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Procedimientos en Microbiología Clínica

RECOMENDACIONES DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE ENFERMEDADESINFECCIOSAS Y MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

Coordinador: José Domínguez

Autores: Carles Alonso Rosa Bartolomé

José DomínguezLurdes MatasNuria Rabella

ISBN: 84-609-9045-1

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INDICE:INDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO1. Técnicas de detección de antígeno. Introducción general.

1.1 Presentación del procedimiento1.2 Justificación de la estructura del procedimiento1.3 Objetivos del procedimiento1.4 Fundamento de las técnicas de detección de antígeno1.5 Principales técnicas de detección de antígeno1.6 Controles de calidad1.7 Consideraciones finales y perspectivas de futuro

2. Técnicas rápidas en el diagnóstico de las enfermedades de de transmisión sexual.3. Técnicas rápidas en el diagnóstico de las infecciones respiratorias.4. Técnicas rápidas en el diagnóstico de las infecciones bacterianas del sistema nervioso central.5. Técnicas rápidas en el diagnóstico de las gastroenteritis.6. Técnicas rápidas en el diagnóstico de las parasitosis.7. Técnicas rápidas en el diagnóstico de las infecciones por herpesvirus.8. Técnicas rápidas en el diagnóstico de las micosis invasoras.9. Técnicas rápidas en el diagnóstico de las hepatitis víricas y la infección por el VIH.10. Bibliografía

10.1 Enfermedades de transmisión sexual10.2 Infecciones respiratorias10.3 Infecciones bacterianas del sistema nervioso central10.4 Gastroenteritis10.5 Parasitosis10.6 Herpesvirus10.7 Micosis invasoras10.8 Hepatitis víricas e infección por el VIH

INDICE DE LOS DOCUMENTOS TÉCNICOS1. Técnicas rápidas de diagnóstico de las enfermedades de transmisión sexual.2. Técnicas rápidas de diagnóstico de las infecciones respiratorias.3. Técnicas rápidas de diagnóstico de las infecciones bacterianas del sistema nervioso central.4. Técnicas rápidas de diagnóstico de las gastroenteritis.5. Técnicas rápidas de diagnóstico de las parasitosis.6. Técnicas rápidas de diagnóstico de las infecciones por herpesvirus.7. Técnicas rápidas de diagnóstico de las micosis invasoras.

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Procedimientos en Microbiología ClínicaRecomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología ClínicaEditores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

19. TÉCNICAS RÁPIDAS DE DETECCIÓN DE ANTÍGENO. 2005

Coordinador: José Domínguez

Autores: Carles Alonso Rosa Bartolomé

José DomínguezLurdes MatasNuria Rabella

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1. TÉCNICAS RAPIDAS DE DETECCIÓN DEANTIGENO. INTRODUCCIÓN GENERAL1.1 PRESENTACIÓN DEL PROCEDIMIENTOLas técnicas inmunológicas de detección deantígenos nos permiten detectar la presencia demicroorganismos o de fragmentos de los mismos enlas muestras clínicas. El desarrollo de estas técnicasse inició con el propósito de poder acelerar eldiagnóstico de las enfermedades infecciosastratando de superar algunos de los inconvenientes,especialmente la lentitud, de las técnicasconvencionales. Que duda cabe que disponer deresultados rápidos es de utilidad para el manejoclínico y terapéutico de los pacientes.Son técnicas especialmente útiles en aquellos casosen que el microorganismo causal crece lentamente obien, no crece en los medios de cultivo. Además, losresultados de los mismos no se ven alterados por laadministración previa de antimicrobianos.Como inconvenientes principales de las mismascabe destacar que no ofrecen información sobre lasensibilidad del microorganismo detectado a losantimicrobianos, y que en algunos casos no hanalcanzado los niveles de sensibilidad y especificidaddeseados.

1.2 JUSTIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA DELPROCEDIMIENTODado el gran número de técnicas de detección deantígenos disponible y la enorme cantidad demicroorganismos susceptibles de poder serdetectados resulta imposible desarrollar un únicodocumento científico y un único documento técnicoque incluya todas las posibilidades. En este sentido,el documento científico ha sido estructurado ensíndromes, destacando en cada caso cual es elpapel de las técnicas rápidas y qué microorganismosse pueden detectar por ellas.Por lo que respecta al procedimiento técnico hemosdesarrollado uno diferente por cada síndrome.Hubiera resultado imposible describir en un únicoprocedimiento de forma suficientemente clara, todaslas técnicas, todos los tratamientos de las muestras,todas las posibles aplicaciones y las interpretacionesde los resultados con todos sus matices. De formaque para cada síndrome hemos planteado undocumento técnico, en formato de procedimientonormalizado de trabajo, en el cual se recogen quémuestras se deben utilizar, cómo deben manipularse,conservarse y tratarse, qué microorganismospodemos detectar en estas muestras, mediante quétécnicas y cómo debemos interpretar los resultadosobtenidos.

1.3 OBJETIVOS DEL PROCEDIMIENTOEl objetivo del procedimiento es el de elaborar undocumento de trabajo que permita conocer lastécnicas disponemos y que microorganismospodemos detectar con ellas en cada caso.Por otro lado, en los documentos técnicos nohacemos un abordaje detallado de cómo se realizanlas técnicas ya que muchas de ellas estáncomercializadas, existen numerosas variantes para

la detección de microorganismos concretos yresultaría imposible, además de poco práctico,describir todas ellas. En cambio, incidimos en quémuestras son las más adecuadas para optimizar elrendimiento de las técnicas y cuál es el tratamientoprevio que se les debe aplicar a las mismas.También se plantean las ventajas e inconvenientesde las técnicas, qué dan de sí, qué podemos esperarde ellas, qué se les puede pedir, etc. En definitiva,hemos querido dotar al procedimiento de lasuficiente información práctica para que sea unaherramienta útil en el diagnóstico de lasenfermedades infecciosas.

1.4 FUNDAMENTO DE LAS TÉCNICAS DEDETECCIÓN DE ANTÍGENOLas técnicas de detección de antígeno son técnicasinmunológicas que se fundamentan en la afinidadantígeno-anticuerpo. Definiríamos el antígeno comoaquella molécula estructural o metabólica de origenmicrobiano que es reconocida como extraña por elorganismo humano y que es capaz de desencadenaruna respuesta inmunitaria. Por otro lado, unanticuerpo es una gammaglobulina sintetizada porlas células plasmáticas en respuesta a laestimulación ejercida por un antígeno, con el quereacciona de forma específica, gracias a lacorrespondencia entre sus estructuras.De forma que si disponemos de anticuerposespecíficos podemos detectar los antígenoscorrespondientes en una muestra clínica. Esta es labase de las técnicas de detección de antígenosmicrobianos. Los anticuerpos específicos empleadosen estas técnicas son obtenidos como antisueros deanimales inmunizados, que serían anticuerpospoliclonales, o por producción in vitro mediantehibridomas con la obtención de anticuerposmonoclonales. Los anticuerpos monoclonalespueden utilizarse solos o combinando diferentesanticuerpos dirigidos contra dos o más epítoposdiferentes. La principal ventaja de los anticuerposmonoclonales es su alto grado de especificidad, locual los hace extremadamente útiles para distinguirentre microorganismos muy próximosantigénicamente. Sus limitaciones incluyen, por lotanto, una incapacidad de detectar todas lasvariedades de un mismo microorganismo debido a sualta especificidad y una teórica baja afinidad.

1.5 PRINCIPALES TÉCNICAS DE DETECCIÓN DEANTÍGENOA pesar de que el fundamento de todas estastécnicas requiere de la utilización de un anticuerpoespecífico, las técnicas existentes se diferencian enfunción del soporte en que tiene lugar la reacción yen la forma de revelar la presencia de este antígeno.A nivel estructural los anticuerpos presentan dosextremos iguales que son los que se unenespecíficamente al antígeno, es decir cadaanticuerpo puede unirse a dos moléculas deantígeno (fragmentos Fab: fragment antigen binding),y un extremo diferente con propiedades biológicasrelacionadas con la activación del sistema del

DOCUMENTO CIENTÍFICO

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complemento y con la fagocitosis (fragmento Fc:llamado así porque cristaliza con facilidad). Elrevelado de la presencia del antígeno se realizamediante anticuerpos conjugados. Los anticuerpos através del fragmento Fc pueden ser fijados apartículas (moléculas de oro coloidal, partículas delátex, etc) y también pueden unirse químicamente aenzimas, moléculas fluorescentes, radioactivas olumínicas.Las principales técnicas de detección de antígenosson: a) contrainmunoelectroforesis, b) técnicas deaglutinación, c) inmunocromatografía, d) enzimo-inmunoanálisis, e) inmunofluorescencia y f) métodosluminométricos. Seguidamente se describen losfundamentos de estos métodos.Contrainmunoelectroforesis.- En un par de pocillospracticados en un gel de agarosa se enfrentan lamuestra en la cual deseamos estudiar la presenciade antígeno y el antisuero homólogo. Al aplicar uncampo eléctrico a través del gel, el antígeno migrahacia el pocillo del antisuero y las immunoglobulinashacia el del antígeno, bien como consecuencia de lacarga eléctrica o bien arrastradas en sentido contrariopor el flujo osmótico que se establece en el interior delagar. Este flujo osmótico (o electroendosmosis) sedebe a que en un gel de agar los residuos aniónicos(fundamentalmente sulfato y piruvato) se encuentranfijados covalentemente a la matriz del gel sin podermigrar dentro del campo magnético. En cambio, loscationes con las moléculas de agua asociadas sí soncapaces de migrar catódicamente. Comoconsecuencia, se produce un movimiento neto deagua que puede arrastrar a las moléculas que, en lascondiciones en que se practique la electroforesis,presenten carga neutra. De una forma o de otra, elantígeno y el anticuerpo se concentran en una zona dereacción entre los dos pocillos donde al encontrarse enla proporción adecuada forman una banda deprecipitación (Figuras 1a y 1b).Técnicas de aglutinación.- Sobre una tarjeta dereacción se mezclan la muestra clínica que albergaal antígeno con el reactivo que contiene a losanticuerpos específicos. Al entrar en contacto losanticuerpos mediante los dos puntos de unión con elantígeno establecen entramados de muchasmoléculas de antígeno y de anticuerpos. Estaaglutinación de partículas antigénicas forma grumos(Figuras 2a y 2b). Para que estos grumos seanfácilmente visibles macroscópicamente, losanticuerpos están unidos por el fragmento Fc apartículas inertes de mayor tamaño, tales comopartículas de látex. Estas técnicas sonextraordinariamente rápidas, ofreciendo resultadosen 2-10 minutos, pero en general adolecen debuena sensiblidad.Inmunocromatografía.- Sobre una membrana denitrocelulosa o nylon se encuentran absorbidos en lalínea de reacción anticuerpos contra el antígeno quebuscamos y sobre la línea control anticuerpos anti-conjugado, de forma que cuando la muestra contieneantígeno, este fluye por la membrana quedandoretenido en la línea de reacción. El conjugado, quetambién es un anticuerpo específico frente al

antígeno que buscamos, está marcado con unamolécula de oro coloidal, que también fluye por lamembrana, es retenido por el antígeno en la línea dereacción y por el anticuerpo en la línea control(Figuras 3a y 3b). En el caso de muestras negativasque no contienen antígeno, el conjugado es retenidoúnicamente en la línea control. Estás técnicas sonrápidas, obteniéndose resultados en 15-30 minutos.Enzimoinmunoanálisis (EIA).- Normalmente ladetección tiene lugar en placas de poliestireno,donde los anticuerpos específicos están fijadossobre la superficie de los pocillos. Estos anticuerposretienen a los antígenos presentes en la muestra ysu presencia es revelada posteriormente mediante lautilización de anticuerpos también específicos delantígeno conjugados con enzimas. Estas enzimasprovocan un cambio de color al interaccionar con elsustrato específico. Las enzimas más utilizadas sonla fosfatasa alcalina y la peroxidasa que actúansobre el p-nitrofenil fosfato y el agua oxigenada,respectivamente. En el caso de la peroxidasa eloxígeno liberado del agua oxigenada actúa sobreotro sustrato: o-fenilendiamina, ácido 5-aminosalicílico o la 3,3�,5,5�tetrametilbencidina. Deforma, que en este tipo de EIA, a mayor intensidadde color mayor cantidad de antígeno fijado al pocillo(Figuras 4a y 4b).Existen otros tipos de EIA, como son los EIAcompetitivos, en que el antígeno de la muestracompite por los anticuerpos específicos conantígenos sintéticos que nosotros añadimos, deforma que a mayor intensidad de color menorcantidad de antígeno fijado. También es posiblerealizar EIA cuantitativos, que mediante la inclusiónde calibradores, que tienen una concentraciónconocida de antígeno, permiten extrapolar lacantidad de antígeno presente en las muestras.La posibilidad de emplear como conjugado unanticuerpo marcado con un isótopo radioactivo cadavez es menos frecuente. La necesidad de disponerde instalaciones adecuadas, la necesaria recogidaselectiva de los desechos, los riesgos derivados detrabajar con isótopos radioactivos y el hecho que losconjugados enzimáticos ofrecen unos resultadossimilares en sensibilidad han limitado el desarrollo deestas técnicas.Inmunofluorescencia.- Las pruebas deinmunofluorescencia se basan en la adición deanticuerpos específicos sobre extensiones demuestras clínicas realizadas sobre un portaobjetos.En la inmunofluorescencia directa el anticuerpoempleado esta marcado con una sustanciafluorescente (fluorocromos), una de las másutilizadas es la fluoresceína. En lainmunofluorescencia indirecta el anticuerpoempleado no está marcado con ninguna sustancia,revelándose la presencia del antígeno al emplear unsegundo anticuerpo marcado con un fluorocromofrente al anticuerpo primario. La lectura de los

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resultados se realiza por observación al microscopiode fluorescencia de los microorganismos o de lascélulas infectadas fluorescentes sobre un fondooscuro.Métodos luminométricos.- La reacción tiene lugar entubos de propileno o poliestireno donde seencuentran fijados los anticuerpos específicos. Lapresencia de antígeno fijado por los anticuerpos deltubo se evidencia por la adición de anticuerpostambién específicos marcados con sustanciaslumínicas como son los ésteres de acridina (existenotras sustancias como el luminol o el adamantildioxietano). La rotura de los ésteres de acridina porla adición de agua oxigenada en ácido nítrico conhidróxido sódico libera luz que es leída por unluminómetro como unidades relativas de luz (RLU).Este tipo de técnica también permite realizardeterminaciones cuantitativas.

1.6 CONTROLES DE CALIDADEn la interpretación de los resultados obtenidos portécnicas inmunológicas de detección de antígeno esfundamental introducir suficientes medidas de controlque aseguren la calidad de los mismos. Esimprescindible incluir siempre controles positivos ynegativos. Estos controles pueden ser facilitados porlos fabricantes de los métodos comercializados,pueden ser muestras propias del laboratorio o bienpueden ser adquiridos controles comercializados yestandarizados de laboratorios y agenciasinternacionales. En función de la técnica puede sernecesario controles adicionales, como �blancos� enlas técnicas de EIA o controles de partículas nosensibilizadas en las técnicas de aglutinación.Por otro lado, no debe descuidarse el registro decontrol de lotes, de temperaturas de neveras para laconservación de los reactivos, control de losincubadores y calibración de las pipetas automáticasy de los aparatos necesarios. La participación enprogramas nacionales e internacionales de controlde calidad en los que se debe determinar lapresencia o no de antígeno en un lote de muestras,es vital para asegurar la calidad de los resultados.

1.7 CONSIDERACIONES FINALES YPERSPECTIVAS DE FUTUROEl futuro en este campo está fundamentalmente enmanos de las compañías de reactivos de laboratorio,que han de ser capaces de ofrecer una batería detécnicas sensibles y específicas que, empleandopreferentemente muestras clínicas no obtenidas porprocedimientos invasores, proporcionen undiagnóstico etiológico rápido, de forma que seaposible establecer una orientación terapéuticaadecuada y precoz de las enfermedades infecciosas.Que duda cabe que la activa investigación en nuevosformatos de estas técnicas que se está llevando acabo actualmente, puede conducir a que en pocotiempo hayan cambios significativos que modifiquenlas pautas de actuación, incluidos los procedimientosestablecidos en el presente documento.

2. TÉCNICAS RAPIDAS EN EL DIAGNOSTICO DELAS ENFERMEDADES DE TRANSMISIÓNSEXUALDe los microorganismos cuya transmisión sexualtiene importancia epidemiológica, únicamente nosreferiremos a las causadas por Neisseriagonorrhoeae y Chlamydia trachomatis serogruposB,D,E,F y K.En el hombre ambos microorganismos producenuretritis, con discretas diferencias en lascaracterísticas clínicas por lo que se refiere al tiempode incubación, a los síntomas y a las posiblescomplicaciones, especialmente la orquiepididimitis.En la mujer el cuadro inicial es una cervicitisgeneralmente poco sintomática (discreto aumento deflujo vaginal o dolor pélvico-perineal). Lascomplicaciones, se producen por progresiónascendente de la infección y que pasa a afectarendometrio, trompas y anejos, produciendoendometritis, salpingitis y enfermedad pélvicainflamatoria. Ello puede condicionar a largo plazoproblemas de esterilidad y embarazo ectópico.También se ha implicado C. trachomatis en elsíndrome uretral agudo.Con el fin de limitar la cadena epidemiológica, elseguimiento de los pacientes con infecciones detransmisión sexual debe incluir el estudio de la/spareja/s sexuales, independientemente de lapresencia o no de sintomatología.Las manifestaciones clínicas de estas infeccionesacostumbran a ser más evidentes en el hombre queen la mujer de manera que las técnicas de detecciónde antígeno ofrecen mejores resultados para eldiagnóstico de la uretritis que de la cervicitis.Además la sensibilidad para la detección deportadores asintomáticos es realmente limitada. Parael estudio de contactos y portadores asintomáticos,las técnicas de detección genética presentan mejorrendimiento. En diversos estudios realizados ennuestro medio, la prevalencia de infecciones por C.trachomatis es considerablemente menor que en lospaíses anglosajones. Esta circunstancia obliga aseleccionar y valorar con mucha atención la técnicadiagnóstica a aplicar. Al igual que en muchos paíseseuropeos, se observa un incremento de frecuenciade aislamiento de N. gonorrhoeae, especialmente enla población de hombres homo y bisexuales.

3. TÉCNICAS RAPIDAS EN EL DIAGNOSTICO DELAS INFECCIONES RESPIRATORIASEl aparato respiratorio es una de las principales víaspor la que los agentes patógenos penetran en elorganismo; se ha calculado que diariamente llegan alos pulmones más de 10.000 microorganismosviables. La nasofaringe está colonizada por una grancantidad y variedad de microorganismos que puedenser aspirados hacia las vías aéreas bajas; ladiseminación desde otros territorios orgánicos o lainhalación de microorganismos exógenos tambiénpuede dar lugar a una infección pulmonar.Atendiendo a aspectos anatómicos podemos dividir alas infecciones de las vías aéreas en dos grandes

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grupos: las de la vía áerea superior y las de lainferior.Infecciones del tracto respiratorio superiorSinusitis. - Los principales agentes responsables desinusitis aguda son Streptococcus pneumoniae,Haemophilus influenzae no tipable y Streptococcuspyogenes. En fases iniciales es fácil identificar virusrespiratorios como virus parainfluenza, virus de lagripe, adenovirus y rinovirus.Otitis media.- La otitis media es una de las patologíasmás frecuentes en el niño. Los principales patógenosson S. pneumoniae y H. influenzae no tipable. Otrospatógenos menos frecuentes son S. pyogenes yMoraxella catarrhalis.Laringotraqueitis. - La mayor parte de los episodiosson de origen vÍrico. Los virus más frecuentementeimplicados son parainfluenza 1, 2 y 3, y con menorfrecuencia, gripe A y B, y virus respiratorio sincitial.También pueden estar implicados rinovirus,enterovirus, coronavirus, metaneumovirus yadenovirus. Únicamente en un pequeño porcentajela etiología no es vírica, estando implicado en estoscasos Mycoplasma pneumoniae.Epiglotitis.- La introducción de la vacuna frente a H.influenzae tipo b ha reducido la incidencia del queera el principal patógeno responsable.Excepcionalmente se han implicado otrosmicroorganismos como son S. pneumoniae,Staphylococcus aureus y S. pyogenes. La etiologíavírica es infrecuente.Faringoamigdalitis. La etiología más frecuente esvírica (adenovirus, rinovirus, enterovirus, y,excepcionalmente, el virus de Epstein-Barr). Ensegundo lugar, bacteriana, concretamente S.pyogenes (otras bacterias aparecen en menos del5% de los casos). La etiología estreptocócica es laúnica forma de la enfermedad en la que eltratamiento antibiótico está claramente indicado. Elprincipal objetivo del tratamiento antibiótico es laprevención de la fiebre reumática, y la erradicaciónde S. pyogenes de la orofaringe. En este sentido lastécnicas de detección de antígeno estreptocócico enmuestra orofaríngea han mostrado una elevadarapidez y especificidad. La sensibilidad dependerádel método empleado y del número demicroorganismos presentes en la muestra. Enmuestras con baja carga microbiana es posibleobtener falsos negativos, por lo que debenconfirmarse por cultivo.Infecciones del tracto respiratorio inferiorBronquiolitis.- La bronquiolitis es una infección agudade las vías inferiores. Este término se ha utilizadotradicionalmente para definir un síndrome vírico consibilancias en los niños pequeños. La bronquiolitisimplica inflamación de las vías aéreas pequeñascaracterizada por la obstrucción de los bronquiolos.Durante el primer año de vida, la bronquiolitis es lamanifestación más frecuente de la infección deltracto respiratorio inferior. El principal agenteetiológico es el virus respiratorio sincitial.Bronquitis aguda.- Es un proceso inflamatorio queafecta a tráquea y bronquios. Se da a cualquieredad, aunque la población fumadora y los niños

presenta una mayor incidencia. La etiología vírica esresponsable del 50-90% de los casos, los virusrespiratorios más frecuentemente involucrados sonadenovirus, virus de la gripe A y B, virus respiratoriosincitial, parainfluenza, rinovirus y coronavirus

Bronquitis crónica.- La enfermedad pulmonarobstructiva crónica (EPOC) es la enfermedadrespiratoria de mayor prevalencia e impactosocioeconómico. En España un 9% de la poblaciónde entre 40 y 70 años cumple criterios de EPOC.Además, en nuestro país, la EPOC representa lacuarta causa de mortalidad, con una tasa global de33 por 100.000 habitantes. En la bronquitis crónicase ha postulado que la infección bacteriana juega unpapel patogénico clave en la lesión del tejidopulmonar. Se establece un círculo vicioso donde lalesión favorece la infección y viceversa. Estospacientes sufren anualmente entre 1 y 4reagudizaciones. Aunque la infección no es la únicacausa, sí representa un porcentaje próximo al 50%.Son tres los microorganismos asociados a lareagudización de la bronquitis crónica: H. influenzae,S. pneumoniae y M. catarrhalis. Estos mismosmicroorganismos es posible encontrarlos enpacientes bronquíticos no reagudizados colonizandola vía respiratoria.Neumonía.- Las neumonías son la primera causa demortalidad entre las enfermedades infecciosas,particularmente en los individuos de más de 65 años.Desde un punto de vista práctico resulta útil clasificarlas neumonías de acuerdo con el grupo de poblaciónque afectan.

Neumonía adquirida en la comunidad. Son muyconstantes los principales agentes etiológicosresponsables de las neumonías adquiridas en lacomunidad (NAC). Así, S. pneumoniae es elprincipal agente etiológico de neumonía adquiridaen la comunidad en todo el mundo. H. influenzaese encuentra en los primeros lugares comoagente etiológico en los cuadros clínicos deneumonía típica. Legionella pneumophila,Chlamydophila pneumoniae y M. pneumoniae seencuentran también en los primeros puestos encasi todos los estudios. Los bacilosgramnegativos aerobios son una causa pocofrecuente de NAC en la población noinmunodeprimida. En las etiologías de lasneumonías más graves S. pneumoniae, L.pneumophila y bacilos gramnegativos (incluido H.influenzae), son los patógenos a considerar entodos los casos. En función de los datosdisponibles sobre la gravedad de la neumonía enrelación a la etiología, los esfuerzos deberían irdirigidos fundamentalmente a diagnosticar lasneumonías por neumococo y por L. pneumophila.Así mismo en los adultos no debemos olvidar alvirus de la gripe A como causante de neumonía.Otros virus respiratorios también pueden estarimplicados aunque su frecuencia es muchomenor.En los niños el virus respiratorio sincitial es elagente etiológico más común y en los niños más

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pequeños es frecuente el ingreso hospitalario. Porotra parte la infección en estos pacientes por elvirus de la gripe y otros virus respiratorios puededar lugar a manifestaciones clínicas graves.

Neumonía nosocomial. La neumonía nosocomiales la segunda causa de infección hospitalaria y laprimera en las Unidades de Cuidados Intensivos,llegando la mortalidad en algunas estadísticas al30-50% de todos los casos. La implicación de losbacilos gramnegativos (enterobacterias yPseudomonas aeruginosa) en la neumoníanosocomial es muy frecuente. En el pacientesometido a ventilación mecánica, S. aureus sesituaría en segundo lugar, mientras que losmicroorganismos más prevalentes en lacomunidad serían únicamente frecuentes enaquellas neumonías nosocomiales de apariciónprecoz.Neumonía en el paciente inmunodeprimido.Actualmente, una elevada proporción depacientes hospitalizados o de individuosresidentes en la comunidad presentan defectosespecíficos de los sistemas defensivos que espreciso conocer ya que los expone de formaparticular a etiologías específicas. Actualmente lamayoría de estos pacientes presentan infecciónpor el virus de inmunodeficiencia humana oreciben tratamiento inmunosupresor concorticoides o quimioterapia para evitar el rechazode órganos transplantados. Los pacientesinmunodeprimidos pueden presentan neumoníasde etiología muy diversa, dependiendo del tipo ygrado de su déficit inmunitario.

El diagnóstico de las neumonías plantea másdificultades que el de cualquier otro síndromeinfeccioso; esto es debido fundamentalmente, a quela neumonía es un síndrome plurietiológico; enrelación a la edad, lugar de adquisición y estado delhuésped, los microorganismos implicados puedenser muy diferentes.Además muchos agentes causales pueden formarparte, regular o transitoriamente, de la flora comensalde la vía respiratoria y en el caso de las neumoníases especialmente difícil obtener muestrasrepresentativas del foco de infección por técnicas noinvasoras, no pudiéndose realizar técnicas invasorasde forma indiscriminada, sino quedando suutilización limitada a pacientes con neumonías dealto riesgo. Además, debe tenerse en cuenta quenumerosos microorganismos que producen patologíarespiratoria no pueden aislarse en cultivosconvencionales (M. pneumoniae, C. pneumoniae,Coxiella burnetii...). La serología únicamenteproporciona un diagnóstico retrospectivo de escasovalor para la orientación terapéutica de los pacientes.Las técnicas inmunológicas más utilizadas presentanproblemas de especificidad y sensibilidad tanto enmuestras respiratorias como extra-respiratorias.Actualmente, no se dispone de técnicas deamplificación genética comercializadasestandarizadas para detectar los agentes causalesmás habituales.

