNA, agregue 0.1% v/v de β-Mercaptoetanol. Conserve la muestra restante en congelación a

-20 °C si se usará en menos de 1 mes (Haga alícuotas de 0.75 mL) o a -80 °C para preservación

a largo plazo. Una vez realizada la selección del material a muestrear, proceda con la

extracción de RNA total.

D) PREPARACIÓN DE SEMILLA

Pese 2.5 g de semillas (aproximadamente 50 semillas) para disrupción en mortero. Si

recupera una mayor cantidad de semillas, divida en submuestras de 50 semillas. Conserve el

tejido sobrante en refrigeración a 4 °C en caso de ser necesario repetir o realizar más pruebas.

Una vez realizada la selección del material a muestrear, proceda con la extracción de RNA

total.

E) PREPARACIÓN DE INSECTOS

Retire el etanol en el que se encuentran preservados los insectos y seque completamente

sobre papel absorbente. Posteriormente, deposite los insectos en tubos de microcentrífuga

de 1.5 mL para llevar a cabo la disrupción mecánica. Una vez realizada la selección del

material a muestrear, proceda con la extracción de RNA total.




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EXTRACCIÓN DE RNA TOTAL

La extracción se puede realizar con kit comercial como Qiagen RNeasy® Plant Extraction Kit,

o Promega®, Total RNA Isolation System, entre otros listados en la sección de anexos. Tenga

en cuenta que la calidad del RNA depende directamente del método empleado para

extracción y del material del que se está extrayendo; por ello es propuesta la metodología de

Ramírez-Ortega (2016) para extracción de ácidos nucleicos en tejidos recalcitrantes. Para

preparación de reactivos ver el apartado de Anexos.

1. En un mortero enfriado a -80°C, macere la muestra (si es posible, con nitrógeno líquido)

hasta obtenerse un polvo fino. Transfiera a un tubo de 2 mL y agregue 1,000 µL de Buffer

de extracción. Agregue 0.1% v/v de β-Mercaptoetanol.

Si utiliza un disruptor, agregue 1,000 µL de Buffer de extracción directamente al tubo

que contiene el tejido, cierre bien y proceda a macerar en el equipo.

En caso de látex, no es necesario macerar después de agregar el Buffer de Extracción.

2. Incube la muestra a 95°C, 5 min para lisis celular. Posteriormente enfríe a temperatura

ambiente.

3. Agregue 0.1 v/v de SDS al 10% y 0.2 v/v de Cloroformo frio. Agite por inversión y

centrifugue a 12,000 rpm por 5 minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.

4. Agregue 0.1 v/v de Acetato de Sodio (3M, pH 5.2) y 0.25 v/v de Fenol: Cloroformo: Alcohol

isoamílico (25:24:1). Agite en vórtex por 1 min y centrifugue a 14,500 rpm durante 15

minutos.

Si el sobrenadante queda turbio, sobre el mismo tubo agregue 0.25 v/v de fenol:

cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1), agite y centrifugue a 14,500 rpm por 5 min.

Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.

5. Agregue 2.00 v/v de Etanol Absoluto. Agite por inversión y centrifugue a 13,000 rpm

durante 15 min. Descarte el sobrenadante.

6. Lave la pastilla de RNA con 500 µL de EtOH 70%, agite en vórtex hasta despegar la pastilla

del tubo y centrifugue a 13,000 rpm por 3 minutos. Deseche el sobrenadante, cuidando no

perder la pastilla

7. Deje secar la pastilla y resuspenda con 50 – 75 µL de agua grado biología molecular u otro

buffer de elución compatible (TE, PBS, SS). Tome una alícuota del mismo volumen del

buffer para blanco de cuantificación.

8. Incube con 1 U/µL de DNAsa I, a 37 °C durante 30 min – 1 hora, para eliminar DNA residual

de la extracción.




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9. Guarde el RNA extraído a 4 °C para su uso inmediato, a -20 °C para almacenamiento a

durante el periodo de diagnóstico o consérvelo a -80°C para resguardo prolongado.

