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$: presidente Prof. Doutora Maria Inês Purcell de Portugal Branco · UNIFAC modelo UNIFAC w água x escala fracção molar Expoentes o estado padrão ‘ livre de soluto • estado$

iii

o júri

presidente Prof. Doutora Maria Inês Purcell de Portugal Branco Professora auxiliar do Departamento de Química da Universidade de Aveiro

Prof. Doutora Maria Alice Zarur Coelho Professora associada nível 1 da Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro

Prof. Doutor Francisco Avelino da Silva Freitas Professor auxiliar do Departamento de Química da Universidade de Aveiro

Prof. Doutor Carlos Manuel Santos Silva Professor auxiliar do Departamento de Química da Universidade de Aveiro

iv

agradecimentos

Gostaria de agradecer em primeiro lugar aos meus orientadores, Doutor Carlos Manuel Silva e Doutor Avelino Silva, pelo seu incentivo na realização deste trabalho, pela sua orientação e disponibilidade e pela oportunidade que tive de evoluir, quer cientificamente quer como pessoa, ao longo deste último ano. Um agradecimento ainda aos meus pais e ao meu irmão pelo apoio, não só durante este último ano, mas em todo o meu percurso académico. Queria agradecer à Helena, pelo incentivo e companheirismo ao longo dos últimos 3 anos, em que me transmitiu sempre confiança de que eu iria conseguir atingir os meus objectivos. Por fim, um agradecimento ainda a todos os meus amigos, quer da residência quer do curso, em especial à Andreia, pela sua amizade e pela ajuda que sempre me deu. A todos, muito obrigado…

v

palavras-chave

Aminoácidos, Peptídeos, Equilíbrio, Coeficiente de Actividade, UNIFAC, Debye-Hückel, Modelo

resumo

O objectivo deste trabalho foi desenvolver um modelo para coeficientes de actividade de aminoácidos/peptídeos em solução aquosa que exiba uma boa capacidade de correlação e de previsão. O modelo proposto compreende quatro aspectos fundamentais: (i) calcula o equilíbrio químico do aminoácido (AA) em solução aquosa, que dá origem às espécies AA± (zeuterião), AA+, AA–, H+ e OH–; (ii) calcula os desvios à idealidade das interacções de curto alcance entre as espécies em solução, utilizando o método de contribuições de grupo de UNIFAC; (iii) as interacções de longo alcance, de natureza electrostática, são também quantificadas com a inclusão de um termo de Debye-Hückel (DH); (iv) o zeuterião é considerado uma molécula contendo dois grupos distintos carregados electricamente. Por este motivo também contribui para os desvios à idealidade calculados por DH. Com o objectivo de optimizar os parâmetros de interacção energética de UNIFAC foi compilada uma base de dados com 14 aminoácidos/peptídeos e desenvolvido um programa em Matlab. Foram também efectuadas previsões. A qualidade dos resultados foi medida pelo rmsd (root mean square deviation). De forma a interpretar correctamente os dados experimentais de aminoácidos de cadeia aberta contendo substituintes alquilo no carbono-α foi definido um grupo CH3 modificado (mCH3). Globalmente foram optimizados 17 parâmetros de interacção energética. O modelo apresentado correlacionou com precisão os dados experimentais de oito aminoácidos/peptídeos, fornecendo rmsdcorrel = 0,90%. A previsão de seis sistemas foi efectuada com um rmsdprev = 5,65%. Estes resultados são muito bons quando comparados com outros trabalhos baseados no método de UNIFAC, como o de Gupta e Heidemann (1990) (rmsdcorrel = 3,74% e rmsdprev = 14,94%) e o de Pinho et al. (1994) (rmsdcorrel = 0,80% e rmsdprev = 20,17%).

vi

keywords

Amino Acids, Peptide, Equilibrium, Activity Coefficient, UNIFAC, Debye-Hückel. Model

abstract

The purpose of this work was the development of a model for the activity coefficients of amino acids/peptides in aqueous solution with good correlation and prediction capabilities. The proposed model comprises four aspects: (i) the chemical equilibrium calculation of the amino acid (AA) in aqueous solution, which originates species AA± (zwitterion), AA+, AA-, H+ and OH-, (ii) the deviations from the ideal solution behaviour due to the short-range interactions between species in solution are taken into account by the UNIFAC group contribution method, (iii) the long-range interactions, owing to electrostatic forces, are accounted for a Debye-Hückel (DH) term, (iv) the zwitterion is assumed to be a molecule with two distinct groups electrically charged, which contribute to additional deviations from ideal behaviour. In order to optimize the interaction parameters of the UNIFAC model, a database containing 14 amino acids/peptides was compiled and a Matlab program was developed. Predictions were also accomplished for the activity coefficients. The accuracy of the results for both correlation and prediction was measured via rmsd (root mean square deviation). A mCH3 (modified CH3) group was introduced to interpret the experimental data of amino acids containing alkyl groups on its alpha-carbon. Altogether 17 interaction parameters were fitted. The proposed model correlated accurately the experimental data of 8 amino acids/peptides, providing rmsdcorrel = 0.90%. The predictions achieved for the remaining 6 systems gave rise to rmsdpred = 5.65%. These results are very good in comparison with other UNIFAC based models, such as those by Gupta and Heidemann (1990) (rmsdcorrel = 3.74% and rmsdpred = 14.94%) and Pinho et al. (1994) (rmsdcorrel = 0.80% and rmsdpred = 20.17%).

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1.1: Produção de alguns aminoácidos, em toneladas por ano............................... 7

Tabela 1.2: Lista de aminoácidos usados no estudo e algumas propriedades físicas. ....... 9

Tabela 3.1: Grupos constituintes da espécie zeuteriónica de aminoácidos e peptídeos. .. 30

Tabela 3.2: Parâmetros para o cálculo de pK1 e pK2, para cada aminoácido .................. 38

Tabela 3.3: Valores de pK1 e pK2 para alguns aminoácidos/peptídeos a 25ºC................ 38

Tabela 3.4: Dados experimentais de coeficientes de actividade ..................................... 39

Tabela 4.1: Principais parâmetros de interacção entre grupos m e n utilizados.............. 40

Tabela 4.2: Número de pontos experimentais, parâmetros de interacção usados na

correlação e rmsd obtido para cada aminoácido/peptídeo. ........................... 41

Tabela 4.3: Comparação dos resultados obtidos neste trabalho com outros modelos

publicados. ................................................................................................ 44

Tabela A.1: Conversão entre escalas de concentração................................................... 48

Tabela A.2: Conversão entre coeficientes de actividade na convenção não simétrica ...... 48

Tabela A.3: Parâmetros Rk e Qk do modelo UNIFAC....................................................... 49

Tabela A.4: Parâmetros de interacção do modelo UNIFAC utilizados neste trabalho....... 50

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.1: Estrutura básica de um α-aminoácido. ........................................................ 2

Figura 1.2: Curva de titulação da alanina por adição de uma base. ................................ 5

Figura 1.3: Reacção de desidratação de dois aminoácidos formando um dipeptídeo. ....... 6

Figura 1.4: Mercado de aminoácidos – relação entre preço e consumo............................ 7

Figura 1.5: Esquema do processo de produção de um aminoácido, por fermentação....... 8

Figura 2.1: Representação esquemática da distância a, entre as espécies i e j............... 22

Figura 3.1: Interacções electrostáticas entre as espécies com carga. ............................. 29

Figura 3.2: Coeficientes de actividade experimentais em função da molalidade para 5

aminoácidos de cadeia lateral alifática. ....................................................... 31

Figura 3.3: Representação esquemática da estrutura do programa de cálculo............... 33

Figura 3.4: Exemplo de ficheiro de dados da glicina. .................................................... 34

Figura 3.5: Algoritmo de cálculo usado na optimização. ............................................... 35

Figura 4.1: Coeficientes de actividade (convenção não simétrica e escala molal) de

aminoácidos em água: dados experimentais e correlação obtida com o modelo

deste trabalho. ........................................................................................... 41


aminoácidos/peptídeos em água: dados experimentais e correlação obtida com

o modelo deste trabalho. ............................................................................ 42


aminoácidos/peptídeos em água, experimentais e previstos pelo modelo. .... 43


aminoácidos/peptídeos em água, experimentais e previstos pelo modelo. .... 43

NOMENCLATURA

Símbolos

a actividade; distância entre iões

amn parâmetro interacção UNIFAC

A parâmetro Debye-Hückel

AA aminoácido

B parâmetro Debye-Hückel

c molaridade

f fugacidade

G energia livre de Gibbs

H constante de Henry

I força iónica

i soluto ou espécie

j espécie

Ka constante de acidez

K1 constante de equilíbrio químico

K2 constante de equilíbrio químico

Kb constante de basicidade

KD constante de equilíbrio químico

KW produto iónico da água

M massa molar

m molalidade

n número de moles

Nsolu número de solutos

Nsolv número de solventes

P pressão

Ps pressão de vapor

q parâmetro de superfície de molécula

Q parâmetro de superfície de grupo

R constante universal dos gases

r parâmetro de volume de van der Waals de molécula

R parâmetro de volume de van der Waals de grupo

S solubilidade

s solvente

T temperatura absoluta

V volume

x fracção molar

y fracção molar na fase gasosa

z carga do ião

Símbolos gregos

Índices 1 AA±

2 AA+

3 AA−

4 H+

5 OH−

i espécie

0 condição inicial

c escala molaridade

DATA dados experimentais

DH modelo de Debye-Hückel

j reacção; espécie

k número grupos funcionais (UNIFAC)

l soluto

m escala molalidade; grupo funcional (UNIFAC)

n grupo funcional (UNIFAC)

s solvente

UNIFAC modelo UNIFAC

w água

x escala fracção molar

Expoentes o estado padrão

‘ livre de soluto

• estado padrão para o solvente

* convenção não simétrica

id ideal

∇ convenção não simétrica para fugacidade

ν coeficiente estequiométrico

γ coeficiente de actividade

ε escala de concentração

ξ avanço de reacção

φ avanço de reacção intensivo

Φ fracção de volume de molécula

Θ fracção de área de molécula

θ fracção de área de grupo

Γ coeficiente de actividade de grupo

τ parâmetro UNIFAC

δ critério de paragem da função objectivo

ρ massa volúmica da solução

ρo massa volúmica do solvente

µ potencial químico

◊ convenção simétrica para fugacidade

∞ diluição infinita

+ catião

- anião

± zeuterião

E propriedade em excesso

DH modelo de Debye-Hückel

UNIFAC modelo UNIFAC

C termo combinatorial (modelo UNIFAC)

R termo residual (modelo UNIFAC)

calc valor calculado

exp valor experimental

k iteração

ÍNDICE

1. QUÍMICA DOS AMINOÁCIDOS ................................................. 1

1.1. Caracterização e classificação de aminoácidos....................... 2

1.2. Propriedades ácido-base dos aminoácidos ............................. 4

1.3. Reacções dos aminoácidos .................................................... 5

1.4. Produção e mercado de aminoácidos..................................... 6

1.5. Estrutura dos aminoácidos/peptídeos estudados .................. 9

2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS .................................................. 11

2.1. Termodinâmica de soluções de electrólitos .......................... 11

2.1.1. Escalas de concentração ............................................... 11

2.1.2. Soluções de electrólitos.................................................. 13

2.2. Equilíbrio químico de aminoácidos em solução aquosa........ 16

2.3. Modelos de coeficientes de actividade.................................. 18

2.3.1. Modelo UNIFAC ............................................................. 18

2.3.2. Modelo de Debye-Hückel ............................................... 21

2.3.3. Revisão de modelos de coeficientes de actividade para

aminoácidos ................................................................................. 23

3. MODELO PROPOSTO PARA COEFICIENTES DE ACTIVIDADE DE

AMINOÁCIDOS ................................................................... 25

3.1. Cálculo do equilíbrio químico .............................................. 25

3.2. Descrição do modelo ........................................................... 28

3.3. Programa de cálculo............................................................ 32

3.4. Estratégia de cálculo........................................................... 36

3.5. Base de dados utilizada neste trabalho ............................... 36

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................ 40

5. CONCLUSÕES ...................................................................... 45

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................... 46

7. APÊNDICES ......................................................................... 48

Capítulo 1 – QUÍMICA DOS AMINOÁCIDOS

– 1 –

1. QUÍMICA DOS AMINOÁCIDOS

As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células,

constituindo mais de 50% do seu peso seco [1]. Já presentes nas mais antigas

formas de vida na Terra, as proteínas são constituídas a partir do mesmo

conjunto básico de blocos, os aminoácidos, unidos entre si por ligações

covalentes. Entre as diversas funções desempenhadas pelas proteínas, há a

destacar [2]:

– Funções estruturais em tecidos vivos, como por exemplo o colagénio;

– Funções específicas sobre órgãos ou determinadas estruturas de um

organismo (como é o caso da insulina);

– Funções de defesa no que diz respeito ao reconhecimento e neutralização

de vírus, bactérias e outras substâncias estranhas, como é o caso dos

anticorpos;

– Funções energéticas, a partir dos aminoácidos que as compõem;

– Funções enzimáticas, com por exemplo as lipases;

– Funções de transporte de gases, como por exemplo a hemoglobina.