Las técnicas inmunológicas de detección deantígenos de los diferentes patógenos respiratorios,algunas de las cuales se han consolidado en susposibilidades reales en los últimos años, puedenaplicarse a muestras procedentes del foco deinfección, suero por el que circulan y orina por la quese eliminan. Esto permitiría poder aplicarlas de formageneral, independientemente de la gravedad delproceso en estudio.

4. TÉCNICAS RAPIDAS EN EL DIAGNOSTICO DELAS INFECCIONES BACTERIANAS DEL SISTEMANERVIOSO CENTRALLa clínica de presentación de las infecciones delsistema nervioso central puede ser aguda, subagudao crónica y depende de la virulencia del agenteinfeccioso y de la localización de la infección.Meningitis agudas bacterianasLa inflamación de las meninges se conoce comomeningitis y cuando está ocasionada por bacterias,hablamos de meningitis bacteriana, siendo las másfrecuentes las agudas, causadas pormicroorganismos piógenos. Los tres patógenos másfrecuentes causantes de meningitis bacteriana agudason, Neisseria meningitidis, S. pneumoniae y H.influenzae.N. meningitidis es la causa más común demeningitis en niños y adultos jóvenes y se asocia aun porcentaje de mortalidad del 3% al 13%. Sesubdivide en serogrupos y serotipos. Se han descritotrece serogrupos según las característicasantigénicas de los polisacáridos de la cápsula. Losserogrupos A, B, C, X, Y y W135 son los que seasocian con más frecuencia a la enfermedadmeningocócica y los más frecuentes son el C, el B yel Y. Mientras el serogrupo B causa la mayoría decasos esporádicos, la enfermedad debida a losserogrupos A y C puede presentarse en formaepidémica.S. pneumoniae es la causa más frecuente y gravede meningitis aguda adquirida en la comunidad. Lascepas virulentas de S. pneumoniae se encuentrancubiertas por una capa compleja de polisacáridos.Estos polisacáridos capsulares se han utilizado parala clasificación serológica de las cepas y en laactualidad se han identificado más de 90 serotiposde los cuales, sólo 18, son los responsables del 80%de la patología humana. La incidencia de meningitispor S. pneumoniae en niños menores de 2 años enEspaña es de 13�13 por 100.000 niños cada año,siendo sus tasas de letalidad (6%) y secuelassuperiores a las ocasionadas por otrosmicroorganismos. La comercialización en España deuna vacuna conjugada antineumocócica eficaz hasupuesto que los expertos recomienden suadministración sistemática en menores de 2 años.Un aspecto importante a tener en cuenta en estameningitis es su tratamiento que presenta problemasdebido al aumento de la prevalencia de la resistenciadel microorganismo a las cefalosporinas de tercerageneración.La mayoría de las meningitis causadas por H.influenzae tienen lugar en niños menores de 5 años

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de edad con un máximo de incidencia entre 6 y 12meses. La superficie de muchas cepas de estemicroorganismo está cubierta por una cápsula depolisacáridos y se han identificados seis serotiposantigénicos (de la a hasta la f). Antes de laintroducción de la vacuna de H. influenzae, elserotipo b era el responsable de más del 95% de lasinfecciones invasivas por este microorganismo, conuna incidencia de 7,5 casos por 100.000 niñosmenores de 5 años, no obstante, su incidencia hadisminuido espectacularmente en aquellos países enlos que se ha introducido la vacuna conjugada frentea H. influenzae tipo b de forma sistémática en elcalendario vacunal. Actualmente los serotipos c y f,así como los serotipos no encapsulados de H.influenzae, son los responsables de la mayor partede las infecciones.Streptococcus agalactiae y Escherichia coli sonuna causa común de meningitis bacteriana enneonatos. Listeria monocytogenes y en especiallos serotipos 1/2b y 4b están implicados en lameningitis neonatal, pero también pueden provocarenfermedad en los adultos mayores de 60 años,pacientes alcohólicos, con neoplasias y contratamientos inmunosupresores. Otros factorespredisponentes incluyen diabetes, insuficiencia renaly hepática crónica, enfermedades autoinmunes ysituaciones asociadas a un aumento de los depósitosde hierro.En la tabla 1 se exponen las etiologías másfrecuentes de las meningitis bacterianas según laedad.Los métodos de diagnóstico microbiológicopresentan algunas limitaciones. La tinción de Gramdel líquido cefalorraquídeo (LCR) permite unaidentificación bacteriana rápida y precisa en el 60%-90% de los pacientes con una meningitis bacterianay presenta una especificidad de ≥97%. Laprobabilidad de que se visualice algúnmicroorganismo mediante esta tinción secorrelaciona con la concentración bacteriana en elLCR. Una concentración de ≤103 UFC/ml se asocia aun 25% de positividad de la tinción de Gram. Unaconcentración de 103-105 UFC/ml se asocia a un60% de positividad y una concentración >105 UFC/mlse correlaciona con el 97% de casos con tinción deGram positiva.La probabilidad de que esta tinción sea positivadepende también del tipo específico de bacteria quecause la meningitis. S. pneumoniae se observa en el90% de casos, H. influenzae en el 86%, N.meningitidis en el 75%, bacilos gramnegativos en el50% y aproximadamente en un tercio de los casosde meningitis causadas por L. Monocytogenes seobservan bacilos grampositivos.

Tabla 1. Etiologías más frecuentes de meningitisbacteriana aguda según la edad.

Edad Etiología

Neonatos < 1 mesS. agalactiaeE. coliL. monocytogenes

Niños 1 mes � 5 añosN. meningitidisS. pneumoniaeH. influenzae

Pacientes de 5 a 19 años N. meningitidis

Adultos hasta 65 años N. meningitidisS. pneumoniae

Adultos > 65 años einmunodeprimidos

N. meningitidisS. pneumoniaeL. monocytogenes

La tinción de Gram es un método rápido, barato yespecífico para el diagnóstico de las meningitis, peroen los pacientes que han recibido tratamientoantibiótico previo, la sensibilidad de esta tinciónpuede disminuir en un 20%. Maxson y cols. indicanque un tratamiento antibiótico oral o parenteral demenos de 24 horas de duración antes de larealización de la punción lumbar, no da lugar,necesariamente, a una tinción de Gram del LCRnegativa. Algunos autores consideran que la tinciónde Gram puede ser más sensible que las técnicas dedetección de antígeno, en concreto, que la prueba deaglutinación por látex y que, por ello, esta tincióndebe realizarse siempre.El cultivo de LCR ha sido considerado como latécnica de referencia para el diagnóstico de lasmeningitis bacterianas, no obstante, el resultadotarda en obtenerse 24 horas o más y puede sernegativo si el paciente ha recibido tratamientoantimicrobiano. Se ha observado que laadministración previa de antibióticos afecta más alporcentaje de positividad de los hemocultivos que delcultivo del LCR. Esta persistencia en el LCR puedeestar en relación con la presencia de una altaconcentración bacteriana en dicha muestra. Losleucocitos polimorfonucleares presentes en el LCRdesempeñan un papel menos importante en laeliminación bacteriana. Algunos estudios presentanunos porcentajes de cultivos positivos de LCR del90%. Otro aspecto importante del aislamiento delmicroorganismo en el cultivo es la detección deserogrupos, como en el caso de N. meningitidis,mediante técnicas de coaglutinación y la posibilidadde realizar determinaciones de sensibilidad aantimicrobianos.La meningitis bacteriana sigue siendo en laactualidad una importante causa de morbilidad ymortalidad que exige un tratamiento antibióticourgente y eficaz, por ello, es importante la realizaciónde un diagnóstico etiológico rápido que, además debasarse en la anamnesis y la exploración delpaciente, se fundamente en la realización de unatinción de Gram, cultivo del LCR y de la puesta enmarcha de otras técnicas rápidas como la detecciónde antígenos.

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5. TÉCNICAS RAPIDAS EN EL DIAGNOSTICO DELAS GASTROENTERITISLos microorganismos asociados con lasgastroenteritis incluyen bacterias, virus y parásitos.Tanto en la población adulta como en la infancia,Salmonella y Campylobacter son los entero-patógenos bacterianos que se aíslan con másfrecuencia en nuestro medio, especialmente durantelos meses cálidos del año. Shigella y Yersiniaenterocolitica son bacterias que causangastroenteritis también por mecanismo invasor comolas dos anteriores pero con una frecuencia muchomás baja. Las especies de Shigella se aíslanpreferentemente durante los meses cálidos y soncausa frecuente de enteritis en los viajeros. Yersiniaenterocolitica se aísla durante los meses fríos.Otros enteropatógenos poco frecuentes en nuestromedio son los diferentes tipos de E colidiarreagénicos que causan enfermedades entéricascon una sintomatología que varía desde una diarreacoleriforme hasta una disentería grave. E. colienteropatógeno (ECEP) es responsable de un grannúmero de casos de diarrea infantil en paísessubdesarrollados. E. coli enterohemorrágico (ECEH)y en especial E. coli O157:H7 ha sido la causa ennuestro medio de casos esporádicos poco frecuentesde colitis hemorrágica y de muy escasos brotes detoxiinfección alimentaria asociada a la ingesta deagua o alimentos contaminados. El ganado vacuno yovino constituye el principal reservorio siendo lacarne picada y las hamburguesas los principalesvehículos de transmisión. E. coli enterotoxigénico(ECET), excepcional en nuestro medio, estáconsiderado como la causa más frecuente de diarreainfantil en países subdesarrollados, y también es elagente causal más frecuente de la diarrea delviajero. ECET producen una enterotoxinatermoestable (ST), otra termolábil (LT) o ambas, quedan lugar a la secreción de electrolitos y agua en laluz intestinal. E. coli enteroagregativo (ECEA) dalugar a diarrea persistente en niños tanto en paísesdesarrollados como en vías de desarrollo y enpacientes con SIDA. E. coli enteroinvasivo (ECEI) seha detectado en brotes por alimentos contaminados.Otras bacterias patógenas también poco comunesson Vibrio cholerae O1, O139, bacterias toxigénicascausantes del cólera, V. cholerae de otros serotipos,Vibrio fluvialis y Vibrio parahaemolyticus que danlugar a casos esporádicos o a brotes de toxiinfecciónalimentaria asociados a la ingestión de mariscoscrudos o poco cocidos.En nuestro medio, las bacterias toxigénicas quecausan con mayor frecuencia infección porenterotoxinas vehiculadas por alimentos son, sinduda, S. aureus, Clostridium perfringens y Bacilluscereus.S. aureus es causante de enteritis por mecanismotoxigénico que con gran frecuencia ocasiona brotesde toxiinfección alimentaria. Este microorganismoproduce una gran variedad de sustanciasextracelulares que se definen como toxinas porqueafectan la función de la célula huésped o a sumorfología. Algunas de ellas expresan su efecto

perjudicial mediante una acción enzimática, otrascomo las enterotoxinas y las toxinas implicadas en elshock tóxico son potentes inductores de citocinasque actúan como superantígenos bacterianos.Alrededor del 50% de los aislamientos de S. aureusproducen enterotoxinas de las cuales se reconocencinco tipos serológicos distintos (A, B, C, D y E)subdividiendose el tipo C en tres subtipos (C1, C2 yC3). Todas estas enterotoxinas son polipéptidos deentre 20 y 30 KDa y son producidas por S. aureus enlos alimentos contaminados antes de su ingesta(toxinas preformadas). Por ello, la sintomatología dela gastroenteritis aparece tras un periodo deincubación muy corto (1-6 horas) y de forma brusca.El diagnóstico de esta toxiinfección alimentaria sebasa, fundamentalmente, en la detección de lasenterotoxinas en los alimentos y/o en las heces.El reservorio de B. cereus es fundamentalmentetelúrico y está ampliamente distribuido en lanaturaleza. Se encuentra en la materia orgánica endescomposición, en el polvo, el suelo, los vegetalesy el agua. Son bacilos aerobios o anaerobiosfacultativos formadores de esporas. Estas esporaspueden contaminar accidentalmente los alimentoscrudos, secos y cocidos o preparados, que si semantienen a temperatura ambiente, permitan lamultiplicación del microorganismo y la producción yliberación en el alimento de toxinas que ocasionanbrotes de toxiinfección alimentaria con relativafrecuencia. Existen dos tipos diferentes deenterotoxinas producidas por B. cereus, lasenterotoxinas termolábiles que provocan diarrea ylas toxinas eméticas que son termoestables. Eldiagnóstico de esta toxiinfección alimentaria tambiéndebe hacerse mediante la detección de la toxina enlos alimentos y/o en las heces.C. perfringens es un bacilo grampositivo esporuladoque forma parte de la microbiota anaeróbica normaldel tubo digestivo del ser humano y de los animales.Además sus esporas se encuentran ampliamentedistribuidas por el medio ambiente. Estemicroorganismo produce cuatro toxinas diferentes(alfa-toxina, beta-toxina, epsilon-toxina e iota-toxina)y sus cepas se distribuyen en cinco tipos (A-E)dependiendo del tipo de toxina que produzcan.Algunos estudios han implicado a C. perfringens encasos esporádicos de diarrea, diarrea asociada aluso de antibióticos y diarrea en instituciones paracuidados crónicos, no obstante este microorganismoproduce con relativa frecuencia toxiinfeccionesalimentarias. C. perfringens del tipo A produce unaenterotoxina termolábil citotóxica que en el hombreda lugar a un cuadro secretor benigno a nivel delintestino delgado. C. perfringens del tipo C se haasociado a enteritis necrotizante del intestinodelgado por acción de la toxina beta. Las cepas tipoA de C. perfringens son las responsables de casitodos los casos de intoxicación alimentaria y danlugar a la formación de una alfa toxina que es unaenterotoxina. La intoxicación alimentaria por C.perfringens se debe a la ingestión de alimentos quecontienen más de 106 unidades formadoras decolonias (UFC)/g de alimento, productoras de

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enterotoxina y casi siempre se asocia con alimentosproteicos de origen animal que se almacenaninadecuadamente. En el intestino delgado laenterotoxina se une a un receptor de membranainduciendo una ruptura de la permeabilidaddependiente del ión calcio que da lugar a la pérdidade metabolitos e iones de bajo peso molecular. Estapérdida modifica la función metabólica intracelularque incluye la síntesis de macromoléculas y seasocia con daño morfológico y lisis celular final. Estatoxina no esta preformada en el alimento, sino quese libera en el intestino después de la ingesta dealimentos contaminados.Clostridium difficile causa desde una diarrea levehasta un cuadro grave de colitis pseudomembra-nosa. Es la principal causa de la diarrea asociada altratamiento antibiótico y frecuentemente es deadquisición nosocomial, siendo responsable directode la prolongación de la estancia hospitalaria en unnúmero sustancial de pacientes con un gran costeeconómico asociado. Este microorganismo puedeaislarse también de las heces en un 3% deindividuos sanos y de hasta un 80% de los niñosmenores de un año, siendo las manifestacionesclínicas extraordinariamente escasas, en estapoblación, debido, probablemente, a la ausencia, enel colon de estos niños, de los receptores para lastoxinas que produce esta bacteria. En la patogeniade la infección por este microorganismo esimportante la reducción de la flora intestinal normalpor el tratamiento antibiótico y la acción de lastoxinas A y B. Las cepas de C. difficile asociadas aenfermedad en humanos generalmente producenambas toxinas. La toxina B es una potente citotoxinay la toxina A es una enterotoxina con capacidad pararomper las estrechas uniones existentes entre lascélulas epiteliales intestinales. Probablemente,ambas toxinas actúan de forma sinérgica.Recientemente se han comunicado casos deinfección por C. difficile causados por cepasproductoras sólo de toxina B, que representan el10% del total de las cepas toxigénicas.Las especies enteropatogenas del géneroCampylobacter son microaerófilas y crecen bien a37ºC, no obstante, la temperatura óptima decrecimiento de C. jejuni es de 42ºC. Las colonias deesta especie se observan en los medios de cultivoselectivos después de 48-72 horas de la incubación.Generalmente no son necesarios los medios deenriquecimiento para el aislamiento de C. jejunidebido a que las personas infectadas excretan de106 a 109 UFC del microorganismo por gramo deheces.La investigación de Helicobacter pylori tiene, en laactualidad, un gran interés por su papel en lapatología gastroduodenal. Se acepta a H. pyloricomo agente etiológico de la gastritis activa y crónicatipo B del hombre, así como su implicación en lasulceras pépticas y en el carcinoma gástrico tipoMALT en adultos, desempeñando también un papelimportante en la patología gastrointestinal infantil. Enel procedimiento microbiológico 17 de la SEIMC(Diagnóstico microbiológico de la infección por

Helicobacter pylori. M. López-Brea, T. Alarcón, M.Baquero, D. Domingo y G. Royo. 2004) se describetodo lo relacionado con este microorganismo,incluyendo los métodos de detección de antígeno.Los principales agentes clásicamente implicados enlas gastroenteritis víricas son rotavirus, norovirus,adenovirus entéricos y astrovirus. Actualmente, laimportancia médica de rotavirus es indiscutible y suprevalencia es muy elevada. Constituye, en nuestromedio y especialmente durante los meses fríos, lacausa principal de diarrea aguda con deshidrataciónen los niños menores de cinco años de edad. Lamayoría de hospitalizaciones por esta infeccióntienen lugar durante los dos primeros años de vida,no siendo infrecuente su transmisión nosocomial.Los rotavirus, pertenecientes a la familia Reoviridae,son virus sin envoltura que miden alrededor de 75nm de diámetro. La cápside está constituida por trescapas concéntricas de proteínas y el genoma estáformado por una doble cadena de ARN de 11segmentos. En relación a sus característicasantigénicas, estos virus se subdividen en grupos,subgrupos y serotipos. Existen siete gruposdenominados de la A a la G. En humanos, lagastroenteritis es debida fundamentalmente al grupoA y con mucha menor frecuencia a los grupos B y C.Los antígenos de grupo se localizan preferentementeen la proteína VP6 de la cápside, donde, en losrotavirus del grupo A, también se encuentran losantígenos de subgrupo. En este grupo, lascaracterísticas antigénicas del serotipo están enrelación con las proteínas externas de la cápside, laglicoproteína VP7 (serotipo G) y con la proteína VP4(serotipo P).Las infecciones por astrovirus ocurren en los cincocontinentes. A pesar de que en la mayoría de loscasos estas infecciones son benignas, los casos dehospitalización debidos a astrovirus sonrelativamente frecuentes, así como también sutransmisión nosocomial. A pesar de que lasinfecciones por astrovirus ocurren con menorfrecuencia que las infecciones por rotavirus ocalicivirus, desde el punto de vista de la saludpública deben tenerse en cuenta, puesto que hansido responsables de brotes de gastroenteritis encolegios, escuelas militares, geriátricos, guarderías yentre individuos inmunodeprimidos. La prevalenciade infecciones por astrovirus varía en función de losgrupos de edad estudiados, pero por regla generalparece que es mayor en niños menores de dos años.Actualmente, los astrovirus humanos se clasifican enocho serotipos, de los cuales se considera que elserotipo 1 es el más prevalente en todo el mundo.Los adenovirus son virus sin envuelta con una doblecadena de ADN y cuya cápside presenta simetríaicosaédrica. Existen 45 serotipos distintos de estosvirus que están asociados a una gran variedad decuadros clínicos, incluyendo faringitis, neumonía,conjuntivitis, cistitis hemorrágica y diarrea. El tipo deinfección depende del serotipo, no obstante, no esinfrecuente detectar un mismo serotipo en diferentescuadros clínicos. La mayoría de adenovirus entéricosdetectados hasta ahora pertenecen al subgénero F,

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especialmente, los adenovirus tipo 40 y 41 son ennuestro medio la tercera causa de diarrea en lapoblación infantil después de rotavirus y astrovirus.Los calicivirus humanos fueron en 1972 losprimeros agentes víricos asociados a gastroenteritisy desde entonces han provocado numerosos brotesepidémicos y hoy en día se consideran como laprimera causa de brotes de gastroenteritis víricas enadultos.Los norovirus son virus ARN sin envuelta quepertenecen a la familia Caliciviridae y quepreviamente se conocían como virus Norwalk-like(NLV). Existe una gran diversidad antigénica yactualmente la mayoría de norovirus humanos sehan clasificado genéticamente en dos grupos, elgenogrupo I y el II. El genogrupo I comprende almenos 7 subgrupos y el genogrupo II al menos 10.Las gastroenteritis producidas por parásitos quedanrecogidas en la sección �Técnicas rápidas en eldiagnóstico de las parasitosis� de este documentocientífico y en el documento técnico PNT-TDA-05.

6. TÉCNICAS RAPIDAS EN EL DIAGNOSTICO DELAS PARASITOSISLas enfermedades causadas por parásitos continúansiendo una causa muy importante de morbilidad ymortalidad en el mundo, especialmente en países envías de desarrollo. En el nuestro, algunas parasitosisson endémicas y otras se diagnostican en personasque han viajado a determinadas regiones del globo.El diagnóstico microbiológico tradicional de lasparasitosis intestinales se basa, en la mayor parte delos casos, en la visualización del parásito en lasheces. Las pruebas de detección de antígeno tienen,en general, una muy buena sensibilidad yespecificidad. Su principal inconveniente es que sólopueden detectar uno o pocos parásitos a la vez. Porello, el examen microscópico de las heces debecontinuar utilizándose si se pretende realizar unestudio completo. Debido a la expulsión intermitentede la mayoría de los parásitos, se necesita elexamen de tres muestras para poder conseguir unasensibilidad del 90%. Además, es preciso que serealice por personal especialmente formado enparasitología. Las pruebas de amplificación desecuencias genómicas son las que se considera quetienen mayor sensibilidad y especificidad, pero noestán comercializadas.Las parasitosis hemotisulares se diagnostican por elexamen microscópico de la sangre periférica. Enmuchas áreas de bajo desarrollo económico sondifíciles de realizar porque requieren personalespecialmente formado y material no siempredisponible. La mayoría de las pruebas de detecciónde antígeno se han desarrollado para poder serpracticadas sin ningún equipamiento especial y porpersonas sin formación específica.Entamoeba histolytica causa entre 34 y 50 millonesde infecciones sintomáticas y entre 50.000 y 100.000muertes al año. Tiene distribución mundial, aunquees más frecuente en zonas con malas condicioneshigiénicas. El protozoo provoca ulceraciones en lamucosa intestinal, que pueden llegar a originar una

perforación, evolucionar a un ameboma o, a travésde la vena porta, distribuirse al hígado y a toda laeconomía y ocasionar abscesos. Así, la infecciónpuede cursar de manera asintomática, o bienmanifestarse clínicamente en forma de cuadrosintestinales de curso crónico y recidivante, o agudo(disentería amebiana); o en forma de abscesoamebiano, más frecuentemente de localizaciónhepática. El diagnóstico microbiológico de las formasintestinales se realiza por el examen directo de lasheces o de muestras del borde de las úlceras,visualizando los trofozoítos o los quistes enpreparaciones en fresco o sin teñir.Desgraciadamente, a menos que se observen restosde hematíes en su interior que demuestren supatogenicidad, estas formas son indistinguibles delas de Entamoeba dispar, mucho más prevalente queE. histolytica y que no causa infección alguna. Enesta situación, el clínico sólo debería valorar loscasos en que existe un cuadro clínico compatible. Elabsceso amebiano se diagnostica por detección deanticuerpos circulantes.Las pruebas de detección de antígeno, realizadas enheces y en el contenido de los abscesos, sonespecíficas de la especie patógena. La distinciónentre E. histolytica y E. dispar se ha hechotradicionalmente por el análisis de cimodemas apartir del cultivo de heces, proceso lento y difícil derealizar rutinariamente. Actualmente se puederealizar por tipado con anticuerpos monoclonalesfrente a antígenos de superficie y por análisis delpolimorfismo de fragmentos de restricción; en laactualidad se dispone de pruebas de EIA que sebasan en la detección de epítopos específicos de lalectina amebiana. La detección de anticuerpos esindicativa de infección, ya sea presente o anterior(pueden persistir durante años).

