El ADN y la Ingeniería genética

Tema 16

Utilización de los seres vivos para obtener productos útiles al ser humano

La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología Molecular, que

permiten manipular el genoma de un ser vivo.

• Producción de alimentos y bebidas (pan, vino, yogurt)• Obtención de medicamentos

• Clonación, mapas genéticos,• Organismos transgénicos, terapia génica

Biotecnología

Ingeniería genética

BiotecnologíaUtilización de los seres vivos para

obtener productos útiles al ser humano

Utilización de los seres vivos para obtener productos útiles al ser

humano

AlimentosMedicamentos

Bebidas

AlimentosMedicamentos

Bebidas

Tecnología del ADN

recombinante(década 70)

Si hay modificación de genes

Animales y plantas transgenicas

Animales y plantas transgenicas

No hay modificación de genes

Técnicas utilizadas en Ingeniería genética

Aplicaciones de la ingeniería genética

Tecnología del ADN recombinante

1. Fragmentar y aislar el ADN2. Unión a vectores.3. Introducción en las células.4. Clonación5. Búsqueda del clon idóneo.6. Análisis del ADN clonado: transferencia Southern,7. Secuenciación.8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Enzimas de restricción

1. Endonucleasas que cortan el ADN por una secuencia (siempre la misma) corta y conocida.

2.Posteriormente, los fragmentos de distintos ADN cortados con la misma enzima se podrán unir mediante otro enzima, una ADN ligasa

Formación de ADN complementario por hibridación

• Tenemos dos tipos distintos de ADN• Se separan las cadenas de ADN (desnaturalización).• Se devuelven las condiciones adecuadas y se

produce la renaturalización.• Se pueden obtener moléculas híbridas de los dos

tipos de ADN

• El porcentaje de hibridación está relacionado con el parentesco evolutivo

• Estas técnicas permiten localizar enfermedades genéticas

Síntesis de ADNc usando ARNm como molde

Se utiliza el enzima transcriptasa inversa para sintetizar un ADNc partiendo de un ARNm maduro (sin intrones) para que pueda ser utilizado luego en bacterias (los procariotas no realizan un proceso postranscripcional de eliminación de intrones

Clonación de ADN

En ingeniería genética se entiende por clonación la obtención de múltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN en el interior de un organismo hospedador.

Estos organismos deben cumplir las siguientes características:

1.Crecimiento rápido2.No debe ser patógeno3.Debe favorecer la entrada del transgén4.Debe ser muy bien conocido5.Debe ser fácilmente manipulable

Escherichia coli

Vectores de clonación

• Son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados.

• Debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. • Tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del

fragmento de ADN a clonar.

Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.

Los vectores más usados son plásmidos y virus

• Virus que infectan bacterias• Incorporan material genético mediante el proceso de

transducción. • Al infectar otra célula (bacteria) introduce el material

del antiguo huésped.

Bacteriófagos

• Una genoteca es una colección de clones cada uno de los cuales contiene un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADN derivado del ADN o el ARN totales de la célula o tejido.

• La colección de clones debería contener, teóricamente, todas las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es decir, debería contener muestras de todo el ADN del organismo.

• Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de ácidos nucleicos.

Almacenamiento de genes clonados

Identificación de clones

Una genoteca contiene muchos

clones

Hay que identificar el que nos interesa Sondas de ADN

Sondas de ADN

•Oligonucleótidos de cadena sencilla•Se pueden sintetizar a partir de la secuencia de bases del gen o de la secuencia de aminoácidos de la proteína•Están marcadas (radiactividad o fluorescencia) para poder ser identificadas

Una vez localizadas, las colonias que contienen el gen de interés se cultivan en grandes cantidades

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN y además en muy poco tiempo.

La reacción es un proceso cíclico: 1.La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras. 2.Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas). 3.Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias.

Aplicaciones de la PCR

Amplificación de:

• ADN antiguos (mamuts, momias, fósiles…•ADN obtenidos de la escena de un crimen (medicina forense).•ADN de células embrionarias (diagnostico prenatal de trastornos genéticos)•ADN de genes virales (en células infectadas por virus difíciles de detectar, como el VIH)

Animación de la PCR: http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf

* Método de Sanger – método de la interrupción controlada de la replicación de ADN

* Elementos necesarios:

- DNA polimerasa - primer o cebador - Mezcla de dATP, dCTP, dGTP y dTTP - Una pequeña cantidad de cada uno ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*marcados (*florescencia específica para cada uno de ellos)

Secuenciación del ADN

Pasos de la secuenciación

1. Primero es necesario obtener una gran cantidad de fragmentos de ADN (clonación)

2. Desnaturalización del ADN (obtención de cadenas simples)3. Mezcla de todos los componentes de la reacción4. Comienza la síntesis de ADN, que termina cuando la ADN polimerasa

incorpora un ddNTP marcado5. Se obtienen fragmentos de distinta longitud, todos ellos acabados en un

ddNTP*6. Se separan las moléculas marcadas mediante un gel de poliacrilamida.7. Un detector identifica cada uno de los ddNTP* finales gracias al color.8. El espectrograma resultante nos indica la secuencia de bases.