Dada a importância destas macromoléculas nos sistemas biológicos, torna-se

fundamental aprofundar o conhecimento das propriedades dos seus blocos

básicos. Para além de formarem as proteínas, os aminoácidos na sua forma livre

estão presentes em alimentos e bebidas, em medicamentos e outros produtos de

elevada importância económica. Quanto maior o conhecimento das propriedades

destas pequenas moléculas, melhor será possível optimizar os seus processos de

produção, em busca de produtos de melhor qualidade e, consequentemente, de

maior valor comercial. Os aminoácidos são geralmente obtidos por síntese ou

fermentação, processos estes que originam muitas vezes misturas complexas de

biomoléculas e que requerem o recurso a processos de separação, de modo a

extrair o produto desejado de subprodutos, excesso de reagentes ou impurezas,

geralmente por processos de cristalização ou precipitação. Uma vez que os

processos de separação podem representar cerca de 50% [2] do custo total de

produção, é essencial conhecer o comportamento dos aminoácidos em solução,

nomeadamente os seus coeficientes de actividade e a sua solubilidade.


– 2 –

Esta dissertação surge também da necessidade de encontrar um modelo

preditivo que descreva o equilíbrio químico e físico de uma gama de

aminoácidos/peptídeos, uma vez que apesar de já existirem alguns modelos que

efectuam essa descrição, se continuar a verificar uma fraca capacidade preditiva.

1.1. Caracterização e classificação de aminoácidos

Como já foi referido, os aminoácidos são uma classe de compostos orgânicos

que podem ser encontrados em todos os organismos vivos, sendo os elementos

básicos na formação das proteínas.

Desde o seu isolamento, efectuado pela primeira vez na segunda metade do

século XIX, as suas propriedades físicas e químicas têm vindo a ser estudadas,

não só pela sua importância em inúmeros processos fisiológicos e seu valor como

elementos base de todas as formas de vida, mas também pela sua importância

na indústria alimentar e farmacêutica, onde se pretende obter um produto com o

máximo grau de pureza e com o mínimo custo possível.

Quimicamente têm em comum a presença de um grupo carboxilo e um grupo

amina ligados a um átomo de carbono central, denominado carbono-α, e diferem

entre si pela cadeia lateral representada por R na Figura 1.1, variável em

estrutura, tamanho, carga eléctrica e solubilidade em água [3].

Dos cerca de setecentos aminoácidos descobertos nos sistemas biológicos,

vinte fazem parte de um grupo especial por serem utilizados pela natureza como

blocos básicos na síntese de peptídeos e proteínas, sendo conhecidos como

aminoácidos naturais [4].

Os aminoácidos mais comuns são os α−aminoácidos, onde o grupo amina

está ligado ao carbono−α (ver Figura 1.1) [5].

Figura 1.1: Estrutura básica de um α-aminoácido.


– 3 –

O mais simples destes é a glicina, de fórmula molecular C2H5NO2, e é o único

aminoácido que não é opticamente activo (não apresenta estereoisómeros), uma

vez que não contém nenhum centro quiral. À excepção da glicina, todos os outros

aminoácidos possuem um átomo de carbono assimétrico, o carbono−α, ao qual

se encontram ligados quatro grupos constituintes diferentes como representado

na Figura 1.1 [1]. Apresentam portanto actividade óptica, devido ao centro quiral

no carbono−α, existindo os estereoisómeros D e L, predominando no entanto o

isómero L [6].

Os aminoácidos podem classificar-se segundo o seu grupo R, distinguindo-se

quatro classes [4]:

1. Grupo R não polar (hidrofóbico).

Os aminoácidos desta classe possuem grupos hidrocarbonados, apresentando

menor solubilidade em água que os aminoácidos com grupo R polar. A esta

classe pertencem, por exemplo, a leucina, a valina e a alanina, este último, o

menos hidrofóbico desta classe [4].

2. Grupo R polar sem carga (hidrofílico).

Estes aminoácidos são relativamente mais solúveis em água do que os

anteriores. Os seus grupos R são constituídos por grupos funcionais neutros

polares, que podem formar pontes de hidrogénio com as moléculas de água.

Como exemplo desta classe tem-se a serina, a treonina e a glicina [4].

3. Grupo R carregado negativamente (acídico).

Os dois aminoácidos cujos grupos R possuem uma carga negativa a pH=7,0

são o ácido aspártico e o ácido glutâmico, cada um deles com um segundo grupo

carboxilo [1].

4. Grupo R carregado positivamente (básico).

São aminoácidos básicos em que os grupos R apresentam uma carga positiva

em pH=7,0. Como exemplo tem-se a lisina e a arginina [1].


– 4 –

1.2. Propriedades ácido-base dos aminoácidos

O conhecimento do comportamento ácido-base dos aminoácidos é

fundamental para se entender algumas das suas propriedades físico-químicas.

Embora sejam representados como contendo um grupo amina e um grupo ácido

carboxílico, os aminoácidos apresentam algumas propriedades que não condizem

com esta estrutura [7].

– Ao contrário das aminas e dos ácidos carboxílicos, os aminoácidos são

sólidos cristalinos, não voláteis, que fundem, com decomposição, a

temperaturas bastante elevadas (tipicamente superiores a 200ºC).

– São solúveis em solventes apolares e são apreciavelmente solúveis em

água.

– As respectivas soluções aquosas comportam-se como soluções de

substâncias de elevado momento dipolar.

– As constantes de acidez e basicidade são anormalmente pequenas, para

grupos como COOH e NH2.

Estas características são as esperadas para sais onde a rede cristalina é

estabilizada por forças electrostáticas de atracção entre grupos com cargas

opostas, como o cloreto de sódio. Se os aminoácidos cristalizassem numa forma

não iónica seriam estabilizados por forças de van der Waals, bastante mais

fracas que as forças electrostáticas, e apresentariam pontos de fusão abaixo do

que apresentam [4].

Todas as propriedades acima referidas estão perfeitamente concordantes com

uma estrutura iónica dipolar dos aminoácidos, uma estrutura do tipo:

NH 3+ — CHR — −COO

Propriedades físicas como a solubilidade, ponto de fusão e momento dipolar

elevado correspondem ao que é expectável de um sal com estrutura semelhante à

acima representada [7].


– 5 –

Ponto isoeléctrico

Quando um aminoácido é dissolvido em água, forma-se um ião dipolar, o

zeuterião, e este pode agir como dador e receptor de protões. É portanto uma

substância anfotérica, uma vez que pode participar em reacções quer como ácido

quer como base, dependendo da espécie com a qual reage.

A Figura 1.2 mostra a curva de titulação da alanina, onde se observam duas

fases distintas na zona dos pontos a e b. Nesta zona, apesar de incrementos

progressivos de OH-, há uma menor alteração do pH. No ponto a, a concentração

da espécie catiónica, dadora de protões e representada por 1, é igual à

concentração da espécie zeuteriónica, receptora de protões e representada por 2.

No ponto b, a espécie 2 é agora dadora de protões e de concentração igual a 3,

receptora de protões. Em pH=6,01 existe um ponto de inflexão, chamado ponto

isoeléctrico, cujo valor é calculado pela média aritmética de pKa e pKb, isto é,

( )ba pKpKpI += 21 [4].

Na secção 3.3.1 apresentam-se todos os parâmetros necessários para calcular

os valores de pKa e pKb dos aminoácidos em estudo.

Figura 1.2: Curva de titulação da alanina por adição de uma base. Adaptado de [8].

1.3. Reacções dos aminoácidos

As reacções dos aminoácidos, como em todos os compostos orgânicos, são as

reacções características dos seus grupos funcionais, os grupos amina e ácido


– 6 –

carboxílico. Não sendo objectivo deste trabalho analisar as reacções dos

aminoácidos, importa referir a formação dos peptídeos. Através de uma reacção

de desidratação, dois aminoácidos podem ligar-se covalentemente por uma

ligação peptídica formando um dipeptídeo – Figura 1.3. Uma sucessão destas

reacções pode levar à formação de uma proteína, sendo os grupos R responsáveis

pela grande variedade de proteínas que podem ser formadas.

Dos 20 aminoácidos naturais, o organismo humano apenas tem capacidade

de produzir 11 destes, pelo que os restantes 9 devem fazer parte da alimentação,

sendo conhecidos como aminoácidos essenciais. Os 20 aminoácidos naturais

são: valina, leucina, isoleucina, lisina, treonina, metionina, histidina,

fenilalanina, triptofano, alanina, arginina, glutamina, ácido aspártico, ácido

glutâmico, prolina, cisteína, tirosina, asparagina, glicina e serina, sendo que os

primeiros 9 aqui enunciados são os aminoácidos essenciais.

Figura 1.3: Reacção de desidratação de dois aminoácidos formando um dipeptídeo.

1.4. Produção e mercado de aminoácidos

A produção de aminoácidos teve a sua origem no Japão, após trabalhos de

investigação onde se descobriu que o glutamato monossódico, obtido a partir do

ácido glutâmico, que acentuava e melhorava o sabor de alguns alimentos [9].

Iniciou-se então o utilização do glutamato monossódico na alimentação, sendo

ainda hoje adicionado a uma grande variedade de alimentos.

Devido à sua vasta gama de aplicações, como a alimentação, a cosmética, a

indústria farmacêutica, entre outras, a procura de aminoácidos cresceu

rapidamente e foi acompanhada pelo desenvolvimento de tecnologias de

produção. Nas últimas três décadas, o aumento da procura originou um

crescimento de mercado de cerca de 5 a 10% ao ano [10]. Na Tabela 1.1 e Figura

1.4 podem ver-se, respectivamente, a quantidade de alguns aminoácidos

produzidos, em toneladas por ano, e a relação entre o preço e o consumo:


– 7 –

Tabela 1.1: Produção de alguns aminoácidos, em toneladas por ano. Adaptado de [10].

Aminoácido Produção

(ton/ano)

Método de

produção Aplicação

Ácido Glutâmico 1200000 Fermentação Aditivo alimentar

Lisina 600000 Fermentação Aditivo alimentar

Metionina 550000 Síntese Aditivo alimentar

Treonina 40000 Fermentação Aditivo alimentar

Glicina 16000 Síntese Aditivo alimentar, edulcorante

Aspartato 14000 Catálise enzimática Aspartamo, polímeros

Fenilalanina 13000 Fermentação Aspartamo

Císteina 4500 Fermentação Aditivo alimentar, indústria

farmacêutica

Cistina 3500 Extracção,

fermentação Indústria farmacêutica

Alanina 1500 Extracção,

fermentação Edulcorante

Leucina 1200 Extracção,


Valina 1000 Extracção,

Fermentação

Indústria farmacêutica,

Pesticidas

Isoleucina 500 Extracção,


Figura 1.4: Mercado de aminoácidos (publicado em 2006) – relação entre preço e

consumo. Adaptado de [10].