CUANTIFICACIÓN Y VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD DEL RNA

CUANTIFICACIÓN DE RNA TOTAL CON NANODROP

Como regla heurística, se considera que una muestra de ácidos nucleicos es pura a partir de

una razón A260/A280 entre 1.8 – 2.00 y A260/A230 >1.7. Si las extracciones cumplen esta

condicional, son aptas para ser utilizadas en pruebas posteriores.

INTEGRIDAD DE RNA CON GEL DE AGAROSA (OPCIONAL)

Prepare la electroforesis con un gel de agarosa al 1.0% teñido con Bromuro de Etidio

1:10000. Cargue 5 µL de cada muestra sobre el gel y un RNA positivo de PMeV-2. Coloque 2

µL de marcador de alto peso molecular. Resuelva los productos de dsRNA a 120 V por 45 min

y observe una banda de 4.5 Kb, en los controles positivos y en las muestras.

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

El presente protocolo considera distintas variantes del procedimiento para RT-PCR en punto

final, en dos pasos y un solo paso, y PCR cuantitativa (utilizando SYBR Green I como

fluoróforo). El par de iniciadores PMeV-RP-F1/R1 amplifican un segmento del genoma viral

del Umbravirus PMeV-2 (Cruz-Jaramillo et al., (en escritura)), y el par de iniciadores END-18S-

F/R como control endógeno (Ramírez-Ortega et al., 2016).

Tabla 1. Oligonucleótidos iniciadores para diagnóstico

Nombre Secuencia (5’ -> 3’) Amplicón (pb)

PMeV-RP-F1 GACGTTTTCGAGCGCATCTC 371

PMeV-RP-R1 GCCAACTGGTCATCCGGTAA

END-18S-F GCCCCGGGTAATCTTTGAAATTTC AT 150

END-18S-R GTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTA




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TÉCNICA DE RT-PCR EN DOS PASOS

PRIMER PASO: SÍNTESIS DE cDNA (RETROTRANSCRIPCIÓN)

1. Prepare la siguiente incubación:

Tabla 2. Preincubación de RNA

Reactivo 1 rxn (µL) Conc. Inicial Conc. Final RNA Total 2.00 100 – 500 ng/µL 10 – 50 ng/µL Oligo RP-F1 2.50 10 µM 1.25 µM Oligo RP-R1 2.50 10 µM 1.25 µM Total 7.00 (de 20.00) - -

2. Incube la mezcla en un termociclador a 95 °C por 3 min. Retire inmediatamente la mezcla

y deposítela en hielo hasta terminar el siguiente paso.

3. Prepare el número de reacciones con las siguientes cantidades

Tabla 3. Mezcla de Reacción de RT (Consultar No. Cat. en el Anexo A)

Reactivo 1 rxn (µL) Conc. Inicial Conc. Final Buffer FS 4.00 5 x 1 x dNTP´s Mix 2.00 10 mM 1 mM RNAseOUT 0.50 40 U/µL 1 U/µL RT SuperScript III 0.50 200 U/µL 5 U/µL DTT 2.00 100 mM 10 mM H2O miliQ estéril 4.00 - - Total 13.00 (de 20.00) - -

4. Agregue los 13 µL de la reacción preparada en cada muestra, el volumen final es de 20 µL.

Introduzca el siguiente programa en el termociclador:

Tabla 4. Programa de Reacción de RT

Temperatura Tiempo 45 °C 30 min 85 °C 5 min 4 °C espera

5. Retire las reacciones de cDNA del termociclador y guárdelas a 4 °C para uso inmediato, o

a -20 °C para almacenamiento hasta por 7 días.




