UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

QUÍMICA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

TEMA: Producción de un Biofertilizante a partir de cepas Azotobacter spp. Aisladas de plantaciones de Stevia Rebaudiana Realizado por:

Andrade Ma. José Correa Carina Cueva Patricia Jácome Rafael Simba Saskia Tufiño Carolina

20091 

 

ÍNDICE …………………1. INTRODUCCIÓN……………………………… ……… 3

2. OBJETIVOS………………………………………………………………… 4 2.1 General……………………………………………………………… 4 2.2 Específicos………………………………………………………… 4

3. MARCO TEÓRICO………………………………………………………… 4

3.1 Stevia Rebaudiana…………………………………………………… 4 3.2 Biofertilizante………………………………………………………… 4 3.3 Fermentación discontinua…………………………………………… 5 3.4 Factores de crecimiento……………………………………………… 5

3.4.1 Oxígeno……………………………………………………………… 5 3.4.2 Temperatura……………………………………………………….. 5 3.4.3 pH…………………………………………………………………… 5

3.5 Bacterias fijadoras de nitrógeno……………………………………… 5

4. MARCO METODOLÓGICO…………………………………………………… 6

4.1 Muestreo del Suelo ………………………………………………………… 6 4.1.1 Procesamiento de muestras……………………………………… 6 4.1.2 Medición de pH de las muestras del suelo…………………… 7

4.2 AISLAMIENTO………………………………………………………………… 7

4.2.1 Aislamiento primario……………………………………………… 7 4.2.2 Aislamiento secundario…………………………………………… 7 4.2.3 Pigmentación de los aislamientos………………………………. 7

4.3 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA……………………………………………… 8

4.4 CONSERVACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS MEDIANTE LA

TÉCNICA DE CRIO PRESERVACIÓN EN GLICEROL AL 50% (V/V)……… 8

4.5 SELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO………………………………………… 8

4.5.1 Formulación del medio de cultivo alternativo (ca)……………… 9

4.6 PRODUCCIÓN DE BIOFERTILIZANTE A NIVEL DE LABORATORIO…… 9

4.6.1 Reactivación de las cepas bacterianas…………………………… 9 4.6.2 Obtención del pre inóculo…………………………………………… 9 4.6.3 Fermentación discontinua………………………………………… 10

4.7 EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO………………………… 10

4.7.1 Determinación de la concentración de biomasa……………… 10 4.7.2 Evaluación del consumo de glucosa…………………………… 11 4.7.3 Evaluación de la variación de pH………………………………… 11 4.7.4 Evaluación de la temperatura del caldo de cultivo…………… 11

4.8 VIABILIDAD DEL PRODUCTO EN CONDICIONES DE LABORATORIO…… 12

4.9 TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS………………………………………………… 12

4.9.1 Tinción gram…………………………………………………………… 12 4.9.2 Prueba de quiste……………………………………………………… 12 4.9.3 Peso seco celular (pcs g/ml)………………………………………… 12

4.10 ANÁLISIS DE DATOS………………………………………………… 12

5. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………… 13

2  

1. INTRODUCCIÓN

s fijadoras de nitrógeno para emplearlas en un programa de fertilización bajo un esquema de agricultura

diana. La bacteria encontrada fue Azotobacter y su rendimiento se determinó con base en la producción de

entación, ón de A/A

En la India ímic y un b ertilizante en una plantación bacterias de rillum, y los resultados omasa en un 53,20%. La

c emostró el umento de glucósidos en la planta. [2]

miento de sorción más alto brasilense y

Rhi mente 20 mg N/ i una gran fuente p r ner un natural reduciendo el uso de los fertilizantes químicos nitrogenados,

ofreciendo una may ctividad. El q inina s de acelerar y

ros, sustancias f bilización de fosfatos y oligoelementos

El uso de fert teriorando la calidad de lo y suavizando los

an el ecosistema natural d suelo desarrollando plantas más vulnerables. La tierra stos de

