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INFORME TÉCNICO
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN: 20050771
PRODUCCIÓN DE EDULCORANTES POR BIOCONVERSIÓN
DR. ENRIQUE DURÁN PÁRAMO
UPIBI-IPN RESUMEN La industria de alimentos representa un sector económico importante a nivel
mundial. Dentro de los insumos relacionados con dicha industria se encuentran los
edulcorantes que son utilizados como aditivos para la preparación de
formulaciones alimenticias. Los jarabes con alto contenido en fructosa o en
glucosa producidos por bioconversión son utilizados en la industria de refrescos,
de panificación y de confitería.
El presente proyecto de investigación está relacionado con la producción de
edulcorantes a partir de soluciones concentradas en sacarosa, por medio de su
bioconversión utilizando la enzima invertasa en solución e inmovilizada. Es
necesario mencionar que, si bien la materia prima para la producción de
edulcorantes es propiamente un edulcorante también, los productos de la
bioconversión permiten obtener un mayor poder edulcorante buscado por la
industria de los alimentos.
El proceso a desarrollar involucra la conversión de sacarosa en glucosa, fructosa y
otros azúcares, obteniéndose una mezcla de azúcares con un poder edulcorante
mayor al de la sacarosa.
El proyecto de investigación comprende la caracterización cinética de la
bioconversión tanto con enzima libre como inmovilizada. Se seleccionará el
método de inmovilización más conveniente y posteriormente los soportes de
inmovilización que se utilizarán.
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son catalizadores biológicos (proteínas), entre sus características se
encuentra la capacidad de acelerar ciertas reacciones químicas. Su importancia
ha ido en aumento en los últimos años, ya que están presentes en procesos
industriales destinados a la producción de fármacos, aditivos, detergentes,
bebidas, por mencionar algunos casos. Recientemente se emplea e industrias tal
como la cervecera enzimas inmovilizadas, con la finalidad de reutilizar el
catalizador y poder incrementar la productividad.
El presente proyecto involucra el uso de la enzima invertasa en la producción de
jarabes, que pueden ser empleados por la industria refresquera. La cual
actualmente emplea jarabes altamente fructosados, obtenidos del maíz y que se
caracterizan por ser más dulces y económicos en comparación con el azúcar de
caña.
Se utilizará la enzima inmovilizada con la finalidad de reutilizar el catalizador, y
evaluar el efecto sobre la productividad. Misma que será comparada con la
obtenida empleando la enzima en forma libre. El sustrato a emplear es la
sacarosa. Cabe mencionar que se evaluará que método de inmovilización se
empleará para inmovilizar la enzima.
JUSTIFICACIÓN
En la actualidad en nuestro país, el azúcar de caña atraviesa por una situación
crítica, ya que ha sido sustituida por jarabes fructosados, los cuales además de
ser más económicos que el azúcar de caña también tienen un poder edulcorante
mayor. Estos jarabes se importan, ya que se elaboran a partir de los grandes
excedentes de maíz que son subsidiados por el gobierno de Estados Unidos.
Como una alternativa a esta situación, se propone el empleo de la bioconversión
enzimática en la elaboración de jarabes fructosados empleando como sustrato el
azúcar de caña (sacarosa). Mismos que pueden ser empleados como materia
prima en la producción de refrescos o confitería, por mencionar algunas
aplicaciones.
OBJETIVOS:
GENERAL
- Producción de edulcorantes por bioconversión.
ESPECÍFICOS
- Caracterización cinética de la hidrólisis de soluciones de sacarosa para la
producción de glucosa y fructosa utilizando invertasa libre.
- Caracterización cinética de la hidrólisis de soluciones de sacarosa para la
producción de glucosa y fructosa utilizando invertasa inmovilizada.