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VALIDACIÓN DE CDNA POR PCR DE CONTROL ENDÓGENO

1. Prepare el número de reacciones con las siguientes cantidades:

Tabla 5. Mezcla de Reacción de PCR (18S)

Reactivo 1 rxn (µL) Conc. Inicial Conc. Final Buffer PCR-MgCl2 1.25 10 x 1 x MgCl2 0.75 50 mM 3.0 mM dNTP´s Mix 1.00 10 mM 0.8 mM Oligo 18S F 1.00 10 µM 0.8 µM Oligo 18S R 1.00 10 µM 0.8 µM Taq DNA Polimerasa 0.10 5 U/µL 0.04 U/µL H2O miliQ estéril 6.90 - - cDNA Molde 0.50 100 – 500 ng/µL 4 – 20 ng/µL Total 12.5 -

2. Programe en el termociclador:

Tabla 6. Programa de Reacción de PCR (18S)

Temperatura Tiempo Ciclos 94 °C 3 min 1 94 °C 35 seg

35 50 °C 35 seg 72 °C 45 seg 72 °C 7 min 1 4 °C espera 1

3. Retire las Reacciones de PCR del termociclador y guárdelas a 4 °C para uso inmediato, o a

-20 °C para almacenamiento hasta por 7 días, si no planea continuar con el siguiente paso.

4. Prepare la electroforesis con un Gel de Agarosa al 1.5% w/v, sobre Buffer TAE 1x, teñido

con Bromuro de Etidio o Gel Red a una dilución 1:10000.

5. Cargue los pozos del gel con cada producto de PCR con 3 µL de Buffer de Carga. Coloque 2

µL de un Marcador de Peso Molecular (resolución de 50 a 500 pb), preparado con Buffer

de Carga, en el primer pozo y en el último del Gel de Agarosa.

6. Resuelva los productos de PCR por electroforesis a 90 V por 45 min.

7. Evalúe el resultado de cada Reacción de PCR. El amplicón esperado tiene un tamaño de

150 pb, comparable en tamaño con los Marcadores de Peso Molecular a los extremos y la

posición del amplicón de la Reacción del Control Positivo (+).




14

A. Las muestras que presenten el amplicón del tamaño deseado son viables para realizar

la Reacción de PCR para la detección de PMeV.

B. Las muestras con un resultado negativo, deberán reevaluarse desde el procedimiento

de PCR del Control Endógeno, la Reacción de cDNA o en su defecto, la extracción de RNA

Total.

Por motivos de comparación, básese en el siguiente ejemplo visual:

Figura 6. Resultado de la validación de cDNA por control endógeno. Carril 1: MPM 1Kb plus (Thermo Scientific), 2: Control NTC, 3: Control Positivo, 4–7: Muestras de producto amplificable de 18S. Las muestras M1 – M3 cumplen con el criterio de fragmento amplificable de 18S, por lo que el cDNA es válido para preparar la reacción de PCR de diagnóstico. Sin embargo, la Muestra M4 requiere ser corroborada nuevamente.

SEGUNDO PASO: REACCIÓN DE PCR PARA DIAGNÓSTICO DE PMEV

1. Descongele las reacciones de cDNA y guárdelas a 4°C hasta su uso.

2. Prepare un control positivo a 2 ng/µL (Plásmido clonado, cDNA positivo, Amplicón

previo).





15

Tabla 7. Mezcla de Reacción de PCR (PMeV)

Reactivo 1 rxn (µL) Conc. Inicial Conc. Final

Buffer PCR-MgCl2 2.50 10 x 1 x

MgCl2 0.50 50 mM 1 mM

dNTP´s Mix 0.25 10 mM 0.1 mM

Oligo RP-F1 0.25 10 µM 0.1 µM

Oligo RP-R1 0.25 10 µM 0.1 µM

Taq DNA Polimerasa 0.25 5 U/µL 0.05 U/µL

H2O miliQ estéril 18.00 - -

cDNA Molde 2.00 100 – 500 ng/µL 8 – 40 ng/µL

Total 25.0 - -


Tabla 8. Programa de Reacción de PCR (PMeV)

Temperatura Tiempo Ciclos

94 °C 3 min 1

94 °C 30 seg

40 59 °C 30 seg

72 °C 30 seg

72 °C 5 min 1

4 °C espera 1

5. Retire las Reacciones de PCR del termociclador y guárdelas a 4 °C para uso inmediato, o a

-20 °C para almacenamiento hasta por 7 días si no planea continuar con el siguiente paso.