80 por sacos de 19Kg, este o aci E rógeno,

cultivo de

En la Universidad Javeriana se realizó una investigación sobre el aislamiento de bacteria

orgánica. El aislamiento se realizó a partir del suelo de un cultivo de Stevia Reubau

biomasa y concentración de glucósidos en la planta presentando mejor estabilidad, pigmmayor velocidad de crecimiento 0,1405 h-1 fase exponencial de 18 horas y una produccipromedio de 38,4 mg/ml a las 150 horas. [1]

se realizaron estudios para comparar un fertilizante qu o iofde Stevia, mediante mediciones de fósforo soluble con Azospi

emuestran una eficiencia incrementando la producción de bidquímica inorgánica del biofertilizante cambio favoreciendo el cre imiento mas no se da El Azotobacter es el género que ha demostrado tener el rendi ab(72.64%) a nivel de la rizosfera comparado con microorganismos como Azospirillum

zobium analizados también para la elaboración de biofertilizantes, fijan aproximadag de azúcar en un cultivo de Stevia en medio libre de n trógeno, siendo

a a obte biofertilizante tienen mayor velocidad de crecimiento que otras cepas aisladas de cultivos diferentes

or produ

zotobacter produce fitohormonas (ácido indolacético y cito u s) capaceapotenciar el crecimiento de las plantas; promueve la formación de siderófoanti úngi s y genera enzimas que favorecen a la solufacilitand

cao la asimilación de estos compuestos.

ilizantes químicos constituye un daño biológico a los suelos de

s mismos: inducen el aumento de acidez y salinidad eliminando el humus tejidos de la planta provocando que ésta sea menos resistente y saludable, elimin

e

se hace dependiente a los químicos incrementando los daños al suelo y los cofertilización. Actualmente un fertilizante químico nitrogenado se comercializa en $3

a costo es alto por la energía que se utiliza para su elab r ón.

l objetivo de la presente investigación es realizar el aislamiento de una cepa fijadora de nitAzotobacter, que pueda ser empleada para la producción de un biofertilizante en el Stevia re audiana, mediante fermentación discontinua. b

a. 33.5 e M

MBtu 1 T amoniaco anhidro. Costo d 1 B = 2.20 a 5.00 USD Costo de 1 T amoniaco anhidro = 200 USD

tu

3  

2. OBJETIVOS

cer el más adecuado para una producción a nivel

eae), nativa de regiones subtropicales y opicales de América del Sur y América Central. La especie Stevia rebaudiana Bertoni, conocida omúnmente como dulce hoja, o, simplemente, stevia, es ampliamente cultivada por sus hojas

.2 Biofertilizante

en forma natural con las raíces de las lantas, beneficiando su crecimiento y el rendimiento de los cultivos. os microorganismos contribuyen con el crecimiento de las plantas y el rendimiento de los cultivos,

pero para que éstos sean beneficiados es indispensable que las bacterias u hongos se encuentren er varios millones de bacterias por gramo de soporte sólido o

. Una vez que la semilla germina y las raíces empiezan a desa rán y colonizarán la superficie de las raíces y promoverán el crecimiento de las plantas.

2.1 General

Producir un biofertilizante con cepas Azotobacter spp aisladas de cultivos de Stevia Rebaudiana mediante fermentación discontinua.

2.2 Específico

Aislar, seleccionar y preservar la bacteria Azotobacter spp de muestras de cultivos de Stevia Rebaudiana proveniente de la agrícola El Edén, en el agar ashby.

Evaluar el crecimiento de Azotobacter spp en caldo pikovskaya modificado y caldo alternativo con melaza y estableindustrial.

Producir biomasa de la cepa escogida de Azotobacter spp ofreciéndoles las condiciones óptimas para su crecimiento.

Elaborar un bioreactor para la producción del biofertilizante utilizando fermentación discontinua.

Controlar el desarrollo del bioproceso mediante los parámetros: pH, temperatura y concentración de oxígeno.

