12/03/2015

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Lic. María Natalia Taboada Ruiz

Estudiante VI Semestre Doctorado en Biotecnología

Universidad Nacional de Colombia

Fundamento de PROPIEDADES BIOQUÍMICAS

Para demostrar si el microorganismo :

� Es capaz de fermentar azúcares

� La presencia de enzimas

� Degrada determinados compuestos

� Producen compuestos coloreados

Las pruebas bioquímicas, son pruebas simples, que se handesarrollado para demostrar en forma clara una determinadacaracterística bioquímica y de esta forma, las bacteriasfuertemente relacionadas pueden separarse en dos especiesdiferentes con base a pruebas bioquímicas

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FLUJOGRAMAS PARA IDENTIFICACIÓN

Fermenta lactosa?

Puede utilizar ác. cítrico como

única fuente de carbono?

Puede utilizar ác. cítrico como

única fuente de carbono?

Shigella sp. produce

lisina descarboxilasa

Salmonella sp. en

general produce

H2SEscherichia sp. Produce acetoína?

Citrobacter sp. Enterobacter sp.

NO SI

NOSI

SI

SI NO

NO

Prueba de Catalasa

La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva.

H2O2 H2O + O2Catalasa

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Prueba de Oxidasa

Se basa en la producción de la enzima oxidasa intracelular.Esta reacción oxidasa se debe a un sistema de citocromo oxidasa, que activa laoxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular.

El sistema citocromo oxidasa está presente en organismos aerobios, a los que lespermite utilizar el oxígeno como aceptor final de hidrógeno para reducir el oxígenomolecular a peróxido de hidrógeno en el último eslabón de la cadena respiratoria.

Reactivo de oxidasa: Solución al 1% de NNN’N',

tetrametil, 1-4 fenilendiamina en agua

destilada

Prueba de Indol

Se determina si la bacteria posee una enzima (triptofanasa). La triptofanasa hidroliza el triptófano en indol y alanina. El indol se detecta empleando un reactivo específico (Reactivo de Kovac´s). El triptófano forma parte de las peptonas del medio

Un anillo rosa-rojizo en la superficie indica que se ha formado un complejo coloreado entreel indol y el p-dimetilamino benzaldehído. El alcohol amílico concentra el complejocoloreado en la superficie.

El HCl proporciona el pH ácido que

requiere la reacción.

El alcohol amílico es, insoluble en agua

y menos denso.

Reactivo de Kovac´s(alcohol isoamilo, p-

dimetilaminobenzaldehído y ácido

clorhídrico concentrado)

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Prueba de Rojo de Metilo

Detecta la fermentación ácido-mixta. Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (Rojo de Metilo) al cultivo.

La fermentación ácido mixta produce ácido acético, etanol, H2 ,CO2 y proporciones

diferentes de ácido láctico o propiónico(fórmico) según las especies.

Una coloración roja, indicadora de la presencia de ácidos provenientes de la fermentación de la glucosa, constituye un resultado positivo.

Prueba de Voges-Proskauer

Detecta la fermentación butanodiólica.En esta fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol.

Mediante un reactivo, (α-naftol e KOH al 40%),

se detecta la presencia de un precursor del

butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína)

La acetoína en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo

El diacetilo origina una coloración roja al reaccionar con los restos guanidínicos de algunos aminoácidos de la peptona del medio (Ej. Arginina)

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Prueba de Consumo de Citratos-Simmons

Se determina la utilización del citrato como única fuente de carbono y energía.

Se utiliza el medio de Simmons: utiliza un

medio sólido con citrato sódico y un indicador

ácido-base (Azul de Bromotimol)

En este caso se detecta la alcalinización del medio por el consumo del citrato (el indicador toma color azul).

PositivoNegativo

Método O-F, Óxido-Fermentativo, Hugh-Leifson

Indica del tipo de metabolismo energético: respiratorio (O) o fermentador (F).Se suele utilizar glucosa como sustrato.

Se detecta la acumulación de

ácidos con un indicador ácido-base

(Azul de Bromotimol).

Si transforman la glucosa en CO2, el medio se verá amarillo (por la formación de ácido carbónico originado al reaccionar el CO2 con el agua del medio)

Se incuba en condiciones de

aerobiosis (sin parafina) y de

anaerobiosis (con parafina, tubo

cerrado), simultáneamente.

Recién

inoculado

Vía

oxidativa

Vía

Fermentativa

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Fermentación de Azúcares

Se determina si la bacteria es capaz de fermentar un carbohidrato particular(producción de ácidos acompañados o no de gases). Se aplica a bacterias conmetabolismo fermentador, ensayándose por separado diferentes carbohidratos.

Viraje del indicador: indica producción de ácidos. Presencia de burbujas en la campanita Durham, producción de gases.

La producción de ácidos se pone de

manifiesto con un indicador ácido-base

(Púrpura de Bromocresol) y la de gases

con una campanita Durham (tubo

cerrado por uno de sus extremos que se

coloca invertido en medio de cultivo)

Negativo Producción de

ácidos. Gases(-)

Producción de

ácidos y gases

Reducción de Nitratos y Nitritos

En esta prueba se detecta una respiración anaerobia: la que utiliza nitrato como aceptor final de electrones. Los nitratos se reducen a nitritos y algunas bacterias reducen los nitritos a productos gaseosos ( N2 y N2O). Las enzimas responsables de ambas reducciones se denominan nitrato y nitrito reductasa, respectivamente

Reactivos: (soluciones en ácido acético de

α-naftilamina y ácido sulfanílico) y zinc.

Negativo Positivo

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Método de KliglerPermite un diagnóstico rápido orientativo del tipo de Enterobacteria aislado. LasEnterobacterias más patógenas no suelen fermentar la lactosa. Se detecta laproducción de ácidos (acompañada o no del desprendimiento de gases) de glucosao lactosa y producción de SH2.

Reactivos: indicador Rojo de Fenol, el cual vira

al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato

de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el

que reacciona luego con una sal de hierro

proporcionando el típico sulfuro de hierro de

color negro.

Lac (-)

SH2(+)

Lac+) Lac (-) Lac (-)

TSI Agar (Agar Hierro Triple Azúcar)

Método Diferencial para la diferenciación de Enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, sacarosa y producción de SH2 (Rojo Fenol: indicador)

Base ácido (amarillo): Glucosa fermentada.

Pico ácido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa

fermentada.

Base ácido (amarillo): Glucosa fermentada.

Pico alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no

fermentada

Base alcalino (rojo) y pico alcalino (rojo): Ninguno de los tres glúcidos es

fermentado

Un ennegrecimiento en el medio

indica la producción de SH2

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LIA Agar (Lisina Hierro Agar)Utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella sp., basado en la descarboxilación/desaminación de lisina, y en producción de ácido sulfhídrico (Indicador: Púrpura de bromo cresol). Más sensible que el TSI

A: Reacción ácida. Color amarillo

K: Reacción alcalina. Color violeta

R: Reacción alcalina: color rojo

K/K: Descarboxilación lisina

K/A: Fermentación glucosa. Descarboxilación

lisina

R/A: Desanimación lisina. Fermentación glucosa

Medio SIM (Sulfuro, Indol, Movilidad)Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. (Reactivo de Kovac´s)Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

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Muchas Gracias por su Atención