Giardia lamblia es un protozoo flageladocosmopolita que se adquiere por la ingestión deagua contaminada o por contacto directo de personaa persona y que produce cuadros diarreicos y/o demalabsorción. Su prevalencia se calcula en 5-50%en países en desarrollo, 1-7% en paísesindustrializados, y, en ciertas circunstancias, comoen determinadas instituciones, hasta el 90%. Eldiagnóstico etiológico se efectúa por el examenmicroscópico de las heces. Al ser su eliminaciónintermitente, se recomienda recoger tres muestras endías alternos para aumentar la sensibilidad. Además,suele estar en el moco intestinal, hecho que dificultasu visualización. En algunos casos es precisoobtener una muestra duodenal para examen directoy a veces se diagnostica por endoscopia. Existendiversos métodos de detección de antígeno, cuyasensibilidad y especificidad de más del 90%, superana las del examen microscópico.Cryptosporidium parvum es un coccidio dedistribución mundial, que se transmite por vía fecal-oral y, más raramente, sexual. Se calcula que suprevalencia en humanos oscila entre el 0,6% y el10,4%. Provoca cuadros de gastroenteritis,especialmente en pacientes inmunodeprimidos,

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particularmente los infectados por el VIH. En elexamen microscópico de las heces conservadas yteñidas con mertiolato-yodo-formol (MIF), losooquistes de C. parvum se pueden confundir conlevaduras, aunque, a diferencia de éstas, no se tiñencon el yodo ni se reproducen por gemación. Enconsecuencia, es preferible realizar una preparaciónpermanente de las heces, con tinciones quemanifiestan su ácido-alcohol resistencia, como latinción de Kinyoun. La de auramina-rodamina puedeservir como cribado, que se debe confirmar. Laspruebas de detección de antígeno y PCR constituyenalternativas válidas al examen microscópicotradicional.El paludismo o malaria es una infección causadapor una o varias de las cuatro especies dePlasmodium patógenas para el hombre: Plasmodiumfalciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariaey Plasmodium ovale. Es transmitida por el mosquitoAnopheles. Su incidencia y mortalidad se estiman enunos 300 millones y 1,5 millones de personas al año,respectivamente. En España, se declaran unos 400casos/año, especialmente en pacientes que viajan azonas endémicas y que no han efectuado laquimioprofilaxis. Son especialmente frecuentes lasinfecciones por P. falciparum en pacientesprocedentes de África. En los que proceden deSudamérica se suele encontrar P. vivax o P.falciparum y en los que proceden de Centroamérica,P. vivax. Causan una infección sistémica, que puedellegar a ser mortal, especialmente la infección por P.falciparum. El tratamiento antipalúdico depende de laespecie implicada y de la presencia de resistencia enla región en que se haya adquirido.El diagnóstico se efectúa por el examenmicroscópico de sangre periférica teñido continciones hematológicas, como el Giemsa o Diff-Quick. La debe hacer personal experimentado. Laspreparaciones hechas con la técnica de la gotagruesa sirven como prueba de cribado. El estudio delas extensiones es imprescindible para el diagnósticode especie y para la cuantificación de la parasitemia.Se han desarrollado muchos otros tipos de pruebaspara el diagnóstico de la malaria, basadas en elexámen con microscopio de fluorescencia o en lacitometría de flujo. Las técnicas de amplificacióngenética por PCR son las más sensibles, tienenmayor capacidad de diagnosticar infecciones mixtasy se consideran de referencia.En las zonas pobres de los países endémicos esdifícil efectuar el diagnóstico etiológico por examenmicroscópico, ya sea por falta de instalaciones y/o depersonal entrenado. Por ello, el tratamiento seadministra de forma empírica. Evidentemente, esinevitable que en muchas situaciones el tratamientosea inadecuado, hecho que repercute en laevolución del paciente y en la generación deresistencias a los antipalúdicos en la región.Las técnicas de detección de antígeno se handiseñado para ser realizadas en cualquier tipo delaboratorio, no siendo necesario personal técnicoespecializado. De esta manera se evitaríantratamientos inadecuados, se mejoraría la atención a

los pacientes y también se controlaría el incrementoen la aparición de resistencias de Plasmodium. Pordesgracia, el coste económico de estas pruebas nopermite que sean accesibles en las zonas conmenos recursos. Además, su sensibilidad es menorque el examen microscópico directo.La leishmaniasis visceral es una infecciónendémica en el área mediterránea. Desde la décadade los 80 se está produciendo un aumento de laincidencia de la coinfección Leishmania-VIH. Ennuestro país, entre el 2 y el 9% de los pacientesinfectados por el VIH desarrollan una leishmaniasisvisceral, siendo especialmente frecuente en losdiagnosticados de SIDA y con una cifra de CD4inferior a 200/µl. En nuestro medio el 70% de lospacientes con leishmaniasis visceral están infectadospor el VIH, y de estos el 71% son adictos a drogaspor vía parenteral. El diagnóstico clínico de laleishmaniasis asociada al SIDA se ve dificultado porla presencia de manifestaciones atípicas, posiblesenfermedades coexistentes y al hecho de que losenfermos serpositivos difícilmente desarrollananticuerpos frente a nuevos agentes infecciosos.Debido a la baja sensibilidad de la serología, eldiagnóstico microbiológico de certeza se lleva a cabomediante la visualización del parásito y cultivo demuestras de aspirado de médula ósea. Sin embargo,se trata de una técnica invasora y que implica unacierta habilidad debido en ocasiones a la pocacantidad de parásitos, lo que hace necesario eldesarrollo de métodos diagnósticos más simplespero con elevada sensibilidad y especificidad.Existen diferentes especies de filarias, todas ellastransmitidas por artrópodos, que afectan a los tejidoslinfático, subcutáneo y cutáneo. Las hembras adultasproducen microfilarias, que se pueden encontrar enla sangre o en la piel. Afectan a 120 millones depersonas al año y Wuchereria bancrofti causa másdel 90% de los casos. Se encuentra en regionestropicales y subtropicales y se transmite por lapicadura de mosquitos de los géneros Anopheles,Culex y Aedes. El adulto vive en el sistema linfático,causando linfangitis, linfadenitis, fibrosis obstructiva,elefantiasis de las extremidades y los genitales ehidrocele. El parásito circula en la sangre periféricageneralmente por la noche, excepto en la región delsur del Pacífico, en la que no se observa ningunaperiodicidad.El diagnóstico se basa en la observación de lasmicrofilarias presentes en la sangre periférica. Enpreparaciones en fresco, se observa el movimientode las filarias fácilmente. Sin embargo, para eldiagnóstico de especie se necesita observarpreparaciones teñidas, ya sea de extensiones desangre o de preparaciones hechas con la técnica dela gota gruesa. El número de microfilarias puede sermuy escaso y muchas veces es preciso empleartécnicas de concentración, como la de Knott o la demembrana. Aún así, el examen microscópico directono es capaz de diagnosticar todos los casos.Debido a que no existe ningún reservorio animal, laOMS se ha planteado la posibilidad de eliminardefinitivamente esta enfermedad. Las pruebas de

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detección de antígeno, sencillas de realizar, podríandesempeñar un importante papel en el control de lamisma. También existen pruebas de detección deanticuerpos y PCR. Debido al carácter crónico de lainfección, es posible encontrar personas infectadasen nuestra área geográfica que anteriormente hayanvivido en zonas endémicas.

7. TÉCNICAS RAPIDAS EN EL DIAGNOSTICO DELAS INFECCIONES POR HERPESVIRUSLos herpesvirus pertenecen a la familia Herpesviridae.Son un grupo de virus morfológicamente similares,cuyo genoma consiste en ADN bicatenario, recubiertode una cápside proteica de morfología icosaédricarodeada de una envuelta de estructura lipoproteica dela cual parten unas proyecciones glicoproteicas. Laprincipal propiedad de los herpesvirus es su capacidadde permanecer latentes en el organismo y reactivarse,a pesar de la presencia de anticuerpos específicos,dando lugar a infecciones recurrentes. Estasrecurrencias pueden darse en personas previamentesanas como consecuencia de diversos estímulos o enpersonas inmunodeprimidas. Actualmente sereconocen ocho herpesvirus humanos (Tabla 2) queposeen características biológicas distintivas que son labase de su identificación en el laboratorio.Los HHV-1 y 2 están relacionados antigénicamentecon el HHV-3 pero no con el HHV-4, 5 , 6, 7 y 8. LosHHV-1 y 2 entran en el organismo a través de la pielo mucosa oral (HHV-1) y/o genital (HHV-2),multiplicándose en las células epiteliales y dandolugar a lesiones vesiculares. Difunden a los ganglioslinfáticos regionales, donde se multiplicannuevamente, causando, ocasionalmente, viremia.Simultáneamente, el virus alcanza los ganglios

nerviosos sensoriales, en cuyas neuronas seestablece la persistencia vírica.Tras diferentes estímulos el virus puede reactivarsellegando por migración centrífuga a través de losaxones neuronales hasta las superficies mucosas ocutáneas, inervadas por ellos y produciendo lesionesde características semejantes a las de laprimoinfección. La primoinfección por HHV-2 puedeestar asociada a fiebre, malestar, disuria y adenopatíasinguinales. Una de las complicaciones más frecuenteses la meningitis aséptica que se presenta en un 10%de los casos. La queratoconjuntivitis herpética secaracteriza por la formación de úlceras dendríticas quepueden afectar el estroma corneal. Las recurrencias enesta localización pueden conducir a la ceguera.Los HHV-1 y 2 pueden afectar cualquier zona de la piely las lesiones pueden adoptar diferentes disposicionesque en ocasiones pueden mimetizar la infección porHHV-3. La principal forma clínica de la recurrencia dela infección herpética es la lesión de la mucosa oral olabial. En los enfermos inmunodeprimidos estarecurrencia se manifiesta a menudo como unamucositis localizada en un área de la boca ogeneralizada a toda la mucosa oral y en cuya etiologíase asocian frecuentemente hongos del géneroCandida. Estos pacientes pueden desarrollar unaneumonitis, hepatitis o una infección diseminada. Lainfección orofaríngea en niños está causadageneralmente por el HHV-1 mientras que lasinfecciones por el HHV-2 se adquieren al iniciar la vidasexual activa durante la adolescencia.La puerta de entrada del HHV-3 es la mucosa delaparato respiratorio, donde éste se multiplica.

Tabla 2. Clasificación, nomenclatura actual y abreviaturas oficiales de los virus de la familia Herpesviridae

Subfamilia Género Especie

AlphaherpesvirinaeSimplexvirus Herpesvirus humano 1 (HHV-1) (v. herpes simple 1)

Herpesvirus humano 2 (HHV-2) (v. herpes simple 2)

Varicellovirus Herpesvirus humano 3 (HHV-3) (v. varicela zoster)

Betaherpesvirinae Cytomegalovirus Herpesvirus humano 5 (HHV-5) (citomegalovirus)

Roseolovirus Herpesvirus humano 6 (HHV-6)Herpesvirus humano 7 (HHV-7)

Gammaherpesvirinae Lymphocryptovirus Herpesvirus humano 4 (HHV-4) (v. Epstein Barr)

Rhadinovirus Herpesvirus humano 8 (HHV-8)

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Seguidamente se produce la viremia que permite ladiseminación del virus a todo el organismo y su llegadaa la piel, donde produce la lesión vesicularcaracterística desde la cual y a través de los axonesnerviosos el virus alcanza el ganglio nervioso sensorialde la zona donde permanece en estado de latencia.Las membranas mucosas de la boca, la faringe, laconjuntiva y los genitales externos también suelenestar afectadas, sin embargo en estas localizacioneslas vesículas se rompen fácilmente y en muchasocasiones pasan desapercibidas. La estomatitis esfrecuente en el caso de la varicela grave siendo laslesiones dolorosas. En caso de reactivación, losviriones llegan a la piel a través de los nerviossensitivos, donde producen lesiones vesiculares(herpes zoster) muy similares a las de la varicela perocaracterizadas por su distribución en un únicodermatoma.Las manifestaciones clínicas causadas por losHHV1, 2 y 3 pueden ser indistinguibles por lo que laconfirmación de la etiología de la infección esnecesaria para el inicio precoz del tratamiento y elestablecimiento de las dosis adecuadas del mismo.La técnica de referencia para el diagnóstico delaboratorio de las infecciones por HHV-1, 2 y 3 es elaislamiento en cultivo celular. La multiplicación víricase manifiesta por un efecto citopático característico,generalmente de 24 a 48 horas después de lainoculación para HHV-1 y 2 y es de evolución muylenta (aparece de 5 a 7 días después de lainoculación) en el caso de HHV-3. La identificacióndefinitiva se realiza por medio de antisuerosespecíficos marcados con fluoresceína. Lasensibilidad del método depende de la fase en la quese encuentre la lesión, del estado deinmunocompetencia del paciente y de si se trata deuna primoinfección o de una reactivación. Lasmuestras adecuadas para el aislamiento consistenen el líquido vesicular obtenido a partir de la lesión obien el exudado del fondo de las úlceras cualquieraque sea su localización. En todos los casos, parafacilitar la obtención de resultados positivos, lasmuestras deben tomarse precozmente. El método decultivo-centrifugación en el que tras la inoculación dela muestra al cultivo celular (tubo shell-vial) sefavorece la infección mediante una centrifugaciónsuave durante unos 40 minutos y se realiza, sinesperar a la aparición del efecto citopático, unadetección de los antígenos víricos a las 24-48 horas,permite disminuir el tiempo de diagnóstico habitualde 5-7 días. La sensibilidad de esta técnica es similara la del cultivo convencional. Estos métodosrequieren instalaciones adecuadas para elmantenimiento y/o propagación de cultivos celulares.La puerta de entrada del HHV-4 es la orofaringe. Aquí,el virus se multiplica y llega a los linfocitos B, dondepersiste. La respuesta inmune celular frente a lainfección es la principal causante de la sintomatologíadel enfermo. La infección es usualmente asintomáticaen niños pero los adolescentes y adultos jóvenespresentan una enfermedad característica que es elsíndrome mononucleósico.

El diagnóstico de laboratorio de la mononucleosisinfecciosa es serológico y la prueba más ampliamenteutilizada es la detección de anticuerpos heterófilosfrente a hematíes de carnero, según la técnica dePaul-Bunnell. La presencia de estas aglutininas sedetecta en el 50% al 80% de los pacientes entre laprimera y la tercera semana de la enfermedad. Unavez que aparecen pueden persistir durante variosmeses. Su ausencia es más frecuente en los pacientesmás jóvenes, sobre todo los menores de 5 años.El aislamiento del virus a partir de muestrasorofaríngeas o linfocitos periféricos requiere suinoculación en linfocitos de sangre de cordón umbilicaly la observación de su transformación. La complejidadde estos procedimientos y el conocimiento de lafrecuente eliminación del virus por portadores sanosdeterminan que esta técnica esté reservada a loslaboratorios de investigación. Los anticuerpos de laclase IgG frente al antígeno de la cápside vírica seencuentran en general a un título elevado en el suerotomado en la fase aguda y se mantienen a lo largo detoda la vida. La seroconversión solo se detecta en el10-20% de los casos. Los anticuerpos de la clase IgMfrente al antígeno de la cápside sólo aparecen durantela mononucleosis infecciosa y persisten 4-8 semanas,por lo que su detección tiene significado diagnóstico.El HHV-5 (citomegalovirus) se transmiteprobablemente por contacto directo a través de lasaliva, la orina, por transfusión, a través de la placentay, en el transplante, por el órgano transplantado. En laspoblaciones con bajo nivel socioeconómico la infecciónpostnatal por HHV-5 es muy frecuente mientras quecuando este nivel es alto solo el 10-15% de losadolescentes han estado en contacto con el virus,aumentando rápidamente el porcentaje en los adultosjóvenes hasta los 35 años. Aunque en general laadquisición de la infección es asintomática algunospacientes desarrollan un síndrome mononucleósico.La diseminación se produce por vía hematógena. Estaenfermedad se caracteriza por la aparición en sangreperiférica de linfocitos atípicos indistinguibles de losque aparecen en la infección por virus Epstein-Barracompañados clínicamente de fiebre prolongada,malestar y mialgias. Asimismo suele constatarsediscreta alteración de las pruebas hepáticas. El viruspersiste indefinidamente en múltiples tejidos delhuésped, en los linfocitos y en las células de lasglándulas salivales entre otros. Cuando la inmunidadcelular disminuye, ya sea por enfermedad o portratamiento, el virus se reactiva y puede dar lugar aneumonía, hepatitis, afectación del tracto gastro-intestinal y, ocasionalmente, a infección diseminada.El método de elección para el diagnóstico de lasinfecciones por HHV-5 es el aislamiento en cultivoscelulares. Las muestras para aislamiento de HHV-5 nodeben ser nunca congeladas debido a la rápidadestrucción del virus en los procesos de congelación ydescongelación. Sin embargo la viabilidad se mantienea 4ºC durante 24 a 48 horas. Debido a la lentamultiplicación del HHV-5 en los cultivos celulares,éstos deben mantenerse durante 4 a 6 semanas antesde considerarlos negativos. La observación del efectocitopático característico del virus permite detectar su

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presencia. Las células se caracterizan por estaraumentadas de tamaño y por poseer una inclusiónintranuclear eosinófila separada de la membrananuclear por un halo claro. Este tipo de células puedendetectarse también en la orina y en las secrecionesrespiratorias de los pacientes, así como en las biopsiasde los órganos afectos y en las muestras de autopsia.Si bien cuando es positiva es diagnóstica, puede sernegativa en pacientes virúricos, así como en muestrasde órganos a partir de los cuales se aísla HHV-5.La lentitud de aparición y desarrollo del efectocitopático reduce la utilidad clínica del aislamientovírico. La disponibilidad de anticuerpos monoclonalesfrente a varios antígenos de HHV-5 ha permitido ponera punto diferentes técnicas para el diagnóstico rápidode estas infecciones. Entre ellas una de las másutilizadas en la actualidad es la detección de antígenoprecoz de HHV-5 en cultivo celular. En esta técnica seinocula la muestra mediante centrifugación en dostubos shell-vial que contienen un cubreobjetosrecubierto de células MRC5, a las 24 y 48 horasrespectivamente se retira este cubreobjetos y se tiñecon un anticuerpo monoclonal específico paraantígeno precoz de HHV-5 marcado con fluoresceína.Este método, al igual que el aislamiento en cultivocelular, requiere un laboratorio con instalacionesadecuadas para el mantenimiento y/o propagación decultivos celulares.El HHV-6 consiste en dos virus muy parecidos peroclaramente diferentes que se denominan HHV-6A yHHV-6B. El HHV-6A no se ha relacionado con ningunaenfermedad hasta el momento mientras que el HHV-6B es el agente etiológico del exantema súbito y deotros síndromes en los niños y frecuentemente esactivo en los pacientes inmunodeprimidos. La infecciónen el adulto se puede presentar como un síndromemononucleósico, hepatitis y encefalitis. En lospacientes inmunodeprimidos, transplantados o coninfección por el virus de la inmunodeficiencia humana(VIH) el virus es capaz de reactivarse. En los pacientescon transplante de médula ósea y de órgano sólido laviremia por HHV-6 puede inducir supresión medular.Por otro lado parece que la infección sintomática porHHV-6 está casi siempre asociada a la infección porHHV-5. En los pacientes infectados por el VIH el HHV-6 actúa como inmunomodulador modificando lareplicación del VIH y colaborando en la disminución delnúmero de linfocitos T CD4.La técnica de referencia para el diagnóstico delaboratorio es el aislamiento en cultivo celular a partirde leucocitos de sangre periférica. Al cabo de 5 a 21días aparece un efecto citopático específico querequiere la confirmación mediante anticuerposmonoclonales. Una adaptación rápida de la técnica esel cultivo-centrifugación (shell-vial) con el que seobtienen resultados en 1 a 3 días. La complejidad delos métodos de cultivo empleados en el aislamiento delHHV-6 ha llevado a que el diagnóstico de laboratorioutilizado de rutina sea el serológico. La infección porHHV-6 se demuestra serológicamente por la presenciade anticuerpos específicos de la clase IgM o bien porla seroconversión.

El HHV-7 ha sido aislado de linfocitos T CD4+ depersonas sanas. Hasta el momento sólo ha sidorelacionado con un caso de exantema súbito en el queno se detectó el HHV-6 por lo que su papel patógenoes desconocido hasta el momento. El hecho de que elHHV-7 se pueda aislar de la saliva del 75% de losadultos sanos sugiere que se transmita mediante lassecreciones orales. La detección de este virus no serealiza de forma rutinaria.El HHV-8 se considera como el agente etiológico delsarcoma de Kaposi ya que se ha detectado ADNvírico en todas las formas del tumor incluyendopacientes seropositivos para el VIH, pacientes consarcoma de Kaposi endémico y aquellos con lallamada forma mediterránea. También se hadetectado el genoma del virus en los linfocitos desangre periférica de pacientes seropositivos para elVIH con o sin sarcoma de Kaposi, en linfomas decélulas B y en células uroteliales de pacientesinmunocompetentes.El HHV-8 es de distribución universal. Los estudiosde seroprevalencia sugieren la transmisión sexual dela infección aunque la presencia de anticuerpos enniños apunta a la existencia de otros mecanismos deinfección. El diagnóstico de laboratorio puederealizarse mediante técnicas de PCR. Por otra parteexisten diversos reactivos para la determinación deanticuerpos. Sin embargo, no hay informaciónsuficiente sobre la historia natural de la infección porHHV-8 y la eficacia de las pruebas de laboratoriopara la interpretación clínica de los resultadosobtenidos.

8. TÉCNICAS RAPIDAS EN EL DIAGNOSTICO DELAS MICOSIS INVASORASEn los últimos años la frecuencia de las infeccionesfúngicas se ha incrementado principalmente por unaumento en la supervivencia de pacientesinmunodeprimidos. Como en todas las infecciones, lainstauración precoz del tratamiento adecuado esimprescindible para mejorar el pronóstico, peroalgunos antifúngicos pueden ocasionar toxicidadimportante y por esta razón es preciso obtener undiagnóstico etiológico que ajuste el tratamientoempírico. Las micosis a las que se refiere el presentedocumento son la candidiasis, la aspergilosis, lacriptococosis y la neumonía por Pneumocystisjiroveci, para cuyo diagnóstico o seguimiento se handesarrollado métodos estandarizados de detecciónde antígeno. Existen muchas otras micosis, pero nose dispone de este tipo de metodología, o bien sonmuy infrecuentes en nuestro medio y se realizan sóloen laboratorios de referencia (histoplasmosis).En muchas ocasiones, las micosis invasoraspresentan manifestaciones clínicas inespecíficas. Engeneral, se requiere un alto índice de sospecha paradiagnosticarlas. Las pruebas de detección deantígeno ayudan en la toma de decisiones clínicas,muchas veces en combinación con otras pruebasmicrobiológicas (detección de anticuerpos, PCR) ocon exploraciones complementarias (diagnóstico porimagen o broncoscopias). En la criptococosis y en lahistoplasmosis, el hallazgo del hongo en una

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muestra clínica siempre es patológico. En cambio, enla candidiasis y en la aspergilosis no siempre es fácildistinguir entre colonización e infección.La aspergilosis es una infección típicamenteoportunista. El hongo es cosmopolita y vive en restosorgánicos en descomposición. Los conidios, ubicuosen la atmósfera, tienen el tamaño adecuado parapoder alcanzar el alvéolo pulmonar, venciendo todoslos mecanismos de defensa externos del árbolrespiratorio. Una vez allí, son fagocitados por losmacrófagos. En caso que alguna germine y empiecea desarrollar un filamento, el neutrófilo ejerce suacción. Las distintas formas clínicas de aspergilosisinvasoras (pulmonar, sinusal, traqueobronquial,cerebral, cutánea, diseminada, etc) suelen afectar apacientes inmunodeprimidos, especialmente enestados de neutropenia importante, receptores detransplantes de órganos sólido o médula ósea,tratamiento con dosis altas de corticoides,quimioterapia antineoplásica (en especialciclosporina ) y pacientes con SIDA. Tienen un malpronóstico y una alta mortalidad. La instauraciónprecoz de un tratamiento antifúngico adecuadopuede mejorar considerablemente el desenlace de lainfección. Por desgracia, el cuadro clínico suele serinespecífico.El diagnóstico de certeza se establece con lapráctica del examen microscópico directo y el cultivode una muestra apropiada, como una biopsia o unlavado broncoalveolar obtenido por broncoscopia.Pero la mayoría de las veces es imposible derecoger, debido a la presencia de hipoxemia,trombocitopenia y/o al mal estado general delpaciente. Por otra parte, un cultivo positivo de unamuestra obtenida por broncoscopia no indicasiempre aspergilosis invasora, especialmente enpacientes con EPOC o sometidos a transplante deórgano sólido. Además, el resultado suele ser tardío.Los hemocultivos suelen ser negativos. El problemaprincipal en el diagnóstico de la aspergilosis invasoraes, pues, la dificultad del diagnóstico de formasuficientemente precoz como para que sea deutilidad para el paciente. Todo ello ha justificado eldesarrollo de métodos alternativos de diagnósticoprecoz en muestras sencillas de obtener. Ladetección de anticuerpos de forma aislada no es útilpor la inmunodepresión de los enfermos afectados yla respuesta presente en la mayoría de personassanas. En cambio, las pruebas de diagnósticodirecto, ya sea detección de antígeno, de secuenciasgenómicas o de metabolitos, han dado mejoresresultados. Su sensibilidad y especificidad sonaceptables, al menos en las situaciones másfrecuentes. Realizadas en pacientes pertenecientesa los grupos de más riesgo, de manera sistemática yrepetida, proporcionan un alto índice de sospechadiagnóstica que, junto con el resto de datos clínicos,ayudan a tomar decisiones diagnósticas yterapéuticas precozmente.Los hongos del género Candida son capaces decausar infecciones oportunistas de muchos tiposdiferentes: de piel, mucosas, uñas, infeccionesurinarias, de catéter, de otras localizaciones y,

finalmente, sistémicas. Las infecciones localizadassuelen sospecharse por los signos clínicos y sediagnostican con un exámen microscópico directo ocon el cultivo. Sin embargo, las manifestacionesclínicas de las candidiasis sistémicas soninespecíficas y requieren un alto índice de sospecha.Además, su incidencia ha ido en aumento en losúltimos años. Un hemocultivo positivo establece eldiagnóstico, pero por razones que se desconocen,los hemocultivos suelen ser negativos. Paraincrementar su sensibilidad, es conveniente usar elsistema de lisis-centrifugación o, en su defecto,airearlos e incubarlos durante 30 días. Un cultivopositivo en una muestra de un territorio normalmenteestéril tiene valor diagnóstico. Sin embargo, en lamayoría de las ocasiones no se dispone del mismo.Al igual que en la aspergilosis, es difícil dar valorpatológico a un cultivo positivo de un territorionormalmente colonizado por microbiota comensal osaprofita, especialmente frecuente en este casoporque Candida forma parte de la microbiotacomensal de la especie humana. Muchas muestraspositivas en diferentes regiones anatómicas sugierenenfermedad invasora. La detección de anticuerpostampoco es útil, debido a que muchas personas losdesarrollan sin presentar candidiasis y a que lospacientes que la padecen no suelen poderproducirlos. Es preciso disponer de otras pruebasque la confirmen. Por ello, las de detección deantígeno en sangre deberían solucionar el problema.Las técnicas de PCR son útiles. Se amplificandiferentes genes cromosómicos (lanosteroldemetilasa, proteniasa aspártica, quitina sintasa yactina), o bien genes presentes en múltiples copiascomo rARN 18S, o 28S o genes mitocondriales.Tienen una alta sensibilidad y además, existe unacorrelación con la evolución. Es preciso eliminarcualquier fuente de contaminación (en el enzimalítico, hongos en el aire o en el agua). No estándisponibles comercialmente.Cryptococcus neoformans es un hongolevaduriforme que causa infecciones en pacientesgeneralmente inmunodeprimidos, especialmente enlos infectados por el VIH. Se adquiere por víainhalatoria, pero la forma clínica más frecuente es lameningoencefalitis. Las manifestaciones clínicassuelen ser de aparición relativamente lenta, concefalea, irritabilidad y cambio de carácter; peroexisten casos de progresión rápida. La fiebre esbaja, o está ausente. La rigidez de nuca y los signosde Kernig y Brudzinski no existen o son leves yaparecen signos de edema cerebral o dehidrocefalia. Las anomalías analíticas del LCRpueden ser leves en cualquiera de sus parámetros(leucocitos, proteínas o glucosa) o faltar en absoluto(en el 20% de los casos en pacientes con SIDA). Sintratamiento la enfermedad es mortal en todos loscasos. Otras formas clínicas son la neumonía, laafectación cutánea (presente en el 10% de los casosy más frecuente en inmunodeprimidos), ósea,articular, ocular y la de la próstata, entre otras. Lamayoría pueden evolucionar a la formameningoencefalítica. El diagnóstico se puede realizar

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fácilmente y de manera rápida si el examenmicroscópico con tinta china del líquidocefalorraquídeo es positivo; pero la sensibilidad deeste método es limitada. El hongo se cultiva en losmedios micológicos habituales, aunque a vecescrece muy lentamente. El uso de agar con semillasde níger o negrillo (Guizotia abyssinica) es muy útilpara aislarlo de muestras en que también Candidaestá presente, porque su actividad fenoloxidásicametaboliza el ácido cafeico del medio, desarrollando alos 5 días unas colonias de color marrón oscuro. Laspruebas de detección de antígeno son muy sensibles yespecíficas y se pueden utilizar en suero y líquidocefalorraquídeo siempre que se sospeche unacriptococosis del sistema nervioso central.Histoplasma capsulatum (H. capsulatum var.capsulatum y H. capsulatum var. duboisii) es unhongo dimórfico que se encuentra principalmente enAmérica y África, que se adquiere por vía aérea yque causa infecciones subclínicas, o bien infeccioneslocalizadas y diseminadas, de curso parecido a latuberculosis. Afecta especialmente a pacientes conSIDA. El cultivo de las lesiones o de la sangre sueleser positivo, pero tardíamente (hasta 60 días enalgunos casos). La detección de anticuerposespecíficos para el diagnóstico de la histoplasmosispresenta algunos problemas. Por ejemplo, lasprecipitinas al antígeno M aparecen si se efectúa unaintradermoreacción a la histoplasmina y susensibilidad es del 75%. La aparición de precipitinasal antígeno H es tardía y la sensibilidad es del 20%.Además, existen falsos positivos. Existen reaccionescruzadas con otras micosis. También existenpruebas de fijación de complemento, inmunodifusión,aglutinación de partículas de látex y hemaglu-tinación, pero su efectividad es limitada. Cuando estáindicado el tratamiento, es preciso que sea de largaduración. Actualmente la prueba de detección deantígeno en orina y sangre tiene una alta sensibilidady especificidad. Es una técnica que únicamente sedesarrolla en laboratorios de referencia (Dr. Wheat,http://www.miravistalabs.com/.)Pneumocystis jiroveci antes Pneumocystis cariniies un patógeno oportunista que produce neumonía,fundamentalmente en pacientes inmunodeprimidos.Es la infección oportunista más frecuente en lospacientes con SIDA. Es un microorganismo dedistribución universal. El 80-90% de los niños se hanexpuesto al microorganismo en los primeros 3-4años de vida. La adquisición ocurre probablementepor vía respiratoria, aunque se desconocen lasfuentes. Tras su inhalación P. jiroveci entra enestado de latencia debido a la respuesta humoral ycelular del huésped y permanece en estado latentehasta que se produce la inmunodepresión que lepermite reactivarse. En este sentido se comportacomo un oportunista estricto. La neumonía intersticialde células plasmáticas constituye una entidad clínicade características diferentes a la típica neumonía depacientes inmunodeprimidos. Suele cursar de formainsidiosa e inespecífica y evolucionaprogresivamente hacia el distrés respiratorio y lacianosis. Los síntomas más frecuentes son la fiebre,

la tos sin expectoración y la disnea. En los pacientescon SIDA se han descrito localizacionesextrapulmonares. La mayoría de exploracionescomplementarias son absolutamente inespecíficas yaunque la radiografía de tórax suele presentaralteraciones, una radiografía normal no descarta laneumonía por Pneumocystis. El cuadro clínico y laradiografía de tórax no permiten diferencia laneumonía por P. jiroveci de otras afeccionespulmonares en los pacientes inmunodeprimidos. Losintentos de realizar el diagnóstico mediantedetección de antígenos en suero han resultadoinfructuosos. Tampoco los métodos serológicos sonútiles. Por ello, el diagnóstico definitivo debeestablecerse mediante la demostración de algunaforma de P. jiroveci en muestras respiratorias. Apesar que en determinadas circunstancias unamuestra de esputo puede ser adecuada paraproporcionar el diagnóstico, el método más utilizadoes la fibrobroncoscopia con lavado broncoalveolar.