MARCO TEÓRICO
La sacarosa representa el 60 a 80 % de los edulcorantes y el 30 % de los
carbohidratos usados como edulcorantes consumidos por el hombre. Su costo es
generalmente bajo y es simple su producción y pureza. Su concentración en la
caña de azúcar es alta (16 - 18 %). Sus propiedades físicas de caramelización, su
higroscopía comparativamente baja y su estabilidad en muchos procesos para
alimentos le hacen ser ideal como edulcorante en muchos alimentos, bebidas y
productos de confitería. La sacarosa es también un preservante efectivo en la
leche condensada dulce, donde inhibe el crecimiento bacteriano y de mohos como
resultado de la presión osmótica en soluciones de alta concentración. Este azúcar
también desarrolla el color en las carnes curadas, y favorece la conservación de
las carnes durante su curado.
La sacarosa es un disacárido compuesto por una molécula de glucosa (dextrosa) y
una de fructosa (levulosa). Es dextrógira o dextrorrotatoria, lo cual significa que
gira a la derecha +66,5° el plano de la luz polarizada. Al calentar en un medio
ácido o por acción de la enzima invertasa se descompone para formar (+) D-
glucosa y (-) D-fructosa, una mezcla de mayor dulzura que gira a la izquierda -20°
el plano de la luz polarizada (levógira, levorrotatoria), invirtiéndolo de derecha a
izquierda y por eso se llama azúcar invertido y al proceso inversión o hidrólisis. La
sacarosa se obtiene a partir de la caña de azúcar o de la remolacha azucarera. Es
estable al aire pero en polvo se torna higroscópica, absorbiendo hasta el 1% de
humedad. Es fermentable pero a concentraciones altas (aproximadamente 17%)
resiste a la descomposición bacteriana. Es el principal endulzante utilizado por el
sabor excelente que imparte. También se utiliza como preservante, antioxidante,
excipiente, agente granulador y tensoactivo en jabones, productos de belleza y
tintas.
Industria de edulcorantes
El hombre siempre ha sido atraído por el sabor dulce; quizá éste, fue uno de los
métodos que empleo el hombre primitivo en la selección de alimentos seguros.
Probablemente el primer edulcorante empleado como tal fue la miel de abeja. Los
azúcares representan la forma mas común y conocida de los edulcorantes,
ampliamente distribuidos en la naturaleza se encuentran en frutas, vegetales,
miel y leche. Son también las unidades de que están constituidos carbohidratos
más complejos (polisacáridos): almidón, celulosa, pectina, glucógeno, aparecen
igualmente en moléculas orgánicas simples y complejas como el ADN, las
glicoproteínas, etc.
Todos los carbohidratos deben ser desdoblados hasta azúcares simples
(monosacáridos), para poder ser asimilados siendo la glucosa y la fructuosa los
mas comunes.
La sacarosa o azúcar de mesa es el azúcar más conocido en la industria y el
hogar. Existe una confusión fuera del ámbito académico, ya que a la sacarosa
se le ha conocido siempre con el término de azúcar. La melaza, el piloncillo y la
azúcar morena no son más que diversas formas de presentación de la sacarosa o
subproductos de su procesamiento. A partir de los sesenta en los países
desarrollados se han venido implementando procesos industriales, en su mayoría
biotecnológicos, para la elaboración de edulcorantes calóricos (consisten en
azúcares y alcoholes del azúcar, contienen calorías como la sacarosa) y no
calóricos (son químicamente un grupo muy heterogéneo y todos ellos tienen en
común un intenso sabor dulce y no contienen suficiente energía), que han
modificado la estructura de este mercado. Esta situación a traído graves
consecuencias a los países para los que las exportaciones de azúcar de caña
constituyen una entrada importante de divisas y ha sido un factor determinante en
las fluctuaciones del precio internacional del azúcar de caña.
Dado el aporte de la biotecnología en este sector, en función del su origen, es
necesario distinguir la clasificación de los edulcorantes: naturales, químicos,
biotecnológicos y químico biológicos. La industria del azúcar es hoy el consumidor
más grande de enzimas industriales. En particular, son usadas para la
producción de glucosa y azúcar invertido de sacarosa como para la isomerización
de glucosa a fructosa. El interés en enzimas inmovilizadas por éstos y los otros
procesos en la industria del azúcar son importantes, este interés ha resultado en el
desarrollo de algunos procesos comercializados que involucra enzimas
inmovilizadas.