Preço (US$ / kg)

Consumo (ton/ano)


– 8 –

Na Figura 1.4 observa-se que a quantidade produzida é inversamente

proporcional ao preço de mercado, sendo o glutamato monossódico o aminoácido

mais produzido e o mais barato.

Como se observa na Tabela 1.1, os principais métodos de obtenção de

aminoácidos à escala industrial são a fermentação, a extracção após hidrólise de

proteínas e síntese química [11].

A fermentação é um método que utiliza microrganismos que, através do seu

metabolismo, convertem nutrientes que lhes são fornecidos em produtos, neste

caso um ou vários aminoácidos. Na fermentação, açúcares (fonte de carbono) são

adicionados ao meio de cultura onde os microrganismos se encontram, e o seu

metabolismo, por acção de enzimas, pode produzir vários aminoácidos através de

sucessivas reacções. Na Figura 1.5 pode observar-se uma representação

esquemática da produção do glutamato monossódico.

Não sendo um objectivo deste trabalho, mais detalhes acerca do processo de

fermentação para produção de aminoácidos podem ser encontrados nas

referências [9] e [10].

Figura 1.5: Esquema do processo de produção de um aminoácido, por fermentação [12].


– 9 –

1.5. Estrutura dos aminoácidos/peptídeos estudados

Na Tabela 1.2 são apresentadas as estruturas de todos os 14

aminoácidos/peptídeos estudados neste trabalho, bem como a sua temperatura

de fusão, massa molar e solubilidade em água a 25ºC.

Tabela 1.2: Lista de aminoácidos usados no estudo e algumas propriedades físicas. Adaptado de [13].

Aminoácido Estrutura Tfusão

(ºC)

M

(kg/mol)

Solubilidade em água a 25ºC (g/kgágua)

Glicina

290 75,07 250,9

Alanina

297 89,10 165,0

Ác. Amino

Butírico

304 103,12 210,0

Valina

315 117,15 88,5

Ác. Amino

Valérico

n.d. 117,15 n.d.

Hidroxiprolina

274 131,13 361,0

Prolina

221 115,14 1623,0

Serina

228 105,10 421,7


– 10 –

Treonina

256 119,12 98,1

Glicilglicina

263 132,12 n.d.

Glicilalanina

n.d. 146,15 n.d.

Alanilglicina

n.d. 146,15 n.d.

Alanilalanina

n.d. 160,17 n.d.

Triglicina

n.d. 189,17 n.d.

n.d.: dados não disponíveis.

Tabela 1.2: (conclusão).

Capítulo 2 – FUNDAMENTOS TEÓRICOS

– 11 –

2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS Apresentam-se neste capítulo os conceitos fundamentais necessários à

modelação dos coeficientes de actividade de aminoácidos e peptídeos em solução

aquosa de acordo com a abordagem adoptada nesta dissertação. Assim, começa-

se pelas ferramentas termodinâmicas utilizadas para descrever soluções de

electrólitos e o equilíbrio químico e aminoácidos em solução aquosa, faz-se uma

breve apresentação dos modelos de UNIFAC e Debye-Hückel, concluindo-se com

uma revisão dos principais modelos existentes na literatura para calcular os

coeficientes de actividade destas moléculas.

2.1. Termodinâmica de soluções de electrólitos

A termodinâmica de soluções de electrólitos difere da termodinâmica de

soluções de não electrólitos, devido à presença de cargas eléctricas nas espécies

em solução e que dão origem a interacções electrostáticas que não são de todo

desprezáveis. O comportamento da fase líquida é mais difícil de descrever, onde

as interacções electrostáticas de longo alcance são responsáveis por fortes

desvios à idealidade mesmo em soluções diluídas. Também outros aspectos são

diferentes e devem ser tidos em conta, como as escalas de concentração usadas e

a definição de estados padrão [14].

2.1.1. Escalas de concentração

As escalas de concentração geralmente usadas para exprimir a composição de

uma solução de electrólitos são: molalidade, molaridade e fracção molar.

Escala de molalidade

A molalidade, mi, é definida como o número de moles (ni) de soluto i por kg de

solvente s:

∑=

=solvN

sss

ii

Mn

nm

1

(1)


– 12 –

em que ns é o número de moles do solvente s, Ms a sua massa molecular em

kg/mol e Nsolv é o número total de solventes em solução.

Escala de molaridade

A molaridade, ci, é definida como o número de moles de soluto i por dm3 de

solução:

V

nc i

i = (2)

em que V é o volume do sistema.

Escala de fracção molar

É a escala mais usada para sistemas de não electrólitos; a fracção molar da

espécie i, xi, é definida como:

∑=

=espéciesN

ii

ii

n

nx

1

(3)

em que ni é o número de moles da espécie i e Nespécies é o número de espécies,

solutos e solventes em solução. A relação entre fracção molar e a molalidade é

dada por:

∑∑==

+=

solvsolu

1

'

1

1N

sss

N

ll

ii

Mxm

mx (4)

Considerando o caso particular de um sal, a molalidade e a fracção molar são

dadas por, respectivamente:

∑

=

sss

sal

Mn

nmsal (5)

∑ +

=

ssals

salsal nn

nx (6)


– 13 –

em que nsal e ns são o número de moles do sal e do solvente respectivamente e Ms

a massa molar do solvente, em kg/mol. As equações (5) e (6) estão relacionadas

por:

∑−

=

sss Mxx

xm

'

1

1 sal

salsal (7)

Na equação (7), s'x representa a fracção de solvente em base livre de soluto.

Mais conversões entre cada uma das escalas de concentração podem ser

obtidas, sendo apresentadas em apêndice na Tabela A.1.

2.1.2. Soluções de electrólitos

É importante analisar a termodinâmica de soluções contendo um soluto

involátil num solvente, antes de introduzir o efeito de ionização dos aminoácidos

em solução. Esta discussão torna-se importante na medida em que os

aminoácidos se comportam como sólidos não voláteis à temperatura ambiente.

Quando se fala em soluções ideais de não-electrólitos, estas seguem a Lei de

Raoult, dada pela equação (8):

σiii PxPy = (8)

em que xi e yi são as fracções molares do componente i nas fases líquida e

gasosa, respectivamente, P é a pressão total e Piσ a pressão de vapor do

componente i. Quando se lida com soluções reais, o comportamento do solvente

segue a Lei de Raoult quando a concentração dos solutos tende para zero. Uma

solução diluída tem comportamento ideal quando o solvente segue a Lei de

Raoult e o soluto segue a Lei de Henry, equação (9) [15]:

iii HxPy = (9)

No entanto, em soluções de electrólitos, os iões interagem fortemente entre si

e com o solvente, ainda mais no caso de solventes polares como a água,

originando fortes desvios à idealidade, mesmo a baixas concentrações.


– 14 –

Soluções reais de electrólitos podem ser descritas termodinamicamente em

termos das suas propriedades em excesso, calculadas a partir dos potenciais

químicos de cada espécie, µi.

Da termodinâmica de não electrólitos, para um componente i a uma dada

temperatura, pressão e composição, o potencial químico µi relaciona-se com a

actividade ai por:

ioii aRT ln+= µµ (10)

onde oiµ é o potencial químico de i num estado padrão convenientemente

definido, que, para misturas de não electrólitos voláteis, corresponde a líquido

puro à temperatura e pressão do sistema [16].

Actividade para solvente

Para uma mistura contendo um soluto involátil num solvente, aplica-se

directamente a equação (10) para o solvente s, ou seja:

soss aRT ln+= µµ (11)

onde a actividade do solvente, as, se calcula por:

sxss xa ,γ= (12)

em que xs,γ é o coeficiente de actividade para o solvente, escrito na convenção

simétrica e em fracção molar. Numa solução real, os coeficientes de actividade

são normalizados de acordo com a convenção simétrica em que γs,x → 1 quando

xs → 1.

Actividade para soluto

No entanto, para um soluto involátil não é conveniente escolher para estado

padrão o líquido puro à temperatura e pressão do sistema, na medida em que

nessas condições o soluto não é líquido [14].

Escrevemos então o potencial químico como:

( )iiii RT εγµµ ε,ln+= + (13)


– 15 –

em que +iµ é o potencial químico padrão da espécie i (a uma dada composição

fixa, mas dependente da temperatura, pressão e natureza do soluto e solvente), εi

é a escala de concentração adoptada (mi, ci ou xi) e εγ ,i é o coeficiente de

actividade do soluto nesta escala de concentração e em convenção simétrica. No

caso de involáteis selecciona-se comummente a convenção não simétrica,

segundo a qual os coeficientes de actividade, *iγ , são unitários a diluição infinita.

Assim, a actividade de um componente i pode calcular-se de várias formas:

ixixi xa *,, γ= (14)

imimi ma *,, γ= (15)

icici ca *,. γ= (16)

Onde, por definição, os coeficientes de actividade assimétricos escritos em

fracção molar ( ∗xi ,γ ), molalidade ( ∗

mi ,γ ) e molaridade ( ∗ci ,γ ) satisfazem as condições

*,xiγ → 1 , *

,miγ → 1 e *,ciγ → 1, quando ∑

=

solu

1

N

iiε → 0.

Os valores tabelados de coeficientes de actividade surgem normalmente em

convenção não simétrica e escala molal, enquanto os calculados por modelos

termodinâmicos surgem maioritariamente em convenção simétrica e escala de

fracção molar. Tal como para as escalas de concentração, também é possível

relacionar essas duas convenções. Partindo então da definição de coeficiente de

actividade e usando fracções molares tem-se que:

◊

∧

∧◊

∧

=≡ii

i

idi

ixi fx

f

f

f

,,γ (17)

∇

∧

∧∇

∧

=≡ii

i

idi

ixi fx

f

f

f

,

*,γ (18)

em que ∧

if é a fugacidade do componente i na solução à temperatura T e pressão

P e ◊if e ∇

if são as fugacidades do componente i no estado padrão nas


– 16 –

convenções simétrica e não simétrica, respectivamente. Igualando a fugacidade

calculada pelas duas equações anteriores, vem:

∇◊ = iixiiixi fxfx *,, γγ (19)

No limite, quando xi → 0 verifica-se que *,xiγ → 1 e iγ → ∞

iγ . Logo:

∇◊∞ = iii ffγ (20)

em que ∞iγ é o coeficiente de actividade do componente i a diluição infinita.

Combinando as equações (19) e (20), obtém-se a relação que se procurava:

∞=i

xixi γ

γγ ,*

, (21)

Podem consultar-se em apêndice (ver Tabela A.2) outras relações entre os

coeficientes de actividade de diferentes escalas e convenções.

2.2. Equilíbrio químico de aminoácidos em solução aquosa

Como se referiu no Capítulo 1, os aminoácidos e peptídeos apresentam na

sua estrutura os grupos carboxilo e amina, grupos estes que em água se ionizam

e dão origem a uma espécie dipolar com carga global zero, AA±, chamada de

zeuterião, e a espécies catiónicas e aniónicas, AA– e AA+ respectivamente.

Dependendo do pH a que se encontra a solução, as espécies AA– e AA+ podem

existir em maior ou menor quantidade, sendo que no ponto isoeléctrico

predomina a espécie zeuteriónica, AA±. Estas moléculas apresentam um

momento dipolar elevado o que dá origem a interacções importantes quer entre

os seus iões quer com solventes polares como a água.

Considerando então a ionização de um aminoácido genérico (AA) em água,

podem escrever-se as seguintes equações de equilíbrio:


– 17 –

±⇔ AAAADK

KD (R0)

±++ +⇔ AAHAA1ξ

K1 (R1)

−+± +⇔ AAHAA2ξ

K2 (R2)

−+ +⇔ OHHOH3

2

ξ KW (R3)

Na reacção R0 forma-se o zeuterião que, ao aceitar um protão na reacção R1,

forma o catião AA+. O zeuterião pode também ceder um protão, reacção R2,

dando origem ao anião AA– [17]. A reacção R3 representa a autoprotólise da água.