9. TÉCNICAS RAPIDAS EN EL DIAGNOSTICO DELAS HEPATITIS VIRICAS Y LA INFECCIÓN POREL VIHLa detección del antígeno de superficie (HBsAg) esel primer y principal marcador de infección en eldiagnóstico de las hepatitis víricas, tanto en formade cuadro agudo como en las formas crónicasproducidas por el virus B de la hepatitis (VHB)En la hepatitis C (VHC) también es posibledeterminar la presencia en el suero del paciente delantígeno del core de la hepatitis C (HCcAg). Ambasdeterminaciones deben realizarse en función delcuadro clínico del paciente y junto a la detección deotros marcadores de infección aguda o crónica.El diagnóstico de la infección por el virus de lainmunodeficiencia humana (VIH) se basaprincipalmente en la detección de anticuerpos frentea este virus. La detección de antígeno p24 tieneinterés teórico en dos situaciones; en primer lugarpara el diagnóstico de la primoinfección y ensegundo lugar como indicador de progresión ypronóstico de la infección. Para esta segundasituación, actualmente está generalizado el uso detécnicas moleculares de cuantificación viral (cargavírica) que permiten el seguimiento y controlevolutivo y de respuesta terapéutica en el pacienteinfectado por el VIH.Durante la primoinfección y antes de laseroconversión podemos detectar altos títulos deantígeno p24 del VIH. Posteriormente la formaciónde inmunocomplejos antígeno p24 y anticuerposanti-p24 circulantes dificulta su detección.Actualmente las técnicas de disociación por calorjunto a amplificaciones de la señal en el EIA ofrecenresultados de mayor confianza que las técnicasantiguas por acidificación.Existen muchos reactivos comercializados quecombinan la detección de anticuerpos frente a VIH 1y VIH 2 y a su vez la detección de antígeno p24.Estos reactivos pueden conseguir disminuir elperiodo ventana sin que se vea afectada lasensibilidad y especificidad para la detección de

http://www.miravistalabs.com/.

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anticuerpos frente al VIH. En cualquier caso laantigenemia primaria dura 1-3 semanas, de modoque únicamente es realmente útil su detección, ensituaciones clínicas de elevada sospecha deinfección por el VIH.Las recomendaciones y observaciones sobre lastécnicas rápidas de detección de antígeno en lashepatítis víricas y en la infección por el VIH quedanrecogidas en los procedimientos SEIMC 2a(Serología de las hepatitis víricas. A. Delgado-Iribarren García-Campero, J.M.l Echevarría Mayo yP. León Rega. SEIMC, 2004) y 6 (Diagnósticomicrobiológico de la infección por VIH. 6. R. Ortiz deLejarazu Leonardo, R. Cisterna Cáncer, J.M. EirosBouza, A. González López, M.C. Maroto, T.Pumarola Suñe y J.R. Vivas. SEIMC. 1998) por loque este apartado no se acompaña delcorrespondiente documento técnico.

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10.5 PARASITOSIS
















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10.8 HEPATITIS VÍRICAS E INFECCIÓN POR ELVIHVer bibliografía de los siguientes procedimientos SEIMC:1. Serología de las hepatitis víricas. 2a. A. Delgado-Iribarren García-Campero, J.M. Echevarría Mayo y P. LeónRega. SEIMC. 2004.2. Diagnóstico microbiológico de la infección por VIH. 6. R.Ortiz de Lejarazu Leonardo, R. Cisterna Cáncer, J.M. EirosBouza, A. González López, M.C. Maroto, T. PumarolaSuñe y J. Romero Vivas. SEIMC. 1998.

PNT- TDA-01TÉCNICAS RÁPIDAS DE DIAGNOSTICO DE LAS ENFERMEDADES DE TRANSMISIÓN SEXUAL

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

01 Edición inicial

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DOCUMENTO TÉCNICO

Fecha:PNT-TDA-01Servicio de Microbiología

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Técnicas rápidas de diagnóstico de las

enfermedades de transmisión sexual Edición 01 Página 2 de 4

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl objetivo de este documento es normalizar eldiagnóstico de las enfermedades de transmisiónsexual (ETS) mediante técnicas de detección deantígeno. Su aplicación se extiende al procesodiagnóstico en el laboratorio. Los procedimientos dela fase preanalítica deben consignarse endocumento/s independientes dada la convenienciade participación de diferentes facultativos para laobtención de algunas muestras.

2. FUNDAMENTOEl diagnóstico rápido de las ETS permite eltratamiento dirigido de las formas de enfermedad nocomplicada, así como las indicacionesepidemiológicas (estudio de pareja/s). Ambascircunstancias ayudan a limitar la progresión de lacadena de transmisión del microorganismo.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Joergensen JH,

and Yolken RH, ed. Manual of Clinical Microbiology.8th ed. American Society for Microbiology, 2003.Washington, DC.

- Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology ProceduresHandbook. 2nd ed. 2004. American Society forMicrobiology, Washington, DC.

- Procedimientos en Microbiología Clínica. Recogida,transporte y procesamiento general de muestras enel laboratorio de microbiología. 1a. C. Sánchez y C.Guerrero. Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica. 2003.

4. TIPOS DE MUESTRA.En la tabla 1 se detallan las principales muestras arecoger, en función de la patología y la situaciónepidemiológica presentada. Debemos recordar elaxioma de que en las ETS generalmente setransmite más de un microorganismo y que el estudiode pacientes, parejas y posibles portadores debe serlo mas amplio posible.En función del cuadro clínico y los antecedentesepidemiológicos en el momento de recoger lasmuestras para el diagnóstico etiológico de las ETS,debemos atender a las recomendaciones para elaislamiento de los microorganismos posiblementeimplicados.

5. REACTIVOSEl manejo y la conservación de reactivos debenajustarse a las instrucciones de los fabricantes.Cualquier modificación respecto de aquellas deberáconstar en el correspondiente PNT.

6. TÉCNICAS DISPONIBLESExisten diferentes reactivos comerciales, condiferentes técnicas: EIA, ELISA de membrana,

inmunocromatografía e inmunofluorescenciaindirecta.Cada centro debe valorar cual de ellos es másconveniente en función del número y cadencia dedeterminaciones, de la prevalencia de cada uno delos microorganismos implicados en su área y de losrecursos humanos disponibles.

7. APARATOS Y MATERIALEl equipamiento necesario para la realización de lastécnicas descritas, incluyendo el tratamiento de lasmuestras, es el siguiente:- Centrífuga- Vórtex- Pipetas automáticas- Centrífuga- Microscopio de fluorescencia

8. PROCEDIMIENTOLos procedimientos concretos de las técnicas, alrealizarse mediante reactivos comercializados, no sedetallan, ya que se encuentran debidamentedescritos en la documentación de cada equipocomercial. Debe constar como se identifican lasmuestras o si se ha optado por ello, referirse alprocedimiento de identificación y registro demuestras. Deben señalarse también los controles aincluir y cualquier modificación introducida a lasrecomendaciones del fabricante.

9. CONTROL DE CALIDADSiguiendo las recomendaciones generales para elcontrol de calidad interno en Microbiología Clínica(CCI-SEIMC) para los reactivos comerciales, debesolicitarse al fabricante que disponga de un Sistemade Calidad reconocido y que facilite al laboratorio losdatos relativos al control de cada lote de reactivo.La mayoría de técnicas comerciales incluyenactualmente controles positivo y/o negativo pararealizar bien a la vez que cada una de lasdeterminaciones bien cada vez que se realice ungrupo de ellas, en función del sistema depresentación.Cada centro debe también considerar laconveniencia de participar en programas externos decontrol de calidad.

10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.Previamente a la interpretación de los resultados sedebe realizar la validación de los mismos en funciónde los controles incluidos. Es importante definir loscriterios de validación técnica y facultativa, así comoel procedimiento a seguir en caso de resultadosdudosos. En la interpretación deben seguirse lasinstrucciones del fabricante.


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Tabla 1. Muestras para diagnóstico de ETS por N.gonorrhoeae y/o C. TrachomatisSíndromeclínico

Sospechaetiológica

Muestra Método Comentarios

N. gonorrhoeaeEscobillón endocervicalintroducir 1-2 cm y rotardurante 10 seg.

Transporte rápido y atemperatura ambiente paracultivo

Cervicitis

C. trachomatis

Exudadoendocervical Escobillón o cepillo

endocervical introducir1-2 cm y rotar durante 10seg

Previamente retirar moco ypus exocervical

N. gonorrhoeae

EndometritisC. trachomatis

Biopsiaendometrio

La muestra debe sercolocada en un boteestéril y añadir suerofisiológico o medio detransporte para evitardesecación


N. gonorrhoeae

Enfermedadpélvicainflamatoria C. trachomatis

Biopsia trompaFalopio /punción abcesotubo-ovárico



N. gonorrhoeae Exudado uretralEscobillón endouretralfino. Introducir 1-2 cm yrotar 2-3 veces

Recoger la muestra antesde la primera micciónmatinal o esperar unmínimo de una hora desdela micción

Exudado uretralEscobillón endouretralfino. Introducir 1-2 cm yrotar 2-3 veces

Recoger la muestra antesde la primera micciónmatinal o esperar unmínimo de una hora desdela micción.Previamente eliminarexudado purulento

Uretritis

C. trachomatis

OrinaRecoger 10-20 mL de laprimera parte de lamicción

También para síndromeuretral femenino.

N. gonorrhoeae

Prostatitis yepididimitis C. trachomatis

Secreciónprostática oseminal y orina



N. gonorrhoeaeRecoger también ExudadofaríngeoExudado rectal

Estudio deportadoresasintomáticos C. trachomatis

Ex.uretralEx.endocervical

Recoger también orina


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11. RESPONSABILIDADESEl personal técnico de la sección será el responsable derevisar las solicitudes estudiando la idoneidad de lamuestra remitida con la determinación solicitada, deltratamiento de las muestras, de la realización de lastécnicas y de la validación de los resultados en funciónde los resultados de los controles. El facultativoresponsable de la sección, además de la supervisión delas tareas citadas, será responsable de mantener al díalos procedimientos, de la interpretación de los resultadose informe de los mismos.El personal debe conocer las ventajas y limitacionesde las técnicas empleadas, así como su fundamento yel funcionamiento de los aparatos utilizados. Ademásdebe trabajar en condiciones de máxima seguridadpersonal y ambiental, realizando una adecuadasegregación de los residuos.

12. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO YLIMITACIONES

Las técnicas de detección de antígeno para eldiagnóstico de las ETS, están actualmentesuperadas, en términos de sensibilidad yespecificidad, por las técnicas de biología molecular,especialmente para la búsqueda de portadores enmuestras de fácil recogida como es la orina.

De todos modos la disponibilidad de técnicas rápidaspara realizar las determinaciones y control/espertinentes para muestras individuales, permite,incluso a pesar de su limitada sensibilidad y la bajaprevalencia de algunas ETS, el diagnóstico etiológicoy su tratamiento específico en la primera visita.

13. BIBLIOGRAFÍA1. Chavez M, Vargas J, Pueyo I, Valverde A, Serrano MC,

Claro R, Martín-Mazuelos E. Incidence of genitourinaryinfection caused by Chlamydia trachomatis in a STDcenter calculated by direct antigen detection. EnfermInfecc Microbiol Clin 2000; 18:392-395.

2. Donders GG, van Gerven V, de Wet HG, van StratenAM, de Boer F. Rapid antigen test for Neisseriagonorrhoeae and Chlamydia trachomatis are notaccurate for screening women with disturbed vaginallactobacillary flora. Scand J Infect Dis 1996; 28:559-562.

3. Schachter J. DFA, EIA, PCR, LCR and othertechnologies: what test should be used for diagnosis ofchlamydia infection?. Immunol Invest 1997; 26:157-161.

4. Warford A, Chernesky M, Peterson EM 1999. Cumitech19ª, Laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatisinfections. Coordinating ed., C.A. Gleaves. AmericanSociety for Microbiology, Washington, D.C.

PNT-TDA-02TÉCNICAS RÁPIDAS DE DIAGNOSTICO DE LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS


Jefe de Servicio



01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

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DOCUMENTO TÉCNICO


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Técnicas rápidas de diagnóstico de

las infecciones respiratorias Edición 01 Página 2 de 7

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl propósito de este procedimiento es el de definir lastécnicas rápidas de detección de antígeno que existenpara el diagnóstico etiológico de las infeccionesrespiratorias. Se describe qué tipo de muestras son lasmás adecuadas en función de los microorganismos quese pretende detectar y en función de la técnica que seplantee utilizar.

2. FUNDAMENTOEn el transcurso de un proceso infeccioso de las víasrespiratorias es posible detectar antígenos delagente responsable en muestras procedentes delfoco de infección (moco nasal, exudado faríngeo,moco nasofaríngeo, esputo, líquido pleural, lavadobroncoalveolar, material obtenido por punciónaspirativa, etc.).En la infección bacteriana también es posibledetectar antígenos en el suero por el que circulan yen la orina por la que se eliminan. Aunque enprincipio pueda sorprender, la orina constituye unmejor reservorio de antígenos bacterianos que elsuero. La circulación de antígeno en sangre nosiempre es óptima, existe formación deinmunocomplejos y secuestro por el sistema retículo-endotelial, de forma que determinados antígenospueden eliminarse rápidamente. Por otra parte, laorina es una muestra fácil de obtener y en cantidadsuficiente como para que permita concentrar losantígenos presentes en la misma.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA.- Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Joergensen JH,

and Yolken RH, ed. Manual of ClinicalMicrobiology. 8th ed. American Society forMicrobiology, 2003. Washington, DC.

- Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology ProceduresHandbook. 2nd ed. 2004. American Society forMicrobiology, Washington, DC.

- Procedimientos en Microbiología Clínica.Recogida, transporte y procesamiento general demuestras en el laboratorio de microbiología. 1a.C. Sánchez y C. Guerrero. Sociedad Españolade Enfermedades Infecciosas y MicrobiologíaClínica. 2003.

4. TIPOS DE MUESTRAEn la tabla 1 se indican las muestras de elecciónpara la detección de cada microorganismo y lastécnicas por los que se pueden detectar.

4.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE LAMUESTRA.En el procedimiento SEIMC de Recogida, transporte yprocesamiento general de muestras en el laboratoriode microbiología. 1a. (Sociedad Española deEnfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.2003) se indican las directrices principales de larecogida y conservación de las muestras (PNT-RTP-01).

4.2. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA.Tratamiento de muestras de orina para la detecciónde antígeno neumocócico y de Legionella1. Hervir durante 5 minutos y dejar atemperar

después las orinas.2. Centrifugar 15 minutos a 3.000 rpm.3. Concentrar 2’5-10 ml del sobrenadante por

ultrafiltración selectiva 25 veces.4. Trabajar con orina concentrada. En caso de

muestra insuficiente para realizar laconcentración de orina, se puede realizar conorina directa.

Tabla 1.

Microorganismo Muestra TécnicaStreptococcus pyogenes Exudado faríngeo ICT

Orina CIE, ICTMuestra respiratoria LAStreptococcus pneumoniaeLíquido pleural CIE, ICT, LAOrina EIA, ICTMuestra respiratoria IFDLegionella pneumophilaLíquido pleural EIA, ICTMuestra respiratoria LAHaemophilus influenzae Líquido pleural LA

Virus gripe A y B Moco nasofaríngeo IFI, ICT, EIAExudados faríngeo y nasal IFI, ICT, EIA

Virus respiratorio sincitial Moco nasofaríngeo IFD, IFI, ICT, EIAExudados faríngeo y nasal IFD, IFI, ICT, EIA

Metaneumovirus Moco nasofaríngeo IFIVirus parainfluenza 1,2,3 Moco nasofaríngeo IFIAdenovirus Moco nasofaríngeo IFI, ICT

Exudados faríngeo y nasal IFI, ICT CEI: contrainmunoelectroforesis; ICT: Inmunocromatografía; IFD: Inmunofluorescencia directa; IFI: Inmunofluorescencia indirecta; EIA: Enzimoinmunoensayo; LA: Aglutinación por partículas de látex.


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La concentración de la orina por ultrafiltraciónselectiva puede realizarse de forma pasiva o porcentrifugación. En ambos casos los resultados sonequiparables. Sin embargo el método basado encentrifugación es significativamente más rápido. Laultrafiltración selectiva pasiva consiste en una celdadonde se introduce la muestra de orina, que encontacto con un material absorbente mediante unamembrana de permeabilidad selectiva permite elpaso de agua y solutos de bajo peso molecular,concentrándose progresivamente el antígeno aldisminuir el volumen de líquido.En la concentración por centrifugación el dispositivocombina una membrana de ultrafiltración de bajaadsorción en una carcasa vertical acoplada a un tubode centrifugación. El agua y solutos de bajo pesomolecular atraviesan la membrana comoconsecuencia de la fuerza centrifuga,concentrándose progresivamente el antígeno en lacarcasa vertical.

Tratamiento de muestras de líquido pleural para ladetección de antígeno neumocócico, de Legionella yde Haemophilus influenzae1. Diluir 1:4 el líquido con tampón EDTA 0,1 M.2. Hervir la mezcla durante 5 minutos y dejar enfriar

a temperatura ambiente (18-25ºC)3. Agitar vigorosamente durante 5 segundos4. Centrifugar a 1400 g durante 15 minutos5. Trabajar con el sobrenadante.

Tratamiento de muestras respiratorias para ladetección de antígeno de Legionella1. Tomar la parte más viscosa del esputo o del

broncoaspirado, el sedimento del lavadobroncoalveolar o del catéter telescopado.

2. Realizar una extensión sobre un portaobjetos.3. Dejar secar al aire y fijar inicialmente a la llama.4. Fijar la extensión también con formalina al 10%

durante 10 minutos en cámara húmeda.5. Lavar con agua destilada y dejar secar.

Tratamiento de muestras respiratorias para ladetección de antígeno neumocócico y deHaemophilus influezaeEsputo o Broncoaspirado (BAS)1. Mezclar a partes iguales la muestra con

ditiotreitol (Sputasol).2. Agitar con vórtex durante 30 segundos.3. Calentar a 100ºC durante 5 minutos.4. Centrifugar durante 15 minutos a 2.000g y

descartar el sobrenadante.Lavado broncoalveolar (BAL)1. Calentar aproximadamente 1 ml del BAL a 100º

C durante 5 minutos.2. Centrifugar durante 15 minutos a 2.000g y

descartar el sobrenadante.Catéter telescopado1. Agitar con vórtex en el suero fisiológico o tampón

fosfato en el que viene introducido el catétertelescopado.

2. Calentar 0’5 ml de la suspensión a 100ºCdurante 5 minutos.

Biopsia o punción pulmonar1. Homogeneizar la muestra con mortero.2. Calentar 0’5 ml a 100ºC durante 5 minutos.

Tratamiento de las muestras respiratorias para ladetección de virus respiratoriosExudado faríngeo y exudado nasal1. Poner 1 ml de suero fisiológico dentro de un tubo

estéril.2. Introducir el escobillón y agitar de manera que la

muestra clínica recogida quede resuspendida enel medio.

Lavado broncoalveolar y moco nasofaríngeo1. Homogeneizar la muestra agitándola

vigorosamente durante cinco segundos.

5. REACTIVOS.Contrainmunoelectroforesis1. Omnisérum® (Statens Seruminstitut. Dinamarca)2. Agarosa type II: Medium EEO.3. Ácido dietil barbitúrico.4. Barbital sódico.5. Brillant-Blue R250.6. Ácido acético.

Preparación de reactivos:1.- Agarosa (Disolver a 90ºC. Conservar a 6ºC).- Agarosa Type II: Medium EEO 4 g- Tampón Veronal (pH= 8,6) 400 ml2.- Tampón Veronal (pH= 8,6).- Ácido dietil-barbitúrico 1,55 g- Barbital sódico 8,55 g- Lactato cálcico-5 H2O 0,4 g- Azida sódica 0,5 g- Agua destilada 1 LAgitar bien hasta disolver bien los ingredientes. Ajustarel pH a 8,6. Guardar a 6ºC.3.- Colorante Coomasie Brillant-Blue (conservación atemperatura ambiente).- Brillant-Blue R 250 2 g- Etanol 96% 180 ml- Ácido acético 40 ml- Agua destilada 180 ml4.- Decolorante Coomasie (conservación atemperatura ambiente).- Etanol 96% 250 ml- Ácido acético 83 ml- Agua destilada 667 ml

Aglutinación de partículas de látex.1. Ditiotreitol (Sputasol®)Preparación del reactivo:Reconstituir el vial de Sputasol® con 5 ml de aguadestilada estéril. Diluir 1 ml de suspensión de Sputasolen 19 ml. de agua destilada estéril. Se ha de utilizar lasolución de trabajo en las 24 horas siguientes a lapreparación. Conservación a 6ºC. La solución madre


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de Sputasol se puede utilizar durante 1 semana.Conservación a 6ºC.2. Los reactivos específicos incluidos en los

equipos comercializados.

Inmunofluorescencia1. Formol (40%)2. Acetona y PBS3. Los reactivos específicos incluidos en los


Inmunocromatografía (ICT) yenzimoinmunoensayo (EIA)1. EDTA.2. Los reactivos específicos incluidos en los


6. TÉCNICAS DISPONIBLESLas técnicas disponibles para la detección de cadamicroorganismo se han enumerado en la tabla 1.Excepto la contrainmunoelectroforesis para ladetección de S .pneumoniae, todas las técnicas estándebidamente estandarizadas y disponiblescomercialmente.

Técnicas de detección de antígeno deStreptococcus pyogenesLas técnicas utilizadas para la detección de antígenode S. pyogenes a partir de muestras directas defaringe, son fundamentalmente técnicas deaglutinación facilitada, enzimoinmunoensayos einmunocromatografías. Estas técnicas han demostradoser técnicas rápidas, sensibles y específicas. Engeneral, las muestras deben tratarse química oenzimáticamente para liberar el antígeno presente enla muestra. La sensibilidad depende del reactivoempleado y de la carga bacteriana. De forma que anteresultados negativos es necesario realizar cultivos.

Técnicas de detección de antígenos para eldiagnóstico etiológico de la neumoníaneumocócicaLa técnica inmunológica utilizada tradicionalmentepara la detección de antígeno polisacárido capsular(PCA) en orina ha sido la contrainmunoelectroforesis(CIE). La CIE es una técnica útil para la detección deantígeno neumocócico en orina.La CIE no está ampliamente implantada dado que esuna técnica laboriosa que para una máximarentabilidad requiere utilizar orina concentrada y deuna difusión pasiva de las placas de agarosa a 4ºCdurante 18 h y tinción específica con azul brillante deCoomasie.Se ha comercializado una técnica de inmuno-cromatografía de membrana (ICT) para la detecciónde polisacárido C (PnC) de S. pneumoniae enmuestras de orina. El PnC es un antígeno común detodos los serotipos neumocócicos.La ICT ha demostrado ser una técnica muy sensibley específica, siendo muy útil en el diagnóstico de laneumonía neumocócica, especialmente en los casos

no bacteriémicos siendo una alternativa real y máseficaz que la CIE. Las técnicas de detección deantígeno se muestran como una herramienta útil enel diagnóstico de la neumonía neumocócica nobacteriémica. Sin embargo, la ICT es mucho másrápida que la CIE, proporcionando resultados en 15minutos, es menos compleja y requiere un menorequipamiento. Otra ventaja adicional de la ICT sobrela CIE es que permite detectar por igual todos losserotipos, incluidos los serotipos 7 y 14, que no sondetectables por CIE en las condicioneshabitualmente utilizadas. Además la CIE emplea unomnisérum policlonal contra los 84 serotiposneumocócicos. En función del serotipo laimunoreactividad de los PCA varíasignificativamente, lo que influye en la representaciónde los anticuerpos específicos y comporta diferenciasimportantes entre lotes de omnisérum, repercutiendodirectamente en la sensibilidad y homogeneidad delos resultados de la técnica. Además existe un rápidoturnover para determinados antígenos capsularesque dificulta su detección. Por otra parte, tambiénha de señalarse la diferente identidad inmunológicadel antígeno presente en la orina respecto al nativo,probablemente debido a una parcial metabolización.En conclusión, la sensibilidad y especificidad de laICT para detectar antígeno de S. pneumoniae enorina se ha mostrado muy útil en el diagnósticorápido de la neumonía neumocócica, especialmenteen la no bacteriémica, que no se diagnosticaetiológicamente en la gran mayoría de casos.