Las enzimas son proteínas que aceleran las reacciones termodinámicamente
posibles en los seres vivos. La mayoría de las enzimas son de origen globular. La
sacarosa es hidrolizada a fructosa y glucosa por una enzima, que se conoce con
el nombre de invertasa. Esta reacción se puede representar de la siguiente
manera:
sacarosa + agua ↔ glucosa + fructosa + agua
invertasa
En muchos casos se usan enzimas en la industria alimentaría para incrementar los
efectos deseables. Se pueden usar enzimas de distinto origen ya sea animal,
vegetal o microbiano.
Invertasa
La enzima invertasa provoca la inversión de la sacarosa; la hidrólisis de sacarosa
para producir fructuosa y glucosa, aumentando la solubilidad de la solución y
obteniéndose un sabor mas dulce.
El nombre oficial para el invertasa es el beta-beta-fructofuranosidasa, la invertasa
se utiliza principalmente en la industria del alimento (confitería) donde la fructosa
se prefiere sobre la sucrosa porque es más dulce y no se cristaliza como
fácilmente. Sin embargo, el uso del invertasa es algo limitado porque otra enzima,
isomerasa de la glucosa, se puede utilizar para convertir la glucosa a la fructosa
más económicamente. Por razones de la salud y del gusto, su uso en sector
alimenticio requiere que la invertasa esté purificada altamente.
Una amplia gama de microorganismos produce el invertasa y puede, así, utilizar la
sucrosa como alimento. Comercialmente, la invertasa es biosintetizada
principalmente por las tensiones de la levadura del saccharomyces cerevisiae o
del Saccharomyces carlsbergensis. Incluso dentro de la misma cultura de la
levadura, la invertasa existe en más de una forma. En contrario a la mayoría de las
otras enzimas, la invertasa exhibe actividad relativamente alta sobre una amplia
gama de pH (3,5 - 5,5), con el pH = 4.5 cercano óptimo. La actividad enzimática
alcanza un máximo en alrededor 55º C.
Aunque la invertasa libre se puede utilizar con tiempos de residencia alrededor de
un día, el uso de enzimas inmovilizadas en un PBR con tiempo de residencia de
cerca de 15 minutos hace el proceso competitivo.
Glucosa isomerasa
Esta enzima transforma la glucosa en fructosa que es más soluble y más dulce.
Se usa en la elaboración de jarabes. Fue descubierta en 1957 por Marshall y Koi,
en Pseudomonas bydrophila. Actualmente hay una extensa gama de
preparaciones comerciales de glucosa isomerasa. Cabe señalar que la glucosa
isomerasa, es una de las raras enzimas no hidrolíticas usadas en la industria, se
utiliza por lo general en forma inmovilizada.
Se requieren procesos de separación para obtener fructosa pura, pero no para la
obtención de jarabes con 42% de fructosa, porque éstos presentan propiedades
similares a las de los jarabes de azúcar invertido. Estos se producen en algunos
países industrializados por acción de esta enzima; inicialmente la producción en
gran escala de jarabes fructosados se llevó acabo usando células completas o
enzima soluble.
La actividad de la glucosa isomerasa producida por algunos microorganismos se
ha utilizado en forma inmovilizada a soportes sólidos en la conversión continua
de glucosa a fructuosa.
El método de inmovilización por adsorción presenta las mayores ventajas por ser
sencillo, suave, reversible, lo que permite la reutilización del soporte y de la
enzima; el complejo obtenido tiene una alta actividad por unidad de peso de
soporte. Además, ya que tanto el sustrato como el producto de la glucosa
isomerasa son moléculas pequeñas sin carga; permiten que la enzima adsorbida
pueda usarse en concentraciones fuertes de sustrato.
Jarabes
Se le llama jarabes glucosados a hidrolizados a partir de un ED de 20 (aunque
éstos tengan muy bajos contenidos de glucosa). A menudo se incurre en el error
de pensar que dicho jarabe contiene 20 % de glucosa, pero de acuerdo con la
definición, debe entenderse como un jarabe que presenta un poder reductor
similar al de una solución con 20% de glucosa.