6. Prepare la electroforesis con un Gel de Agarosa al 1.5% w/v, sobre Buffer TAE 1x, teñido

con Bromuro de Etidio o Gel Red a una dilución 1:10000.

7. Cargue los pozos del gel con 12 µL de producto de PCR con 3 µL de Buffer de Carga 6x.

Coloque 2 µL de un Marcador de Peso Molecular (resolución de 100 a 1000 pb), preparado

con Buffer de Carga, en el primer pozo y en el último del Gel de Agarosa.

8. Resuelva los productos de PCR por electroforesis a 90 V por 45 min.

9. Evalúe el resultado de cada Reacción de PCR. El amplicón esperado tiene un tamaño

aproximado de 370 pb, comparable en tamaño con los Marcadores de Peso Molecular a los

extremos y la posición del amplicón del Control Positivo:




16

A. Si la muestra presenta el amplicón del tamaño deseado, se considera POSITIVA para

PMeV.

B. Si en una muestra no se observa el fragmento del tamaño esperado, dicha muestra es

NEGATIVA a PMeV.

C. Si el Control Positivo (+) no presenta la banda correspondiente, repita el procedimiento

de PCR utilizando una nueva clona de pDNA como Control (+), junto con todas las

muestras.

D. Si el Control Negativo (–) muestra la banda de 371 pb, se considera la presencia de

contaminación durante la reacción. En este caso, es necesario repetir el procedimiento

de PCR con todas las muestras incluidas cambiando los reactivos posiblemente

contaminados.


Figura 7. Resultado de Electroforesis (Gel Recortado a la región). Carril 1: MPM 100 pb 2 (/): Carril Vacío, 3: Control NTC (-), 4-6: Amplificaciones de 370 pb de muestras positivas a PMeV. La aparición de fragmentos de menor tamaño se debe a cuestiones de dímeros o hibridaciones incompletas en el procedimiento.




17

TÉCNICA DE RT-PCR EN UN SOLO PASO (ONE STEP)


previo).


Tabla 9. Mezcla de Reacción de One Step RT-PCR (PMeV)

Reactivo 1 rxn Conc. Inicial Conc. Final

Reaction Mix 12.50 2 x 1 x



SS III RT/Platinum Taq 1.00 100 x 1 x


RNA Total 2.00 100 – 500 ng/µL 8 – 40 ng/µL

Total 25.0 - -


Tabla 10. Programa de Reacción de One Step RT-PCR (PMeV)


55 °C 30 min 1

94 °C 2 min 1

94 °C 15 seg 40

62 °C 30 seg

68 °C 30 seg

68 °C 5 min 1

4 °C espera 1

4. Al finalizar la reacción, retire los productos de RT-PCR del termociclador y guárdelos a 4

°C para uso inmediato o a -20 °C para almacenamiento, hasta por 7 días si no planea

continuar con el siguiente paso.

5. Prepare los reactivos de electroforesis utilizando los pasos de la sección anterior.

6. Evalúe el resultado de cada producto de PCR con el mismo criterio que la sección anterior.




18

TÉCNICA DE RT-PCR CUANTITATIVA A PARTIR DE cDNA

1. Seguir las instrucciones del apartado “SÍNTESIS DE cDNA (RETROTRANSCRIPCIÓN)”.


previo).

3. Prepare una dilución 16.67X de SYBR Green I (p. ej. 1.25 µL de SYBR Green 10000x en

748.75 µL de agua grado Biología Molecular) en tubos color ámbar o marrón.