As constantes de equilíbrio KD, K1, K2 e KW permitem escrever:

AA

AAD a

aK

±= (22)

+

±+=AA

AAH

a

aaK1 (23)

±

−+=AA

AAH

a

aaK2 (24)

−+=OHHW aaK (25)

Para aminoácidos alifáticos o valor de KD é da ordem de 105 a 106 [18], o que

significa que quase todo o aminoácido AA presente em solução está na forma de

AA±, AA+ e AA–. Adoptando-se a convenção simétrica e a escala molal, vem que:

imii ma ×= *,γ , pelo que as constantes das equações (22)-(25) se podem exprimir

como o produto de um termo de coeficientes de actividade por outro de

molalidades. Por exemplo, para a equação (23) obtém-se:

m

AA

AAH

AA

AAH

AA

AAH KKm

mm

a

aaK ,1,1*

**

1 * ×≡×==+

±+

+

±+

+

±+

γγγγ

(26)

Relações idênticas podem ser escritas para K2 e KW.


– 18 –

2.3. Modelos de coeficientes de actividade

Apresenta-se nesta secção uma breve descrição dos modelos de coeficientes

de actividade de UNIFAC e Debye-Hückel, dado terem sido escolhidos neste

trabalho para o estudo de aminoácidos. Termina-se com uma revisão de alguns

modelos existentes na literatura para este efeito.

2.3.1. Modelo UNIFAC

O modelo UNIFAC (UNIversal Functional Activity Coefficient) é um modelo

semi-empírico, preditivo, desenvolvido por Fredeslund et al [19], baseado em

termodinâmica molecular e bastante usado para descrever o equilíbrio líquido-

vapor em sistemas de não-electrólitos. No entanto, várias extensões deste método

foram sendo aplicadas em outros tipos de soluções, nomeadamente poliméricas e

electrolíticas. O objectivo de métodos preditivos como o UNIFAC é utilizar

informação obtida a partir de sistemas conhecidos (i.e., parâmetros) para prever

o comportamento de sistemas distintos para os quais não exista informação

disponível [20].

A ideia principal dos métodos de contribuição de grupos é que apesar de

existirem milhares de compostos químicos com interesse para a indústria, o

número de grupos funcionais que os compõem é muito inferior. Utiliza-se então o

princípio de que uma propriedade física de um componente é a soma das

contribuições de cada um dos grupos funcionais da molécula para essa mesma

propriedade. No entanto, qualquer que seja o método de contribuição de grupos,

produzirá resultados aproximados, uma vez que a contribuição de um

determinado grupo numa molécula não é exactamente a mesma que a

contribuição desse mesmo grupo noutra. Outro pressuposto é que a contribuição

de um grupo dentro de uma molécula é independente da contribuição de outro

grupo na mesma molécula [20]. Quanto menor o número de grupos em que a

molécula é dividida, maior a exactidão do método. No limite, pode considerar-se

toda a molécula como um grupo, perdendo-se no entanto as vantagens desta

abordagem. Para ter utilidade prática, deve ser efectuada uma divisão sensata da

molécula: o número de grupos deve permanecer pequeno, mas não tão pequeno


– 19 –

que se percam os efeitos da estrutura molecular para as propriedades da

mistura.

Usando as interacções entre cada um dos grupos funcionais presentes nas

moléculas da mistura é então possível calcular o coeficiente de actividade de

cada um dos componentes.

O método original de UNIFAC, proposto por Fredeslund et al. [19], propõe o

cálculo do coeficiente de actividade da espécie i na convenção simétrica e escala

de fracção molar, como sendo a combinação de dois termos, um termo

combinatorial e um termo residual:

RCUNIFAC lnlnln iii γγγ += (27)

O primeiro é igual ao termo combinatorial do método UNIQUAC e representa o

desvio à idealidade devido às diferenças de tamanho e forma das moléculas em

solução. Neste trabalho é usada a correcção de Kikic et al. [21], introduzida para

soluções diluídas:

ΘΦ

−+ΘΦ

−Φ

−+Φ

=i

i

i

ii

i

ci

i

ciC

i qxx

1ln51lnlnγ (28)

em que,

∑

=Φ

jjj

iici

xr

xr32

32

(29)

∑

=Φ

jjj

iii xr

xr (30)

∑

=Θ

jjj

iii xq

xq (31)

Nas equações anteriores o índice j representa o número total de moléculas

presentes na solução. Os parâmetros ri e qi são, respectivamente, volume de van

der Waals e área superficial das moléculas e são calculados pelos parâmetros de

área e volume de cada um dos grupos k que constituem a molécula, Rk e Qk:


– 20 –

∑=k

kiki Rr ν (32)

∑=k

kiki Qq ν (33)

onde o índice k representa o número de diferentes grupos funcionais na molécula

i e ikν é o número de grupos k presentes na molécula i. Na Tabela A.3 em

apêndice são apresentados todos os parâmetros Rk e Qk utilizados nas equações

(32) e (33).

O termo residual, Riγ , é conhecido como o termo energético e tem em conta as

interacções energéticas de curto alcance entre grupos. É calculado por:

( )∑ Γ−Γ=k

ikk

iki lnlnln R νγ (34)

em que kΓ é o coeficiente de actividade do grupo k na solução e ikΓ é o coeficiente

de actividade do grupo k numa solução contendo apenas moléculas do tipo i.

O coeficiente de actividade kΓ é calculado por:

ΘΘ

−

Θ−=Γ ∑∑

∑m

nnmn

kmm

mmkmkk Q

τττln1ln (35)

onde os índices m e n correspondem a todos os grupos presentes em solução. A

partir da equação (36) obtém-se a fracção de área do grupo m, mΘ :

∑

=Θ

nnn

mmm XQ

XQ (36)

∑∑

∑=

j nj

in

jj

im

mx

x

Xν

ν (37)

onde Xm é a fracção de grupos m. Por fim, o parâmetro nmτ calcula-se por:


– 21 –

−=

T

amnnm expτ (38)

onde T representa a temperatura absoluta da mistura e mna é o parâmetro de

interacção entre os grupos m e n, sendo uma constante ajustável neste trabalho.

Importa ainda referir que as equações (35)-(38) são também usadas no cálculo de

ikΓln .

2.3.2. Modelo de Debye-Hückel

Os aminoácidos são electrólitos fracos em solução aquosa. De modo a incluir

as interacções electrostáticas (de longo alcance) que se estabelecem entre as

espécies carregadas em solução (AA±, AA+, AA–, H+ e OH–) no desvio à idealidade,

vai recorrer-se ao modelo de Debye-Hückel apresentado a seguir.

Lei limite de Debye-Hückel

É sabido que iões com cargas opostas se atraem mutuamente. Como

resultado, é mais provável encontrar aniões perto de catiões e vice-versa. A

energia eléctrica do ião central e, consequentemente, o seu potencial químico é

reduzido em resultado das interacções com a sua atmosfera iónica de carga

oposta [22]. Esta diminuição de energia corresponde à diferença entre a energia

livre de Gibbs e o seu valor em solução ideal, podendo representar-se por

±γlnRT . Mesmo em soluções muito diluídas, as forças atractivas e repulsivas

são significativas, pelo que a sua contribuição para os desvios à idealidade deve

ser contabilizada.

Peter Debye e Erich Hückel desenvolveram, em 1923, um modelo simples

para soluções de electrólitos e obtiveram expressões para os coeficientes de

actividade de espécies iónicas, representados por +γ e −γ . Neste modelo os iões

são tratados simplesmente como esferas rígidas carregadas e com diâmetro fixo.

O modelo inicialmente proposto por eles permite calcular coeficientes de

actividade de iões em soluções muito diluídas, tomando a designação de lei limite

de Debye-Hückel [22]:

21

log IAzz ⋅−= −+±γ (39)


– 22 –

em que +z e −z são as cargas eléctricas do catião e do anião, respectivamente, a

constante A vale 0,509 para soluções aquosas a 25ºC e I representa a força

iónica da solução dada por:

∑= 2

2

1ii zmI (40)

Neste caso, a força iónica tende para zero a diluição infinita. A equação de

Debye-Hückel mostrou ser aplicável para forças iónicas muito baixas, inferiores a

1 mmol/kg.

Extensão da lei de Debye-Hückel

Para soluções onde a força iónica é mais elevada, o coeficiente de actividade

da espécie i pode ser estimado por uma extensão da lei de Debye-Hückel (usada

neste trabalho):

IBa

IAz ii +

−=∗

1log

2DH,γ (41)

em que zi é a carga da espécie i e a é a distância de maior aproximação entre as

espécies i e j, representada na Figura 2.3.

Figura 2.1: Representação esquemática da distância a, entre as espécies i e j.


– 23 –

2.3.3. Revisão de modelos de coeficientes de actividade para aminoácidos

Há várias décadas que são conhecidos estudos experimentais de medição de

coeficientes de actividade de aminoácidos [23-27], dados que foram utilizados

neste trabalho (ver secção 3.5). No entanto, quanto a modelos termodinâmicos

capazes de prever o seu comportamento em solução, só nos últimos vinte anos

foram surgindo e sendo publicados alguns resultados. Segundo Macedo [28], os

modelos publicados podem distinguir-se em duas grandes categorias:

1. Modelos que apenas consideram as interacções de curto alcance entre as

partículas, considerando o aminoácido em água apenas na sua forma

zeuteriónica, como os modelos publicados por Gupta e Heidemman [17],

Kuramochi et al. [29] e Xu et al. [30].

No trabalho publicado por Gupta e Heidemann [17] é usado o método UNIFAC

para alguns aminoácidos e antibióticos. Neste modelo é considerado o equilíbrio

químico e usadas as respectivas constantes de ionização. Foram ainda

introduzidos dois novos grupos, correspondentes às moléculas da glicina e

prolina.

No trabalho de Kuramochi et al. [29] foi usado o modelo UNIFAC e foram

introduzidos novos grupos. O zeuterião é considerado uma molécula neutra e é

proposta uma alteração ao método UNIFAC de Larsen et al [31] de modo a ser

estendido a soluções de biomoléculas. Para que o método representasse

correctamente os coeficientes de actividade foram definidos novos grupos. Nesse

trabalho, os aminoácidos foram divididos em quatro grupos: α-CH, NH2, COOH e

sc-CH2, e ainda foi introduzido o novo grupo CONH para os peptídeos.

No trabalho publicado por Xu et al. [30] foi usado o modelo de Wilson para

soluções aquosas de polímeros para calcular os coeficientes de actividade e as

solubilidades de aminoácidos e peptídeos em água, usando dois parâmetros

ajustáveis por aminoácido. Nos parâmetros de energia foi introduzida a

influência da temperatura, podendo obter-se, segundo os autores, uma melhor

representação da solubilidade a temperaturas elevadas [30].


– 24 –

2. Modelos que, para além das interacções de curto alcance, têm em conta as

interacções de longo alcance devidas às forças electrostáticas entre iões. Para

isso usam a equação de Debye-Hückel. Nesta abordagem inserem-se os trabalhos

publicados por Peres e Macedo [32], Pinho et al. [33] e o modelo desenvolvida no

âmbito desta dissertação.

No artigo de Pinho et al. [33] foi combinado o modelo UNIFAC modificado por

Kikic et al. [21] com a equação de Debye-Hückel. Novos grupos iónicos foram

definidos, tendo em conta as cargas das espécies em solução, e os dados

experimentais da literatura foram usados para ajustar os parâmetros de

interacção entre esses novos grupos e os já existentes, obtendo-se resultados

satisfatórios como se verá no Capítulo 4.

O modelo de Peres e Macedo (1994) [32] utiliza os modelos de Debye-Hückel e

de UNIQUAC para descrever o equilíbrio sólido-líquido de aminoácidos/peptídeos

em soluções aquosas. Tal como nos modelos anteriormente indicados, os dados

experimentais de coeficientes de actividade foram usados para optimizar novos

parâmetros, obtendo-se também resultados satisfatórios.

