Proteoma celular

Es la totalidad de proteínas expresadas en una célula particular bajo condiciones de medioambiente y etapa de desarrollo (o ciclo celular) específicas, como lo puede ser la exposición a estimulación hormonal. También se puede hablar del proteoma completo de un organismo, que puede ser conceptualizado como las proteínas de todas las variedades de proteomas celulares. Es aproximadamente, el equivalente proteínico del genoma.

La proteómica es el estudio del proteoma, que se realizan tradicionalmente mediante la técnica de electroforésis en gel de dos dimensiones. En la primera dimensión las proteínas se separan por isoelectroenfoque, que separa las proteínas con base en su carga eléctrica. En la segunda dimensión, las proteínas se separan por peso molecular utilizando SDS-PAGE. El gel se tiñe con Azul de Coomassie o Nitrato de Plata para visualizar las proteínas; las manchas en el gel son las proteínas que han migrado a una localización específica y permite de esta forma identificarlas.

Métodos de rotura celular y extracción de proteínas

El primer paso en el aislamiento de una proteína es la rotura celular, para posteriormente poder extraer la proteína con un tampón adecuado. El método de rotura a elegir depende de las características mecánicas del tejido o células de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización. Entre los distintos métodos ellos están:

Lisis celular. Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura.

Destrucción mécanica. Entre estos métodos se encuentran la homogenización (hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido).

Congelación-descongelación. La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25 ºC).

Durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extracción para solubilizar las proteínas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones específicos para proteínas solubles o bien que contengan además detergentes si se pretende purificar proteínas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice.

Además en ocasiones es necesario añadir el tampón de extracción agentes protectores de grupos funcionales específicos de la proteína o bien inhibidores de proteasas. El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de enzimas, membranas y células rotas. En cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente) constituye el extracto crudo donde se encuentra la proteína de interés objeto de la purificación.

Vamos a utilizar un mezcla de

EDTA que secuestra el cobre que es un cofactor necesario para la expresión de la polifenoloxidasa

Para prevenir la proteólisis durante la extracción se debe utilizar alguno/s de los procedimientos siguientes: 1) extraer con buffer que contenga SDS (sodio dodecil sulfato), adicionar agentes protectores como dimetil sulfóxido (10 %, v/v) o glicerol (25 % v/v) o agentes reductores como ditiotreitol (1mM), L-cisteína (5 mM) o β-mercaptoetanol (1mM)) o 7) adicionar agentes quelantes como EDTA (2 mM) o EGTA (2mM) para remover cationes bivalentes que son cofactores de metalopeptidasas y de varias peptidasas serínicas

2-mercaptoetanol se emplea profusamente en el laboratorio para reducir los puentes disulfuro y puede actuar como antioxidante biológico, reciclando radicales hidroxilo

Vamos a utilizar tris-HCl Es una amina primaria, con la reactividad típica, por ejemplo la condensación con aldehídos y el establecimiento de un equilibrio ácido-base (responsable de su capacidad tamponante). coincide con el pH fisiológico de la mayoría de los seres vivos. Sumado a su bajo coste, esto hace del Tris uno de los tampones más comunes en laboratorios de biología y bioquímica.

Los cambios bruscos de pH, ácidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la acción de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos) son los principales factores que pueden desnaturalizar las proteínas. Para evitar o minimizar estos factores la manipulación de las proteínas durante el proceso de purificación suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4ºC) y se procura que el proceso sea lo más corto posible

Se somete a centrifugación (10.000 – 15.000 rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las proteínas solubles, del precipitado que además de restos celulares también contienen proteínas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes.

A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrífuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los rotores estén fijos.

Las proteinas son solubles en agua cuando adoptan una conformación globular. La solubilidad es debida a los radicales (-R) libres de los aminoácidos que, al ionizarse, establecen enlaces débiles (puentes de hidrógeno) con las moléculas de agua. Así, cuando una proteina se solubiliza queda recubierta de una capa de moléculas de agua (capa de solvatación) que impide que se pueda unir a otras proteinas lo cual provocaría su precipitación (insolubilización).

Los múltiples grupos ácido-base de una proteína determinan que sus propiedades de solubilidad dependan de la concentración de las sales disueltas, de la polaridad del disolvente, del pH y de la temperatura

se almacena a -20°C