Técnicas de detección de antígenos para eldiagnóstico etiológico de la neumonía porLegionellaLas técnicas de detección de antígenos solubles deLegionella en orina se han mostradoextraordinariamente útiles para el diagnóstico rápidode la legionelosis. La primera técnica disponiblecomercialmente que demostró ser una técnica útil,sensible y específica, fue el radioinmunoensayo(RIA). En la actualidad existen fundamentalmentetres técnicas de EIA disponibles comercialmente,todas ellas presentan una excelente especificidad ysensibilidad, especialmente cuando se emplea orinaconcentrada.Actualmente, se dispone también de una técnica deICT rápida que aporta resultados en 15 minutos deforma individualizada y que no requiere deequipamiento especial. Los resultados obtenidosmediante esta técnica de ICT son absolutamenteequiparables con los de las técnicas de EIA ensensibilidad y especificidad. Es una técnica másrápida y es técnicamente menos compleja que lastécnicas de EIA.La ICT es especialmente útil para pequeñoslaboratorios sin los equipos adecuados y con unnúmero reducido de muestras. También puede serútil como complemento del EIA para determinacionesurgentes. Las técnicas de EIA son una buena opción


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para laboratorios con equipamiento adecuado y unnúmero considerable de determinaciones.

Técnicas de detección rápidas de antígeno deHaemophilus influenzaeLas técnicas empleadas son de aglutinación de látexy de coaglutinación. Son técnicas que permitenobtener resultados rápidos pero cuya sensibilidad noes muy elevada.

Técnicas de detección de antígenos de virusrespiratoriosLa técnica de referencia para la detección deantígenos víricos en muestras respiratorias es lainmunofluorescencia ya sea directa o indirecta. En laactualidad existen para el virus respiratorio sincitial ypara los virus gripales A y B técnicas de EIA y deICT. Así mismo para detectar antígeno de adenovirusexisten técnicas de ICT comercializadas. Losresultados obtenidos mediante ICT sonabsolutamente equiparables con los de las técnicasde EIA en sensibilidad y especificidad. Sin embargola sensibilidad de estas técnicas con respecto a lainmunofluorescencia es menor. Para la detección delos antígenos víricos mediante estas técnicas ydebido al pequeño tamaño de los virus se requierencélulas intactas que en caso de estar infectadaspermitan la observación de acúmulos intracelularesque indican la presencia de los antígenos víricos.

7. APARATOS Y MATERIALEl equipamiento necesario para la realización de lastécnicas descritas, incluyendo el tratamiento de lasmuestras, es el siguiente:- Agitador orbital- Centrífuga- Baño Maria- Vórtex- Alimentador de electroforesis- Lector de placas- Lavador de placas- Pipetas automáticas- Microscopio de fluorescencia- Portaobjetos para inmunofluorescencia- Estufa de 37ºC- Cámara húmeda- Cubetas de tinción- Cubreobjetos

8. PROCEDIMIENTONo se detallan los procedimientos concretos derealización de las técnicas siguientes: técnicas deaglutinación, inmunofluorescencia, inmunocroma-tografia y enzimoinmunoensayos, ya que alrealizarse en todos los casos medianteprocedimientos comercializados se encuentrandebidamente descritos en la documentación de cadaequipo comercial. En cambio, para la realización dela técnica de contrainmunoelectroforesis al ser unatécnica no comercializada se recomienda seguir elsiguiente protocolo estandarizado: Anhalt JP, Kenny

GE, Rytel MW. 1978. Detection of microbial antigensby counterimmunoelectrophoresis. Cumitech 8.Washington, CD. American Society for Microbiology.

9. CONTROL DE CALIDAD.Siguiendo las Recomendaciones generales para elcontrol de calidad interno en Microbiología Clínica(CCI-SEIMC) realizado por el grupo colaboradorGEGMIC, para los reactivos comerciales, debesolicitarse al fabricante que disponga de un Sistemade Calidad reconocido y que facilite al laboratorio losdatos relativos al control de cada lote de reactivo. Lamayoría de técnicas comerciales incluyenactualmente controles positivo y/o negativo pararealizar bien a la vez que cada una de lasdeterminaciones bien cada vez que se realice ungrupo de ellas, en función del sistema depresentación. Cada centro debe también considerarla conveniencia de participar en programas externosde control de calidad.

Contrainmunoelectroforesis: En cada serie se incluyeun control positivo correspondiente a un extractoantigénico obtenido de una cepa de referencia de S.pneumoniae mediante el siguiente procedimiento:hervir 5-10 ml de una suspensión con una densidaddel 0,5 de la escala de McFarland de una cepa dereferencia de S. pneumoniae durante 5 minutos.Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos y realizaralicuotas del sobrenadante de 1 ml.También se realizarán en todas las técnicascontroles de calidad internos empleando muestraspropias de resultado ya conocido. La participación encontroles de calidad externos es recomendable paraasegurar la calidad de nuestros resultados. Porejemplo, “European Working Group for Legionellainfection” organiza un control de calidad para ladetección de antígeno Legionella en orina.

10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSContrainmunoelectroforesisSe considera que la detección de antígeno espositiva cuando se observa claramente la presenciade una banda de precipitación entre el pocillo de lamuestra y el Omnisérum®. Si aparece una bandaentre el pocillo del tampón veronal y el pocillo delcontrol o de cualquier muestra, se considera que elresultado no es válido.

Técnicas de aglutinaciónUna muestra es positiva si se produce una aglutinaciónclara de las partículas visible macroscópicamente entreel reactivo y la muestra y entre el reactivo y el controlpositivo.

InmunofluorescenciaSe considera positiva una determinación cuando sevisualizan claramente bacilos fluorescentes alexaminar las preparaciones al microscopio defluorescencia. En el caso de los virus respiratorios seconsidera una determinación positiva cuando se


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observa la presencia de acúmulos fluorescentes enla distribución celular característica para el antígenovírico estudiado. Las técnicas deinmunofluorescencia al utilizar un colorante decontraste permiten la evaluación de la muestra alpoder observar en el momento de la lectura si existeel número de células (bacterianas o del epiteliorespiratorio) necesario para que la prueba se aceptecomo válida. En caso de no cumplir este requisito elresultado debe informarse como no concluyente yaque la ausencia de un número mínimo de células nosindica que la obtención de la muestra ha sidoinadecuada.

EnzimoinmunoensayoSe consideran positivas aquellas muestras con unvalor de absorbancia tantas veces superior al delcontrol negativo como indique el fabricante en cadacaso.

InmunocromatografíaUna determinación se considera positiva cuando seobtiene una banda coloreada en la línea control(donde se fija el conjugado) y también en la línea dereacción (donde se fija el antígeno); y negativocuando únicamente se obtiene una banda en la líneacontrol.

11. RESPONSABILIDADES.El personal técnico de la sección será el responsablede revisar las solicitudes estudiando la idoneidad de lamuestra remitida con la determinación solicitada, deltratamiento de las muestras, de la realización de lastécnicas y de la validación de los resultados en funciónde los resultados de los controles. El facultativoresponsable de la sección, además de la supervisiónde las tareas citadas, será responsable de mantener aldía los procedimientos, de la validación final de losresultados, su interpretación y el informe de losmismos.El personal de la sección de detección de antígenosdebe conocer las ventajas y limitaciones de lastécnicas rápidas, así como el fundamento de todas lastécnicas y del funcionamiento de los aparatos. Ademásdebe trabajar en condiciones de máxima seguridadpersonal y ambiental, realizando una adecuadasegregación de los residuos.

12. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO YLIMITACIONES.

Detección de antígeno neumocócico mediantecontrainmunoelectroforesisLa CIE emplea un omnisérum policlonal frente a los84 serotipos neumocócicos. En función del serotipola imunoreactividad de los PCA varíasignificativamente, lo que influye en la representaciónde los anticuerpos específicos y comporta diferenciasimportantes entre lotes de Omnisérum®,repercutiendo directamente en la sensibilidad yhomogeneidad de los resultados de la técnica.Además en las condiciones en que se realiza

normalmente la CIE los serotipos 7 y 14 no sondetectables.

Detección de antígeno neumocócico medianteinmunocromatografíaLas limitaciones que plantea la utilización de ladetección de antígeno neumocócico en orinamediante ICT y que debemos tener en cuenta parauna óptima interpretación y de los resultados de latécnica son los siguientes:La antigenuria es detectable desde el inicio de lossíntomas y hasta un mes más tarde, siendo enalgunos casos mayor el tiempo de excreción deantígeno.Por otro lado, resultados preliminares indican que laICT permite detectar antígeno neumocócico en orinaen los casos de exacerbación por sobreinfecciónneumocócica en bronquíticos crónicos, pero tambiénes posible detectar antígeno en pacientesbronquíticos estables. Además, la técnica de ICTdetecta antígeno en orina de niños sanos portadoresorofaríngeos de neumococo, especialmente en niñosmenores de 2 años.

Detección de antígeno de Legionella medianteinmunocromatografia y enzimoinmunoensayoTodas las técnicas descritas detectan con una gransensibilidad el antígeno de L. pneumophila serogrupo1, siendo además capaces de detectar “in vitro”antígeno soluble de todos los serogrupos de L.pneumophila. El único EIA que según su fabricantetiene capacidad para detectar todos los serogruposde L. pneumophila y así como otras especies deLegionella, no garantiza igual sensibilidad para todoslos serogrupos y especies. La capacidad de detectarantígeno de otros serogrupos está en función de lascaracterísticas propias de cada antígeno: capacidadde pasar a la orina, cantidad excretada einmunogenicidad. Antígenos de otros serogrupos deL. pneumophila pueden no ser excretados por laorina. Un antígeno puede ser excluido de pasar através de las paredes de los capilares glomerularesen función de su tamaño y de su carga, no estando,en consecuencia presente en orina.La detección de antígeno de L. pneumophila esdetectable desde el inicio de la sintomatología y enalgunos casos hasta muchos meses después.

Detección rápida de Legionella medianteinmunofluorescenciaLa sensibilidad de la tinción de immunofluorescenciadirecta de muestras respiratorias es sólo del 25-50%.La tinción detecta bacilos de la especie L.pneumophila, pero no de otras especies deLegionella. Además puede presentar reaccionescruzadas con otros microorganismos. Las técnicasde inmunofluorescencia que emplean anticuerposmonoclonales, en comparación con los policlonales,presentan un menor ruido de fondo, así como menosreacciones cruzadas.


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Detección de antígeno neumocócico mediantetécnicas de aglutinaciónPara obtener óptimos resultados en muestras deesputo es necesario que la muestra sea de buenacalidad. Además la técnica puede tener reaccionescruzadas con otros microorganismos.

Detección de antígeno de Haemophilus influenzaemediante técnicas de aglutinaciónEl principal inconveniente radica en que la técnicadetecta la presencia de Haemophilus capsulados,siendo los no capsulados los principalesresponsables de las infecciones respiratorias.

Detección de antígenos de virus respiratoriosmediante la técnica de inmunofluorescenciaPara la obtención de resultados las muestras debenser de calidad, es decir, deben observarse comomínimo 25 células ciliadas en toda la preparación.Además es imprescindible el entrenamiento previodel personal para la lectura.

Detección de antígenos de virus respiratoriosmediante técnicas de enzimoinmunoensayo y deinmunocromatografíaEstas técnicas más sencillas y de más fácilinterpretación que la inmunofluorescencia tienencomo principal inconveniente una menor sensibilidad.

13. BIBLIOGRAFÍA1. Biso AL, Gerber MA, Gwaltney JM, Kaplan EL, Schwart

RH. Diagnosis and management of group Astreptococcal pharyngitis: a practice guideline. Clin InfectDis 1997; 25:574-583

2. Coonrod JD. Urine as an antigen reservoir for diagnosisof infectious diseases. Am J Med 1983; 75(1B):85-92

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4. Domínguez JA, Matas L, Manterola JM, Blavia R,Sopena N, Padilla E, Giménez M, Sabrià M, Morera J,Ausina V. Comparison of radioimmunoassay andenzyme immunoassay kits for detection of Legionellapneumophila serogroup 1 antigen in both concentratedand nonconcentrated urine samples. Journal of ClinicalMicrobiology 1997; 35:1627-1629

5. Minnich LL, Smith TF, Ray CG. Cumitech 24. RapidDetection of Viruses by Immunofluorescence.Coordinating ed., S. Specter. American Society forMicrobiology, 1988. Washington, D.C.

PNT-TDA-03TÉCNICAS RÁPIDAS DE DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES BACTERIANAS DEL SISTEMA NERVIOSO

CENTRAL


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01 Edición inicial


Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología del Hospital ��.La informaciónen él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable de suelaboración. Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO


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Técnicas rápidas de diagnóstico de lasinfecciones bacterianas del sistema nervioso

central Edición 01 Página 2 de 5

1. PROPÓSITO Y ALCANCE.El propósito del procedimiento es el de definir lastécnicas rápidas de detección de antígeno para eldiagnóstico etiológico de las infecciones bacterianas delsistema nervioso central (SNC). Se describen el tipo demuestra más adecuado y las característicasfundamentales de las técnicas a utilizar.

2. FUNDAMENTO.En el transcurso de un proceso infeccioso delsistema nervioso central es posible detectarantígenos del agente responsable, tanto en muestrasprocedentes del foco de infección (LCR) como enmuestras de orina por donde se eliminan.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA.- Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Joergensen JH,

Yolken RH, ed. Manual of Clinical Microbiology.8th ed. American Society for Microbiology, 2003.Washington, DC.

- Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology ProceduresHandbook. 2ª edición. 2004. American Society forMicrobiology, Washington, DC.


4. TIPOS DE MUESTRA.En la tabla 1 se indican las muestras de elecciónpara la detección de cada microorganismo y lastécnicas por las que se pueden detectar. Lasmuestras que pueden estudiarse son LCR y orina. Laorina es fácil de obtener y posee una concentraciónde antígenos bacterianos 10-50 veces superior a ladetectada en suero. A pesar de sus ventajas, lamuestra más adecuada para la detección deantígenos en el diagnóstico de meningitis es el LCRya que se debe confirmar en esta muestra. Ademásun resultado positivo de detección de antígeno enorina pueden deberse a colonizaciones bacterianas oa infecciones invasoras diferentes a la meningitis.

4.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE LAMUESTRA.

En el procedimiento en Microbiología Clínica.Recogida, transporte y procesamiento general demuestras en el laboratorio de microbiología. 1a(Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas yMicrobiología Clínica. 2003) se indican las directricesprincipales de la recogida y conservación de lasmuestras (PNT-RTP-01).

4.2. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA.Tratamiento de muestras de orina1. Hervir durante 5 minutos y dejar atemperar

después la orina.2. Centrifugar 15 minutos a 3.000 rpm.3. Concentrar 2,5-10 ml del sobrenadante por

ultrafiltración selectiva 25 veces.4. Trabajar con orina concentrada. En caso de

muestra insuficiente para realizar laconcentración de orina, se puede realizar conorina directa.

Tratamiento de muestras de líquido cefalorraquídeoHervir 5 minutos y dejar atemperar después el LCR.Centrifugar 15 minutos a 3.000 rpm.Trabajar con el sobrenadante.Si se emplean técnicas comerciales deben seguirselas recomendaciones del fabricante.

5. REACTIVOS.ContrainmunoelectroforesisAntisueros específicos.

Para las técnicas de aglutinación de partículas delátex, coaglutinación, Enzimoinmunoensayo eInmunocromatografíaLos reactivos específicos incluidos en los equiposcomercializados.

6. TÉCNICAS DISPONIBLES.Las técnicas disponibles para la detección de cadamicroorganismo se han enumerado en la tabla 1.Excepto la contrainmunoelectroforesis todas lastécnicas están debidamente estandarizadas ydisponibles comercialmente.Existen varios métodos rápidos de detección deantígenos bacterianos desarrollados con el propósitode incrementar el porcentaje diagnóstico de lasinfecciones bacterianas del SNC, sobre todo en losenfermos que han recibido tratamiento antibiótico

Tabla 1Microorganismo Muestra Técnica

Streptococcus agalactiaeEscherichia coliListeria monocytogenesNeisseria meningitidisHaemophilus influenzae

Liquido cefalorraquídeoOrina

Contrainmunoelectroforesis (CIE)Aglutinación por partículas de látex (LA)Coaglutinación (CoA)Enzimoinmunoensayo (EIA)Inmunocromatografía (ICT)


Hospital..........



empírico previo, y así facilitar el tratamientoadecuado de los pacientes. Estas pruebas utilizananticuerpos frente al antígeno polisacárido capsularde los patógenos bacterianos meníngeos como H.influenzae tipo B, S. pneumoniae, N. meningitidisserogrupos A, C, Y y W135, E. coli K1 y S.agalactiae.Se dispone de métodos de contrainmunoelec-troforesis (CIE), coaglutinación (CoA), aglutinaciónpor látex (LA) y enzimoinmunoanalisis (EIA). Lasensibilidad de estos métodos depende del tipo demicroorganismo patógeno causante de la meningitis.El método de CIE es de uso infrecuente ya querequiere un especial equipamiento, un antisueroconservado con un estricto control de calidad y unagran experiencia técnica para obtener resultadosóptimos de sensibilidad y especificidad. Además laCIE es un método laborioso y lento de realizarcuando se compara con los métodos de LA y CoA,que son fáciles y rápidos y no requierenequipamientos especiales. El método de aglutinaciónpor látex reemplazó a la CIE y a la CoA y es elmétodo más utilizado, es fácil de realizar, no requiereun equipamiento especial, es rápido y los resultadospueden estar disponibles en ≤15 minutos.

Técnicas rápidas de detección de antígeno de N.meningitidisLa mayoría de los equipos comerciales para lainvestigación de antígeno de este microorganismo noincluyen la detección de N. meningitidis delserogrupo B debido al limitado poder inmunógeno deeste polisacárido. La prueba de aglutinación por látexque detecta el antígeno polisacárido de losserogrupos A, C, Y y W135, presenta unasensibilidad que varía según diversos autores del50% al 93%. Algunos autores han intentado mejorarla sensibilidad de la aglutinación con látex mediantela utilización de un aparato comercial de ultrasonidos(Inmunosonic. Electro-Medical Supplies. GreenhamLtd.UK.) que intensifica la inmunoaglutinación de laprueba de látex. Este método además de ser rápido(aproximadamente 30 minutos) y barato, presentauna sensibilidad casi cinco veces mayor que laprueba de aglutinación por látex sin ningunamodificación.

Técnicas rápidas de detección de antígeno de H.influenzaeLos métodos rápidos de detección de antígeno paraeste microorganismo se desarrollaron durante unaépoca en la cual la infección por H. influenzae tipo bera relativamente común, detectándose unasensibilidad de la prueba de aglutinación por látexpara este microorganismo del 78% al 100%. Laintroducción en el calendario vacunal infantil de lavacuna conjugada ha dado lugar a una considerabledisminución de la incidencia de esta infección y porlo tanto debe replantearse la utilidad de estadetección de antígeno. Otra consecuencia de lavacunación frente a H. influenzae tipo b ha sido la

detección mediante técnica de aglutinación por látexde resultados falsos positivos debido a la presenciaen orina o LCR de antígeno de este microorganismodespués de la vacunación. La mayoría de los niñosvacunados con la vacuna polisacárida presentan enorina un resultado de aglutinación por látex positivodurante los cuatro primeros días después de lavacunación y algunos hasta después de más de unasemana. La excreción urinaria del antígeno de H.influenzae es todavía más marcada cuando se utilizala vacuna conjugada. La mayoría de los niñospresentan en orina un resultado de aglutinación porlátex positivo durante dos semanas después de lavacunación y de ellos en el 41% el resultado estodavía positivo a los 30 días. La colonizaciónnasofaríngea por H. influenzae puede dar lugartambién a la excreción urinaria del antígeno.

Técnicas rápidas de detección de antígeno de S.pneumoniaeLa prueba de aglutinación por látex para la detecciónde este microorganismo presenta una sensibilidadque varía según diversos autores del 67% al 100%.Cuando se comparan la sensibilidad y especificidadde la contrainmunoelectroforesis, la prueba deaglutinación mediante partículas de látex (WellcogenLA test kits. Murex Diagnostics Ltd, England) y lacoaglutinación (Phadebact CoA test kit. BouleDiagnostics, Sweden) en la detección de antígeno deS. pneumoniae en un total de 95 LCR de pacientescon sospecha de meningitis, la prueba LA resulta elmás sensible (86,6%) seguido de la CoA (73,0%) yde la CIE (66,6%). La CIE, no obstante, es el métodoque presenta una mejor especificidad (93,7%) encomparación con la prueba LA (91,0%) y la CoA(90,0%).También se puede utilizar en orina y LCR una nuevaprueba de detección de antígeno muy sensible yespecífico. Se trata de una prueba rápida deinmunocromatografía de membrana (Binax NOWStreptococcus pneumoniae Urinary Antigen Test,Binax, Portland, ME, USA) utilizado en el diagnósticode la neumonía neumocócica. Mediante estemétodo, en algunos estudios la sensibilidad yespecificidad es del 100% en la detección deantígeno de neumococo en muestras de LCR y deorina de pacientes adultos con sospecha demeningitis bacteriana. En otros, al comparar estaprueba (Binax NOW) de detección de antígeno de S.pneumoniae, en muestras de LCR y orina con elcultivo del LCR la sensibilidad y especificidad de latécnica realizada en LCR es del 95,4% y del 100%respectivamente y la sensibilidad cuando se realizaen orina es del 57,1%.

Técnicas de detección de antígeno de S.agalactiae y E. coliLa aglutinación de látex, para la detección de estemicroorganismo, presenta una sensibilidad que varía,según diversos autores, del 69% al 100%.


Hospital..........



7. APARATOS Y MATERIAL.El equipamiento necesario para la realización de lastécnicas descritas, incluyendo el tratamiento de lasmuestras, es el siguiente:- Agitador orbital- Centrífuga- Baño Maria- Vórtex- Alimentador de electroforesis- Pipetas automáticas- Estufa de 37ºC- Cámara húmeda- Lector de placas de EIA- Lavador automático de placas de EIA

8. PROCEDIMIENTO.Los procedimientos concretos de realización de lastécnicas siguientes: Técnicas de aglutinación,enzimoinmunoensayo e inmunocromatografía, alrealizarse en todos los casos medianteprocedimientos comercializados, no se detallan, yaque se encuentran debidamente descritos en ladocumentación de cada equipo comercial. Encambio, para la realización de la técnica decontrainmunoelectroforesis, al ser una técnica nocomercializada se recomienda seguir el siguienteprotocolo estandarizado: Anhalt JP, Kenny GE, RytelMW. 1978. Detection of microbial antigens bycounterimmunoelectrophoresis. Cumitech 8.Washington, CD. American Society for Microbiology.

9. CONTROL DE CALIDAD.Siguiendo las Recomendaciones generales para elcontrol de calidad interno en Microbiología Clínica(CCI-SEIMC) realizado por el grupo colaboradorGEGMIC, para los reactivos comerciales, debesolicitarse al fabricante que disponga de un Sistemade Calidad reconocido y que facilite al laboratorio losdatos relativos al control de cada lote de reactivo. Lamayoría de técnicas comerciales incluyenactualmente controles positivo y/o negativo pararealizar bien a la vez que cada una de lasdeterminaciones bien cada vez que se realice ungrupo de ellas, en función del sistema depresentación. Cada centro debe también considerarla conveniencia de participar en programas externosde control de calidad. También se realizarán entodas las técnicas controles de calidad internosempleando muestras propias de resultado yaconocido. La participación en controles de calidadexternos es recomendable para asegurar la calidadde nuestros resultados.

10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.ContrainmunoelectroforesisSe considera que la detección de antígeno espositiva cuando se observa claramente la presenciade una banda de precipitación entre el pocillo de lamuestra y el de los anticuerpos específicos. Siaparece una banda entre el pocillo del tampón y el

pocillo del control o de cualquier muestra, seconsidera que el resultado no es válido.

Técnicas de aglutinaciónUna muestra es positiva si se produce una aglutinaciónclara de las partículas visible macroscópicamenteentre el reactivo y la muestra y entre el reactivo y elcontrol positivo.


InmunocromatografíaUna determinación se considera positiva cuando seobtiene una banda coloreada en la línea control(donde se fija el conjugado) y también en la línea dereacción (donde se fija el antígeno); y negativacuando únicamente se obtiene una banda en la líneacontrol.

11. RESPONSABILIDADES.El personal técnico de la sección será el responsable derevisar las solicitudes estudiando la idoneidad de lamuestra remitida con la determinación solicitada, deltratamiento de las muestras, de la realización de lastécnicas y de la validación de los resultados en funciónde los resultados de los controles. El facultativoresponsable de la sección, además de la supervisión delas tareas citadas, será responsable de mantener al díalos procedimientos, de la validación final de losresultados, su interpretación y el informe de los mismos.El personal de la sección de detección de antígenosdebe conocer las ventajas y limitaciones de lastécnicas rápidas, así como el fundamento de todas lastécnicas y del funcionamiento de los aparatos. Ademásdebe trabajar en condiciones de máxima seguridadpersonal y ambiental, realizando una adecuadasegregación de los residuos.

12. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO YLIMITACIONES.

La sensibilidad de los métodos de detección deantígeno bacteriano en el LCR varía del 50% al100% dependiendo de las pruebas utilizadas y de losmicroorganismos estudiados.No son recomendables los métodos de aglutinaciónpor látex que detectan un panel de antígenos devarios microorganismos, es mejor la investigación decada microorganismo por separado. En un estudiorealizado por Perkins y cols mediante aglutinaciónpor látex en 1268 muestras (786 orinas, 478 LCR, 3líquidos pleurales y 1 líquido sinovial) para el estudiode antígenos de S. agalactiae, S. pneumoniae, H.influenzae, N. meningitidis serogrupos A, B, C, Y,W135 y E. coli K1 se detectaron un 54% deresultados falsos positivos, un 38% de verdaderospositivos y un 7% de resultados indeterminados.


Hospital..........