Capítulo 3 – MODELO PROPOSTO

– 25 –

3. MODELO PROPOSTO PARA COEFICIENTES DE ACTIVIDADE DE AMINOÁCIDOS

Neste capítulo apresenta-se o desenvolvimento do modelo proposto neste

trabalho para calcular coeficientes de actividade de aminoácidos e peptídeos em

solução aquosa. É um modelo que integra interacções de curto e de longo

alcance, traduzidas pelas equações de UNIFAC e Debye-Hückel, respectivamente.

Faz-se também uma descrição do programa e do algoritmo utilizados na

optimização dos parâmetros do modelo. Apresenta-se ainda a base de dados

compilada.

3.1. Cálculo do equilíbrio químico

O equilíbrio químico de aminoácidos em solução aquosa encontra-se descrito

na secção 2.2. O cálculo deste equilíbrio é imprescindível para se conhecer a

concentração de cada espécie em solução, pelo que será abordado em primeiro

lugar.

De modo a simplificar as expressões a desenvolver, adopta-se a notação

seguinte para as espécies envolvidas: AA± ≡ 1, AA+ ≡ 2, AA– ≡ 3, H+ ≡ 4 e OH– ≡ 5.

O número de moles de cada espécie pode calcular-se pelas relações

estequiométricas correspondentes aos equilíbrios traduzidos pelas equações

químicas R1 a R3 (ver secção 2.2):

∑=

+=≡±

3

1,10,11

jjjAA

nnn ξυ (42)

∑=

+=≡+

3

1,20,22

jjjAA

nnn ξυ (43)

∑=

+=≡−

3

1,30,33

jjjAA

nnn ξυ (44)

∑=

+=≡+

3

1,40,44

jjjH

nnn ξυ (45)


– 26 –

∑=

+=≡−

3

1,50,55

jjjOH

nnn ξυ (46)

onde ji,υ representa o coeficiente estequiométrico da espécie i na reacção j, jξ é o

avanço da reacção j e 0,in o número inicial de moles do componente i.

Substituindo os coeficientes estequiométricos obtém-se:

210,11 ξξ −+= nn (47)

10,22 ξ−= nn (48)

20,33 ξ+= nn (49)

3210,44 ξξξ +++= nn (50)

30,55 ξ+= nn (51)

No início, apenas temos as espécies AA±, H+ e OH–, pelo que o número total de

moles, 0n , é dado por:

∑=

++==NC

ii nnnnn

10,50,40,10,0 (52)

Dividindo as equações (47) a (51) pela massa de solvente, estas aparecem

escritas em termos das molalidades de cada componente ( )ssii Mnnm = e do

avanço intensivo de cada reacção j ( )ssjj Mnξφ = :

210,11 φφ −+= mm (53)

12 φ−=m (54)

23 φ=m (55)

3210,44 φφφ +++= mm (56)

30,55 φ+= mm (57)


– 27 –

Como as reacções em que o zeuterião intervém para originar o AA+ e o AA- são

pouco extensas, pode introduzir-se a aproximação:

0,1210,11 mmm ≅−+= φφ (58)

Substituindo as relações (54)-(58) nos equilíbrios (23)-(25) obtém-se:

( )

1

3210,1

,1

1,1 φ

φφφ

γ −++⋅

=≡m

K

KK m (59)

( )0,1

3212

,2

2,2 mK

KK m

φφφφγ

++⋅=≡ (60)

( ) 3321,

, φφφφγ

⋅++=≡W

WmW K

KK (61)

onde se atendeu à notação definida na equação (26). A solução do sistema de

equações não linear obtém-se facilmente por manipulação algébrica:

mm

mmW

KmK

KmKm

,10,12,1

,23

0,1,2

0,121 ⋅+

⋅+⋅=φ (62)

m

m

K

Km

,11

,22

0,12 ⋅

⋅−=

φφ (63)

m

mW

K

Km

,11

,0,13 ⋅

⋅−=

φφ (64)

Assim, conhecendo-se a molalidade inicial do aminoácido, 0,1m , as constantes de

equilíbrio termodinâmicas ( )WKKK ,, 21 e as constantes expressas em termos de

coeficientes de actividade ( )γγγ ,,2,1 , , WKKK calculam-se 1φ , 2φ e 3φ pelas equações

(62)-(64), que substituídos nas equações (54)-(58) permitem determinar a

concentração do sistema. Este cálculo é iterativo: inicia-se com coeficientes de

actividade unitários e obtém-se uma primeira estimativa para im ; com estes

valores calculam-se os iγ ’s que serão utilizados na obtenção de novas

molalidades; o procedimento repete-se até se atingir convergência.


– 28 –

3.2. Descrição do modelo

O modelo proposto nesta dissertação compreende as interacções de curto e de

longo alcance, traduzidas pelas equações de UNIFAC e Debye-Hückel,

respectivamente. Desta forma, a função de Gibbs em excesso do sistema, na

convenção assimétrica pode escrever-se como:

EEE GGG *,DH

*,UNIFAC

*, += (65)

Em todas as publicações existentes na literatura, a contribuição das cargas

do zeuterião, AA±, não foi tida em conta por ser uma molécula globalmente

neutra. No entanto, neste trabalho, o efeito das cargas dos grupos NH3+ e COO–

do AA± é considerado muito importante para os desvios à idealidade, pois grande

parte do aminoácido existe na forma AA±. Este facto levou-nos a introduzir esta

contribuição. Como se observa na Figura 3.1, os grupos iónicos interagem

electrostaticamente com os restantes grupos em solução, quer sejam espécies

positivas, negativas ou zeuteriónicas, afectando dessa forma o coeficiente de

actividade do AA±.

Partindo da equação (65) deriva-se o coeficiente de actividade não simétrico,

obtendo-se:

DH,,

UNIFAC,,, lnlnln ∗∗∗ += mimimi γγγ (66)

O termo de Debye-Hückel para o caso particular do zeuterião, DH

mAA

,

,ln ∗

±γ , será

então calculado por:

DH,

,

DH,

,

DH,

, 3lnlnln ∗∗∗

+−± +=mNHmCOOmAA

γγγ (67)

Grupos UNIFAC usados neste trabalho. Novo grupo mCH3.

Na Tabela 3.1 encontram-se listados os grupos que compõem as espécies

zeuteriónicas de aminoácidos e peptídeos. Como se pode observar na Tabela 3.1

foi introduzido um novo grupo neste trabalho, chamado mCH3 (modified CH3),

cuja justificação passamos a expor.


– 29 –

O

NH3+

O-

O

NH3+

O-

ONH3+

O-

ONH3+

OH

O NH2

O-

AA±

AA±

AA+

AA–

AA±

Interacções electrostáticas entre

cargas opostas

Figura 3.1: Interacções electrostáticas entre as espécies com carga.

Na Figura 3.2 encontram-se representados coeficientes de actividade

experimentais em função da molalidade para 5 aminoácidos que diferem entre si

pela presença de um ou mais grupos CH3 na cadeia lateral alifática (ver Tabela

1.2). A alanina, com o grupo 3CHR = (ver Figura 1.1), apresenta um coeficiente

de actividade superior à glicina ( HR = ) e inferior ao ácido aminobutírico

( 32CHCHR = ). Prosseguindo para o ácido aminovalérico ( 322 CHCHCHR = ), o

seu coeficiente de actividade é superior ao do ácido aminobutírico e inferior ao da

valina ( 33CHCHCHR = ). Como a única diferença entre este pequeno grupo de

aminoácidos reside na estrutura da sua cadeia lateral, o comportamento distinto

dos seus coeficientes de actividade pode ser atribuído ao grupo CH3 e aos

subgrupos CH2 e CH.

Por outro lado, os parâmetros originais UNIFAC para a interacção energética

(amn) entre o grupo CH3 e os demais da mistura já publicados não são capazes de

descrever correctamente o andamento das curvas apresentadas na Figura 3.2.

Pelo contrário, a adição de grupos CH3 faz diminuir o valor do coeficiente de

actividade, contrariando os dados experimentais. Por este motivo, define-se neste

trabalho o grupo mCH3 (modified CH3), específico para este tipo de sistemas.


– 30 –

Parâmetros de interacção energética a optimizar

Os parâmetros de interacção energética entre os grupos que aparecem na

Tabela 3.1 dividem-se em dois tipos: os que já estão publicados e os que foram

definidos/redefinidos neste trabalho. Os valores dos primeiros foram tirados de

tabelas existentes na literatura (ver Tabela A.4 no Apêndice); os restantes foram

optimizados (ou fixados ao longo do trabalho) utilizando a base de dados da

secção 3.3. Os pares ajustados são: H2O/CNH3+, CNH3+/H2O, COO–/H2O, COO–

/CNH3+, CNH3+/mCH3, mCH3/COO–, mCH3/H2O, H2O/mCH3, COO–/OH,

OH/CNH3+, OH/COO–, NH3+/OH, OH/CNH2+, H2O/CNH2+, CNH2+/H2O,

CONHCH2/COO–, CONHCH2/CNH3+, CONHCH2/mCH3 e mCH3/CONHCH2.

Tabela 3.1: Grupos constituintes da espécie zeuteriónica de aminoácidos e peptídeos.

Aminoácido/peptídeo Grupos constituintes

glicina CH2NH3+; COO–

alanina mCH3; CHNH3+; COO–

ác. aminobutírico mCH3; mCH2; CHNH3+; COO-

valina 2 × mCH3; mCH; CHNH3+; COO-

ác. aminovalerico mCH3; 2 × mCH2; CHNH3+; COO-

hidroxiprolina CH2; 2 × CH; OH; CH2NH2+; COO-

prolina 2 × CH2; CH; CH2NH2+; COO-

serina mCH2; OH; CHNH3+; COO-

treonina mCH3; mCH; OH; CHNH3+; COO-

alanilalanina 2 × mCH3; CONHCH; CHNH3+; COO-

alanilglicina mCH3; CHNH3+; CONHCH2; COO-

glicilalanina mCH3; CONHCH; CH2NH3+; COO-

glicilglicina CH2NH3+; CONHCH2; COO-

triglicina 2 × CONHCH2; CH2NH3+; COO-


– 31 –

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

molalidade

Coef

. de

Act

ivid

ade,

γ*

glicina

alanina

ác.aminobutírico

ác.aminovalérico

valina

Figura 3.2: Coeficientes de actividade experimentais em função da molalidade para 5 aminoácidos de cadeia lateral alifática.

Coeficientes de actividade real e aparente

O coeficiente de actividade real de um aminoácido decorre do desvio à

idealidade das diversas espécies que aparecem com a sua ionização. No entanto,

os dados experimentais publicados são apresentados para o aminoácido não

dissociado AA. Este valor passa a ser designado por aparente ( )*ap,mγ , em

contraposição ao coeficiente real ( )*mγ .

Torna-se necessário relacionar os dois coeficientes. Para isso parte-se da

igualdade das fugacidades para a solução real e aparente:

◊◊ ××=×× px,x fxfx aapap γγ ( 68)

Atendendo a que, quando 1→x , 1ap →x e 1ap, →= xx γγ , conclui-se que

◊◊ = apff , pelo que ap,ap xx xx γγ = . Dividindo ambos os membros pelo coeficiente


– 32 –

de actividade a diluição infinita, aparecem os coeficientes em convenção

assimétrica:

*

ap

*ap, xx x

x γγ = (69)

O quociente entre a fracção molar real e a aparente é dado por:

( ) AA

AA

AA

AA

AAAAAA

AA

AAAAAA

AA

m

m

n

n

nnn

n

nnnn

nn

x

x ±±

−+±

±

−+±

±==

++=

++=

total

total

ap

real (70)

Combinando as duas equações anteriores, obtém-se:

**ap, x

AA

AAx m

mγγ ⋅=

± (71)

e como nestes sistemas o valor de *xγ coincide com *

mγ (ver Tabela A.2), a relação

final pretendida é:

**ap, m

AA

AAm m

mγγ ⋅=

± (72)

3.3. Programa de cálculo

No desenvolvimento desta dissertação foram usados o software de cálculo

MATLAB e a aplicação de cálculo e base de dados termodinâmicos THERMOLIB

[34]. A estrutura do programa feito em MATLAB pode observar-se na Figura 3.3.