Tabla 11. Mezcla de Reacción de qPCR – SYBR Green I 1:15000


Buffer PCR-MgCl2 2.50 2 x 1 x

MgCl2 0.50 50 mM 1 mM

dNTP´s Mix 0.25 10 mM 0.1 mM



Taq DNA Polimerasa 0.25 5 U/ µL 0.05 U/µL

SYBR Green I 1.00 16.67 x (25:15000) 0.666x (1:15000)


cDNA Molde 2.00 100 – 500 ng/µL 8 – 40 ng/µL

Total 25.0 - -

5. Use el siguiente programa de PCR cuantitativa

Tabla 12. Programa de qPCR (PMeV)


94 °C 3 min 1

94 °C 10 seg

40 59 °C 10 seg

72 °C 20 seg

95 °C 10 seg 1

65 °C 5 seg 1

Δ +0.5 °C

95 °C

Captura de Fluorescencia =




19

6. Evalúe el resultado de cada Reacción de qPCR y el análisis del ensayo HRM. El amplicón

esperado tiene un ciclo de cuantificación 3 < Cq < 36 y un punto de fusión MT = 87 ± 1°C,

comparable a la posición del amplicón del Control Positivo. El aislado PMeV-Mx presenta

un MT = 87 °C, mientras que el aislado PMeV-Br presenta un MT = 87.5 °C.

A. La reacción de qPCR es VÁLIDA si las unidades de fluorescencia superan el umbral de

400 – 500 RFU.

B. Para casos donde se observa el amplicón con Cq < 36 y MT = 87± 1°C, la muestra es

POSITIVA para diagnóstico de PMeV.

C. Si en una muestra se obtiene un Cq > 36, pero el punto de fusión presenta un MT = 87±

1°C, como el Control Positivo, repita el procedimiento con una mayor concentración de

molde.

D. Si se observa una muestra con una temperatura de fusión diferente al intervalo MT =

87±1 °C, independientemente del Cq, la muestra es NEGATIVA para diagnóstico PMeV.

Con lo anterior se descartan productos inespecíficos a la prueba, como dímeros en la

reacción, visibles en el control negativo.

E. Si la reacción no tiene ningún Cq ni punto de fusión MT, como los controles negativos,

la muestra es NEGATIVA para diagnóstico de PMeV.

F. Si el Control Positivo no presenta amplificación, repita el procedimiento de qPCR con

otro Control Positivo.


Figura 8. Resultados de RT-PCR cuantitativa a partir de CDNA. A) Curva de amplificación y B) Curva de Fusión. Los productos positivos a PMeV cumplen con las dos condiciones: Cq < 36 y MT = 87 °C. Los dímeros generalmente tienen un MT = 80°C. El fluoróforo SYBR Green I a una dilución 1:15000 en la reacción de qPCR puede llegar hasta los 3000 RFU.




20

TÉCNICA DE RT-PCR CUANTITATIVA EN UN SOLO PASO


previo).

2. Prepare una dilución 16.67X de SYBR Green I como se ha descrito anteriormente.


Tabla 13. Mezcla de Reacción de qPCR (PMeV) – SYBR Green I 1:15000


Reaction Mix 12.50 2 x 1 x



SYBR Green I 1.00 16.67 x (25:15000) 0.666x (1:15000)

SS III RT/Platinum Taq 1.00 100 x 1 x


RNA Total 2.00 100 – 500 ng/µL 8 – 40 ng/µL

Total 25.0 - -

4. En la interfaz del termociclador de qPCR utilizado, introduzca el siguiente programa de

reacción.

Tabla 14. Programa de Reacción de RT-qPCR OneStep (PMeV)


55 °C 30 min 1

94 °C 3 min 1

94 °C 10 seg 40

59 °C 10 seg

72 °C 20 seg

95 °C 10 seg 1

65 °C 5 seg 1

Δ +0.5 °C

95 °C

5. Evalúe el resultado de acuerdo al mismo criterio de la sección anterior.




21

Es posible la aparición de dímeros en ciclos tardíos, a partir de los 35 – 36 ciclos de la prueba,

sin embargo, pueden descartarse como falsos positivos mediante la comparación del punto

de fusión de un positivo verdadero con respecto al punto de fusión de los dímeros.