3. MARCO TEÓRICO

3.1 Stevia Rebaudiana Es un género de plantas fanerógamas perteneciente a la familia de las asteráceas. Son hierbas y arbustos de la familia del girasol (Asteractrcdulces. Como un sustituto del azúcar. 3 Los biofertilizantes se caracterizan por la presencia de microorganismos vivos que no causan daño o enfermedad al hombre, a los animales ni a las plantas. Pueden emplearse bacterias u hongos microscópicos, llamados micorrízicos, que se asocianpL

vivos. El biofertilizante debe contenpor m osoililitro, en caso de ser acu

rrollarse, las bacterias se multiplica

4  

3.3 Fermentación discontinua Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el

o, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de

sa y la concentración de metabolitos cambia generalmente de las células observándose las cuatro fases típicas de

recimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte. rocesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase

tabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos

no

importante para el metabolismo microbiano y el anhídrido

Una vez disuelto el O2 éste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a cada célula individual.

3.4.2 Temperatura

Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptima tienen retardado su crecimiento y por lo tanto reducida la producción celular, es decir su productividad. Por otro lado, si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrés al

consiguiente producción de proteasas celulares que ocasionan una isminución en el rendimiento de los productos proteicos.

etabolitos celulares son liberados al medio, lo que puede riginar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de ultivo y añadir un ácido o una base cuando se necesite para mantener constante el pH. Por

dición del ácido o base debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el H del medio de cultivo sea el mismo en todo el fermentador.

eno pasa a la planta, y pueden observarse niveles elevados de roteína en la planta. Este nitrógeno elevado no se libera al suelo hasta que muere parte de la lanta, o se exuda al suelo en la rizósfera.

microorganism

aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomacomo resultado del metabolismo cEn los plogarítmica (mesecundarios). 3.4 Factores de crecimiento:

3.4.1 Oxíge El oxígeno es el sustrato gaseoso máscarbónico es el producto metabólico más importante. El oxígeno no es un gas muy soluble ya que una solución saturada de oxígeno contiene aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua. Debido a la influencia de los ingredientes del cultivo, el contenido máximo de oxígeno realmente es más bajo de lo que debería ser en agua pura. El suministro se logra pulverizando aire en el fermentador durante el proceso.

choque térmico con la d

3.4.3 pH

La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante el crecimiento en un fermentador, los mocsupuesto que esta ap 3.5 Bacterias fijadoras de nitrógeno Las bacterias fijadoras de nitrógeno son componentes muy importantes del suelo. Para desarrollar la fertilidad del suelo, debe aumentar el contenido de nitrógeno. En las condiciones medioambientales adecuadas, las bacterias fijadoras de nitrógeno producen enzimas que toman el nitrógeno en su forma gaseosa de la atmósfera, y, con los azúcares que obtienen de la planta, fijan el nitrógeno dentro de la biomasa bacteriana. Si las bacterias satisfacen sus necesidades de nitrógeno, entonces, el nitrógpp

5  

Se dividen en dos grandes grupos: las simbióticas especificas de las leguminosas como el hizobium y las libres que viven en el suelo y no necesitan la planta para su reproducción como el

s de acelerar y

su enriquecimiento en nitrógeno y a su regeneración de forma ecológica y gradual, cluso en terrenos de alta concentración salina. ) Se ha comprobado que fertilizando los cultivos con estas bacterias y con nitrógeno químico en n porcentaje entre el 20 y 50% del utilizado normalmente, se consigue un aumento de producción

nicamente con fertilizante químico al 100%. Esto es debido a que, l liberarse la bacteria de su función fijadora de nitrógeno, produce más factores de crecimiento

vegetal cano, esto puede suponer el ahorro del abonado de cobertera. ) Crea una barrera protectora contra hongos y bacterias patógenas en la raíz de la planta, por lo

anterior, es un mayor desarrollo de las raíces de las plantas, con

) También se ha comprobado un mayor índice de germinación de semillas comparada con otros sistemai) Las s estirpes de Azotobacter y Azospirillum son capaces de fijar un 72,64% más de

a N2 + 16 ATP + 8e-+ 8H+ nitrogenasa 2NH3 + 8H2 + 16 ADP+ 16 P

e cada cultivo de Stevia se toman cinco muestras de 500g a una profundidad de 10 a 15 cm, el uestreo se realiza en forma de zig –zag a lo largo del cultivo.

de papel que se colocan dentro de bolsas de plásticos erméticas y posteriormente se transportan en coolers.