A base do programa assenta no gestor de optimização representado pelo bloco

1. Neste gestor, são definidos os aminoácidos que irão ser ajustados e as

estimativas iniciais dos parâmetros a optimizar, amn_iniciais. No bloco 1 é usada a

função fminsearch, uma função do MATLAB que usa o algoritmo de Nelder-Mead

para procurar mínimos relativos; a função objectivo é dada por:

( )∑ ∗∗ −=i

mimiFobj2exp,

,calc,

, γγ (73)


– 33 –

inp

ut

inp

ut

( )2exp,,

calc,,∑ ∗∗ −=

imimiFobj γγ

calc*,,miγ

Figura 3.3: Representação esquemática da estrutura do programa de cálculo.

Dentro da rotina de optimização, bloco 4, são definidos os parâmetros amn a

ajustar, isto é, os grupos m e n do método UNIFAC cuja interacção permitirá

ajustar a curva do modelo aos dados experimentais. Neste bloco entra a

informação do bloco 5, bloco composto por ficheiros individuais para cada

aminoácido/peptídeo que contêm os dados experimentais de coeficiente de

actividade e constante de equilíbrio de cada um e ainda a construção da

molécula a partir dos vários grupos que a compõe (de modo a ser usada na

aplicação THERMOLIB). Na Figura 3.4 encontra-se um exemplo de um ficheiro do

bloco 5, neste caso para a glicina. O bloco 4 tem ainda como entrada o resultado

do cálculo de ∗iγ do bloco 6. Este é um bloco importante, visto que é onde são

combinados o equilíbrio químico e as contribuições para os coeficientes de

actividade de UNIFAC e de Debye-Hückel, UNIFAC,∗iγ e DH,∗

iγ , respectivamente,

provenientes do bloco 7. O cálculo do equilíbrio químico é fundamental, uma vez

que, tendo em conta os avanços das reacções R1 a R3, é necessário saber o

número de moles de cada uma das espécies, AA±, AA+ e AA–, H+ e OH–. Para o

cálculo do equilíbrio são resolvidas as equações (54)-(58) e (62)-(64) e obtém-se

um vector-molalidade que contém a concentração de cada espécie em solução.

Relativamente ao cálculo dos coeficientes de actividade e à optimização dos

parâmetros de interacção em particular (blocos 4 a 7 da Figura 3.3), a estrutura

do algoritmo que foi desenvolvido mostra-se na Figura 3.5.


– 34 –

Figura 3.4: Exemplo de ficheiro de dados da glicina, bloco 5 da Figura 3.3.

Como se pode constatar, o cálculo dos coeficientes de actividade e obtenção

dos parâmetros amn é um processo iterativo. No início, são introduzidos os dados

de temperatura do sistema, constantes de equilíbrio em função da temperatura,

molalidades de cada uma das espécies, coeficientes de actividade experimentais e

as estimativas iniciais dos parâmetros ajustáveis do modelo UNIFAC, amn_iniciais.

De seguida, a rotina verifica se é a primeira iteração, isto é, se 0=k , e em caso

afirmativo os coeficientes de actividade são assumidos como sendo iguais a 1.

Através do cálculo do avanço de cada uma das reacções dados pelas equações

(62) a (64) é possível determinar a molalidade de cada uma das espécies em

solução, 0=kim , pelas equações (54)-(58). As molalidades calculadas são

convertidas para fracções molares e, através da biblioteca THERMOLIB, a

contribuição pelo modelo de UNIFAC para o coeficiente de actividade é calculada.

function glicina(T) global AMINOACIDOS %% Massa molecular de cada espécie solucao.MW = [18.015 75.07 76.07 74.07 17.007 1.008 ]/1000; %Massa molecular (kg/mol) %% Carrega a base de dados termodinâmicos na memóri a. carregarBasedeDados; %%Preparar os componentes solucao.zwiterion = gerarCompMinimo( 'GLICINA' , 'COO-:CH2NH3+' ,nan); solucao.Amais = gerarCompMinimo( 'GLICINA+' , 'COOH:CH2NH3+' ,nan); solucao.Amenos = gerarCompMinimo( 'GLICINA-' , 'COO-:CH2NH2' ,nan); solucao.Solvente = LerComponentePuro( 'AGUA' ); %% Dados de Equilibrio pK1 = 7.1157-2.9548e-2*T+4.5506e-5*T^2; %pK1 em função da temperatura pK2 = 26.155-8.3834e-2*T+9.6965e-5*T^2; %pK2 em função da temperatura pKW = 4471.33/T-6.0846+0.017053*T; %pKw em função da temperatura solucao.K1=10^(-pK1); %Valor de K1 solucao.K2=10^(-pK2); %Valor de K1 solucao.KW=10^(-pKW); %Valor de K1 %% Dados experimentais da Glicina dadosexp = ... [0.2 0.0176; ... 0.3 0.0232; ... 0.5 0.0421; ... 0.7 0.0489; ... 1.0 0.0579; ... 1.5 0.0868; ... 2.0 0.1041; ... 2.5 0.1181; ... 3.0 0.1297; ... 3.114 0.1321; ... ]; %% Construção da estrutura AMINOACIDOS AMINOACIDOS.carregados{end+1}={ 'glicina' ,solucao,dadosexp};


– 35 –

T, K(T), miexp, i,mexp, amn_iniciais

k = 0

Resultadosamn_finais

Equilíbrio QuímicoCálculo de mik=0

UNIFAC + Debye-HückelCálculo i,m*

sim

Início

( )∑ −=j

micalcmiFobj

2exp*,,

*,, γγ

i,mk=0 = 1k ≠ 0 ? não

k=k+1

amnk-1=amnk não

Equílibrio QuímicoCálculo de mik com i,mk-1

sim

Fim?δ≤∆Fobj

Figura 3.5: Algoritmo de cálculo usado na optimização.

A biblioteca tem como parâmetros de entrada apenas a temperatura do sistema e

a composição em fracção molar de cada espécie, obtendo-se UNIFAC,,∗miγ . É ainda

calculada a contribuição para o coeficiente de actividade pela equação de Debye-

Hückel, DH,,∗miγ , tendo em conta as contribuições de todas as espécies com carga,

incluindo o zeuterião, obtendo-se pela equação (66) o coeficiente de actividade

∗mi,γ . Como já foi referido, para obter os parâmetros amn usa-se a função objectivo

definida pela equação (73).

Neste momento, o programa verifica se a condição estabelecida para finalizar

o cálculo é cumprida. A condição usada é que a variação (δ) do valor da função

objectivo seja inferior a 1×10-3. Para k = 0 a condição não é verificada e avança-se

para uma nova iteração. Neste ponto, o número de iterações é incrementado e

calcula-se novamente o equilíbrio químico, desta vez não com 1=∗iγ , mas com o

valor do coeficiente de actividade calculado no passo anterior, 1, −∗ kiγ , e obtém-se o

novo vector-molalidade, kim . Retoma-se então o cálculo de coeficientes de

actividade com as duas contribuições. Este ciclo segue até que seja satisfeita a

condição de paragem. Nesta altura os parâmetros obtidos correspondem ao

resultado final.


– 36 –

3.4. Estratégia de cálculo

Apresenta-se nesta secção a estratégia adoptada para a optimização dos

parâmetros de interacção de UNIFAC apresentados em 3.2.

Começou-se pela glicina, uma vez que é o aminoácido mais simples (ver

Tabela 1.2) e os grupos que o compõem fazem também parte de outros

aminoácidos. Para a glicina, os parâmetros de interacção usados no ajuste foram

H2O/CNH3+, CNH3+/H2O, COO–/H2O e COO–/CNH3+.

De seguida tratou-se simultaneamente a alanina e o ácido aminobutírico,

dada a semelhança entre eles (ver Tabela 1.2). Os pares que se revelaram mais

importantes foram: CNH3+/mCH3, mCH3/COO–, mCH3/H2O e H2O/mCH3.

Para a serina foram escolhidos 2 parâmetros de interacção, COO–/OH e

OH/CNH3+, que foram mantidos iguais a OH/COO– e CNH3+/OH,

respectivamente.

Para a prolina e hidroxiprolina usaram-se 3 parâmetros no processo de

minimização: OH/CNH2+, H2O/CNH2+ e CNH2+/H2O, pois foram os que revelaram

maior influência sobre a função objectivo.

Por fim, foram ajustados dois peptídeos, a glicilglicina e a alanilalanina,

recorrendo-se a 4 parâmetros de interacção. Começou por se ajustar a

glicilglicina com os 2 parâmetros: CONHCH2/COO– e CONHCH2/CNH3+. Para a

alanilalanina, os parâmetros usados foram: CONHCH2/mCH3 e mCH3/CONHCH2.

É importante referir que à medida que os parâmetros se iam ajustando, iam

sendo fixados durante as optimizações seguintes.

Neste trabalho foram testados muitos outros parâmetros, mas durante a

optimização os seus valores evoluíam para números que já não influenciavam o

coeficiente de actividade, não alterando o valor da função objectivo. Por este

motivo, os pares de grupos cujos coeficientes foram optimizados foram aqueles

que se revelaram mais importantes para o ajuste.

3.5. Base de dados utilizada neste trabalho

Na Tabela 3.2 estão compilados os parâmetros usados no cálculo das

constantes de equilíbrio K1 e K2 em função da temperatura. Na Tabela 3.3 são


– 37 –

apresentados os valores de pK1 e pK2 de aminoácidos/peptídeos a 25ºC para os

quais não existe informação da sua variação com a temperatura. Para determinar

o produto iónico da água, Kw, em função da temperatura foi usada a equação

seguinte proposta por Robinson e Stokes [35]:

TT

pK w ⋅+−= 017053,00846,633,4471

(74)

Na Tabela 3.4 apresentam-se os coeficientes de actividade experimentais

utilizados neste trabalho.

Remeteram-se para apêndice (Tabelas A.3 e A.4) os parâmetros de área,

volume e de interacção energética do modelo UNIFAC. Relativamente à equação

de Debye-Hückel, equação (41), foi usado 10104 −×=a m [14]; as constantes A

e B dependem da temperatura e foram calculadas por [14]:

0,50,52534 molkg101863,1109865,4106096,1 −−−− ⋅×+⋅×−×= TTA (75)

0,50,52369 molkg108675,8103349,3104974,3 −⋅×+⋅×−×= TTB (76)


– 38 –

Tabela 3.2: Parâmetros para o cálculo de pK1 e pK2, para cada aminoácido [14]:

2210 TTpK ⋅+⋅+= ααα . A 1ª linha refere-se a pK1 e a 2ª linha a pK2.

Aminoácido 0α 21 10×α

52 10×α

7,1157 -2,9548 4,5506 Glicina

26,155 -8,3834 9,6965

7,7018 -3,8881 5,3411 Alanina

28,345 -9,7007 11,750

6,5886 -2,8617 4,7586 Valina

26,936 -8,9094 10,514

7,2273 -3,4139 5,3636 Hidroxiprolina

24,770 -7,8220 9,2390

7,3987 -3,5533 5,7879 Prolina

25,672 -7,5599 8,4482

7,6139 -3,3074 4,9864 Serina

25,569 -8,4130 9,8118

6,9981 -3,0640 5,0129 Isoleucina

27,555 -9,2760 11,087

7,0040 -3,0337 4,9161 Leucina

27,433 -9,1848 10,910

6,8528 -2,8962 4,6299 Norleucina

27.405 -9.0778 10.681

Tabela 3.3: Valores de pK1 e pK2 para alguns aminoácidos/peptídeos a 25ºC [14].