Cuando una muestra tiene una carga viral baja, menor a 100 copias/µL, debe aumentarse la

concentración de cDNA molde o RNA Total inicial en la prueba de qPCR. Los productos de

qPCR pueden resolverse como una PCR convencional, en un gel de agarosa, por electroforesis,

utilizando el procedimiento descrito en este mismo protocolo.

Los kits de amplificación usados para el procedimiento de diagnóstico están señalados en el

cuerpo de anexos. Elija el procedimiento de PCR o qPCR a seguir, de acuerdo a los reactivos

disponibles para realizar el procedimiento y la experiencia del técnico de diagnóstico.

CONFIRMACIÓN DE RESULTADOS

Las muestras que resulten POSITIVAS a Papaya Meleira virus pueden ser confirmadas

repitiendo la técnica o, de ser posible, mediante secuenciación Sanger y comparando los

resultados obtenidos con la base de datos de GenBank, utilizando el algoritmo MEGA-BLAST.

La secuencia se confirma con un mínimo de 97% de cobertura con otra secuencia de Papaya

Meleira virus, una identidad de composición de bases que supere el 90% y con un E-Value

menor a 1E-9. Para determinar modificaciones en la composición de bases, se deberá realizar

un alineamiento global de secuencias contra la secuencia parcial del fragmento RP-F1/R1 del

aislado PMeV-Br (No. Acceso KT186131.1) y del aislado PMeV-Mx (No. Acceso KT186130.1).

DESTRUCCIÓN DE LA MUESTRA

Concluido el diagnóstico, las muestras de RNA Total deberán ser desactivadas, a menos que

se trate de un aislado novedoso con el que no se cuente en el banco de controles positivos del

Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, o si se trata de muestras útiles para

corroboración del diagnóstico.

El periodo de desactivación se realiza después de la entrega del dictamen de resultados. La

desactivación se realiza por calor húmedo en autoclave durante 25 minutos a 15-20 lb/in2,

antes de ser desechada o incinerada, siguiendo las indicaciones para Residuos Peligrosos

Biológico – Infecciosos (RPBI).




22

RECOMENDACIONES DE TRABAJO

Limpie y desinfecte perfectamente su área de trabajo.

Trabaje con guantes de polietileno.

Siempre trabaje con consumibles (tubos, puntas etc.) estériles.

Cada muestra y submuestra debe de ir en un tubo independiente rotulado con su

respectivo número de identificación.

Use campana de extracción de gases para preparar las soluciones necesarias.

Las mezclas de reacción (Master Mix) deben realizarse en la campana de flujo laminar,

o bien, en un gabinete para PCR.

Siempre que pipetee una muestra, deseche la punta y ocupe una nueva. Lo mismo para

el caso de los controles positivos y negativos.

Utilice las concentraciones de RNA recomendadas para ambas técnicas. En caso de ser

necesario, realice las diluciones pertinentes.

Se recomienda adquirir oligonucleótidos grado HPLC si utiliza qPCR.

Recuerde descongelar los oligonucleótidos, fluoróforos y demás reactivos a

temperatura ambiente sobre una gradilla refrigerante para reacciones de PCR o sobre

hielo, no fuerce su descongelamiento con la mano o aplicando calor.

La alícuota de SYBR Green I debe estar en tubos color ámbar o marrón (es

fotosensible)

La Taq Polimerasa debe almacenarse siempre a -20°C

El uso correcto de los instrumentos de medición permite la obtención de resultados

óptimos.




23

LITERATURA CITADA

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25

ANEXOS

A. REACTIVOS Y KITS NECESARIOS PARA EL MÉTODO

A continuación, se enlistan los nombres de los reactivos, Marca, No. Catálogo y No. CAS. Se proporciona el

Número CAS para efectos de equivalencia del mismo reactivo con otro proveedor.

Polvos

Reactivo (Nombre, Fórmula o Siglas) Marca No.