Desarrollos biotecnológicos, específicamente en el área de la tecnología
enzimática, han hecho posible la producción a gran escala de jarabes
maltosados, que empiezan a ganar terreno en la industria alimentaría. La maltosa
tiene un poder edulcorante equivalente a 50 a 75% del poder edulcorante de la
sacarosa, pero a diferencia de la glucosa, la maltosa tiene una calidad de dulzor
de alta aceptabilidad. Los jarabes son principalmente usados en cervecería,
panadería, bebidas no alcohólicas, confitería, etc., y su importancia radica
probablemente más en sus propiedades funcionales que en su poder como
edulcorante.
BIOCONVERSIONES
Los procesos biocatalíticos involucran el uso de microorganismos y enzimas libres
o inmovilizadas en medios acuosos o inorgánicos conteniendo compuestos
orgánicos como sustrato. En estos procesos las enzimas convierten el sustrato en
un nuevo compuesto de interés comercial.
Una de las principales ventajas de las enzimas además de las de índole
económica o biotecnológica, se asocia a su gran especificidad de acción lo cual
evita reacciones laterales imprevistas. Así mismo, se pueden trabajar en
condiciones moderadas: presión atmosférica, temperaturas bajas o medias y pH
de 3 a 10, obviamente las condiciones varían en función de la enzima que se trate.
La enzima de interés es la invertasa, la cual cataliza la hidrólisis de sacarosa y
glicósidos relacionados. La invertasa de levadura, ha tenido un rol excepcional en
el desarrollo de la enzimología moderna. Dicha enzima fue extraída de la levadura
en 1860 por Berthelot. Posteriormente, el trabajo de dicha enzima tomó una gran
importancia para el desarrollo de cinéticas enzimáticas. Además, fue una de las
enzimas tratadas en 1990 por Sorensen, en la determinación de la concentración
del ión hidrógeno y la dependencia de la actividad de la enzima sobre el pH. El
sustrato típico de esta enzima es la sacarosa.
La invertasa inmovilizada y células enteras de levadura han sido estudiadas para
la inversión en continuo de soluciones de sacarosa. Para lo cual se han empleado
soluciones diluidas de sacarosa bajo condiciones ideales en el laboratorio, mismas
que son de interés académico. Sin embargo, el empleo de la invertasa
inmovilizada tiene su principal dificultad en la recuperación del catalizador
inmovilizado de las soluciones viscosas y pegajosas de sacarosa. Una importante
ventaja es que se puede emplear el catalizador inmovilizado para operar en
continuo.
Hay evidencias de que la enzima inmovilizada en material tal como
polietilenamina, presenta mayor estabilidad durante un tiempo de 90 días a una
temperatura de 50ºC, almacenada en una solución de sacarosa al 80% (Godbole,
1990).
INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA
La inmovilización enzimática es un conjunto de técnicas que proporcionan
beneficios en los bioprocesos, incluyendo aumento de la productividad de la
bioconversión, en algunos casos brinda estabilidad al biocaralizador y facilidad en
los procesos de recuperación; ya que las enzimas son fácilmente recuperadas y
recicladas.
La ventaja más importante de la inmovilización enzimática es la productividad por
operaciones continuas y reuso del biocatalizador (Groboillot, 1994).
Existen varios métodos para inmovilizar, estos pueden ser divididos en 2
categorías (Kennedy, 1983):
• Unión química
• Retensión física
UNIÓN QUÍMICA.
Dentro de este tipo de inmovilización se encuentra la unión a soportes, los
soportes pueden ser orgánicos, inorgánicos y sintéticos. La forma en la que están
unidas las células a los soportes puede ser por medio de adsorción ó unión
covalente.
Unión a soportes.
La elección del soporte y el tipo de enlace son determinantes en el
comportamiento posterior del biocatalizador. Debe procurarse que la
inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición,
amplíe el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones
microbianas. Además, el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las
condiciones de operación del reactor, y ser fácilmente separable del medio líquido
para que pueda ser reutilizado (Kennedy, 1983).