La falta de especificidad de la técnica de aglutinaciónpor látex (resultados falsos positivos) se debefundamentalmente a la presencia de un procesoinfeccioso diferente o a la contaminación de lasmuestras por microorganismos que presentan unareacción cruzada con los anticuerposcorrespondientes a los cuatro microorganismos (S.agalactiae, S. pneumoniae, H. influenzae y N.meningitidis) que constituyen el panel quecorrientemente se estudia mediante esta técnica.Los métodos de detección de antígeno no detectansolamente los antígenos excretados sino también losmicroorganismos vivos por lo que la colonización nopuede diferenciarse de la infección. Las bacteriascuando contaminan las muestras de orina y estánpresentes en cantidades de 5,7x104 pueden darlugar a resultados de detección de antígenopositivos, incluso, pocos microorganismos soncapaces de ocasionar estos mismos resultados, si seconserva la muestra a temperatura ambiente durante8-10 horas antes de realizarse la determinación. Enlas muestras obtenidas de forma no estéril, la floramicrobiana de contaminación es una causa frecuentede resultados falsos positivos. La presencia de lamicrobiota de contaminación en la orina esparticularmente problemática en neonatos en loscuales se recoge esta muestra mediante bolsaadhesiva colocada en el periné. Pueden serproblemáticos los resultados positivos de la pruebade látex en el diagnóstico del S. agalactiae, N.meningitidis y E.coli K1 en neonatos sin clarasevidencias de enfermedad. En niños sin bacteriemia,la colonización bacteriana es la principal causa delos resultados positivos de la prueba de látex paradetectar S. agalactiae, por lo que en neonatos, elestudio de la orina recogida mediante bolsa adhesivase debe considerar como una prueba de screeningde colonización más que de infección.Para evitar al máximo estos resultados falsospositivos, la orina y todas las demás muestras debensometerse a un calentamiento a 100º C durante 5minutos antes de la realización de la prueba. Puedendar lugar también a resultados falsos positivos losartefactos introducidos durante la preparación de lamuestra como la filtración con polisulfona.Recientemente se ha puesto en duda el uso deforma rutinaria en el laboratorio de la prueba deaglutinación por látex para el diagnóstico etiológicode la meningitis bacteriana. Debido a que su usoraramente contribuye a modificar la decisión deltratamiento antimicrobiano y a la presencia deresultados falsos positivos el �Practice GuidelineCommittee for Bacterial Meningitis� no recomiendasu uso rutinario como diagnóstico rápido de lasmeningitis bacterianas. Se recomienda sólo el uso dela prueba de aglutinación por látex en los pacientesque hayan recibido tratamiento antibiótico previo, quepresenten un LCR con un recuento celular y pruebasbioquímicas alteradas, con tinción de Gram negativay en los que los cultivos del LCR y de la sangre

permanezcan negativos a las 48 horas de surealización.

13. BIBLIOGRAFÍA1. Ingram DL, Pearson AW, Occhiuti AR. Detection of

bacterial antigens in body fluids with the wellcogenHaemophilus influenzae b, Streptococcuspneumoniae, and Neisseria meningitidis (ACYW135)Latex Agglutination Tests. J Clin Microbiol 1983; 18:1119-1121.

2. Rai GP, Zachariah K, Sharma R, Phadke S,Belapurkar KM. Development of a sandwich dot-enzyme linked immunosorbent assay forStreptococcus pneumoniae antigen detection incerebrospinal fluid. Comp Immun Microbiol Infect Dis2004; 27: 217-223.

3. Rai GP, Zachariah K, Sharma R, Phadke S,Belapurkar KM. Pneumococcal antigen detection incerebrospinal fluid: a comparative study on counterimmunoelectrophoresis, latex agglutination andcoagglutination. Comp Immun Microbiol Infect Dis2003; 26: 261-267.

4. Samra Z, Shmuely H, Nahum E, Pagáis D, Ben-Ari J.Use of the NOW Streptococcus pneumoniae urinaryantigen test in cerebrospinal fluid for rapid diagnosis ofpneumococcal meningitis. Diagn Microbiol Infect Dis2003; 45:237-240.

PNT-TDA-04TÉCNICAS RÁPIDAS DE DIAGNÓSTICO DE LAS GASTROENTERITIS


Jefe de ServicioNombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial



DOCUMENTO TÉCNICO


Hospital........Técnicas rápidas de diagnóstico de las

gastroenteritis Edición 01 Página 2 de 6

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl propósito de este procedimiento es el de definir quétécnicas rápidas de detección de antígeno existen parael diagnóstico etiológico de las gastroenteritis. Sedescribe la forma de recoger las muestras y sualmacenamiento, así como las característicasfundamentales de las técnicas disponibles.

2. FUNDAMENTOEn el transcurso de una gastroenteritis es posibledetectar antígenos del agente responsable en lasmuestras de heces, permitiendo de este modoobtener un diagnóstico etiológico rápido.




- Procedimientos en Microbiología Clínica.Recogida, transporte y procesamiento general demuestras en el laboratorio de microbiología. 1 a.C. Sánchez y C. Guerrero. Sociedad Españolade Enfermedades Infecciosas y MicrobiologíaClínica. 2003.

4. TIPOS DE MUESTRA4.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE LASMUESTRAS DE HECES PARA DETECCIÓN DEANTÍGENOS.En el procedimiento en Microbiología Clínica.Recogida, transporte y procesamiento general demuestras en el laboratorio de microbiología. 1 a.(Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas yMicrobiología Clínica. 2003) se indican las directricesprincipales de la recogida y conservación de lasmuestras (PNT-RTP-01).En líneas generales, las muestras de heces debenrecogerse durante la fase aguda de la infección,preferentemente durante los 3-5 primeros días de laenfermedad. Las muestras recogidas ocho días omás tras la aparición de los síntomas, pueden nocontener suficiente antígeno para efectuar ladetección.Es necesario un mínimo de un gramo de heces, quedeben transportarse en un recipiente limpio y secopreferiblemente de plástico, bien cerrado. Debendesecharse las muestras de heces mezcladas conorina. Tampoco son adecuadas para la detección deantígeno las heces conservadas en formol al 10%,en SAF o en PVA. Las muestras de heces no debenrecogerse en recipientes que contengan sueroanimal, iones metálicos, agentes oxidantes odetergentes.No deben admitirse escobillones de frotis rectales yaque la cantidad de heces que puede haber en elloses insuficiente para realizar las técnicas de detecciónde antígeno. Una vez emitidas, las heces frescas

pueden conservarse hasta dos horas a temperaturaambiente, durante dos días refrigeradas a 4ºC ypasado este tiempo deben congelarse a -20º C opreferentemente a -70º C. Una muestradescongelada no debe volver a congelarse, por loque es recomendable preparar alícuotas.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DEHECES.Deben seguirse las recomendaciones del fabricante.

5. REACTIVOSAglutinación de partículas de látex, EIA e ICTLos reactivos específicos incluidos en los equiposcomercializados.

6. TÉCNICAS DISPONIBLESTodas las técnicas disponibles están debidamenteestandarizadas y disponibles comercialmente.

Técnicas de detección de antígeno deEscherichia coli O157:H7Existen métodos de EIA para la detección delantígeno O157 directamente en las heces que tienenbuena sensibilidad y especificidad. Los ECVTpresentan varios factores de virulencia y entre ellosse encuentran las verotoxinas que son potentescitotoxinas de naturaleza proteica que destruyen lascélulas Vero y están relacionadas estructural einmunológicamente con la toxina Shiga producidapor Shigella dysenteriae tipo 1. Existen dos tipos deverotoxinas VT1 (o SLT-I) y VT2 (o SLT-II).Disponemos de técnicas comerciales de EIA para ladetección de los dos tipos de toxinas directamenteen las heces que tienen buena sensibilidad yespecificidad. Se ha comprobado que los valores desensibilidad y especificidad de estos métodoscomerciales de EIA son mejores cuando la detecciónde los dos tipos de toxinas se realiza en hecesdespués de un enriquecimiento en caldo. Tambiénhay disponible una técnica rápida de ICT.

Técnicas de detección de antígeno deStaphylococcus aureusExisten pocos métodos comerciales de detección deantígeno para realizar este diagnóstico. Uno de ellos(SET-RPLA. OXOID) detecta las enterotoxinas A, B,C y D mediante la técnica de aglutinación pasivareversa por látex. Esta técnica puede utilizarse enalimentos, heces y en aislamientos de S. aureus apartir de un medio de cultivo para determinar si soncepas toxigénicas. La prueba se lleva a cabo enplacas de microtitulación con pocillos en “V”. Sehacen diluciones de la muestra a estudiar, se añadeun volumen de la suspensión de látex apropiada acada pocillo y se mezcla el contenido. Si lasenterotoxinas están presentes tendrá lugar laaglutinación y se formará una capa difusa lechosasobre la base del pocillo. Si por el contrario, lasenterotoxinas están ausentes, se observará un puntoblanco compacto en la base del pocillo. Los




resultados obtenidos son semi-cuantitativos y sevaloran de una a tres cruces. El tiempo deincubación de la técnica es de 24 horas.Existe también otro método de detección de antígeno(Staphylococcal enterotoxin visual immunoassay.Tecra) mediante una técnica de EIA para ladetección de enterotoxinas en alimentos, heces y enaislamientos de S. aureus para detectar sutoxigenicidad. El tiempo de incubación de estatécnica es de unas 4 horas.

Técnicas de detección de antígeno de BacilluscereusExisten pocos métodos comerciales de detección deantígeno para realizar este diagnóstico. Uno de ellos(BCET-RPLA. OXOID) sirve para la detección de laenterotoxina que produce diarrea mediante la técnicade aglutinación pasiva reversa por látex. Esta técnicapuede utilizarse en alimentos, heces y aislamientosde B. cereus a partir de un medio de cultivo paradeterminar su toxigenicidad.Existe también otro método de detección de antígeno(Bacillus diarrhoeal enterotoxin visual immunoassay.Tecra) para la detección de la enterotoxina queproduce diarrea en alimentos, heces y en aislados deB. cereus para detectar su toxigenicidad, mediantetécnica de EIA. El tiempo de incubación de estatécnica es de unas 5 horas.

Técnicas de detección de antígeno deClostridium perfringensEl diagnóstico de la intoxicación alimentaria por C.perfringens puede hacerse mediante el cultivocuantitativo de las muestras de heces. La presenciade una cifra superior a 106 UFC por gramo de heceses sugestivo de intoxicación alimentaria por C.perfringens. No obstante, estos valores tambiénpueden detectarse en personas asintomáticas. Esmejor realizar cultivos cuantitativos de muestras delos alimentos implicados que son sugestivos cuandomuestran valores de aislamiento superiores a 106

UFC por gramo de alimento.El método diagnóstico más adecuado es la detecciónde la enterotoxina en las heces, que puede realizarsemediante un cultivo tisular en células Vero conanticuerpos neutralizantes para inhibir los efectoscitopáticos o mediante técnicas de detección deantígeno del tipo de EIA o aglutinación pasivareversa por látex. La enterotoxina de C. perfringenses muy estable lo que permite la conservación de lasmuestras durante periodos prolongados de tiempohasta su estudio.Existe un método de detección de antígenocomercializado (PET-RPLA. OXOID) que detecta laenterotoxina producida por C. perfringens tipo Amediante la técnica de aglutinación pasiva reversapor látex. Esta técnica puede utilizarse en heces yaislamientos de C. perfringens a partir de medio decultivo para determinar si son toxigénicos. Los límitesde detección de la toxina mediante esta técnica sesitúan entre 2-4 ng por gramo de muestra. La técnica

de aglutinación pasiva reversa por látex secorrelaciona bien con la detección mediante PCR delgen de la enterotoxina, es más sensible yreproducible que los estudios de citotoxicidad celulary resulta más simple que otras técnicas de EIA.

Técnicas de detección de antígeno deClostridium difficileExiste una gran variedad de métodos de detecciónde antígeno para realizar el diagnóstico de lainfección por C. difficile, y en su selección hay quetener presente que el diagnóstico de esta infecciónha de ser lo más rápido posible para iniciar eltratamiento antibiótico al paciente e implantar lasmedidas adecuadas de control de la infecciónnosocomial. Además, para un óptimo diagnósticobacteriológico sólo deben procesarse heces líquidasy recién recogidas debido a la rápida desaparición dela actividad de la citotoxina. Si no se pueden analizardurante las dos primeras horas de su evacuación, lasheces deben congelarse a -20ºC hasta su estudio.Las muestras pueden congelarse y descongelarsehasta dos veces, pero es preferible realizar alícuotas.Detección de antígeno no específico. Consiste en ladetección de la glutamato dehidrogenasa (GHD),enzima producida por todas las cepas de C. difficile(toxigénicas o no), mediante un test de aglutinacióncon partículas de látex. Este método presentavalores de especificidad del 98-99%, mientras quelos valores de sensibilidad entre el 47-67% no sonaceptables para realizar el diagnóstico de lainfección/colonización por C. difficile. Existe unatécnica comercial que detecta simultáneamente elantígeno GHD y la toxina A, pero la sensibilidad deltest es mayor para la detección del enzima que parala detección de la toxina, por lo que, en muchasocasiones, los resultados positivos corresponden a ladetección de cepas de C. difficile no toxigénicas quecon relativa frecuencia se encuentran en las heces.Por este motivo los resultados positivos de este testrequieren la posterior realización de otras pruebas,como la de citotoxicidad o de EIA para detectar lastoxinas A y B, que permitan confirmar dichosresultados.Detección de toxinas. La detección de las toxinas Ay/o B puede realizarse mediante pruebas decitotoxicidad o mediante técnicas de EIA.Test de citotoxicidad. Esta considerado por muchosautores como el método estándar por su gransensibilidad y especificidad para la detección de latoxina B en las heces. Este método se basa en lainoculación de una suspensión de un filtrado deheces en un cultivo celular y en la observación delefecto citopático que se produce a las 24-48 horas yque consiste en un redondeamiento de las células delas líneas que se utilizan (Vero, Hep2, fibroblastos,CHO y HeLa). La confirmación del resultado seobtiene mediante la repetición de la prueba con laadición de un antisuero específico frente a lastoxinas de C. difficile o frente a las de C. sordellii queson antigénicamente idénticas. A pesar de la buena




sensibilidad y especificidad del test, este métodopuede presentar algunos incovenientes. En el 2% delos casos se han detectado efectos citopáticosinespecíficos que no son neutralizados con elantisuero. Pero, sobre todo, no es un test rápido, eslaborioso, no está bien estandarizado y requiere ladisponibilidad de la antitoxina y el mantenimiento delos cultivos celulares de los que no disponen lamayoría de los laboratorios. Debe emplearse comoprueba confirmatoria, pero no parece útil en loslaboratorios convencionales.Técnicas de EIA. En los últimos diez años se handesarrollado muchos ensayos de EIA comercialesque incluyen pruebas de EIA convencionales y demembrana para la detección de la toxina A, la B oambas. La mayoría de los EIA convencionalesutilizan anticuerpos monoclonales antitoxina A parala detección exclusiva de dicha toxina y se presentancomo tests manuales excepto uno, (VIDAS system.bioMerieux-Vitek) que está automatizado. Son muyespecíficos, pero algo menos sensibles que el test decitotoxicidad. Hay que tener presente que estos testsno detectan los casos de infección por C. difficileproducidos por algunas cepas productoras de toxinaB y no productoras de toxina A. Para solventar esteproblema es aconsejable utilizar técnicas de EIA quedetecten ambas toxinas A y B. Estos tests tienen unabuena sensibilidad y especificidad comparados conel test de citotoxicidad. Muy recientemente se hadesarrollado un EIA de flujo horizontal para detectarlas toxinas A y B de C. difficile (Immuno CardToxinas A y B. Meridian. Bioscience. Europe). Estetest tiene una buena sensibilidad y especificidad, esrápido ya que el resultado puede obtenerse a los 15minutos y permite realizar, también, la determinaciónde la producción de toxina de la cepa aislada en uncultivo en medio de CCFA.El método óptimo para realizar el diagnóstico de lainfección por C. difficile es realizar simultáneamentela detección de toxinas mediante EIA y el cultivo deheces en CCFA. En los casos en los que el resultadode la detección de toxinas sea negativo y se aislencolonias de C. difficile hay que realizar ladeterminación de la toxigenicidad de la cepa aisladamediante el test de citotoxicidad o mediante EIA.Este último método como ya se ha comentado es elmás rápido, no obstante, no todos los kits de EIApermiten realizar esta determinación. El cultivo y ladeterminación in vitro de la producción de toxina dela cepa aislada pueden incrementar el resultadopositivo en el diagnóstico de la infección por C.difficile en un 10%.

Técnicas de detección de antígeno deCampylobacterEl ProSpect Campylobacter Microplate Assay es unEIA en fase sólida para la detección cualitativa delantígeno especifico de Campylobacter en muestrasfecales y en cultivos fecales realizados en caldo deenriquecimiento. Este antígeno es un antígeno desuperficie compartido por C. jejuni y C. coli. No se

han encontrado reacciones cruzadas con otrasbacterias enteropatógenas.Comparada con el cultivo, es una prueba rápida y defácil realización que en aproximadamente dos horaspuede ofrecer resultados. El inconveniente de estemétodo es que si el resultado es positivo y no se harealizado simultáneamente el cultivo, no sedispondrá de la cepa para el estudio de sensibilidadantimicrobiana. En los cultivos para el aislamiento deeste microorganismo, aun en medios selectivos,suele haber sobrecrecimiento de la microbiota fecal ydar resultados falsos negativos. Este método esmenos sensible que el cultivo pero su altaespecificidad hace muy infrecuente la obtención deresultados falsos positivos. Ante un resultadonegativo y una alta sospecha clínica de infección porCampylobacter debe realizarse el cultivo.

Técnicas de detección de antígeno de RotavirusExiste un gran número de técnicas comerciales para ladetección en las heces de antígeno de rotavirus delgrupo A. Existen técnicas de EIA, de aglutinación y deICT.Técnicas de EIA. Se realiza una detección cualitativade antígeno de rotavirus en heces mediante un EIA.Estas técnicas aportan cierta información sobre lacantidad de antígeno viral excretado por las heces encomparación con las otras técnicas antigénicas enlas que el resultado sólo es cualitativo.Técnica de EIA de membrana. Es un métodocualitativo, rápido y fácil de realizar que se presentaen tests individualizados. Para su realización serequiere un equipamiento mínimo y el resultado, quese lee visualmente, se obtiene en menos de 30minutos. Es un método muy adecuado paralaboratorios de hospitales pequeños con un númeroescaso o esporádico de investigaciones de rotavirusen heces. Existe algún EIA de membrana quedetecta a la vez rotavirus y adenovirus entéricos enheces.Técnicas de aglutinación de partículas de látex. Esun test rápido, cuyos resultados pueden obtenerseen menos de 30 minutos y además es fácil derealizar. Requiere poco equipamiento y el kitcomercial incluye todos los reactivos necesarios parasu realización. Una desventaja importante de estostests es que son menos sensibles que los EIA.Existen tests comerciales de aglutinación por látexque detectan a la vez rotavirus y adenovirus enheces.Técnicas de ICT. Recientemente se hancomercializado técnicas inmunocromatográficascualitativas para la detección de antígeno derotavirus sólo o de rotavirus y adenovirus entéricosen las heces.

Técnicas de detección de antígeno deAdenovirus.Adenovirus no es un agente etiológico de la diarreainfantil tan importante como rotavirus y por estarazón, se han desarrollado menos pruebas




comerciales de detección de antígeno y ademásmuchos laboratorios no realizan el diagnóstico deestos virus de forma rutinaria. Existen métodos tipoespecíficos que detectan sólo los serotipos 40 y 41 yotros métodos grupo específicos que detectan todoslos adenovirus. Existen métodos de aglutinación conpartículas de látex, EIA e ICT. Estas técnicas, comose ha comentado, permiten detectarsimultáneamente adenovirus y rotavirus, lo queaumenta la frecuencia de investigación deadenovirus en heces.

Técnicas de detección de antígeno de Astrovirus.Los astrovirus pertenecientes a la familiaAstroviridae, son virus sin envoltura con un ARNmonocatenario de polaridad positiva, pequeños de28-41 nm y con apariencia de estrella al microscopioelectrónico. Existen ocho (1-8) serotipos diferentesde estos virus, pero existe una reacción cruzadaantigénica entre ellos y se ha detectado unanticuerpo grupo específico denominado MAb8E7que reconoce a los ocho serotipos humanos.En 1990 se diseñó uno de los primeros EIA para ladetección de astrovirus. Este EIA se basaba en lautilización del anticuerpo MAb8E7 el cual reconoceun epítopo común a todos los serotipos. Actualmenteen Europa se dispone de un kit comercial de EIAamplificado (Amplified IDEIATM Astrovirus, DAKOCytomation, Cambridgeshire, United Kingdom) quees específico para la detección de astrovirushumanos en heces. Los pocillos de la placa estánrevestidos por un anticuerpo policlonal específico degénero. La presencia de antígeno se revela medianteun anticuerpo monoclonal específico de género,conjugado con dextrano y que incorpora múltiplesmoléculas de enzima que amplifica la señal. Existetambién, otro kit disponible comercialmente de EIA(Prospect Astrovirus EZ Microplate Assay. Alexon-Trend, Inc) para la detección de antígeno deastrovirus cuyas características son muy parecidas alcitado Amplified IDEIA Astrovirus de DAKO.

Técnicas de detección de antígeno de Norovirus.Se ha comercializado un EIA (IDEIA NLV, DakoCytomation, United Kingdow) que detecta los dosgenogrupos de norovirus mediante dos anticuerposmonoclonales específicos para cada uno de ellos. Lapresentación incluye dos placas una para cadagenogrupo. Estos pocillos están recubiertos por unanticuerpo monoclonal específico anti-genogrupo I yanti-genogrupo II. La suspensión de heces que seañade a los pocillos, se incuba simultáneamente conotro anticuerpo policlonal específico conjugado, paracada uno de los dos genogrupos.

7. APARATOS Y MATERIALEl equipamiento necesario para la realización de lastécnicas descritas, incluyendo el tratamiento de lasmuestras, es el siguiente:- Agitador orbital- Centrífuga

- Baño Maria- Vórtex- Alimentador de electroforesis- Pipetas automáticas- Estufa de 37ºC- Cámara húmeda- Lector de placas de EIA- Lavador automático de placas de EIA

8. PROCEDIMIENTOLos procedimientos concretos de realización de lastécnicas de aglutinación, enzimoinmunoensayo einmunocromatografia, al realizarse en todos loscasos mediante procedimientos comercializados nose detallan ya que se encuentran debidamentedescritos en la documentación de cada equipocomercial.

9. CONTROL DE CALIDADSiguiendo las Recomendaciones generales para elcontrol de calidad interno en Microbiología Clínica(CCI-SEIMC) realizado por el grupo colaboradorGEGMIC, para los reactivos comerciales, debesolicitarse al fabricante que disponga de un Sistemade Calidad reconocido y que facilite al laboratorio losdatos relativos al control de cada lote de reactivo. Lamayoría de técnicas comerciales incluyenactualmente controles positivo y/o negativo pararealizar bien a la vez que cada una de lasdeterminaciones bien cada vez que se realice ungrupo de ellas, en función del sistema depresentación. Cada centro debe también considerarla conveniencia de participar en programas externosde control de calidad. También se realizarán entodas las técnicas controles de calidad internosempleando muestras propias de resultado yaconocido. La participación en controles de calidadexternos es recomendable para asegurar la calidadde nuestros resultados.

10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSTécnicas de aglutinaciónUna muestra es positiva si se produce una aglutinaciónclara de las partículas visible macroscópicamente entreel reactivo y la muestra y entre el reactivo y el controlpositivo.


InmunocromatografíaUna determinación se considera positiva cuando seobtiene una banda coloreada en la línea control(donde se fija el conjugado) y también en la línea dereacción (donde se fija el antígeno); y negativocuando únicamente se obtiene una banda en la líneacontrol.




11. RESPONSABILIDADESEl personal técnico de la sección será el responsablede revisar las solicitudes estudiando la idoneidad de lamuestra remitida con la determinación solicitada, deltratamiento de las muestras, de la realización de lastécnicas y de la validación de los resultados en funciónde los resultados de los controles. El facultativoresponsable de la sección, además de la supervisiónde las tareas citadas, será responsable de mantener aldía los procedimientos, de la validación final de losresultados, su interpretación y el informe de losmismos.El personal de la sección de detección de antígenosdebe conocer las ventajas y limitaciones de lastécnicas rápidas, así como el fundamento de todas lastécnicas y del funcionamiento de los aparatos. Ademásdebe trabajar en condiciones de máxima seguridadpersonal y ambiental, realizando una adecuadasegregación de los residuos.


Detección de antígeno de Campylobacter.Según diferentes estudios, la detección de antígenopor EIA presenta una sensibilidad entre el 89% y el96% y una especificidad de 98%- 99% al compararlacon el cultivo de heces para el aislamiento de estemicroorganismo. Los valores predictivos positivos(VPP) y negativos (VPN) oscilan entre 78%-80% y99% respectivamente.

Deteccion de antigeno de Rotavirus.En la evaluación de tres técnicas diferentes dedetección de antígeno: EIA, ICT y aglutinación departículas de látex, para la detección de rotavirus enheces en niños con gastroenteritis se han obtenidolos siguientes valores: a) para la técnica de EIA,sensibilidad de 96%, especificidad de 99%, VPP de98% y VPN de 98%; b) para la técnica deaglutinación, sensibilidad de 68%, especificidad de99%, VPP de 96% y VPN de 88%; c) para la ICT,sensibilidad de 98%, especificidad de 96%, VPP de92% y VPN de 99%.Las técnicas de EIA convencionales se consideran losmétodos de referencia por su alta sensibilidad yespecificidad, además permiten la realización demuchas determinaciones simultaneas. No obstante eltiempo de realización de la técnica es largo y serequiere un equipamiento específico. Como seobserva, la especificidad de las técnicas deaglutinación de partículas de látex es buena pero susensibilidad es baja. Su sensibilidad es adecuada, sólocuando se estudian muestras de heces quecorresponden a un periodo inicial de la enfermedad,momento en el que se excretan gran cantidad departículas víricas por las heces. En función de losresultados, su bajo coste y la simplicidad y rapidez derealización, puede considerarse a la ICT como unabuena técnica para uso rutinario en los laboratoriosdonde se realiza la investigación de rotavirus en heces.Otra ventaja de esta técnica es que además, como ya

se indicó, permite realizar también, al mismo tiempo, lainvestigación de adenovirus entéricos en las heces.

Deteccion de antígeno de Astrovirus.En algunos estudios, cuando se compara ladetección de antígeno de astrovirus por EIA con elcultivo celular y la RT-PCR, la sensibilidad de latécnica de EIA es del 100% y la especificidad del99%. Otros trabajos, por el contrario, presentanpeores resultados para el EIA al comparar estatécnica con la RT-PCR. La RT-PCR es más sensibleque algún EIA y que el cultivo celular en eldiagnóstico de la infección por astrovirus.

