presentacion trabajo practico curva de calibracion
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Presentación trabajo práctico Curva de Calibración
Valentina Ferrada Rubio
03 septiembre 2007
Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Bioquímica Aplicada
¿Qué es una curva de calibración?• Es una curva que se construye a partir de
diferentes concentraciones de un analito y su respuesta frente a una reacción. Este gráfico tiende a ser lineal, mientras progrese según la ley de Lambert Beer.
A(DO) = log(I0/I)
A (DO)= k*c
Curva de calibración del Glicógeno
• Materiales: Equipos
EspectrofotómetroMicropipetas automáticas
Materiales de laboratorioMatraces aforadosVasos precipitadosPuntas para p100, p200Tubos Khan de vidrio
Protocolo
• Se ocupó una solución estándar de 50 mL de glucosa 2 g/L, en ácido benzoico 3 g/L
• 5 mL de reactivo de glucosa (1 mL para cada tubo)
Procedimiento:
• Calculamos los volúmenes que necesitábamos de la solución estándar para cada tubo
1.- V(1) * 2 mg/mL = 0.5 mg/mL * 1 mL
V(1) = 0.25 mL
2.- V(1) * 2 mg/mL = 1 mg/ mL * 1 mL
V(1) = 0.5 mL
3.- V(1) * 2 mg/mL = 1.5 mg/mL * 1 mL
V(1) = 0.75 mL
4.- V(1) * 2 mg/mL = 2 mg/mL * 1 mL
V(1) = 1 mL
• Para que todos los tubos quedaran con 2 mL, se les agregó agua destilada a los tubos que lo necesitaban.
Tabla:
[glucosa]
mg/mL
Solución Estándar
mL H2O dest.Reactivo
mL Absorbancia
Tubo 1 0,5 0,25 0,75 1
Tubo 2 1 0,5 0,5 1
Tubo 3 1,5 0,75 0,25 1
Tubo 4 2 1 0 1
Blanco 0 0 1 1
• Las absorbancias dadas en los diferentes tubos fueron:
Abs. 1 Abs. 2 Abs. 3 Abs. 4
Tubo 1 0,1337 0,126 0,1391 0,1403
Tubo 2 0,4048 0,2989 0,2648 0,2834
Tubo 3 0,4663 0,4567 0,4911 0,4353
Tubo 4 0,7334 0,6192 0,6175 0,6031
• Con estas absorbancias se calcula el promedio, para luego sacar la desviación estándar (S)
Abs. 1 Abs. 2 Abs. 3 Abs. 4 Promedio S
Tubo 1 0,1337 0,126 0,1391 0,1403 0,134775 0,00651633
Tubo 2 0,4048 0,2989 0,2648 0,2834 0,312975 0,06278388
Tubo 3 0,4663 0,4567 0,4911 0,4353 0,46235 0,02313576
Tubo 4 0,7334 0,6192 0,6175 0,6031 0,6433 0,06049931
• Posteriormente, se calculó el Intervalo de confianza (IC), el Coeficiente de Variación (CV), el Coeficiente de Exactitud (CE) y BC.
Promedio S DE simple IC superior IC inferior CV BC CE
Tubo 1 0,134775 0,00651633 0,0065 0,14514 0,12441 4,834969 6.96% 93.04%
Tubo 2 0,312975 0,06278388 0,0627 0,41286 0,21208 20,06019 22.68% 77.32%
Tubo 3 0,46235 0,02313576 0,0231 0,49915 0,42554 5,003949 5.85% 94.14%
Tubo 4 0,6433 0,06049931 0,0604 0,739554 0,547045 9,404525 12.87% 87.71%
• Obtenidos estos datos, se puede hacer una curva de Regresión lineal. Concentración
mg/mLAbsorbancia
(460 nm)
0,5 0,134775
1 0,312975
1,5 0,46235
2 0,6433
Regresión linealy = 0,335x - 0,0304
R2 = 0,9987
00,10,20,30,40,50,60,7
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentración mg/mL
Ab
sorb
acia
(46
0 n
m)
Serie1
Lineal (Serie1)
• R² es un Coeficiente de Regresión que indica que tan adecuada quedó la recta en
relación a los puntos. Mientras más cercano a 1 sea este coeficiente, mejor es la recta.
R²= 0.9987
• Ecuación de la recta
y= 0.335x – 0.0304
• Según la ley de Lambert Beer, la Absorbancia (A) es igual a la Concentración de la muestra (c) por una constante (k):
A= k*c
• Para calcular la constante (k), es necesario calcular el promedio de las absorbancias dadas en cada tubo:
k= A / c
Tubo 1: k1= 0.134775 / 0.5
k1= 0.26955
• Tubo 2 k2 = 0.312975 / 1.0
k2 = 0.312975
• Tubo 3: k3= 0.46235 / 1.5
k3= 0.3082
• Tubo 4: k4 = 0.6433 / 2.0
k4 = 0.32165
Promedio:
k1 + k2 + k3 + k4 / 4 = 0.303075
• Con el valor de k se puede construir una nueva recta. La variable incógnita será la Absorbancia.
Tubo 1: A= 0.303075 * 0.5
A1= 0.1515
Tubo 2: A= 0.303075 * 1.0
A2= 0.303075
Tubo 3: A= 0.303075 * 1.5
A3= 0.4546
Tubo 4: A= 0.303075 * 2.0
A4= 0.60615
Concentración v/s Absorbanciay = 0,3031x - 4E-05
R2 = 1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentración (mg/mL)
Ab
sorb
anci
a (4
60 m
n)
Serie1
Lineal (Serie1)
Concentración mg/mL absorbancia (460 mn)0,5 0,15151 0,303075
1,5 0,45462 0,60615
Gráfico resultante:
• El valor del coeficiente de regresión es igual a 1, lo que indica que la recta quedó
muy adecuada en relación a los datos.
EjemploConcentración
analito Abs. 1 Abs. 2 Abs. 3
15 0.15 0.20 0.17
30 0.32 0.26 0.35
45 0.42 0.39 0.45
60 0.55 0.57 0.60
Promedio
0.1733
0.31
0.42
0.5733
Curva resultante:
Regresión lineal y = 0,0087x + 0,0416
R2 = 0,9964
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 20 40 60 80
Concentración analito
Ab
sorb
anci
a
Serie1
Lineal (Serie1)
Concentración analito
Absorbancia
15 0.1733
30 0.31
45 0.42
60 0.5733
Conclusión
Los métodos estadísticos son necesarios para validar la curva de calibración.
Los valores muy dispersos pueden deberse a errores aleatorios.
Fin