RAzotobacter y el Azospirillum, entre los más importantes en agricultura. El Azotobacter y el Azospirillum, en concentraciones adecuadas, pueden sustituir al nitrógeno químico (urea, amoníaco) sin disminuir la producción y a menor coste. Otras ventajas comprobadas del uso de estas bacterias como biofertilizante son: a) Producen fitohormonas, como el ácido indolacètico y las citoquininas, capacepotenciar el crecimiento de las plantas. b) Al permanecer vivas durante años y reproducirse en el suelo, no sólo no lo degradan sino que contribuyen a incusobre las cosechas obtenidas úa

, En cereales de sedque ésta crece más sana y fortalecida. e) Producen enzimas que solubilizan los fosfatos y los hacen más accesibles a la planta, así comofactores que facilitan la absorción de oligoelementos. f) Se ha demostrado que resisten mejor las condiciones de sequía y los climas áridos ya que se forman alginatos en las raíces de las plantas. g) Como consecuencia de todo loel consiguiente beneficio general para ésta, así como el peso de los frutos. h

s de abonado. nueva

nitrógeno atmosférico, que las estirpes originales. Hay pues un cúmulo de ventajas para el usuario, económicas, ecológicas, A corto, medio y largo plazo en la progresiva sustitución de la fertilización química por las bacterias naturales, totalmente inofensivas para el medio y el ser humano. L

4. MARCO METODOLÓGICO

4.1 MUESTREO DEL SUELO

DmLas muestras se empacan en bolsash

4.1.1 Procesamiento de muestras

Una vez en el laboratorio, las muestras de suelo se tamizan en un tamiz estándar de 4.75 mm, con el fin de obtener gránulos uniformes, para realizar el aislamiento primario.

6  

4.1.2 Medición de pH de las muestras del suelo

La medición del pH se realizan siguiendo el protocolo descrito por Van Lierop, 1981; se coloca en n frasco de vidrio limpio suelo tamizado y agua destilada en proporción 1:1 p/v. Posteriormente, la

ediciones en cada cultivo.

los diferentes cultivos, se realiza el aislamiento

aerobias

dos x100) y se realiza coloración de gram.

B) Gránulos mucilaginosos después de la incubación

4.2.2 Aislamiento secundario

El aislamiento secundario o en cajas con Agar Ashby – obtenidas en el aislamiento primario. Las cajas son incubadas por e observa el crecimiento en el medio selectivo Ashby – Sacarosa,

.2.3 Pigmentación de los aislamientos

. La siembra se realiza mand una colonia de cada aislamiento y realizando una estría en toda la caja, se incuba a 28°C

por 7 dí y se observa pigmentación.

ususpensión se deja precipitar durante 5 min y se toma el valor de pH del sobrenadante con un potenciómetro. Los valores de pH del sobrenadante a partir de cuatro m 4.2 AISLAMIENTO

4.2.1 Aislamiento primario

A partir de cada muestra de suelo obtenida enprimario por triplicado, empleando la técnica de gránulos de suelo; que consiste en colocar 20 gránulos en cajas de Agar Ashby – Sacarosa (medio especifico para Azotobacter spp) a una distancia aproximada de 1 cm. Las cajas se incuban a 28°C por 7 días hasta observar alrededor de los gránulos colonias translucidas y mucilaginosas. Se realiza el recuento de gránulos con colonias, con el fin de obtener el porcentaje de recuperación de bacterias diazótrofasasimbioticas para cada cultivo (% de recuperación = No. de gránulos con colonias mucilaginosas/total de gránulos sembra

A) Siembra de gránulos en agar Ashby

se realiza mediante siembra por agotamientSacarosa a partir de las colonias7 días a 28°C, posteriormente sla morfología de la colonia y de las células por medio de la coloración de Gram. Las cepas aisladas que presenten crecimiento en el segundo aislamiento se codifican de acuerdo al cultivo de donde fueron aisladas.