Identificación de genes codificadores de proteínasIdentificación de genes codificadores de proteínas

Genes que interactúan entre síGenes que interactúan entre sí

Comparación de genomas de distintas especiesComparación de genomas de distintas especies

El estudio de la genómica es el conocimiento del genoma completo y

de las interacciones entre los genes que lo forman.

objetivoGenómica

Ensayo de micromatrices de ADNEnsayo de micromatrices de ADN

Sirve para saber si un tejido normal presenta genes alterados que podrían provocar una enfermedad

Estudios sistemáticos de las proteínas codificadas por el genoma de un

organismo.

Conjunto de proteínas de una célula, tejido o genoma completo

PROTEÓMICA

Proteoma

Proteómica

El conjunto de proteínas supera con mucho al de los genes. Su importancia radica en que son ellas las que desempeñan las actividades celulares

Ingeniería genética y medicina

1. Secuencia de la proteína (insulina)2. Síntesis de los ADN3. Obtención de plásmidos

recombinantes con los genes para formar las dos cadenas de la insulina.

4. Expresión en E. coli5. Purificación y procesado químico6. Obtención de insulina activa

1. Los seres humanos difieren en un 0.1% del genoma.

2. Estas diferencias están localizadas en regiones cromosómicas concretas.

3. Estas zonas se usan como marcadores genéticos

4. Con la identificación de los marcadores se hace la huella genética (método de Southern blot)

5. La comparación de huellas genéticas permite resolver casos policiales.

Ingeniería genética y medicina

Ingeniería genética y agricultura

Obtención de plantas transgénicasObtención de plantas transgénicas

Resistencia a herbicidas

Resistencia a herbicidas

Mejora del producto

Mejora del producto

Plantas farmacéuticas

Plantas farmacéuticas

Se introduce un gen de E. coli que permite

usar mayores concentraciones de

herbicidas sin dañar a la planta de interés, y

eliminando malas hierbas.

Se introduce un gen de E. coli que permite

usar mayores concentraciones de

herbicidas sin dañar a la planta de interés, y

eliminando malas hierbas.

Las plantas producen sustancias medicinales, vacunas o anticuerpos

(planticuerpos).

Las plantas producen sustancias medicinales, vacunas o anticuerpos

(planticuerpos).

Se mejora el valor nutricional del

producto, por ejemplo añadiendo beta-caroteno al arroz

Se mejora el valor nutricional del

producto, por ejemplo añadiendo beta-caroteno al arroz

Ingeniería genética y medio ambiente

Uso de bacterias modificadas para degradar materia

orgánica (petróleo)

Uso de bacterias modificadas para degradar materia

orgánica (petróleo)

Obtención de metales a partir de minerales

de baja ley

Obtención de metales a partir de minerales

de baja ley

Fijación de metales pesados a la superficie

de la célula para limpieza de suelos

Fijación de metales pesados a la superficie

de la célula para limpieza de suelos

Ingeniería genética y ganadería

MEJORA DE RAZAS

MEJORA DE RAZAS

PRODUCCIÓN DE MEDICAMENTOSPRODUCCIÓN DE MEDICAMENTOS

ESTUDIO DE ENFERMEDADES

HUMANAS

ESTUDIO DE ENFERMEDADES

HUMANASObtener razas mas

resistentes, mas productivas, con

mayor desarrollo, resistentes a

condiciones más difíciles

Obtener razas mas resistentes, mas productivas, con

mayor desarrollo, resistentes a

condiciones más difíciles

Se estudia la expresión de genes humanos en

organismos transgénicos

Se estudia la expresión de genes humanos en

organismos transgénicos

Se usan animales transgénicos.

Se pueden obtener sustancias de interés

como proteínas humanas para combatir

enfermedades:Enfisema hereditario

Factores de coagulación

Se usan animales transgénicos.

Se pueden obtener sustancias de interés

como proteínas humanas para combatir

enfermedades:Enfisema hereditario

Factores de coagulación