Deteccion de antígeno de Norovirus.En un reciente trabajo se han comparado dostécnicas de EIA, el SRSV (II)-AD (Denka Seiken Co,Tokio, Japan) y el IDEIA NLV (Dako Cytomation,United Kingdow) con la RT-PCR en el diagnóstico denorovirus humanos en heces. El kit de Denkapresentó una alta sensibilidad, superior al 70% y unaespecificidad de solo el 69%. El kit de Dako presentóuna baja sensibilidad, inferior al 30% y una altaespecificidad (100%). Este kit, como ya se hacomentado, es capaz de discriminar entre losgenogrupos I y II, pero no es capaz de detectaralgunos de los subgrupos más frecuentes, por lo quepuede dar lugar a resultados falsos negativos.Debería mejorarse su sensibilidad mediante lainclusión adicional de anticuerpos específicos frentea estos subgrupos no detectados. El kit de Denkapresenta muchas reacciones inespecíficas consustancias presentes en las heces y tambiénreacciona con los sapovirus humanos, por lo que dalugar a resultados falsos positivos. Este último kitpuede utilizarse como screening de muestras deheces para hacer el diagnóstico de norovirus, perolos resultados positivos deben confirmarse mediantela técnica de RT-PCR. La técnica de RT-PCR es mássensible que el IDEIA NLV (Dako) en la detección delantígeno de norovirus humanos.

13. BIBLIOGRAFÍA1. Burton-MacLeod JA, Kane EM, Beard RS, Hadley LA,

Glass RI, Ando T. Evaluation and comparison of twocommercial enzyme-linked immunosorbent assay kits fordetection of antigenically diverse human noroviruses instool samples. J Clin Microbiol 2004;42:2587-2595.

2. Cubitt WD, Mitchell DK, Carter MJ, Willcocks MM,Holzel H. Application of electronmicroscopy, enzymeimmunoassay, and RT-PCR to monitor an outbreak ofastrovirus type 1 in a paediatric bone marrow transplantunit. J Med Virol 1999;57:313-321.

3. Dediste A, Vandenberg O, Vlaes L, Ebraert A, Douat N,Bahwere P, Butzler JP. Evaluation of the ProSpecTMicroplate Assay for detection of Campylobacter: aroutine laboratory perspective.Clin Microbiol Infect2003;9:1085-1090.

4. Park CH, Vandel MN, and Hixon DL. Rapidimmunoassay for detection of Escherichia coli O157directly from stool antigens. J Clin Microbiol 1996;34:988-990.

PNT-TDA-05TÉCNICAS RÁPIDAS DE DIAGNOSTICO DE LAS PARASITOSIS




01 Edición inicial


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DOCUMENTO TÉCNICO


Hospital...........Técnicas rápidas de diagnóstico de

las parasitosis Edición 01 Página 2 de 6

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl propósito del procedimiento es el de definir quétécnicas rápidas de detección de antígenoestandarizadas existen para el diagnóstico etiológicode algunas de las infecciones parasitarias (Entamoebahistolytica, Giardia lamblia, Crysptosporidium parvum,Leishmania, Plasmodium y Wuchereria brancofti). Sedescribe qué muestras son las más adecuadas enfunción de los parásitos que se desea detectar y enfunción de la técnica que se plantea utilizar. Existenpruebas de detección de antígeno para otrasparasitosis; pero no están comercializadas (Taenia,Trypanosoma, Strongyloides) o bien no se dispone detrabajos publicados sobre ellas.

2. FUNDAMENTOEn las infecciones gastrointestinales del tubo digestivo,se pueden detectar antígenos del parásito responsableen las heces o bien en muestras recogidas porendoscopia. En las parasitosis hemotisulares ladetección de antígeno se realiza fundamentalmente enla sangre, sin embargo también es posible en algúncaso detectar antígeno en orina, como sucede en eldiagnóstico de la leishmaniasis.




- Procedimientos en Microbiología Clínica. Recogida,transporte y procesamiento general de muestras enel laboratorio de microbiología. 1 a. C. Sánchez y C.Guerrero. Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica. 2003.

- Ausina V, Sabrià M, Irrutia de Diego A et al.Enfermedades Infecciosas. En: Rozman C. MedicinaInterna Farreras-Rozman. 15ª edición, Elsevier,Madrid 2004.

4. TIPOS DE MUESTRAEn la tabla 1 se indica el tipo de muestras de elecciónpara la detección de cada parásito y las técnicas porlos que éstos se pueden detectar.

4.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE LAMUESTRAEn el procedimiento en Microbiología Clínica.Recogida, transporte y procesamiento general demuestras en el laboratorio de microbiología. 1 A.(Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas yMicrobiología Clínica. 2003) se indican las directricesprincipales de la recogida y conservación de lasmuestras (PNT-RTP-01).Consideraciones adicionalesSangre:- Algunos de los estudios se pueden efectuar de

sangre obtenida de una punción digital de formainmediata in situ (Plasmodium, Wuchereria).

- Si se envía la sangre al laboratorio, en algunasocasiones se debe usar anticoagulante (EDTA oheparina) y en otras no. Se deben seguir lasinstrucciones del fabricante.

- En la prueba de Og4C3 ELISA de Wuchereriabancrofti puede conservarse la sangre obtenidapor punción digital (Nobuto-type 1, Advantec,Tokio) en un papel de filtro y enviarlo al laboratorio.El procedimiento es el siguiente:1. Se realiza una punción digital Se absorbe

la sangre en un papel de filtro. Se calculaque se absorben 100 µL de sangre, queserían 40µL de suero.


Entamoeba histolytica/dispar Heces, pus (abscesos)EIAICT (combinando con Giardia yCryptosporidium)

Giardia lamblia Heces IFD, EIA, ICT

Cryptosporidium parvum Heces IFD, EIA, ICT

Leishmania Orina LA

Plasmodium Sangre ICTWuchereria brancofti Sangre ICT

ICT: Inmunocromatografía; IFD: inmunofluorescencia directa; EIA: Enzimoinmunoensayo;LA: Aglutinación por partículas de látex.




2. Los autores que han usado esta técnicarefieren que se puede guardar la muestra en lanevera (4oC) durante meses y se puedenenviar por correo ordinario, sin pérdidasignificativa de reactividad; aunque nosuministran ninguna evidencia de ello.

- En las pruebas de detección de antígeno deWuchereria bancrofti no es necesario recoger lamuestra por la noche (esencial en la mayor partede zonas geográficas si se desea realizar eldiagnóstico por examen microscópico directo).

Heces:En general, se deben enviar al laboratorio sin medio detransporte. Se ha comprobado que algunas de laspruebas se pueden realizar sobre muestra fijada. Enalgunos casos, se puede conservar la muestra a –20oC.

4.2. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA.Deben seguirse las instrucciones suministradas por elfabricante.

5. REACTIVOSLos reactivos específicos incluidos en los equiposcomercializados.

6. TÉCNICAS DISPONIBLES.Técnicas de detección de antígeno de EntamoebahistolyticaExisten pruebas que no distinguen E. histolytica de E.dispar (Entamoeba®, TechLab; ProSpecT®, Alexon) ypruebas que sí (E. histolytica test®, TechLab, MerlinOptimum S test®, Merlin Diagnostika), todas ellas deenzimoinmunoensayo. Entamoeba test y E. histolyticatest se basan en la detección de epítopos de la lectinade Entamoeba. Esta última se basa en la detección deun epítopo específico presente sólo en la de E.histolytica y es capaz de diferenciarla de E. dispar.

Técnicas de detección de antígeno de Giardia lambliaExisten pruebas de inmunofluorescencia directa(Merifluor®, Meridian), inmunoensayo (entre otros:Melotest Giardiasis®, ProSpecT Giardia®, GiardiaCELISA®, DSL-Giardia®) e inmunocromatografía(ImmunoCard STAT!®, Meridian).

Técnicas de detección de antígeno de CryptosporidiumparvumExisten pruebas de inmunofluorescencia directa(Merifluor®, Meridian; Monofluo®, Bio-Rad; Crypto-CelIF, Cellabs), inmunoensayo (ProSpecT®, Alexon;Premier®; Techlab Cryptosporidium®, IDEIACryptosporidium®, Dako; Color Vue®, Seradyn;Cryptosporidium Antigen Detection Microwell ELISA,LMD, Ridascreen Cryptosporidium ELISA,Quadratech) e inmunocromatografía (Crypto-Strip,Coris BioConcept).

Pruebas combinadas en hecesMerifluor Cryptosporidium/Giardia®, Meridian: pruebade inmunofluorescencia directa para Cryptosporidiumparvum y Giardia lamblia.ImmunoCard STAT! Cryptosporidium/Giardia,Meridian: prueba de inmunocromatografía para ladetección de Cryptosporidium parvum y Giardialamblia.Triage®: prueba de inmunocromatografía paradetección de E. histolytica/dispar, Cryptosporidiumparvum y Giardia lamblia.ColorPac®, BD: prueba de inmunocromatografía paradetección de Cryptosporidium parvum y GiardialambliaProSpecT Giardia/Cryptosporidium, Alexon: prueba deenzimoinmunoensayo para Cryptosporidium parvum yGiardia lamblia.

Técnicas de detección de antígeno de PlasmodiumOptiMAL®, Flow: prueba de inmunocromatografía quedetecta la infección causada por todas las especies dePlasmodium y, además, específicamente, la causadapor Plasmodium falciparum. Se basa en la detecciónde diferentes isoenzimas de lactato-deshidrogenasaproducidas por Plasmodium.ICT Malaria P.f/P.v® (Binax), ParaSight® (BD),Paracheck-Pf® (AMRAD), Makromed (Makro Medical),BIO P.F. (VEDA LAB), Malaria Rapid (Vision Biotech),ParaHIT f (Span Diagnostics) son pruebas deinmunocromatografía que detectan una proteína ricaen histidina. En la prueba ICT Malaria P.f/P.v (Binax)hay dos anticuerpos, uno detecta específicamente laproteína de P. falciparum y la otra detecta las proteínasde todas las especies de Plasmodium patógenas parala humana. Las demás solamente detectan P.falciparum.

Técnicas de detección de antígeno de LeishmaniaExiste como método rápido de detección de antígenouna técnica de aglutinación de partículas de látex enorina para detección de antígeno de Leishmania enmuestras de orina (Katex. Kalon Biological Ltd.UK). Elmétodo se ha mostrado útil en el diagnóstico de laleishmaniasis. La técnica ha demostrado unacorrelación elevada en pacientes diagnosticados consida diagnosticados de leishmaniasis visceral porexamen microscópico y cultivo.

Técnicas de detección de antígeno de WuchereriabrancoftiICT, Binax: prueba de inmunocromatografía que sepuede realizar en sangre total (punción digital) o ensuero. Emplea anticuerpos monoclonales ypoliclonales que reconocen antígenos de W. bancrofti.El correspondiente al anticuerpo monoclonal no hasido caracterizado. Antes se comercializó porAMRAD.Og4C3-ELISA, TropBio: prueba de EIA en doblesandwich que se realiza en suero. Emplea unanticuerpo monoclonal contra Onchocerca gibsoni. Los




antígenos detectados se encuentran, principalmente,en las formas adultas.

7. APARATOS Y MATERIALEl equipamiento necesario para la realización de lastécnicas descritas, incluyendo el tratamiento de lasmuestras, es el siguiente:- Lector de placas de microtitulación.- Sistema de lavado (automático o manual).- Microscopio de fluorescencia.- Centrífuga.- Vórtex.- Baño María.

8. PROCEDIMIENTOLos procedimientos de realización de las técnicas nose detallan, ya que se encuentran debidamentedescritos en la documentación de cada equipocomercial.

9. CONTROL DE CALIDADSiguiendo las recomendaciones generales para elcontrol de calidad interno en Microbiología Clínica(CCI-SEIMC) realizado por el grupo colaboradorGEGMIC, para los reactivos comerciales, debesolicitarse al fabricante que disponga de un Sistema deCalidad reconocido y que facilite al laboratorio losdatos relativos al control de cada lote de reactivo. Lamayoría de técnicas comerciales incluyen actualmentecontroles positivo y/o negativo para realizar bien a lavez que cada una de las determinaciones bien cadavez que se realice un grupo de ellas, en función delsistema de presentación. Cada centro debe tambiénconsiderar la conveniencia de participar en programasexternos de control de calidad.

10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSEnzimoinmunoensayoSe consideran positivas aquellas muestras con unvalor de absorbancia tantas veces superior al delcontrol negativo como indique el fabricante en cadacaso.La prueba de W. bancrofti permite la cuantificación delresultado, dato que puede resultar útil desde el puntode vista clínico, especialmente cuando se vayaadquiriendo más experiencia con esta prueba.

InmunocromatografíaUna determinación se considera positiva cuando seobtiene una banda coloreada en la línea control (dondese fija el conjugado) y también en la línea de reacción(donde se fija el antígeno); y negativo cuandoúnicamente se obtiene una banda en la línea control.La interpretación de los resultados depende de latécnica utilizada.En la prueba OptiMAL® para diagnóstico de la malariahay dos bandas que pueden ser positivas, unaespecífica de P. falciparum y la otra dirigida contra lascuatro especies de Plasmodium. Si solamente espositiva esta última, existe infección por P. vivax, P.

ovale o P. malariae. Si son positivas las dos, existendos posibilidades:- Banda de P. falciparum más intensa que la otra:

infección por P. falciparum solamente- Banda de P. falciparum más tenue que la otra:

infección mixta por P. falciparum.Enla prueba ICT Malaria P.f/P.v®:- La positividad de la banda en P. falciparum indica

infección por éste.- La positividad de las dos bandas, la

correspondiente a P. falciparum y la dirigida atodas las especies de Plasmodium indica unainfección por P. falciparum o una infección mixtapor P. falciparum y otra especie.

- La positividad únicamente de la bandacorrespondiente a todas las especies indica unainfección por una o varias de ellas y excluye la deP. falciparum.

Técnicas de aglutinaciónUna muestra es positiva si se produce una aglutinaciónclara de las partículas visible macroscópicamenteentre el reactivo y la muestra y entre el reactivo y elcontrol positivo.



AmebiasisLos trabajos publicados indican que las pruebas dedetección de antígeno son más sensibles que elexamen microscópico de heces para la detección deEntamoeba. En áreas de baja endemia, el valorpredictivo positivo de infección por E. histolytica deestas pruebas es muy bajo y, la mayoría de veces, losresultados positivos indican colonización por E. dispar.Por ello, y debido a la frecuencia de la colonización porla especie no patógena E. dispar, es imprescindibleconfrontar los resultados positivos con la clínica delpaciente, para evitar diagnósticos erróneos ytratamientos innecesarios. Otra estrategia consistiríaen usar una de las pruebas específicas de E.




histolytica, que tienen una sensibilidad comparable yuna especificidad de especie muy superior (del ordendel 93%), y comparable a la obtenida por el cultivo opor PCR. Hay autores que desautorizan usar elexamen microscópico directo de las heces para eldiagnóstico de la amebiasis por ser un método pocosensible, incapaz de diferenciar entre E. histolytica y E.dispar y sujeto a dar resultados falsos positivos. LaOMS recomienda que lo óptimo es usar un método dediagnóstico de E. histolytica, y que si se utiliza unmétodo que no diferencie E. histolytica de E. disparsólo debería administrarse tratamiento si hubiera otrasrazones que hicieran sospechar infección (alto título deanticuerpos, o antecedentes epidemiológicos decontacto con un enfermo diagnosticado o broteepidémico). Se ha registrado reacción cruzada con E.dispar en la prueba de detección de antígeno basadaen anticuerpos frente a un antígeno rico en serinapresente solamente en E. histolytica (Merlin®), no asícon la basada en la detección específica de lectina deE. histolytica (E.histolytica test®, TechLab).

GiardiasisLa prueba de inmunofluorescencia directa permitevisualizar el parásito y se considera la prueba dereferencia. Además, son más sensibles que el examenmicroscópico convencional. Las de inmunoensayopermiten una lectura objetiva y la realización demúltiples pruebas a la vez. A veces hay problemas deinterpretación con la inmunocromatografía, cuandoaparecen bandas tenues.La sensibilidad de los métodos de EIA e ICT es menorque la IFD, especialmente en muestras que contienenpoca cantidad de parásito. Por esta razón, hay autoresque desaconsejan su uso como prueba de cribado ocomo método único de diagnóstico, especialmente enpoblaciones con baja prevalencia de la infección.Existen trabajos que sugieren que sería preciso,también con estos métodos, examinar más de unamuestra, antes de descartar definitivamente eldiagnóstico.

CriptosporidiasisLas pruebas de detección de antígeno en lacriptosporidiasis tienen una gran sensibilidad yespecificidad, especialmente las deinmunofluorescencia directa, que permiten lavisualización del parásito y que se consideran laprueba de referencia.

Pruebas combinadas en hecesLas pruebas combinadas en heces suelen tener lasventajas e inconvenientes de las mismas realizadaspor separado. En general, la detección de Giardia yCryptosporidium es excelente, con una sensibilidadmuy alta y una especificidad cercana al 100%. Losfalsos negativos suelen ocurrir en muestras quecontienen una pequeña cantidad de parásito. Por otraparte, las que detectan Entamoeba no distinguen entrela especie E. histolytica y E. dispar, hecho que debeser reflejado en el informe y tenido en cuenta por el

clínico a la hora de valorar los resultados positivos. Laspruebas de detección de antígeno combinadas nopueden sustituir completamente el examenmicroscópico rutinario, porque es necesario paradiagnosticar la mayoría de las otras especies deparásitos.Triage®: no distingue entre E. histolytica y E. dispar.Está diseñada para sustituir el examen microscópicoen heces pero solamente detecta E. histolytica/dispar,G. lamblia y C. parvum.

PaludismoEs posible que la inmunocromatografía sea la únicaforma de diagnosticar pacientes de malaria que hanempezado a automedicarse, cuando el examenmicroscópico y la PCR ya son negativos. Hay pruebasque detectan todas las especies de Plasmodium(OptiMAL y ICT P.f/P.v) y otras que sólo sirven para P.falciparum. Debe conocerse la especie endémica en lazona de qué se trate en cada caso parar escogercorrectamente la prueba a utilizar y para interpretaradecuadamente los resultados. Es convenienteinformarse en la bibliografía de la sensibilidad yespecificidad de cada una de las pruebas en cadacaso.La prueba OptiMAL, usada en zonas en las que seconoce la especie endémica, puede utilizarse para sudiagnóstico. Por ejemplo, en lugares donde seencuentra Plasmodium falciparum y Plasmodium vivaxúnicamente, se puede establecer el diagnóstico decada una de las dos especies y de las infeccionesmixtas. Se considera que cuando la banda de P.falciparum es más tenue que la dirigida contra todaslas especies de Plasmodium existe una infecciónmixta. La explicación sería que en las demás especies,al existir todos los estadios de maduración en sangreperiférica, habría más lactato deshidrogenasa que enlas infecciones únicamente por P. falciparum, en lasque solamente existen parásitos en los estadios detrofozoíto joven y gametocito.La prueba ICT P.f/P.v se basa en dos tipos deanticuerpos, unos específicos de P. falciparum y otrosdirigidos contra epítopos de la proteína rica en histidinapresente en todas las especies patógenas para elhombre. Sin embargo, solamente se han podidorealizar estudios para el diagnóstico de la infección porP. falciparum y P. vivax. No se tiene suficienteexperiencia para P. ovale y P. malariae, aunqueparece lógico que estas infecciones puedan serdiagnosticadas con este kit. El mismo fabricante hanombrado la prueba P.f/P.v; es decir, como siúnicamente diagnosticara P. falciparum y P. vivax,aunque en las instrucciones señala que puedeutilizarse para todas las especies. Futuros trabajosdeben dilucidar este punto.Se considera que las pruebas de PCR son las mássensibles y específicas y son las de referencia. Laspruebas de detección de antígeno son menossensibles que el examen microscópico de una muestrade sangre periférica realizada por personal entrenado,especialmente en parasitemias leves y en infecciones




por P. vivax (en comparación a P. falciparum.Respecto a otras especies no se dispone de suficienteinformación). Ocasionalmente, pueden aparecer falsosnegativos en parasitemias intensas.Es necesario el examen microscópico de sangreperiférica para poder distinguir los trofozoitos y losgametocitos y para estimar la parasitemia, elementosnecesarios para el pronóstico y seguimiento. Estaspruebas no detectan los casos de Plasmodiumfalciparum en que solamente se encuentrangametocitos en la sangre periférica. Las de detecciónde la proteína rica en histidina persisten positivas unos7-14 días después de iniciado el tratamiento y, enconsecuencia, no se pueden utilizar para un control dela efectividad inmediata del mismo. Ello no ocurre conla prueba OptiMAL, que detecta el enzima lactatodeshidrogenasa. Existen falsos positivos en pacientescon factor reumatoide en todas las pruebas. Haypruebas que sólo detectan las infecciones por P.falciparum (por ejemplo, ParaSight®, Paracheck Pf)

LeishmaniaLa aglutinación de partículas de látex para detecciónde antígeno de Leishmania en muestras de orina esuna técnica sensible y específica, de fácilinterpretación, barata y reproducible. Sin embargo, elantígeno de Leishmania puede detectarse durantelargos períodos de tiempo después del diagnóstico,por lo que la técnica no parece ser de utilidad en lamonitorización clínica del tratamiento.

W. bancroftiEs difícil estimar la sensibilidad y la especificidad delos métodos de detección de antígeno, debido a laabundancia de infecciones subclínicas y a la ausenciade un gold-standard. De todas formas, parece queestos métodos son bastante más sensibles que latécnicas de observación microscópica. Se han dadodiversas explicaciones para comprender por qué enmuchos casos se detecta antigenemia sinmicrofilaremia, especialmente en jóvenes de menos de25 años:- Infección incipiente. El nivel de antigenemia suele ser

bajo.- Infección causada por adultos machos sin presencia

de hembras. El nivel de antigenemia también es bajo.- Supresión inmune de las microfilarias. Se da en

pacientes de más de 35 años con antigenemia alta.- Post-tratamiento. La antigenemia puede persistir

durante 42 meses.

En todo caso, está indicado seguir la evolución de lospacientes con antigenemia sin microfilaremia. Otrasventajas de las pruebas de detección de antígeno sonsu sencillez (ICT) y que se pueden almacenar lasmuestras en la nevera para una posteriordeterminación, si se usa la técnica de recogida demuestra en papel de filtro o si se conserva el suero a –70oC. La prueba ICT es cualitativa y el EIA escuantitativo.

No permiten el seguimiento de la infección, ya que sepuede detectar antígeno en los pacientes hasta dosaños después de un tratamiento satisfactorio. Se hainformado de la aparición de falsos positivos en laprueba de inmunocromatografía comercializada porBinax si la lectura se realiza más allá de los 10 minutosque marca el fabricante.

13. BIBLIOGRAFÍA1. Aldeen WE, Carroll K, Robison A et al. Comparison of NineCommercially Available Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays for Detection of Giardia lamblia in Fecal Specimens. JClin Microbiol 1998, 36:1338-1340.2. Braga C, Dourado MI, Ximenes RAA et al. Field Evaluationof the Whole Blood Immunochromatographic test for rapidbancroftian filariasis diagnosis in the northeast of Brazil. RevInst Med trop S. Paulo 2003, 45:125-129.3. Coleman RE, Maneechai N, Rachaphaew N. Fieldevaluation of the ICT Malaria PF/PV immunochromatographictest for the detection of asymptomatic malaria in aPlasmodium falciparum/vivax endemic area in Thailand. Am JTrop Med Hyg 2002, 66:379-383.4. Haque R, Ali IKM, Akther S et al. Comparison of PCR,Isoenzyme Analysis, and Antigen Detection for Diagnosis ofEntamoeba histolytica Infection. J Clin Microbiol 1998,36:449-452.5. Johnston SP, Ballard MM, Beach MJ et al. Evaluation ofThree Comercial Assays for Detection of Giardia andCryptosporidium Organisms in Fecal Specimens. J ClinMicrobiol 2004, 41:623-626.6. Rosenblatt JE y Sloan LM. Evaluation of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detection ofCryptosporidium spp. in Stool Specimens. J Clin Microbiol1993, 31:1468-1471.7. Sharp SE, Suarez CA, Duran Y et al. Evaluation of theTriage Micro Parasite Panel for Detection of Gairdia lamblia,Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar, andCryptosporidium parvum in Patient Stool Specimens. J ClinMicrobiol 2001, 39:332-334.8. Soto Tarazona A, Solari Zerpa L, Mendoza Requena D etal. Evaluation of the Rapid Diagnostic Test OptiMAL forDiagnosis of Malaria due to Plasmodium vivax. Braz J InfectDis 2004, 8:151-155.9. Vilaplana C., Blanco S, Domínguez J, Giménez M, Tural C,Muñoz C, and Ausina V. Non invasive diagnosis of visceralleishmaniasis by a latex antigen detection test in urinesamples. J Clin Microbiol. 2004; 4:1853-1854.

PNT- TDA-06TÉCNICAS RÁPIDAS DE DIAGNOSTICO DE LAS INFECCIONES POR HERPESVIRUS




01 Edición inicial



DOCUMENTO TÉCNICO


Hospital.......Técnicas rápidas de diagnóstico de

las infecciones por herpesvirus Edición 01 Página 2 de 4

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl propósito de este procedimiento es el de definir quétécnicas rápidas de detección de antígeno existen parael diagnóstico de las infecciones causadas porherpesvirus. Se describe qué muestras son las másadecuadas en función del herpesvirus que se deseadetectar y en función de la técnica que se planteautilizar.

2. FUNDAMENTOLos herpesvirus que infectan al hombre son ocho:herpesvirus 1 y 2 (herpes simple 1 y 2), herpesvirus3 (virus varicela-zóster), herpesvirus 4 (virus Epstein-Barr), herpesvirus 5 (citomegalovirus), herpesvirus 6,7 y 8. Todos ellos pertenecen a la misma familia ycomparten una característica biológica común que esla capacidad de establecer un estado de latencia trasla primoinfección, sin embargo presentancaracterísticas genómicas y antigénicas diferentes.En la actualidad existen comercializadas técnicaspara la detección de antígenos de los herpesvirus 1,2, 3 y 5. Los herpesvirus 1, 2 y 3 afectanprincipalmente a la piel y las mucosas, en estalocalización las células infectadas son fácilmenteasequibles para su recogida y en ellas se puededetectar la presencia de los antígenos víricos. Enotras localizaciones de la infección, por ejemplo elsistema nervioso central, habitualmente no se puededisponer de muestra por lo que las técnicas dedetección de antígeno aunque están descritas no seutilizan de forma rutinaria. La detección de antígenode herpesvirus 5 como técnica diagnóstica sólo se hapodido desarrollar para su utilización en rutina enmuestra de sangre periférica.