4

Con el fin de observar la producción de pigmentos en medio solido, de cada aislamiento se realiza una siembra en agar diferencial Ashby con 5 g/l de benzoato, remplazando la fuente de carbono sacarosa) en cajas petri para observar la pigmentación en las colonias(

to o as

7  

en estria en agar Ashby con benzoato

del medio como

ares sin sembrar.

B) Baterias bioquímicas servidas en tubos de 13 * 100

viales de 1.5 ml de 50 % V/V de glicerol puro estéril. Luego se mantiene en ongelación a -80°C.

5 SELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

Siembra

4.3 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA A cada aislamiento se le realiza una caracterización con base en el comportamiento bioquímico frente a la fermentación de glucosa, maltosa, manitol y ramnosa también se realiza una prueba de asimilación y crecimiento en benzoato como fuente de carbono, test de catalasa, oxidasa y desnitrificación en caldo nitrato. La bacteria de azucares se siembra con una colonia de cada cepa, e lleva a incubar a 28°C por 24 horas. Posteriormente se verifica la acidificación s

indicativo de la fermentación de azúcares y benzoato. Finalmente se realiza la prueba de Nessler para determinar la desnitrificación, y las pruebas de catalasa y oxidasa a partir de las colonias. Todas las pruebas bioquímicas se realizaron por triplicado.

Baterias bioquímicas de azúc

A) Baterias bioquímicas servidas en placas de 24 pozos

4.4 CONSERVACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS MEDIANTE LA TÉCNICA DE CRIO PRESERVACIÓN EN GLICEROL AL 50% (V/V) A partir de las cepas aisladas y evaluadas se realizan cultivos en erlenmeyer de 100 ml con 50 ml de caldo nutritivo, el cual se incuba a 28°C por 24 Horas con agitación de 150 rpm. El cultivo se deposita en 10 c

4. En el caso de Azotobacter, existen una variedad de medio de cultivo químicamente definidos, recomendados por la literatura entre ellos se encuentra además del Agar Ashby el caldo Pikovskaya modificado; sin embargo, el medio de cultivo que se utilice en la fermentación no solo

8  

debe cumplir con las necesida stión, sino también con las exigencias del proceso de El caldo Ashby es un m debido a que no contiene nitrógeno. Su ventaja es q ento es lento, es observable a partir de los 3 – 5 días de mayor gasto de energía para la producción. El caldo Pikovskaya modificad cimiento rápido de las bacterias y requiere un gaEn ambos casos se nece costo alto adecuado solo para producciones pequeñas a ula un medio de cultivo alternativo a base de melaza tomando al caldo Pikovskaya modificado como patrón.

4.5.1 Formulación del medio de cultivo alternativo (ca)

la composición de la melaza y se procedió a sustituir los

4.6 PRODUCCIÓN

4.6.1 Rea

Para reactivar a l uido, ideal para el crecimiento de tubos de ensayo (5 ml/tubo) y se este dre bajo condiciones de esterilidad y se incu

4.6.2 Obte

ara la preparación del pre inoculó se toman en cuenta los siguientes requisitos:

un control permanente de cultivo mediante la

no durante 30 horas que es el tiempo estimado que tarda en alcanzar la fase xponencial. Se procura obtener preinóculos con una concentración de biomasa del orden de 108-

des nutritivas del microorganismos en cueproducción (costo y eficiencia) del mismo. edio de cultivo selectivo para Azotobacter ue al ser un medio selectivo el crecimi

realizada la siembra lo que implica un

o es un medio no selectivo pero permite el cresto de energía menor sitan reactivos químicos que implican un escala de laboratorio, por este motivo se form

e partió de un estudio químico de S

componentes del medio químicamente definido (CPM), por el medio natural, que constituye un medio adecuado para el crecimiento de microorganismos. Se toma como base la fuente de carbohidratos y proteínas (carbono y nitrógeno), garantizando el contenido requerido por la bacteria, según el caldo Pikovskaya modificado. Una vez obtenida la concentración teórica de melaza necesaria para sustituir los componentes del medio químico se realizan pruebas de crecimiento a nivel laboratorio, para ello se siembran cepas de Azotobacter spp en CA sólido utilizando concentraciones menores y mayores a la obtenida teóricamente. Las siembras se realizan por triplicado.