Catálogo

CAS

Bromuro de Cetil-trimetil-amonio (CTAB) Sigma Aldrich H6269-500G 57-09-0

Laurilsulfato de Sodio (SDS) Sigma Aldrich L3771-500G 151-21-3

Acetato de Sodio (CH3COONa) Sigma Aldrich S8750-500G 127-09-3

Polivinil Pirrolidona Grado 40 (PVP 40) Sigma Aldrich PVP40-500G 9003-39-8

Tetra-acetato de Etilen-diamina (EDTA) Sigma Aldrich E5134-500G 6381-92-6

Cloruro de Sodio (NaCl) Sigma Aldrich S3014-1KG 7647-14-5

Hidróxido de Sodio (NaOH) Sigma Aldrich S8045-500G 1310-73-2

Agarosa Grado Biología Molecular Thermo Scientific 16500-500 9012-36-6

Tris Básico (Tris Base) Sigma Aldrich 93362-500G 77-86-1

Líquidos

Reactivo (Nombre, Fórmula o Siglas) Marca No. Catálogo CAS

Etanol Absoluto (EtOH) Sigma Aldrich E7023-500ML 64-17-5

Metanol (MetOH) Sigma Aldrich 179957-1L 67-56-1

Isopentanol (Alcohol Isoamílico) Sigma Aldrich I9392-1L 123-51-3

Cloroformo Sigma Aldrich C2432-500ML 67-66-3

Fenol Sigma Aldrich P1037-25G 108-95-2

Ácido Acético Glacial (CH3COOH) Sigma Aldrich 695092-500ML 64-19-7

Acetato de Sodio 3M pH 5.5 (CH3COONa) Ambion AM9740 127-09-3

2-Mercaptoetanol (βME) Sigma-Aldrich M3148-25ML 60-24-2

Agua Bidestilada (H2O) Indistinto - -

Agua Grado Biología Molecular (H2O) Sigma-Aldrich W4502-1L 7732-18-5

Buffer Tris Acetato –EDTA 10X (TAE) Sigma-Aldrich T8280-1L -




26

A continuación, se enlistan los nombres de los kits de reacciones enzimáticas compatibles y kits probados

para el método de diagnóstico. Kits enzimáticos distintos a los mencionados requieren validación para su

ejecución en el diagnóstico.

Kits de Reacciones Enzimáticas

Kit de Reacción Propósito Marca Catálogo

Proteinase K Digestión Tejido Vegetal Sigma-Aldrich P2308-25MG

DNAse I Limpieza RNA Total Sigma-Aldrich D5025-150KU

SuperScript II RT cDNA Thermo Scientific 18064022

SuperScript III RT cDNA Thermo Scientific 18080044

MMLV RT cDNA Thermo Scientific 18057018

Taq DNA Polymerase Recombinant PCR/qPCR Thermo Scientific 10342178

Platinum Taq Polymerase PCR/qPCR Thermo Scientific 10966018

Go Taq Hot Start Polymerase PCR Promega M5005

One Step SuperScript III RT /

Platinum Taq Polymerase

PCR/qPCR OneStep Thermo Scientific 12574035

Kits de Extracción y Purificación

Kit de Reacción Propósito Marca Catálogo

RNeasy Plant Purification Kit Extracción/Purificación Qiagen 74904

SV Total RNA Isolation System Extracción/Purificación Promega Z3100

GeneJET Plant RNA Purification Kit Extracción/Purificación Thermo Scientific K0801

TRIZol Reagent Solution Extracción de RNA Thermo Scientific 15596026

TRIzol Plus RNA Purification Kit Extracción/Purificación Thermo Scientific 12183555

Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Purificación de amplicones Promega A9281




27

Reactivos Adicionales Varios

Reactivos Propósito Marca Catálogo

SYBR Green I 10000x qPCR Thermo Scientific S7567

TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder Electroforesis Thermo Scientific 10488085