Los materiales empleados como soportes en la inmovilización difieren en tamaño,
densidad, porosidad y forma, generalmente se encuentran en forma de cilindro,
hojas, fibras y regularmente en forma de esferas. Los soportes pueden clasificarse
en tres grandes grupos: soportes inorgánicos, orgánicos y sintéticos.
Los tipos de uniones que existen son:
Adsorción.
La unión se realiza por medio de interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals
y por puentes de hidrógeno. Los principales factores que influyen en la adsorción
son: el pH del medio, la fuerza iónica, el diámetro de poro y la presencia de iones.
Unión covalente.
Pueden agregarse sustancias las cuales forman el puente de unión del soporte al
biocatalizador, se logra un enlace fuerte que reduce la perdida de células como
ocurre con el glutaraldehído. Es de fácil realización, sin embargo, las sustancias
que se utilizan para formar el puente entre el biocatalizador y el soporte pueden
resultar en tóxicas en ocasiones, haciendo variar la fisiología del mismo ya que se
trata de interacciones químicas, lo cual provocaría la pérdida de dicho
biocatalizador (Durán, 1997).
RETENSIÓN FÍSICA.
Los métodos de retensión física incluyen encapsulación y atrapamiento. Se
presenta a continuación una breve explicación de los mismos así como algunas de
las ventajas que tienen.
Encapsulación.
La encapsulación del biocatalizador, se lleva a cabo reteniendo al mismo dentro
de una membrana semi-permeable que permite la difusión de los sustratos. La
formación de la membrana se logra en dos pasos:
1º la enzima se inmoviliza en esferas de hidrogel, se adiciona una capa de un
polímero catiónico (polilisina de polietilenamina), ésta es adsorbida formando la
superficie de la esfera. Después, el gel se disuelve y la enzima permanece
atrapada dentro de la cápsula.
Atrapamiento enzimático.
Consiste en la retensión física del biocatalizador en una red rígida, que evita la
salida de este al ambiente líquido, además permite la difusión de los substratos y
productos. Los soportes pueden ser geles de naturaleza sintética (poliacrilamida,
poliuretano, cloruro de polivinilo) o de naturaleza biológica (agar, celulosa,
gelatina, colágeno, alginato, carragenina) (Groboillot, 1994).
La ventaja de emplear los geles biológicos es que las reacciones de
polimerización son muy suaves, por lo que se disminuye en gran medida el riesgo
de causar daños al biocatalizador. Otra característica de estos soportes es que no
son tóxicos, por lo que son muy utilizados en la industria alimentaria y en la
industria farmacéutica.
La gelificación se lleva a cabo por los cambios de temperatura, además de la
presencia de cationes divalentes en el caso del alginato y la carragenina.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Los materiales y técnicas analíticas empleados se presentan a continuación:
1. Equipo
El equipo principal que será empleado durante el trabajo experimental es el
siguiente:
• Espectrofotómetro UV-Vis.
• HPLC.
• Baño de recirculación con control de temperatura.
• Célula de Lewis para reacciones enzimáticas a temperatura y
agitación controlada.
• Juego de pipetas automáticas.
2. Reactivos
Cuadro 1. Reactivos empleados.
REACTIVO GRADO
Cloruro de sodio Analítico Cloruro de potasio Analítico Citrato de sodio Analítico Dextran Analítico
Invertasa Analítico
Glucosa Analítico
Sacarosa Analítico
Fructosa Analítico
3. Soluciones
• Solución de KCl 0.3 M
• Solución k-carragenina 2% (w/v).
• Solución citrato de sodio 0.1 M
• Solución de dextran 2% (v/v).
Después de la selección para inmovilizar la enzima, se montó en laboratorio dicha
técnica y actualmente se lleva acabo la estandarización para el uso de dicha
enzima (invertasa). A continuación se presenta el esquema de esta técnica (ver
figura 1).
La descripción de la técnica es la siguiente:
La enzima se adiciona a una solución de soporte al 2% contenida en un recipiente
enchaquetado, manteniendo constante temperatura (55ºC) para evitar que el
polisacárido gelifique y con agitación de 120 rpm, la suspensión se mantiene
completamente uniforme.