Aminoácido pK1 pK2

Ác. Aminobutírico 2,291 9,832

Ác. Aminovalérico 2,318 9,808

Treonina 2,090 9,100

Alanilalanina 3,120 8,296

Alanilglicina 3,160 8,240

Glicilalanina 3,170 8,230

Glicilglicina 3,060 8,130

Triglicina 3,260 7,910


– 39 –

4,0

1,4

93[c

]

0,6

03

3,5

1,4

06

0,6

21

3,0

0,7

42[a

]

1,3

37

0,6

41

2,5

0,7

62

1,2

68

0,6

7

2,0

0,7

87

1,1

65

1,0

26

1,2

05

0,7

05

0,9

44

1,5

0,8

19

1,0

35[b

]

1,1

02

1,0

14

1,1

48

0,7

46

0,9

51

0,6

89

1,0

0,8

75

1,0

23

1,0

65

1,0

72

1,0

07

1,0

96

0,8

05

0,9

59

1,0

35

0,8

55

0,8

55

0,7

03

0,7

0,8

94

1,0

16

1,0

42

1,0

55

1,0

02

1,0

69

0,8

51

0,9

66

1,0

02

0,8

63

0,8

69

0,7

82

0,5

0,9

08

1,0

12

1,0

28

1,0

76

1,0

44

1,0

02

1,0

47

0,8

87

0,9

75

0,9

86

0,8

69

0,8

83

0,8

23

0,3

0,9

48

1,0

07

1,0

16

1,0

45

1,0

32

1,0

00

1,0

28

0,9

29

0,9

84

0,9

77

0,9

08

0,9

12

0,8

77

0,8

04

0,2

0,9

6

1,0

05

1,0

11

1,0

3

1,0

22

1,0

00

1,0

19

0,9

51

0,9

89

0,9

82

0,9

31

0,9

35

0,9

11

0,8

51

Tabela 3.4:

Dados

exper

imen

tais

de

coef

icie

nte

s de

act

ivid

ade

(con

ven

ção n

ão s

imét

rica

e e

scala

mola

l de

con

cen

traçõ

es)

em f

un

ção d

a m

ola

lidade,

usa

dos

nes

te t

rabalh

o [13, 23-2

7].

Molalidade

Glicina

Alanina

Ác. Aminobutírico

Valina

Ác. Aminovalérico

Hidroxiprolina

Prolina

Serina

Treonina

Alanilalanina

Alanilglicina

Glicilalanina

Glicilglicina

Triglicina

[a] Para

m =

3,1

14 →

γ∗

= 0

,737;

[b] Para

m =

1,8

6 →

γ∗

= 1

,045;

[c] Para

m =

5,0

→ γ

∗ = 1

,675;

m =

6,0

→ γ

∗ = 1

,828;

m =

7,0

→ γ

∗ = 1

,977;

m =

7,3

→ γ

∗ = 2

,004.

Capítulo 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

– 40 –

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 4.1 estão listados os principais parâmetros obtidos neste trabalho

segundo a estratégia delineada na secção 3.4. A Tabela 4.2 contém o número de

pontos experimentais utilizado para cada aminoácido/peptídeo, o número de

parâmetros de interacção envolvidos na correlação e o rmsd (root mean square

deviation) resultante. O rmsd mede a qualidade de um ajuste ou de uma

previsão, calculando-se por:

( )( )

100%DATA

1

2exp,,

calc,,

DATA

⋅−

=∑

=

∗∗

Nrmsd

N

imAAmAA γγ

(77)

Nas Figuras 4.1 e 4.2 estão representados os coeficientes de actividade

(experimentais e modelados) em função da molalidade para seis aminoácidos –

glicina, prolina, hidroxiprolina, serina, alanina e ácido aminobutírico – e ainda

dois peptídeos – a glicilglicina e a alanilalanina. As duas figuras correspondem às

moléculas cujos parâmetros de interacção foram optimizados. Pode constatar-se

que se obtiveram resultados muito bons. Por exemplo, no caso da alanilalanina

(ver Figura 4.2) o modelo mostra-se inclusivamente capaz de traduzir a inversão

de comportamento do *,mAAγ : diminui inicialmente com o aumento concentração

para começar a aumentar de seguida. O rmsd global para estas oito biomoléculas

foi de 0,90%. Pinho et al. [33] e Gupta e Heidemann [17] obtiveram 0,80% e

3,74%, respectivamente (ver Tabela 4.3).

Tabela 4.1: Principais parâmetros de interacção entre grupos m e n utilizados.

CH3 H2O CNH3+ CNH2+ COO– CNH OH mCH3 CONHCH2

CH3 1318* 5000 5000 5000 255,7* 986,5* 0,0 390,9*

H2O 300,0* 621,1 -68,3 -1000 168,0* -229,1* -686,8 835,6*

CNH3+ 5000 284,0 n.d. -1000 -768,4 99,9 -1037,6 5000

CNH2+ 5000 -245,3 n.d. 5000 n.d. 5000 n.d. n.d.

COO– 5000 -422.1 414,8 5000 5000 -485,0 5000 5000

CNH 65,33* -448,2 -335,9 n.d. 5000 -150,0* n.d. n.d.

OH 156,4* 353,5* 99,9 -234,6 -485,0 42,7* 156,4 -382,7*

mCH3 0,0 -324,2 5000 n.d. -1689,6 n.d. 986,5 5000

CONHCH2 27,97* -509,3* 62,7 n.d. -1792,5 n.d. 394,8* -1378,9 *Parâmetros disponíveis em [36]. n.d.: dados não disponíveis.


– 41 –

Tabela 4.2: Número de pontos experimentais, parâmetros de interacção usados na correlação e rmsd obtido para cada aminoácido/peptídeo.

Aminoácido nº pontos

exp. nº parâmetros rmsd (%)

rmsd (%) médio

glicina 10 4 0,52

alanina 7 0,15

ác. aminobutírico 7 4

1,24

serina 11 2 0,46

prolina 15 1,39

hidroxiprolina 7 3

0,97

glicilglicina 6 2 1,74

Correlação

alanilalanina 5 2 0,68

0,90

ác. aminovalérico 5 – 2,29

treonina 7 – 11,89

valina 3 – 0,31

alanilglicina 5 – 3,04

glicilalanina 5 – 6,98

Previsão

triglicina 2 – 3,46

5,65

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

Molalidade

Co

efic

ien

te d

e A

ctiv

ida

de,

γ*

GlicinaProlinaHidroxiprolinaSerina

Figura 4.1: Coeficientes de actividade (convenção não simétrica e escala molal) de aminoácidos em água: dados experimentais e correlação obtida com o modelo deste trabalho.


– 42 –

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 20.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

Molalidade

Coef

icie

nte

de

Act

ivid

ade,

γ*

AlaninaÁc. Amino-butíricoAlanilalaninaGlicilglicina

Figura 4.2: Coeficientes de actividade (convenção não simétrica e escala molal) de aminoácidos/peptídeos em água: dados experimentais e correlação obtida com o modelo deste trabalho.

Sendo este modelo uma combinação do método de contribuição de grupos de

UNIFAC e da equação de Debye-Hückel, era importante avaliar a sua capacidade

preditiva.

Nas Figuras 4.3 e 4.4 mostram-se resultados previstos pelo modelo

desenvolvido neste trabalho juntamente com os pontos experimentais. Pode

observar-se que para a valina, triglicina e ácido aminovalérico o modelo exibe

uma excelente capacidade de previsão, obtendo-se um rmsd de 0,31%, 3,46% e

2,29%, respectivamente. Note-se que Pinho et al. [33] fornecem 16,43%, 10,00%

e 16,40% (ver Tabela 4.3); Gupta e Heidemann [17] apresentam apenas o rmsd

para a valina, sendo igual a 12,05%.

O modelo também exibe uma boa capacidade preditiva para a alanilglicina,

com rmsd de 3,04%, diminuindo a sua eficiência no caso da glicilalanina e da

treonina, com 6,98% e 11,89%, respectivamente. No entanto, estes resultados

não deixam de ser satisfatórios, quando comparados com outros autores: Pinho

et al. [33] fornecem previsões com rmsd’s iguais a 28,22%, 26,12%, 17,06%, e

17,87% (ver Tabela 4.3) para alanilglicina, treonina, glicilglicina e ácido

aminobutírico, respectivamente. Por seu lado, Gupta e Heidemann [17]

apresentam rmsd’s para a treonina e ácido aminobutírico iguais a 13,78% e

17,34%, respectivamente.


– 43 –

Em termos globais, o modelo proposto nesta dissertação oferece previsões de

coeficientes de actividade com rmsd = 5,65%, Pinho et al. [33] 20,17% e Gupta e

Heidemann [17] 14,94%.

Para concluir este capítulo, importa referir que Kuramochi et al. [29]

também usaram o método UNIFAC. No entanto não foi incluído nesta

comparação, porque calcularam o rmsd de forma diferente. No trabalho de Xu et

al. [30] foi usado o modelo de Wilson e os dados experimentais de todos os

aminoácidos foram correlacionados.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10.75

0.8

0.85

0.9

0.95

1

1.05

1.1

Molalidade

Coef

icie

nte

de

Act

ivid

ade,

γ*

ValinaAlanilglicinaTriglicina

Figura 4.3: Coeficientes de actividade (convenção não simétrica e escala molal) de aminoácidos/peptídeos em água, experimentais e previstos pelo modelo.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 20.7

0.75

0.8

0.85

0.9

0.95

1

1.05

1.1

1.15

1.2

Molalidade

Co

efic

ien

te d

e A

ctiv

ida

de,

γ*

TreoninaGlicilalaninaÁc.amino-valérico

Figura 4.4: Coeficientes de actividade (convenção não simétrica e escala molal) de aminoácidos/peptídeos em água, experimentais e previstos pelo modelo.


– 44 –

Tabela 4.3: Comparação dos resultados obtidos neste trabalho com outros modelos publicados.

rmsd (%)

Aminoácido nº ptos exp. Gupta e Heidemann[17] Pinho et al.[33] Este trabalho

glicina 10 4,20 0,60 0,52

alanina 7 8,97 0,19 0,15

ác. aminobutírico 7 17,34 17,87(p) 1,24

serina 11 3,32 0,24 0,46

prolina 15 3,01 1,21 1,39

hydroxiprolina 7 0,06 0,39 0,97

glicilglicina 5 – 17,06(p) 1,74

alanilalanina 6 – 0,52 0,68

rmsd médio global para correlação (%)

Correlação

3,74 0,80 0,90 ác. aminovalérico 5 – 16,40 2,29

treonina 7 13,78 26,12 11,89

valina 3 12,05 16,43 0,31

alanilglicina 5 – 28,22 3,04

glicilalanina 5 – 0,59(c) 6,98 Previsão

triglicina 2 – 10,00 3,46

rmsd médio global para previsão (%)

14,94 20,17 5,65

Nota: (p) → resultado da previsão. (c) → resultado da correlação.

Capítulo 5 – CONCLUSÕES

– 45 –

5. CONCLUSÕES

O objectivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um modelo para

coeficientes de actividade de aminoácidos/peptídeos em solução aquosa que

exiba uma boa capacidade de correlação e de previsão.

O modelo proposto combina o método UNIFAC com a equação de Debye-

Hückel para contabilizar as interacções de curto e de longo alcance que existem

entre as espécies em solução. O equilíbrio químico é também incluído para se

quantificar a abundância das espécies iónicas resultantes da ionização das

biomoléculas. O zeuterião, que é vulgarmente considerado uma molécula

globalmente neutra, foi aqui encarada como possuindo dois grupos distintos

carregados electricamente e cujas interacções electrostáticas não podem ser

desprezadas. De forma a interpretar correctamente os dados experimentais de

aminoácidos de cadeia aberta contendo cadeias alifáticas no carbono-α foi

também definido um grupo mCH3 (modified CH3).

Optimizaram-se no total 17 parâmetros de interacção energética. O modelo foi

capaz de representar muito bem os dados experimentais, fornecendo um rmsd de

0,90%. Os trabalhos de Pinho et al. [33] e Gupta e Heidemann [17] apresentam

0,80% e 3,74%, respectivamente.

Relativamente à capacidade preditiva do modelo proposto, obtiveram-se

resultados muito superiores aos dos autores citados. Obtivemos um rmsd =

5,65%, enquanto Pinho et al. [33] conseguiram 20,17% e Gupta e Heidemann

[17] 14,94%.