TrackIt 100 bp DNA Ladder Electroforesis Thermo Scientific 10488058

TrackIt Cyan/Yellow Loading Buffer Electroforesis Thermo Scientific 10482035

Ethidium bromide solution Electroforesis Sigma-Aldrich E1510-10ML

GelRed Nucleic Acid Gel Stain, 10,000X in

water

Electroforesis Biotium 41003-1

B. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA LA EXTRACCIÓN DE RNA TOTAL

Buffer de Extracción: Solución de CTAB al 2% con NaCl 5M, pH = 5.2

Preparación de 1 L. Pesar las siguientes sustancias:

Nombre Cantidad Concentración Final Masa Molar (g/mol)

CTAB 20.0 g 2.0 % (w/v) 364.48

PVP (40) 5.0 g 0.5 % (w/v) 40 000 (promedio)

NaCl 292.0 g 5.0 M 58.4 g

Tris (Base) 2.4228 g 0.02 M 121.14

EDTA 1.4612 g 0.005 M 292.24

Mezcle bien los polvos de las sustancias anteriores para que la PVP quede rodeada de sustancias

higroscópicas. Agregue agua a temperatura ambiente lentamente y al mismo tiempo agite. Posteriormente,

agregue agua tibia hasta completar 750 mL aproximadamente. Si aún permanecen grumos sin disolver,

caliente la solución hasta ebullición. Ajuste el pH con NaOH 10N. Afore a 1 L con agua tibia y esterilice en

la autoclave.




28

SDS al 10%

Preparación de 250 mL. Pesar las siguientes sustancias:


SDS 25.0 g 10 % (w/v) 288.38

Deposite 100 mL de agua bidestilada estéril en el recipiente que usará para preparar la solución, pese la

cantidad de SDS indicada y viértala lentamente en el recipiente hasta terminar de depositar los polvos y

diluya completamente en agitación lenta. Termine de aforar el resto del volumen final de la solución. Evite

la inhalación directa del SDS. No caliente la solución.

Etanol absoluto grado biología molecular al 70%.

Preparación de 100 mL. Tomar de las siguientes sustancias:


Etanol Abs. 70.0 mL 70 % (v/v) 46.07

Deposite 30 mL de agua grado biología molecular en el recipiente que usará para preparar la solución.

Conserve en refrigeración.

Fenol–Cloroformo–Alcohol isoamílico (25:24:1).



Cloroformo 240.0 mL 48 % (v/v) 119.38

Fenol 250.0 mL 50 % (v/v) 94.11

Alcohol

Isoamílico

10.0 mL 2 % (v/v) 88.15

Tome los volúmenes correspondientes de cada reactivo y mézclelos en un frasco ámbar. Si parte de

Cloroformo: Isoamílico 24:1, mezcle volúmenes iguales de ese reactivo y de Fenol. Conserve la solución a -

20 °C.




29

Solución Buffer de Acetato de Sodio 3 M

Preparación de 1 L. Tomar de las siguientes sustancias:


Ac. Sodio 180.55 g 3.0 M 82.03

¡Use una campana de extracción de vapores para preparar la solución! Deposite 500 mL de agua bidestilada

estéril en el recipiente que usará para preparar la solución, pese la cantidad de Acetato de Sodio indicada

y viértala lentamente en el recipiente hasta terminar de depositar los polvos y diluya completamente en

agitación lenta. Termine de aforar el resto del volumen final de la solución. Ajuste el pH agregando

lentamente Ácido Acético Glacial. Esterilice la solución en autoclave.

Etanol-Metanol-Ácido Acético (21:3:1)



Etanol Abs. 210.0 mL 84 % (v/v) 46.07

Metanol 30.0 mL 12 % (v/v) 32.04

Ác. Ac. Glacial 10.0 mL 4 % (v/v) 60.05

¡Use una campana de extracción de vapores para preparar la solución! Tome los volúmenes

correspondientes de cada reactivo y mézclelos en un frasco ámbar. Conserve la solución a -20 °C.

protocolo para la detecciÓn del … · meleira virus 1 y papaya meleira virus 2, que tiene la...

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