proceso de obtencion de embriones (1)
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PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE EMBRIONES
Se lava y se desinfecta la manga donde se trabajará los animales.
Desinfección general del laboratorio y material que se usará
para el rastreo de embriones.
Identificar y seleccionar el material que se usará en el
lavado de embriones
Se introduce la vaca a la manga, la recolección de embriones se llevó acabo a los 7 días a partir
del
comienzo del celo, por el método gravitacional
Se desinfecta y se seca la zona epidural de la vaca
Aplicación de anestesia epidural en la donadora
(5 ml de xilocahina al 2%) en espacio epidural
Se procede a colocarse el guante con un poco de lubricante
para la introducción de la mano en el recto de la vaca
Lavar con agua y jabón la región perianal
Limpieza del recto y palpación de ovarios para determinar
si el animal respondió a la superovulación
Posteriormente se realiza el secado en región de la vulva
Desinfectar el área perianal y la vulva con una
solución yodada y/o alcohol al 70%
Se procede a desinfectar el estilete
Preparación del catéter para iniciar el procedimiento del
lavado embrional
Se hace un hemostato al catéter junto con el estilete para
evitar este salga de su sitio
Posteriormente se introduce el estilete dentro del catéter
Catéter listo con camisa para iniciar el proceso de
recolección de embrión
Se introduce el catéter de foley en la vagina y se retira la
camisa del catéter
Una vez que el catéter está en el lugar adecuado el balón
se infla.
Se guia el catéter hacia el cuerno uterino seleccionado a
lavar
Frasco de 1 lt con PBS+1% de SFB o albumina, medio de
lavado, se coloca a 1mt de altura de la grupa de la vaca
donante (método gravitacional)
El balón es inflado rápidamente con 10 a 15 ml de aire o del
medio, de tal manera que quede bien fijado a la pared del
cuerno uterino
En seguida se le conecta una y
Una vez ya introducido el catéter en el útero se retira el
estilete
Un extremo se comunica a través de la tubería
correspondiente con el frasco del medio de lavado
El siguiente extremo con el filtro colector
Se empieza el lavado bajo control rectal
Se abre el paso de la manguera de salida y se colecciona el
lavado en el filtro colector (poros de 75-100 micras de
diámetros
Se da un masaje desde la unión uterotubárica hasta el
lugar donde de colocó el balón para ayudar a extraer los
Embriones; se cierra el paso
Se puede lavar cuerno por cuerno o bien ambos cuernos al
mismo tiempo, al término del acto final de lavado, el catéter
es removido y se retira lentamente la mano del recto
La operación de flujo y reflujo se repite varias veces utilizándose por lo menos 500 ml de
medio de lavado por cada cuerno uterino; utilizar aproximadamente 1 lt de PBS de dulbecco,
suplementado con 0.4% de albumina serica bovina
(BSA) y antibióticos
Se recomienda aplicar 7 ml de prostaglandina (Pgf2a) por
animal, vía intramuscular con el fin de ayudar a la regresión
del cuerpo lúteo
Limpiar y dejar habilitada el instrumental y el sitio de trabajo
para una 2da. practica
BUSQUEDA Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
Identificar y seleccionar el material que se usará durante la
búsqueda de embriones
Se introduce la vaca a la manga.
Se desinfecta y se limpia el área epidural
Se le administra anestesia epidural baja (5 ml de
xilocaína al 2 %).
Posteriormente se lava con agua y jabón
En seguida se limpia cuidadosamente el área perianal y
la vulva
Se desinfecta el área alrededor de la vulva con alcohol
al 70 %
Se hace una limpieza rectal, esto se aprovecha para sacar
las heces del recto, lo que facilita la manipulación del aparato
reproductor y posteriormente la colocación del embrión
El medio recolectado es volcado en un filtro especial con una
maya de 50 m que permita el paso del medio y no de los
embriones
Finalizando el filtrado se lava la maya del filtro con PBS
utilizando una jeringa y aguja fina; el fluido es recolectado
en una caja de pretri.
Posteriormente se procede a la búsqueda de los embriones con ayuda de un microscopio
estereoscópico a 10-15 aumentos y en forma sistemática de zig-zag se revisan cuadro por cuadro.
A medida que se van identificando los embriones se toman
con micro pipetas y se trasladan a caja de cultivo con tapa
Estas cajas deben contener medio de lavado enriquecido
con suero fetal bovino a una proporción de 10 – 20 %
Transferirán los embriones localizados con una pipeta
drum mond a una segunda caja de petri con 5 ml de medio
de mantenimiento (vigro holding), para lavarlos y clasificarlos
Seleccionar los embriones para ser empajillados
Se envasarán el embrión en una columna de medio dividida en tres partes
por dos burbujas el llenado se realiza de la siguiente manera:
Absorberán una primera columna pequeña de medio
Enseguida absorberán una columna de aire
Le sigue una columna grande de medio que es donde debe de cargarse
el embrión
Absorberán otra columna de aire
Por último una columna pequeña de medio
La pajilla la deberán sellar con calor (pinzas calientes), tapones plásticos ó
bien con Polvo polivinil
Se coloca la pajilla dentro de la pistola de transferencia de
embriones
Se corta la punta de la pajilla
Se complementa con la pipeta plástica desechable con su funda (azul, con punta metálica y dos orificios hacía los costados)
Se le coloca la camisa
Posteriormente se lubrica la camisa para facilitar su
introducción a la vagina de la vaca
Se procede a introducir el catéter (embrionizador), por la
Vagina, hasta llegar al útero
Una vez dentro del útero se retira la camisa, se sigue
introduciendo hasta depositar El embrión el en último tercio
del cuerno uterino
El embrionizador es removido suavemente
Enseguida se retira la mano del recto de la vaca La
transferencia de embriones es fácil y apasionante. Pero
para que la técnica tenga éxito, cada paso debe ser
cuidadosamente revisado
Se limpia el área de trabajo para que pueda ser usada una
segunda vez