DE BIOFERTILIZANTE A NIVEL DE LABORATORIO

ctivación de las cepas bacterianas

as bacterias se utiliza el caldo Pikosvskaya modificado liq Azotobacter spp. El caldo correctamente preparado se vierte en

riliza. Luego se inocula cada tubo con la cepa maba a 30°C por 24 horas.

nción del pre inóculo

P 1.- El cultivo debe estar metabólicamente activo y libre de contaminantes. Para ello se trabaja bajo normas estrictas de esterilidad y se realiza observación directa al microscopio de las características del microorganismo utilizando técnicas microbiológicas. 2.- El inoculo debe estar en su fase exponencial (grado máximo de desarrollo). Para ello se evalúa el crecimiento bacteriae109 células/ml. 3.- Se debe disponer de una cantidad de cultivo suficiente para inocular el volumen de medio liquido a utilizar en la fermentación, el cual debe estar entre el 3 – 10 % del volumen total a fermentar. En este caso se trabaja con un volumen equivalente al 10% del volumen total a fermentar.

9  

Procedimiento Con las cepas reactivadas anteriormente se realiza un pool bacteriano. 10 ml de pool se inoculan en 90 ml de caldo Pikovskaya modificado (10% de volumen total a fermentar) y otros 10 ml en 90 ml de caldo alternativo, obteniéndose un volumen final de 100 ml de cultivo por cada caldo de fermentación. Posteriormente se incuban a 30°C por 24 horas y 150 rpm en matraces de 250 ml.

uego son cubados a una temperatura promedio de 28°C por 72 horas. El oxigeno se suministra utilizando

un aireador para pecera con un flujo de aire aproximado de 1 m3 /h en matraces de 2000 ml.

l esquema del proceso global de producción de Azotobacter spp a nivel de laboratorio

na serie de corridas cinéticas en las que se evalúa la variación de pH, la mperatura del caldo de cultivo y la concentración de biomasa. Además se evalúa el consumo de

4.7.1 Determinación de la concentración de biomasa

bsorbancia. Además se realizan conteos de colonias en caja para determinar las unidades formadores de colonias por litro.

4.6.3 Fermentación discontinua

Una vez obtenidos los preinóculos, estos se inoculan en 900 ml de CPM y 900 de CA. Lin

E Inóculo 

Preinóculo CO2O2

10ml   100ml 1000ml de biofertilizante 

Cepas reactivadas

90 ml de caldo de cultivo. Se incuban con agitación de 150 rpm a 30  ºC por 

90 ml de caldo de cultivo. Se incuban con aireación aprox. De 1 m3 / h a 

24 horas en un matraz de  28ºC por 72 Horas   250 ml.

4.7 EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO Se ha realizan utesustrato en CPM con lo que se puede obtener las variaciones cinéticas de crecimiento. Las muestras se toman casa tres horas durante las 72 horas que dura la fermentación. Este procedimiento se realiza tres veces. Se utiliza la técnica de determinación de biomasa por densidad óptica para el CPM y la determinación del Peso seco para el CA, debido a que por el color de la melaza es imposible de medir la a

10  

Se mide la abso uestra a 540 nm y luego se obtiene la concentración de biomasa n gramos por litro utilizando la curva de calibración de absorbancia en función de peso seco para

glucosa

rbancia de cada meAzotobacter. Se utiliza medio estéril como blanco. Para el conteo de bacterias en caja se realizan diluciones de 10-1 a 10-9 y se siembran en CPM sólido. Cada dilución se realiza por duplicado.