La suspensión se hace pasar a través de una aguja por medio de una bomba
peristáltica. Controlando el flujo, la aguja deja sólo pasar gotas de la solución de
soporte – enzima. Las gotas, al ponerse en contacto con la solución de KCl 0.3 M,
solidifican instantáneamente formándose así esferas de aproximadamente 3 mm.
de diámetro.
La solución de KCl 0.3 M se encuentra con agitación mínima, para evitar que las
esferas se peguen entre ellas al momento de caer.
Suspensión de soporte al 2% con enzima
Bomba peristáltica
ºC, con agitación Solución de KCl 0.3 M
Figura 1. Esquema de la técnica de inmovilización enzimática por atrapamiento.
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA Y DE FRUCTOSA
Dichos azúcares se determinarán por dos métodos:
- Por azúcares reductores con el ácido 3,5-dinitrosalicílico.
- Por HPLC con soluciones diluidas de ácido sulfúrico y detector de índice
de refracción.
Cuadro 2. Concentraciones utilizadas para curva patrón.
FRUCTOSA GLUCOSA Absorbancia Absorbancia (g/l)
0 0 0 0.1831 0.19285 0.4 0.3843 0.399 0.8 0.5849 0.63785 1.2 0.77545 0.80005 1.6 0.96625 0.99735 2 1.169 1.169 2.4
1.35375 1.3713 2.8 1.49745 1.52855 3.2 1.6542 1.7338 3.6 1.8342 1.9385 4
CURVAS TIPO (GLUCOSA-FRUCTOSA)
y = 2,0852x - 0,0412R2 = 0,999
y = 2,1607x - 0,0434R2 = 0,9982
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 0.5 1 1.5 2 2
ABSORBANCIA (540 nm)
CO
NC
ENTR
AC
IÓN
(g/l)
.5
GLUCOSA FRUCTOSA
Figura 2. Curva Patrón de glucosa y fructosa determinados por HPLC.
RESULTADOS
Se realizaron un conjunto de cinéticas enzimáticas con invertasa libre con
soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones.
A continuación se presentan un conjunto de gráficas (figuras 3 a 8) que
representan cinéticas enzimáticas con invertasa libre comercial (SIGMA), a
diferentes concentraciones de sacarosa.
Concentración 1.5M de Sacarosa
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 1 2 3
Tiempo (minutos)
Con
cent
raci
ón d
e A
zúca
res
Red
ucto
res
(g/l)
4
2(g/l) 1(g/l) 0.5 (g/l) 0.25(g/l) 0.1(g/l)
Figura 3. Cinética Enzimática con sacarosa 1.5 M.
Concentración 1M de Sacarosa
0
1
2
3
4
5
6
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
Tiempo (minutos)
Con
cent
raci
ón d
e A
zúca
res
Red
ucto
res
(g/l)
2(g/l) 1(g/l) 0.5 (g/l) 0.25(g/l)
Figura 4. Cinética Enzimática con sacarosa 1 M.
Concentración 0.5M de Sacarosa
0
1
2
3
4
5
6
7
0 1 2 3
Tiempo (minutos)
Con
cent
raci
ón d
e A
zúca
res
Red
ucto
res
(g/l)
4
2(g/l) 1(g/l) 0.5 (g/l) 0.25(g/l) 0.1 (g/l)
Figura 5. Cinética Enzimática con sacarosa 0.5 M.
Concentración 0.25M de Sacarosa
0
1
2
3
4
5
6
7
0 1 2 3
Tiempo (minutos)
Con
cent
raci
ón d
e A
zúca
res
Red
ucto
res
(g/l)
4
2(g/l) 1(g/l) 0.5 (g/l) 0.25(g/l) 0.1 (g/l)
Figura 6. Cinética Enzimática con sacarosa 0.25 M.