- Procedimientos en Microbiología Clínica. Recogida,transporte y procesamiento general de muestras enel laboratorio de microbiología. 1 a. C. Sánchez y

C. Guerrero. Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica. 2003.

- Procedimientos en microbiología clínica.Diagnóstico de laboratorio de las infecciones porherpesvirus. 8a. 2005.

- 4. TIPOS DE MUESTRAEn la tabla 1 se indican las muestras de elecciónpara la detección de cada herpesvirus y las técnicaspor los que se pueden detectar.

4.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE LAMUESTRA.Líquido vesicular

Limpiar bien la zona con alcohol de 70ºCPinchar la vesícula con una aguja y jeringa deinsulina y aspirar el contenidoObtener más muestra frotando la base de la lesióncon un escobillón

Frotis o exudado (mucosas: oral, nasal , rectal ygenital)

Se recoge el material celular de la base de la lesiónfrotando con un escobillón

Escobillón conjuntivalPasar el escobillón por la conjuntiva

Raspado corneal (muestra obtenida por el oftalmólogo)Utilizar un anestésico tópicoObtener la muestra con una espátula estéril finaDepositar las células obtenidas en un tubo conmedio de cultivo celular.

Muestras obtenidas por biopsia o necropsia (cerebro,esófago, estómago, intestino, pulmón)

Obtener estérilmente la muestraColocar en un recipiente con suero fisiológico estérilde manera que quede completamente cubierto

Sangre (para detección de herpesvirus 5)Recogida en un tubo con heparina de litio o conEDTA.

Todas las muestras deben conservarse a 4ºC hasta suprocesamiento.

4.2. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA.Líquidos vesiculares

Poner el líquido obtenido con la jeringa en un tuboestéril que contenga 1 mL de suero fisiológico.


Líquido vesicular IFD, IFIExudados de piel y mucosas IFD, IFIHerpesvirus 1Muestras de tejidos IFD, IFILíquido vesicular IFD, IFIExudados de piel y mucosas IFD, IFIHerpesvirus 2Muestras de tejidos IFD, IFIExudados cutáneos IFD, IFIHerpesvirus 3 Muestras de tejidos IFD, IFI

Herpesvirus 5 Sangre IFIIFD: Inmunofluorescencia directa; IFI: Inmunofluorescencia indirecta.




Exudados de lesiones mucosas (oral, nasal, rectal ygenital), exudados de faringe, conjuntiva y raspadoscorneales y exudados de lesiones cutáneas (vesículas)

Poner dentro de un tubo 1-2 mL de suero fisiológicoestéril.Introducir el escobillón y agitar de manera que elmaterial quede suspendido en el medio

Biopsias y necropsiasHomogeneizar añadiendo suero fisiológico estérilen cantidad suficiente para una suspensión al 10%(10 partes material en 90 partes de suerofisiológico).

5. REACTIVOSInmunofluorescencia1. PBS2. Los reactivos específicos incluidos en los

equipos comercializados.3. Acetona4. Fijador de sacarosa-formol (para la antigenemia)5. Líquido de montaje

6. TÉCNICAS DISPONIBLESLas técnicas disponibles para la detección de cadaherpesvirus se han enumerado en la tabla 1. Todas lastécnicas están debidamente estandarizadas ydisponibles comercialmente.

7. APARATOS Y MATERIALEl equipamiento necesario para la realización de lastécnicas descritas, incluyendo el tratamiento de lasmuestras, es el siguiente:- Centrífuga- Vórtex- Pipetas automáticas- Citocentrífuga- Microscopio de fluorescencia

8. PROCEDIMIENTOLos procedimientos concretos de las técnicasinmunofluorescencia, al realizarse mediantereactivos comercializados, no se detallan, ya que seencuentran debidamente descritos en ladocumentación de cada equipo comercial. Para elestudio de la antigenemia de herpesvirus 5 lamayoría de los protocolos incluidos en los equipos dereactivos detallan el procesamiento a seguir con lasmuestras de sangre.

9. CONTROL DE CALIDAD.Siguiendo las Recomendaciones generales para elcontrol de calidad interno en Microbiología Clínica(CCI-SEIMC) realizado por el grupo colaboradorGEGMIC, para los reactivos comerciales, debesolicitarse al fabricante que disponga de un Sistemade Calidad reconocido y que facilite al laboratorio losdatos relativos al control de cada lote de reactivo. Lamayoría de técnicas comerciales incluyenactualmente controles positivo y/o negativo pararealizar bien a la vez que cada una de lasdeterminaciones o cada vez que se realice un grupo

de ellas, en función del sistema de presentación.Cada centro debe también considerar laconveniencia de participar en programas externos decontrol de calidad.

10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSLa presencia del virus se caracteriza por un color verdebrillante, fluorescente en el núcleo de la célula, enocasiones también en el citoplasma, que contrasta conel color rojo de las células no infectadas al examinarlas preparaciones al microscopio de fluorescencia.En la prueba de la antigenemia una muestra debeconsiderarse positiva cuando se puede observarfluorescencia en los núcleos de los leucocitos. Enocasiones se acompaña de fluorescencia en elcitoplasma pero nunca ésta aislada. Debe tenerse encuenta que durante el procesamiento de lasmuestras pueden perderse leucocitos ya seanpositivos o no, por lo que se recomienda realizar dospreparaciones de la muestra y la obtención de lamedia de células positivas, expresando el resultadofinal como el número de células positivas por elnúmero de células en la preparación, éste debe sercomo mínimo de 50.000. No se dispone de un valoruniversal a partir del que pueda asegurarse laenfermedad por herpesvirus 5, si bien muchosestudios cifran entre 2 y 200 células infectadas por100.000 leucocitos.

11. RESPONSABILIDADESEl personal técnico de la sección será el responsablede revisar las solicitudes estudiando la idoneidad de lamuestra remitida con la determinación solicitada, deltratamiento de las muestras, de la realización de lastécnicas y de la validación de los resultados en funciónde los resultados de los controles. El facultativoresponsable de la sección, además de la supervisiónde las tareas citadas, será responsable de mantener aldía los procedimientos, de la validación final de losresultados, su interpretación y el informe de losmismos.El personal debe conocer las ventajas y limitaciones delas técnicas empleadas, así como su fundamento y elfuncionamiento de los aparatos utilizados. Ademásdebe trabajar en condiciones de máxima seguridadpersonal y ambiental, realizando una adecuadasegregación de los residuos.


La detección de los antígenos víricos en las muestrastomadas de las lesiones mucocutáneas causadas porHHV1, 2 y 3 mediante la utilización de anticuerposmonoclonales específicos, para cada uno de estosvirus, marcados con fluoresceína ha demostrado seruna técnica igual o más sensible que el aislamientovírico. En el caso del HHV-3 ha sido propuesto como elmétodo diagnóstico de elección.La detección de la proteína pp65 de HHV-5 en losleucocitos de sangre periférica es indicativa deinfección diseminada. Esta técnica llamada prueba de




la antigenemia ha demostrado una sensibilidadsuperior al 95% y una especificidad del 98% en eldiagnóstico de la infección activa. Además laantigenemia suele positivizarse previamente a laaparición de la sintomatología de forma que lacuantificación de las células pp65 positivas constituyeun buen marcador de predicción de desarrollo deenfermedad. Esta técnica se utiliza para la elsegimiento de pacientes con riesgo de desarrollar laenfermedad por HHV-5 con el fin de poder instaurar untratamiento específico anticipado y para la evaluaciónde la respuesta al tratamiento.La calidad de la muestra es de la máximaimportancia para la obtención de resultados fiables.Una muestra con un número de células inferior a 25debe informarse como no adecuada para ladetección de antígenos.

La principal limitación de las técnicas deinmunofluorescencia es la necesidad de formaciónrequerida por el personal para poder efectuar lalectura y la interpretación de los resultados.

13. BIBLIOGRAFÍA1. Rabella García N, Labeaga Puchaes R, MargallCoscojuela N, Sánchez López I. Inmunofluorescencia directapara el diagnóstico de las infecciones mucocutáneascausadas por virus herpes simple. Med Clin (Barc)1994;102:637.2. Barraquer P, Rabella N, Labeaga R, Mercader M, Prats G.Diagnóstico de las infecciones causadas por el virus varicelazoster. Enferm Infecc Microbiol Clin 1996;14:277-278.3. Rabella N, Pérez JL, Pumarola T. El laboratorio devirología en la infección por citomegalovirus. Posibilidadesactuales. Enferm Infecc Microbiol Clin 1997;15 (Supl 2):69-76.

PNT-TDA-07TÉCNICAS RÁPIDAS DE DIAGNOSTICO DE LAS MICOSIS INVASORAS




01 Edición inicial


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las micosis invasoras Edición 01 Página 2 de 6

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl propósito de este procedimiento es el de definir lastécnicas rápidas de detección de antígeno que existenpara el diagnóstico etiológico de la aspergilosisinvasora, la candidiasis sistémica, la criptococosis y laneumonía por Pneumocystis jiroveci. Se describe quémuestras son las más adecuadas en función de losmicroorganismos que se deseen detectar y en funciónde la técnica que se plantee utilizar.

2. FUNDAMENTOEn las micosis invasoras se pueden encontrarfragmentos antigénicos del hongo causante de lainfección en los líquidos orgánicos y en la sangre delpaciente. Generalmente son de la pared o de lacápsula y se detectan por una reacción antígeno-anticuerpo. Los métodos basados en anticuerposmonoclonales tienen la ventaja de proporcionarresultados reproducibles. Aunque también presentesen la orina, los métodos disponibles dan resultadoscontradictorios en este tipo de muestra.





4. TIPOS DE MUESTRAEn la tabla 1 se indican las muestras de elecciónpara la detección de cada microorganismo y lastécnicas por los que se pueden detectar.

4.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE LAMUESTRA.En el procedimiento en Microbiología Clínica.Recogida, transporte y procesamiento general demuestras en el laboratorio de microbiología. 1 a.(Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas yMicrobiología Clínica. 2003) se indican las directricesprincipales de la recogida y conservación de lasmuestras (PNT-RTP-01).

4.2. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA.Tratamiento de muestras de suero en la detección deantígenos de Aspergillus y Candida- La muestra de suero se trata por calentamiento al

baño maría con una solución de EDTA paradisociar el antígeno de los inmunocomplejoscirculantes.

- Posteriormente, centrifugar 3 minutos a 10.000g yse utilizar el sobrenadante.

Tratamiento de muestras para la detección deantígeno de Cryptococcus neoformansLíquido cefalorraquídeo- Centrifugar a 1.000g durante 15 minutos. Se puede

aprovechar la misma centrifugación que se realizapara el procesamiento convencional de la muestra.El sedimento se procesa para examenmicroscópico directo y el cultivo y el sobrenadantese separa para la realización de la prueba dedetección de antígeno.

- Se puede guardar en nevera 3 días y, si serequiere más tiempo de conservación, a �20oC oañadiendo timerosal hasta lograr una concentraciónfinal del 0,01%.

- Calentar la muestra a 100oC durante 5 minutosantes de procesarla.Suero- Preparar el suero según procedimiento

convencional.- Se puede guardar en nevera 3 días y, si se

requiere más tiempo de conservación, a �20oC oañadiendo timerosal hasta lograr una concentraciónfinal del 0,01%.

Tabla 1

Microorganismo Muestra Técnica

Aspergillus Suero LA, EIA

Candida Suero LA, EIA

Suero LA, EIACryptococcus

Líquido cefalorraquídeo LA, EIA

Antígenos fúngicosuniversales Suero y líquidos orgánicos Factor G Tachypleus tridentatus

Pneumocystis jiroveci Muestra respiratoria IFI, IFD

EIA: Enzimoinmunoensayo; LA: Aglutinación por partículas de látex.; IFI: Inmunofluorescenciaindirecta; IFD: Inmunofluorescencia directa.


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- Añadir pronasa (50 µL de solución de pronasa a300 µL de muestra) e incubar a 56OC durante 30minutos.

Tratamiento de muestras para la detección delcomponente ß-(1→3)-D glucano.La muestra se trata con los reactivos incluidos en laprueba para inactivar las proteasas que pudieranestar presentes.

Tratamiento de muestras para la detección deantígeno de Pneumocystis jiroveciSe requiere un tratamiento con un agente mucolítico(Sputasol®) para el tratamiento de las muestras másmucosas. A continuación deben seguirse lasrecomendaciones de cada fabricante.

5. REACTIVOSLos reactivos específicos están incluidos en losequipos comercializados.

6. TÉCNICAS DISPONIBLES.Técnicas de detección de antígeno para el diagnósticode la aspergilosisPlatelia® Aspergillus (Bio-rad) es una prueba quedetecta galactomanano aspergilar mediante unareacción inmunoenzimática tipo �sandwich� que serealiza en microplaca. Utiliza anticuerposmonoclonales de ratón EB-A2 dirigidos frente algalactomanano de Aspergillus. El galactomananoaspergilar tienen una estructura formada por unesqueleto lineal de manosas unidas por enlacesglicosídicos α-(1→2) y α-(1→6), cuya estructura seramifica mediante enlaces α-(1→2) con polímeros deβ-(1→5)-galactofuranosas, con un promedio decuatro unidades por cada ramificación. Estas últimoscomponentes son los epítopos reconocidos poranticuerpos específicos. Los anticuerposmonoclonales utilizados están previstos para 1)sensibilizar los pocillos de la microplaca y unirse alantígeno de la muestra y 2) para la detección, con unanticuerpo sensibilizado con peroxidasa. La pruebatiene un umbral de detección establecido en 1 ng degalactomanano por ml de suero. Otras técnicasdisponibles en formato de aglutinación de partículasde látex (Pastorex® Aspergillus yradioinmunoensayo) tienen una sensibilidad inferior ala técnica de EIA.

Técnicas de detección de antígeno para el diagnósticode la candidiasisCand-Tec® (Ramco Laboratories, Houston, Texas). Esuna prueba de aglutinación de partículas de látex. Fuela primera en comercializarse, pero su sensibilidad yespecificidad son variables según los trabajos.Pastorex® Candida (Bio-rad). Prueba de detección demanano de la pared de Candida mediante unanticuerpo monoclonal que reconoce las especies másfrecuentes de Candida: C. albicans, C. tropicalis, C.

parapsilosis, C. glabrata y C. krusei. Consiste en unaaglutinación de partículas de látex.Platelia® Candida (Bio-rad). Usa el mismo anticuerpomonoclonal que la prueba anterior, pero haincrementado su sensibilidad utilizando una técnica dedetección de EIA en doble sandwich.

Técnicas de detección de antígeno para el diagnósticode la criptococosisExisten diversas pruebas de aglutinación de partículasde látex disponibles comercialmente: Crypto-La®,IMMY, Pastorex®, Murex® y Calas® (MeridianDiagnostics) y también existe una prueba de EIA(PREMIER EIA®. Meridian Diagnostics)

Técnicas de detección de antígenos fúngicosuniversalesFungitec® y Glucatell® son marcas comerciales deuna prueba de detección del componente β-(1→3)-D-glucano, propio de la pared de quitina y es, enconsecuencia, útil para la mayoría de hongos. Sebasa en que el factor G de un lisado de amebocitosde la cacerola de las Molucas (Tachypleustridentatus) es sensible a este componente de lapared fúngica, desencadenando una cascadaenzimática.

Técnicas de detección de antígeno para el diagnósticode la neumonía por P. jiroveciExisten diversas técnicas disponibles comercialmentepara la detección de antígenos específicos de P.jiroveci en muestras respiratorias. Hay desarrolladastécnicas de inmunofluorescencia directa e indirecta(Dako Corp., Carpinteria Calf. y Chemicon InternationalInc.).

7. APARATOS Y MATERIALEl equipamiento necesario para la realización de lastécnicas descritas incluyendo el tratamiento de lasmuestras, es el siguiente:- Pipetas automáticas para dispensar 50, 100, 300 y

1.000 µL- Ultracentrífuga 10.000g- Agitador vórtex- Baño María 100oC o estufa- Baño María 37oC o incubador de microplacas- Lavador de placas de EIA.- Aparato de lectura para microplacas con filtros 450-

620 nm.- Agitador orbital (100 rpm)

8. PROCEDIMIENTOLos procedimientos de realización de las técnicas nose detallan, ya que se encuentran debidamentedescritos en la documentación de cada equipocomercial.

9. CONTROL DE CALIDADSiguiendo las Recomendaciones generales para elcontrol de calidad interno en Microbiología Clínica(CCI-SEIMC) realizado por el grupo colaborador


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GEGMIC, para los reactivos comerciales, debesolicitarse al fabricante que disponga de un Sistemade Calidad reconocido y que facilite al laboratorio losdatos relativos al control de cada lote de reactivo. Lamayoría de técnicas comerciales incluyenactualmente controles positivo y/o negativo pararealizar bien a la vez que cada una de lasdeterminaciones bien cada vez que se realice ungrupo de ellas, en función del sistema depresentación. Cada centro debe también considerarla conveniencia de participar en programas externosde control de calidad.

10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSDetección de antígeno galactomanano de AspergillusLos resultados se suministran en forma de índice dedensidad óptica respecto al control �valor umbral�.Para cada suero se calcula la densidad óptica enrelación con la proporcionada por el control valorumbral. Este cálculo permite limitar las variacionesde densidad óptica inter-ensayos e intra-ensayosdebidas a las diferentes condiciones de realizaciónde la prueba. El fabricante marca los siguientescriterios para interpretar los resultados:

Índice de densidad óptica > 1,5 ⇒ pruebapositiva1 < Índice de densidad óptica < 1,5 ⇒ pruebadudosaÍndice de densidad óptica < 1 ⇒ pruebanegativa

Sin embargo, existen trabajos que sugieren quedebería disminuir el criterio para considerar la pruebapositiva hasta 1 ó 0,5. En la versión estadounidensede la misma prueba, comercializada recientemente,el punto de corte que recomienda el fabricante ya esde 0,5. Evidentemente, con estos criterios seaumenta la sensibilidad, a costa de una disminuciónde la especificidad. Por ello sólo deben aplicarse enpoblaciones con una alta prevalencia a priori deaspergilosis invasora, para disminuir el número defalsos positivos. Es conveniente confirmar todoresultado positivo con una nueva muestra. La pruebaes útil para el diagnóstico y para el seguimiento dela enfermedad aspergilar invasora.

Detección de antígeno de CandidaSe consideran positivos los resultados superiores a 0,5ng/mL.

Detección de antígeno de CryptococcusEl resultado se da en forma de título. Si en ladetección de antígeno de criptococo en suero y LCR(aglutinación de partículas de látex) se utiliza un testque no incorpora un tratamiento de la muestra conpronasa, se recomienda realizar la prueba enmuestra pura y en diluciones sucesivas al 1/10,1/100, 1/1.000 y 1/10.000. Sirve para el diagnósticode la criptococosis y, si se repite con la misma marcacomercial, también sirve para el seguimiento. Por ello

se recomienda describir la técnica empleada en elinforme de los resultados.

Detección de antígeno de P. jiroveciSe considera positiva una determinación cuando sevisualizan claramente estructuras compatibles con P.jiroveci fluorescentes al examinar las preparacionesal microscopio de fluorescencia. Normalmente elfluoróforo empleado en la conjugación del anticuerpomonoclonal ofrece una fluorescencia verde brillante.La tinción muestra un patrón difuso de fluorescenciadistribuido alrededor del cluster de losmicroorganismos y a menudo tiñe la matriz en la quelos Pneumocystis están embebidos.



Detección de antígeno galactomanano de AspergillusLa presencia de galactomanano en el suero esintermitente. Por lo tanto, un resultado negativo noexcluye el diagnóstico. Por otra parte, la precocidaddel tratamiento es esencial para mejorar elpronóstico y, en un 65% de los casos, una pruebapositiva antecede a la aparición de cualquier signoclínico (rango de 1 a 27 días). Debido a laexistencia de falsos positivos, para incrementar laefectividad de la prueba debe realizarse de manerarepetida y prospectiva en pacientes con alto riesgode padecer la enfermedad. Solamente unavaloración global, hecha por el equipo asistencialpodrá orientar con mayor visos de corrección elmanejo de cada paciente. Para el diagnóstico de laaspergilosis invasora se recomienda realizar laprueba de manera repetida en los pacientes de altoriesgo. Actualmente, el criterio más utilizado es dedos veces por semana en este tipo de pacientes.

La prueba es muy sensible. Las esporas deAspergillus están presentes en la atmósfera,especialmente asociadas con el polvo, y pueden


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contaminar la muestra o los reactivos, dando lugar aresultados falsamente positivos. Por ello debenextremarse las precauciones de limpieza:- No trabajar en una habitación donde se cultive

Aspergillus.- Limpiar las superficies contaminadas.- Tapar los tubos.- No exponer los pocillos al aire más tiempo del

estrictamente necesario.- Utilizar material limpio de polvo.- Utilizar agua destilada estéril.El galactomanano es termoestable. Por lo tanto, laesterilización del material no garantiza la ausenciadel mismo.Resultados falsos positivos: oscilan entre el 8 y el14%. Las posibles causas son:- Colonización masiva del tubo digestivo porAspergillus.- Infecciones por otros hongos, como Paecilomyces,Penicillium, Alternaria y Candida que presentanreacción cruzada con el anticuerpo usado en laprueba.- Bacteriemia por microorganismos con antígenoscon reacción cruzada.- Ingesta de cereales (como la pasta italiana), lechematernizada y otros alimentos que contengangalactomanano en pacientes con lesiones de lamucosa digestiva (mucositis). Aspergillus seencuentra ampliamente distribuido en la naturaleza ylas materias primas. Los procesos industriales nodestruyen el galactomanano. y éste se puedeencontrar en una gran variedad de alimentos, comoté, arroz, leche, pimienta e, incluso, en algunosantibióticos (piperacilina/tazobactam).- Tratamiento con ciclofosfamida.- Lactantes. En neonatos el porcentaje de falsospositivos puede llegar a ser del 83%. Al parecer lacausa sería la reacción cruzada que se produce porel ácido lipoteicoico de bacterias del géneroBifidobacterium que colonizan normalmente el tubodigestivo, especialmente en la población que sealimenta de leche, y que pasarían al torrentecirculatorio por translocación, en una mucosanaturalmente inmadura.Resultados falsos negativos:- Lesión encapsulada y poca invasión vascular .- Lesión con poca cantidad de hongo- Inmunocomplejos anti-Aspergillus.- El tratamiento del paciente con anfotericina B previoa la recogida de la muestra puede negativizar laprueba.No está claro que un solo resultado positivo seasignificativo. Es conveniente repetirlo en una nuevamuestra para su confirmación. La mayoría detrabajos se han realizado en pacientesinmunodeprimidos, principalmente con neutropeniagrave y persistente o sometidos a transplantes demédula ósea o pulmón. Dada la frecuencia de laenfermedad, es difícil disponer de resultados a granescala y en ciertas situaciones clínicas la experienciapublicada es escasa, particularmente en enfermos

con enfermedades pulmonares crónicas tratados concorticoides y en formas de aspergilosis invasoras nopulmonares.Esta prueba incluye las especies del géneroAspergillus y, aunque existen reacciones cruzadascon otros hongos, no es una prueba válida para eldiagnóstico de procesos infecciosos similarescausados por otras especies, como por ejemplo delgénero Scedosporium (Scedosporium apiospermum– Pseudallescheria boydii y Scedosporiumprolificans).No se conoce la utilidad de la prueba para confirmarel diagnóstico de aspergilosis invasora en pacientesde bajo riesgo con cultivo positivo de muestraspotencialmente contaminadas (como el esputo). Detodos modos, la lógica sugiere que debe tenerse encuenta un resultado positivo en un paciente con uncultivo de esputo positivo por Aspergillus, que tomaaltas dosis de corticoides y cuya mucosa intestinalestá intacta.Monitorización: en pacientes diagnosticados deaspergilosis invasora, una disminución del índice serelaciona con un mejor pronóstico. En cambio, sumantenimiento indica peor pronóstico.

Detección de antígeno de CandidaLos trabajos realizados hasta el momento no hanobtenido tan buenos resultados como en la pruebapara Aspergillus. Es posible que su uso encombinación con la detección de anticuerposcirculantes incremente la sensibilidad y especificidad.

Detección de antígeno de CryptococcusExisten pocos problemas en esta excelente pruebapara el diagnóstico y seguimiento de la criptococosis.Los puntos que deben tenerse en cuenta son lossiguientes:Causas de falsos positivos:- Infección diseminada por Trichosporon beigelii.- Sepsis por Capnocytophaga canimorsus.- Agar. Hay que tener precaución de separar lamuestra de LCR que se usa para sembrar medios decultivo de la usada para la prueba de detección deantígeno. Si se centrífuga previamente y se usa elsobrenadante, esta causa de falso positivodesaparece.- Factor reumatoide. Se elimina si se usa eltratamiento con pronasa.Causas de falsos negativos:- Fenómeno similar al de prozona, que se corrigediluyendo la muestra a 1/10, 1/100, 1/1.000 y1/10.000.- Infección causada por una cepa productora de bajacantidad de polisacárido capsular.El uso de pronasa, además de eliminar muchosfalsos positivos y falsos negativos, facilita valorar eltítulo de la reacción.


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Técnicas de detección de antígenos fúngicosuniversalesLas proteasas presentes en la muestra puedeninterferir con la prueba. Debe utilizarse vidrio libre deendotoxina y de glucano (presente en el polvo, acausa de la presencia de sustancias de procedenciafúngica).Resultados falsos positivos:- endotoxina o glucano presente en los materiales.- hemodiálisis (la celulosa de la membrana es laresponsable).- gasas de esponja utilizadas en procedimientosquirúrgicos.- tratamiento con albúmina o gamma-globulina.Las infecciones por Cryptococcus neoformans y porzigomicetos no se detectan mediante esta prueba.Detección de antígenos de P. jiroveciSe dispone de técnicas de inmunofluorescenciadirecta e indirecta, que emplean anticuerposmonoclonales específicos frente a una familia deglicoproteínas de superficie que incluye tantoepítopos específicos de P. jiroveci como tambiénepítopos comunes de género. Dependiendo delanticuerpo monoclonal empleado la tinción puedepermitirnos ver la forma quística únicamente o todaslas formas del microorganismo. Como las formastrofozoitas son más numerosas que las quísticas, lastécnicas que emplean anticuerpos monoclonalesfrente a todas las formas del organismo son mássensibles. Hay que destacar que técnicas deinmunofluorescencia directa pueden no reaccionarsobre muestras fijadas a los portaobjetos con etanol.Es recomendable fijar con acetona o siguiendo lasrecomendaciones del fabricante

13. BIBLIOGRAFÍA1. Odabasi Z, Mattiuzzi G, Estey E et al. β-D-Glucan as a

Diagnostic Adjunct for Invasive Fungal Infections:Validation, Cutoff Development, and Performance inPatients with Acute Myelogenous Leukemia andMyelodysplastic Syndrome. Clin Infect Dis 2004; 39:199-205.

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