4.7.2 Evaluación del consumo de

Para determinar el uso de glucosa se utilizo la técnica de DNS que se basa en el uso de 3,5 – dinitrosalicilico para provocar la oxidación de los azucares y, al mismo tiempo, se propia reducción, desarrollándose la siguiente reacción:

ó

. 3,5 ó

3 , 5

egún lo anterior, una mole de azúcar reacciona cido dinitrosalicilico, dando lugar una relación estequiométrica que permite cono ares reductores presentes en tra. Esta reac ede ser leída ctrofotómetro ya que da lugar

reacción colomet o 3,5 – din marillo cambia al acido 3 – am 5 sali oscu ya intensidad es proporcional a la

d d ares

ga cada mu min a 5000 se recupera el sobrenadante en

para proteger de la luz y se oloca 0.25 ml de sobrenadante con 0.25 ml de reactivo 3,5 DNS en cada uno. Además se prepara n b l que s l rea s a ebullición por 5

terior con gan 2.25ml de agua estilada en cada tu a a 546 on el blanco. El blanco e coloca 2.75 ml de olumen.e utiliza la curva d ia en fun a obtener concentración sidual de sustrato en gram ro.

4.7.3 Evaluación de la variación de pH

inar la variación del mismo durante la

a tem el proceso de producción del entación.

S con una mol de a

cer cantidfácilmente al

a ad de azucespela mues

a una ino,

cantida

Se centrifu

ción además puricas el acid

cílico de un coloreductores

Procedimiento

estra por 10ran tubos de

itrosalicilico de colro – marrón, cu

rpm. Posteriormentedos con aluminio

or a– nitro e azuc

r pardo

tubos limpios. Se prepa ensayos forracu lanco a

inutos y pose le coloca únicamente emente se frena la reacciónbo y se lee la absorbanci agua para completar el v

e calibración de absorbancos por lit

ctivo. Se llevaron los tubo hielo. Finalmente se agre

nm ajustando a cero c

ción de glucosa par

mdsSre De cada muestra tomada se mide el pH para determfermentación, para ello se utilizo un potenciómetro previamente calibrado. 4.7.4 Evaluación de la temperatura del caldo de cultivo L peratura del caldo de cultivo se mide durante todobiofertilizante utilizando para ello un termómetro acoplado al equipo de ferm

11  

4.8 VIABILIDAD DEL PRODUCTO EN CONDICIONES DE LABORATORIO Para determinar la viabilidad del producto se almaceno el producto terminado en envases plásticos

ada semana se evalúa el estado del producto mediante observación directa al microscopio. Se valúa la población microbiana, la actividad y la contaminación por un periodo establecido de empo. Además se deben realizar conteos de colonias en caja con el medio Ashby como medio de ultivo s

4.9.1 Tinción gram - Se preparan- Se cubre el f

Se lava el fro gol durante

4.9.2 Prueba de quiste

mulsionado con agua estéril

l.

.10 ANÁLISIS DE DATOS

esiones lineales con el objetivo de determinar la ndencia del crecimiento bacteriano en ambos medios de cultivo.

cerrados y se los coloca en refrigeración (4ºC) bajo condiciones higiénicas para evitar la contaminación Cetic electivo 4.9 TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

frotis del cultivo. Se secan al aire y se fijan al calor. rotis con el reactivo cristal violeta durante un minuto. tis con agua durante 5 segundos, y luego se aplica el reactivo yodo de Lu-

un minuto. - Se lava y se aplica el decolorante. - Se lava y se cubre con el reactivo de Safranina durante 30 segundos. - Se lava, se seca y se coloca en el microscopio. - Se coloca un asa del cultivo en un portaobjetos, e

Se agrega una o dos gotas de Yodo Lugol y se fija al aire. - - Se coloca al microscopio con aceite de inmersión. 4.9.3 Peso seco celular (pcs g/ml) - Se toma 5 ml de cada dilución y de elimina en el horno el sobrenadante. - Se pesa la biomasa seca y se obtiene el PCS en gr/m 4 Para analizar los datos obtenidos se utilizan regrte

12  

13  

belonline.net/UserFiles/File/7kdas.pdf

] http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema12MI.html

]http://www.google.com.ec/search?hl=es&rlz=1R2ADBF_es&q=bacterias+fijadoras+de+nitrogeno+fijadoras

5. BIBLIOGRAFÍA

[1] http://www.javeriana.edu.co/universitas_scientiarum/articulos/produccion_biofertilizante.pdf

[2] http://www.no [3 [4&meta=&aq=0&oq=bacterias [5] http://jb.asm.org/cgi/reprint/77/1/86.pdf