Concentración 0.1M de Sacarosa
0
1
2
3
4
5
6
0 1 2 3
Tiempo (minutos)
Con
cent
raci
ón d
e A
zúca
res
Red
ucto
res
(g/l)
4
2(g/l) 1(g/l) 0.5 (g/l) 0.25(g/l) 0.1 (g/l)
Figura 7. Cinética Enzimática con sacarosa 0.1 M.
Concentración 0.05M de Sacarosa
0
1
2
3
4
5
6
0 1 2 3 4
Tiempo (minutos)
Con
cent
raci
ón d
e A
zúca
res
Red
ucto
res
(g/l)
2(g/l) 1(g/l) 0.5 (g/l) 0.25(g/l) 0.1 (g/l)
Figura 8. Cinética Enzimática con sacarosa 0.05 M.
A partir del conjunto de cinéticas realizadas a diferentes concentraciones de
sustrato, se fabrica la gráfica de velocidades de reacción contra concentración de
sustrato (cuadro 3 y figura 9).
Cuadro 3. Velocidades de reacción de invertasa libre.
Conc.Sacarosa 2(g/l) 1 (g/l) 0,5 (g/l) 0,25 (g/l) 0,1 (g/l) 1.5 4487.89109 3588.20123 3701.65623 1616.65492 597.3707271 11662.5547 10112.0143 5584.07087 2369.52007
0.5 88002.045 14390.3243 11531.6623 3387.08735 1387.875490.25 49149.6213 16210.3003 8130.73351 4901.71779 1387.984160.1 50868.5163 17401.3233 7855.2863 4523.18604 1375.785040.05 28542.7344 12639.6542 6719.9355 3228.06988 1008.4742
2 g/l
020000400006000080000
100000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Concentración de sustrato
Velo
cida
des
Figura 9. Velocidad de reacción vs concentración de sacarosa
De acuerdo a la figura 9, se pone de manifiesto la inhibición enzimática
presentada en el sistema estudiado, por la presencia de concentraciones de
sustrato mayores a 0.5M de sacarosa.
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE INVERTASA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN. Se realizó un estudio sobre el efecto de la concentración de la enzima invertasa
libre sobre la velocidad de reacción en el sistema (figura 10, cuadro4).
Vmax
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
0 0.5 1 1.5
Concentración de enzima (g/l)
Velo
cida
d m
axim
a
2
Figura 10. Concentración de invertasa vs velocidad de reacción.
Cuadro 4. Concentración de enzima vs velocidad de reacción.
Conc. Enzima (g/l) Vmax
2 88002.0451 17401.3233
0.5 11531.66230.25 4901.717790.1 1387.98416
Con dicho estudio se puede observar que la concentración de enzima libre óptima
resulta a una concentración de 0.25 g/l en el sistema estudiado.
CONCLUSIONES
La producción por edulcorantes vía enzimática, con invertasa libre comercial, fue
demostrada con soluciones de sacarosa de diversas concentraciones. También,
se puso de manifiesto la inhibición enzimática presentada en el sistema estudiado,
por la presencia de altas concentraciones de sustrato. Sin embargo, el proyecto no
llegó completamente a su etapa final, debido a que faltó realizar los estudios
relacionados con la caracterización cinética de la enzima en estado inmovilizada,
todo ello debido a que la estudiante de maestría quedó fuera del proyecto por
renuncia. Dicha etapa faltante, será resuelta en los meses a venir con la
participación de dos alumnos de licenciatura de la carrera de ingeniería
biotecnológica. Dichos resultados serán reportados como complemento del
presente informe en el futuro próximo.
IMPACTO DEL PROYECTO
El proyecto es de alto impacto desde el punto de vista que fundamenta las bases
para poder producir edulcorantes vía bioconversión. La idea es que el proyecto
pueda derivar en el futuro próximo en el uso de mieles finales de ingenios cañeros
para la producción continua, por bioconversión enzimática o celular, de jarabes
altamente fructosados o altamente glucosados, para su aplicación en la industria
refresquera y de confitería. Con ello, el valor agregado de las mieles finales de
ingenio se vería incrementado de forma exponencial. Sin embargo, es necesario
aún realizar múltiples experimentos para llegar a dicha etapa.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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