Concluindo, o modelo desenvolvido no âmbito desta dissertação apresenta um

óptimo comportamento na correlação e previsão dos coeficientes de actividade

das biomoléculas aminoácidos e peptídeos.

Como trabalho futuro, seria recomendável avaliar a capacidade do modelo

para estimar solubilidades de aminoácidos/peptídeos, analisando-se a influência

do pH sobre os resultados. A sua extensão ao cálculo de coeficientes de

actividade de algumas proteínas e antibióticos seria também interessante.


– 46 –

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] Lehninger, A. - Princípios de Bioquímica. Cap.5, Barcelona: Omega, 1984.

[2] Pradhan, A.A., Vera J.H., Effect of Anions on the Solubility of Zwitterionic Amino Acids, J. Chem. Eng. Data, Vol. 45, 2000, 140-143.

[3] Halpern, M. J. - Bioquímica: organização molecular da vida. Lisboa: Lidel, 2008.

[4] Lehninger, A. - Bioquímica. Cap 4, 4º vol., São Paulo: Edgard Blücher, 1976.

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[6] http://micro.magnet.fsu.edu/aminoacids/index.html (consultado em 10/09/2007).

[7] Morrison, R., Boyd, R; Química Orgânica. 14ª Ed; Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2005.

[8] http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/proteins.htm (consultado em 30/10/2008).

[9] Encyclopedia of bioprocess technology: fermentation, biocatalysis, and bioseparation. 1º vol., New York: John Wiley, 1999, 89-100.

[10] Eggeling, L., Pfefferle, W., Sahm, H.; Amino Acids – Cap. 14. In: Basic Biotechnology, 3ª Ed., Cambridge University Press, 2006.

[11] Barret, G. C. Chemistry and biochemistry of the amino acids. London: Chapman and Hall, 1985.

[12] http://www.ajinomoto.com/features/amino/lets/product/index.html (consultado em 15/10/2008)

[13] Hutchens, J.O.;Fasman, G.D.; In CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology; CRC Press, 1º vol., Cleveland: 1976,104-125.

[14] Pinho, S. P. A; Phase Equilibria in Electrolite Systems; Tese de Doutoramento, FEUP, 2000.

[15] Thomsen, K.; Aqueous Electrolytes: model parameters and process simulation; Tese de Doutoramento, Technical University of Denmark, 1997.

[16] Prausnitz, J.M., Lichtenthaler, R.N., Azevedo, E.G.; Molecular Thermodynamics of Fluid Phase Equilibria. 3ª Ed., Prentice Hall, 1999.

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[19] Fredenslund A., Jones R.L., Prausnitz J.M.; Group-contribution estimation of activity coefficients in nonideal liquid mixtures; AIChE J. 21(6),1975,1086-1099.

[20] Poling B.E., Prausnitz J.M., O’Connell J.P.; The Properties of Gases and Liquids, 5ª Ed., Singapura: McGraw-Hill, 2004.

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Capítulo 5 – CONCLUSÕES

– 47 –

[23] Smith, P.K., Smith, E.R., Thermodynamic Properties of Solutions of Amino Acids and Related Substances. The Activity of Aliphatic Amino Acids in Aqueous Solutions at Twenty-Five Degrees. J. Biol. Chem. 121, 1937, 607-613.

[24] Smith, E.R., Smith, P.K.. Thermodynamic Properties of Solutions of Amino Acids and Related Substances. VI. The activities of Some Peptides in Aqueous Solution at Twenty-Five Degrees. J. Biol. Chem. 135, 1940, 273-279.

[25] Hutchens, J.O., Figlio, K.M., Granito S.M. An Isopiestic Comparison Method for Activities. THE ACTIVITIES OF L-SERINE AND L-ARGININE�HYDROCHLORIDE. J. Biol. Chem. 238, 1963, 1419-1422.

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[27] Smith, P.K., Smith, E.R., Thermodynamic Properties of Solutions of Amino Acids and Related Substances. V. The Activities of Some Hydroxy- and N-Methylamino acids and Proline in Aqueous Solution at Twenty-Five Degrees J. Biol. Chem. 132, 1940, 57-64.

[28] Macedo, E. A.; Solubility of Amino Acids, Sugars and Proteins. Pure Appl. Chem., 77(3), 2005, 559 - 568

[29] Kuramochi, H., Noritomi, H., Hoshino, D., Nagahama, K.. Measurement of solubilities of two amino acids in water and prediction by the UNIFAC model. Biotechnol. Progr. 12, 1996, 371-379.

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[32] Peres, A.M. and Macedo, E.A. Representation of solubilities of amino acids using the UNIQUAC model for electrolytes. Chem. Eng .Sci. 49, 1994, 3803–3812.

[33] Pinho, S. P.; Silva, C. M.; Macedo, E. A. Solubility of Amino Acids: a Group-Contribution Model involving Phase and Chemical Equilibria. Ind. Eng. Chem. Res. 33, 1994, 1341-1347.

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[35] Robinson, R.A., Stokes, R.H., Eletrolyte Solutions, 2ªEd., London, Butterworths, 1970.

[36] Tiegs, D.; Gmehling, J.; Rasmussen, P.; Fredenslund, Aa. Vapor-Liquid Equilibria by UNIFAC Group Contribution. Revision and Extension 4. Ind. Eng. Chem. Res. 26, 1987, 159-161.

APÊNDICES

– 48 –

7. APÊNDICES Conversão entre escalas de concentração.

Nas Tabelas A.1 e A.2 encontram-se as relações entre diferentes escalas de

concentração e entre coeficientes de actividade em convenção simétrica e não

simétrica, respectivamente.

Tabela A.1: Conversão entre escalas de concentração – molalidade, molaridade e fracção molar. Tabela adaptada de [14].

Tabela A.2: Conversão entre coeficientes de actividade na convenção não simétrica – escalas de molalidade, molaridade e fracção molar. Tabela adaptada de [14].

Para: mi ci xi

mi — ∑

=

+solu

1

1N

lll

i

Mm

mρ

∑∑==

+solvsolu

1

'

1

1N

sss

N

ll

i

Mxm

m

ci ∑

=

−solu

1

N

lll

i

Mc

c

ρ

—

∑

∑∑

=

=

=

−+

solv

solu

solu

1

'

1

1N

sss

N

lllN

ll

i

Mx

Mc

c

c

ρ

De:

xi ∑

=

solv

1

N

sss

i

Mx

x

∑=

espécies

1

N

jjj

i

Mx

xρ

—

Para: *,miγ *

, ciγ *,xiγ

*,miγ —

*

,

1

solu

1 mi

N

lll

o Mm γρρ

+ ∑

= *

,

1

'

1

solvsolu

1 mi

N

sss

N

ll Mxm γ

+ ∑∑

==

*, ciγ *

,1

solu

ci

o

N

lllMc

γρ

ρ ∑=

−

— *

,11

'

1

solusolvsolu

ci

o

N

lll

N

sss

N

ll McMxc

γρ

ρ ∑∑∑===

−+

De:

*,xiγ

*

,

1

'

1

solv

solv

xiN

sss

N

sss

Mx

Mx

γ∑

∑

=

= *

,

1

'

1

solv

espécies

xiN

sss

N

jjj

o

Mx

Mx

γρρ

∑

∑

=

= —

APÊNDICES

– 49 –

Parâmetros do modelo UNIFAC

Na Tabela A.3 são apresentados os parâmetros Rk e Qk utilizados no cálculo

do coeficiente de actividade pelo método UNIFAC. Para o novo grupo mCH3, os

parâmetros usados foram os já existentes para o grupo CH3.

Na Tabela A.4 são publicados todos os parâmetros amn utilizados no cálculo

dos coeficientes de actividade.

Tabela A.3: Parâmetros Rk e Qk do modelo UNIFAC [20].

Grupo Subgrupo Rk Qk

CH 0,4469 0,228 CH3

CH2 0,6744 0,540

CH3NH CH2NH 1,2070 0,936

CH2NH2 1,3692 1,236 CH3NH2

CHNH2 1,1417 0,924

CONHCH 1,7508 1,264 CONH2

CONHCH2 1,9637 1,488

COO- COO- 1,3013 1,224

COOH COOH 1,3013 1,224

H2O H2O 0,9200 1,400

OH OH 1,0000 1,200

CH2NH3+ 1,3692 1,236

CNH3+

CHNH3+ 1,1417 0,924

CNH2+ CH2NH2

+ 1,2070 0,936

mCH3 0,9011 0,848

mCH2 0,6744 0,540 mCH3

mCH 0,4469 0,228

APÊNDICES

– 50 –

17

0,0

0,0

156,4

-30,48

n.d.

-1037,6

-30,48

-1037,6

-1378,9

-1378,9

5000

315,3

-686,8

156,4

0,0

0,0

0,0

16

0,0

0,0

156,4

-30,48

n.d.

-1037,6

-30,48

-1037,6

-1378,9

-1378,9

5000

315,3

-686,8

156,4

0,0

0,0

0,0

15

0,0

0,0

156,4

-30,48

n.d.

-1037,6

-30,48

-1037,6

-1378,9

-1378,9

5000

315,3

-686,8

156,4

0,0

0,0

0,0

14

986,5

986,5

-150,0

-164,0

5000

99,9

-164,0

99,9

394,8

394,8

-485,0

-151,0

-229,1

0,0

986,5

986,5

986,5

13

1318,0

1318,0

-448,2

-330,4

-245,3

284,0

-330,4

284,0

-509,3

-509,3

-422,1

-66,17

0,0

353,5

-324,2

-324,2

-324,2

12

663,5

663,5

5000

-1000

5000

-1000

-1000

-1000

5000

5000

0,0

0,0

-14,09

199,8

663,5

663,5

663,5

11

5000

5000

5000

-1000

5000

-1000

-1000

-1000

-1792,5

-1792,5

0,0

0,0

-1000

-485,0

-1689,6

-1689,6

-1689,6

10

390,9

390,9

n.d.

5000

n.d.

5000

5000

5000

0,0

0,0

5000

5000

835,6

-382,7

419,7

419,7

419,7

9

390,9

390,9

n.d.

5000

n.d.

5000

5000

5000

0,0

0,0

5000

5000

835,6

-382,7

419,7

419,7

419,7

8

5000

5000

-335,9

0,0

n.d.

0,0

0,0

0,0

62,7

62,7

414,8

414,8

629,1

99,9

5000

5000

5000

7

391,5

391,5

108,8

0,0

n.d.

0,0

0,0

0,0

62,7

62,7

414,8

414,8

48,89

83,02

391,5

391,5

391,5

6

5000

5000

-335,9

0,0

n.d.

0,0

0,0

0,0

62,7

62,7

414,8

414,8

629,1

99,9

5000

5000

5000

5

5000

5000

5000

n.d.

0,0

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

5000

5000

-68,3

-234,6

n.d.

n.d.

n.d.

4

391,5

391,5

108,8

0,0

n.d.

0,0

0,0

0,0

62,7

62,7

414,8

414,8

48,89

83,02

391,5

391,5

391,5

3

255,7

255,7

0,0

63,72

5000

-768,4

63,72

-768,4

n.d.

n.d.

5000

5000

168,0

42,7

986,5

986,5

986,5

2

0,0

0,0

65,33

-30,48

5000

5000

-30,48

5000

27,97

27,97

5000

315,3

300,0

156,4

0,0

0,0

0,0

1

0,0

0,0

65,33

-30,48

5000

5000

-30,48

5000

27,97

27,97

5000

315,3

300,0

156,4

0,0

0,0

0,0

CH

CH2

CH2NH

CH2NH2

CH2NH2+

CH2NH3+

CHNH2

CHNH3+

CONHCH

CONHCH2

COO-

COOH

H2O

OH

mCH

mCH2

mCH3

Tabela A.4: Parâmetros de interacção do m

odelo UNIFAC utilizados neste trabalho. (NOTA: n.d. = não disponível)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

presidente prof. doutora maria inês purcell de portugal branco · unifac modelo unifac w água x...

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